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Die vorliegende Erfindung ist auf
ein enzymatisches Reaktionssystem gerichtet, welches zur Herstellung
von enantiomer angereicherten Alkoholen, Ketonen, Aldehyden und
Carbonsäuren
ausgehend vom korrespondierenden racemischen, enantio- oder diastereomerenangereicherten
oder prochiralen Alkohol benutzt werden kann. Gleichfalls behandelt
diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der eben genannten
enantiomerenangereicherten Substrate.
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Enantiomerenangereicherte Alkohole,
Aldehyde, Ketone oder Carbonsäuren
sind wertvolle Precursor oder Intermediate, die in der großtechnischen
Synthese zur Herstellung von bioaktiven Wirkstoffen. eingesetzt werden.
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Neben den klassischen katalytisch
arbeitenden Verfahren rücken
in letzter Zeit immer mehr auch enzymatisch arbeitende Herstellprozesse
für enantiomerenangereicherte
Zwischen- oder Endprodukte in den Focus der synthetisch arbeitenden
Chemiker. Ein Themengebiet der enzymatischen Katalyse befasst sich
mit der Oxidation bzw. Reduktion von organischen Verbindungen wie
Alkoholen, Aldehyden, Ketonen oder Carbonsäuren. Zu diesem Zweck werden
u.a. sogenannte Alkoholdehydrogenasen herangezogen (
DE10218689 ).
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Alkoholdehydrogenasen (ADHs) sind
in die Klasse E.C. 1.1.1.1 eingeteilt und gehören damit zu den Oxidoreduktasen.
Sie finden sich in einer Reihe von Organismen (Enzyme Catalysis
in Organic Synthesis, Ed.: K. Drauz and H. Waldmann, 1995, VCH,
Vol. II, 595ff). Interessant sind insbesondere "Breitband"-Enzyme, die stereoselektiv ein breites
Spektrum an Substraten umsetzen. Die Herstellung von enantiomer
angereicherten Alkoholen ausgehend von Ketonen oder racemischen
Alkoholen kann z.B. nach unten dargestelltem Schema erfolgen (
DE10037101 ; als aktuelle,
umfassende Übersicht
zum Stand der Technik, siehe: W. Hummel, Adv. Biochem. Engineering
/ Biotechnology 1997, 58, 145–184).
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Alle Redoxenzyme benötigen ein
Coenzym (Cosubstrate), das in der Lage ist, Reduktionsäquivalente während der
Redox-Reaktion zu übertragen.
Seit langem bekannt sind die NAD(P)-abhängigen Dehydrogenasen (s.o.),
deren Gleichgewichtslage die Bildung des reduzierten Produkts favorisiert
und die FAD-abhängigen (Flavo-)Proteine,
die oxidierend wirken. Für
beide Gruppen sind zahlreiche präparative
Anwendungen bekannt.
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Eine kleinere Gruppe von Enzymen
besitzt als Coenzym eine ortho-chinoide Verbindung wie Pyrrolochinolin-chinon
(PQQ) (I), Tryptophan-tryptophan-Chinon (TTQ) (II) oder TOPA Chinon
(TPQ) (III) und LTQ (IV) (Duine, J.A., J. Bioscience and Bioengineering
1999, 88, 231–236).
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Wegen der Struktur dieser Coenzyme
mit einer orthochinoiden Teilstruktur werden diese Enzym als Chinoproteine
bezeichnet. Auch letztere favorisieren wie die Flavoproteine die
Oxidationsrichtung. Präparative Anwendungen
sind kaum bekannt, da PQQ als Coenzym wegen des sehr hohen Preises
unattraktiv ist und keine Regenerierung des Coenzyms beschrieben
ist.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
war daher u.a die Angabe eines weiteren enzymatisch arbeitenden
Reaktionssystems, welches in der Lage ist, achirale bzw. chirale,
insbesondere enantiomerenangereicherte, Alkohole, Aldehyde, Ketone
und Carbonsäuren
ausgehend von einem Alkohol zu erzeugen. Insbesondere sollte dies
unter ökonomisch
wie ökologischer
Sicht in besonderes vorteilhafter Art und Weise erfolgen.
