DE10359780A1

DE10359780A1 - Verfahren zur optischen Bilderfassung

Info

Publication number: DE10359780A1
Application number: DE2003159780
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. Jehmlich
Original assignee: Pentacon GmbH Foto und Feinwerktechnik
Current assignee: Pentacon GmbH Foto und Feinwerktechnik
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2023-12-20
Also published as: DE10359780B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines Objektes mittels eines optischen Systems, wobei das Bild aus mehreren Teilbildern zusammenzusetzen ist. Dabei sind folgende Schritte vorgesehen: DOLLAR A (a) Festlegen einer Anzahl n von Meßpunkten auf dem Objekt in der Aufnahmeebene des optischen Systems, wobei die Anzahl n der Meßpunkte gleich oder größer drei ist; DOLLAR A (b) Bestimmen der Schärfeebene für jeden dieser Meßpunkte; DOLLAR A (c) Berechnen eines Höhenprofils des Objektes aus den für jeden Meßpunkt ermittelten Schärfeebenen und DOLLAR A (d) Aufnehmen der Teilbilder durch Abrasterung des Objektes, wobei die Anzahl n von Teilbildern größer als die Anzahl n von Meßpunkten ist und wobei die Schärfeebene jedes Teilbildes aus dem Höhenprofil des Objektes berechnet wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines Objektes mittels eines optischen Systems, wobei das Bild aus mehreren Teilbildern zusammenzusetzen ist.
Ein derartiges Verfahren kann insbesondere zur Untersuchung von biologischen Proben angewendet werden. Solche biologischen Proben werden z. B. durch Markierung von Kontaminationen mit fluoreszierenden Substanzen und anschließenden Trennen der Flüssigkeit von den Kontaminationen durch Filtern erzeugt. Die Filter sind die Träger der markierten Kontaminationen. Ziel einer solchen Untersuchung ist es in vielen Fällen festzustellen, ob eine Kontamination vorliegt, beispielsweise eine mikrobiologische Kontamination mit Bakterien wie E. coli.
Bei der Untersuchung von extrem gering oder nicht kontaminierten Proben bestehen besondere Schwierigkeiten. Ein Problem ist insbesondere die Schwierigkeit, das optische System, beispielsweise ein Licht- oder Fluoreszenzlichtmikroskop auf die Probe zu fokussieren. Dies ist insbesondere deshalb schwierig, weil die mikrobiologische Kontamination der Probe außerordentlich gering sein kann, wobei diese Kontamination gleichwohl von Relevanz beispielsweise für die Eignung von Wasser, aus dem die Probe entnommen wurde, als Trinkwasser sein kann. Bekannte Verfahren zur automatischen Fokussierung können daher in diesen Fällen in der Regel nicht mit Erfolg eingesetzt werden.
Im Hinblick auf die möglicherweise geringe Konzentration an Kontaminationen müssen ferner ausreichend große Proben untersucht werden, so daß mehrere Aufnahmen der Probe angefertigt werden müssen, die im Anschluß zu einem vollständigen Bild der Probe zusammengefügt werden müssen.
Im Stand der Technik sind Mikroskope zur elektronischen Bilderfassung großer Objektfelder bekannt, bei denen die Aufnahmepositionen zur Aufnahme von Teilbildern über motorische Antriebe in der Aufnahmeebene (x, y-Ebene) und die Fokuseinstellung (z-Achse) eingestellt werden.
Des weiteren sind mikroskopische Vorrichtungen bekannt, deren zu untersuchende Objekte vorzugsweise mit UV-Licht beleuchtet werden und fluoreszierende Objekte von einer elektronischen Kamera aufgenommen werden. Eine derartige Vorrichtung wird beispielsweise in EP 0 339 582 beschrieben.

Ein weiteres Problem besteht darin, daß die Proben oft nicht ideal eben sind (Durchwölbung der Präparate, Unebenheit der Objektträger, u. ä.), so daß beim automatischen Abrastern der Probe ein einmaliges Einstellen der Schärfeebene für eine sichere Detektion von Kontaminationen nicht ausreicht, weshalb Kontaminationen außerhalb der Schärfeebene übersehen werden könnten.

Überdies ist in derartigen Fällen eine Bestimmung der Schärfeebene eines Teilbildes mittels bekannter Verfahren sehr zeitaufwendig und mit langen oder mehrfachen Belichtungen verbunden. Für die Untersuchung fluoreszierender Substanzen ist das zeitaufwendige, insbesondere mehrfach erforderliche Suchen der Schärfeebene jedoch nachteilig, da mit zunehmender Belichtung der Probe die fluoreszierenden Substanzen ihre Leuchtkraft verlieren, wodurch sie unsichtbar werden und das Ergebnis der Untersuchung verfälschen.

