DE10359374A1

DE10359374A1 - Raster microscope sample investigation procedure for fluorescent lifetime imaging microscopy examination combines continuous and pulsed light through beam splitter and acousto-optic component

Info

Publication number: DE10359374A1
Application number: DE2003159374
Authority: DE
Inventors: Heinrich Dr. Ulrich; Werner Dr. Knebel
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2005-07-14

Abstract

A raster microscope sample investigation procedure combines continuous (11) and pulsed (5) light of the same wavelength to excite sample (41) photo activity for a FLIM (Fluorescent Lifetime Imaging Microscopy) examination and couples it into the microscope (37) through a beam splitter (19) and power adjusting (13) acousto optic (15) component. Independent claims are included for a raster microscope using the procedure with light guide carrying the combined light.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe.The The invention relates to a method for scanning microscopic examination a sample.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Rastermikroskop mit einer Lichtquelle, die gepulste Lichtstrahlung erzeugt, die eine Wellenlänge aufweist.The Invention also relates a scanning microscope with a light source, the pulsed light radiation generates a wavelength having.

In der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so daß ein Spiegel in x- und der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen.In Scanning microscopy (scanning microscopy) is a sample with a Light beam illuminated to reflect the reflection emitted by the sample. or to observe fluorescent light. The focus of the illumination beam is using a controllable beam deflector, in general by tilting two mirrors, moving in an object plane, where the deflection axes are usually perpendicular to each other, so that a mirror in x and the other in deflects y-direction. The tilt of the mirror, for example accomplished with the help of galvanometer actuators. The performance of the light coming from the object depends on the position of the object Scanning beam measured.

Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.specially in confocal scanning microscopy becomes an object with the focus a light beam scanned in three dimensions.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.One confocal scanning microscope generally comprises a light source a focusing optics, with the light of the source on a pinhole - the so-called. Excitation aperture - focused is a beam splitter, a beam deflecting device for beam control, a microscope optics, a detection aperture and the detectors for Detection of the detection or fluorescent light. The illumination light is over a Beam splitter coupled. The fluorescence emitted by the object or reflection light passes over the beam deflector back to the beam splitter, this happens, then to the detection panel to be focused behind which the detectors are located. Detection light, that does not come directly from the focus region takes another Light path and does not pass the detection aperture, so you have one Receives point information, by sequentially scanning the object to a three-dimensional one Picture leads. Usually, a three-dimensional image is formed by layerwise image data acquisition achieved.

Im Allgemeinen werden die zu untersuchenden Proben mit einer Markierung, meist einem Fluoreszenzfarbstoff, der optisch anregbar ist, versehen. Bei diesen Farbstoffen kann es sich beispielsweise auch um GFP (Green-Fluorescence-Protein) oder CFP (Cyan-Fluorescence-Protein) handeln.in the In general, the samples to be tested are labeled with a label, usually a fluorescent dye which is optically excitable provided. at these dyes may also be, for example, GFP (Green Fluorescence Protein) or CFP (cyan fluorescence protein).

Durch Messung der Lebensdauer des angeregten Zustandes eines Probenfarbstoffs oder eines Teils der Probe kann sowohl die Auflösung als auch der Kontrast gesteigert werden. Hierdurch wird unter anderem eine Gewebsunterscheidung (Zellmorphologie, Krebsfrüherkennung) ermöglicht. Mit Lifetimemessungen erhält man einen weiteren Parameter, der zur Unterscheidung von verschiedenen Farbstoffen und der Autofluoreszenz dient.By Measurement of the lifetime of the excited state of a sample dye or part of the sample can be both the resolution and the contrast be increased. As a result, among other things, a tissue distinction (Cell morphology, early cancer detection) allows. Received with lifetimetry measurements one more parameter that distinguishes from different ones Dyes and the autofluorescence serves.

