DE1617681C3 - Verfahren zur Gewinnung eines in vivo antikoagulierend wirkenden und defibrinierenden Enzyms aus dem Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung eines in vivo antikoagulierend wirkenden und defibrinierenden Enzyms aus dem Gift der Viper Ancistrodon RhodostomaInfo
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Description
50
Gegenstand des Hauptpatents ist ein in vivo antikoagulierend wirkendes und defibrinierendes Enzym
aus dem Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma, das dadurch gekennzeichnet ist, daß a) seine biologische
Aktivität thrombinartig, d. h. Fibrin mit bündelartigem Charakter erzeugend, ist, daß es in vivo jedoch nicht
proteolytisch wirkt und daß seine Wirkung in vivo rasch mittels eines spezifischen Antiserums gegen das Gift der
Viper Ancistrodon Rhodostoma aufgehoben wird, b) es an Di- oderTriäthylaminoäthylcellulose adsorbiert wird,
c) es in physiologischer Kochsalzlösung löslich ist, d) es eine elektrophoretische Mobilität von 3,92 · 10-sV/
cm · see in einem 0,1 mol. Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0 aufweist, e) es ein Molekulargewicht,
bei der Bestimmung in der Ultrazentrifuge, von etwa 000 bis etwa 40 000 hat, f) es einen Sedimentationskoeffizienten
S20W «· 3,40 Svedberg aufweist, g) es ein
partielles spezifisches Volumen von 0,66 besitzt, h) es bei der Immunelektrophorese gegen ein spezifisches
Antiserum gegen das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma nach dem Agar-Diffusionsverfahren zwei
Präcipitatbanden ergibt, i) seine biologische Aktivität durch Diisopropylfiuorphosphat in einer Konzentration
von ΙΟ-3 Mol/l bei pH 8 und Zimmertemperatur
innerhalb 5 Minuten nicht inhibiert wird und j) daß es proteinartig und in reinem Zustand weitgehend farblos
ist. Dieses Enzym kann gemäß Anspruch 2 des Hauptpatentes dadurch gewonnen werden, daß man das
Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma an einer Säule eines schwach basischen Anionenaustauschermaterials
chromatographiert und die das aktive Material enthaltende Fraktion weitgehend frei von unerwünschten
proteolytischen Enzymen auffängt und daraus das Enzym isoliert. Bei dieser chromatographisch durchgeführten
Reinigung und geeignete schwach basische Anionenaustauscher solche, die eine tertiäre Aminogruppe
enthalten, z. B.Triäthylaminoäthylcellulose.
Es hat sich nun gezeigt, daß infolge von Schwankungen
der Eigenschaften des Handelsproduktes von Ansatz zu Ansatz die Triäthylaminoäthylcellulose nicht
in jedem Fall gemäß dem in dem Hauptpatent, insbesondere in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
eine genügend deutliche Trennung zwischen der das Enzym enthaltenden Fraktion und der dieser unmittelbar
vorausgehenden Fraktion ergibt Infolgedessen ist das nach dieser beschriebenen Arbeitsweise erhaltene
gereinigte Produkt häufig noch mit einem geringen Anteil eines in dem Gift vorhandenen haemorrhagischen
Faktors verunreinigt, dessen größerer Teil in den vorausgegangenen Elutionsstufen eliminiert wurde.
Obwohl die Verunreinigung nicht so groß ist, daß sie bei der in Betracht gezogenen Dosierung des zu applizierenden
Wirkstoffes gefährlich werden kann, ist es jedoch wünschenswert, ein so reines Produkt wie
möglich zu erhalten, insbesondere wenn das Produkt durch intramuskuläre oder subcutane Injektion verabfolgt
werden soll. Der erforderliche Reinheitsgrad kann zwar durch geeignetes Variieren der Molaritäten der
Elutionsmittel in den jeweiligen Stufen des Reinigungsverfahrens erzielt werden. Unglücklicherweise führt
jedoch eine Abänderung des ausgearbeiteten Verfahrens zu einer Verminderung der Ausbeute an Wirkstoff.
