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Verfahren zur Herstellung von protrahiert wirkenden Vitamin-B12-Präparaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von sowohl oral zu gebenden
wie auch intramuskulär oder subkutan injizierbaren protrahiert wirkenden Vitamin-B12-Präparaten.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässerige Lösung einer
Vitamin-Bl2-aktiven Substanz mit einem Zinksalz und mit Tannin versetzt und den
entstehenden Niederschlag als Suspension oder in getrocknetem Zustand verwendet.
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Vitamin B12 oder Cobalamin hat erst in den letzten Jahren eine weite
Verwendung gefunden, und zwar für die Behandlung von anämischen und neurologischen
Zuständen und für die Prophylaxe von potenei ellen Vitamin-B12-Mangelzuständen,
wie bei der Behandlung von Alterskrankheiten. Bei der parenteralen Verabreichung
massiver Dosen von Vitamin B,2 für diese Zwecke wird das Vitamin gewöhnlich in der
Form einer wässerigen, isotonischen Salzlösung subkutan oder intramuskulär injiziert.
Danach wird der Vitamin-Bl2-Spiegel des Serums plötzlich beträchtlich über die renale
Schwelle für Vitamin B12 erhöht, und das Vitamin wird innerhalb einer Zeit von ungefähr
24 Stunden sehr schnell mit dem Urin ausgeschieden.
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Um das Vitamin B12 für das Körpergewebe dauernd verfügbar zu machen,
ist es daher notwendig, dem Patienten das Vitamin mehrmals wöchentlich zu verabreichen.
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Das erfindungsgemäß hergestellte Vitamin-Bl2-Präparat erzeugt bei
subkutaner oder intramuskulärer Injektion eine dedeutende Erhöhung des Vitamin-Bl2-Spiegels
im Serum, wobei diese Erhöhung so reguliert werden kann, daß die renale Schwelle
für Vitamin B12 nicht überschritten wird. Darüber hinaus kann dieser erhöhte Vitamin-Bl2-Spiegel
des Serums eine beträchtlich längere Zeit hindurch aufrechterhalten werden, und
zwar wird bei subkutaner oder intramuskulärer Injektion eine Erhöhung des Vitamin-Bl2-Spiegels
des Serums für eine Zeit von 2 Wochen erzeugt, während mit wässerigen Vitamin-B12-Präparaten
nur eine ungefähr 24stündige Wirkung erhalten wird.
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Es wurde festgestellt, daß Vitamin B12 mit Zink einen wasserlöslichen
Komplex ergibt, der nach der Injektion, ebenso wie die wässerigen Vitamin-B12-Präparate,
innerhalb von ungefähr 24 Stunden mit dem Urin ausgeschieden wird. Ein Komplex aus
Tannin mit Vitamin B12 ergibt ein Präparat, bei welchem die Wirkung etwas verlängert
wird, d.h., der Vitamin-Bt2-Spiegel des Blutes ist nach der Injektion dieses Präparates
etwas über 24 Stunden erhöht, aber die Verlängerung ist nicht mit der vergleichbar,
die erfindungsgemäß erhalten wurde. Bei dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat
wirken das Zink und das Tannin zusammen, so daß die Zeit, während welcher der Vitamin-B,2-Spiegel
des Serums erhöht bleibt, stark
verlängert wird. Es wird angenommen, daß mit dem
erfindungsgemäßen Präparat ein Depot von Vitamin B12 gebildet wird, aus welchem
das Vitamin B12 so in den Blutstrom abgegeben wird, daß der Vitamin-Bl2-Spiegel
des Serums gegenüber dem vor der Injektion erhöht ist, aber unterhalb der renalen
Schwelle liegt.
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Dieser Zustand kann unter geeigneten Bedingungen 2 Wochen aufrechterhalten
werden.
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Der Ausdruck »Vitamin-B12-aktive Substanz« bezeichnet üblicherweise
Cobalamin oder eine Verbindung, die strukturell mit Cobalamin verwandt ist und welche
das Wachstum von Mikroorganismen, die Vitamin B12 in der Nährlösung benötigen, wie
z. B. Lactobacillus leichmannii, beschleunigt. Zu dieser Klasse von Verbindungen
gehören Derivate von Cobalamin, wie Cyanocobalamin und Hydroxycobalamin.
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Der erfindungsgemäß hergestellte Komplex aus Vitamin B12 mit Zink
und Tannin ist in Wasser unlöslich und kann als wässerige Vitamin-B12-Suspension
verwendet werden. Diese Suspension kann die bei der Herstellung erhaltene sein.
