DE1205092B - Process for the production of 3-keto-steroids saturated in ring A by microbiological means - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von im Ring A gesättigten 3-Keto-steroiden auf mikrobiologischem Wege Es ist bereits bekannt, A4m3-Keto-steroide durch Behandlung mit Mikroorganismen in entsprechende Al,4-3-Keto-steroide umzuwandeln. Zusammenstellungen über hierbei verwendete Mikroorganismen finden sich z. B. in Angewandte Chemie, 1957, S. 461, und Experientia, 1955, S. 469 und 478. Es ist ferner bekannt, daß Bacillus sphaericus und Corynebacterium simplex A6-3-Hydroxy-steroide in die entsprechenden ,dI,4-3-Keto-steroide überführen können. In dieser Reaktion verläuft die l(2)-Dehydrierung parallel zur Oxydation der 3-Hydroxylgruppe, so daß sich auf diese Weise keine in l(2)-Stellung gesättigten 3-Ketosteroide herstellen lassen.Process for the production of 3-keto-steroids saturated in ring A by microbiological means. It is already known to convert A4m3-keto-steroids into corresponding A1, 4-3-keto-steroids by treatment with microorganisms. There are compilations of the microorganisms used here, for example. B. in Angewandte Chemie, 1957, p. 461, and Experientia, 1955, p. 469 and 478. It is also known that Bacillus sphaericus and Corynebacterium simplex A6-3-hydroxy-steroids in the corresponding, dI, 4-3 -Keto-steroids. In this reaction, the l (2) -dehydrogenation runs parallel to the oxidation of the 3-hydroxyl group, so that no 3-keto steroids saturated in the l (2) position can be produced in this way.

Es wurde nun gefunden, daß die Gruppe von Mikroorganismen, die sonst zur 1-Dehydrierung von Steroiden verwendet wird, überraschenderweise keine 1-Dehydrierung ausführt, wenn man als Ausgangsmaterial 3-Hydroxy-steroide verwendet, von deren C-Atom 5 keine Doppelbindung ausgeht, die also weder im Ring A noch in 5(6)-Stellung ungesättigt sind. Nach der Erfindung wird in einem solchen Fall lediglich die 3-Hydroxylgruppe zur 3-Ketogruppe oxydiert. Die Reaktion bleibt dann stehen, eine Dehydrierung in 1-Stellung findet nicht statt.It has now been found that the group of microorganisms which is otherwise used for 1-dehydrogenation of steroids surprisingly does not carry out 1-dehydrogenation if 3-hydroxy steroids are used as starting material, from the carbon atom 5 of which there is no double bond, which are therefore unsaturated neither in ring A nor in the 5 (6) position. According to the invention, only the 3-hydroxyl group is oxidized to the 3-keto group in such a case. The reaction then stops and dehydration in the 1-position does not take place.

, Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von im Ring A gesättigten 3-Ketosteroiden, das darin besteht, daß man ein 3-Hydroxysteroid, das weder im Ring A noch in 5(6)-Stellung eine Doppelbindung besitzt, durch an sich bekannte Behandlung mit solchen Mikroorganismen oder daraus isolierten Enzymen, die bekanntermaßen A4-3-Keto-steroide bzw. Asm3-Hydroxy-steroide in AI,4-3-Keto-steroide umwandeln, zu dem entsprechenden, im Ring A gesättigten 3-Keto-steroid oxydiert. , Object of the invention is thus a process for preparing saturated in ring A 3-ketosteroids, which consists in reacting a 3-hydroxysteroid, which neither in 5 (6) position, a double bond in the ring A, by per se known treatment with such microorganisms or enzymes isolated therefrom, which are known to convert A4-3-keto-steroids or Asm3-hydroxy-steroids into AI, 4-3-keto-steroids, to the corresponding 3-keto- saturated in ring A steroid oxidized.

