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Die
Erfindung betrifft Vorrichtungen zur Objektbehandlung und -untersuchung
in einem Flüssigkeitsbad,
insbesondere Perfusionsvorrichtungen mit einer Perfusionskammer
für biologische
Zellen, und Verfahren zur Anwendung der Vorrichtungen.
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Aus
der Literatur sind offene oder geschlossene (abgedeckte) Perfusionskammern
bekannt, in den Messungen mit Messelektroden oder patch-Pipetten
durchgeführt
werden können.
Bei offenen Systemen handelt es sich um wannenförmige Perfusionskammern, bei
denen eine Flüssigkeit
(Behandlungslösung) über eine
Schlauchverbindung eingeführt
und über
eine zweite Schlauchverbindung wieder abgeführt wird. Die Geschwindigkeit
des Lösungswechsels
hängt vom
Lösungsfluss
und vom Kammervolumen ab. Eine Beschleunigung der Perfusion kann
durch eine Verringerung des Kammervolumens erreicht werden. Bei
geschlossenen Perfusionskammern ist eine Abdeckplatte auf der Perfusionskammer
vorgesehen. Durch Öffnungen
in einer Kammerwand oder in der Abdeckplatte können Messelektroden in die
Perfusionskammer eingeführt
werden (siehe zum Beispiel
DE
43 05 405 C1 ).
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Es
sind auch Perfusionsvorrichtungen bekannt, die speziell für eine schnelle
Perfusion von vereinzelten, größeren Objekten,
wie zum Beispiel Xenopus Oozyten, ausgelegt sind. Diese Zellen sollen
zum Beispiel gleichzeitig mit zwei Mikroelektroden untersucht werden.
Hierzu beschreibt S. Hering in "Pflüger Archiv", Bd. 436, 1998,
S. 303–307
eine Perfusionskammer, die mit einer Glasplatte abgedeckt ist. Durch Öffnungen
in der Glasplatte sind Messelektroden so in die Perfu sionskammer
einführbar,
dass die Zelle von den Elektroden penetriert werden kann und der
Prozess durch die Glasplatte beobachtet werden kann. Eine Öffnung in
der Glasplatte ist von einem Trichter umgeben. Das Einfüllen von Lösung in
den Trichter und das anschließende
Anlegen eines Unterdrucks an den Kammerabfluss ermöglichen
die Perfusion der Kammer und der darin enthaltenen Objekte (z. B.
Xenopus Oozyten). Bei mehrfacher Applikation von Lösungen in
den Trichter wird angestrebt, jeweils gleichgroße Flüssigkeitsmengen aus der Kammer
abzusaugen.
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Die
von S. Hering beschriebene Konstruktion kann in Bezug auf die folgenden
Aspekte Nachteile aufweisen. Erstens wird die den Trichter umgebende Öffnung mit
der zweiten Messelektrode nur über
die Flüssigkeitsschicht
zwischen der Elektrode und dem Innenrand der Öffnung verschlossen. Durch
diese zweite Öffnung
kann deshalb, wenn der Unterdruck in der Kammer die Kraft des verschließenden Flüssigkeitsmeniskus übersteigt,
Luft in die Kammer eintreten, was zu Schäden an der Zelle und damit
zu Störungen
im Messablauf führen
kann. Ein weiterer Nachteil des potentiellen Lufteintritts besteht
darin, dass ein automatisierter Betrieb erschwert wird. So sollen
bei kontinuierlichem Betrieb der Perfusionskammer gleiche Lösungsmengen
in den Trichter eingespritzt und am Abfluss abgesaugt werden. Dies wäre durch
den Lufteintritt nur mit häufigen
Korrekturen möglich.
Bei wiederholtem Anlegen von starkem Unterdruck an die Kammer tritt
nahezu zwangsläufig durch
die zweite Öffnung
Luft ein. Damit wird bei gleichem Absaugvolumen entsprechend weniger
Flüssigkeit
abgeführt
und es bildet sich ein störendes Restvolumen
im Zufuhrtrichter. Ein automatisierter Betrieb, bei dem wiederholt
gleiche Menge zu und abgeführt
werden sollen, ist mit dieser Kammerkonstruktion nicht möglich.
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Zweitens
ist für
viele Untersuchungen an Objekten, wie z. B. Xenopus-Oozyten, ein
schneller Austausch der Perfusionslösung wünschenswert. Dies betrifft
insbesondere Messungen zur Charakterisierung von Rezeptor-aktivierten
Ionenkanälen. Eine
langsame Zufuhr führt
häufig
zur Desensibilisierung der Rezeptoren noch während der Applikation des Agonisten
und damit zu inkorrekten Messergebnissen. Bei der von S. Hering
et al. beschriebenen Kammerkonstruktion wird die Lösung seitlich
an die auf dem Boden der Kammer liegende Zelle appliziert. Der abrupte
Flüssigkeitsstrom
führt zu
einem „Hammer"-Effekt, das heißt die Zelle
wird seitlich von einem Druckpuls getroffen. Dieser seitliche Druckpuls kann,
je nach Geschwindigkeit und Dauer des Flüssigkeitsstroms, zu Translokationen
der Oozyten und letztendlich zum Herausspülen der Zellen aus der Kammer
führen.