Es hat sich mittlerweile der Begriff FLIM (Fluorescence-Lifetime-Imaging-Microscopy) eingebürgert. Oft wird FLIM in Kombination mit FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) meist unter Verwendung von GFP-Markierungen zum Studium von molekularen Wechselwirkungen verwendet.It Meanwhile, the term FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) has become established. Often is FLIM combined with FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) mostly using GFP tags used for the study of molecular interactions.

Aus DE 690 33 621 T2 ist ein Rastermikroskop mit einem Pulslaser, der Lichtpulse im Subpicosekundenbereich emittiert, bekannt. Das Rastermikroskop basiert auf der Zweiphotonen-Anregung von Fluorophoren mit Hilfe der kurzen Lichtimpulse hoher Intensität.Out DE 690 33 621 T2 is a scanning microscope with a pulse laser that emits light pulses in the subpicosecond known. The scanning microscope is based on the two-photon excitation of fluorophores using the short high-intensity light pulses.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe anzugeben, das es gestattet, gleichzeitig verschiedene Prozesse in einer Probe auszulösen und beispielsweise im Rahmen eines FLIM-Experiments zu beobachten.It The object of the present invention is a method for scanning microscopy To provide an examination of a sample that allows simultaneous trigger different processes in a sample and, for example, in the context to observe a FLIM experiment.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• Erzeugen von kontinuierlicher Lichtstrahlung, die eine Wellenlänge aufweist,
• Erzeugen von gepulster Lichtstrahlung, die im Wesentlichen dieselbe Wellenlänge wie die kontinuierliche Lichtstrahlung aufweist,
• Vereinigen der kontinuierlichen und der gepulsten Lichtstrahlung mit einem Vereinigungsmittel,
• Einkoppeln der vereinigten Lichtstrahlung in ein Rastermikroskop.

The object is achieved by a method which is characterized by the following steps:

Generating continuous light radiation having a wavelength,
Generating pulsed light radiation having substantially the same wavelength as the continuous light radiation,
Combining the continuous and the pulsed light radiation with a combining agent,
• Coupling of the combined light radiation in a scanning microscope.

Es ist ermöglicht, gleichzeitig verschiedene Prozesse – beispielsweise Photoaktivierung – in einer Probe auszulösen und dabei die Probe – beispielsweise im Rahmen eines FLIM-Experiments – beobachten zu können.It is possible simultaneously different processes - for example photoactivation - in one To trigger a sample and doing the sample - for example as part of a FLIM experiment - to observe.

Diese Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine weitere Lichtquelle vorgesehen ist, die kontinuierliche Lichtstrahlung im Wesentlichen derselben Wellenlänge wie der der gepulsten Lichtstrahlung erzeugt, dass ein Vereinigungsmittel die gepulste und die kontinuierliche Lichtstrahlung vereinigt, und dass ein Einkoppelmittel die vereinigte Lichtstrahlung in den Strahlengang des Rastermikroskops einkoppelt.These Task is solved by a scanning microscope, which characterized is that another light source is provided, the continuous one Light radiation of substantially the same wavelength as that of the pulsed light radiation produces a combining agent that is pulsed and continuous Light radiation combined, and that a coupling agent united the Light radiation coupled into the beam path of the scanning microscope.

