DE1257725B - Process for the production of an acid-resistant digestive enzyme preparation - Google Patents
Process for the production of an acid-resistant digestive enzyme preparationInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung eines säurefesten Verdauungsenzym-Präparates Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung !eines säurefesten Verdauungsenzym-Präparates mit proteolytischer und amylolytischer Wirkung durch ;Züchten von Aspergillus oryzae auf Weizenkleie in saurem Milieu.Process for the preparation of an acid-fast digestive enzyme preparation The invention relates to a method for producing an acid-resistant digestive enzyme preparation with proteolytic and amylolytic effects through; cultivation of Aspergillus oryzae on wheat bran in an acidic environment.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 auf angesäuerter Weizenkleie züchtet, die gebildeten Enzyme aus der Fermentationsmasse mit Wasser extrahiert, die Enzyme durch Zusatz von Zinkchlorid oder Kobaltchlorid stabilisiert, den Extrakt einengt und den Enzymkomplex mit Tsopropanol ausfällt.The inventive method is characterized in that one breeds the Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 strain on acidified wheat bran, the enzymes formed are extracted from the fermentation mass with water, the enzymes stabilized by the addition of zinc chloride or cobalt chloride, the extract narrows and the enzyme complex precipitates with isopropanol.
Erfindungsgemäß werden somit säurefeste Verdauungsenzyme erhalten, die im Magen Eiweiß und Stärke ohne Anwenden von säureneutralisierenden Mitteln verdauen.According to the invention, acid-fast digestive enzymes are thus obtained, the protein and starch in the stomach without the use of acid neutralizing agents digest.
Bisher sind gewöhnlich Pankreatin und Malzdiastase als Verdauungsheilmittel verabreicht worden. Pancreastrypsin und Amylase sind in. neutralen und schwach alkalischen Medien sehr wirksam. Diese Wirksamkeiten werden jedoch durch Inberührungbringen mit Magensäure zum überwiegenden Teil zerstört. Eine Wiederaktivierung dieser Enzyme tritt in dem Darmtrakt nicht ein (K. O k a z a k i: Yakuxaigaku (Japan), Bd.16, S.15 [1957], Chemical Abstracts, Bd.51, S.9738 [1957]). Malzdiastase ist gegenüber dieser Säure empfindlicher. Deshalb werden diese Enzyme zusammen mit einem Säure neutralisierenden Mittel, wie Natriumbicarbonat, eingenommen.So far, pancreatin and malt diastasis are commonly used as digestive remedies been administered. Pancreastrypsin and amylase are in. Neutral and weakly alkaline Media very effective. However, these effects are brought about by touching Destroyed for the most part with gastric acid. A reactivation of these enzymes does not enter the intestinal tract (K. O k a z a k i: Yakuxaigaku (Japan), vol. 16, P.15 [1957], Chemical Abstracts, vol.51, p.9738 [1957]). Malt diastasis is opposite more sensitive to this acid. This is why these enzymes work together with an acid neutralizing agents, such as sodium bicarbonate.
Obgleich von einigen Ärzten viele günstige Eigenschaften der Säure neutralisierenden Mittel anerkannt werden, sind ebenfalls Nebenwirkungen dieser Mittel, wie Sodbrennen, Alkalosis, Verstopfung, Diarrhoe, Unterdrückung der bakterienabtötenden Wirkung des Magens usw., unter anderem diskutiert worden. (C. F u c h s : Drug and Cosmetic Industry, Juni, S. 692 [1949]). Das Säure neutralisierende Mittel ist für diejenigen Patienten nicht geeignet, die an zu hohem Blutdruck, Nierenstörungen usw. leiden und die somit kein Natriumsalz zu sich nehmen dürfen. Von diesem Gesichtspunkt aus wurden Untersuchungen zum Zweck der Herstellung säurefester proteolytischer und amylolytischer Enzyme unternommen.Although by some doctors many beneficial properties of the acid Neutralizing agents are recognized as side effects of these Means, such as heartburn, alkalosis, constipation, diarrhea, suppression of the bactericidal Effect of the stomach, etc., among other things, has been discussed. (C. F u c h s: Drug and Cosmetic Industry, June, p. 692 [1949]). The acid neutralizing agent is for not suitable for those patients suffering from high blood pressure, kidney disorders etc. and who are therefore not allowed to consume the sodium salt. From this point of view from studies for the purpose of producing acid-fast proteolytic ones and amylolytic enzymes.
