DE10349441A1 - Selecting nucleic acid that binds target molecules, useful potentially as therapeutic agents, by screening short sequences with two fixed regions flanking a random region - Google Patents

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Abstract

Selecting a nucleic acid (I), especially an aptamer, that binds a target molecule (II), is new. Selecting a nucleic acid (I), especially an aptamer, that binds a target molecule (II) comprises: (a) preparing a heterogeneous population of nucleic acids (NA, preferably D-NA), each of which comprises a randomized sequence (RS), different for each NA, and at least one constant sequence (CS); (b) contacting the population with (II); (c) separating NA that have not interacted with (II); (d) separating, from (II), the NA (NA1) that have interacted; (e) optionally repeating steps (a)-(d); (f) amplifying NA1; (g) optionally repeating steps (a)-(f); and (h) optionally sequencing NA1 isolated from steps (d) or (f). The new feature is that step (f) is performed in two alternative ways: (a) preparing a NA, preferably RNA, to be amplified, that comprises defined 5' and 3' partial sequences, flanking RS; (b) preparing a first adapter molecule (AM1), comprising two strands, the first (S1), preferably RNA, and the second (S2), preferably DNA, where S2 has a 5'-overhang that is at least partly complementary to (part of) the defined 5'-partial sequence; (c) preparing a second adapter molecule (AM2), comprising two strands, one (S11) having a 5'-phosphate group on the 5'-terminal nucleotide, while the other (S12), which is DNA, has a 3'-end at least partly complementary to (part of) the defined 3'-partial sequence, and also includes a cleavage site that generates a first claevage product (CP1), comprising the specified 3'-end of S12; (d) ligating AM1 and AM2 to the NA being amplified to generate a ligation product (LP); (e) reverse transcription of LP to form a product (RTP); (f) optionally performing second strand synthesis to generate a double-stranded product (RTP2); (g) optionally cleaving, in RTP2, the strand that is complementary to the NA being amplified, to form a transcription starting product (TSP); and (h) generating a transcription product from TSP. The second way comprises: (a) preparing the NA, i.e. an RNA, to be amplified, having at the 5'-end a primer sequence (PS1) and first defined partial sequence, at the 3'-end a second defined partial sequence and second primer binding site, and RS between the defined partial sequences; (b) reverse transcription to generate RTP, using S12 of AM2 as primer; (c) performing second strand synthesis, by using S1 of AM1 and S12 of AM2, to generate a double-stranded reaction product; and (d) performing a transcription reaction on the product to produce TP. Independent claims are also included for: (1) two related methods for selecting (I); (2) nucleic acid that comprises, in the 5' to 3' direction, first defined partial sequence, RS and second defined partial sequence, where the two defined sequences are at least partly complementary, particularly sufficiently so that a base-paired stem structure or helix is formed, preferably at 20-40, especially about 37, [deg]C; (3) nucleic acid comprising two defined partial sequences and RS, as in (2), and forming a base-paired stem structure or helix at 20-40, preferably about 37, [deg]C; and (4) population comprising at least two nucleic acid of (2) or (3), with at least two members differing in RS at at least one position.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren.The The present invention relates to a process for the preparation of Target molecule-binding Nucleic acids.

