DE1300895B - Process for the biochemical production of 5'-inosic acid - Google Patents
Process for the biochemical production of 5'-inosic acidInfo
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- DE1300895B DE1300895B DE1966K0058379 DEK0058379A DE1300895B DE 1300895 B DE1300895 B DE 1300895B DE 1966K0058379 DE1966K0058379 DE 1966K0058379 DE K0058379 A DEK0058379 A DE K0058379A DE 1300895 B DE1300895 B DE 1300895B
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Description
1 21 2
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur bio- an Produkt beträchtlich verringert. Wenn jedoch dieThe invention relates to a method for reducing bio-based product considerably. However, if the
chemischen Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Menge an Mangan innerhalb der genannten Konzen-chemical production of 5'-inosinic acid by the amount of manganese within the stated concentration
Züchten eines Mikroorganismus in einem üblichen trationen geregelt wird, wird eine gute Produkt-Cultivating a microorganism in a usual trationen becomes a good product
Hypoxanthin enthaltenden Nährmedium. ausbeute erhalten. Es muß jedoch noch erwähntNutrient medium containing hypoxanthine. yield obtained. It still needs to be mentioned, however
Aus der britischen Patentschrift 979141 ist bereits 5 werden, daß diese zuletzt genannte gute Produktdie biochemische Herstellung von 5'-Inosinsäure durch ausbeute nur dann erhalten wird, wenn auch die zu-Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlen- lässigen definierten Mengen der anderen drei Metallhydrate, Stickstoffsubstanzen und Mineralsalze ent- ionen zugegen sind. Schließlich ist zu bemerken, daß haltenden Nährmedium bekannt, wobei beim Einsatz in dem Falle, daß die vorhandene Calciummenge von 5°/o Maltose 2,3 mg/ml 5'-Inosinsäure erhalten io unterhalb der angemessenen zulässigen Menge liegt, werden. die angesammelte Produktmenge selbst dann geringerFrom the British patent specification 979141 it is already 5 that this last-mentioned good product die biochemical production of 5'-inosinic acid by yield is obtained only if the too-breeding of microorganisms in a carbon, defined amounts of the other three metal hydrates, Nitrogen substances and mineral salts are present. Finally, it should be noted that holding nutrient medium known, when used in the event that the amount of calcium present 2.3 mg / ml 5'-inosinic acid obtained from 5% maltose is below the appropriate allowable amount, will. the amount of product accumulated even then is less
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wird, wenn die vorhandene Manganmenge für die An-An object of the present invention is a method when the amount of manganese present for the
zur biochemischen Herstellung von 5'-Inosinsäure, Sammlung optimal ist.for the biochemical production of 5'-inosinic acid, collection is optimal.
wodurch sich eine höhere Ausbeute an 5'-Inosinsäure Die in Verbindung mit den obengenannten Mikroerzielen läßt. 15 Organismenstämmen zu verwendenden zulässigenwhich results in a higher yield of 5'-inosinic acid die in connection with the above-mentioned micro-goals leaves. 15 organism strains to be used
Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die 5'-Inosin- Mengen der Metallionen lassen sich daher nur durchAccording to the invention it has been found that the 5'-inosine amounts of the metal ions can therefore only be passed through
säure in höherer Ausbeute erhalten werden kann, wenn bestimmte Konzentrationen oder Konzentrations-acid can be obtained in higher yield if certain concentrations or concentration
man bestimmte Mikroorganismen in Gegenwart von bereiche definieren. Unter diesen Metallen übento define certain microorganisms in the presence of areas. Practice under these metals
bestimmten Metallionen und bei ganz bestimmten äußerst geringe Mengen an Mn++ einen besonders Konzentrationen dieser Metallionen in einem sonst 20 großen Einfluß auf die Produktausbeute aus.certain metal ions and with very certain extremely small amounts of Mn ++ a particular concentration of these metal ions with an otherwise great influence on the product yield.