Die Erfindung hat den Vorteil, dass durch den simultanen und/oder frameweisen, linienweisen oder punktweisen Einsatz beider Lichtstrahlen der Prozess der Photoaktivierung durch die Lifetimemessung detektiert und bestätigt werden kann.The Invention has the advantage that by the simultaneous and / or frame, Line by line or pointwise use of both light beams of the process Photoactivation can be detected and confirmed by the Lifetimemessung can.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante beinhaltet das Verfahren den weiteren Schritt des Auslösens einer Photoaktivierung in der Probe mit der kontinuierlichen Lichtstrahlung. Die Probe ist hierbei vorzugsweise mit natürlichen Farbstoffen, wie GFP-, CFP-, YFP-Varianten markiert. Beispielsweise kann mit der Strahlung eines Lasers, der kontinuierliche Lichtstrahlung von 405 nm Wellenlänge emittiert, eine Photoaktivierung einer GFP-Variante in der Probe durchgeführt werden. Hierbei entsteht nach einiger Zeit eine GFP-Konformation, die dann mit weiterer Lichtstrahlung von 488 nm Wellenlänge optisch anregbar ist.In a preferred embodiment variant includes the process the further step of triggering a photoactivation in the sample with the continuous light radiation. The sample is here preferably with natural Dyes labeled as GFP, CFP, YFP variants. For example, can with the radiation of a laser, the continuous light radiation of 405 nm wavelength emitted, a photoactivation of a GFP variant in the sample carried out become. This results in a GFP conformation after some time, then optically excited with further light radiation of 488 nm wavelength is.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante des Verfahrens ist der Schritt des Durchführens einer FLIM-Untersuchung mit der gepulsten Lichtstrahlung vorgesehen. Vorzugsweise wird hierfür gepulste Lichtstrahlung von 405 nm Wellenlänge verwendet, wobei beispielsweise GFP oder CFP Farbstoffe optisch anregbar sind. Hierbei wird GFP nur im kurzwelligen Bereich des Absorptionsspektrums angeregt, da das Maximum der Absorption bei ca. 488 nm liegt. Ohne eine vorherige Photoaktivierung würde eine FLIM-Messung in einem herkömmlichen Frameversion-FLIM-Imaging-System typischerweise ca. 10 Sekunden dauern, bis die Ergebnisse eine so gute Statistik aufweisen, dass die Messung aussagekräftig ist. Erfindungsgemäß kann durch starke Erhöhung des GFP-Anteils durch Photoaktivierung mit kontinuierlichem Laserlicht die Statistik für die FLIM-Auswertung wesentlich erhöht werden. Die Ergebnisse sind dann schneller erzielbar und zuverlässiger.In a further preferred embodiment of the method is the step of performing a FLIM examination provided with the pulsed light radiation. Preferably, this is pulsed Light radiation of 405 nm wavelength used, for example GFP or CFP dyes are optically excitable. This is only GFP excited in the short-wave range of the absorption spectrum, since the Maximum of the absorption is about 488 nm. Without a previous one Photoactivation would a FLIM measurement in a conventional Frame version FLIM imaging system typically about 10 seconds take until the results have such good statistics that the measurement meaningful is. According to the invention can by strong increase of GFP content by photoactivation with continuous laser light the statistics for the FLIM evaluation is significantly increased. The results are then achievable faster and more reliable.

Vorzugsweise erfolgt die Photoaktivierung in der Probe linien- oder punktweise. Hierzu wird der Fokus der kontinuierlichen Lichtstrahlung mit Hilfe einer Strahlablenkeinrichtung entsprechend über die Probe geführt.Preferably the photoactivation takes place in the sample linewise or pointwise. For this purpose, the focus of the continuous light radiation with the help a beam deflector performed accordingly over the sample.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird linien- oder punktweise zunächst mit der kontinuierlichen Laserstrahlung eine Photoaktivierung vorgenommen und danach mit der gepulsten Laserstrahlung eine FLIM-Messung durchgeführt. In der Zeit zwischen der Photoaktivierung und dem Start der FLIM-Messung ist eine Fortbewegung der GFP-Moleküle aufgrund der Diffusion noch nicht sehr weit erfolgt. Der besondere Vorteil dieses Verfahrens liegt also darin, dass eine ortsgenaue Zuordnung der gemessenen Lebensdauerzeiten erfolgen kann.In a preferred embodiment becomes linewise or pointwise first photoactivated with the continuous laser radiation and then using the pulsed laser radiation to perform a FLIM measurement. In the time between the photoactivation and the start of the FLIM measurement is a movement of the GFP molecules due to diffusion yet not very far. The particular advantage of this method lies in the fact that a location-accurate assignment of the measured Lifetime can be done.