DE 101 01 624 beschreibt ein Verfahren zur automatischen Scharfeinstellung eines optischen Systems. Hierbei handelt es sich um eine Weiterentwicklung des sogenannten Spitzen-Stop-Verfahrens, bei dem die Fokussierung eines Objektives auf eine Probe durch eine schrittweise Bewegung der Probe (oder der Objektivlinse des Objektives) entlang der optischen Achse der Objektivlinse in eine Position maximalen Kontrastes auf ebendieser optischen Achse erfolgt. Das in DE 101 01 624 beschriebene Verfahren versagt jedoch, wenn es bei der Untersuchung ausgedehnter transparenter Proben verwendet werden soll, die nur sehr wenige oder keine Kontaminationen oder anderen Gebilden enthalten.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes von ausgedehnten Objekten mittels eines optischen Systems angegeben werden, das eine verbesserte, insbesondere schnellere und genauere Fokussierung auf das Objekt ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 6.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines Objektes mittels eines optischen Systems, wobei das Bild aus mehreren Teilbildern zusammenzusetzen ist, vorgesehen, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Festlegen einer Anzahl n von Meßpunkten auf dem Objekt in der Aufnahmeebene des optischen Systems, wobei die Anzahl n der Meßpunkte gleich oder größer drei ist
(b) Bestimmen der Schärfeebene für jeden dieser Meßpunkte;
(c) Berechnen eines Höhenprofils des Objektes aus den für jeden Meßpunkt ermittelten Schärfeebenen und
(d) Aufnehmen der Teilbilder durch Abrasterung des Objektes, wobei die Anzahl m von Teilbildern größer als die Anzahl n von Meßpunkten ist und wobei die Schärfeebene jedes Teilbildes aus dem Höhenprofil des Objektes berechnet wird.

Das Verfahren ermöglicht die Aufnahme einer Vielzahl von Teilbildern in vergleichsweise kurzer Zeit, da aus dem Höhenprofil die für die Aufnahme des jeweiligen Teilbildes erforderliche Schärfeebene bestimmt werden kann. Es ist also nicht erforderlich, die Schärfeebene durch Anwendung bekannter Verfahren zur automatischen Fokussierung für jedes einzelne Bild gesondert zu bestimmen.

Der Begriff "Objekt" und der Begriff "Probe" werden in der vorliegenden Beschreibung synonym verwendet.

Die Anzahl der Meßpunkte sollte so auf dem Objekt verteilt sein, daß ein Höhenprofil aus den für jedem Meßpunkt ermittelten Schärfeebenen durch Interpolation zwischen den Meßpunkten und durch Extrapolation außerhalb der von den Meßpunkten begrenzten Fläche berechnet werden kann.

Unter dem Ausdruck "Festlegen einer Anzahl n von Meßpunkten" ist zu verstehen, daß sowohl die Anzahl n der Meßpunkt als auch deren Position x_n, y_n in der x, y-Ebene festgelegt wird.

Die Meßpunkte werden auf dem Objekt vorzugsweise so gewählt, daß sie gleichmäßig über das Objekt verteilt sind. Besonders bevorzugt sollten sich Meßpunkte am Rand des Objektes und in dessen Zentrum befinden, wobei Rand und Zentrum des Objektes nach einem Ausmessen des Objektes bestimmt werden.

Vorzugsweise wird in Schritt (b) die Schärfeebene für jeden Meßpunkt durch Messung des relativen Kontrastes bei einer schrittweisen Bewegung des Objektes oder einer Objektivlinse des optischen Systems entlang einer optischen Achse (z-Achse) der Objektivlinse gemessen und der maximale Kontrast des Objektes für diesen Meßpunkt bestimmt.

Bei ausgedehnten Objekten werden die Meßpunkte zweckmäßigerweise durch Bewegen des Objektes in der Aufnahmeebene (x, y-Ebene) relativ zu der Objektivlinse des optischen Systems angesteuert. Unter einem ausgedehnten Objekt im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Objekt verstanden, daß aus mehreren Teilbildner besteht. Hat beispielsweise die Probe einen Durchmesser von 1,5 cm, so müssen bei einer Teilbildgröße von 1 mm² mindestens 176 Teilbilder aufgenommen werden, wozu die Probe abgerastert wird. Die Kontaminationen haben eine Größe von wenigen Quadratmikrometern. Die Größe eine Teilbildes hängt von der Auflösung der verwendeten Kamera ab.

Unter Schärfeebene wird die Schärfe eines Teilbildes verstanden. Zur Bestimmung der Schärfeebene können die allgemein bekannten Verfahren verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch in Schritt (b) die Schärfeebene durch Bestimmung des maximalen Kontrastes ermittelt.