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Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. In Anspruch
1 wird das erfindungsgemäße Reaktionssystem
vorgestellt. Die von Anspruch 1 abhängigen Unteransprüche 2 bis
5 stellen bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Reaktionssystems
dar. Ansprüche
6 bis 10 beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten
Alkoholen, während
Anspruch 11 den neuen Organismus Pseudomonas PE1 (DSM 15146) schützt. Anspruch
12 bezieht sich auf die aus diesem Organismus stammende Alkoholdehydrogenase
bzw. die sie codierende Nukleinsäuresequenz.
Letztlich bezieht sich der Anspruch 13 auf bevorzugte Verwendungen
der hier beanspruchten Alkoholdehydrogenase.
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Dadurch, dass man ein enzymatisches
Reaktionssystem aufweisend
- i) eine chinoproteinabhängige Alkoholdehydrogenase,
- ii) eine chinoide Verbindung befähigt zur Übertragung von Reduktionsäquivalenten
mit
Ausnahme von Pyrrolochinolin (I), Tryptophantryptophan-Chinon (TTQ)
(II) und Topachinon (III) sowie LTQ (IV), bereitstellt, gelangt
man in völlig überraschender,
dafür aber
nicht minder vorteilhaften Art und Weise zur Lösung der gestellten Aufgaben.
Durch den Ersatz von (I), (II) und (III) oder (IV) in den Reaktionssystemen erhält man unvorhersehbar
eine kostengünstige
Möglichkeit,
chinoproteinabhängige
Alkoholdehydrogenasen, vorzugsweise die aus Pseudomonas, insbesondere
P. sp. PE1, DSM 15146, in enzymatische Oxidationsprozesse im technischen
Maßstab
einzubinden und so die begehrten hoch enantiomerenangereicherten
Produkte zum Einsatz in der industriellen Synthese kostengünstig bereitzustellen.
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Vorzugsweise akzeptiert das Reaktionssystem
primäre
und sekundäre
Alkohole, die beispielsweise als racemisches Gemisch vorliegen können oder,
wenn weitere Stereozentren in dem Substrat vorhanden sind, auch
als enantiomerenreine Verbindung oder als Diastereomerengemische
vorliegen können
(z.B. chirale Aminoalkohole). Man kann so z.B. aus ggf. N-geschützten primären β-Rminoalkoholen
enantiomerenreine β-Aminosäuren gewinnen.
Aus sekundären
Alkoholen gewinnt man naturgemäß ggf. enantiomerenangereicherte
Ketone (Schema 1).
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Die Entfernung eines ggf. im Molekül vorhandenen
Stereozentrums ist bei der erfindungsgemäßen Umsetzung nicht ausschlaggebend.
Ein solches kann sich in unmittelbarer Umgebung zum Reaktionszentrum befinden
als auch weiter entfernt im Molekül vorkommen, insbesondere weiter
als 3 C-Atome vom Reaktionszentrum entfernt sein. Die erfindungsgemäß im Reaktionssystem
eingesetzte Alkoholdehydrogenase kommt vorzugsweise aus dem Organismus
der Gattung Pseudomonas, vorzugsweise Pseudomonas sp., besonders bevorzugt
aus dem Stamm DSM 15146.
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Als chinoide Systeme zur Aufnahme
der Reduktionsäquivalente
können
prinzipiell alle dem Fachmann geläufigen ortho- oder sogar para-chinoiden
Systeme eingesetzt werden, da die Chinoproteine offenbar viele derartige
Strukturen akzeptieren, wie nachfolgende Aufstellung zeigt. Vorzugsweise
enthalten die erfindungsgemäß eingesetzten
chinoiden Systeme als Minimalstruktur das para- oder ortho- Benzochinongerüst und es werden
Verbindungen erfindungsgemäß eingesetzt,
die solche Gerüste
aufweisen, mit Ausnahme der Systeme I bis IV.
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Tabelle
1: Aktivitäten der
Oxidation von Phenylethandiol durch eine Alkohol-Dehydrogenase aus
Pseudomonas sp. (DSM 15146) bei Zusatz von verschiedenen Cofaktoren
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Diese Darstellung zeigt deutlich,
in welcher Bandbreite chinoide Systeme im erfindungsgemäßen Reaktionssystem
akzeptiert werden. Der Einsatz eines bestimmten chinoiden Systems
hängt in
erster Linie von ökonomischen
Gesichtspunkten ab. Der Fachmann wird sich für dessen Auswahl an Werten
wie Stoffeinsatzkosten oder Stoffumsatzraten orientieren. Mithin
ist er jedoch frei in seiner Wahl.