Im Bereich der pharmazeutischen Forschung haben sich in der jüngsten Vergangenheit Oligonukleotid-Liganden als pharmazeutische Wirkstoffe oder Vorläufer derselben etabliert. Aus der Gruppe dieser Oligonukleotid-Liganden, zu denen, unter anderem, Antisense- und Ribo- zym-Oligonukleotide sowie RNAi/siRNA gehören, sind die sogenannten Aptamere insoweit von besonderem Interesse, als dass es sich dabei um Nukleinsäuren, bevorzugterweise um einzelsträngige Nukleinsäuren, handelt, die an ein Zielmolekül binden. Die Technologie, mit der diese Aptamere erzeugt werden, ist als SELEX-Prozess (systematic evolution of ligands by exponentional enrichment) bekannt und beispielsweise beschrieben in den US-Patenten 5,270,163 und US 5,843,653 . Die Wechselwirkung der Aptamere mit ihrem Zielmolekül beruht dabei im Wesentlichen nicht auf Basenhybridisierung, sondern auf einer Kombination aus hydrophoben Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und Coulomb-Wechselwirkungen. Die hochaffine und hochspezifische Wechselwirkung zu einem Zielmo lekül wird über komplexe und stabile Strukturen der Oligonukleotide vermittelt. Tatsächlich scheint es so zu sein, dass Oligonukleotide ähnlich stabile Strukturen ausbilden können, wie dies für Proteine seit langem bekannt ist. Mit Hilfe des SELEX-Prozesses, hierin auch als SELEX-Technologie bezeichnet, ist aus diesem Grunde eine Vielzahl von Aptameren – sowohl auf RNA- als auch auf DNA-Basis – gegen verschiedenste Targets selektiert worden. Eine Übersicht findet sich in Gold at al. (Annu Rev. Biochem 1995. 64: 763–97), Osborne & Ellington (Chem. Rev. 1997. 97: 349–370) oder James (Curr. Opin. Pharmacol, 2001, 540–546).In the field of pharmaceutical research, oligonucleotide ligands have recently become established as pharmaceutical agents or precursors thereof. Of the group of these oligonucleotide ligands, which include, inter alia, antisense and ribozyme oligonucleotides and RNAi / siRNA, the so-called aptamers are of particular interest insofar as they are nucleic acids, preferably single-stranded nucleic acids, which bind to a target molecule. The technology with which these aptamers are produced is known as the SELEX process (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) and is described, for example, in US Pat. Nos. 5,270,163 and US Pat US 5,843,653 , The interaction of the aptamers with their target molecule is based essentially not on base hybridization, but on a combination of hydrophobic interactions, hydrogen bonds and Coulomb interactions. The high-affinity and highly specific interaction with a target molecule is mediated via complex and stable structures of the oligonucleotides. In fact, it appears that oligonucleotides can form similarly stable structures as has long been known for proteins. With the help of the SELEX process, also referred to herein as SELEX technology, a variety of aptamers - both RNA- and DNA-based - have been selected against a wide variety of targets. An overview can be found in Gold at al. (Annu Rev. Biochem 1995: 64: 763-97), Osborne & Ellington (Chem Rev 1997: 97: 349-370) or James (Curr Opin. Pharmacol, 2001, 540-546).

Der SELEX-Prozess sieht dabei grundsätzlich die folgenden Schritte vor: Bereitstellen einer Nukleinsäurebibliothek, wobei die verschiedenen Nukleinsäuren sich zumindest in einem vollständig oder teilweise randomisierten Bereich unterscheiden, Abtrennen der nicht an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren von den Komplexen aus Zielmolekül und daran bindenden Nukleinsäuren, Gewinnen der Nukleinsäuren aus dem Komplex aus Nukleinsäure und Zielmolekül, reverse Transkription im Falle, dass es sich bei der an das Zielmolekül bindende Nukleinsäure um eine Ribonukleinsäure handelt, Durchführen der Polymerasekettenreaktion, gefolgt von Transkription (falls es sich um eine RNA handelt) und in der Regel erneutem Verwenden der solchermaßen erhaltenen, amplifizierten Nukleinsäure in einem Selektions- schritt. Am Ende der in der Regel mehrfach wiederholten Selektionsschritte werden dann die typischerweise mit einer hohen Affinität an das Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren durch Klonierung vereinzelt und sequenziert.Of the SELEX process basically looks like this the following steps: providing a nucleic acid library, being the different nucleic acids at least in one completely or partially randomized area, separating the not to the target molecule binding nucleic acids from the complexes of target molecule and binding nucleic acids, Recovering the nucleic acids from the complex of nucleic acid and target molecule, reverse transcription in the case that it binds to the target molecule nucleic acid to a ribonucleic acid acts, performing the polymerase chain reaction, followed by transcription (if it is is an RNA) and usually re-using the thus obtained, amplified nucleic acid in a selection step. At the end of the rule several times Repeated selection steps are then typically with a high affinity to the target molecule binding nucleic acids isolated by cloning and sequenced.

Für die verschiedenen Schritte des SELEX-Prozesses, insbesondere für den Amplifikati- onsschritt, ist dabei vorgesehen, dass die zu amplifizierenden Nukleinsäure neben dem randomisierten Bereich auch zumindest einen konstanten Bereich umfasst, der beispielsweise als Primerbindungsstelle oder Promotor für die verschiedenen beteiligten Enzyme dient.For the different ones Steps of the SELEX process, in particular for the amplification step, It is provided that the nucleic acid to be amplified in addition to the randomized area also has at least one constant area comprising, for example, as primer binding site or promoter for the various enzymes involved.