Vorzugsweise liegt die Wellenlänge der kontinuierlichen Lichtstrahlung und die Wellenlänge der gepulsten Lichtstrahlung im Bereich von 350 nm bis 420 nm. Vorzugsweise beträgt die Wellenlänge der kontinuierlichen Laserstrahlung und die Wellenlänge der gepulsten Laserstrahlung 405 nm. Das Vereinigungsmittel umfasst vorzugsweise einen Strahlteiler, insbesondere einen Polarisationsstrahlteiler.Preferably is the wavelength the continuous light radiation and the wavelength of the pulsed Light radiation in the range of 350 nm to 420 nm. Preferably, the wavelength of the continuous Laser radiation and the wavelength of the pulsed laser radiation 405 nm. The combining agent comprises preferably a beam splitter, in particular a polarization beam splitter.

Der Einsatz von Lichtstrahlung im einem Wellenlängenbereich zwischen 350 nm bis 420 nm hat den Vorteil, dass neben einer Photoaktivierung auch andere Prozesse, wie die Freisetzung von caged-Calcium oder eine Konformationsänderung, wie beispielsweise des Calcium-Indikators „Chameleon", bewirkt werden kann und damit vorzugsweise eine lokale Calciumkonzentration mit Hilfe von FRET-Messungen bestimmbar sind.Of the Use of light radiation in a wavelength range between 350 nm to 420 nm has the advantage that in addition to a photoactivation also other processes, such as the release of caged calcium or a conformational such as the calcium indicator "Chameleon" can be effected and thus preferably a local calcium concentration can be determined with the aid of FRET measurements are.

Besonders vorteilhaft ist die Kombination von kontinuierlicher Lichtstrahlung in einem Wellenlängenbereich zwischen 350 nm und 370 nm mit einer gepulsten Lichtstrahlung um 405 nm, weil sich durch die aufeinander folgende Bestrahlung der beiden Lichtstrahlungen die spektralen Eigenschaften einiger GFPs in so einer Weise verändern lassen, dass es zu einem „An- und/oder Ausschalten" der GFPs kommt.Especially advantageous is the combination of continuous light radiation in a wavelength range between 350 nm and 370 nm with a pulsed light radiation 405 nm, because the successive irradiation of the Both light radiations the spectral properties of some GFPs change in such a way let it be a " and / or shutting down "the CFPs comes.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform wird die mit Hilfe des Vereinigungsmittels vereinigte kontinuierliche und gepulste Lichtstrahlung in einen Lichtleiter eingekoppelt, der vorzugsweise als polarisationserhaltende Lichtleitfaser ausgeführt ist. In der polarisationserhaltenden Lichtleitfaser werden die Lichtstrahlungen (gepulst und kontinuierlich), die aufgrund der polarisationsabhängigen Strahlvereinigung eine unterschiedliche Polarisation aufweisen (s- und p-Polarisation) unabhängig voneinander von der Lichtleitfaser geführt.In A preferred embodiment is the with the aid of the combining agent combined continuous and pulsed light radiation into a light guide coupled, preferably as a polarization-maintaining optical fiber accomplished is. In the polarization-maintaining optical fiber, the light radiations become (pulsed and continuous), which due to the polarization-dependent beam combination a have different polarization (s and p polarization) independently guided from each other by the optical fiber.