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Das Verhältnis, in dem die chinoiden
Verbindungen in Bezug auf die chinoproteinabhängige Alkoholdehydrogenase
im Reaktionssystem eingesetzt werden können, kann ebenfalls vom Fachmann
je nach Einsatzzweck beliebig gewählt werden. Vorzugsweise wird
das Verhältnis
so aussehen, dass unter ökonomischen Gesichtspunkten
das Reaktionssystem vorteilhaft arbeitet. Dies hängt auch von den individuellen
Aktivitäten der
eingesetzten chinoiden Systeme ab. Der Fachmann kann die optimalen
Verhältnisse
durch einfache Routineexperimente ermitteln.
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Das erfindungsgemäße Reaktionssystem liegt vorteilhafterweise
in einem wässrigen
System vor. Das wässrige
System kann ein Einphasen- oder Mehrphasensystem umfassen, bei dem
dem wässrigen
Medium beliebige wasserlösliche
oder wasserunlösliche
organische Lösungsmittel
zugesetzt sein können.
Als organische Solventien kommen insbesondere solche in Betracht,
die sich inhärent
gegenüber
dem Reaktionssystem zeigen und keine Nebenreaktionen bedingen. Insbesondere
sind dies tertiäre
Alkohole, Ketone wie Aceton oder MIBK, Ester wie Essigester oder
Acetessigester, verzweigte oder lineare, ggf. mehrfach ungesättigte Alkane,
wie n-Hexan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, n-Heptan, Octan, Isooctan,
Aromaten, wie Toluol, Xylol oder Ether, beispielsweise Diethylether
und Methyl-tert-butylether (MTBE). Diese wässrigen Medien können darüber hinaus
auch mit Tensiden versetzt sein. Ebenfalls ist jedoch denkbar, dass
das Reaktionssystem zur Gänze
in einem wie eben dargestellten organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch
eingesetzt wird bzw. vorliegt. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln
alleine oder in Kombination mit Wasser ist besonders vorteilhaft
bei solchen Substraten oder Produkten, die eine schlechte Wasserlöslichkeit
aufweisen.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung achiraler bzw. chiraler, insbesondere
enantiomerenangereicherter, Alkohole oder Aldehyde, Ketone oder
Carbonsäuren
ausgehend vom korrespondierenden racemischen, enantio- oder diastereomerenangereichertem
oder prochiralem Alkohol unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktionssystems.
In Schema 1 ist eine Auswahl aus möglichen Spielarten für den Einsatz
des erfindungsgemäßen Reaktionssystems
für verschiedene
Oxidationsprobleme exemplarisch dargestellt.
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Sofern das Reaktionssystem in einem
wässrigen
Medium zur Oxidation eingesetzt wird, sollte der pH-Wert des Mediums
im Allgemein im für
diese enzymatische Umsetzung üblichen
Bereich liegen. Vorzugsweise wird die Reaktion dann in einem pH-Bereich
von 2–12,
mehr bevorzugt zwischen 4 und 10 und ganz bevorzugt zwischen 6 und
8, durchgeführt.
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Gleiches trifft ebenfalls für das Temperaturintervall
zu, bei dem die Oxidation vonstatten gehen soll. Je nach Temperaturabhängigkeit
der eingesetzten chinoproteinabhängigen
Alkoholdehydrogenase im Hinblick auf Stabilität und Umsatzrate kann die Reaktion
im Bereich von –15
bis 100°C,
vorzugsweise 4 bis 100, äußerste bevorzugt
10 bis 50°C
durchgeführt
werden.
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Speziell im Falle der Alkoholdehydrogenase
aus DSM 15146 hat sich ein Temperaturintervall von 20 bis 35°C als besonders
vorteilhaft erwiesen.
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Wie schon angedeutet kann das Reaktionssystem
vorzugsweise im wässrigen
Milieu eingesetzt werden. Beim gegenständlichen Verfahren können diesem
jedoch wasserlösliche
oder wasserunlösliche
organische Lösungsmittel
zugefügt
sein. Die oben angegebenen Ausgestaltungen des Reaktionsmediums
gelten hier entsprechend.
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Als Alkoholdehydrogenase kann prinzipiell
eine jede eingesetzt werden, die als Cofaktor ein Chinoprotein (z.B.