In vielen in der Literatur beschriebenen Aptameren und Spiegelmeren, d.h. aus L-RNA bestehende Aptameren, (Leva S, Lichte et al.(2002) Chemistry & Biology 9: 351–9) findet sich ein Teil der PCR-Primerbindungsregionen als ein für die Erkennung des jeweiligen Zielmoleküls essenzieller Teil des Moleküls wieder. Beispiele sind: 2'-NH2-RNA-Aptamer gegen IgE, bei dem der gesamte 5'-Primerbereich mit Ausnahme von zwei 5'-terminalen Gs im minimalen Bindungsmotiv vorkommt (Wiegand, T. W., P. B. Williams, et al. (1996). J. Immunol 157(1): 221–30), minimale RNA-Aptamere gegen Substance P, in denen entweder Bereiche der 5'- oder der 3'-konstanten Region vorhanden sind (Nieuwlandt, D., M. Wecker, et al. (1995). Biochemistry 34(16): 5651–9), oder das aus einem N30-Pool hervorgegangene Aptamer N30yc7 gegen eine Tyrosin-Phosphatase (Bell, S. D., J. M. Denu, et al. (1998) J Biol Chem 273(23): 14309–14).Many aptamers and spiegelmer described in the literature, ie aptamers consisting of L-RNA, (Leva S, Lichte et al. (2002) Chemistry & Biology 9: 351-9) find part of the PCR primer binding regions to be one of the Recognition of the respective target molecule essential part of the molecule again. Examples are: 2'-NH 2 RNA aptamer against IgE, in which the entire 5'-primer region except for two 5'-terminal Gs occurs in the minimal binding motif (Wiegand, TW, PB Williams, et al. (1996) J. Immunol 157 (1): 221-30), minimal RNA aptamers against Substance P in which either regions of the 5 'or 3' constant region are present (Nieuwlandt, D., M. Wecker, et . al. (1995) Biochemistry 34 (16): 5651-9), or a N 30 -pool emerged N30yc7 aptamer against a tyrosine phosphatase (Bell, SD, JM Denu, et al (1998). J Biol Chem 273 (23): 14309-14).

Dies verdeutlicht auf anschauliche Weise, dass eine Verkürzung der erhaltenen, oft 80–110 Nukleotide langen Sequenzen bei unveränderter Affinität zum Target nicht durch einfaches Weglassen der konstanten Regionen zu erreichen ist. Es ist jedoch essentiell, dass Aptamere vergleichsweise kurz sind, zum einen aus Gründen der leichten chemischen Darstellbarkeit von Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren, zum anderen aus Gründen der grundsätzlichen Verabreichbarkeit derartiger Nukleinsäuren.This illustrates in a clear way that a shortening of the received, often 80-110 Nucleotide long sequences with unchanged affinity for the target not by simply omitting the constant regions is. However, it is essential that aptamers are comparatively short are, for one reasons the easy chemical representation of ribonucleic acids and deoxyribonucleic acids, for another reason the fundamental Administerability of such nucleic acids.

Im Stand der Technik sind weitergehende Verfahren entwickelt worden, um bereits im Rahmen der Selektion vergleichsweise kurze, an das jeweilige Zielmolekül bindende Nukleinsäuren zu isolieren.in the The prior art has developed further methods, already comparatively short in the context of the selection, to the respective target molecule binding nucleic acids to isolate.