Die die vereinigte Lichtstrahlung in den Beleuchtungsstrahlengang einkoppelnde Einkoppeloptik (Hauptstrahlteiler) und die übrigen optischen Elemente im Strahlengang des Rastermikroskops sind vorzugsweise derart ausgeführt, dass sie für beide Polarisationen der Lichtstrahlungen gleichermaßen geeignet sind. Das die vereinigte Lichtstrahlung in den Strahlengang des Rastermikroskops einkoppelnde Einkoppelmittel wirkt vorzugsweise weitgehend polarisationsunabhängig.The the combined light radiation einkoppelnde in the illumination beam path Einkoppeloptik (main beam splitter) and the other optical elements in Beam path of the scanning microscope are preferably designed such that she for Both polarizations of light radiation equally suitable are. The combined light radiation in the beam path of the Raster microscope einkoppelnde coupling preferably acts largely polarization independent.

Vorzugsweise beinhaltet die Lichtquelle und/oder die weitere Lichtquelle zumindest einen Laser. Hierbei kann es sich beispielsweise um Festkörperlaser oder um Gaslaser handeln. Vorzugsweise ist der Laser als Halbleiterlaser ausgeführt.Preferably includes the light source and / or the further light source at least a laser. This may be, for example, solid-state lasers or act on gas lasers. Preferably, the laser is a semiconductor laser executed.

In einer bevorzugten Variante des Rastermikroskops sind Mittel zum Einstellen der Lichtleistung der kontinuierlichen Lichtstrahlung und/oder der gepulsten Lichtstrahlung vorgesehen. Diese Mittel beinhalten vorzugsweise ein akustooptisches Bauteil, beispielsweise einen AOTF (acousto-optical-tunable-filter).In a preferred variant of the scanning microscope means for adjusting the light output of the continuous light radiation and / or the provided pulsed light radiation. These means preferably include an acousto-optical component, for example an AOTF (acousto-optical tunable filter).

Zum Durchführen von Lifetime-Experimenten beinhaltet das Rastermikroskop Mittel zum Erfassen der Zerfallszeit des angeregten Zustands einer Probe. In der Fluorescence-Lifetime-Imaging-Microscopy (FLIM) wird die Lebensdauer der angeregten Farbstoffmoleküle in jedem Bildpunkt (Pixel) der gescannten Bilder bestimmt. Der Kontrast im Bild resultiert aus den unterschiedlichen Lebensdauerzeiten der verschiedenen Fluorochrome. Typischerweise wird ein gepulster Laser zur optischen Anregung der Farbstoffe verwendet. Zur zeitaufgelösten Detektion wird die Methode des Time-Correlated-Single- Photon-Counting (TCSPC) angewendet. Dabei wird die Zeitdifferenz zwischen der Anregung der Farbstoffe und der anschließenden Abregung gemessen.To the Carry out Lifetime experiments involves the scanning microscope means for detecting the decay time of the excited state of a sample. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) uses the Lifetime of the excited dye molecules in each pixel the scanned images. The contrast in the picture results from the different lifetimes of the different fluorochromes. Typically, a pulsed laser is used to optically excite the dyes uses. To the time-resolved Detection becomes the method of Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) applied. The time difference between the excitation of the Dyes and the subsequent Dexterity measured.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsvariante ist das Rastermikroskop als konfokales Rastermikroskop ausgestaltet.In a very particularly preferred embodiment is the scanning microscope designed as a confocal scanning microscope.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigt:In the drawing of the subject invention is shown schematically and will be described below with reference to the figures. Showing:

Fig. ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einer Lichtquelle und einer weiteren Lichtquelle.FIG. a scanning microscope according to the invention with a light source and another light source.