Dabei wird zunächst
der Kontakt der Zelle mit den Elektroden gestört und später unterbrochen, was zum Abbruch
der Messung führt.
Der Kontakt von Messelektroden mit der Zelle ist jedoch sehr empfindlich
bezüglich
mechanischer Störungen.
Bereits geringe mechanische Störungen
führen
zu Veränderungen
der Abdichtung der Elektroden an der Oozytenmembran. Ein seitlicher
Druckpuls ist daher für
stabile und reproduzierbare Messungen sehr nachteilig. Der Einsatz
der herkömmlichen
Vorrichtung ist deshalb auf experimentelle Arbeiten beschränkt und
nicht für
routinemäßige oder
automatisierte Messungen geeignet.
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Ein
weiterer Nachteil der von Hering beschriebenen Technik besteht im
Auftreten eines Restvolumens, das besonders durch Kapillarkräfte und
Adhäsion
von Restflüssigkeit
zwischen den Elektroden und der Innenwand des Trichters auftritt. Durch
die Kapillarkräfte
können
Zufuhr und Abfuhr der Flüssigkeit
aus dem Trichter nicht ausreichend synchronisiert werden. Außerdem kann
es zu einer Vermischung der Flüssigkeiten
im Trichter und damit zu einer Verdünnung der Konzentration von
Testsubstanzen kommen.
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Weitere
Perfusionskammern für
elektrophysiologische Untersuchungen an biologischen Zellen werden
von A. Savchenko et al. in „Pflugers
Arch.", Band 429
(3), 1995, S. 436–442
und von A.C.S. Costa et al. in „Biophys. J.", Band 67 (1), 1994,
S. 395–401,
sowie in
US 6 277 559
B2 beschrieben.
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Die
Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Perfusionsvorrichtung
bereitzustellen, mit der die Nachteile der herkömmlichen Perfusionsvorrichtungen überwunden
werden und die insbesondere eine Behandlung und/oder Untersuchung
biologischer Objekte, wie z. B. biologischer Zellen mit einer erhöhten Stabilität und Zuverlässigkeit
ermöglicht. Die
verbesserte Perfusionsvorrichtung soll des Weiteren insbesondere
den Betrieb bei erhöhten
Perfusionsraten und einen kontinuierlichen, automatisierten Betrieb
ermöglichen.
Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, verbesserte Verfahren zur
Untersuchung und/oder Behandlung biologischer Objekte, wie insbesondere
biologischer Zellen in Perfusionsvorrichtungen anzugeben, bei denen
insbesondere mit verminderten Flüssigkeitsmengen
unter Beibehaltung einer hohen Selektivität gearbeitet werden kann. Die Erfindung
soll insbesondere mit geringen Flüssigkeitsvolumina im Bereich
von z. B. 50 bis 200 μl
einen vollständigen
und zuverlässigen
Austausch der Flüssigkeit
im Volumen der Perfusionskammer einer Perfusionsvorrichtung ermöglichen.
Dabei soll die Balance zwischen zugeführten und abfließenden Flüssigkeitsvolumina
auch bei einer Folge von zahlreichen Messzyklen gewahrt bleiben.
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Diese
Aufgaben werden durch eine Perfusionsvorrichtungen, eine Untersuchungsvorrichtung und
ein Perfusionsverfahren mit den Merkmalen entsprechend den Patentansprüchen 1, 19 oder 21 gelöst. Vorteilhafte
Ausführungsformen
und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Vorrichtungsbezogen
wird die oben genannte Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Perfusionsvorrichtung
mit einer in einem Kammerkörper
gebildeten Perfusionskammer und einer in der Perfusionskammer angeordneten
Halterungseinrichtung für das
zu untersuchende Objekt dahingehend gelöst, dass die Halterungseinrichtung
einen Vorsprung aufweist, der derart in die ragend Perfusionskammer
positioniert werden kann, dass eine zu einem Abfluss der Perfusionskammer
fließende
Flüssigkeit
den Vorsprung allseits seitlich umströmt. Die Halterungseinrichtung
umfasst ein vorzugsweise zylinderförmiges Teil, das höhenverstellbar
in dem Kammerboden eingefügt
ist und von einem (Perfusions-)spalt umgeben ist, der mit dem Abfluss
verbunden ist. Die Perfusionskammer bildet um die Halterungseinrichtung
relativ zum Kammerkörper
den umlaufenden Spalt (Ringspalt, Perfusionsspalt). Der Abfluss
kann im Kammerkörper
oder in der Halterungseinrichtung vorgesehen sein. Der Perfusionsspalt
besitzt vorzugsweise einen kreisringförmigen Querschnitt. Die damit
vorzugsweise koaxiale Anordnung der Halterungseinrichtung mit dem
umgebenden Perfusionsspalt besitzt den Vorteil, dass beim Durchtritt
einer Flüssigkeit
durch die Perfusionskammer eine allseitige Umströmung der Aufnahme der Halterungseinrichtung
und damit des zu untersuchenden Objektes erfolgt, so dass der einseitige
Druckpuls, wie er bei der herkömmlichen
Perfusionskammer auftritt, vermieden wird. Die Lösung umfließt das Objekt von allen Seiten
in den vorzugsweise koaxialen Perfusionsspalt und wird entweder
in einen seitlichen Kanal (Abfluss) oder alternativ durch Öffnungen
in der Halterungseinrichtung abgeführt. Beide technischen Lösungen leiten
einen annähernd
laminaren Fluss um die Zelle in den Perfusionsspalt. Das Objekt,
das bspw. eine einzelne biologische Zelle, eine Zellgruppe oder
eine Zusammensetzung aus Zellbestandteilen umfasst, wird von der
mindestens einen Einführöffnung in
die Perfusionskammer hin zum Abfluss in dem laminaren Durchfluss
umspült.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung ist die Halterungseinrichtung in der Perfusionskammer
derart ver stellbar angeordnet, dass die Position der Aufnahme für das zu
untersuchende Objekt in der Perfusionskammer und insbesondere entlang
der Länge
des Perfusionsspaltes veränderlich
ist. Diese Ausführungsform
kann Vorteile in Bezug auf die Anpassung der Kammergeometrie an
das zu untersuchende Objekt besitzen.