Die erste Stufe bei der diesbezüglichen Forschungsarbeit bestand darin, Pilze daraufhin zu untersuchen, welche derselben von Natur aus säurefeste Verdauungsenzyme zu bilden vermögen. Pilze der Aspergillus spezies sind seit langem zur Herstellung von Saki, Shochu (japanischer destillierter Wein), Miso (Bohnenpaste) und Shoyu (Soya) in Japan angewandt worden. Unter denselben ist eine Reihe von Stämmen bekannt gewesen, die die stark proteolytischen oder amylolytischen Enzyme bilden. Als Heilmittel sind die Pilze der Klasse Aspergillus oryzae zur Herstellung von Verdauungszubereitungen angewandt worden, seitdem Dr. T a k a m i n e die »Takadiastase« hergestellt hat. Es wurde erkannt, daß der optimale pH-Wert für diese Enzyme in einem pH-Bereich von 6 bis 8 liegt. Somit lassen sich aus diesen bekannten Pilzen die erfindungsgemäß herstellbaren säurefesten Enzyme nicht erhalten. Um die die säurefesten Enzyme bildenden Pilze zu isolieren, wurden wilde Pilze bei einer Temperatur von 30'C auf einem Koji-Agar-Kulturmedium bei einem eingestellten pH-Wert von 2 bis 3 gezüchtet und sodann hauptsächlich aus diesem Medium eine reine Aspergillus-Gattung gezogen. Aus diesen Stämmen wurde ein neuer Stamm erhalten, der für die erfindungsgemäßen Zwecke zufriedenstellend war, wie es durch die Prüfungen bezüglich seiner amylolytischen und proteolytischen Wirksamkeiten gezeigt wird.The first step in this research was to examine fungi to determine which of them are naturally capable of producing acid-fast digestive enzymes. Aspergillus mushrooms have long been used to make saki, shochu (Japanese distilled wine), miso (bean paste) and shoyu (soya) in Japan. Among them, a number of strains have been known which produce the highly proteolytic or amylolytic enzymes. As a remedy, the Aspergillus oryzae class of mushrooms has been used in the manufacture of digestive preparations since Dr. T akamine produced the "takadiastase". It has been found that the optimal pH for these enzymes is in a pH range of 6-8. Thus, the acid-fast enzymes which can be prepared according to the invention cannot be obtained from these known fungi. In order to isolate the fungi which produce the acid-fast enzymes, wild fungi were cultured at a temperature of 30 ° C. on a koji agar culture medium at an adjusted pH of 2 to 3 and then a pure Aspergillus genus was mainly grown from this medium . From these strains, a new strain was obtained which was satisfactory for the purposes of the invention, as shown by the tests for its amylolytic and proteolytic activities.
Nach dem Klassifizierungsverfahren von T h o m und R a p e r und dem Klassifizierungsverfahren von Sakaguchi-Yamada(K.Sakaguchiund Y a m a d a: J. of Agri. Chem. Soc. [in Japan], Bd. 20, S. 65, 141 [1944]) zeigt sich der neue Stamm als eine Abwandlung des Aspergillus oryzae.According to the classification procedure of T h o m and R a p e r and the Classification method of Sakaguchi-Yamada (K.Sakaguchi and Y a m a d a: J. of Agri. Chem. Soc. [in Japan], vol. 20, Pp. 65, 141 [1944]) shows the new strain as a modification of the Aspergillus oryzae.
