Verfahren zur Herstellung von Z-xpfelsäure Die vorliegende
Erfindung betrifft ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von D-Äpfelsäure
aus Fumarsäure. Z-Äpfelsäure wird bei der Herstellung von Gelee, zum Ansäuern von
Flaschengetränken wie auch als Emulgiermittel bei der Herstellung von Margarine
und Majonnaise verwendet. Neuerdings haben verschiedenartige Ester der Z-Äpfelsäure
als Weichmacher Bedeutung erlangt. Bisher wurde jedoch die L-Äpfelsäure vorwiegend
durch Extrahieren aus natürlichen Substanzen hergestellt, wobei die hohen Kosten
eine Herstellung im technischen Maßstab unmöglich machten. Erfindungsgemäß wird
daher ein Verfahren zur vollständigen Umwandlung eines Fumarsäurematerials in Z-pfelsäure
vorgeschlagen, bei dem die in Organismen enthaltene Fumarase verwendet wird. Obwohl
die Umsetzung -von Fumarsäure mit der Fumarase umkehrbar ist, verläuft die erfindungsgemäße
Umsetzung unter Bildung von Äpfelsäure nach einer Seite. Fumarase kann aus Tieren,
Pflanzen oder Mikroörganismen
gewonnen werden und ihre enzymatische
Umsetzung kann in bekannter (eise durch die folgende Gleichung wiedergegeben werden:
OOC-CH=CH-C00 + H20 OOC-CH 2-CHOH-C00 Wenn das Molverhültnis von Fumarsäure zu Äpfelsäure
auf etwa 1 : 3,3 ansteigt, wird bei der oben angegebenen reversiblen Umsetzung ein
chemisches Gleichgewicht erreicht. Beim Erreichen dieses Zustandes wird die Umsetzung
praktisch abgebrochen. Das angegebene Verhältnis wird erhalten, wenn die enzymatische
Umsetzung, bei der das wasserlösliche Natriumsalz verwendet wird, bei einer geeigneten
Temperatur und einem geeigneten pH-Jert durchgeführt wird. Die Zage des chemischen
Gleichgewichts zwischen Fumarsäure und ilpfelsäure kann natürlich in gewissem Ausmaß
theoretisch durch Regeln der Umsetzungsbedingungen verändert werden; oder das nichtumgesetzte
Fumarsäurematerial kann in geeigneter Weise aus der Apfelsäure enthaltenden Lösung,
in der chemisches Gleichgewicht erreicht worden ist, zurückgewonnen und als .Ausgangsmaterial
wiederverwendet werden. Bei der Herstellung im technischen Maßstab ist .jedoch die
Durchführung solcher Verfahren sehr mühsam und schwierig. Nach dem erfindungsgemäß
vorgeschlagenen Verfahren kann nahezu die gesamte, als Ausgangsmaterial verwendete
Fumarsäure in tipfelsäure umgewandelt werden, ohne daß
irgendwelche
ächwierigkeiten auftreten. Das erfindungsgemiß vorgeschlagene Verfahren kann schematisch
wie folgt dargestellt werden: Fumarase Calciumfumarat --@ Calciumfumarat
--
(feste Phase E-- -#.:#.(flüssige Phase Calciummalat Calciummalat (flüssige
Phase -E -- (feste Phase Erfindungsgemäß ist gefunden worden, daß die Calciumsalze
sowohl der Fumar- als auch der ipfels@iure in aasser sehr wenig löslich sind und
daß das letztere Salz weniger löslich ist als des erstere. Bei Versuchen ist gefunden
worden, daß die Calciumsalze von Fuma.r- und _spfelsäure in @7asser eine Löslichkeit
von 1,3 g/loo ccm bzw. von -),£ (-/iio ccm haben. Im Folgenden wird das erfindungsgem,;'ß
vorgeschlagene Verfahren erläutert: Einer w.'-_ssrigen Lösung, in der Calciumfumarat
suspendiert (oder abgeschieden) ist, wird Fumarase zugesetzt. Das Enzym, das auf
das in -Nasser gelöste Fumarat einwirkt, überführt einen Teil davon in Calciummalat,
das wegen seiner geringeren Löslichkeit aus dem System auskristallisiert, ehe die
Umsetzung das chemische Gleichgewicht erreicht hat. Die oben angegebene Umsetzung
verläuft daher von der linken zur rechten Seite, bis nicht nur das feste Cslciumfurinrat
vollstIndig verschwunden ist, sondern auch ds in der flüssigen Phase vorliegende
Calciumfumarat bis
zu einem solchen Ausmaß verringert worden ist,
daß es mit dem wasserlöslichen Anteil des Calciummalats (gesättigte Lösung) im Gleichgewicht
steht. Dadurch wird die Umsetzung schließlich begrenzt. Aus der obigen Beschreibung
geht also hervor, daß die Umsetzung, trotz der reversiblen Wirkung der Fumarase,
niemals von der rechten zur linken Seite verläuft. Nach beendeter Umsetzung wird
die abgeschiedene Masse, die aus reinem Calciummalat besteht, gewonnen. Dieses Salz
wird dann nach einem bekannten und geeigneten Verfahren (z.B. durch Säurehydrolyse)