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Gemäß einer
weiteren vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung ist die erfindungsgemäße Perfusionsvorrichtung mit
einer Elektrodenhalterung zur Positionierung von mindestens einer
Messelektrode ausgestattet. Eine oder mehrere Messelektroden werden
insbesondere für
elektrophysiologische Untersuchungen an biologischen Zellen verwendet. Mit
der Elektrodenhalterung können
die Messelektroden ortsfest relativ zur Perfusionskammer und damit relativ
zum zu untersuchenden Objekt positioniert werden. Die Messelektroden
selbst haben bei den Untersuchungen auch eine mechanische Halterungsfunktion
für das
Objekt.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Perfusionsvorrichtung mit einer Abdeckplatte
ausgestattet, die die Perfusionskammer nach oben verschließt und in
der die mindestens eine Einführöffnung in
die Perfusionskammer gebildet ist. Die Verwendung der vom Kammerkörper der
Perfusionsvorrichtung vorzugsweise abtrennbaren Abdeckplatte kann
Vorteile in Bezug auf einen vereinfachten Zugriff auf das Kammerinnere,
z. B. zur Ablage eines zu untersuchenden Objekts auf der Halterungseinrichtung
oder für
Reinigungszwecke besitzen. Des Weiteren bildet die Abdeckplatte
einen Verdunstungsschutz. Ein Flüssigkeitsverlust
durch Verdunstung wird vermindert. Die Reproduzierbarkeit der Steuerung
bei der Flüssigkeitszufuhr
und -abfuhr kann erhöht
werden.
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Wenn
gemäß einer
Variante ein Einführtrichter
vorgesehen ist, der mit der mindestens einen Einführöffnung verbunden
ist, können
sich Vorteile in Bezug auf die Flüssigkeitszufuhr in die Perfusionskammer
ergeben. Gemäß einer
erfindungsgemäßen Gestaltung
ist der Einführtrichter
ein Teil des Kammerkörpers,
was Vorteile für
einen vereinfachten, integralen Aufbau der Perfusionsvorrichtung
besitzen kann. Bevorzugt ist es jedoch, wenn der Einführtrichter
als Teil der o. g. Abdeckplatte auf deren Oberseite angeordnet ist,
so dass durch die Abdeckplatte ein Boden des Einführtrichters
gebildet wird, in dem die mindestens eine Einführöffnung angeordnet ist und unter
dem sich im zusammengesetzten Zustand die Perfusionskammer befindet.
Vorteilhafterweise kann dann zur Beschickung oder Reinigung der
Perfusionskammer der Aufbau aus Abdeckplatte und Einführtrichter
besonders einfach von der Perfusionsvorrichtung abgenommen werden.
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Besondere
Vorteile der erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung
ergeben sich, wenn die Abdeckplatte zwei Einführöffnungen aufweist, die am Boden
des Einführtrichters
gebildet und im zusammengesetzten Zustand der Abdeckplatte mit dem Kammerkörper symmetrisch
relativ zur Längsrichtung
des durch die Halterungsrichtung gebildeten Vorsprungs in der Perfusionskammer
angeordnet sind. Diese Variante der Erfindung besitzt erstens den
Vorteil, dass der wannenförmige
Trichter beide Einführöffnungen
zur Flüssigkeitszufuhr
und/oder zum Zugriff durch die Messelektroden einschließt. Dadurch
wird der oben für
die herkömmlichen
Perfusionsvorrichtungen beschriebene, nachteilige Eintritt von Luft
in die Perfusionskammer in jedem Fall vermieden. Die Flüssigkeit
kann gleichermaßen
durch beide Einführöffnungen
eintreten, was den Eintritt von Luft ausschließt. Ein zweiter Vorteil besteht
in der symmetrischen Anordnung der Einführöffnungen oberhalb der Aufnahme
für das
zu untersuchende Objekt. Dadurch wird das symmetrische Umspülen des
Objekts von allen Seiten von den Einführöffnungen hin zum koaxialen
Perfusionsspalt verbessert. Durch das symmetrische Umspülen der
Zellen von allen Seiten in den koaxialen Perfusionsspalt treten seitlich
Kräfte
praktisch nicht auf. Mechanische Störungen der Messungen oder Objektbehandlungen werden
vermieden.