Für das Verfahren nach der Erfindung lassen sich alle Mikroorganismen verwenden, die in 4- oder 5-Stellung ungesättigte Steroide mit einer Sauerstoff-Funktion in 3-Stellung in die entsprechenden ,J 1, 4-3-Keto-steroide umzuwandeln vermögen. So kann die Umsetzung z. B. mit Mikroorganismen aus folgenden Gattungen durchgeführt werden: Alternaria, Didymella, Caloneetria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Fusarium, Ophiobolus, Septomyxa, Vermicularia, Acetobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Baeillus, Corynebacterium, Erysipelothrix, Listeria, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Pseudomonas oder Streptomyces. Besonders gute Ergebnisse lassen sich bei Verwendung von Bacillus sphaericus, Corynebacterium simplex und Pseudomonas testosteroni erzielen.For the process according to the invention, all microorganisms can be used which are capable of converting steroids unsaturated in the 4- or 5-position with an oxygen function in the 3-position into the corresponding, I 1, 4-3-keto steroids. So the implementation z. B. can be carried out with microorganisms from the following genera: Alternaria, Didymella, Caloneetria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Fusarium, Ophiobolus, Septomyxa, Vermicularia, Acetobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Baeillus, Corynebacterium, Erysipelothrix, Protaminiapora, Nromonosacterium, Listeria, Micocacteria Pseudomonas or Streptomyces. Particularly good results can be achieved when using Bacillus sphaericus, Corynebacterium simplex and Pseudomonas testosteroni.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich nach den üblichen Methoden der Fermentationstechnik durchführen. Im allgemeinen züchtet man den Mikroorganismus in einer geeigneten Nährlösung unter aeroben Bedingungen submers in Schüttelkolben oder Fermentern. Die Temperatur wird je nach den Bedürfnissen des verwendeten Organismus zwischen 20 und 35'C gehalten.The process according to the invention can be carried out according to the usual methods of fermentation technology. In general, the microorganism is cultured in a suitable nutrient solution under aerobic conditions submerged in shake flasks or fermenters. The temperature is kept between 20 and 35'C depending on the needs of the organism used.

Das umzuwandelnde Steroid wird zweckmäßig in einem mit Wasser mischbaren und für den Mikroorganismus wenig toxischen Lösungsmittel, wie Methanol, Aethanol, Aceton, Dimethylformamid oder Propylenglykol, zugegeben. Die Zugabe kann entweder zur unbeimpften Nährlösung oder auch zu der anwachsenden Kultur erfolgen. Darauf wird die Kultur zur Inkubation einige Zeit unter den gleichen Bedingungen gehalten. Es ist auch möglich, die Pilzkulturen vor der Zugabe der Steroide zu filtrieren und dann die Steroide mit der wäßrigen Suspension des Mycels zu inkubieren.The steroid to be converted is conveniently in a water miscible and solvents that are less toxic to the microorganism, such as methanol, ethanol, Acetone, dimethylformamide or propylene glycol are added. The addition can be either to the uninoculated nutrient solution or to the growing culture. Thereon the culture is kept under the same conditions for some time for incubation. It is also possible to filter the fungal cultures before adding the steroids and then incubating the steroids with the aqueous suspension of the mycelium.