Es wurde weiterhin gefunden, daß das Enzym aus dem Stamm viele interessante enzymologische Eigenschaften zeigt. Es wurde in den vergangenen Jahren gezeigt, daß aus Pilzen gewonnene Amylase die folgenden Substanzen enthält: Amylase, Amyloglucosidase und Transglucosidase (J. N i k u n i: Mein. Inst. Sci. and Ind. Research, Osaka University, Bd. 9, S. 194 [1952]; Chem.- Abst.; Bd. 47, S.10568 [1953]; H. O k a s a k i: Symposia an enzyme Chem. [in Japan], Bd. 9, S. 43 [1954]; K. K i t a h a r a: J. Fermentation Technology, Bd. 27, S. 254 [1949]) und daß jeder Pilz des Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori, Rhizopus tonkinensis und Rhizopus peka das Enzym bildet, das an die drei verschiedenen Aktivitäten der Amylase,_ der Amyloglucosidase und der Transglucosidase aufweist, und der Stärke verzuckernde Typus jedes Pilzes in Abhängigkeit von dem anteilmäßigen Verhältnis der obigen drei Enzyme schwankt.It was also found that the enzyme from the strain many interesting shows enzymological properties. It has been shown in the past few years that amylase obtained from mushrooms contains the following substances: amylase, amyloglucosidase and transglucosidase (J. Ni k u n i: Mein. Inst. Sci. and Ind. Research, Osaka University, Vol. 9, p. 194 [1952]; Chem. Vol. 47, p. 10568 [1953]; H. O k a s a k i: Symposia an enzyme Chem. [in Japan], Vol. 9, p. 43 [1954]; K. K i t a h a r a: J. Fermentation Technology, Vol. 27, p. 254 [1949]) and that every fungus des Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Aspergillus awamori, Rhizopus tonkinensis and Rhizopus peka forms the enzyme involved in the three different activities of the Amylase, _ the amyloglucosidase and the transglucosidase, and the starch saccharifying type of each mushroom depending on the proportion of the above three enzymes varies.
O k a z a k i (H. O k a z a k i: J. Agr. Chem. §0C. [in Japan], Bd. 24, S. 88 [1950]; Chem. Abstr., Bd. 45, S. 9115 [1951]) berichtete, daß fünf Verzuckerungstypen in Pilzen beobachtet wurden, und gemäß einem weiteren Bericht von ihm (H. O k a z a k i: Arch. Biochem. and Biophys., Bd. 63, S. 322 [1956]; Chem. Abstr., Bd.50, S.15652 [1956]) bildet Aspergillus oryzae große Mengen von Amylase, so daß die Verzuckerungsgeschwindigkeit in dem ersten Stadium ansteigt und nicht im Verlauf der Zeit zunimmt. Im allgemeinen war - die amylolytische Wirkung des Aspergillus-oryzae-Enzyms in einem Medium mit einem pH-Wert unter 3 schlecht, da die Amyloglucosidase säurefest und die Amylase nicht säurefest ist. Es wurde gefunden, daß der aus der Natur isolierte neue Stamm morphologisch zu Aspergillus oryzae gehört, jedoch in neutralem Medium ein verzuckerndes Verhalten zeigt, das demjenigen in- F i g. 1 gezeigten Verhalten des Aspergillus-awamori-Typus ähnlich ist, und in saurem Medium verdaut das Enzym Stärke besser, als es das gewöhnliche Aspergillus-oryzae-Enzym, wie in der F i g. 2 gezeigt, tut.O k a z a k i (H. O k a z a k i: J. Agr. Chem. §0C. [In Japan], Vol. 24, p. 88 [1950]; Chem. Abstr., Vol. 45, p. 9115 [1951]) reported that five types of saccharification observed in mushrooms, and according to a further report by him (H. O k a z a k i: Arch. Biochem. and Biophys., Vol. 63, p. 322 [1956]; Chem. Abstr., Vol. 50, S.15652 [1956]) Aspergillus oryzae forms large amounts of amylase, so that the saccharification rate increases in the first stage and does not increase with time. In general was - the amylolytic effect of the Aspergillus oryzae enzyme in a medium with a pH value below 3 bad, because the amyloglucosidase is acid-fast and the amylase is not acid-proof. It was found that the new strain isolated from nature Morphologically belongs to Aspergillus oryzae, but a saccharifying one in a neutral medium Behavior shows that the person in F i g. 1 behavior of the Aspergillus awamori type shown is similar, and in acidic medium the enzyme digests starch better than ordinary Aspergillus oryzae enzyme as shown in FIG. 2 shown does.
