DE1155134B

DE1155134B - Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln aus Kollagenabbauprodukten

Info

Publication number: DE1155134B
Application number: DEF25921A
Authority: DE
Inventors: Dr Josef Schmidt-Thome; Dr Fritz Lindner
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1958-06-07
Filing date: 1958-06-07
Publication date: 1963-10-03

Description

Veifahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln aus Kollagenabbauprodukten Die Anwendung von Blutplasmaersatzmitteln ist von größter Bedeutung in Fällen, in denen menschliches Blut oder Plasma in der Form von Konserven nicht oder nicht ausreichend verfügbar ist. Ein solches Ersatzmittel muß hydrophile Kolloide enthalten, deren Molekülgröße so eingestellt ist, daß sie mindestens 12 bis 24 Stunden im Blutkreislauf verbleiben; der kolloidosmotische Druck muß etwa den gleichen Wert wie der des Blutplasmas haben; das Ersatzmittel soll nach einigen Tagen aus dem Blutkreislauf verschwunden und vollständig abgebaut oder ausgeschieden worden sein. Weiter ist es notwendig, daß ein solches Mttel frei von fiebererregenden und antigenen Eigenschaften und in jeder Beziehung gut verträglich ist.
Eine Reihe von Stoffen ist als Plasmaersatzmittel bekannt, z. B. tierisches Blutplasma, Gummiarabikum, Pektine, Polysaccharide, wie Dextrane oder Laevane, künstliche Kolloide, wie Polyvinylpyrrolidon oder Polyvinylalkohol. über das Schicksal dieser Stoffe im menschlichen Körper und ihre Ausscheidung oder Speicherung sowie über ihre antigene Wirkung besteht in den meisten Fällen noch keine Klarheit, so daß sie nicht immer unbedenklich anwendbar sind. Es ist weiter beschrieben worden, Gelatinelösungen als Plasmaersatzmittel zu verwenden. Die Gelatine hat vor vielen anderen Blutersatzmitteln den Vorteil, daß sie ein Protein ist, das nur geringe antigene Eigenschaften besitzt und durch proteolytische Fermente abgebaut bzw. vom menschlichen Körper leicht ausgeschieden werden kann. Ein Nachteil der Gelatine ist, daß ihre Lösungen bei Zimmertemperatur gelieren können, so daß sie vor dem übertragen durch Erwärmen verflüssigt werden müssen, und daß infolge der raschen Ausscheidung die Verweilzeit im Blutkreislauf zu kurz ist.
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden, die Eigenschaften der Gelatine zu verbessern. Durch hydrolytischen Abbau kann man eine Verringerung der mittleren Molekül.,größe erreichen, so d-,iß auch bei Zimmertemperatur keine Gelierung mehr auftritt. Eine derart abgebaute Gelatine wird aber noch schneller ausgeschieden als unbehandelte Gelatine.
Weiterhin hat man Gelatine »gehärtet« bzw. vernetzt, indem man sie mit Aldehyden, wie Formaldehyd oder Glyoxal, behandelte und anschließend oder während der Vernetzungsreaktion hydrolytisch oder durch Oxydation teilweise abbaute, um von den zunächst erhaltenen hochmolekularen Produkten zu solchen mit einem niedrigen Molekulargewicht zu kommen. Die Endprodukte besitzen eine größere Zahl ionisierbarer Carboxylgruppen als die Ausgangsgelatine, wodurch deren isoelektrischer Punkt herabgesetzt und deren Löslichkeit verbessert wird. Aber auch diese veränderten Gelatinen befriedigen noch nicht hinsichtlich ihres pharmakologischen Verhaltens; teils sind sie giftig, teils ist ihre Verweilzeit im menschlichen Körper noch ungenügend.
Eine andere Verbesserung wurde durch die Umsetzung von Gelatine mit Anhydriden oder Chloriden gewisser Polycarbonsäuren erreicht (vgl. deutsche Patentschrift 945 650). Auch dadurch entstehen Produkte mit einem veränderten Verhältnis von freien Amino- zu Carboxylgruppen und damit erhöhter Löslichkeit und günstigeren kolloidosmotischen Eigenschaften.
Sie besitzen zwar eine genügend lange Verweilzeit im menschlichen Körper, sie bewirken jedoch nicht unbedenkliche Veränderungen in der Leber und in der Niere, die sich histomorphologisch durch Azan-, Fibrin- und Glykogenfärbung nachweisen lassen (vgl. Czok und Atarbeiter, Klinische Wochenschrift, Bd. 37 [1959], S. 511 bis 519).
Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln aus Kollagenabbauprodukten vorgeschlagen worden, bei dem man Kollagenabbauprodukte in wäßriger Lösung bei einer Temperatur von 60 bis 150' C bis zu einem Molekulargewicht von 2000 bis 20 000, vorzugsweise 5000 bis 10 000, abbaut, das abgebaute Kollagen mit einem Diisoeyanat bei Temperaturen von 0 bis 100' C ün neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösungsmittel, in der Weise umsetzt, daß die angewandte Isocyanatmenge geringer ist als die, welche sich aus der Anzahl der ün abgebauten Kollagen vorhandenen Amino- und Guanidinogruppen errechnet, und vorzugsweise etwa 20 bis 80 % dieser Menge beträgt, dann das entstandene Vernetzungsprodukt auf einen pa-Wert von etwa 7 einstellt und die Lösung durch Zusatz von Natriumchlorid isotonisch macht.
Es wurde, nun ein Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln aus Kollagenabbauprodukten durch Behandlung mit Vernetzungsmitteln und weiterem Abbau der erhaltenen Vernetzungsprodukte gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Kollagenabbauprodukte mit Diisocyanaten bei Temperaturen von 0 bis 1001 C im neutralen bis schwach alkalischen pl,-Bereich, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösungsmittel, umsetzt, wobei die angewandte Isocyanatmenge 20 bis 80 % derjenigen beträgt, die sich aus der Anzahl der vorhandenen Amino- und Guanidinogruppen errechnet, die entstandenen Vernetzungsprodukte in wäßriger Lösung bei Temperaturen von 60 bis 150' C bis zu einem Molekulargewicht von 10 000 bis 100 000, vorzugsweise 30 000 bis 60 000, abbaut, die erhaltenen Lösungen auf einen pl,-Wert von 7 einstellt und durch Zusatz von Natriumchlorid isotonisch macht.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Kollagenabbauprodukte sollen frei sein von fiebererregenden und sonstigen pharmakologisch wirksamen Bestandteilen; am geeignetsten ist eine möglichst reine Knochengelantine. Unerwünschte anorganische Bestandteile, vor allem Caleiumsalze, können durch Dialyse, Elektrodialyse oder am besten durch Behandeln mit einem lonenaustauscher entfernt werden.
Bei der Umsetzung reagiert die Isocyangruppe bevorzugt mit den raktionsfähigen Aminogruppen bzw. Amid- oder Guanidinogruppen der Peptidketten, wodurch Hamstoffgruppen gebildet werden. Dadurch erfolgt eine Vernetzung von zwei oder mehreren Polypeptidketten über Harnstoffbrücken zu einem größeren Molekül. Den Reaktionsverlauf zeigt folgendes Formelbild: Die Vernetzungsreaktion wird im neutralen bis schwach alkalischen pu-Bereich vorgenommen, da in sauerer Lösung die Reaktion sehr langsam oder gar nicht vor sich geht. Da bei der Umsetzung die basischen Aminogruppen in sehr schwach basische Hamstoffgruppen umgewandelt werden, werden vorher als innere Salze vorhandene Carboxylgruppen frei, und der pH-Wert verschiebt sich nach dem sauren Bereich. Da bei der Umsetzung der Kollagenabbauprodukte Vernetzung auftritt, die Viskosität steigt und die Lösung nach einiger Zeit geliert, ist eine fraktionierte Zugabe des Isocyanates über eine längere Zeit und eine Nachstellung des pH-Wertes nach der Gelierung nicht mehr zweckmäßig. Durch mehrstündiges Stehenlassen der Vernetzungslösung nach der Gelierung erreicht man die vollständige Umsetzung des Isoeyanats mit dem zu vernetzenden Ausgangsmaterial. Die Zugabe des Isocyanats erfolgt unter starkem Rühren der Lösung entweder unmittelbar oder in einem organischen, mit Wasser mischbaren, aber gegen Isoeyanate inerten Lösungsmittel gelöst, z. B. in Tetrahydrofuran oder Aceton. Die Temperatur der Lösung kann zwischen 0 und 1000 C schwanken, am zweckmäßigsten arbeitet man bei 301 C. Als Isocyanate sind geeignet aliphatische Diisocyanate der allgemeinen Formel OCN-(C1-12).l-NCO in der x eine ganze Zahl von 2 bis 20 is4 oder auch aromatische und hydroaromatische Diisoeyanate.