Nach der Fermentation, die papier- oder dünnschichtchromatographisch verfolgt werden kann, werden die Steroide nach üblichen Methoden aus dem Kulturfiltrat abgetrennt. Vorzugsweise werden die Endprodukte mit organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Methylenehlorid oder Essigester, extrahiert. Statt durch Extraktion können die Steroide auch durch Adsorption, z. B. durch Zugabe von Aktivkohle, isoliert werden. Die Endprodukte werden hierbei nahezu quantitativ adsorbiert und nach der Filtration mit einem Lösungsmittel aus dem Filterkuchen eluiert. Gelegentlich ist es erforderlich, das erhaltene Gemisch der Steroide aufzutrennen, z. B. durch Chromatographie über Aluminiumoxyd, Silicagel oder Kieselgur. Als Ausgangsmaterial können Steroide der verschiedenen Steroidreihen verwendet werden, z. B. solche der Testan-, Androstan-, Pregnan-, 18- oder 19-nor-Androstan-, Cardenolid-, Bufadienolid-, Gallensäure- und Sapogenin-Reihe. Die Steroide können, ausgenommen in Ring A und in 5(6)-Stellung, Doppelbindungen enthalten, z. B. in einer oder mehreren der Stellungen 6, 7, 9(11), 11, 14, 15, 16, 17(20), 20, 20(22) oder 22. Ferner können die Ausgangsmaterialien Substituenten in einer oder mehreren der Stellungen 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 tragen. Als Substituenten kommen vor allem in Frage: Alkyl-, Alkyliden-, Hydroxy-, Oxo-, Oxido-, Amino-, Halogen-, Cyano-, Mereapto- oder Thiosubstituenten. Diese Substituenten können gegebenenfalls in funktionell abgewandelter Form vorliegen. So können Hydroxy-, Amino- und Mercaptogruppen alkyliert oder acyliert sein. An zwei benachbarten C-Atomen stehende Hydroxylgruppen können als cyclisches Ketal mit einer Carbonylverbindung vorliegen. Oxo-und Thiogruppen können ketalisiert sein oder als Enolacylat, Enoläther oder Enamin vorliegen.After the fermentation, which can be followed by paper or thin-layer chromatography, the steroids are separated from the culture filtrate using customary methods. The end products are preferably extracted with organic solvents such as chloroform, methylene chloride or ethyl acetate. Instead of extraction, the steroids can also be adsorbed, e.g. B. can be isolated by adding activated carbon. The end products are adsorbed almost quantitatively and, after filtration, eluted from the filter cake with a solvent. Occasionally it is necessary to separate the resulting mixture of steroids, e.g. B. by chromatography over aluminum oxide, silica gel or kieselguhr. As a starting material, steroids of the various steroid series can be used, e.g. B. those of the testan, androstan-, pregnan, 18- or 19-nor-androstan-, cardenolide, bufadienolide, bile acid and sapogenin series. The steroids can, except in ring A and in the 5 (6) position, contain double bonds, e.g. B. in one or more of the positions 6, 7, 9 (11), 11, 14, 15, 16, 17 (20), 20, 20 (22) or 22. Furthermore, the starting materials can have substituents in one or more of the positions 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 wear. Particularly suitable substituents are: alkyl, alkylidene, hydroxy, oxo, oxido, amino, halogen, cyano, merepto or thio substituents. These substituents can optionally be present in a functionally modified form. Hydroxy, amino and mercapto groups can be alkylated or acylated. Hydroxyl groups on two adjacent carbon atoms can be present as a cyclic ketal with a carbonyl compound. Oxo and thio groups can be ketalized or in the form of enol acylate, enol ether or enamine.