Im Jahre 1954 berichtete Y o s h i d a (F. Y o s h i -d a: J. Agr. Chem. Soc. Japan, Bd. 28, S. 66 [1954]), daß der optimale pH-Wert für die Wirkung der Protease in der Nähe von pH 6,5 bezüglich gelblichgrüner Aspergillus, wie Aspergillus oryzae, und in der Nähe von pH 2,5 bezüglich schwärzlicher Aspergillus, wie Aspergillus niger, auf Grund der Bestimmung der proteolytischen Wirkungen verschiedener Aspergillus-Enzyme festgestellt wurde, die aus Weizenkleiekoji-Extrakten erhalten wurden.- Im Jahre 1955 beobachtete Kageyama (K.Kageyama: J. Fermentation Technology, Bd. 33, S. 109 [1955]; Chern. Abstr., Bd.49, S.13589 [1955]), daB Stämme des Aspergillus oryzae hauptsächlich aus Reiskoji säureaktive Protease bilden, jedoch bilden dieselben Stämme ebenfalls aus Weizenkleiekoji alkalischaktive Protease.In 1954, Y o s h i d a (F. Y o s h i-d a: J. Agr. Chem. Soc. Japan, Vol. 28, p. 66 [1954]) that the optimal pH value for the effect the protease near pH 6.5 with respect to yellowish green Aspergillus such as Aspergillus oryzae, and near pH 2.5 for blackish Aspergillus, such as Aspergillus niger, based on the determination of the proteolytic effects of various Aspergillus enzymes obtained from wheat bran koji extracts In 1955, Kageyama (K. Kageyama: J. Fermentation Technology, Vol. 33, p. 109 [1955]; Chern. Abstr., Vol. 49, p. 13589 [1955]) that strains of Aspergillus oryzae mainly form acid-active protease from Reiskoji, but form the same Also from wheat brankoji strains alkaline-active protease.
Wie weiter oben ausgeführt, bilden aus Weizenkleiekoji die Stämme der Aspergillus-oryzae-Gruppe hauptsächlich alkalischaktive Protease und die Aspergillus-niger-Gruppe säureaktive Protease. Es wurde jedoch die neue Tatsache festgestellt, daß das Enzym des erfindungsgemäß isolierten Stammes stark säureaktive Protease zusätzlich zu in neutralem Medium aktiver Protease enthält, wie in den F i g. 3 und 4 gezeigt. Durch die oben aufgeführten Tatsachen, und zwar die eingehenden Untersuchungen bezüglich der Klassifizierung auf Grund morphologischer Studien bezüglich des charakteristischen Verhaltens in der Enzymwirksamkeit wurde der neuartige festgestellte Stamm als neuer Stamm unter der Gruppe Aspergillus oryzae festgestellt und demselben der Name Aspergillus oryzae TPR-18 gegeben. Dieser Aspergillus oryzae TPR-18 ist im Applied Microorganism Institute of Tokyo University unter der Bezeichnung JAM 2800 hinterlegt worden.As explained above, the stems are made from wheat brankoji the Aspergillus oryzae group mainly alkaline-active protease and the Aspergillus niger group acid active protease. However, the new fact was found that the enzyme of the strain isolated according to the invention in addition to strongly acid-active protease contains protease active in neutral medium, as shown in FIGS. 3 and 4 shown. By the facts listed above, namely the in-depth investigations regarding the classification based on morphological studies regarding the characteristic Behavior in enzyme activity, the novel strain was identified as new Tribe found under the group Aspergillus oryzae and the same the name Aspergillus oryzae TPR-18 given. This Aspergillus oryzae TPR-18 is in the Applied Microorganism Institute of Tokyo University under the designation JAM 2800.
Die zweite Stufe bestand bei den ausgeführten Untersuchungen darin, die optimalen Bedingungen des Mediums und des Kulturverfahrens festzustellen, durch das Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 ausreichend zum Wachsen gebracht werden kann, um so eine ausreichende Menge des säurefesten Enzyms zu erhalten. Es wurde jeweils Weizenkleie, Ölkuchen, Sojabohnenküchen und Kopramehl für das Kulturmedium angewandt, wobei es sich zeigte, daß Weizenkleie für diesen Zweck die geeignetste Substanz ist; wobei weiterhin festgestellt wurde, daß die Ausbeute an säureaktiver Protease durch Zugabe einer geringen Säuremenge zu dem Kulturmedium erhöht wird.The second stage in the investigations carried out consisted of determine the optimal conditions of the medium and the culture process the Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 can be made to grow sufficiently so as to obtain a sufficient amount of the acid-fast enzyme. It was each wheat bran, oil cake, soybean cake and copra flour for the culture medium and wheat bran was found to be the most suitable for this purpose Substance is; it was further found that the yield of acid-active Protease is increased by adding a small amount of acid to the culture medium.