In weiterer Ausgestaltung des Verfahrens gemäß Anspruch 2 des Hauptpatents 14 42134 wurde nun
festgestellt, daß die oben genannte Verunreinigung, d. h. der haemorrhagische Faktor, weitgehend beseitigt
werden kann, wenn man, wie im Patentanspruch 1 angegeben, das Eluat der Austauschersäule oder das
Rohgift einer weiteren Reinigungsstufe unter Anwendung einer Gelfiltration unterwirft
Die Gelfiltration ist eine Arbeitsweise, bei der Materialien verwendet werden, die man im allgemeinen
als »Molekularsiebe« bezeichnet Diese Stoffe sind unlösliche, praktisch inerte Produkte mit der Eigenschaft,
daß sie die Trennung von Molekülen auf der Basis ihrer Permeabilität durch die mit dem Lösungsmittel
angequollenen Stoffe ermöglichen, eine Eigenschaft, die in Beziehung steht zu der Molekulargröße und der
Form der gelösten Molekeln. Diese Molekularsiebe werden von verschiedenen Gesellschaften hergestellt
und jedes ist durch einen ungefähren nutzbaren Molekulargewichtsbereich gekennzeichnet, innerhalb
desselben das Material fraktioniert Es ist wichtig, daß man das am besten geeignete Material auswählt, so daß
eine gute Trennung des thrombinartigen Wirkstoffes
und des haemorrhagischen Faktors erzielt wird. Typische geeignete Stoffe sind vernetzte Dextrane,
Polyacrylamidgele und Galaktosepolymerisate. Diese Materialien fraktionieren gut im Molekulargewichtsbereich
von 20 000 bis 100 000.
Der Vorteil der Gelfiltration liegt darin, daß die Fraktionierung in einem weiten Bereich von Puffersystemen
vorgenommen werden kann, wobei die abgetrennten Komponenten in dem gewählten Eluierungsmittel
erhalten werden und frei sind von dem Puffersystem des ursprünglichen unreinen Präparates,
das der Kolonne aufgegeben wurde.
So kann die gemäß dem Hauptpatent bei der Fraktionierung mit einer Triäthylaminoäthylcellulosekolonne
erhaltene Fraktion 6 die 0,1m Tris(hydroxymethyl)aminomethan/Phosphat
Puffer (Tris/Phosphat) vom pH-Wert 6 enthält, mit vernetztem Dextran auf einem Hintergrund von 0,1m Natriumphosphat, 0,1m
NaCl vom pH-Wert 7,0 fraktioniert werden, wobei der abgetrennte thrombinartige Wirkstoff in dem letzteren
Lösungsmittel erhalten wird und frei ist von dem Tris/Phosphat-Puffer. Es kann jedes beliebige geeignete
wäßrige Grundlösungsmittel gewählt werden; es ist jedoch wünschenswert, ein System adequater Aktivitätsstabilität
zu wählen, das eine ausreichend hohe Ionenstärke aufweist, um anomale Absorptionseffekte
auszuschalten, die mit einigen Proteinen z. B. in reinem Wasser als Grundlösungsmittel auftreten können.
Angenähert isotonische Lösungen wie z. B. der obengenannte Kochsalz/Phosphat-Puffer sind im vorliegenden
Falle frei von solchen Wirkungen.