Besonders bevorzugte Ausgangsmaterialien für das Verfahren nach der Erfindung sind: Androsteron, 3-epi-Androsteron, 17x-Methylandrostan-3ß,17fl-diol, 17#x-Methyl-19-nor-androstan-3ß,17ß-diol, 5ß-Androsteron, Androstan-3,x,17ß-diol, Androstan-3fl,17ß-diol, Androstan-3fl-ol-16-on, Androstan-3fl,16ß-diol, 5ß-!Androstan-3oc,16ix,17ß-triol, 16-Androsten-3ß-ol, 16-Androsten-3x-ol und die entsprechenden 16- und 17-Ester, 5oc-Pregnan-3ß-ol-20-on, Pregnan-3oc,20,x-diol, Pregnan-11,20-dion-3x-ol, 5x-Pregnan-3x,20x-diol, 5cc-Pregnan-3ß,20cc-diol, Pregnan-3oc-ol-20-on, 5oc-Pregnan-3ß-ol-20-on, 5x-Pregnan-3(x-ol-20-on, 5x-Pregnan-3fl,20ß-diol, 5ß-Pregnan-3oc,6x-diol-20-on, 5oc-Pregnan-3ß,16x,20#-triol, Pregnan-3,x,17oc-diol-11,20-dion, 5o;-Pregnan-3fl,11fl,17,x,20ß,21-pentol, 5oc-Pregnan-20-on-3x,llß,17oc,21-tetrol, 5P-Pregnan-11,20-dion-3fl,17,x,21-triol, 5x-Pregnan-3ß,llß,20oc,21-tetrol, 5x-Pregnan-3fl,17,y,20ß,21-tetrol, 5x-Pregnan-3ß,17#x, 20cc-triol, 5x-Pregnan-3ß,21-diol-11,20-dion, 5x-Pregnan-20-on-3fl,11fl,21-triol und deren 21-Ester, Desoxycholsäure-methylester, 3x-Hydroxy-11-cholensäuremethylester, 5oc-Pregnan-11,20-dion-3ß,5,17oc,21-tetrol, 16cc-Methyl-pregnan-3fl-ol-20-on, Digitoxigenin, Periplogenin, Bufalin, epi-Sarmentogenin, Digoxigenin.Particularly preferred starting materials for the process according to the invention are: androsterone, 3-epi-androsterone, 17x-methylandrostane-3ß, 17fl-diol, 17 # x-methyl-19-nor-androstane-3ß, 17ß-diol, 5ß-androsterone , Androstan-3, x, 17ß-diol, Androstan-3fl, 17ß-diol, Androstan-3fl-ol-16-one, Androstan-3fl, 16ß-diol, 5ß-! Androstan-3oc, 16ix, 17ß-triol, 16-androsten-3ß-ol, 16-androsten-3x-ol and the corresponding 16- and 17-esters, 5oc-pregnan-3ß-ol-20-one, pregnan-3oc, 20, x-diol, pregnan-11 , 20-dione-3x-ol, 5x-pregnan-3x, 20x-diol, 5cc-pregnan-3β, 20cc-diol, pregnan-3oc-ol-20-one, 5oc-pregnan-3β-ol-20-one , 5x-Pregnan-3 (x-ol-20-on, 5x-Pregnan-3fl, 20ß-diol, 5ß-Pregnan-3oc, 6x-diol-20-on, 5oc-Pregnan-3ß, 16x, 20 # - triol, pregnan-3, x, 17oc-diol-11,20-dione, 5o; -pregnan-3fl, 11fl, 17, x, 20β, 21-pentol, 5oc-pregnan-20-one-3x, llβ, 17oc , 21-tetrol, 5P-pregnan-11,20-dione-3fl, 17, x, 21-triol, 5x-pregnan-3β, 11ß, 20oc, 21-tetrol, 5x-pregnan-3fl, 17, y, 20β , 21-tetrol, 5x-pregnan-3β, 17 # x, 20cc-triol, 5x-pregnan-3β, 21-diol-11,20-dione, 5x-pregna n-20-one-3fl, 11fl, 21-triol and its 21-esters, methyl deoxycholic acid, methyl 3x-hydroxy-11-cholenic acid, 5oc-pregnane-11,20-dione-3β, 5,17oc, 21-tetrol , 16cc-methyl-pregnan-3fl-ol-20-one, digitoxigenin, periplogenin, bufalin, epi-sarmentogenin, digoxigenin.

Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Verbindungen können entweder auf Grund ihrer physiologischen Wirksamkeit als Arzneimittel verwendet werden oder dienen als Zwischenprodukte zur Herstellung von Pharmazeutika. Beispiel 1 In einem 1-1-Erlenmeyerkolben mit 200nil einer Nährlösung aus 0,501, Hefeextrakt (mit Sörensen-Phosphat auf pH 6,8 gepuffert) wird eine Kultur von Corynebaeterium simplex als Schüttelkultur angezüchtet. Nach 16stündigem Wachstum bei 28'C werden 70 mg epi-Androsteron, gelöst in 4 nil Methanol, zugesetzt und bei gleicher Temperatur weitergeschüttelt. Nach 24 Stunden wird die Kulturlösung dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform ausgeschüttelt und die vereinigten Extrakte eingeengt. Nach Dünnschichtchromatogramm ist kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Der eingeengte Extrakt wird über eine kleine Säule Kieselgel filtriert, vom Lösungsmittel befreit und aus Äther-Pentan umkristallisiert. Schmelzpunkt des erhaltenen Androstan-3,17-dions 129 bis 130'C. The compounds produced by the process of the invention can either be used as medicaments because of their physiological activity or serve as intermediates for the production of pharmaceuticals. Example 1 A culture of Corynebaeterium simplex is grown as a shaking culture in a 1-1 Erlenmeyer flask with 200 μl of a nutrient solution of 0.501 yeast extract ( buffered to pH 6.8 with Sörensen phosphate). After 16 hours of growth at 28 ° C., 70 mg of epi-androsterone, dissolved in 4 nil of methanol, are added and the mixture is shaken at the same temperature. After 24 hours, the culture solution is extracted three times with the same volume of chloroform and the combined extracts are concentrated. According to the thin-layer chromatogram, no more starting material can be detected. The concentrated extract is filtered through a small column of silica gel, freed from the solvent and recrystallized from ether-pentane. Melting point of the androstane-3,17-dione obtained 129 to 130'C.