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Schließlich besteht
ein weiterer Vorteil der Integration der Einführöffnungen in den Boden des Einführtrichters
darin, dass durch die Größe der Einführöffnungen
(ggf. vermindert durch die eingesetzten Messelektroden) der Fluss
einer in den Einführtrichter
gefüllten
Flüssigkeit
in die Perfusionskammer verzögert
wird. Wenn eine neue Flüssigkeit,
z. B. eine Testlösung
in den Einführtrichter
auf der Abdeckplatte gefüllt
wird, erfolgt zunächst
lediglich eine Diffusion vom Trichter durch den verbleibenden Zwischenraum zwischen
den Messelektroden und den Innenseiten der Einführöffnungen in die Perfusionskammer.
Erst bei Anwendung eines Unterdrucks am Abfluss der Perfusionskammer
wird die Flüssigkeit
durch die Einführöffnungen
symmetrisch hin zum untersuchenden Objekt gezogen. Der Unterdruck
kann so eingestellt werden, dass diese Strömungsbewegung erheblich schneller
als die Diffusionsbewegung erfolgt. Dies ermöglicht vorteilhafterweise einen
Lösungswechsel
in der Perfusionskammer mit einer scharf abgegrenzten und sich relativ
schnell bewegenden Flüssigkeitsfront (Grenze
zwischen verschiedenen Behandlungs-, Spül- oder Testlösungen).
Die zeitliche Steuerung der Objektbehandlung oder -untersuchung
kann mit hoher Genauigkeit und Präzision durchgeführt werden.
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Wenn
die Einführöffnungen
gemäß einer
bevorzugten Gestaltung jeweils den gleichen Durchmesser besitzen,
wird die symmetrische Ausübung der
Strömungskräfte vorteilhafterweise
noch verbessert.
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Die
Abdeckplatte mit dem Einführtrichter
ist vorzugsweise seitlich verschiebbar auf dem Kammerkörper angeordnet.
Vorteilhafterweise kann dadurch die Perfusionskammer wahlweise geöffnet oder
verschlossen werden, ohne dass die Abdeckplatte mit dem Einfülltrichter
vollständig
vom Kammerkörper
getrennt werden.
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Gemäß einer
weiteren vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung besitzt die Halterungseinrichtung in der Perfusionskammer
die Form eines Zylinders. Diese Gestaltung verbessert die Gleichförmigkeit
des Durchflusses durch den Perfusionsspalt hin zum Abfluss.
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Wenn
die Halterungseinrichtung gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung an ihrem oberen Ende eine Halterung der Vertiefung
zur mittigen Aufnahme des zu untersuchenden Objektes aufweist, können sich
weitere Vorteile für
die Stabilisierung des Objekts im Flüssigkeitsstrom ergeben.
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Gemäß einer
weiteren Variante am unteren Ende der Halterungseinrichtung eine
Schraubverbindung zur Fixierung im Kammerkörper vorgesehen sein, wodurch
vorteilhafterweise die oben beschriebene Verstellbarkeit der Halterungseinrichtung
erleichtert wird. Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin,
dass durch die flexible (z. B. durch Verschrauben) Verbindung des
zylinderförmigen
Vorsprungs (Perfusionspodest) das zu untersuchende Objekt höhenverstellbar
in der Perfusionskammer platziert werden kann. Diese flexible Höhenverstellbarkeit
hat die folgenden Vorteile: Erstens können die seitlich durch die
in der Abdeckplatte in die Kammer eingeführten Messelektroden in ihrem
Winkel verstellt werden. Die Verstellbarkeit des Einstichwinkels ist
vorteilhaft. Diese Veränderung
kann durch Anpassung der Höhe
des durch die Hal terungseinrichtung gebildeten Perfusionspodestes
in der Perfusionskammer korrigiert werden. Dies ist besonders bei
Untersuchungen an Objekten verschiedener Größe von Vorteil, wo der Einstich
in genauer seitlicher Position und unter einem bestimmten Winkel
in die Zelle erfolgen muss. Zweitens ermöglicht es die Höhenverstellbarkeit
der Halterungseinrichtung, die Zelle wahlweise höher oder tiefer im Perfusionsspalt
zu positionieren. Dies hat Auswirkungen auf die Zeit zwischen Anlegen
eines Unterdrucks am Perfusionskanal und der Zellperfusion, aber
auch auf die Stabilität
der Zelle im Flüssigkeitsstrom
während
der Messung. Ein tieferes Absenken der Zelle in der Perfusionskammer
durch Absenken der Halterungseinrichtung verlängert die Zeit, bis die Lösung im
Trichter die Zelle erreicht und stabilisiert die Zelle im laminaren
Durchfluss, da das Einwirken von seitlichen (ggf. asymmetrischen)
Kräften
auf die Oberfläche
der Zelle in tieferen Abschnitten des Perfusionskanals weiter verringert
wird.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist vorgesehen, dass die Halterungseinrichtung zumindest
teilweise aus einem transparenten Material besteht, was die Beleuchtung
und/oder Beobachtung der zu untersuchenden Objekte von der Bodenseite
des Kammerkörpers
her ermöglicht.