üblichen Hypoxanthin enthaltenden Nährmedium Es ist also ersichtlich, daß das Mengenverhältnisusual hypoxanthine-containing nutrient medium It can therefore be seen that the quantitative ratio
züchtet. der vier Metallionen zueinander eine wichtige Rollebreeds. of the four metal ions to each other play an important role
Das Verfahren zur biochemischen Herstellung von spielt und daß nur bei Einhaltung der bestimmtenThe process for the biochemical production of plays and that only with compliance with the specific
5'-Inosinsäure durch Züchten eines Mikroorganismus Mengenverhältnisse bemerkenswert große Produktin einem hierfür üblichen, Hypoxanthin enthaltenden 25 mengen angesammelt werden können.5'-inosinic acid by cultivating a microorganism in proportions of remarkably large product a customary, hypoxanthine-containing 25 amounts can be accumulated.
Nährmedium ist nun erfindungsgemäß dadurch ge- Die folgenden Beispiele dienen der ErläuterungAccording to the invention, the nutrient medium is now thereby The following examples serve to illustrate
kennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wenn nicht andersindicates that one Brevibacterium ammoniagenes of the process according to the invention. If not otherwise
ATCC15750 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 10 bis angegeben, beziehen sich die Prozentangaben aufATCC15750 in the presence of 2 mg / 1 Fe ++, 10 to indicated, the percentages relate to
30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++und 100 bis 300 μg/l Zn++, das Gewicht, bezogen pro Liter Nährmedium. Die Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 bzw. 30 Angaben über die angesammelten Mengen der30 μg / l Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca ++ and 100 to 300 μg / l Zn + +, the weight per liter of nutrient medium. The Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 or 30 information on the accumulated amounts of
ATCC 6871 in Gegenwart von 3 mg/1 Fe++, 20^g/l 5'-Inosinsäure (IMP) beziehen sich auf mg :ccm inATCC 6871 in the presence of 3 mg / 1 Fe + +, 20 ^ g / l 5'-inosinic acid (IMP) refer to mg: ccm in
Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 250 μg/I Zn++, Brevibac- Form von IMP-Na2 · 7V2 H2O.Mn + +, 2.7 mg / 1 Ca + + and 250 g / I Zn ++, Brevibac- form of IMP-Na 2 · H 2 O. 7V 2
terium ammoniagenes ATCC 6872 in Gegenwart von . .terium ammoniagenes ATCC 6872 in the presence of. .
2,5 mg/1 Fe++ 10 bis 60 μg/^ Mn++ 2,7m mg/I Ca++ B e 1 s ρ 1 e 1 12.5 mg / 1 Fe ++ 10 to 60 μg / ^ Mn ++ 2.7m mg / I Ca ++ B e 1 s ρ 1 e 1 1
und 40 bis 300 μg/l Zn++, Micrococcus sodenensis 35 Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15750and 40 to 300 μg / l Zn ++, Micrococcus sodenensis 35 It becomes Brevibacterium ammoniagenes ATCC15750
ATCC15932 in Gegenwart von 12 mg/1 Fe++, 0,28 gezüchtet. Die Bakterien werden zunächst in einemATCC15932 grown in the presence of 12 mg / 1 Fe ++, 0.28. The bacteria are first in one
bis 2,8 mg/1 Mn++, 1,4 mg/1 Ca++ und 10 bis 50 μg/l Impf medium gezüchtet, das 2°/0 Glucose, eine Lösungto 2.8 mg / 1 Mn + +, 1.4 mg / 1 Ca ++ and 10 to 50 g / l seed medium grown, the 2 ° / 0 glucose, a solution
Zn++, Aspergillus sojae 16320 in Gegenwart von eines Aminosäuregemisches (je 70 μg/l der folgendenZn ++, Aspergillus sojae 16320 in the presence of an amino acid mixture (70 μg / l each of the following
2 mg/1 Fe++, 1,5 bis 15 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und Aminosäuren: Glycin, L-Alanin, L-Asparaginsäure,2 mg / 1 Fe ++, 1.5 to 15 μg / l Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca ++ and amino acids: glycine, L-alanine, L-aspartic acid,
10 bis 150μg/l Zn++, Brevibacterium ammoniagenes 40 L-Typtophan, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Histidin,10 to 150μg / l Zn ++, Brevibacterium ammoniagenes 40 L-typtophan, L-phenylalanine, L-proline, L-histidine,