Beispiel 2 Ein Kleinfermenter mit 121 einer sterilen Nährlösung aus 10/, Hefeextrakt (mit Sörensen-Phosphat auf pH 6,8 gepuffert) wird mit 800 ml Schüttelkultur von Bacillus sphaericus beimpft. Die unter starkem Belüften und Rühren bei 28'C wachsende Kultur bekommt nach 17 Stunden einen Zusatz von 4 g Digitoxigenin in 200 rnl Methanol. Die Umsetzung wird dünnschichtehromatographisch verfolgt; 14 Stunden nach dem Zusatz ist kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen, sondern nur das weniger polare Umsetzungsprodukt. Der Ansatz wird nach 19 Stunden abgebrochen und dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform ausgerührt. Die vereinigten Extrakte werden -über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wird mit Petroläther behandelt; man dekantiert und kristallisiert den ungelösten Teil aus Essigester um: Schmelzpunkt des erhaltenen Digitoxigenons 200'C; 216 m#t, EI.. 430,5 (Äthanol); [x] +30' D (Chloroform); UV-Absorption in 96 0/,iger Schwefelsäure bei 339 und 410 m#t.Example 2 A small fermenter with 121 sterile nutrient solution of 10 % yeast extract ( buffered to pH 6.8 with Sörensen phosphate) is inoculated with 800 ml of Bacillus sphaericus shaking culture. The culture, which grows with vigorous aeration and stirring at 28 ° C., is given after 17 hours an addition of 4 g of digitoxigenin in 200 ml of methanol. The conversion is followed by thin-layer chromatography; 14 hours after the addition, no more starting material can be detected, only the less polar reaction product. The batch is terminated after 19 hours and stirred three times with the same volume of chloroform. The combined extracts are dried over sodium sulfate and, after filtration, freed from the solvent. The residue is treated with petroleum ether; the undissolved part is decanted and recrystallized from ethyl acetate: melting point of the digitoxigenone obtained 200'C; 216 m # t, EI .. 430.5 (ethanol); [x] +30 ' D (chloroform); UV absorption in 96 % sulfuric acid at 339 and 410 m # t.

Beispiel 3 In einem 1-1-Erlenmeyerkolben mit 200m1 einer Nährlösung aus 10/, Hefeextrakt, pH 6,5, wird eine Kultur von Bacillus sphaericus als Schüttelkultur angezüchtet. Nach 8stündigem Wachstum bei 28'C werden 70mg 17oc-Methyl-19-nor-androstan-3ß,17fldiol in 4 ml Methanol zugesetzt. 40 Stunden nach dem Zusatz wird die Kulturlösung dreimal mit 200 ml Chloroform ausgeschüttelt; der eingeengte Extrakt wird über eine kleine Säule Kieselgel filtriert, vom Lösungsmittel befreit und aus Essigester umkristallisiert. Das erhaltene 171x-Methyl-19-nor-androstan-17fl-ol-3-on schmilzt bei 145 bis 147'C.Example 3 A culture of Bacillus sphaericus is grown as a shaking culture in a 1-1 Erlenmeyer flask with 200 ml of a nutrient solution of 10 % yeast extract, pH 6.5. After 8 hours of growth at 28 ° C., 70 mg of 17oc-methyl-19-nor-androstane-3ß, 17fldiol in 4 ml of methanol are added. 40 hours after the addition, the culture solution is extracted three times with 200 ml of chloroform; the concentrated extract is filtered through a small column of silica gel, freed from the solvent and recrystallized from ethyl acetate. The resulting 171x-methyl-19-nor-androstan-17fl-ol-3-one melts at 145 to 147 ° C.