Der Komplex kann jedoch auch von der Herstellungslösung abgetrennt und mit Wasser
aufgeschwemmt werden. Die Zeit, für welche diese Mischung eine Erhöhung des Vitamin-Bl2-Spiegels
des Serums erzeugt und der Grad, in welchem der
Vitamin-Bl2-Spiegel
des Serums während dieser Zeit erhöht ist, können eingestellt werden, indem entweder
das Verhältnis von Tannin oder von Zink, die mit der Vitamin-Bl2-aktiven Substanz
in diesem wasserunlöslichen Komplex vereinigt werden, reguliert wird.
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Außerdem ist die Menge der Vitamin-B12-aktiven Substanz, die in diesem
wasserunlöslichen Komplex enthalten ist, ein bestimmender Faktor für die Kontrolle
der Zeitdauer, während welcher der Vitamin-B12-Spiegel des Serums nach der Injektion
erhöht ist.
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Es wurde gefunden, daß 2 mg reines Tannin durch ungefähr 1 mg Zinkion
in Wasser vollkommen unlöslich gemacht werden, d. h. annähernd 2,5 Mol Zinkion pro
Mol Tannin sind erforderlich, um ein unlösliches Zinktannat zu erhalten. Es wurde
weiter gefunden, daß ungefähr 2 mg reines Tannin pro Milligramm kristallisiertes
Cobalamin ein vollkommen wasserunlösliches Zink-Vitamin-Bl2-Tannin-Präparat erzeugen,
d. h. 4,5 Mol Tannin sind pro Mol Vitamin B12 erforderlich, um ein vollkommen wasserunlösliches
Zink-Vitamin-B12-Tannin-Präparat zu erhalten. Ein vollkommen wasserunlösliches Zink-Vitamin-B12-Tannin
kann daher aus annähernd 1 mg Zinkion, 2 mg reinem Tannin und 1 mg kristallisiertem
Cobalamin bestehen. Wenn Verhältnisse von Zink und Tannin verwendet werden, die
geringer sind, wird ein Präparat erhalten, in welchem ein Teil des Vitamins B12
in der wasserlöslichen Form erhalten bleibt und bei welchem dieser Anteil bei subkutaner
oder intramuskulärer Injektion ähnlich wirkt wie die übliche wässerige, isotonische
Salzlösung von Vitamin B1. Erfindungsgemäß können deshalb Vitamin-B12-Präparate
erhalten werden, in welchen das Verhältnis von Zink und Tannin zu Vitamin B12 so
eingestellt werden kann, daß die Intensität der Wirkung bei der Injektion und die
Zeitdauer, innerhalb welcher diese Intensität der Wirkung erreicht wird, nach Wunsch
eingestellt werden.
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Obwohl mit dem erfindungsgemäß hergestellten Vitamin-B12-Präparat
besonders gute Ergebnisse erhalten werden, wenn dazu ein kristallisiertes Vitamin-B12
-Präparat verwendet wird, so können doch die Vorteile der Erfindung mit jedem Vitamin-B12-Präparat
erhalten werden, das für parenterale Verabreichung geeignet ist.
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Erfindungsgemäß wird das Vitamin-B,2-Präparat erhalten, indem Tannin
und Vitamin B12 in wässeriger Lösung mit einem wasserlöslichen Zinksalz, z. B. mit
Zinkacetat oder Zinkchlorid, in beliebiger Reihenfolge vereinigt werden. Um nach
diesem Verfahren ein injizierbares Präparat herzustellen. wird z. B. eine sterile,
wässerige Suspension des wasserunlöslichen Zink-Vitamin-Bf2-Tannin-Komplexes in
einer isotonischen Salzlösung hergestellt, indem eine sterilisierte, wässerige Lösung
von Tannin mit einer sterilisierten, wässerigen Lösung von kristallisiertem Vitamin
B12 vereinigt wird, und dann wird zu dieser sterilen, wässerigen Mischung von Vitamin
B1- und Tannin eine sterilisierte, wässerige Lösung des wasserlöslichen Zinksalzes
aseptisch zugegeben. Es wurde gefunden, daß durch die Zugabe dieses wasserunlöslichen
Zink-Vitamin-Bl2-Tannin-Komplexes zu einer wässerigen Gelatinelösung ein Präparat
erhalten wird, welches nach subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung eine Erhöhung
des Vitamin-Bl2-Spiegels des Serums ergibt, die über derjenigen liegt, die mit einer
wässerigen Suspension dieses Komplexes erhalten wird, ohne daß die Zeitdauer, während
welcher diese Erhöhung erhalten wird, bedeutend verändert ist. Die in dieser Ausführungsform
der Erfindung verwendete Gelatine kann irgendeine für parenterale Verabrei-
chung
geeignete Gelatine sein. Die Gelatine kann in dieser wässerigen Suspension in jeder
Konzentration unter 16 Gewichtsprozent verwendet werden. Bevorzugt werden Konzentrationen
von 0,5 bis 6 °/o, da diese eine sehr gute physiologische Wirkung ergeben und das
Präparat doch nicht so viskos wird, daß es nur schwer injiziert werden kann. Besonders
bevorzugt werden Gelatinekonzentrationen von 1 bis 4 Gewichtsprozent. Obwohl die
wässerige Suspension des Zink-Vitamin-Bl2-Tannin-Komplexes sich während längerer
Lagerzeit im wesentlichen nicht zersetzt, ist der Tanninbestandteil dieses Komplexes
der Oxydation zugänglich, wodurch Verfärbung des Vitainin-B,2-Präparates eintritt.