ATCC15187 in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 10 bis L-Lysin, L-Arginin, L-Valin, L-Leucin und L-Isoleu-ATCC15187 in the presence of 2 mg / 1 Fe ++, 10 to L-lysine, L-arginine, L-valine, L-leucine and L-isoleu-
30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++und 100 bis 300 μg/l Zn++ ein), 0,1 °/0 K2HPO4, 0,03 % MgSO4 · 7H2O, 0,25%30 μg / l Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca ++ and 100 to 300 μg / l Zn ++ a), 0.1 ° / 0 K 2 HPO 4 , 0.03% MgSO 4 7H 2 O, 0, 25%
oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC15312 in NaCl, 0,0005 % FeSO4, O^g/ccm MnSO4-4H2O,or Brevibacterium ammoniagenes ATCC15312 in NaCl, 0.0005% FeSO 4 , O ^ g / ccm MnSO 4 -4H 2 O,
Gegenwart von 2 mg/I Fe++, 30 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 30 μg/l Biotin, 2 μg/ccm /9-Alanin, 1 μg/ccm Thiamin-Presence of 2 mg / l Fe ++, 30 μg / l Mn ++, 2.7 mg / 1 30 μg / l biotin, 2 μg / ccm / 9-alanine, 1 μg / ccm thiamine
Ca++und 100 μg/l Zn++im Nährmedium züchtet. 45 hydrochloric und 0,2% Harnstoff enthält. Der pH-Ca ++ and 100 μg / l Zn ++ grows in the nutrient medium. Contains 45 hydrochloric and 0.2% urea. The pH
Um dem Nährmedium die genannten Mengen der Wert des Impfmediums wird vor der SterilisierungTo give the nutrient medium the stated amounts the value of the inoculation medium is made before the sterilization
Metallionen einzuverleiben, ist es erforderlich, de- auf 7,3 eingestellt. Der Harnstoff wird gesondert vonTo incorporate metal ions, it is necessary to set de- to 7.3. The urea is separated from
finierte Mengen dieser Ionen in Form der Metall- den anderen Bestandteilen sterilisiert und zu demDefined quantities of these ions in the form of the metal sterilized and the other components
sulfate oder -chloride zuzugeben. In Fällen, wo ein sterilisierten Impfmedium gegeben. Die Mikroorga-add sulfates or chlorides. In cases where a sterilized inoculation medium is given. The microorganism
Teil dieser Metalle, wie z. B. Mangan oder Zink, als 50 nismen werden in dem sterilisierten ImpfmediumPart of these metals, such as B. manganese or zinc, as 50 nisms are in the sterilized inoculation medium
Verunreinigung in anderen Bestandteilen des Nähr- 24 Stunden bei einer Temperatur von 3O0C gezüchtet, mediums enthalten ist, wie z. B. als VerunreinigungContamination in other components of the nutrient is grown 24 hours at a temperature of 3O 0 C, medium is contained, such as. B. as an impurity
von Kaliumphosphat und Magnesiumsalzen, brauchen Das verwendete Fermentationsmedium hat die fol-of potassium phosphate and magnesium salts, need The fermentation medium used has the following
diese Ionen dem Medium nicht besonders zugegeben gende Grundzusammensetzung:these ions are not particularly added to the medium basic composition:
zu werden. Wie die obengenannten Zahlwerte zeigen, 55 10% Glucose,to become. As the above numerical values show, 55 10% glucose,
sind die zu verwendenden zulässigen Mengen an Man- 0. 'are the permissible quantities of Man- 0 to be used . '
gan und Zink bemerkenswert geringer als diejenigen 1^ '° K2HrO4,gan and zinc remarkably lower than those 1 ^ '° K 2 HrO 4 ,
der anderen beiden Metalle, so daß die Mengen dieser 1,2% KH2PO4,of the other two metals, so that the amounts of these 1.2% KH 2 PO 4 ,
Ionen, die als Verunreinigung in den Bestandteilen ^ 20/ MgSO · 7H OIons present as an impurity in the components ^ 20 / MgSO · 7H O
eines Nährmediums enthalten sind, in einigen Fällen 60 . . *' 2 'of a nutrient medium, in some cases 60. . * ' 2 '
ausreichen. Unter diesen beiden Metallen ist die zu 30 μg/l Biotin,sufficient. Among these two metals is the 30 μg / l biotin,
verwendende Menge an Mangan besonders gering, 10 μg/ccm/S-Alanin,The amount of manganese used is particularly low, 10 μg / ccm / S-alanine,
hat jedoch nichtsdestoweniger einen bedeutsamen .however, has a significant one nonetheless.