Das in Anwendung gebrachte Kulturmedium wurde zunächst in geeigneter Weise mit 0,2 n-HCl, entsprechend 20 bis 50 Gewichtsprozent der Weizenkleie, angefeuchtet und sodann 1 bis 2 Stunden bei 100°C sterilisiert. Nach der Sterilisierung ließ man abkühlen, und das Nährmedium wurde sodann mit Pilzsporen beimpft. Man ließ die Kultur bei 30°C 40 bis 50 Stunden wachsen.The culture medium used was initially suitable Way with 0.2 n-HCl, corresponding to 20 to 50 percent by weight of the wheat bran, moistened and then sterilized at 100 ° C for 1 to 2 hours. Left after sterilization to cool, and the nutrient medium was then inoculated with fungal spores. They left the Grow culture at 30 ° C for 40 to 50 hours.
Bei der dritten Stufe der ausgeführten Untersuchungen wurde das Verfahren zur Herstellung des durch Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 gebildeten säurefesten Enzyms bezüglich des Kostenfaktors und der Zweckmäßigkeit untersucht.At the third stage of the investigations carried out, the procedure was for the production of the acid-resistant produced by Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 Enzyme examined with regard to the cost factor and the expediency.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde eine Stabilisierung der Enzymlösung durch die Zugabe von Zinkchlorid und Cobaltchlorid bewirkt. Es kam das folgende Verfahren in Anwendung: Das in einer ausreichenden Menge Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 gebildete Kulturmedium wurde mit Wasser extrahiert und sodann der Extrakt, zu dem Zink» Chlorid oder Cobaltchlorid mit einer Konzentration von 10-3 Mol zugegeben worden war, auf einen pH-Bereich von 5 bis 6 eingestellt und sodann bis zur Hälfte seines Volumens unter verringertem Druck bei 30°C eingeengt. Bei dem obigen Verfahren wurde das Enzym bei dem Einengen der Extrakte nicht zerstört, und das verringerte Volumen der Extraktlösung bedingte bei den sich anschließenden Verfahren eine Zweckmäßigkeit sowohl in Verfahrenshinsicht als auch bezüglich des Verbrauchs von Reagenzien.In the method according to the invention, a stabilization of the Enzyme solution caused by the addition of zinc chloride and cobalt chloride. It came that the following methods are used: That in a sufficient amount Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 formed culture medium was extracted with water and then the extract to which zinc »chloride or cobalt chloride with a concentration of 10-3 moles had been added, adjusted to a pH range of 5 to 6 and then concentrated to half its volume under reduced pressure at 30 ° C. In the above procedure, the enzyme was not destroyed when the extracts were concentrated, and the reduced volume of the extract solution caused the subsequent Procedure an expediency both in terms of procedure and with regard to the Consumption of reagents.
Der nächste Verfahrensschritt bestand darin, das in der eingeengten Extraktlösung vorliegende Enzym auszufällen. Dies wurde an Stelle von Äthanol mit dem 11/2fachen Volumen an Isopropanol bewirkt und das Enzym nach dem Zentrifugieren unter verringertem Druck getrocknet. Dieses Produkt wurde als Wernasea bezeichnet.The next step in the process was that of the narrowed Extract solution to precipitate the enzyme present. This was using in place of ethanol 11/2 times the volume of isopropanol and the enzyme after centrifugation dried under reduced pressure. This product was called Wernasea.
Im folgenden ist eine Beschreibung der Verdauungsfähigkeit des säurefesten Verdauungsenzyms (Veraase) beschrieben, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden ist.The following is a description of the digestive ability of the acid-fast Digestive enzyme (Veraase) described that according to the method according to the invention has been made.
Das Enzym stellte ein Pulver geringfügiger grauer oder bräunlichweißer Farbe dar, war nahezu geruchlos, besaß einen charakteristischen Geschmack, war in Wasserlöslich und in fast allen organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen, Äthern, Acetonen, unlöslich.The enzyme made a powder slightly gray or brownish-white Color, was almost odorless, possessed a characteristic taste, was in Soluble in water and in almost all organic solvents such as alcohols, ethers, Acetones, insoluble.
Die pH-Aktivitätskurve von Protease und Amylase bei 40'C und ihre Abhängigkeit von der Enzymkonzentration, der Reaktionszeit bei verschiedenem pH und beim optimalen pH eines säurestabilen Aufschlußenzyms wurden mit Vernase und Aspergillus-saitoi-Enzym verglichen.The pH-activity curve of protease and amylase at 40'C and their Dependence on the enzyme concentration, the reaction time at different pH and at the optimal pH of an acid-stable digestion enzyme, Vernase and Aspergillus saitoi enzyme compared.
