DE1445639B2

DE1445639B2 - Verfahren zur herstellung von desacetyl-7-aminocephalosporansaeure

Info

Publication number: DE1445639B2
Application number: DE1964C0034295
Authority: DE
Inventors: Jakob Dr. Riehen; Bickel Hans Dr. Binningen; Nüesch (Schweiz)
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1963-11-19
Filing date: 1964-11-05
Publication date: 1976-09-09
Also published as: FR1449610A; DE1445639A1

Description

Gegenstand der Anmeldung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure. Diese Verbindung ist ein wertvolles Ausgangsprodukt für die Herstellung von therapeutisch verwendbaren Desacetyl^-acylamino-cephalosporansäuren, wie z. B. 0-Desacetyl-0-(/9-chloräthyIcarbamoyl) - 7 - [ N'- (ß - chloräthyl) - ureido] - cephalosporansäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man desacetylierende Enzyme bildende Stämme von Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces griseoflavus, Streptomyces prasinus, Streptomyces violaceoruber, Streptomyces thermovulgaris, Thermoactinomyces vulgaris, Actinopycnidium species, Micromonospora species, Nocardia petroleophila, Streptosporangium roseum, Thermopolyspora polyspora, Thermopolyspora glauca, Mycobacterium tuberculosis var. BCG, Mycobacterium phlei, Bacillus subtilis oder deren Enzyme in wäßriger Lösung unter üblichen Bedingungen auf 7-Aminocephalosporansäure einwirken läßt und die Desacetyl-7-aminocephalosporansäure nach Abtennung der Zellmasse bzw. Enzyme und Einengung der Lösung in fester Form ausscheidet.

Es ist bekannt, daß Cephalosporin C durch eine Acetylesterase aus Citrusfrüchten desacetyliert werden kann. Dieses Verfahren liefert aber nur sehr geringe Ausbeuten, so daß es praktisch ohne Bedeutung ist. Im Gegensatz dazu ergibt das erfindungsgemäße Verfahren sehr gute Ausbeuten, nämlich 80 bis 100% der Theorie. Es bedeutet daher einen überraschenden technischen Fortschritt.

Man läßt das Sediment der Mikroorganismen, (das man durch Züchtung in üblicher Weise erhalten hat), oder aus den Zellmassen erhältliche Enzyme auf eine wäßrige Lösung von 7-Amino-cephalosporansäure bei Temperaturen von 20 bis 37° C, vorzugsweise 27 C, einwirken und inkubiert solange, bis die 7-Aminocephalosporansäure ganz oder größtenteils in Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure übergeführt ist. Dies ist im allgemeinen nach 15 bis 24 h der Fall. Während der Inkubation wird das pH bei 6,5 bis 7,5, vorzugsweise zwischen 7,2 und 7,5 gehalten. Nach

ίο beendigter Reaktion filtriert man die Zellmasse ab, wäscht sie mit Wasser nach und engt die vereinigten

. Filtrate auf ein kleines Volumen ein. Beim Eindampfen wird das pH bei etwa 7 gehalten. Die konzentrierte Lösung soll einen Gehalt an Desacetyl-7-aminocephalosporansäure von 5 bis 10% haben. Sie wird langsam auf ein pH von 3,5 bis 4,5, vorzugsweise 4,2, gebracht. Vom pH 5,0 an beginnt die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure auszufallen. Man kühlt die Lösung auf 0⁰C und läßt sie bei dieser Temperatur einige Zeit (1 bis 3 h) stehen. Dann trennt man die ausgefallene Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure ab, beispielsweise durch Filtration oder durch Zentrifugieren, und wäscht sie mit Eiswasser.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen erläutert. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographische Prüfung der Überführung von 7-Amino-cephalosporansäure in Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure erfolgt an SiIicagel im System n-Butanol-Eisessig-Pyridin-Wasser (15:3:10:12). Die Laufzeit beträgt bei 25°C etwa 3 h. Die Chromatograrnme werden mit Ninhydrin-Collidin-Lösung (0,938 g Ninhydrin, 28 ml 2,4,6-Collidin, 700 ml Äthanol, 210 ml Eisessig) entwickelt. Nach dem Besprühen mit der Lösung hält man 5 bis 10 min bei 90°C. 7-Amino-cephalosporansäure hat einen Rf-Wert von 0,43, Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure Rf = 0,37.

NRRL bedeutet »Northern Regional Research Laboratory«, Peoria, Illinois.

ATCC bedeutet »American Type Culture Collection«, Washington D.C.