In die Halterungseinrichtung kann insbesondere ein Lichtleiter eingebracht
werden, der an seiner Lichtaustrittsoberfläche unmittelbaren Kontakt mit dem
Untersuchungsobjekt hat. Dadurch kann z. B. der Zelle während der
Messung Licht zugeführt
werden bzw. es können
Lichtsignale, z. B. Fluoreszenzsignale von der Oberfläche abgenommen
werden.
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Wenn
die Halterungseinrichtung gemäß einer
weiteren Variante der Erfindung eine Referenzelektrode aufweist,
können
Messfehler bei elektrischen Messungen am Untersuchungsobjekt vermieden
oder vermindert werden.
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Weitere
vorteilhafte Ausführungsformen
der Erfindung zeichnen sich dadurch aus, dass der Abfluss aus der
Perfusionskammer mit einer Pumpe verbunden und/oder im Abfluss eine
Referenzelektrode angeordnet ist. Beide Merkmale dienen einer verbesserten
Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung
beim automatisierten Betrieb.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Untersuchungsapparatur
für biologische
Objekte, insbesondere biologische Zellen, Zellgruppen oder Zellbestandteile,
die eine Dosiereinrichtung, eine Messeinrichtung und die erfindungsgemäße Perfusionsvorrichtung
umfasst. Die Dosiereinrichtung dient insbesondere der automatischen
Zufuhr von verschiedenen Flüssigkeiten
(insbesondere Behandlungs-, Spül-
und Testlösungen)
aus Vorratsreservoiren in die Perfusionskammer. Die Messeinrichtung
ist in an sich bekannter Weise für
elektrophysiologische und/oder optische Messungen an den in der Perfusionskammer
behandelten Objekten eingerichtet.
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Verfahrensbezogen
wird die oben genannte Aufgabe durch ein Verfahren zur Untersuchung und/oder
Behandlung mindestens einer biologischen Zelle in der erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung
mit den folgenden Schritten gelöst.
Nach einer Positionierung der mindestens einen Zelle auf der Halterungseinrichtung
erfolgt eine Einfüllung
eines vorbestimmten Volumens einer Behandlungslösung in die Probenkammer und
eine Messung an der mindestens einen Zelle. Durch Anlegen eines
Unterdrucks an den Abfluss der Perfusionskammer oder den Trichterabfluss
des Einführtrichters
kann die Behandlungslösung
abgeführt
werden. Diese Verfahrensweise besitzt den besonderen Vorteil, dass
die Positionierung der mindestens einen Zelle auf der Halterungseinrichtung
durch den Flüssig keitsstrom durch
die Perfusionskammer stabilisiert und damit die Zuverlässigkeit
der Messung erhöht
wird.
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Gemäß vorteilhaften
Varianten der Erfindung sind als Messung an der Zelle eine Fluoreszenzmessung
und/oder eine elektrophysiologische Messung vorgesehen, wodurch
vorteilhafterweise die Reaktion der Zelle auf die Behandlungslösung und/oder
elektrische Reize charakterisiert werden kann.
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Vorteilhafterweise
kann die Behandlungslösung
mit einer Dosiereinrichtung in die Probenkammer eingeführt werden,
die zeitsynchron mit der Steuerung des Abführens der Flüssigkeit
betrieben wird. Dabei werden vorzugsweise in der Dosiereinrichtung
verschiedene Testreservoirs verwendet, von denen die jeweils gewünschte Behandlungslösung in die
Probenkammer, insbesondere in den Einführtrichter der Probenkammer
eingefüllt
wird. Die Richtungen der Flüssigkeitszufuhr
und -abfuhr können umgekehrt
werden, indem die Behandlungslösung durch
den Abfluss in die Probenkammer eingefüllt und durch den Trichterabfluss
abgeführt
wird. In diesem Fall können
sich Vorteile für
eine flexiblere Anwendung der Perfusionsvorrichtung ergeben.
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Wenn
gemäß einer
Variante der Erfindung durch den Abfluss und den Trichterabfluss
jeweils Teilvolumina abgesaugt werden, deren Summe gleich dem eingefüllten Volumen
der Behandlungslösung
ist, können
sich Vorteile für
die Flüssigkeitsdosie-
rung ergeben. Es kann insbesondere in den Einführtrichter mit geringer Dosiergenauigkeit
zunächst ein
größeres Lösungsvolumen
zugeführt
werden, als für
die Perfusion benötigt
wird, und dann über
den Trichterabfluss ein Überschuss
abgezogen werden, so dass die Flüssigkeitsmenge
in der Probenkammer mit hoher Genauigkeit eingestellt wird.