Da die Fraktionierungen durch Gelfiltration auf einem gegebenen Gel in erster Linie eine Funktion der
Größe der Kolonne und des aufgegebenen Volumens sind, ist es wünschenswert, das letztere auf ein so kleines
Volumen wie möglich zu reduzieren, um eine größtmögliche Trennung zu erzielen. Hierzu werden zweckmäßigerweise
Triäthylaminoäthylcelluloseeluate unter vermindertem Druck bei etwa 300C konzentriert. Dabei
kann bis zu einer Konzentration von 3 m Tris/Phosphat, d. h. bis zu dem 30fachen des 0,1 m Tris/Phosphat-Puffers
vom pH-Wert 6 ohne Verlust an Aktivität eingeengt werden. Das konzentrierte Eluat kann dann einer
Kolonne von geeigneter Größe aufgegeben werden. Die hohe Ionenstärke der aufgegebenen Flüssigkeit
stellt offenbar keinen Nachteil dar. Einige gebräuchliche Verfahren zum Einengen wie Ultrafiltration sind
hingegen mit wesentlichen Verlusten an trhombinartiger Aktivität verbunden.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert:
Fraktionierung von Rohgift mit
Triäthylaminoäthylcellulose
Triäthylaminoäthylcellulose
Die Fraktionierung wurde gemäß dem Verfahren des Hauptpatents vorgenommen. Auf die Elution des
Proteins folgten eine Bestimmung der UV-Absorption mit einer kontinuierlich arbeitenden Vorrichtung bei
254 πιμ sowie die Messungen der einzelnen Fraktionen
bei 280 πιμ.
2 g des rohen Giftes wurden in 70 cm3 0,01 m Tris/Phophat vom pH-Wert 8,5 gelöst und der
unlösliche weiße Bodensatz abgeschleudert. Die klare gelbe überstehende Flüssigkeit wurde der Triäthylaminoäthylcellulosekolonne
(35 cm χ 3,9 cm) aufgegeben. Es wurde die nominelle Ionenaustauscherkapazität von
0,65 m Äq/g behandelt und die Kolonne entsprechend dem zuvor angewandten Verfahren beladen. Nach dem
Beladen wurde die Kolonne mit demselben Lösungsmittel, d. h. mit 0,01 m Tris/Phosphat vom pH-Wert 8,5,
eluiert.
Das vollständige Schema der bei Raumtemperatur während 2 Tage mit 250 cm3/h durchgeführten Elution
wird nachstehend angegeben. Es wird das ungefähre Volumen des Eluens aufgeführt, der tatsächliche
Wechsel des Eluens wird jedoch durch das Ablesen der UV-Absorption bestimmt.
Eluens 1 0,01 m Tris/Phosphat, pH-Wert 8,5
Eluens 2 0,01 m Tris/Phosphat, pH-Wert 7
Eluens 3 0,02 m Tris/Phosphat, pH-Wert 6
Eluens 4 0,06 m Tris/Phosphat, pH-Wert 6
Eluens 5 0,1 m NaCl, 0,09 m Tris/Phosphat, pH-Wert
Eluens 6 2 m NaCl, 0,09 m Tris/Phosphat, pH-Wert
| 750 cm3 | Fraktion I1II und III |
| 2000 cm3 | Fraktion IV |
| 3000 cm3 | Fraktion V |
| 1500 cm3 | Fraktion VI |
| 500 cm3 | Fraktion VII |
| 1000 cm3 | Fraktion VIII |
Die Fraktionen I und II wurden nicht so gut getrennt wie bei den früheren im Hauptpatent beschriebenen
Fraktionierungen. Die Fraktion III ist größer, da vermutlich aus der früheren Fraktion IV, die nun sehr
viel kleiner ist, Protein in diese Fraktion gelangt. Der Wechsel in dem neuen System mit den Elutionsmitteln 1
und 2 (diese Elutionsmittel sind identisch mit jenen, die in den früheren Versuchen verwendet wurden) stimmt
überein mit Proteinen, die bei einer niederen Ionenstärke eluiert werden. Das Auswaschen zwischen den
Fraktionen IV und V wurde nun unterlassen, und Fraktion V1 die zuvor mit 0,04 m Tris/Phosphat vom
pH-Wert 6 eluiert worden war, wurde nun mit 0,02 m Pufferlösung vom gleichen pH-Wert eluiert, wobei das
Protein in drei flachen Maxima während einer längeren Zeitperiode erschien. Die thrombinartige Aktivität,
gemessen wie im Hauptpatent beschrieben, nahm in diesen Fraktionen allmählich zu. Fraktion VI wurde als
ein gleiches Maximum eluiert wie früher (mit 0,09 m Tris/Phosphat vom pH-Wert 6) mit einem anfänglichen
Anfeuchten des Proteins und einem Anstieg der thrombinartigen Aktivität, gefolgt von einem stufenweisen
oder allmählichen Abfall. Die Fraktionen VII und VIII wurden wie zuvor eluiert mit ähnlichen Proteinprofilen,
wie dies bei den großen Unterschieden der Ionenstärke gegenüber dem Eluens der Fraktion V zu
erwarten war.