Ein Ansatz ist beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 92/14843 beschrieben. Dabei handelt es sich jedoch um ein Verfahren, bei dem lediglich Aptamere auf DNA-Basis isoliert werden, so dass hier weder ein Transkriptionsschritt als Amplifikationsschritt noch eine reverse Transkription vorgesehen ist. Das dort beschriebene Verfahren beruht auf dem Anhängen bekannter, für die Amplifikation notwendiger Sequenzen an die aus dem Selektionsschritt gewonnenen Oligodesoxynukleotide durch enzymatische Ligation. Die Konstruktion der im Rahmen des dort beschriebenen SELEX-Verfahrens verwendeten Nukleinsäure-Bibliothek weist dem 3'- und dem 5'-Ende zufällige Sequenzen zu, was zu schlechten Ligationsausbeuten führt. Um diese dennoch halbwegs hochzuhalten, wird inmitten der Selektion einmal sequenziert, um entsprechend modifizierte Adapter zufügen zu können. Darüber hinaus kann sich die Amplifikation nicht direkt an die Ligation anschließen, da die randomisierten Adapter zu Mispriming und Mutationen in der PCR führen würden. Sie müssen erst entfernt werden.One approach is described, for example, in International Patent Application WO 92/14843. However, this is a process in which only aptamers are isolated on the basis of DNA, so that here neither a transcription step as amplification step nor a reverse transcription provided is. The method described there is based on the attachment of known sequences necessary for the amplification to the oligodeoxynucleotides obtained from the selection step by enzymatic ligation. The construction of the nucleic acid library used in the SELEX method described therein assigns random sequences to the 3 'and 5' ends, resulting in poor ligation yields. However, in order to keep it up to a reasonable level, it is sequenced once in the middle of the selection in order to be able to add appropriately modified adapters. In addition, amplification can not be directly linked to the ligation, since the randomized adapters would lead to mispresing and mutations in the PCR. They have to be removed first.

Ein alternatives Verfahren wird im US-Patent 6,261,774 B1 beschrieben. Dort werden an die verschiedenen Ribonukleinsäuremoleküle der Nukleinsäure-Bibliothek, die im Selektionsver fahren verwendet wird, am 3'-Ende kurze zusätzliche Sequenzen für die reverse Transkription gehängt. Genauer ist dabei vorgesehen, dass nach der Transkription und Selektion eine Ligation dieser zusätzlichen Sequenzen am 3'-Ende vorgenommen wird, sich daran die reverse Transkriptasereaktion anschließt und anschließend eine Ligation von zusätzlichen Sequenzen am 5'-Ende vorgenommen wird. Die Ligation am 3'-Ende erfolgt dabei unter Verwendung von glattendiger Ligation, was niedrige Temperaturen nötig macht, was wiederum die Ausbildung von Sekundärstrukturen befördert, die für die Ligationseffizienz nachteilig sind. In einem weiteren essentiellen Schritt ist dort vorgesehen, dass nach der Ligation am 3'-Ende eine Ethanol-Präzipitation erfolgen muss, um den Reaktionszyklus fortsetzen zu können.One alternative method is described in US Pat. No. 6,261,774 B1. There, the various ribonucleic acid molecules of the nucleic acid library, used in the Auswahlver drive, at the 3 'end short additional sequences for the reverse Hanged transcription. Specifically, it is envisaged that after transcription and selection a ligation of this extra Sequences at the 3'-end followed by the reverse transcriptase reaction followed by a Ligation of additional Sequences at the 5'-end is made. The ligation at the 3'-end is carried out using of blunt ligation, which requires low temperatures, which in turn promotes the formation of secondary structures that for the Ligation efficiency are disadvantageous. In another essential Step is provided there that after ligation at the 3 'end an ethanol precipitation must be done in order to continue the reaction cycle can.

In der wissenschaftlichen Literatur sind „structurally constrained libraries" zur Anwendung in den SELEX-Prozessen beschrieben. Diese Aptamer-Bibliotheken sind in ihren – durch die teilweise randomisierten Regionen – ausgebildeten Strukturen eingeschränkt bzw. limitiert auf spezifische Faltungs- und Bindungsmotive. Ziel dieser strukturellen Vorgaben ist es dabei, hoch aktive Aptamersequenzen zu generieren, da durch die vorgegebenen Strukturen die Faltungsmöglichkeiten eingeschränkt sind (Hamm J. (1996) Nucleic Acid Research 24 (12): 2220–2227). Inwieweit die dargestellten Bibliotheken zu einer verbesserten Verkürzung derselben führt, ist im Stand der Technik nicht offenbart.In of the scientific literature are "structurally constrained libraries "for use described in the SELEX processes. These are aptamer libraries in their - by the partially randomized regions - trained structures limited or limited to specific folding and binding motifs. aim It is these structural requirements, highly active aptamer sequences to generate, because by the given structures the folding possibilities limited (Hamm J. (1996) Nucleic Acid Research 24 (12): 2220-2227). To what extent the illustrated libraries to an improved shortening of the same leads, is not disclosed in the prior art.