Dies kann vermieden werden und die Stabilität des Vitamin-B,2-P räparates während
längerer Lagerzeit im wesentlichen gesichert werden, wenn die Oxydation durch teilweise
Entwässerung des wässerigen Mediums, in welchem der Zink-Vitamin-B,2.-Tannin-Komplex
suspendiert ist, verhindert wird.
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Dies kann durchgeführt werden, indem zu dem Vitamin-Bl2-Präparat beispielsweise
Propylenglvkol oder Polyäthylenglykol in der Menge von annähernd 50 Volumprozent
gegeben wird. Andere Substanzen, die die Stabilität dieses Vitamin-Bl2-Präparates
verbessern, sind Carboxymethylzellulose und Reduktionsmittel wie Cystein und Natrium-
oder Kaliumcitrat.
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Der Zink-Vitamin-B12-Tannin-Komplex kann auch in Form eines trockenen
Pulvers erhalten werden, welches dann vor der Injektion mit einer wässerigen Lösung
wieder gebrauchsfertig gemacht wird. Dieses Pulver wird durch Gefriertrocknen einer
sterilen, wässerigen Suspension des Zink-Vitamin-Bl2-Tannin-Komplexes unter aseptischen
Bedingungen erhalten.
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Das Pulver, wird vor dem Injizieren mit einer wässerigen, isotonischen
Salzlösung oder einer wässerigen Gelatinelösung wieder zu einer wässerigen Suspension
des Zink-Vitamin-Bl2-Tannin-Komplexes aufgeschwemmt. Es zeigt bei außerordentlich
langen Lagerzeiten eine außergewöhnliche Stabilität, und wenn noch ein Reduktionsmittel
wie Cystein und ein antibakterielles Mittel wie p-Hydroxybenzoesäure zugegeben werden,
wird die Zersetzung verhindert, und es kann mit einer wässerigen Lösung wieder gebrauchsfertig
gemacht werden, ohne daß in der erhaltenen wässerigen Suspension unerwünschte Klumpen
oder Koagulate entstehen.
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Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird durch die Bildung
des wasserunlöslichen Zink-Vitamin-Bl2-Tannin-Komplexes mit einem verhältnismäßig
unreinen Vitamin-Bl2-Präparat die selektive Löslichmachung der in dem Vitamin B12
enthaltenen Verunreinigungen erreicht, und dadurch eine Reinigung der Vitamin-B12-Mischung.
Ein Verfahren, durch welches diese Reinigung von verhältnismäßig unreinem Vitamin
B12 im Verlaufe der Bildung eines wasserunlöslichen Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Komplexes
erzielt werden kann, wird später im Beispiel X beschrieben. Die rohen Vitamin-Bl2-Präparate,
die bei diesem Reinigungsverfahren verwendet werden, können tierischer Herkunft
sein, z. B. aus Leber stammen oder mikrobiologischer Herkunft sein, nach dem in
dem Fachgebiet bekannten Verfahren.
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Es ist aus dem Obigen klar, daß bei der Verwendung dieses Zink-Vitamin-B12-Tannat-Komplexes
bei subkutaner oder intramuskulärer Injektion besondere Vorteile erhalten werden
können. Jedoch kann diese Vitamin-Bl2-Mischung auch oral eingegeben werden, um günstige
Ergebnisse zu erhalten. Die Vorteile der Erfindung werden in den folgenden Beispielen
im einzelnen erläutert:
Beispiel I 550 mg Tannin werden in 50 ml
destilliertem Wasser gelöst, und die erhaltene Mischung wird durch eine sterilisierende
Selas-Filterkerze in ein steriles Gefäß filtriert. Die Selas-Filterkerze wird mit
weiteren 12,5 ml Wasser gewaschen.