PQQ) akzeptiert. Derartige sind zwar bekannt (Duine, J.A., Quinoproteins:enzymes
containing the quinonoid cofactor pyrroloquinoline quinone, topaquinone
or tryptophantryptophan quinone, Eur. J. Biochem. 200 (1991), 271–284), jedoch
wurde sie bisher nicht im technischen Maßstab als adäquate Methode
zur Oxidation von Alkoholen eingesetzt. Für das gegenständliche
Reaktionssystem und damit für
das erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich vorteilhaft eine Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas,
vorzugsweise Pseudomonas sp. PE1 (DSM 15146).
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Der Stamm Pseudomonas sp. PE1 wurde
aus Bodenproben isoliert. Er ist unter der Nummer DSM 15146 am 19.08.2002
bei der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig
durch die Anmelderin nach dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
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Gegenstand der vorliegenden Anmeldung
ist ebenfalls die chinoproteinabhängige Alkoholdehydrogenase
aus Pseudomonas sp. PE1 (DSM 15146).
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Die erfindungsgemäße Alkoholdehydrogenase aus
Pseudomonas sp. PE1 (DSM 15146) wurde in Bezug auf verschiedene
Alkohole getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
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Tabelle
2: Ergebnisse
der stereoselektiven Umsetzungen primärer Alkohole durch enzymatische
Oxidation (50 Std. Inkubation Butendiol 27 Std.). Bestimmung des
ee-Werts: Nichtumgesetzter Alkohol mit GC; Hydroxysäure nach Derivatisierung
mittels TMSH
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Es wird deutlich sichtbar, dass die
neue Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas sp. PE1 (DSM 15146) eine
Reihe von Strukturen hoch enantioselektiv umsetzen kann. In den
Ansätzen
zur Herstellung von Carbonsäuren
wurden auch Anteile vom entsprechenden Aldehyd gefunden, so dass
davon auszugehen ist, dass auch die Aldehyde mit diesem System enantiomerenangereichert
erhalten werden können.
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Es ist denkbar, dass man das erfindungsgemäße Reaktionssystem
so betreibt, dass der reduzierte PQQ-Ersatz (chinoide Verbindung)
durch weitere Maßnahmen
regeneriert wird. Dies kann z.B. durch Oxidation mit Luftsauerstoff, H2O2 oder Oxidasen
erfolgen. Prinzipiell möglich
ist auch die Regeneration der chinoiden Verbindung mittels elektrischem
Strom. Es ist denkbar, die chinoide Verbindung als Elektrodenbestandteil
(Beschichtung) einzusetzen und so den Katalysezyklus beliebig lang
unter Einfluß und
Steuerung eines elektrischen Stromflusses aufrecht zu erhalten.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist daher auch die Verwendung der Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas
PE1 zur Herstellung von achiralen und chiralen, insbesondere enantiomerenangereicherten
organischen Verbindungen, wie z.B. Alkoholen, Ketonen, Aldehyden
oder Carbonsäuren
oder zur Herstellung von durch Mutagenese verbesserten chinoprotein-abhängigen Alkoholdehydrogenasen.
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Derartige Mutageneseverfahren sind
dem Fachmann geläufig
(Eigen, M. und Gardiner, W., Evolutionary molecular engineering
based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 1984, 56, 967–978; Chen,
K. und Arnold, F., Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random
mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic
media. Bio/Technology 1991, 9, 1073–1077; Horwitz, M. und Loeb,
L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad
Sci USA 83, 1986, 7405–7409;
Dube, D. und L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random
Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry
1989, 28, 5703–5707;
Stemmer, P.C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling,
Nature 1994, 370, 389–391
und Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:
In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci
USA 91, 1994, 10747–10751).
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Für
die Anwendung kann das betrachtete Polypeptid in freier Form als
homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestelltes
Enzym verwendet werden. Weiterhin kann das Polypeptid auch als Bestandteil
eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung
mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse
des Wirtsorganismus.
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Möglich
ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form
(Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte
Biomaterialien – Techniken
und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836–852). Vorteilhafterweise erfolgt
die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick,
J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly
Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009–5010; Mori,
T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases
as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic
solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971–1974; Otamiri, M.; Adlercreutz,
P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin
and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active
form in toluene, Biocatalysis 6, 291– 305). Ganz besonders bevorzugt ist
die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie
Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG)
oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki,
S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex
catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11,
375–378).