in die gewünschte freie L-Äpfelsäure umgewandelt. Bei einem solchen Verfahren wird
z.B. das Galciummalat in Wasser gelöst oder suspendiert, worauf unter Rühren eine
berechnete Menge Oxalsäure zwecks Abscheidung von Calciumoxalat zugesetzt wird;
das Gemisch wird dann zwecks Entfernung der Abscheidung filtriert; das dabei erhaltene
Filtrat (Lösung der Äpfelsäure) wird dann zwecks Gewinnung von Aipfelsäure eingedampft
und getrocknet. Obwohl das oben angegebene Verfahren in besonderem Zusammenhang
mit den Galciumsalzen von Fumar- und Äpfelsäure beschrieben worden ist, betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von L-Äpfelsäure,
bei dem als Ausgangsmaterial ein bestimmtes Fumarsäuresalz verwendet worden ist,
das bei der enzymatischen Einwirkung der Fumarase in dessen Suspension ein Äpfelsäuresalz
ergibt, das wegen seiner geringeren Löslichkeit auskristallisiert,
bevor
das Gleichgewicht zwischen dem ;ipfelsäure-Balz und dem Fumarsäuresalz in
flüssiger Phase erreicht ist. Neben Caleiumfumarat können also Fumarsäuresalze
mit den oben angegebenen Eigenschaften, so z.B. Magnesiümfumarat, Zinkfumarat und
dgl., als Ausgangsmaterial ver-wendet werden. Process for the production of D-malic acid The present invention relates to a biochemical process for the production of D-malic acid from fumaric acid. Z-malic acid is used in the production of jelly, to acidify bottled beverages and as an emulsifier in the production of margarine and mayonnaise. Various esters of Z-malic acid have recently gained importance as plasticizers. So far, however, L-malic acid has mainly been produced by extraction from natural substances, the high costs making production on an industrial scale impossible. According to the invention, therefore, a method for the complete conversion of a fumaric acid material into phelic acid is proposed, in which the fumarase contained in organisms is used. Although the reaction of fumaric acid with the fumarase is reversible, the reaction according to the invention proceeds in one direction with the formation of malic acid. Fumarase can be obtained from animals, plants or microorganisms and its enzymatic conversion can be expressed in a known manner by the following equation: OOC-CH = CH-C00 + H20 OOC-CH 2-CHOH-C00 If the molar ratio of fumaric acid to malic acid rises to about 1: 3.3, a chemical equilibrium is reached in the above-mentioned reversible reaction. When this state is reached, the reaction is practically stopped. The stated ratio is obtained when the enzymatic reaction, in which the water-soluble sodium salt is used, at a suitable temperature and a suitable pH value. The chemical equilibrium between fumaric acid and malic acid can of course be changed to a certain extent theoretically by regulating the reaction conditions; or the unreacted fumaric acid material can be suitably prepared from the malic acid-containing solution in the chemical equilibrium reaches where can be recovered and reused as feedstock. In the case of production on an industrial scale, the implementation of such processes is very laborious and difficult. According to the process proposed according to the invention, almost all of the fumaric acid used as the starting material can be converted into tipic acid without any problems. The method proposed according to the invention can be shown schematically as follows: Fumarase calcium fumarate - @ calcium fumarate - (solid phase E-- - #.: #. (Liquid phase calcium malate calcium malate (liquid phase -E - (solid phase according to the invention has been found that the calcium salts of both fumaric and ipfelsic acids are very sparingly soluble in water, and that the latter salt is less soluble than the former. They have a solubility of 1.3 g / 100 ccm or of -), £ (- / 100 ccm. The method proposed according to the invention is explained below: A water-based solution in which calcium fumarate is suspended The enzyme that acts on the fumarate dissolved in water converts part of it into calcium malate, which, due to its lower solubility, crystallizes out of the system before the reaction has the chemical