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137,5 mg kristallisiertes Cyanocobalamin werden in 50 ml Wasser gelöst,
und die erhaltene Lösung wird durch die Selas-Filterkerze in das Gefäß filtriert,
das die sterile Tanninlösung enthält. Die Selas-Filterkerze wird dann mit weiteren
12,5 ml Wasser gewaschen.
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1,0 g kristallisiertes Zinkacetat wird in 50 ml Wasser gelöst, und
die erhaltene Lösung wird durch die Selas-Filterkerze in das Gefäß filtriert, das
die sterile Mischung aus Vitamin B12 und Tannin enthält, wobei eine wässerige Suspension
eines Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Komplexes erhalten wird. Die Selas-Filterkerze wird
dann mit weiteren 12,5 ml Wasser gewaschen.
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Danach werden 50 ml einer wässerigen Lösung, die 2,25 g Natriumchlorid,
150 mg Cystein und 1,25 g Phenol enthält, durch die Selas-Filterkerze in das Gefäß
filtriert, das die sterile, wässerige Suspension des Zink-Vitamin-Bl-Tannat-Komplexes
enthält, so daß das Volumen der Suspension in dem sterilen Behälter auf ein Gesamtvolumen
von 250 ml erhöht wird.
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Die dabei erhaltene isotonische Suspension des Zink-Vitamin-B ,2-Tannat-Komplexes
wird unter dauerndem Rühren aseptisch in sterile pharmazeutische 5-ml-Ampullen abgefüllt.
Die gefüllten Ampullen werden aseptisch verstöpselt und verschlossen.
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Dieses Vitamin-Bl2-Präparat enthält 500 y Vitamin Bi2 pro Milliliter.
Beispiel II Beispiel II Die Wirkung des nach dem Verfahren von Beispiel I erhaltenen
Vitamin-Bl2-Präparates wird mit erstens der einer wässerigen, isotonischen SalzlöungvonVitamin
Bl2, die 0,5 0/o Phenol enthält, und zweitens der einer nach dem Verfahren von Beispiel
I hergestellten wässerigen Suspension von Vitamin-B12-Tannat, wobei die Zugabe des
Zinkacetats weggelassen wurde, verglichen.
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Um jedes dieser Vitamin-Bl2-Präparate zu prüfen, wurde eine Gruppe
von acht Ratten verwendet. Jeder Ratte in den entsprechenden Gruppen wurde subkutan
1,0 ml des entsprechenden Vitamin-B,2-Präparates injiziert. Der Urin jeder Gruppe
von Ratten wurde periodisch aufgefangen und gesammelt.
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Zu dem gesammelten Urin wurde Natriumäthylmercurithiosalicylat (Merthiolate)
hinzugegeben, um die bakterielle Zersetzung zurückzuhalten.
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Bei diesen Versuchen wurde den Ratten während der ganzen Zeit Wasser
nach Belieben zur Verfügung gestellt. Wenn der Urin der Ratten an aufeinanderfolgenden
Tagen aufgefangen wurde, wurde den Ratten täglich 2 Stunden lang Nahrung gegeben.
Wenn andererseits der Urin jeden zweiten Tag aufgefangen wurde, wurde den Ratten
an diesem zweiten Tag Nahrung nach Belieben gegeben.
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Der Vitamin-Bl2-Gehalt des gesammelten Urins wurde durch das chemische
Prüfverfahren von P. J.
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Van M zelle, veröffentlicht in »Journal of the American Pharmaceutical
Association«, Januar 1956, bestimmt.