Einfluß auf das Wachstum der Mikroorganismen- 5 ^'ccm Thiammhydrochlond,Influence on the growth of microorganisms - 5 ^ ' ccm thiamm hydrochloride,
stamme und die Produktausbeute. Wenn die Menge 65 4,5 mg/cem Hypoxanthin. an Mangan die zulässige Grenze überschreitet, wirdand the product yield. If the amount is 65 4.5 mg / cem hypoxanthine. of manganese exceeds the permissible limit
das Wachstum der Mikroorganismenstämme so über- Fe++, Mn++ und Zn++ werden in Form ihrer Sulfatethe growth of the microorganism strains so over- Fe ++, Mn ++ and Zn ++ are in the form of their sulfates
mäßig beschleunigt, daß sich die angesammelte Menge und Ca++ in Form von CaCl2 in verschiedenen Kon-moderately accelerated that the accumulated amount and Ca ++ in the form of CaCl 2 in different con-
zentrationen zugegeben. Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird mit 5 n-NaOH auf 8,5 eingestellt. Nach der Sterilisation des Mediums wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, zu dem Fermentationsmedium in einer solchen Menge gegeben, daß die Konzentration 0,6 % in bezug auf das Fermentationsmedium beträgt.concentrations added. The pH of the fermentation medium is adjusted to 8.5 with 5N NaOH. After the medium has been sterilized, urea, which has been sterilized separately, becomes too added to the fermentation medium in such an amount that the concentration is 0.6% with respect to the fermentation medium is.
Die Impf kultur wird zu dem Fermentationsmedium in einer Menge von 10 Volumprozent gegeben. Das Fermentationsmedium wird dann in verschiedene 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegossen. Es wird dann durch aerobe Schüttelkultur bei einer Temperatur von 3O0C gezüchtet. Nach 96stündigem Züchten haben sich die in Tabelle I angegebenen Mengen IMP in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.The inoculum is added to the fermentation medium in an amount of 10 percent by volume. The fermentation medium is then poured into various 250 cc Erlenmeyer flasks. It is then grown by aerobic shaking culture at a temperature of 3O 0 C. After 96 hours of cultivation, the amounts of IMP shown in Table I have accumulated in the fermentation liquor.
Es wird Brevibacteriumammoniagenes ATCC15751 gezüchtet. Die Herstellung der Impfkultur und die Fermentation werden unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 3 mg/1 Fe++, 20 jxg/1 Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 250 pg/i Zn++ durchgeführt. 4,0 mg/ccm Hypoxanthin werden zu dem Fermentationsmedium zu Beginn des Züchtens zugesetzt. Nach 96stündigemZüchtenwerden 17,6 mg/ccm IMP in der Kulturlösung angesammelt gefunden.Brevibacteriumammoniagenes ATCC15751 is grown. The preparation of the seed culture and the fermentation under the same conditions as in Example 1 using 3 mg / 1 Fe ++, 20 JXG / 1 Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca ++ and 250 pg / performed i Zn + +. 4.0 mg / cc hypoxanthine is added to the fermentation medium at the start of the cultivation. After 96 hours of cultivation, 17.6 mg / cc IMP is found accumulated in the culture solution.
Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 gezüchtet. Die Züchtung wird unter den gleichen Züchtungsbedingungen wie im Beispiel 1 vorgenommen, mit der Ausnahme, daß 3,0 mg/ccm Hypoxanthin zu Beginn der Züchtung zugegeben und die im Beispiel 2 genannten Mengen an Fe++, Mn++, Ca++ und Zn++ verwendet werden. Nach 96stündigem Züchten haben sich 10,8 mg/ccm IMP in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt.Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871 is grown. The cultivation is carried out under the same culturing conditions as in Example 1, except that 3.0 mg / cc hypoxanthine added at the beginning of the culture and the quantities referred to in Example 2 of Fe ++, Mn + +, Ca ++, and Zn ++ can be used. After 96 hours of cultivation, 10.8 mg / cc IMP has accumulated in the fermentation liquid.
Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 gezüchtet. Die Züchtung wird unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 1 % Fleischextrakt sowie 1 % Pepton in dem Impfmedium an Stelle der Lösung des Aminosäuregemisches verwendet und 5 mg/ccm Hypoxanthin zu Beginn zu dem Fermentationsmedium gegeben werden. Die Mengen an IMP, die sich nach 120stündigem Züchten angesammelt haben, sind in Tabelle II angegeben.It becomes Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 bred. The cultivation is carried out under the same conditions as in Example 1, with the Exception that 1% meat extract and 1% peptone in the inoculation medium instead of the solution of the amino acid mixture and 5 mg / cc hypoxanthine are added to the fermentation medium at the beginning. The amounts of IMP that are obtained after 120 hours Cultures have accumulated are given in Table II.
Micrococcus sodenensis ATCC15 932 wird gezüchtet. Es wird zunächst in einem Impfkulturmedium gezüchtet, das 2% Glucose, 0,7 % Caseinaminosäuren, 0,03% MgSO4 · 7H2O, 0,1% K2HPO4, 0,001% FeSO4-OH2O, 1 μg/ccm MnSO4 · 4H2O, 30μg/l Biotin und 0,2% Harnstoff enthält. Der pH-Wert des Impfkulturmediums wird vor der Sterilisierung auf 7,3 eingestellt. Der Harnstoff wird gesondert von den anderen Bestandteilen sterilisiert und zu dem sterilisierten Impfmedium gegeben.Micrococcus sodenensis ATCC15 932 is grown. It is first grown in a seed culture medium containing 2% glucose, 0.7% casein amino acids, 0.03% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.1% K 2 HPO 4 , 0.001% FeSO 4 -OH 2 O, 1 μg / ccm MnSO 4 · 4H 2 O, 30 μg / l biotin and 0.2% urea. The pH of the inoculum culture medium is adjusted to 7.3 prior to sterilization. The urea is sterilized separately from the other components and added to the sterilized inoculation medium.
Die Grundzusammensetzung des verwendeten Fermentationsmediums ist wie folgt:The basic composition of the fermentation medium used is as follows:
10 % Glucose,10% glucose,
0,6% K2HPO4,0.6% K 2 HPO 4 ,
0,6% KH2PO4,0.6% KH 2 PO 4 ,
0,6% MgSO4-7H2O,
30 μg/l Biotin,0.6% MgSO 4 -7H 2 O,
30 μg / l biotin,
2 mg/ccm Hypoxanthin.2 mg / cc hypoxanthine.
Fe++, Mn++, Ca++ und Zn++ werden (in den in Tabelle III genannten Mengen) in verschiedenen Konzentrationen zu dem Fermentationsmedium gegeben. Diese Ionen werden in Form ihrer Sulfate zugegeben, mit Ausnahme Ca++, das als CaCl3 zugesetzt wird. Nach der Sterilisierung des Fermentationsmediums wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, hinzugegeben. Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 1. Fe + +, Mn ++, Ca + + and Zn ++ is added (in the above-mentioned quantities in Table III) at various concentrations to the fermentation medium. These ions are added in the form of their sulfates, with the exception of Ca ++, which is added as CaCl 3. After the fermentation medium has been sterilized, urea, which has been separately sterilized, is added. The other growing conditions are the same as in Example 1.