Der Hauptanteil des gelb gefärbten Materials des Rohgiftes wurde in Fraktion VII eluiert. Ein geringer
Anteil der gefärbten Lösung erscheint jedoch in Fraktion VI, nach dem Hauptprotein und dem
Maximum der thrombinartigen Aktivität, wobei jedoch noch weiterhin bedeutsame Mengen an Aktivität eluiert
werden. Aus Messungen der optischen Dichte bei 280 ιτιμ und 440 πιμ mit den gefärbten Fraktionen sowie
durch Vergleich mit ähnlichen Messungen an der gefärbten Fraktion VII (1-Aminosäureoxydase enthaltendes
Material) kann geschlossen werden, daß der gefärbte Gesamtanteil der Fraktion VI nicht proteingebunden
ist und wahrscheinlich ein Abbauprodukt von ursprünglich in dem rohen Gift enthaltenen Flavoproteinen
ist.
Fraktionierung der Fraktion VI auf
vernetzten! Dextran
vernetzten! Dextran
Das gesammelte Material der Fraktion VI, das aus 2 g rohem Schlangengift erhalten wurde und bis zu
1200 cm3 enthaltend 70 bis 80% der ursprünglichen thrombinartigen Aktivität des Rohgiftes ausmachte,
wurde auf einem Walzenverdampfer bei 30°C/20mmHg konzentriert. Es wurde bis zu 50mal
eingeengt, ohne praktischen Aktivitätsverlust trotz der dabei erreichten hohen Molarität des Tris/Phosphat-Puffers
(bis zu 3 m).
650 cm3 eines gesammelten Fraktion-VI-Präparates
mit der Aktivität von 97 Thrombineinheiten pro cm3 wurde 20mal bei 300C eingeengt. Praktisch das gesamte
Konzentrat (32 cm3) wurde einer mit vernetztem Dextran gefüllten, 97 cm χ 6 cm großen Kolonne
aufgegeben, die mit 0,1 m Natriumphosphat, 0,1 m Natriumchlorid, pH-Wert 7,0, enthaltend 0,1% Chloroform,
äquilibriert worden war. Es wurde mit demselben Lösungsmittel bei Raumtemperatur mit 80 cm3/h weiter
gewaschen und Fraktionen ä 8 cm3 aufgefangen. Es wurde jeweils die Absorption bei 280 πιμ bestimmt und
darauf die thrombinartige Aktivität kontrolliert. Die Aktivität in Thrombineinheiten je cm3 dividiert durch
die optische Dichte bei 280 πιμ ergibt ein Maß für die
Stärke.
Das Maximum der thrombinartigen Aktivität ist am stärksten bei einem Elutionsvolumen von etwa 990 cm3
und das Maximum des haemorrhagischen Faktors bei einem Volumen von 1290 cm3 mit guter Trennung
zwischen beiden. Die Fraktionen zwischen 952 cm3 und 1075 cm3, die spezifische Aktivitäten (Aktivitäten in
Thrombineinheiten pro cm3 dividiert durch die optische Dichte in einer 1-cm-Zelle bei 280 ΐυμ) besser als 800
aufweisen, werden vereinigt. Das erhaltene Gemisch hatte eine optische Dichte bei 280 πιμ von 0,33 und die
Kontrolle ergab 320 Thrombineinheiten pro cm3. Dies entspricht einer Wiedergewinnung an gereinigtem
thrombinartigen Wirkstoff von der Fraktion VI von
ίο 71%, sowie einer Gesamtwiedergewinnung aus dem
Rohprodukt von 50 bis 55%.