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Die Ergebnisse, die mit der wässerigen, isotonischen Salzlösung von
Vitamin B12 erhalten wurden, werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Hierbei ist
der Vitamin-Bl2-Gehalt des Urins als die von der Gruppe der Versuchs ratten ausgeschiedene
Gesamtmenge angegeben und außerdem als berechneter Durchschnittswert für jede Ratte
der Gruppe.
| Gesamtmenge Durdisihmttsmenge |
| Zahl der Stunden des ausgeschiedenen des ausgesosiedenen |
| Vitamins Bis Vitamins Bis |
| pro Injektion pro adit Ratten pro Ratte |
| (mr) (mir) |
| 0 bis 5 2500 313 |
| 5 bis 24 186 23 |
| 24 bis 48 39 5 |
| 48 bis 72 11 1,3 |
Die folgenden Ergebnisse wurden mit der wässerigen Suspension von B12-Tannat erhalten,
und die Ergebnisse sind ebenso wie in der vorhergehenden Tabelle angegeben:
| Gesamtmenge Durhschnittsmenge |
| Zahl der Stunden des ausgeschiedenen des ausgeschiedenen |
| Vitamins Bis Vitamin Bis |
| nach Injektion pro acht Ratten pro Ratte |
| (mix) (m7) |
| 0 bis 6 2670 334 |
| 6 bis 24 144 18 |
| 24 bis 48 38 5 |
| 48 bis 72 weniger als weniger als |
| 10 1 |
| 72 bis 96 weniger als weniger als |
| 10 1 |
Man sieht aus den obigen Ergebnissen, daß die Absorptionskontrolle, die mit der
Vitamin-B,2-Tannat-Mischung erhalten wird, ähnlich der ist, die mit der wässerigen
Vitamin-Bl2-Lösung erreicht wurde.
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Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Präparat
erhalten, das nach dem Verfahren von Beispiel I hergestellt war:
| Gesamtmenge Durchschnittsmenge |
| Zahl der Stunden des ausgesuiiedenen des ausgesdiiedenen |
| nadi Injektion Vitamins Bis Vitamins Bis |
| pro acht Ratten pro Ratte |
| (mr) (mr) |
| 0 bis 5 329 41 |
| 5 bis 24 48 6 |
| 48 bis 72 63 8 |
| 96 bis 120 165 21 |
| 144bis168 119 15 |
| 216 bis 240 52 6,5 |
| 264 bis 268 52 6,5 |
| 336 bis 360 25 3,0 |
Aus der obigen Tabelle sieht man, daß die Absorptionskontrolle mit der Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Mischung
für eine Dauer von über 15 Tagen erhalten wurde, wohingegen mit dem Vitamin-B,2-Tannat
und der wässerigen Vitamin-Bl2-Lösung die Ausscheidung des Vitamins B12 im wesentlichen
nach 72 Stunden beendet war. Bei jedem der obigen Versuche schieden die Ratten während
einer 24stündigen Kontrollperiodc vor dem Versuch kein Vitamin B12 aus.
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Beispiel III Die Absorptionskontrolle, die mit der Vitamin-B12-Mischung
nach Beispiel 1 erreicht wurde, wurde bei Menschen mit der verglichen, die mit einer
wässerigen, isotonischen Salzlösung von Vitamin B12 erhalten wurde. Jedes dieser
Vitamin-Bl2-Präparate wurde an einer Gruppe von fünf Patienten geprüft. Jedem Patienten
in dieser Gruppe wurde subkutan 1 ml des entsprechenden
Vitamin-B12-Präparates
injiziert, wobei jedes Präparat 500 y Vitamin B12 entsprach. In bestimmten Intervallen
nach der Verabreichung des Vitamin-Bl2-Präparates wurde der Vitamin-Bi2-Gehalt in
dem Serum jedes Patienten mit der mikrobiologischen Versuchsmethode von Skeggs u.
a., 184, S. 211 bis 221 (1950), bestimmt.
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Die folgenden Ergebnisse wurden mit der wässerigen, isotonischen
Salzlösung von Vitamin B12 erhalten, wobei der Vitamin-B12-Gehalt des Serums in
my pro ml ausgedrückt ist:
| Patient Zeitspanne nadi Injektion (Stunden) |
| 0 1 8 1 24 1 72 1 144 1 216 |
| 1 367 12000 1793 1588 461 437 |
| 2 233 17000 1647 1426 315 216 |
| 3 338 13530 1598 1397 297 : 245 |
| 4 484 1880 1665 1554 408 373 |
| 5 496 1850 1711 1502 577 472 |
| Durch- |
| schnitt 384 17560 1683 1493 412 349 |
Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem Zink-Vitamin-Bj2-Tannat-Präparat erhalten,
wobei die angegebenen Resultate als Vitamin-Bl2-Spiegel des Serums in my pro ml
angegeben sind.