Die für die Vemetzung günstigste Düsocyanatmenge hängt von der Molekälgröße des Ausgangsstoffes ab. Besonders brauchbare Blutplasmaersatzmittel werden erhalten, wenn man 40 bis 50% der Menge eines Diisocyanats angewendet, die sich aus dem Gehalt an Amino- bzw. Guanidinogruppen des Halogenabbauproduktes, z. B. der Gelatine, errechnet.
Bei dem anschließenden Abbau der Vernetzungsprodukte bis zu einer Molekülgröße von 10 000 bis 100 000, vorzugsweise 30 000 bis 60 000, hat sich eine Erhitzungszeit von 5 bis 6 Stunden bei 1201 C im geschlossenen Gefäß als am günstigsten erwiesen.
Nach dem Abbbau muß das zur Lösung des Düsocyanats verwendete organische Lösungsmittel aus dem Endprodukt entfernt werden.
Dies geschieht am besten durch Abdestilheren des Lösungsmittels im Vakuum, wobei zum Unterdrücken des Schäumens eine geringe Menge eines Schaumverhinderungsmittels, wie Octylalkohol, zu- gesetzt werden kann, das bei der Destillation wieder entfernt wird.
Die Lösung wird nunmehr auf ein solches Volumen gebracht, daß sie 5 O/o Protein enthält. Dann wird so viel Kochsalz oder physiologisches Salzgemisch zugesetzt, daß eine isotonische Lösung entsteht. Die Lösung wird hierauf sterilisiert und in Ampullen abgefüllt. Das Sterilisieren kann z. B. durch Filtrieren oder auch durch 10- bis 20minutiges Erhitzen auf 1201 C vorgenommen werden. Es kann auch durch Gefriertrocknung ein Trockenpulver hergestellt werden, das bei der unmittelbaren Anwendung wieder in sterilem Wasser gelöst wird.
Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Lösungen sind ausgezeichnete Blutplasmaersatzmittel und haben gegenüber den bekannten Mitteln gewisse Vorzüge. Ihre Lösungen sind voll-kommen klar und im Gegensatz zu anderen aus Gelatine hergestellten Ersatzmitteln auch nahezu farblos; der Erstarrungspunkt liegt unterhalb von 100 C. Das Molekulargewicht der Produkte nach dem Verfahren liegt bei 15 000 bis 60 000, es kann durch Änderung der Herstellungsbedingungen weitgehend den Bedürfnissen bei ihrer Anwendung angeglichen werden.
Am besten haben sich Produkte mit einem Molekulargewicht von etwa 30 000 bewährt. Die Endprodukte besitzen, wie die Messungen in der Ultrazentrifuge zeigen, im wesentlichen eine einheitliche Molekülgröße.
Die als Blutersatzmittel für klinische Versuche verwendete Lösung nach dem Verfahren der Erfindung besteht aus 3,5 1/o vernetzter Gelatine unter Zusatz von 0,851/o Natriumchlorid, 0,038% Kahumehlorid, 0,021/o Calcium, 0,0025% Magnesium, 0,0070/0 gebundenem Kohlendioxyd, Spuren von 0,0002% Phosphat, 0,01% Sulfat und doppeldestilliertem Wasser, auf 100,0 g aufgefüllt.
Der isoelektrische Punkt des Plasmaersatzmittels liegt beim pH-Wert 4,5 bis 5. Der kolloidosmotische Druck einer 2,8- bis 3%igen Lösung der abgebauten und wieder vernetzten Gelantine entspricht dem des menschlichen Serums. Die relative Viskosität betägt 1,7 bis 1,8 (Wasser= 1). Der Gelierungspunkt liegt unterhalb 4' C.
Im Tierversuch zeigen die Lösungen eine ausgezeichnete Verträglichkeit und besitzen keine giftigen Wirkungen. Es ist besonders hervorzuheben, daß mit Produkten mit dem Molekulargewicht von nur etwa 20 000 im Blutaustauschversuch und durch den Vergleich der überlebenszeiten volle Plasmaersatzwirkung erzielt wird.
Die niedrige Sterblichkeit der Ratten als Versuchstiere zeigt, daß das Plasmaersatzmittel geeignet ist, 70 bis 80% des im Blutkreislauf vorhandenen Blutplasmas vollwertig zu ersetzen, und daß eine genügende Verweilzeit vorhanden ist.
Sechs Hunde überlebten den Verlust von 20 ccm Blut je Kilogramm Tier, nachdem diese Blutmenge durch das neue Plasmaersatzmittel ausgetauscht wurde, ohne Nebenwirkungen.
Die Bestimmungen des ausgeschiedenen Oxyprolins als Bestandteil der Gelatine ergibt, daß etwa nach 12 bis 24 Stunden die Hälfte des Ersatzmittels aus dem Blut verschwunden und die weitere Ausscheidung innerhalb von 2 bis 3 Tagen beendet ist. Im Gegensatz hierzu zeigt Gelantine viel ungünstigere Ausscheidungsverhältnisse und ist schon nach wenigen Stunden im Blut nicht mehr nachweisbar.