Eine entscheidende Beschränkung für die Verwendung von Oligonukleotiden stellt deren schneller Abbau durch ubiquitäre RNasen und DNasen dar. Gerade in biologischen Systemen sind RNasen und DNasen in großen Mengen anzutreffen und führen zu Halbwertzeiten der RNA- und DNA-Oligonukleotide von wenigen Sekunden bis Minuten (Griffin et al., 1993; Jellinek et al., 1995; Lin et al., 1994).A decisive limitation for the Use of oligonucleotides accomplishes their faster degradation ubiquitous RNases and DNases. Especially in biological systems are RNases and DNases in large To find and lead quantities at half-lives of the RNA and DNA oligonucleotides of a few seconds to minutes (Griffin et al., 1993; Jellinek et al., 1995; Lin et al., 1994).

Verfahren, Oligonukleotide gegen den Angriff von Exonukleasen zu stabilisieren, beruhen meist auf der Modifikation der Enden durch Anhängen von Schutzgruppen, wie z.B. ein ter- minales, invertiertes Nukleotid, d. h. 3'-3'- oder 5'-5'-Verknüpfung, oder anderer großer Gruppen, wie beispielsweise Polyethylenglycol (Bell et al., 1999). Vor Exo- und Endonukleasen gleichermaßen schützt auch der Austausch der natürlichen Substituenten, vor allem am 2'-Kohlenstoff der Ribose und am Phosphor. Unnatürliche, nukleaseresistentere Alternativen zu Ribose (2'-OH) oder Desoxyribose (2'-H) sind: 2'-Amino-, 2'-Fluoro-, 2'-Azido-, 2'-O-Methyl-, 2'-Alkyl-, 2'-Allyl und Arabino-Nukleotide (Eaton and Pieken, 1995). Die häufigs te Phosphor-Modifikation ist der Austausch von Sauerstoff durch Schwefel, was zu sogenannten Phosphorothioaten führt.Method, To stabilize oligonucleotides against the attack of exonucleases, are usually based on the modification of the ends by attaching Protecting groups, e.g. a terminal, inverted nucleotide, d. H. 3'-3 'or 5'-5' linkage, or other great Groups such as polyethylene glycol (Bell et al., 1999). The protection of exon and endonucleases alike also protects the exchange of natural substituents, especially at the 2'-carbon ribose and phosphorus. Unnatural, more nuclear-resistant alternatives to ribose (2'-OH) or deoxyribose (2'-H) are: 2'-amino, 2'-fluoro, 2'-azido, 2'-O-methyl, 2'-alkyl, 2'-allyl and arabino nucleotides (Eaton and Pieken, 1995). The most frequent Phosphorus modification is the exchange of oxygen by sulfur, which leads to so-called phosphorothioates.

Durch Maßnahmen dieser Art können signifikant höhere Halbwertzeiten in biologischen Flüssigkeiten, bis hin zu vielen Stunden, erzielt werden (Eaton and Pieken, 1995; Green et al., 1995; Jellinek et al., 1995; Lin et al., 1994).By activities of this kind can significantly higher Half-life in biological fluids, up to many Hours (Eaton and Pieken, 1995; Green et al., 1995; Jellinek et al., 1995; Lin et al., 1994).

Jede der hier genannten Modifikationen bringt jedoch gewisse Einschränkungen mit sich. Insbesondere ist die Herstellung der modifizierten Oligonukleotide mit DNA- oder RNA-Polymerasen meist nicht möglich. Dies ist jedoch häufig eine Bedingung zur Identifizierung funktionaler Oligonukleotide. Denn gerade durch die Oligonukleotiden eigene direkte Verknüpfung des Phänotyps (die Struktur und somit die Funktion) mit dem Genotyp (die Nukleotidsequenz) und ihre Eigenschaft kopierbar zu sein, ist es möglich, durch Selektion und Amplifikation geeignete Nukleinsäuresequenzen aus natürlichen Bibliotheken, wie sie das Genom oder das Transkriptom darstellen oder synthetischen Bibliotheken, bspw. kombinatorischen Bibliotheken, so stark anzureichern, dass einzelne Sequenzen mit den gewünschten Eigenschaften isoliert werden können.each however, the modifications mentioned here have certain limitations with himself. In particular, the preparation of the modified oligonucleotides with DNA or RNA polymerases usually not possible. However, this is common a condition for identifying functional oligonucleotides. Because just by the oligonucleotides own direct linkage of phenotype (the structure and thus the function) with the genotype (the nucleotide sequence) and its property of being copiable, it is possible by selection and amplification suitable nucleic acid sequences from natural Libraries as they represent the genome or transcriptome or synthetic libraries, for example combinatorial libraries, enrich so much that individual sequences with the desired Properties can be isolated.