| Patient Zeitspanne nadi Injektion (Stunden) |
| 0 1 8 1 24 1 72 1 144 1 216 |
| 6 472 588 1519 i 2490 1502 1379 |
| 7 379 461 1426 2513 1426 1367 |
| 8 548 513 1536 2669 1490 1717 |
| 9 466 1119 1542 2513 1548 1449 |
| 10 980 560 1729 2700 1746 1700 |
| Durch- |
| schnitt 569 648 1550 2517 1542 1522 |
Aus dem Obigen ersieht man, daß die mit der Zink-Vitamin-B12-Tannat-Mischung behandelten
Patienten für eine Zeitdauer von über 216 Stunden einen erhöhten Vitamin-Bl2-Spiegel
des Serums zeigten, wohingegen bei den Patienten, die mit der wässerigen, isotonischen
Salzlösung von Vitamin B12 behandelt waren, der Vitamin-B12-Spiegel des Serums nach
ungefähr 44 Stunden zu dem normalen Wert zurückkehrte.
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Beispiel IV Die Ausscheidung des Vitamins B12 mit dem Urin bei Patienten,
die nach dem Verfahren von Beispiel III behandelt waren, wurde bestimmt, und die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle als y Vitamin B12 ausgedrückt:
| Patient Zeitspanne nach Injektion (Stunden) |
| 0 1 6 1 24 1 48 1 72 1 120 1 168 1 216 |
| 1 0 335,0 28,6 - - - - - |
| 2 - 216,0 34,4 - - - - - |
| 3 - 347,5 14,6 - - - - - |
| 4 - 282,0 14,1 - - - - - |
| 5 - 300,5 15,1 - - - - - |
| Durch- |
| schnitt - 296,2 21,36 |
| 6 - - - - - - - - |
| 7 - - - - - - - - |
| 8 - - - - - - - - |
| 9 - - - - - - - - |
| 10 - - - - - - - |
Aus dem Obigen sieht man als Beweis für die Ergebnisse von Beispiel III, daß die
Absorptionskontrolle, die mit der Zink-Vitamin-B12-Tannat-Mischung erhalten wird,
216 Stunden übersteigt,
wohingegen die Absorptionskcntrolle mit der wässerigen, isotonischen
Salzlösung von Vitamin B12 nur für eine Zeit von ungefähr 24 Stunden erhalten wird.
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Beispiel V Es wurde eine andere Reihe von menschlichen Patienten mit
einer wässerigen, sisotonischen Salzlösung von Vitamin B,2 und der Zink-Vitamin-B12-Tannat-Mischung,
die nach dem Verfahren von Beispiel I hergestellt war, in der Art des Versuches
von Beispiel III behandelt.
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Die folgenden Ergebnisse wurden mit der wässerigen, isotonischen
Salzlösung von Vitamin B,2 erhalten, wobei der Serumgehalt des Vitamins B12 in my
pro ml ausgedrückt ist:
| Patient Zeitspanne nach Injektion (Stunden) |
| 0 1 8 1 24 1 72 t 144 1 216 1 288 |
| 1 344 5700 2000 - 945 676 519 |
| 2 216 4800 863 536 455 379 315 |
| 3 391 9000 2160 956 863 670 571 |
| 4 297 7800 2900 1280 700 577 385 |
| 5 233 6700 940 566 530 414 373 |
| Durch- |
| schnitt 296 6800 1773 835 699 543 433 |
Die folgenden Ergebnisse wurden mit der Zink-Vitamin-B,2-Tannat-Mischung,
die nach Verfahren von Beispiel 1 hergestellt war, erhalten, und der Serumgehalt
an Vitamin B,2 ist in my pro ml ausgedrückt:
| Patient Zeitspanne nach Injektion (Stunden) |
| 0 1 8 1 24 1 72 1 144 W 216 1 288 |
| 6 869 1970 1560 1569 2070 2740 2157 |
| 7 402 1050 660 1166 1679 1073 758 |
| 8 356 793 530 1154 2087 1020 665 |
| 9 484 1400 822 1290 1180 1560 1000 |
| 10 245 1143 700 566 799 910 805 |
| Durch- |
| schnitt 471 1271 854 1149 1563 1461 1077 |
Die oben zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß der Gehalt des Serums an Vitamin
B12 bei denjenigen Patienten, die mit der Zink-Vitamin-Tannat-Mischung behandelt
wurden, für eine Zeitdauer von über 216 Stunden auf einem bedeutend höheren Spiegel
gehalten wurde, während der Gehalt des Serums an Vitamin B12 bei den Patienten.
die mit der wässerigen Lösung von Vitamin Bl2 behandelt wurden, nur für eine Zeit
von ungefähr 144 Stunden erhöht war.