Die Ursache für diese erwünschte verlängerte Verweilzeit der vernetzten Ersatzmittel ün Blut liegt darin, daß sie durch Fermente, wie Trypsin, Pepsin und Gewebefermente, langsamer gespalten werden als Gelatine. Auch die durch die Vernetzung erhöhte Sperrigkeit der Moleküle trägt zu einer langsameren Ausscheidung bei.
Das Plasmaersatzmittel beeinflußt die Blutdruckverhältnisse im. akuten Versuch nicht, es treten keine Veränderungen und Schädigungen im Blutkreislauf auf; Blutdruckuntersuchungen wurden an Katzen, Ratten und am Herz-Lungen-Präparatnach Starling durchgeführt.
Es zeigt sich, daß auch nach mehrmaligem Plasmaaustausch bei der Ratte keine Veränderung in der Versorgung der Gewebe mit Blut oder Sauerstoff stattfindet. Die Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit und Haematokritwerte (Bestimmung der roten Blutkörperchen in Prozent im Verhältnis zum Plasma) werden durch das Blutplasmaersatzmittel nicht beeinflußt.
Aus den Untersuchungen des Gesaintblutbildes und der Blutgerinnung konnte nicht auf eine pathologische Beeinflussung der blutbildenden Organe, geschlossen werden.
Das Plasmaersatzmittel ist lokal gut verträglich. Chemisch sind keine Ablagerungen des Plasmaersatzmittels in den parenchymatösen Organen, wie Leber, Milz und Nieren, von Ratten nachzuweisen. Auch aus den pathologisch-histologischen Befunden geht hervor, daß das Plasmaersatzmittel nicht im retikuloendothelialen Gewebe gespeichert wird. Selbst bei Ratten, die einen vollkommenen Austausch des Blutplasmas (10#/o des Körpergewichtes) gegen das neue erfIndungsgemäße Plasmaersatzmittel überlebten, traten keine der von Czok und Mitarbeitern gefundenen pathologisch-histologischen Änderungen auf (vgl. Klinische Wochenschrift, Bd. 37 [1959], S. 511 bis 519).
Das Plasmaersatzmittel ist ferner frei von flebererregenden Stoffen. Durch die lange Erhitzungszeit beim Abbau werden geringe Mengen antigen wirkender Stoffe, die im Kollagenabbauprodukt noch vorhanden sein können, mit Sicherheit zerstört; denn es wurde keine überempfmdlichkeit gegenüber Proteinen (Anaphylaxie) in ausgedehnten Versuchen festgestellt; zs sind also keine antigenen Eigenschaften vorhanden.
Das Plasmaersatzmittel ist abbaufähig. Die Nierentätigkeit wird nicht beeinflußt. Es traten keine Kreislaufnebenwirkungen auf. Der klinische Stichversuch hat die Ergebnisse der Tierversuche bestätigt. Das Plasmaersatzmittel hat sich als sehr geeignet in der Prophylaxe und Therapie von Volumenmangelzuständen der verschiedensten Genese erwiesen, z. B. nach Unfällen, nach Verbrennungen, bei Operationen. Das Plasmaersatzmittel stabilisierte den Kreislauf und war ausgezeichnet verträglich. Es hatte keine pyrogenen oder antigen Eigenschaften und beeinträchtigte nicht die Nierenfunktion. Beispiel 1 21 einer 511/oigen wäßrigen Lösung von Knochengelatine werden auf den pl,-Wert 7 eingestellt. Dann läßt man unter starkem Rühren 3,32 ccm Hexamethylendiisocyanat, gelöst in 25 ccm Tetrahydrofuran, bei 30' C zufließen. Bei der nun stattfindenden Vernetzungsreaktion steigt die Viskosität immer mehr an, bis die Lösung zu einer Gallerte erstarrt; dies ist nach etwa einer halben Stunde der Fall. Das Rühren wird unterbrochen, und man läßt die Lösung noch 15 Stunden bei Zimmerteraperatur stehen. Anschließend wird die Gallerte im geschlossenen Gefäß 51/2 Stunden auf 1201 C erhitzt. Zu der nun wieder flüssigen Lösung setzt man 18 g Kochsalz hinzu und engt sie zur Entfernung des Tetrahydrofurans im Vakuum auf zwei Drittel des Ausgangsvolumens ein. Hierbei kann man zur Verhinderung des Schäumens Octylalkohol zusetzen, der bei der Destillation mit überdestilhert. Man füllt die Lösung mit Wasser wieder auf das ursprüngliche Volumen auf, stellt gegebenenfalls den pH-Wert auf 7 ein und füllt dann in Flaschen oder Ampullen ab. Diese werden durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 120' C sterilisiert. Die Lösung hat eine relative Viskosität von 1,9 -F 0,1 (Wasser= 1).
In der gleichen Weise kann man die Vernetzung auch durchführen, wenn man als Lösungsmittel für das Düsocyanat Aceton an Stelle von Tetrahydrofuron anwendet.