Die Mengen an IMP, die sich in der Kulturflüssigkeit nach 96stündigem Züchten angesammelt haben, sind in Tabelle III angegeben.The amounts of IMP that have accumulated in the culture fluid after 96 hours of culture, are given in Table III.
Z,ö O Ö
Z, ö
Aspergillus sojae ATCC 16320 wird als Impf stamm verwendet. Bei diesem Stamm handelt es sich um eineAspergillus sojae ATCC 16320 is used as the vaccine strain. This trunk is a
L 300 895L 300 895
Mutante, die von Histidin abhängig ist. 50 ecm einer Lösung, die 8 % Saccharose, 0,1% K2HPO4, 0,005% MgSO4-7H2O, 0,2% NaNO3, 0,05%KCl, 0,001% FeSO4 · 7H2O, 0,1%L-Histidinhydrochlorid und 8,2 mg/ccm IMP und 0,15 mg/ccm Hypoxanthin in dem Fermentationsmedium angesammelt haben.Mutant dependent on histidine. 50 ecm of a solution containing 8% sucrose, 0.1% K 2 HPO 4 , 0.005% MgSO 4 -7H 2 O, 0.2% NaNO 3 , 0.05% KCl, 0.001% FeSO 4 7H 2 O, 0.1% L-histidine hydrochloride and 8.2 mg / cc IMP and 0.15 mg / cc hypoxanthine have accumulated in the fermentation medium.
Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15187 gezüchtet. Hierbei handelt es sich um einen Mutantenstamm, der von Adenin abhängig ist. Es wird das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß weiterhin 100 μg/ccm Adenin zu-It becomes Brevibacterium ammoniagenes ATCC15187 bred. This is a mutant strain that is dependent on adenine. It will be the same inoculation medium used as in Example 1, with the exception that 100 μg / ccm of adenine continue to be added
2% Agar enthält, wird in einem Rouxkolben fest werden gelassen, um ein festes Medium zu erhalten, in dem der Mikroorganismenstamm konserviert werden kann.Contains 2% agar, is allowed to solidify in a Roux flask to obtain a solid medium, in which the microorganism strain can be preserved.
30 ecm sterilisierten Wassers werden in den Rouxkolben gegossen, der die vorliegenden Mikroorganis- io gegeben werden. Es wird weiterhin auch das gleiche men mit den ausreichend gebildeten Sporen enthält, Fermentationsmedium wie im Beispiel 1 verwendet,30 ecm of sterilized water are put into the roux flask poured to be given the present microorganism. It will continue to be the same Men with the sufficiently formed spores contains fermentation medium as in Example 1,
doch werden zusätzlich 70 μg/ccm Adenin zugegeben.but an additional 70 μg / cc adenine are added.
Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 1.
In der folgenden Tabelle V sind die Mengen IMP angegeben, die sich in der Fermentationsflüssigkeit
nach 120stündigem Züchten angesammelt haben.The other growing conditions are the same as in Example 1.
Table V below shows the amounts of IMP that have accumulated in the fermentation liquor after growing for 120 hours.
wodurch eine gleichmäßige Sporensuspension hergestellt wird. 1 ecm der so hergestellten Suspension wird in einen 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegeben, der 30 ecm Fermentationsmedium enthält.whereby a uniform spore suspension is produced. 1 ecm of the suspension produced in this way is placed in a 250 cc Erlenmeyer flask containing the Contains 30 ecm fermentation medium.