Die Figur zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einer Lichtquelle 1, die als Pulslaser 3 ausgeführt ist. Die Lichtquelle 1 emittiert gepulste Lichtstrahlung 5, einer Wellenlänge von 405 nm. Das Rastermikroskop beinhaltet eine weitere Lichtquelle 7, die als Halbleiterlaser 9 ausgeführt ist, der kontinuierliche Lichtstrahlung 11 mit einer Wellenlänge von 405 nm emittiert. Im Strahlengang der kontinuierlichen Lichtstrahlung befindet sich ein Mittel zum Einstellen der Lichtleistung 13, das als AOTF 15 ausgebildet ist. Die gepulste Lichtstrahlung 5 und die kontinuierliche Lichtstrahlung 11 werden von einem Vereinigungsmittel 17, das als Polarisationsstrahlteiler 19 ausgeführt ist, koaxial vereinigt und von einer Optik 21 in einen Lichtleiter 23, der als polarisationserhaltende Lichtleitfaser 25 ausgebildet ist, eingekoppelt. Im Querschnitt 27 der polarisationserhaltenden Lichtleitfaser 25 erkennt man einen elliptischen Faserkern 29. In dem Ausführungsbeispiel weist die kontinuierliche Lichtstrahlung 11 eine saggitale Linearpolarisation auf, während die gepulste Lichtstrahlung 5 eine tangentiale Linearpolarisation aufweist. In der polarisationserhaltenden Lichtleitfaser 25 werden die Lichtstrahlungen (gepulst und kontinuierlich) unabhängig voneinander entsprechend ihrer Linearpolarisationsrichtung geführt. Die aus der polarisationserhaltenden Lichtleitfaser 25 austretende Lichtstrahlung wird mit Hilfe der weiteren Optik 31 kollimiert und mit einem Einkoppelmittel 33, das als dichroitischer Strahlteiler 35 ausgeführt ist, in den Strahlengang des Rastermikroskops 37 eingekoppelt und mit Hilfe des Objektivs 39 auf die Probe 41 fokussiert. Nicht eingezeichnet sind der besseren Übersichtlichkeit halber die den Fokus der Lichtstrahlung über die Probe 41 führende Strahlablenkeinrichtung und die üblicherweise im Beleuchtungs- bzw. Detektionsstrahlengang eines Rastermikroskops angeordneten optischen Elemente, wie beispielsweise Pinholeoptik, Scanlinse und Tubuslinse. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 43 gelangt durch das Objektiv 39 und durch den dichroitischen Strahlteiler 35 hindurch zu dem Detektor 45, der elektrische zur Leistung des Detektionslichts proportionale Signale erzeugt. Diese Signale werden mit einer nicht gezeigten Verarbeitungselektronik aufbereitet und können beispielsweise auf dem Monitor eines PCs als Abbild der Probe dargestellt werden.The figure shows a scanning microscope according to the invention with a light source 1 that as a pulse laser 3 is executed. The light source 1 emits pulsed light radiation 5 , a wavelength of 405 nm. The scanning microscope includes another light source 7 as a semiconductor laser 9 is executed, the continuous light radiation 11 emitted at a wavelength of 405 nm. In the beam path of the continuous light radiation is a means for adjusting the light output 13 that as AOTF 15 is trained. The pulsed light radiation 5 and the continuous light radiation 11 be from a unifying agent 17 , as a polarization beam splitter 19 is executed, coaxially united and of an optic 21 in a light guide 23 , which serves as a polarization-maintaining optical fiber 25 is formed, coupled. In cross section 27 the polarization-maintaining optical fiber 25 you can see an elliptical fiber core 29 , In the exemplary embodiment, the continuous light radiation 11 a saggital linear polarization, while the pulsed light radiation 5 has a tangential linear polarization. In the polarization-maintaining optical fiber 25 the light beams (pulsed and continuous) are guided independently of each other according to their linear polarization direction. The from the polarization-maintaining optical fiber 25 emerging light radiation is using the other optics 31 collimated and with a coupling agent 33 , as a dichroic beam splitter 35 is executed in the beam path of the scanning microscope 37 coupled and with the help of the lens 39 to the test 41 focused. Not shown are the sake of clarity, the focus of the light radiation over the sample 41 leading beam deflection device and the usually arranged in the illumination or detection beam path of a scanning microscope optical elements such as Pinholeoptik, scan lens and tube lens. The detection light emanating from the sample 43 passes through the lens 39 and through the dichroic beam splitter 35 through to the detector 45 which generates electrical signals proportional to the power of the detection light. These signals are processed with processing electronics, not shown, and can be displayed for example on the monitor of a PC as an image of the sample.

Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.The The invention has been described in relation to a particular embodiment. It is, of course, that changes and modifications performed can be without departing from the scope of the following claims.

11: Lichtquellelight source
33: Pulslaserpulse laser
55: gepulste Lichtstrahlungpulsed light radiation
77: weitere LichtquelleFurther light source
99: HalbleiterlaserSemiconductor laser
1111: kontinuierliche Lichtstrahlungcontinuous light radiation
1313: Mittel zum Einstellen der Lichtleistungmedium for adjusting the light output
1515: AOTFAOTF
1717: Vereinigungsmittelcombining means
1919: PolarisationsstrahlteilerPolarization beam splitter
2121: Optikoptics
2323: Lichtleiteroptical fiber
2525: polarisationserhaltene Lichtleitfaserpolarization maintaining optical fiber
2727: Querschnittcross-section
2929: Faserkernfiber core
3131: weitere OptikFurther optics
3333: Einkoppelmittelcoupling means
3535: Strahlteilerbeamsplitter
3737: Rastermikroskopscanning microscope
3939: Objektivlens
4141: Probesample
4343: Detektionslichtdetection light
4545: Detektordetector

Claims

Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe gekennzeichnet durch folgende Schritte: • Erzeugen von kontinuierlicher Lichtstrahlung, die eine Wellenlänge aufweist, • Erzeugen von gepulster Lichtstrahlung, die im Wesentlichen dieselbe Wellenlänge wie die kontinuierliche Lichtstrahlung aufweist, • Vereinigen der kontinuierlichen und der gepulsten Lichtstrahlung mit einem Vereinigungsmittel, • Einkoppeln der vereinigten Lichtstrahlung in ein Rastermikroskop.A method for scanning microscopic examination of a sample characterized by the following Steps: • generating continuous light radiation having a wavelength, • generating pulsed light radiation having substantially the same wavelength as the continuous light radiation, • combining the continuous and the pulsed light radiation with a combining agent, • coupling the combined light radiation in a scanning microscope ,

Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt: • Auslösen einer Photoaktivierung der Probe, die vorzugsweise mit GFP- oder CFP-Varianten markiert ist, mit der kontinuierlichen Lichtstrahlung.Method according to claim 1, characterized by further step: • triggering a Photoactivation of the sample, preferably with GFP or CFP variants is marked, with the continuous light radiation.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt: • Durchführen einer FLIM-Untersuchung, mit der gepulsten LichtstrahlungMethod according to one of claims 1 or 2, characterized through the further step: • performing a FLIM investigation, with the pulsed light radiation

Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Photoaktivierung frameweise, linienweise oder punktweise erfolgt.Method according to one of claims 2 or 3, characterized Photoactivation is frame-wise, line-wise or pointwise he follows.

Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die FLIM-Messung simultan und/oder sequentiell zur Auslösung der Photoaktivierung erfolgt.Method according to one of claims 2 to 4, characterized that the FLIM measurement is simultaneous and / or sequential for triggering the Photoactivation takes place.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge der kontinuierlichen Lichtstrahlung und die Wellenlänge der gepulsten Lichtstrahlung 350 nm bis 420 nm – vorzugsweise bei 405 nm – beträgt.Method according to one of claims 1 to 4, characterized that the wavelength the continuous light radiation and the wavelength of the pulsed light radiation 350 nm to 420 nm - preferably at 405 nm - is.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Vereinigungsmittel einen Strahlteiler, vorzugsweise einen Polarisationsstrahlteiler, umfasst.Method according to one of claims 1 to 6, characterized that the combining means a beam splitter, preferably a Polarization beam splitter comprises.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche Lichtstrahlung und/oder die gepulste Lichtstrahlung Laserstrahlung ist.Method according to one of claims 1 to 7, characterized that the continuous light radiation and / or the pulsed light radiation laser radiation is.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Einstellen der Lichtleistung der kontinuierlichen Lichtstrahlung und/oder der gepulsten Lichtstrahlung vorgesehen sind.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that means for adjusting the light output of the continuous Light radiation and / or the pulsed light radiation are provided.

Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Einstellen der Lichtleistung ein akustooptisches Bauteil, vorzugsweise einen AOTF, beinhalten.Method according to claim 9, characterized in that the means for adjusting the light output are acousto-optic Component, preferably an AOTF include.

Rastermikroskop mit einer Lichtquelle, die gepulste Lichtstrahlung erzeugt, die eine Wellenlänge aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere Lichtquelle vorgesehen ist, die kontinuierliche Lichtstrahlung im Wesentlichen derselben Wellenlänge wie der der gepulsten Lichtstrahlung erzeugt, dass ein Vereinigungsmittel die gepulste und die kontinuierliche Lichtstrahlung vereinigt, und dass ein Einkoppelmittel die vereinigte Lichtstrahlung in den Strahlengang des Rastermikroskops einkoppelt.Scanning microscope with a light source pulsed Generates light radiation having a wavelength, characterized that a further light source is provided, the continuous one Light radiation of substantially the same wavelength as that of the pulsed light radiation produces a combining agent that is pulsed and continuous Light radiation combined, and that a coupling agent united the Light radiation coupled into the beam path of the scanning microscope.

Rastermikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge der kontinuierlichen Lichtstrahlung und die Wellenlänge der gepulsten Lichtstrahlung 350 nm bis 420 nm – vorzugsweise bei 405 nm – beträgt.Scanning microscope according to claim 11, characterized in that that the wavelength the continuous light radiation and the wavelength of the pulsed light radiation 350 nm to 420 nm - preferably at 405 nm - is.

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 oder 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Vereinigungsmittel einen Strahlteiler, vorzugsweise einen Polarisationsstrahlteiler, umfasst.Scanning microscope according to one of claims 11 or 1, characterized in that the combining means comprises a beam splitter, preferably a polarization beam splitter.

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Einstellen der Lichtleistung der kontinuierlichen Lichtstrahlung und/oder der gepulsten Lichtstrahlung vorgesehen sind.Scanning microscope according to one of claims 11 to 13, characterized in that means for adjusting the light output the continuous light radiation and / or the pulsed light radiation are provided.

Rastermikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Einstellen der Lichtleistung ein akustooptisches Bauteil, vorzugsweise einen AOTF, beinhalten.Scanning microscope according to claim 14, characterized in that the means for adjusting the light output are acousto-optic Component, preferably an AOTF include.

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lichtleiter vorgesehen ist, der die vereinigte Lichtstrahlung transportiert.Scanning microscope according to one of claims 11 to 15, characterized in that a light guide is provided, which transports the combined light radiation.

Rastermikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtleiter eine Lichtleitfaser, vorzugsweise eine polarisationserhaltende Lichtleitfaser, istScanning microscope according to claim 16, characterized in that the optical waveguide is an optical fiber, preferably a polarization-maintaining optical waveguide Optical fiber, is

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Einkoppelmittel weitgehend polarisationsunabhängig wirkt.Scanning microscope according to one of claims 11 to 17, characterized in that the coupling means largely polarization independent acts.

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle und/oder die weitere Lichtquelle zumindest einen Laser beinhaltet.Scanning microscope according to one of claims 11 to 18, characterized in that the light source and / or the other Light source includes at least one laser.

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Erfassen der Zerfallszeit eines angeregten Zustandes einer Probe vorgesehen sind.Scanning microscope according to one of claims 11 to 19, characterized in that means for detecting the disintegration time an excited state of a sample are provided.

Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.Scanning microscope according to one of claims 11 to 20, characterized in that the scanning microscope is a confocal Scanning microscope is.