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Äußerst bevorzugt
ist die Immobilisierung an Eupergit® ,
insbesondere Eupergit C® und Eupergit 250L® (Röhm) (als Übersicht,
siehe: E. Katchalski-Katzir, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym.
2000, 10, 157). Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an
Ni-NTA in Kombination mit dem durch Anhängen eines His-Tags (Hexa-Histidin)
veränderten
Polypeptid (Petty, K.J. (1996), Metal-chelate affinity chromatography
In: Ausubel, F.M. et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology,
Vol. 2, New York: John Wiley and Sons).
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Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls
denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked
enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int.
Ed. 39, 380–383).
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Durch diese Maßnahmen kann es gelingen, aus
Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden,
solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln
bzw. ganz in Organik arbeiten können.
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Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten,
enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung
das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen
in > 50 mol-% verstanden.
Unter diastereomerenangereichert (diastereomer angereichert) wird
in äquivalenter Weise
das Vorliegen eines Diastereomeren im Überschuss gegenüber dem
dazugehörigen
anderen Diastereomeren verstanden.
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Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen
gelten als von der Offenbarung mitumfasst.
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Beispiele:
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Kultivierung von Pseudomonas
sp. PE1:
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Pseudomonas sp. PE1 (DSM 15146) wird
in folgendem Medium angezogen: 990 ml Medium 1, 10 ml Ca-Mg-Stammlösung, 1%
Ethanol, 0,1% Hefeextrakt. Medium 1 (pro 1 L): 4,52 g KH2PO4, 15,4 g K2HPO4, 3 g (NH4)2SO4.
Ca-Mg-Stammlösung
(pro 1 L): 2 g CaCl2 × 2H2O,
50 g MgCl2 × 6H2O,
20 g Titriplex I. Agarplatten mit diesem Medium werden durch den
Zusatz von 18 g Agar/L verfestigt. Der Organismus wird bei 22°C vermehrt.
Nach 2 Tagen werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
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Zur Gewinnung von Rohextrakt werden
die Zellen suspendiert (Zusatz von 1,5 ml Puffer pro 1 g Zellmasse)
und dann beispielsweise durch Nassvermahlung aufgeschlossen. Für die Nassvermahlung
werden pro 1 ml Suspension 1,2 g Glasperlen mit 0,3 mm Durchmesser
zugesetzt. Diese Suspension wird dann beispielsweise in einer Schwingmühle (Fa.
Retsch) für
10 min bei voller Leistung geschüttelt.
Nichtaufgeschlossene Zellen und die Glasperlen werden durch Zentrifugation
abgetrennt, der Überstand
ist der enzymatisch aktive Rohextrakt.
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Test für die Umsetzung von (R,S)-Phenylethandiol
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Der Standardtestansatz für die Alkohol-Dehydrogenase
aus Pseudomonas sp. PE1 (DSM 15146) enthält: 5,3 mM (R,S)-Phenylethandiol,
0,4 mM PQQ oder alternativ andere chinoide Verbindungen (s. Tab.
1), 20 mM Kpi-Puffer, und 350 μl
Rohextrakt pro 850 μl
Gesamtvolumen.
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Nach Inkubation über verschiedene Zeitintervalle
(0, 3 und 6h) wurden je 200 μl
der Reaktionsansätze mit
100 μl Chloroform
ausgeschüttelt,
um PED zu extrahieren. Dann wurden die Proben 3 min. bei 13000 rpm zentrifugiert,
so daß sich
deutlich zwei Phasen bildeten. Die Unterphase (Chloroform-Phase)
enthält
hierbei das PED und wird ohne Verunreinigung durch die wässrige Phase
abgenommen. Der in der Chloroformphase enthaltene Alkohol wird durch
Zusatz von einem Zehntel Volumen Trifluoressigsäure-Anhydrid (TFAR) derivatisiert
und 60 min. bei 45° C
inkubiert.
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GC-Analytik:
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Die Auftrennung der Enantiomere erfolgte
an einer CP-Chirasil-DEX-Säule mit
einer Länge
von 25 m und einem Durchmesser von 25 μm (Fa. Chrompack); der Säulenfluß betrug
1,3 ml/min; Trägergas
war Helium. Die Analyse wurde bei einer Säulentemperatur von 90° C durchgeführt, hier
erhielt man eine gute Auftrennung der beiden Enantiomeren mit Retentionszeiten
von 33,0 min für
das R-Enantiomere und 34,0 min für
die S-Komponente.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
dargestellt.