Die F i g. 5, 6 und 7 veranschaulichen die überragende enzymatische Aktivität der Vernase.The F i g. 5, 6 and 7 illustrate the paramount enzymatic Vernase activity.
(a) Protease-Aktivität bei verschiedenen pH-Werten Vernase wirkt bei einem pH-Wert von 3 bis 6 optimal und hat im Vergleich zum Aspergillus-saitoi-Enzym bei einem pH-Wert von 3 die gleiche, bei einem pH-Wert von 6 jedoch eine zwei- bis dreimal höhere Aktivität.(a) Protease activity at different pH values Vernase is involved a pH value of 3 to 6 and has in comparison to the Aspergillus saitoi enzyme at a pH value of 3 the same, at a pH value of 6 a two to one three times higher activity.
Vernase aus Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 weist zwei Aktivitäts-Peaks hinsichtlich der proteolytischen Wirkung bei pH 3 und pH 6 auf und liegt mit seinen Werten mit steigendem pH über den Werten der anderen Kurven.Vernase from Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800 has two activity peaks with regard to the proteolytic effect at pH 3 and pH 6 and lies with his Values with increasing pH above the values of the other curves.
Andererseits besitzt das Aspergillus-saitoi-Enzym nur einen Aktivitäts-Peak bei einem Wert von pH 3 und zeigt außerdem die für ein Aufschlußenzym nachteilige Tendenz, in seiner Aktivität bei pH-Werten über pH 3 rasch nachzulassen (F i g. 5).On the other hand, the Aspergillus saitoi enzyme has only one peak of activity at a value of pH 3 and also shows the disadvantageous for a digestion enzyme Tendency to decrease rapidly in its activity at pH values above pH 3 (Fig. 5).
(b) Amylaseaktivität bei verschiedenen pH-Werten F i g. 8 und die untenstehende Tabelle dienen zur Erläuterung der Einheit-pro-Gramm-Werte von Vernase und Aspergillus-saitoi-Enzym bei pH-Werten von 3, 5 und B.(b) Amylase activity at different pH values F i g. 8 and the The table below is used to explain Vernase's unit-per-gram values and Aspergillus saitoi enzyme at pH values of 3, 5 and B.
Die Amylaseaktivität von Vernase ist höher als die von Aspergillus-saitoi-Enzym.
Es ist allgemein bekannt, daß ein Enzym eine spezifische Wirkung gegenüber einem spezifischen Substrat aufweist. Da die Unterschiede der Spezifitäten die Aktivitäten und enzymatische Wirkung ändern, ist daher die Anwendbarkeit eines Enzyms durch eine Spezifität bedingt.It is well known that an enzyme has a specific effect against it having a specific substrate. Because the differences in specificities are the activities and change enzymatic action, therefore, the applicability of an enzyme is due requires a specificity.
Protease von Vernase zeigt eine niedere Aufschlußwirkung als die von Aspergillus saitoi bei einem Gehalt an Enzym von 0,010/" bei einem pH-Wert von 3 (F i g. 6 (I)).Vernase protease shows a lower disintegration effect than that of Aspergillus saitoi with an enzyme content of 0.010 / "at a pH of 3 (Fig. 6 (I)).
Jedoch zeigt Vernase eine höhere Aufschlußwirkung als Aspergillus-saitoi-Enzym bei allen anderen Konzentrationen mit Ausnahme von 0,010/,. However, Vernase shows a higher disintegration effect than Aspergillus saitoi enzyme at all other concentrations with the exception of 0.010 /,.
Wie aus F i g. 6 und 7 hervorgeht, sind die Reaktionsweise und die Spezifität dem Aspergillus-saitoi-Enzym überlegen.As shown in FIG. 6 and 7, the reaction mode and the Specificity superior to the Aspergillus saitoi enzyme.