Zur Aufnahme von Teilbildern ausgedehnter Objekte wird das Objekt zweckmäßigerweise in der Aufnahmeebene (x, y-Ebene) relativ zu der Objektivlinse des optischen Systems bewegt. Dabei sollte das Objekt derartig abgerastert werden, daß jeweils für aneinander angrenzende Teilbereiche des Objektes Teilbilder aufgenommen werden. Die Schärfeebene für jeden Teilbereich bzw. das Teilbild, das für jeden Teilbereich erhalten werden soll, wird aus dem Höhenprofil berechnet.

Optisch sichtbare Markierungen sind Markierungen, die sich deutlich von den zu detektierenden Objekten unterscheiden, von denen besonders Markierungen mit anderen Farben und Formen bevorzugt werden, die durch Bildauswerteprogramme sehr einfach von den Kontaminationen unterschieden werden können. Geeignete Marker zur Erzeugung derartiger Markierungen sind beispielsweise Cyaninfarbstoffe.

Sollte sich nur eine geringe Zahl an Gebilden oder keine Gebilde in der Probe befinden, die optisch erfaßt werden können, so kann es ferner zweckmäßig sein, optisch sichtbare Markierungen, d. h. Marker, in die Probe einzubringen, wobei die Position der optisch sichtbaren Markierungen in der Aufnahmeebene des optischen Systems als Meßpunkt verwendet werden kann. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Meßpunkte können alle auf der Verwendung derartiger Markierung beruhen. Es ist jedoch auch möglich, neben Meßpunkten, die sich aus der Verwendung derartiger Markierung ergeben, auch Meßpunkte zu verwenden, die sich aus bereits in dem Objekt vorhandenen Gebilden ermitteln lassen.

Die Marker können gleichmäßig über das Objekt verteilt werden oder an ausgewählten Orten auf das Objekt aufgebracht werden, vorzugsweise am Rand und im Zentrum des Objektes.

Das Verfahren läßt sich mit jedem optischen System durchführen, daß eine Bewegung des Objektes in der Aufnahmeebene (x, y-Ebene) relativ zu dem Objektiv des optischen Systems ermöglicht und daß ferner eine Bewegung des Objektes relativ zum dem Objektiv des optischen Systems entlang der optischen Achse (z-Achse) der Objektivlinse des Objektives ermöglicht.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen ausführlicher beschrieben. Dabei zeigen
1 eine schematische Darstellung eines optischen Systems, daß zum Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung geeignet ist;
2 eine schematische Darstellung einer Probe, auf die optisch sichtbare Markierungen aufgebracht sind; und
3 eine schematische Darstellung eines Höhenprofils, daß für die in 2 gezeigte Probe ermittelt worden ist.
Gemäß 1 wird als optisches System ein Fluoreszenzlicht-Mikroskop 1 mit Objektiv 1.1 mit einer Objektivlinse 1.2 verwendet, wobei das Mikroskop 1 ferner eine Beleuchtungseinheit 2, einen Objekttisch 13 zur Aufnahme des abzubildenden Objektes 8, motorische Verstelleinrichtungen zum Bewegen des Objekttisches 13, auf den das Objekt 8 aufgebracht werden kann, in x-, y- und z-Richtung 3 (M1), 4 (M2), 5 (M3), eine Bilderfassungseinheit 6 sowie eine Rechnereinheit 7 zur Steuerung der Relativbewegungen zwischen Objekttisch 13 und Objektivlinse 1.2, zur Festlegung der Meßpunkte, Speicherung der für die Meßpunkte ermittelten Schärfeebenen, Berechnung des Höhenprofils und daraus der Schärfeebene für die Teilbilder sowie zum Zusammenfügen der Teilbilder zu einem Bild des Objektes umfaßt.
In 2 ist ein zu untersuchendes Präparat dargestellt. Es besteht aus einem Objektträger 9, einem Objekt 8 aus einem Filterplättchen, auf dem sich markierte Kontaminationen 11 und in die Probe eingebrachte, optisch sichtbare Markierungen 12 befinden.
Dieses Präparat wird auf den Objekttisch 13 aufgebracht. Sodann wird die Probe mittels der Verstelleinrichtungen 3, 4 in die erste Aufnahmeposition (x₁, y₁) in der x, y-Ebene bewegt, in der eine Markierung 12 in der Probe enthalten ist. Anschließend bewegt die Verstelleinrichtung 5 die Probe schrittweise in z-Richtung. In jeder Aufnahmeposition z_1,d wird eine Bildaufnahme mit der Bilderfassungseinheit 6 durchgeführt und mit geeigneten Algorithmen z. B. der Kontrast in dem erhaltenen Bild bestimmt. Der relative Kontrast wird für jeden dieser Schritte d in z-Richtung bestimmt und nach Durchlaufen aller Schritte die Position (z_1,dmax) mit dem maximalen Kontrast für die Position (x₁, y₁) gespeichert. Danach wird dieser Vorgang für die Aufnahmepositionen mit anderen Markierungen durchgeführt und die jeweiligen Werte (x₂, y₂, z_2,dmax; x_n, y_n, z_n,dmax) bestimmt.
Aus den gewonnenen Werten wird im einfachsten Fall durch Berechnung eines ebenen Flächensegmentes das durch drei benachbarten Werte (x_n, y_n, z_n,dmax) aufgespannt wird, ein Höhenprofil berechnet. Ein Beispiel eines solchen Höhenprofils ist in 3 dargestellt. Bei der Berücksichtigung von mehr als drei Meßpunkten können auch gekrümmte Flächen berechnet werden, wodurch die Genauigkeit der Schärfeebene erhöht wird.
Zur Aufnahme der Teilbilder, aus denen das Bild dann zusammengesetzt werden soll, werden dann nach einem vorgegebenen Algorithmus (z. B. Matrixabtastung, kreisförmige Abtastung oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren) die Aufnahmepositionen (x'_m, y'_m) angefahren, der dazugehörige Fokuspunkt (z'_m) aus dem zuvor bestimmten Höhenprofil berechnet, durch die Verstellvorrichtung 5 angefahren, das Teilbild für diese Aufnahmeposition aufgenommen und in der Rechnereinheit 7 ab gespeichert. Nach Durchlaufen aller Aufnahmepositionen (x'_m, y'_m, z'_m) werden die (beispielsweise ca. 1000) Teilbilder im Speicher der Rechnereinheit 7 zusammengefügt, so daß man ein vollständiges elektronisches Abbild des Objektes 8 mit einer ausreichenden Schärfe in kürzester Zeit erhält, die es gestattet, eine Bildauswertung vorzunehmen.
Die verwendeten Symbole haben folgende Bedeutung:

