DE1442443C3

DE1442443C3 - Verwendung von vernetzten PoIyacrylamiden zur chromatographischen Trennung von proteoiytischen Enzymen und zur Entwässerung von Proteinlösungen

Info

Publication number: DE1442443C3
Application number: DE1442443A
Authority: DE
Inventors: Karl Theo Rolf Uppsala Mosbach (Schweden)
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1961-12-15
Filing date: 1962-12-15
Publication date: 1979-12-13
Also published as: SE328716B; US3298925A; DE1442443B2; GB1031757A; DE1442443A1

Description

Es ist bereits bekannt, zur Ionenaustauschchromatographie poröse, hochmolekulare, organische Kunstharze einzusetzen, die saure oder basische funktionelle Gruppen enthalten. Nach diesen bekannten Verfahren wurden saure oder basische Stoffe, beispielsweise Aminosäuren, getrennt. Die Verwendung von speziellen, vernetzten Copolymeren für die chromatographische Trennung von proteolytischen Enzymen und für die Entwässerung von Proteinlösungen ist daraus jedoch nicht herzuleiten. Außerdem sind seit einiger Zeit für chromatographische Zwecke hydroxylgruppenhaltige Gele auf Kohlehydratbasis bekannt, beispielsweise das Polysaccharid Dextran. Diese Gele sind jedoch nur beschränkt anwendbar, vor allem sind sie gegenüber proteolytischen Enzymen nicht stabil.

Es konnte nun gefunden werden, daß solche Einschränkungen nicht gelten, wenn man vernetzte Polymere mit spezieller Konstitution verwendet.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, für chrornatographische Zwecke Kunstharze zur Verfugung zu stellen, die die geschilderten Nachteile nicht aufweisen und sowohl für die chromatographische Trennung als auch für die Entwässerung geeignet sind.

Die Lösung dieser Aufgabe besteht in der Verwendung von mit Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid oder Glyoxal vernetzten, in hydrophilen bzw. hydrophoben Quellungsmitteln gequollenen Poiyacrylamiden in Granulatform einerseits zur chromatographischen Trennung von proteolytischen Enzymen und andererseits zur Entwässerung von Proteinlösungen.

Diese vernetzten Polyacrylamide werden mittels bekannter Verfahren in Gegenwart von Polymerisationskatalysatoren gewonnen, wobei die Vernetzer in Mengen von 0,5 bis 20, insbesondere bis 10 und zweckmäßigerweise bis 5 Gew.-%, Verwendung finden. Anschließend wird das vernetzte Polyacrylamid getrocknet, beispielsweise durch Gefriertrocknen, im Vakuum, mit Lösungsmitteln oder durch Aussalzen, um dann durch Mahlen oder Pulverisieren, z. B. in der Kugelmühle, oder auch direkt durch Sieben in Granulatform überführt zu werden. Das Granulat wird schließlich gegebenenfalls gesiebt und mit Quellungsmitteln, nämlich hydrophilen Mitteln, wie Wasser, Alkoholen, Wasserlösungen, Cellulosederivaten, Stärke oder Polyäthylenglykol bzw. hydrophoben Mitteln, wie Benzol, Toluol oder Xylol, behandelt. Die so erhaltenen vernetzten und gequollenen Polyacrylamide in Granulatform sind dann erfindungsgemäß verwendbar.

Die Herstellung dieser Polyacrylamide kann beispielsweise wie folgt erfolgen, doch wird für das Her-

"> stellungsverfahren kein Schutz beansprucht:

Herstellung von mit Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid vernetzten! Polyacrylamid: 0,75 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und 24,25 g Acrylamid werden mit 500ml Wasser vermischt. Die Lösung wird filtriert

in und mittels einer Wassersaugpumpe entlüftet. Einige Minuten nach Zusatz von 1,0 g Ammoniumsulfat als Polymerisationskatalysator und von 1,0 ml /3-Dimethylaminopropionitril entsteht ein starres Gel, das danach durch Gefriertrocknung getrocknet wird. Das

ι > Polymere wird dann in einem Mörser pulverisiert und gesiebt. Der Anteil mit dem Durchmesser unter 0,05 mm wird gesammelt.