Es wird erwartet, daß Vernase zahlreiche Peptide und Kohlehydrate aufschließt und reagiert und eine höhere Affinität zu den Peptiden und Kohlehydrater als das andere Enzym besitzt. Diese Prüfungen (F i g. 6 und 7) wurden wie :folgt durchgeführt (colorimetrische Methode nach F o '1 i n) Substrate . . . . . . ... . . . . . . . . 1,2 °/o und 2,1 °/o Milch-Kasein Enzymkonzentration . . . . . 0;01, 0,05 und 0,1 °/o pH-Wert . . . . . . . : : : . . -. .-. . 3 und -6 Reaktionstemperatur ...... 40°C Reaktionszeit ............ 5 Stunden 5 ml von 0,44 m-Trichloressigsäure werden in 6 ml der reagierenden Proben zugegeben und 30 Minuten gehalten und 0,55 m-Sodalösung und 1 ml von Folins Phenol-Reagens verdünnt mit 2 Volumteilen von Wasser in 2 ml der Mischung zugegeben.It is expected that Vernase will break down and react numerous peptides and carbohydrates and have a higher affinity for the peptides and carbohydrates than the other enzyme. These tests (FIGS. 6 and 7) were carried out as follows (colorimetric method according to F o '1 in) substrates. . . . . . ... . . . . . . . 1.2% and 2.1% milk-casein enzyme concentration. . . . . 0; 01, 0.05 and 0.1% pH value. . . . . . . :::. . -. .-. . 3 and -6 reaction temperature ...... 40 ° C reaction time ............ 5 hours 5 ml of 0.44 m-trichloroacetic acid are added to 6 ml of the reacting samples and held for 30 minutes and 0.55 M soda solution and 1 ml of Folin's phenol reagent diluted with 2 parts by volume of water in 2 ml of the mixture.
Optische Dichte: 660 m#t.Optical density: 660 m # t.
Beispiel für die Herstellung des säurefesten Verdauungsenzyms Es wurden 10 kg Weizenkleie mit 5 kg 0,2 n-HCl vermischt und sodann 2 Stunden bei 100°C sterilisiert. Man ließ sodann auf etwa 30°C abkühlen und impfte mit 100 g Sporen des Aspergillus oryzae (TPR-18) JAM 2800.Example of the production of the acid-fast digestive enzyme Es were 10 kg of wheat bran mixed with 5 kg of 0.2 N HCl and then sterilized at 100 ° C. for 2 hours. It was then allowed to cool to about 30 ° C. and inoculated with 100 g of Aspergillus spores oryzae (TPR-18) JAM 2800.
Diese beimpfte Kojimasse wurde aufgeteilt und in sterilisierte Schalen gebracht und bei einer Temperatur von 25 bis 30'C in einer Kojikammer (MURO) gehalten.This inoculated koji mass was divided up and placed in sterilized dishes and kept in a koji chamber (MURO) at a temperature of 25 to 30 ° C.
Bei der ersten Stufe der Entwicklung wurde die Kojnnasse in einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100 °/o gehalten und nach dem Beimpfen 10 bis 15 Stunden gerührt. Nach dem Rühren wurde nach 24 Stunden getrocknet und das Verfahren nach insgesamt etwa 50 Stunden unterbrochen.In the first stage of development, the bunk was in one relative humidity of 100% and after inoculation 10 to 15 Stirred for hours. The stirring was followed by drying after 24 hours and the process interrupted after a total of about 50 hours.
Die Kojimasse wurde 2 Stunden in 30 kg Wasser eingeweicht und sodann vermittels einer Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde zentrifugiert und 261 der klaren Enzymlösung erhalten.The koji mass was soaked in 30 kg of water for 2 hours and then filtered by means of a filter press. The filtrate was centrifuged and 261 the clear enzyme solution obtained.
Zu der Lösung wurden 6,2 g Cobaltchlorid gebracht und mit Essigsäure oder Natriumacetat auf einen pH-Bereich von 5 bis 6 eingestellt und anschließend unter verringertem Druck bei einer Temperatur von 30°C bis auf 141 eingeengt.To the solution, 6.2 g of cobalt chloride was added and added with acetic acid or sodium acetate adjusted to a pH range of 5 to 6 and then concentrated to 141 under reduced pressure at a temperature of 30 ° C.
Die eingeengte Lösung wurde im Eisschrank auf 0°C abgekühlt. 211 99°/oiger Isopropylalkohol, der vorher abgekühlt worden war, wurden langsam zu der Enzymlösung gegossen. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert und mit 11 Isopropylalkohol im Mischer gewaschen, abgetrennt und im Vakuumtrockner getrocknet. Die Ausbeute an Enzym betrug 405 g.The concentrated solution was cooled to 0 ° C. in the refrigerator. 211 99% Isopropyl alcohol that had previously been cooled slowly became the enzyme solution poured. The precipitate formed was centrifuged off and treated with 11 isopropyl alcohol washed in the mixer, separated and dried in a vacuum dryer. The yield of enzyme was 405 g.
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