Haemorrhagische Versuche gegenüber einem Standardpräparat zeigten einen Gehalt an haemorrhagischem
Faktor von etwa 0,5% an, auf der Basis einer Absorption bei 280 ΐπμ.
Die gelbgefärbte Komponente der Fraktion-VI-Lösung, die nach dem Einengen vor dem Beladen der
Kolonne deutlich sichtbar ist, wird auf vernetztem Dextran stark zurückgehalten, da sie als Material mit
ziemlich niederem Molekulargewicht wandert. Sie wird gut sowohl von dem Peak der thrombinartigen Aktivität
als auch dem Peak des haemorrhagischen Faktors abgetrennt.
Die schließlich gesammelte Lösung mit thrombinartiger Aktivität wurde in In physiologischer Kochsalzlösung
zu einer Aktivität von etwa 70 Thrombineinheiten pro cm3 verdünnt und durch Membranfiltration sterilisiert.
Die sterile Lösung wurde in Volumina zu je 1,1 cm3 in Standard 1 cm3 Allglas-Ampullen abgefüllt und
verschlossen. Dies ergibt geeignete Einzeldosismengen für intravenöse oder intramuskuläre Injektion.
Claims (3)
1. Verfahren zur Gewinnung des Enzyms gemäß Anspruch 1 des Patentes 14 42 134, wobei man nach
Anspruch 2 dieses Patents das Gift der Viper Ancistrodon Rhodostoma an einer Säule eines
schwach basischen Anionenaustauschermaterials chromatographiert und die das aktive Material
enthaltende Fraktion weitgehend frei von unerwünschten proteolytischen Enzymen auffängt und
daraus das Enzym isoliert, dadurch gekennzeichnet,
daß (A) man das Rohgift zunächst an einer Säule eines schwach basischen, tertiäre
Aminogruppen enthaltenden Anionenaustauschers adsorbiert und dann mit Pufferlösungen steigender
Molarität vom pH-Wert 5,5 bis 7,5 zuerst die unerwünschten proteolytischen Enzyme und darauf
das gewünschte Enzym fraktionierend eluiert, daß man das so erhaltene, das Enzym enthaltende Eluat
der Gelfiltration an einem Material, das so ausgewählt ist, daß eine gute Trennung des Enzyms
und des haemorrhagischen Faktors erzielt wird, unterwirft und daß man schließlich das Enzym in an
sich bekannter Weise aus dem Eluat der Gelfiltration isoliert oder daß (B) man als erstes die Gelfiltration
des Rohgiftes an einem Material, das so ausgewählt ist, daß eine gute Trennung des Enzyms und des
haemorrhagischen Faktors erzielt wird, durchführt, daß man sodann die so erhaltene das Enzym
enthaltende Fraktion des Gelfiltrationsschrittes an einer Säule eines schwach basischen, tertiäre
Aminogruppen enthaltenden Anionenaustauschers adsorbiert und dann mit Pufferlösungen steigender
Molarität vom pH-Wert 5,5 bis 7,5 zuerst die unerwünschten proteolytischen Enzyme und darauf
das gewünschte Enzym fraktionierend eluiert, und daß man schließlich das Enzym aus dem Eluat der
Anionenaustauscherbehandlung in an sich bekannter Weise gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 (A), dadurch gekennzeichnet, daß man das das Enzym enthaltende
Eluat des Anionenaustauschers einengt und sodann die Gelfiltration vornimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Material für die
Gelfiltration ein vernetztes Dextran verwendet.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB3802966 | 1966-08-24 | ||
| DEN0031111 | 1967-08-23 | ||
| DEN0031111 | 1967-08-23 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1617681A1 DE1617681A1 (de) | 1971-03-18 |
| DE1617681B2 DE1617681B2 (de) | 1977-04-21 |
| DE1617681C3 true DE1617681C3 (de) | 1977-12-22 |
Family
ID=
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