des Fermentations-of the fermentation
Die Grundzusammensetzung
mediums ist wie folgt:The basic composition
mediums is as follows:
10% Glucose,
1% K2HPO4,
IV2 % KH2PO4,
1% MgSO4-7H2O,
0,3 % Caseinaminosäuren, 250 μg/ccm L-Histidinhydrochlorid,
5 μg/ccm ß-Alanin,10% glucose,
1% K 2 HPO 4 ,
IV 2 % KH 2 PO 4 ,
1% MgSO 4 -7H 2 O,
0.3% casein amino acids, 250 μg / ccm L-histidine hydrochloride, 5 μg / ccm ß-alanine,
2 g/ccm Thiaminhydrochlorid,2 g / ccm thiamine hydrochloride,
3 mg/ccm Hypoxanthin.3 mg / cc hypoxanthine.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums wird vor der Sterilisierung auf 8,0 eingestellt. In dieses Grundmedium werden Fe++, Mn++ und Zn++ in Form ihrer Sulfate und Ca++ in Form von CaCl2 in verschiedenen Konzentrationen gegeben. Weiterhin wird Harnstoff, der gesondert sterilisiert worden ist, in einer Menge von 0,6 Gewichtsprozent zu dem Fermentationsmedium gegeben. The pH of the fermentation medium is adjusted to 8.0 before sterilization. Fe + +, Mn + + and Zn ++ in the form of their sulfates and Ca + + in the form of CaCl 2 are added in various concentrations to this basic medium. Furthermore, urea, which has been separately sterilized, is added to the fermentation medium in an amount of 0.6 percent by weight.
Es wirdBrevibacterium ammoniagenes ATCC15 312, ein ebenfalls von Adenin abhängiger Mutantenstamm, gezüchtet. Es wird das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß weiterhin 10 μg/ccm Adenin zugegeben werden. Es wirdIt becomes Brevibacterium ammoniagenes ATCC15 312, a mutant strain also dependent on adenine. The same inoculation medium is used as in the Example 1 is used, with the exception that 10 μg / cc adenine are still added. It will
Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen 40 weiterhin das gleiche Fermentationsmedium wie im wie im Beispiel 1. Die Mengen an IMP, die sich in der Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß keinThe other cultivation conditions are the same as in the fermentation medium as in Example 1. The amounts of IMP used in Example 1, with the exception that none
Adenin zugegeben wird. Weiterhin werden dieAdenine is added. Furthermore, the
Kulturfiüssigkeit in den verschiedenen Kolben nach 120stündigem Züchten angesammelt haben, sind in Tabelle IV angegeben.Culture fluid accumulated in the various flasks after 120 hours of cultivation are in Table IV given.
Es wird der gleiche Impf stamm wie im Beispiel 6 verwendet. Weiterhin wird auch das gleiche Fermentationsmedium wie im Beispiel 6 verwendet, mit der Ausnahme, daß an Stelle von Hypoxanthin 3,0 mg/ccm Adenin zugegeben und 2 mg/1 Fe++, 1,5 μg/l Mn++, 2,7mg/1 Ca++ und 10μg/l Zn++ verwendet werden. Nach 120stündigem Züchten wird gefunden, daß sich erfindungsgemäß zugesetzten Metallionen in folgenden Mengen zugegeben: 2mg/1 Fe++, 30μ§/1 Mn++, 2,7 mg/1 Ca4"+ und 100μg/l Zn++. Die anderen Züchtungsbedingungen sind die gleichen wie im Beispiel 1.The same vaccine strain as in Example 6 is used. Furthermore, the same fermentation medium is used as in Example 6, with the exception that instead of hypoxanthine, 3.0 mg / ccm adenine is added and 2 mg / 1 Fe ++ , 1.5 μg / l Mn + +, 2, 7mg / 1 Ca + + and 10μg / l Zn + + can be used. After 120 hours of cultivation it is found that metal ions added according to the invention are added in the following amounts: 2 mg / 1 Fe + +, 30 μ§ / 1 Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca 4 "+ and 100 μg / l Zn ++ same as in example 1.
Als Ergebnis wird gefunden, daß sich nach 120stündigem Züchten 9,5 mg/ccm IMP in der Fermentationsflüssigkeit angesammelt haben.As a result, it is found that after 120 hours of cultivation, 9.5 mg / cc of IMP is in the fermentation liquid have accumulated.