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Vorteilhafterweise
kann gemäß einer
Variante eine kontinuierliche Zufuhr der Behandlungslösung bei
einem gleichzeitigen kontinuierlichen Abfluss aus der Perfusionskammer
erfolgen. Alternativ kann für
bestimmte Messmethoden ein diskontinuierlicher Betrieb von Vorteil
sein.
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Weitere
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden
Beschreibung der beigefügten
Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
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1:
eine schematische, vergrößerte Schnittdarstellung
einer ersten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung;
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2:
eine schematische Draufsicht auf eine Perfusionsvorrichtung gemäß 1;
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3:
eine schematische, vergrößerte Schnittdarstellung
einer weiteren Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung;
und
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4:
eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Untersuchungsapparatur,
die mit der erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung ausgestattet
ist.
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Die
Erfindung wird im Folgenden beispielhaft unter Bezug auf eine Ausführungsform
beschrieben, bei der die Perfusionsvorrichtung mit einer Abdeckplatte
mit integriertem Einführtrichter
ausgestattet ist. Es wird betont, dass die Umsetzung der Erfindung nicht
auf diese Gestaltung beschränkt,
sondern alternativ derart möglich
ist, dass keine Abdeckplatte oder eine Abdeckplatte ohne einen Einführtrichter
oder ein integraler Aufbau des Kammerkörpers mit dem Einführtrichter
vorgesehen ist. Des Weiteren wird betont, dass es sich bei den Illustrationen
nicht um maßstäbliche Zeichnungen
handelt. Die absoluten Größen und
Größenverhältnisse
können
bei der Umsetzung der Erfindung in Abhängigkeit von den konkreten
Anwendungsforderungen gewählt
werden.
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Die
in den 1 und 2 in schematischer Schnittansicht
bzw. in Draufsicht gezeigte Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung 10 umfasst
einen Kammerkörper 20,
eine Halterungseinrichtung 30, eine Elektrodenhalterung 40,
die Abdeckplatte 50 und eine Auffangeinrichtung 60.
Weitere an sich bekannte Einzelheiten der Perfusionsvorrichtung,
wie z. B. eine Halterung in einem Laborgerät oder Verbindungsteile zum
Anschluss an Mess-, Zusatz- oder Steuergeräte sind in den 1 und 2 aus Übersichtlichkeitsgründen nicht
gezeigt.
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Der
Kammerkörper 20 wird
durch ein Kunststoffteil gebildet, in das die Probenkammer 21, 25 und
der Abfluss 24 integriert sind. Der Kammerkörper 20 besteht
bspw. aus PTFE oder einem anderen geeigneten Kunststoff. Die Perfusionskammer 21, 25 umfasst
einen oberen Kammerbereich 21, durch den eintretende Flüssigkeit
hin zum zu behandelnden Objekt fließt, und einen unteren Kammerbereich 25, der
bei eingesetzter Halterungseinrichtung 30 im Wesentlichen
den Ring- oder Perfusionsspalt bildet, durch den die Flüssigkeit
zum Abfluss 24 abfließt. Der
Abfluss 24 ist mit der Auffangeinrichtung 60 verbunden,
die mit einer Pumpe 61 und einem Auffangreservoir 62 ausgestattet
ist.
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Der
Durchmesser der Zelle 1 ist in der Regel kleiner als 1
mm, z. B. bei Oozyten rd. 800 μm,
oder sogar kleiner als 500 μm.
Das Volumen der Probenkammer 21, 25 beträgt bspw.
rd. 10 bis 15 μl.
Dies bedeutet, dass bei der Zufuhr von bspw. 50 bis 100 μl einer Behandlungslösung das
innere Volumen der Probenkammer mehrfach ausgetauscht wird. Der Durchmesser
des Abflusses 24 beträgt
bspw. 500 μm bis
5 mm.
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Auf
der Unterseite ist der Kammerkörper 20 mit
einer Gewindebohrung 26 ausgestattet, in die die Halterungseinrichtung 30 einschraubbar
ist (siehe unten). Auf der Oberseite des Kammerkörpers 20 ist eine
Ausdehmung 27 vorgesehen, deren innere Ausdehnung der Größe der Abdeckplatte 50 (siehe
unten) angepasst ist.
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Die
Halterungseinrichtung 30 wird durch einen zylinderförmigen Vorsprung
gebildet, dessen oberes Ende eine Aufnahme 31 für das zu
untersuchende Objekt (Zelle 1) bildet und dessen unteres Ende
mit einem Außengewinde 33 zum
Eingriff in die Gewindebohrung 26 ausgestattet ist. Der
zylinderförmige
Vorsprung erstreckt sich in vertikaler Richtung nach oben in die
Probenkammer 21, 25. An der Aufnahme 31 ist
eine halbkugelförmige
Vertiefung 32 vorgesehen, die die Zelle 1 in der
Untersuchungsposition stabilisiert. In die Halterungseinrichtung 31 ist mindestens
ein Lichtleiter 34 für
optische Beleuchtungs- oder Messzwecke integriert, der zwischen
der Aufnahme 31 am oberen Ende der Halterungseinrichtung 30 und
einer Messeinrichtung (nicht dargestellt) verläuft.