11 der Lösung wird nach dem Erhitzen auf 120cl C der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält 54,9 g eines weißen Pulvers. Die Analyse dieses Materials ergibt:

Feuchtigkeit .................... 1,90 g

Stickstoff nach Kjeldahl 17,0111/o,

daraus Gelatine-Hexamethylen-

düsoeyanat-Reaktionsprodukt

berechnet .................... 51,80 g

Calcium ....................... 0,30 g

Chlorid ........................ 0,34 g

Gebundenes Kohlendioxyd ....... 0,10 g

Sulfat ......................... 0,14 g

54,58 g

Das Trockenprodukt kann in physiologischer Salzlösung zur gewünschten Konzentration gebracht und dann verwendet werden.

Beispiel 2 200 cem einer 51/oigen Gelatinelösung vom pff-Wert 7,15 werden bei 30'C unter starkem Rühren mit 0,32ccm Hexamethylendüsoeyanat, die in 10 ccm Wasser suspendiert und durch Turbinieren emulgiert sind, versetzt. Die nach 20 Minuten Rührzeit entstandene Gallerte läßt man dann ohne Rühren noch einige Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird durch 51/2stündiges Erhitzen im geschlossenen Gefäß auf 1201 C abgebaut und die nun wieder flüssige Lösung mit 0,9 1/o Kochsalz versetzt.
Nach dem Filtrieren und gegebenenfalls dem Einstellen des pl,-Wertes auf 7 füllt man in Flaschen ab und sterilisiert durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 120' C. Die Endlösung hat eine relative Viskosität von 1,9 ± 0,1 (Wasser = 1).
Beispiel 3 Es wird mit der gleichen Gelatinelösung im Beispiel 1 gearbeitet, aber die Umsetzung mit 3,88 ccm Octamethylendüsocyanat, gelöst in 40 ccm Aceton, durchgeführt. Das nach dem Abbau erhaltene Produkt zeigt gleich vorteilhafte Eigenschaften im Tierversuch wie das des Beispiels 1; die Lösung hat eine relative Viskosität von 1,9 ± 0,1 (Wasser = 1).
Beispiel 4 Es wird mit der gleichen Gelatinelösung wie im Beispiel 1 gearbeitet, aber die Umsetzung mit 3,32 cem Cyclohexan-1,4-diisocyanat, gelöst in 33 ccm Aceton, durchgeführt. Das nach dem Abbau erhaltene Produkt zeigt gleich vorteilhafte Eigenschaften im Tierversuch wie das des Beispiels 1; die Lösung hat eine relatioe Viskosität von 1,8 ± 0,1 (Wasser = 1).

Claims

PATENTANSPRUCH: VerfahrenzurHerstellungvonBlutplasmaersatzmitteln aus Kollagenabbauprodukten durch Behandlung mit Vernetzungsmitteln und weiterem Abbau der erhaltenen Vernetzungsprodukte, dadurch gekennzeichnet, daß man Kollagenabbauprodukte mit Düsoeyanaten bei Temperaturen von 0 bis 100' C im neutralen bis schwach alkalischen pn-Bereich, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösungsmittel, umset24 wobei die angewandt-- Isocyanatmenge 20 bis 80 % derjenigen beträgt, die, sich aus der Anzahl der vorhandenen Amino- und Guauidinogruppen errechnet, die entstandenen Vernetzungsprodukte inwäßriger Lösung bei Temperaturen von 60 bis 1501 C bis zu einem Molekulargewicht von 10 000 bis 100 000 abbaut, die erhaltenen Lösungen auf einen pg-Wert von 7 einstellt und durch Zusatz von Natriumchlorid isotonisch macht. In Betracht gezogene Druckschriften: Schweizerische Patentschrift Nr. 315 463. In Betracht gezogene ältere Patente: Deutsches Patent Nr. 1118 792.