n: Anzahl der Meßpunkte
m: Anzahl der Teilbilder (= Anzahl der Aufnahmepositionen)
x,: y Koordinaten in der Aufnahmeebene
z: Koordinate parallel zur optischen Achse des Objektives
d: Anzahl der Schritte auf der z-Koordinate
d_max: z_d-Wert mit maximalem Kontrast
x_n, y_n, z_n,dmax: Position der Meßpunkte
x'_m, y'_n, z'_n: Position zur Aufnahme der Teilbilder (Aufnahmeposition)

1: Mikroskop
1.1: Objektivlinse
1.2: Objektiv
2: Beleuchtungseinheit
3: Verstelleinrichtungen für die x-Koordinate
4: Verstelleinrichtungen für die y-Koordinate
5: Verstelleinrichtungen für die z-Koordinate
6: Bilderfassungseinheit
7: Rechnereinheit
8: Objekt (Filterplättchen)
9: Objektträger
11: Kontaminationen
12: optisch sichtbare Markierungen
13: Objekttisch

Claims

Verfahren zum Erzeugen eines Bildes eines Objektes mittels eines optischen Systems, wobei das Bild aus mehreren Teilbildern zusammenzusetzen ist, umfassend die Schritte (a) Festlegen einer Anzahl n von Meßpunkten auf dem Objekt in der Aufnahmeebene des optischen Systems, wobei die Anzahl n der Meßpunkte gleich oder größer drei ist; (b) Bestimmen der Schärfeebene z_n für jeden dieser Meßpunkte; (c) Berechnen eines Höhenprofils des Objektes aus den für jeden Meßpunkt ermittelten Schärfeebenen und (d) Aufnehmen der Teilbilder durch Abrasterung des Objektes, wobei die Anzahl m von Teilbildern größer als die Anzahl n von Meßpunkten ist und wobei die Schärfeebene jedes Teilbildes aus dem Höhenprofil des Objektes bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Schärfeebene für jeden Meßpunkt durch Messung des relativen Kontrastes bei einer schrittweisen Bewegung des Objektes oder einer Objektivlinse des optischen Systems entlang einer optischen Achse der Objektivlinse gemessen und der maximale Kontrast des Objektes für diesen Meßpunkt berechnet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßpunkte durch Bewegen des Objektes in der Aufnahmeebe ne relativ zu der Objektivlinse des optischen Systems angesteuert werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (b) die Schärfeebene durch Bestimmung des maximalen Kontrastes ermittelt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme der Teilbilder das Objekt in der Aufnahmeebene relativ zu der Objektivlinse des optischen Systems bewegt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Festlegen einer Anzahl n von Meßpunkten in der Aufnahmeebene des optischen Systems in Schritt (a) das Einbringen zumindest einer optisch sichtbaren Markierung in die Probe umfaßt, wobei die Position der zumindest einen optisch sichtbaren Markierung in der Aufnahmeebene des optischen Systems anschließend als Meßpunkt verwendet wird.