Aus den obigen Beispielen ist ersichtlich, daß erfindungsgemäß sowohl künstliche Nährmedien als auch natürliche Medien geeignet sind, solange sie nur die für das Wachstum der verwendeten Mikro-Organismenstämme wesentlichen Nährstoffe enthalten. Diese Nährstoffe sind wohlbekannt. Dazu gehören Substanzen, wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, anorganische Verbindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen verwertet werden. Als Quellen für Kohlenstoff können z. B. erwähnt werden Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen usw., oder irgendwelche anderen geeigneten Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Glutaminsäure usw. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Gemisch aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden.From the above examples it can be seen that according to the invention both artificial nutrient media as Natural media are also suitable, as long as they are only necessary for the growth of the micro-organism strains used contain essential nutrients. These nutrients are well known. This includes Substances such as sources of carbon, sources of nitrogen, inorganic compounds and the like, which are used in suitable quantities by the microorganism used. As sources for Carbon can e.g. B. Mentioned are carbohydrates such as glucose, fructose, maltose, sucrose, Starch, starch hydrolyzate, molasses etc., or any other suitable carbon sources such as z. B. glycerin, mannitol, sorbitol, organic acids, glutamic acid, etc. These substances can either can be used alone or in the form of a mixture of two or more of these substances.
Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder Aminosäuren bzw. Aminosäuregemische oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Peoton, Fischmehl, Caseinhydrolysate, Caseinaminosäuren, Fischextrakte, Reiskleieextrakt usw., verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Anorganische Verbindungen außer den Metallionen der vorliegenden Erfindung, die zu dem Nährmedium gegeben werden können, sind unter anderem Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat oder Natriumchlorid usw. Weiterhin müssen dem Medium Nährstoffe zugesetzt werden, die für das Wachstum des jeweils verwendeten Mikroorganismen- ao Stammes wesentlich sind, wie z. B. Histidin oder Adenin. Wie in der Fermentationstechnik üblich, können dem Medium weiterhin wachstumsfördernde Mittel, wie z. B. Biotin oder Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure, zugesetzt werden. »5A wide variety of inorganic or organic salts or Connections such as B. urea or ammonium salts, such as ammonium chloride, ammonium sulfate, Ammonium nitrate, ammonium phosphate, etc., or amino acids or amino acid mixtures or natural nitrogenous substances, such as. B. Corn steeple, yeast extract, meat extract, Peoton, fish meal, Casein hydrolyzates, casein amino acids, fish extracts, rice bran extract, etc. can be used. These substances can either be used alone or in the form of mixtures of two or more these substances are used. Inorganic compounds other than the metal ions of the present Invention that can be added to the nutrient medium include magnesium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, Potassium monohydrogen phosphate or sodium chloride, etc. Furthermore, nutrients must be added to the medium which are necessary for the Growth of the microorganisms used in each case ao strain are essential, such. B. histidine or Adenine. As usual in fermentation technology, the medium can continue to promote growth Means such as B. biotin or amino acids, such as. B. glutamic acid or aspartic acid can be added. »5
Die Fermentation wird unter in der Fermentationstechnik üblichen aeroben Bedingungen, wie z. B. in Form einer aeroben Schüttelkultur oder unter Rühren einer Submerskultur unter Einführung von sterilisierter Luft, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40°C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt. The fermentation is carried out under aerobic conditions customary in fermentation technology, such as, for. Am Form of an aerobic shaking culture or, with stirring, a submerged culture with the introduction of sterilized Air, at a temperature of about 20 to 40 ° C and a pH of about 5 to 9.
Nach Beendigung der Fermentation kann die 5'-Inosinsäure nach üblichen Verfahren aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert werden, wie z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.After the fermentation has ended, the 5'-inosinic acid can be removed from the Fermentation liquid are isolated, such as. B. by treatment with ion exchange resins, extraction with solvents, precipitation with metal salts, chromatography and the like.
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