Beispiel 1

60 g 7-Amino-cephalosporansäure (75%ig) werden in einem 3 1-Gefäß, das mit Glaselektrode und Rührer versehen ist und sich in einem Wasserbad von 35⁰C befindet, in 1200 ml deionisiertem Wasser aufgeschlämmt. Unter Rühren gibt man 2 n-Natronlauge hinzu, bis ein pH-Wert von 7,2 bis 7,5 erreicht ist. Dann versetzt man die klare Lösung mit 15 g ZeIl-Lyophilisat von Bacillus subtilis ATCC 6633 und rührt die Suspension 4 h bei 35° C. Durch Zugabe von 2 n-Natronlauge wird das pH während dieser Zeit ständig zwischen 7,2 und 7,5 gehalten. Mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert man den Verlauf der Desacetylierung. Nach beendeter Reaktion wird die Suspension auf 20⁰C abgekühlt und unter Rühren mit 1200 ml Methanol und 30 g Diatomeenerde versetzt. Man saugt die Suspension über weitere 60 g Diatomeenerde ab und wäscht den Filterkuchen mit 200 ml Methanol-Wasser (1:1). Das Filtrat wird im Rotationsverdampfer auf etwa 1200 ml eingeengt. Zu dem so erhaltenen Konzentrat gibt man unter Rühren konzentrierte Salzsäure, bis ein pH von 4,2 erreicht ist. Dabei fällt die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure feinkörnig aus. Nach 2stündigem Stehen bei 0°C saugt

man den Niederschlag ab, wäscht ihn mit 50 ml Wasser und dreimal 100 ml Methanol-Wasser (2:1) und trocknet bei 35 bis 40⁰C im Vakuumschrank. Man erhält 32,6 g Desacetyl-T-amino-cephalosporansäure.
Das Zell-LyophiJisat wird wie folgt hergestellt:
300 1 einer 24stündigen Kultur von Bacillus subtilis ATCC 6633 in Glucosebouillon werden auf 4' C abgekühlt und zentrifugiert. Man erhält 2,8 kg feuchtes Sediment. Dieses homogenisiert man mit 1,4.1 deionisiertem Wasser. Die erhaltene Suspension versetzt man unter Rühren mit 14 I Aceton und rührt noch 30 min weiter. Dann läßt man die Suspension 15 h bei 0 bis 5⁰C stehen, gießt die überstehende Lösung ab und filtriert. Der Filterrückstand wird mit 2 1 Aceton-Wasser (4:1) und zweimal mit 2 1 Aceton gewaschen. Dann rührt man den Filterrückstand (2,7 kg) 3 h bei 20 bis 25⁰C, zentrifugiert, homogenisiert den Zentrifugenrückstand (2,24 kg) mit 2,2 1 deionisiertem Wasser und lyophilisiert.

Man erhält 360 g Lyophilisat in Form eines grauen Pulvers.

Beispiel 2

Mycobacterium tuberculosis var. BCG (Statens Seruminstitut, Kopenhagen) wird in bekannter Weise auf Sauton-Medium gezüchtet und das feuchte Zellsediment, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit 7-Aminocephalosporansäure zur Reaktion gebracht. Man erhält Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure in 80 %iger Ausbeute.

Beispiel 3

Das durch Zentrifugieren einer Kultur von Streptomyces violaceoruber ATCC 14980 gewonnene Zellsediment wird im Verhältnis 1:3 (Volum:Volum) mit 0,05-m. Phosphatpuffer nach Sörensen vom pH 7 mit l°/oo 7-Amino-cephalosporansäure vermischt. Von der so erhaltenen Suspension werden 3 ml 24 h bei 27°C in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben geschüttelt. Dann trennt man das Mycel ab. In der klaren Lösung

»ο wird die Desacetyl-7-amino-cephaIosporansäure dünnschichtchromatographisch nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-7-aminocephalosporansäure durch enzymatische Hydrolyse von 7-Aminocephalosporansäure, dadurch gekennzeichnet, daß man desacetylierende Enzyme bildende Stämme von Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces griseoflavus, Streptomyces prasinus, Streptomyces violaceoruber, Streptomyces thermovulgaris, Thermoactinomyces vulgäris, Actinopycnidium species, Micromonospora species, Nocardia petroleophila, Streptosporangium roseum, Thermopolyspora polyspora, Thermopolyspora glauca, Mycobacterium tuberculosis var. BCG; Mycobacterium phlei, Bacillus subtilis oder deren Enzyme in wäßriger Lösung unter üblichen Bedingungen auf 7-Aminocephalosporansäure einwirken läßt und die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure nach Abtrennung der Zellmasse bzw. Enzyme und Einengung der Lösung in fester Form ausscheidet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bac. subtilis ATCC 6633 oder dessen Enzyme zur Einwirkung bringt.