Beispiel 4 Analog Beispiel 1 werden einer Schüttelkultur von Corynebaeterium simplex 70 mg Pregnan-3oc-ol-20-on zugesetzt. Nach 20 Stunden Laufzeit wird analog Beispiel 1 mit Chloroform extrahiert und nach Umkristallisation aus Essigester reines Pregnan-3,20-dion erhalten. Schmelzpunkt 120 bis 122'C. Beispiel 5 Analog Beispiel 3 werden einer Schüttelkultur von Bacillus sphaericus 70mg Pregnan-20-on-3ß,llß,21-triol-21-acetat zugesetzt. Nach 40 Stunden wird mit Chloroform extrahiert und nach Umkristallisation aus Essigester reines Pregnan-llß,21-diol-3,20-dion-21-acetat erhalten. Schmelzpunkt 158'C.Example 4 Analogously to Example 1 , 70 mg of pregnan-3oc-ol-20-one are added to a shaking culture of Corynebaeterium simplex. After a running time of 20 hours, it is extracted with chloroform analogously to Example 1 and pure pregnane-3,20-dione is obtained after recrystallization from ethyl acetate. Melting point 120 to 122'C. Example 5 Analogously to Example 3 , 70 mg of pregnan-20-one-3β, 11β, 21-triol-21-acetate are added to a shaking culture of Bacillus sphaericus. After 40 hours, the mixture is extracted with chloroform and, after recrystallization from ethyl acetate, pure pregnan-11ß, 21-diol-3,20-dione-21-acetate is obtained. Melting point 158'C.

Beispiel 6 Analog Beispiel 1 werden einer Schüttelkultur von Corynebaeterium simplex 70 mg 5ß-Androstan-3p, 17ß-diol zugesetzt. Die Umsetzung ist nach 15 Stunden beendet; die Kulturlösung wird analog Beispiel 1 mit Chloroform extrahiert. Nach Umkristallisation aus Aceton-Wasser erhält man 37 mg reines 5fl-Androstan-17fl-ol-3-on vom F. 139 bis 140'C; [ix] T + 33' (Äthanol).Example 6 Analogously to Example 1 , 70 mg of 5β-androstane-3p, 17β-diol are added to a shaking culture of Corynebaeterium simplex. The reaction has ended after 15 hours; the culture solution is extracted analogously to Example 1 with chloroform. After recrystallization from acetone-water, 37 mg of pure 5fl-androstan-17fl-ol-3-one with a melting point of 139 to 140 ° C are obtained; [ix] T + 33 ' (ethanol).

Claims (2)

Patentanspräche: 1. Verfahren zur Herstellung von im Ring A gesättigten 3-Keto-steroiden auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 3-Hydroxy-steroid, das weder im Ring A noch in 5(6)-Stellung eine Doppelbindung besitzt, mit solchen Mikroorganismen oder daraus gewonnenen Enzymen bebrütet, die bekanntermaßen A44-Keto- bzw. A5-3-Hydroxy-steroide in Al,4#3-Keto-steroide umwandeln. Patent claims: 1. Process for the preparation of 3-keto-steroids saturated in ring A by a microbiological route, characterized in that a 3-hydroxy-steroid which has a double bond neither in ring A nor in the 5 (6) position, incubated with such microorganisms or enzymes obtained therefrom, which are known to convert A44-keto- or A5-3-hydroxy-steroids into Al, 4 # 3-keto-steroids. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus sphaericus oder Corynebacterium simplex verwendet. In Betracht gezogene Druckschriften: Experientia, Bd. 7 (1951), S. 81ff.; Journ. Am. Chem. Soc., Bd. 79 (1957), S. 2658. 2. The method according to claim 1, characterized in that one uses Bacillus sphaericus or Corynebacterium simplex. Publications considered: Experientia, Vol. 7 (1951), pp. 81ff .; Journ. At the. Chem. Soc. 79: 2658 (1957).