Dem erhaltenen, gesiebten Pulver werden langsam und unter energischem Rühren 300 ml einer 0,05-m-

-Ί) Natriumphosphatpufferlösung zugesetzt. Die Lösung wird eine Stunde stehengelassen. Die größeren Teilchen werden durch 4 bis 5 Dekantierungen vom Bodensatz getrennt, so daß man eine Suspension von möglichst gleichförmigen Feststoffteilchen erhält. Die

j') kleinsten Teilchen werden ebenfalls durch Dekantieren entfernt.

Herstellung von mit Glyoxal vernetztem Polyacrylamid: 5 g Acrylsäureamid und 0,2 g Ammoniumpersulfat werden mit 100 g Wasser vermischt und

in bei 90° C während 30 Minuten polymerisiert. Das erhaltene Polymerisat wird mit HCl auf 0,1 -n angesäuert und mit 0,5 g 30%igein Glyoxal als Vernetzer versetzt. Die Gelbildung geschieht bei 90° C innerhalb von 30 Minuten. Das erhaltene Gel wird auf die oben

;> angegebene Weise unter Bildung eines gequollenen Pulvers mit einer Granulatgröße von 0,02 bis 0,05 mm nachbehandelt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Die dekantierte Suspension des gequollenen, mit Ν,Ν'-Methylen-bisacrylamid vernetzten Polyacrylamids wird in eine Glaskolonne eingeführt und dort r, sedimentieren gelassen. Das Sedimentieren wird gleichförmiger, wenn man die Apparatur schüttelt. Ist die Sedimentation abgeschlossen, wird die beim Hydratisieren verwendete Pufferlösung durch eine frische Pufferlösung ersetzt. Die Kolonne wird über

in Nacht gewaschen und ist danach zur Verwendung fertig. 40% des Kolonnenbettes sind sogenanntes totes Volumen. Über dem Bett befindet sich eine kleine Schicht der Pufferlösung, unter die die Probe in einem dünnen Polyäthylenrohr mit Innendurchmesser von

■,ι 1 nun eingeführt wird.

Auf diese Weise wird eine für die Chromatographie bestimmte Mischung von Pilziukku.se und radioaktiver Carboanhydrase oben auf die Kolonne (Dimensionen 1,5 X 22 cm) aufgegeben. Das Volumen der Protein-

„ii lösung beträgt 1 ml und die Gesamtmenge der Substanz ungefähr 7 mg. Das Chromatogramm wird mit 0,05 m Natriumphosphatpufferlösunguls Eluiermittel entwickelt bei einer Tropfgesehwindigkeit von l.Sml/Std. Die Fraktionen werden gesammelt. Die

,,, Lakkase wird enzymatisch und die Carboanhydrase durch radioaktive Messungen lokalisiert. Die Carboanhydrase wird radioaktiv gemacht mit Zn''^ durch! Dialyse gegen K)-¹M I .lO-Phenanthrolin in 0,1 M;

Acetatpuffer, pH 5,0, enthaltend 4,10"⁵M Zn⁶⁵ (Ac)₂. Dieser Versuch wird bei Zimmertemperatur ausgeführt.

Die Trennung in die zuerst aufgefangene Fraktion der Pilzlakkase (Molekulargewicht 57 000) und die ■> danach aufgefangene Fraktion der radioaktiven Carboanhydrase (Molekulargewicht 31000) geht deutlich aus dem Diagramm hervor.

Beispiel 2

Nachstehend wird die Entwässerung einer Proteinlösung zur Abtrennung des Proteins aus dieser Lösung in Wasser beschrieben. Es wird das bereits beschriebene, mit Glyoxal vernetzte Polyacrylamid in Form eines trockenen Granulats des Gels verwendet. Dieses Granulat wird auf eine Korngröße von etwa 0,02 bis 0,06 mm Durchmesser pulverisiert. Das Wasser wird vom Protein dadurch abgetrennt, daß Wasser beim Eluierenvom Polyacrylamid aufgenommen wird. Man erhält eine konzentrierte Proteinlösung, die von dem gequollenen Gelgranulat durch Zentrifugieren getrennt werden kann.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verwendung von mit N,N'-Methylen-bisacrylamid oder Glyoxal vernetzten, in hydrophilen bzw. hydrophoben Quellungsmitteln gequollenen Poiyacrylamiden in Granulatform zur chromatographischen Trennung von proteolytischen Enzymen.

2. Verwendung von mit N,N'-Methylen-bisacrylamid oder Glyoxal vernetzten, in hydrophilen bzw. hydrophoben Quellungsmitteln gequollenen Poiyacrylamiden in Granulatform zur Entwässerung von Proteinlosungen.