Solche Modifikationen, die nicht mit den enzymatischen Prozessen vereinbar sind, können erst im Anschluss an die eigentliche Identifizierung der funktionellen Oligonukleotide durch chemische Synthese der identifizierten Sequenzen eingefügt werden. Für diese ist zunächst die chemische Synthetisierbarkeit der identifizierten Sequenzen vonnöten. Daher müssen die RNA-Hybrid-Kandidaten, die zumeist eine Länge von etwa 60–90 Nukleotiden haben, zunächst auf 50 Nukleotide oder weniger verkürzt werden, um eine effiziente chemische Synthese zu gewährleisten. Anschließend werden die unmodifizierten Purine durch 2'-modifizierten Nukleotide ausgetauscht. Häufig wird dadurch die Funktion der Oligonukleotide beeinträchtigt (Kujau et al., 1997). Daher können in den seltensten Fällen alle Nukleotide nachträglich modifiziert werden. Dadurch weisen die meisten stabilisierten Oligonukleotide einige durch Nukleasen angreifbare Schwachstellen im Molekül auf, wodurch ihre Lebens- dauer verringert wird.Such modifications, which are incompatible with the enzymatic processes, can be introduced only after the actual identification of the functional oligonucleotides by chemical synthesis of the identified sequences. For these, first of all, the chemical synthesizability of the identified sequences is necessary. Therefore, the RNA hybrid candidates, most of which are about 60-90 nucleotides in length, must first be shortened to 50 nucleotides or less in order to achieve efficient chemical engineering to ensure mixed synthesis. Subsequently, the unmodified purines are replaced by 2'-modified nucleotides. This often interferes with the function of the oligonucleotides (Kujau et al., 1997). Therefore, in the rarest cases, all nucleotides can be subsequently modified. As a result, most stabilized oligonucleotides have some nuclease vulnerable sites in the molecule, thereby reducing their lifetime.

Im Stand der Technik sind verschiedene enzymatische Verfahren zur Stabilisierung von Oligonukleotiden beschrieben.in the State of the art are various enzymatic methods for stabilization of oligonucleotides.

Phosphorothioate können enzymatisch mittels RNA-Polymerasen eingebaut werden (Jhaveri et al., 1998) oder über Taq-DNA-Polymerase, wobei es jedoch nur möglich ist, bis zu drei Phosphorothioat-dNTPs einzubauen (King et al., 2002). Phosphorothioate weisen darüber hinaus den Nachteil auf, dass die zytotoxisch sind (Henry et al., 2001).phosphorothioates can are enzymatically incorporated by means of RNA polymerases (Jhaveri et al., 1998) or above Taq DNA polymerase, but it is only possible to incorporate up to three phosphorothioate dNTPs (King et al., 2002). Phosphorothioates also have the disadvantage that are cytotoxic (Henry et al., 2001).

Durch Transkription können 2'-Fluoro- und 2'-Aminomodifikationen in RNA eingebracht werden. Eine Übersicht über modifizierte Aptamere wurde von Kusser zusammengestellt (Kusser, 2000). Auch der enzymatische Einbau von 2'-OMethyl- und 2'-Azidonukleotidtriphosphaten mit T7 RNA-Polymerase ist beschrieben (Lin et al., 1994; Padilla and Sousa, 1999; Padilla and Sousa, 2002). Der Einbau dermaßen modifizierter Nukleotide ist allerdings gegenwärtig auf modifizierte Cytidine und Uridine beschränkt (Aurup et al., 1992). Insbesondere 2'-modifizierte Guanosine werden nicht von bekannten RNA-Polymerasen toleriert. Die Ursache dafür liegt vermutlich in der Instabilität des Polymerase-DNA-Komplexes während der Initiationsphase der RNA-Polymerisation. Diese die Polymerisation der ersten 8–12 Nukleotide umfassende Phase muss möglichst zügig verlaufen, da die RNA-Polymerase sonst den Komplex schnell wieder verlässt (Lin et al., 1994; Milligan and Uhlenbeck, 1989).By Transcription can 2'-fluoro and 2'-amino modifications be introduced into RNA. An overview of modified Aptamer was compiled by Kusser (Kusser, 2000). Also the enzymatic incorporation of 2'-OMethyl and 2'-azidonucleotide triphosphates with T7 RNA polymerase is described (Lin et al., 1994, Padilla and Sousa, 1999; Padilla and Sousa, 2002). The installation so modified Nucleotides is present, however limited to modified cytidines and uridines (Aurup et al., 1992). Especially 2'-modified Guanosines are not tolerated by known RNA polymerases. The cause lies probably in instability of the polymerase-DNA complex while the initiation phase of RNA polymerization. This the polymerization the first 8-12 Nucleotide-rich phase must proceed as quickly as possible, since the RNA polymerase otherwise leave the complex quickly (Lin et al., 1994; Milligan and Uhlenbeck, 1989).