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Beispiel VI Auch in dem Urin der Patienten, die nach dem Verfahren
von Beispiel V behandelt waren, wurde das Vitamin B12 wie im Beispiel IV bestimmt.
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In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse enthalten, die mit den
Patienten erhalten wurden, die mit der wässerigen, isotonischen Salzlösung von Vitamin
B12 behandelt waren. Hierbei ist der Gehalt des Urins an Vitamin B,2 in y ausgedrückt:
| Patient Zeitspanne nach Injektion (Stunden) |
| 0 1 1 6 1 24 1 72 1 96 1 120 144 1 168 |
| 1 18,6 780 320 23 53 |
| 2 10,2 432 400 30 70 |
| 3 2,5 630 378 65 116 |
| 4 0,4 405 310 45 56 |
| 5 0,2 949 290 50 63 |
| Durch- |
| schnitt 300 72 |
| 6 0,3 |
| 7 1,0 - - - - - - 0,5 0,720 0,3 0,438 0,6 0,426 - - |
| 8 0,9 - - - - 0,45 396 0,35 0,525 0,6 0,515 - - 0,32 0,304 |
| 9 1,2 - - - - - - 0,9 1,116 0,95 0,646 0,8 1,390 0,16 0,218 |
| 10 - -------------- |
| Durch- |
| schnitt 0,79 0,472 0,320 0,363 0,104 |
Man sieht aus den obigen Ergebnissen, daß die Vitamin-B12-Ausscheidung mit dem Urin
bei den Patienten, die mit der wässerigen Vitamin-Bl2-Lösung behandelt waren, im
wesentlichen innerhalb 24 Stunden beendet ist, während bei den Patienten, die mit
der Zink-Vitamin-B12-Tannat-Mischung behandelt waren, sogar noch nach einer Zeit
von 168 Stunden eine geringe Ausscheidung vorhanden war.
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Beispiel VII Nach dem folgenden Verfahren wurde ein steriles Trockenpräparat
des Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Präparates erhalten: Wässerige Lösungen von Tannin,
kristallisiertem Cyanocobalamin und Zinkacetat wurden steril filtriert und entsprechend
dem Verfahren von Beispiel 1 in einen sterilen Behälter zusammengegeben. Die sterile,
wässerige Suspension des Zink-Vitamin-B12-Tannates, die dabei erhalten wurde, hatte
die folgende Zusammensetzung: Tannin ...................... 1,1 g Vitamin ..................
B12 275 mg Zinkacetat ................... 2,0 g Zu dieser sterilen Suspension von
Zink-Vitamin-B12-Tannat wurde eine steril filtrierte Lösung hinzu-
gegeben, die 600
mg Cystein und 500 mg Methylparahydroxybenzoesäure enthielt. Die erhaltene Suspension
wurde mit steril filtriertem Wasser auf ein endgültiges Volumen von 250 ml verdünnt.
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Diese verdünnte sterile Suspension wurde aseptisch in pharmazeutische
Ampullen gefiillt, die sich für die Lyophilisierung eigneten, und zwar je 2,5 ml
Suspension pro 6-ml-Ampulle. Die gefüllten Ampullen wurden aseptisch verschlossen
und der Inhalt gefroren.
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Die Ampullen mit dem gefrorenen Material wurden der Lyophilisierung
unterworfen.
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Das dabei erhaltene lyophilisierte Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Präparat
kann wieder mit Wasser oder einer wässerigen, isotonischen Salzlösung vor der Injizierung
behandelt werden.
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Dieses lyophilisierte Präparat zeigt eine unendliche Lagerbeständigkeit
und ist deshalb besonders für die Zwecke geeignet, bei welchen das Zink- Vitamin-Bl2-Tannat-Präparat
vor der Verabreichung längere Zeit gelagert werden muß.
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Beispiel VIII Das lyophilisierte Präparat von Beispiel VII wird mit
einer wässerigen, isotonischen Salzlösung, die 1 °/o partiell hydrolysierte, pharmazeutische
Gelatine enthält, wieder aufgelöst.
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Diese wässerige Gelatinesuspension des Zink-Vitamin-B12-Tannats erzeugt
nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion eine Erhöhung des Vitamin-B12-Spiegels
im Serum, der über demjenigen liegt, der mit einer wässerigen Suspension des Zink-Vitamin-Bl2-Tannat-Präparats
erhalten wird. Es wird auch hier eine Wirkungsdauer von über 216 Stunden erhalten.