equivalent hweight has reached. The above-mentioned reaction therefore proceeds from the left to the right side until not only the solid calcium fumarate has completely disappeared, but the calcium fumarate present in the liquid phase has also been reduced to such an extent that it is mixed with the water-soluble portion of the calcium malate ( saturated solution) is in equilibrium. Characterized the reaction is finally limited. From the above description it can be seen that the reaction, despite the reversible action of the fumarase, never proceeds from the right to the left side. After the reaction has ended, the separated mass, which consists of pure calcium malate, is obtained. This salt is then converted into the desired free L-malic acid by a known and suitable method (e.g. by acid hydrolysis). In such a process, for example, the calcium malate is dissolved or suspended in water, whereupon a calculated amount of oxalic acid is added with stirring for the purpose of separating out calcium oxalate; the mixture is then filtered to remove the deposit; the resulting filtrate (solution of malic acid) is then evaporated and dried to obtain malic acid. Although the above-mentioned process has been described in particular in connection with the calcium salts of fumaric and malic acid, the present invention relates to a process for the biochemical production of L-malic acid, in which a certain fumaric acid salt has been used as the starting material, which in the enzymatic action The suspension of the fumarase results in a malic acid salt which, due to its lower solubility, crystallizes out before the equilibrium between the ipic acid courtship and the fumaric acid salt is reached in the liquid phase. In addition to calamine fumarate, fumaric acid salts with the properties indicated above, for example magnesium fumarate, zinc fumarate and the like, can also be used as starting material .
Die bei dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren verwendete Fumarase
kann aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen. Zellen von Laetobacillus
brevis, Lactobacillus delbrückii oder Escherichia coli und vermahlene Massen derselben
werden vorzugsweise verwendet.The fumarase used in the method proposed according to the invention
can come from animals, plants and microorganisms. Cells of Laetobacillus
brevis, Lactobacillus delbrückii or Escherichia coli and ground masses of the same
are preferably used.
Die enzymatische Umsetzung zwischen dem Fumarsäuresalz und der Fumarase
kann vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 15 und 450C und bei einem pH-Wert
von etwa 5 - 8 erfolgen. Je nach der Art des verwendeten Fumarsäuresalzes kann die
Umsetzungszeit zwischen 16 Stunden und etwa 3 Tagen liegen.The enzymatic conversion between the fumaric acid salt and the fumarase
can preferably at a temperature between about 15 and 450C and at a pH value
from about 5 to 8. Depending on the type of fumaric acid salt used, the
Implementation time should be between 16 hours and around 3 days.
In dem folgenden Beispiel wird eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens erläutert, ohne daß dadurch der Erfindungsbereich eingeschränkt werden
soll., In loo ccm Wasser werden 1o g kristalline Fumarsäure suspensiert. Während
die erhaltene Suspension gerührt wird, wird zum Neutralisieren Calciumcarbonat anteilweise
zugesetzt. Beim 'Zugeben von etwa 9 g Calciumcarbonat wird ein pH-Jert von 5,8 erhalten.
Beim Erreichen dieses pH-Wertes wird ein größerer Anteil des wenig löslichen Calciumfumarats
in
Form von weißen, feinen Kristallen abgeschieden.In the following example, an embodiment of the invention
Process explained without thereby limiting the scope of the invention
should., 10 g of crystalline fumaric acid are suspended in 100 cc of water. While
the suspension obtained is stirred, calcium carbonate is partially neutralized
added. When about 9 g of calcium carbonate are added, a pH value of 5.8 is obtained.
When this pH value is reached, a larger proportion of the slightly soluble calcium fumarate is released
in
Deposited in the form of white, fine crystals.