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Die
lediglich schematisch gezeigte Elektrodenhalterung 40 dient
der ortsfesten Positionierung der Messelektroden 41, 42 relativ
zur Perfusionsvorrichtung 10. Die Elektrodenhalterung 40 umfasst bspw.
ein an sich bekanntes Gestell, ggf. mit einer 3D-Präzisionsstelleinrichtung.
Alternativ sind die Messelektroden 41, 42 an Manipulatoren
angebracht, die auf Halterungen stehen, die mechanisch mit dem Kammerkörper 20 verbunden
sind. Die Messelektroden 41, 42 werden durch die
Einführöffnungen 22, 23 in
die Probenkammer hineingeschoben.
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Die
Perfusionsvorrichtung 10 ist mit wenigstens einer der folgenden
Referenzelektroden ausgestattet. Eine erste Referenzelektrode 43 ist
im Abfluss 24 angeordnet. Für Ionenstrommessungen kann
es von Vorteil sein, wenn zwei Referenzelektroden verwendet werden.
Eine zweite Referenzelektrode 44 sollte sich zu diesem
Zweck in unmittelbarer Nähe
zur Zelle befinden, an der die Messungen durchgeführt werden.
Dadurch werden Einflüsse
von Störwiderständen (z.
B. Serienwiderständen)
auf die Messung minimiert.
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In
einer vorteilhaften Ausführung
ist eine der Referenzelektroden 44 in die Halterungseinrichtung 30 integriert,
wobei die Elektrode in unmittelbarer Nähe zur Zelle aus der Halterung
austritt. Das Referenzpotential kann dadurch unmittelbar neben der Zelle
gebildet werden. Als integraler Bestandteil der Halterungsvorrichtung
kann die Elektrode 44 über
die Schraubverbindung 33 vom Kammerkörper gelöst und leicht ausgetauscht
werden. Dies ist besonders bei Verwendung von z. B. Silber-Silberchlorid-Elektroden
von Vorteil, die nach einer bestimmten Zeit erneuert bzw. ausgetauscht
werden müssen.
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Gemäß diesem
unabhängigen
Gesichtspunkt der Erfindung kann die Halterungseinrichtung 30 als
Elektrodeneinsatz oder Einwegelektrode zum Einschrauben in eine
Perfusionsvorrichtung 10 bereitgestellt werden.
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Die
Abdeckplatte 50 ist ein im Wesentlichen ebenes Bauteil
aus einem transparenten Material, wie z. B. aus Glas oder aus Kunststoff.
Die Abdeckplatte 50 besteht aus einem Einführtrichter 51,
der auf einem Basisteil 52 mit den Einführöffnungen 22, 23 angeordnet
ist. Das Basisteil ist eine rechteckige Platte, die in die Ausnehmung 27 des
Kammerkörpers 20 eingepasst
ist. Alternativ kann die Ausnehmung 27 lediglich einen
ein- oder zweiseitigen Anschlag für die Abdeckplatte 50 bilden
und im übrigen eine
Verschiebung der Abdeckplatte 50 auf dem Kammerkörper 20 ermöglichen,
so dass der obere Kammerbereich 21 der Perfusionskammer
freigegeben werden kann. Die Einführöffnungen 22, 23 verlaufen
entsprechend der gewünschten
Ausrichtung der Messelektroden mit einem vorbestimmten Winkel relativ
zur Plattenebene schräg
durch die Abdeckplatte 50.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird zunächst
die Perfusionskammer mit einer Spülflüssigkeit, wie z. B. einer physiologischen Salzlösung gefüllt. Anschließend wird
mindestens eine zu untersuchende Zelle 1 auf der Halterungseinrichtung 30 positioniert.
Hierzu wird die Abdeckplatte 50 abgenommen oder verschoben,
so dass die Perfusionskammer 21, 25 freiliegt.
Die Zelle 1 wird bspw. mit einer Pasteurpipette auf die
Aufnahme 31 aufgelegt. Anschließend werden die Messelektroden 41, 42 je
nach dem gewünschten
Untersuchungsverfahren in an sich bekannter Weise so positioniert,
dass die Messelektroden die Zelle 1 berühren oder in sie einstechen.
Anschließend
wird in den Einführtrichter 51 eine
Behandlungslösung 2 eingefüllt (siehe
Pfeil A in 1). Die Behandlungslösung stellt
zunächst eine
Flüssigkeitsfront
gegenüber
der in der Perfusionskammer 21, 25 vorhandenen
Spülflüssigkeit
dar. Durch die Betätigung
der Pumpe 61 wird die Spülflüssigkeit abgezogen (siehe Pfeil
B in 1), so dass die Behandlungslösung vom Einführtrichter 51 in
die Perfusionskammer 21, 25 einströmt. Je nach
dem gewünschten
Messprotokoll erfolgt zeitgleich oder mit einer bestimmten Verzögerung die
gewünschte optische
und/oder elektrische Messung an der Zelle 1. Anschließend können ggf.
weitere Behandlungslösungen über die
Einführöffnungen 22, 23 in
die Perfusionskammer 21, 25 zugeführt werden.