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Beispiel IX Der Grad der Erhöhung des Vitamin-Bl2-Spiegels im Serum
und die Zeit, während welcher der Vitamin-Bl2-Spiegel des Serums auf einem erhöhten
Wert gehalten wird, können reguliert werden, indem das Verhältnis von Tannin und
Zink zu Vitamin B12 in der Zink-Vitamin-B12-Tannat-Mischung eingestellt wird Wenn
das Verhältnis von Vitamin B12 zu Tannin und Zink über die Verhältniswerte, die
in dem Verfahren von Beispiel 1 angewendet wurden, verdoppelt wird, wird eine wässerige
Suspension des Zink-Vitamin-B2-Tannat-Komplexes erhalten, der die folgende Zusammensetzung
hat: Tannin ................... 550 mg Zinkacetat ............... 1000 mg Vitamin
B12 ................ 275 mg Dieses modifizierte Präparat ergibt nach subkutaner
und intramuskulärer Injektion eine Erhöhung des Vitamin-B12-Spiegels im Serum, die
größer ist als die in den Beispielen II bis VII für die nach dem Verfahren von Beispiel
1 erhaltenen Präparate gezeigte, während die Zeit, während welcher diese Erhöhung
des Vitamin-B12-Spiegels im Serum erzeugt wird, entsprechend verringert ist.
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Beispiel X Ein verhältnis rohes Präparat von Vitamin B12 kann in
einem Verfahren verwendet werden, das im wesentlichen dem im BeispielI angegebenen
entspricht, um ein Zink-Vitamin-B12-Tannat-Präparat zu erhalten, das für parenterale
Verabreichung geeignet ist, und wobei die Reinigung des Vitamins B12 im Verlauf
der Bildung des unlöslichen Zink-Vitamin-B12-Tannat-Komplexes erhalten wird.
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In diesem modifizierten Verfahren wird eine wässerige Lösung von
verhältnismäßig unreinem Vitamin B12 hergestellt, die pro Milliliter eine Vitamin-Bl2-Wirksamkeit
von 100 y enthält. Zu dieser Lösung wird Zinkacetat in solcher Menge hinzugegeben,
daß die erhaltene Lösung eine Zinkionenkonzentration von 200 y pro Milliliter hat.
Das pn dieser Lösung wird mit Natriumhydroxyd auf 7,5 eingestellt und dann wird
diese
Lösung filtriert, um die mit dem Zink ausgefällten Verunreinigungen von dem löslichen
Vitamin B12 abzutrennen.
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Zu der filtrierten Lösung wird dann Tannin in einer Menge hinzugegeben,
daß ein Maximum der Verunreinigungen des Vitamins B12 ausgefällt wird, während im
wesentlichen die gesamte Vitamin-Bl2-Aktivität in der löslichen Form bleibt. Der
erhaltene Tanninniederschlag wird von der Vitamin-Bl2-Lösung durch Filtrieren abgetrennt
und verworfen.
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Danach wird Tannin zu dem das Vitamin B12 enthaltenden Filtrat zugegeben,
und zwar in einer Menge, die 2 mg Tannin pro Milligramm Vitamin B12 entspricht.
Dann wird zu dem Filtrat Zinkacetat in solch einer Menge hinzugegeben, daß die erhaltene
Suspension 1 mg Zinkionen pro 2 mg Tannin enthält. Der erhaltene Zink-Vitamin-B12-Tannat-Niederschlag
wird von der überstehenden Flüssigkeit durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt.
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Der abgetrennte Zink-Vitamin-B 12-Tannat-Niederschlag kann in Wasser
suspendiert werden oder durch Ansäuern mit Zitronensäure oder Salzsäure wieder als
wässerige Lösung hergestellt werden. Die wiederhergestellte Lösung kann steril filtriert
werden, und diese sterile Lösung kann durch Zugabe einer sterilen Lösung von Natriumhydroxyd
oder Natriumphosphat wieder ausgefällt werden.
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Wahlweise kann das abgetrennte Zink-Vitamin-B12-Tannat-Präparat mit
Wasser gemischt werden, um eine wässerige Suspension zu bilden, und sie kann in
Gegenwart von Cystein im Autoklav sterilisiert werden, um ein Präparat zu ergeben,
das sich für parenterale Verabreichung eignet.
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Obwohl in der vorstehenden Beschreibung die Erfindung mit beträchtlichen
Einzelheiten in bezug auf besondere Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es
klar, daß der Fachmann andere Anwendungsformen anwenden kann und daß viele der darin
angegebenen Einzelheiten variiert werden können, ohne aus dem Rahmen der Erfindung
herauszutreten.