Dann werden etwa o,2 g -- auf wasserfreien Zustand bezogen -- Zellen
von Lactobacillus brevis (Mileheäurebakterien, die zuvor in einem volumengleichen
Gemisch aus Nährstoffbouillon und Kojiextrakt etwa 3 Tage gezüchtet worden sind)
der getrennt hergestellten Suspension zugesetzt. Unter mäßigem Rühren wird diese
Suspension etwa 2o Stunden auf eine Temperatur von 25o C gehalten. Nach diesem Zeitraum
ist die Umsetzung beendet. Im Verlauf der Umsetzung erfährt das Aussehen der Suspension
keine besondere Veränderung, nur werden die kristallinen Teilchen der Abacheidung
etwas größer. Gleiche Ergebnisse werden erhalten, wenn Magnesium- oder Zinkfumarat
verwendet werden. Die erhaltene Abscheidung (15,5 g) hat einen Calciumfumarat-gehalt
von weniger als o,1 g.-Nie aus dem folgenden Versuch hervorgeht, besteht dieses
Abscheidung aus praktisch reinem Calcium-L-malats Eine bestimmte Menge der Abscheidung
wird in Wasser aufgeschwemmt und durch Zugeben einer geringen Menge Essigsäure gelöst.
Bei der Bestimmung der in der oben angegebenen Lösung enthaltenen Menge L-Äpfelsäure,
bei der die spezifische Drehung der Lösung in Gegenwart von Uranylacetat
gemessen wird, ist gefunden worden, daß die Menge der oben erhaltenen Abscheidung
1o,¢5 g L-Äpfelsäure
entspricht. Getrennt davon wird Calciummalat,
das aus L-Äpfelsäure hergestellt worden ist, als Ca(C4H405)2.H20 durch Bestimmen
des Kristallwassergehaltes identifiziert. Die theoretisch berechnete Menge betrug
16,o g, was mit dem experimentell gefundenen Wert von 15,5 g gut übereinstimmte.
Da die theoretische Ausbeute von i?pfelsäure aus 1o g Pumarsäure 11,6 g ist,. ist
bei dem Verfahren dieses Beispiels eine Ausbeute von 9o jo erhalten worden. Da Calcium-L-malat
(das o,6 g der L-Äpfelsäure entspricht) und Calciumfumarat (das mit o,1 g Fumarsäure
im Gleichgewicht steht) in der Lösung verbleiben, wird angenommen, daß die in dem
oben angegebenen Beispiel erhaltene Ausbeute die größtmögliche ist. Das Gemisch
der in der Lösung gelösten Calciumsalze kann nach dem Abzentrifugieren der Zellen
in dieser Form bei einem nächsten Ansatz verwendet werden, oder das Gemisch kann
nach dem Verdunsten der Lösung zwecks Gewinnung der Calciumsalze mit frischem Ausgangsmaterial
vermischt werden, wobei die mühsame und schwierige Trennung der Fumar- von der Äpfelsäüre
vermieden werden kann. Nach einem solchen Verfahren kann eine praktische Ausbeute
von loo ö verwirklicht werden.Then about 0.2 g - based on anhydrous state - cells of Lactobacillus brevis (mileheic acid bacteria which have previously been cultured in a mixture of nutrient broth and koji extract of the same volume for about 3 days) are added to the separately prepared suspension. This suspension is kept at a temperature of 25 ° C. for about 20 hours with moderate stirring. After this period, the implementation is complete. In the course of the reaction, the appearance of the suspension does not undergo any particular change, only the crystalline particles of the deposition become somewhat larger. The same results are obtained when using magnesium or zinc fumarate. The deposit obtained (15.5 g) has a calcium fumarate content of less than 0.1 g. The following experiment shows that this deposit consists of practically pure calcium L-malate. A certain amount of the deposit is suspended in water and dissolved by adding a small amount of acetic acid. When determining the amount of L-malic acid contained in the above solution, in which the specific rotation of the solution is measured in the presence of uranyl acetate, it was found that the amount of the deposit obtained above corresponds to 10.5 g of L-malic acid. Separately, calcium malate produced from L-malic acid is identified as Ca (C4H405) 2.H20 by determining the water of crystallization. The theoretically calculated amount was 16. og, which was in good agreement with the experimentally found value of 15.5 g. Since the theoretical yield of malic acid from 10 g pumaric acid is 11.6 g. a yield of 90% was obtained in the procedure of this example. Since calcium L-malate (which corresponds to 0.6 g of L-malic acid) and calcium fumarate (which is in equilibrium with 0.1 g of fumaric acid) remain in the solution, it is assumed that the yield obtained in the example given above is the is greatest possible. The mixture of the calcium salts dissolved in the solution can be used in this form for a next batch after the cells have been centrifuged off, or the mixture can be mixed with fresh starting material after the solution has evaporated for the purpose of obtaining the calcium salts, whereby the laborious and difficult separation of the Fumaric acid can be avoided. A practical yield of 100,000 can be realized by such a process.