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Bei
der in 3 gezeigten Ausführungsform der Erfindung ist
zusätzlich
am Einführtrichter 51 mindestens
ein seitlicher Trichterabfluss 53 vorgesehen, der mit einer
Saugpumpe (nicht dargestellt) verbunden ist. Dieser Trichterabfluss 53 ist
vorzugsweise oberhalb des Basisteils 51 in einem Abschnitt
der Trichterwand angeordnet, der sich in unmittelbarer Nähe zur Position
einer oder beider Elektroden 41, 42 befindet.
Der Durchmesser des Trichterabflusses 53 in der Trichterwand
beträgt
bspw. 500 μm
bis 2 mm.
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Durch
das Anlegen eines Unterdrucks an den Trichterabfluss 53 kann
ein Restvolumen aus der Probenkammer 21 schnell und zuverlässig entfernt werden.
Ein Durchmischen von Restflüssigkeit
und neu applizierter Flüssigkeit
im Einführtrichter 51 wird dadurch
vorteilhafterweise vermieden. Verfahrenstechnisch wird dadurch gewährleistet,
dass Restvolumina schnell entfernt werden und selbst bei Zufuhr
eines Lösungsüberschusses
dieser schnell korrigiert werden kann.
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Das
Anbringen des mindestens einen zusätzlichen Trichterabflusses 53 in
die Trichterwand hat den weiteren Vorteil, dass bei Bedarf in die
Probenkammer 21 auch von unten über den Abfluss 24 Flüssigkeit
zugeführt
und durch den Trichter 51 kontinuierlich abgesaugt werden
kann. Durch eine Lösungszufuhr
zum Abfluss 24 und kontinuierliches Absaugen der Lösung durch
den Trichterabfluss 53 kann die Probenkammer (zwischen
dem schnellen Lösungswechsel
z. B. bei Applikation eines Agonisten in den Trichter) kontinuierlich
(von unten nach oben) perfundiert werden. Durch diese Anwendung erweitert
sich das Anwendungsspektrum der Kammer erheblich und die Stabilität der Messungen
wird erhöht.
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Insbesondere
bei der Ausführungsform
der Erfindung mit dem Trichterabfluss 53 kann das Basisteil 52 der
Abdeckplatte 50 im Inneren des Trichters 51 mindestens
eine weitere freie Öffnung
aufweisen, in die keine Mikroelektrode eingeführt ist. In diesem Fall kann
die Lösung
wahlweise aus dem Trichter ins Innere der Probenkammer oder umgekehrt
aus der Kammer in den Trichter eintreten. Freie Öffnungen, die sich neben den
Elektrodenöffnungen
befinden, können
sich insbesondere aus Symmetriegründen oder zum Druckausgleich
als nützlich
erweisen.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann vorgesehen sein, dass zunächst weniger
Testlösung
aus dem Trichter abgesaugt wird als mit einer Pipettiereinrichtung
eingefüllt
wurde und das im Trichter verbleibende Restvolumen über eine zusätzliche
Saug-Pumpe über
den Trichterabfluss 53 in der Trichterwand aus dem Trichter
abgeführt
wird.
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Eine
komplette Untersuchungsapparatur gemäß der Erfindung, die für den beschriebenen
Verfahrensablauf geeignet ist, ist in 4 schematisch gezeigt.
Die Untersuchungsapparatur 100 umfasst neben der erfindungsgemäßen Perfusionsvorrichtung 10 die
Dosiereinrichtung 70 und die Messeinrichtung (nicht dargestellt).
Die Dosiereinrichtung 70 umfasst eine Flüssigkeitsfördereinrichtung 71 (z.
B. Pipette, Spritze oder dgl.), die mit einem 3D-Antrieb 72 zwischen
Flüssigkeitsreservoiren 73, 74 und
dem Einführtrichter 51 beweglich
ist. Die Flüssigkeitsfördereinrichtung 71 ist
mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden, mit der
auch die Pumpe 61 der Auffangeinrichtung 60 verbunden
ist, um ein zeitsynchrones Arbeiten der Pumpe 61 und der Flüssigkeitsfördereinrichtung 71 zu
ermöglichen.
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Eine
weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
dass zwischen den oben beschriebenen diskreten Applikationen von Testlösungen in
den Einführtrichter
und dem Absaugen der Lösung
durch den Abfluss 24 dieser Abfluss 24 wahlweise
auch für
die Zufuhr von Lösungen
verwendet werden kann. Die Lösung
tritt in diesem Fall durch die Öffnungen
in der Glasplatte in den Trichter aus und wird durch Trichterabfluss 53 abgeführt. Durch
die kontinuierliche Perfusion der Oozyten zwischen den diskreten
Applikation wird z. B. das Auswaschen von Testsubstanzen aus der
Oozytenmembran verbessert. Nach dem Stoppen der kontinuierlichen
Lösungszufuhr über Abfluss 24 wird
das Restvolumen aus dem Trichter über Trichterabfluss 53 entfernt
und es kann wahlweise die Zufuhr von diskreten Lösungsmengen in den Einführtrichter
mit der Pipettiereinrichtung fortgesetzt werden.
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung
in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.