Bedingung für eine erfolgreiche Initiation der RNA-Synthese ist jedoch mindestens ein Guanosin an den ersten beiden zu transkribierenden Positionen. Eine optimale Initiationssequenz sieht sogar drei konsekutive Guanosine an den Positionen 1–3 der RNA für T7 und T3-RNA-Polymerase vor (Milligan and Uhlenbeck, 1989) und GAAGNG für die SP6 RNA-Polymerase, wie beispielsweise dargestellt in Meador et al., 1995.condition for one however, successful initiation of RNA synthesis is at least one Guanosine at the first two positions to be transcribed. A optimal initiation sequence even sees three consecutive guanosines at positions 1-3 the RNA for T7 and T3 RNA polymerase before (Milligan and Uhlenbeck, 1989) and GAAGNG for SP6 RNA polymerase, such as shown in Meador et al., 1995.

Daher ist es bisher praktisch nicht möglich, 2'-modifizierte Guanosinnukleotide enzymatisch in RNA-Moleküle einzubauen, bzw. vollständig 2'-modifizierte Nukleinsäuren mittels RNA-Polymerasen herzustellen.Therefore so far it is practically impossible 2'-modified To incorporate guanosine nucleotides enzymatically into RNA molecules, or completely 2'-modified nucleic acids by means of RNA polymerases manufacture.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Selektion von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren bereitzustellen, wobei die solchermaßen selektier ten Nukleinsäuren nur eine geringe Größe aufweisen verglichen mit solchen Selektionsverfahren, bei denen Nukleinsäurepopulationen verwendet werden, die aus einem randomisierten Bereich und einem etwa gleich langen konstanten Bereich bestehen. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, welches erlaubt, dass das Verfahren zur Selektion von an Zielmolekülen bindenden Nukleinsäuren zwischen den einzelnen Selektionsrunden eine gegenüber dem Verfahren nach dem Stand der Technik eine verringerte Anzahl von Reaktions- und Reinigungsschritten aufweist. Des weiteren lag der vorliegenden Erfindung noch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Selektion von an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäuren bereitzustellen, wobei die Nukleinsäuren teilweise oder vollständig aus modifizierten Nukleosidphosphaten und insbesondere 2'-Fluoromodifizierten Nukleosidphosphaten besteht.Of the The present invention is therefore based on the object, a method for the selection of target-binding nucleic acids to provide, the nucleic acids thus selected only have a small size compared to those selection methods using nucleic acid populations being from a randomized area and about the same long constant range exist. Furthermore, it is a task to provide a method of the present invention which allows the method to select for binding to target molecules nucleic acids between the individual selection rounds one opposite the A method according to the prior art has a reduced number of reaction and cleaning steps. Furthermore, the present was Invention still the task of a method for selection from to a target molecule binding nucleic acids provide, wherein the nucleic acids partially or completely modified nucleoside phosphates and in particular 2'-fluoromodified Nucleoside consists.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.These Task is achieved by the method according to the independent claims solved. preferred embodiments emerge from the dependent claims.

In einem ersten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Selektion einer an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäure, insbesondere Aptamere, umfassend die Schritte:

  • (a) Bereitstellen einer heterogenen Population von Nukleinsäuren, insbesondere D-Nukleinsäuren, wobei eine jede Nukleinsäure einen Bereich mit einer randomisierten Sequenz und zumindest einer konstanten Sequenz aufweist und sich die die Population ausbildenden Nukleinsäuren in der randomisierten Sequenz unterscheiden,
  • (b) Inkontaktbringen der Population von Nukleinsäuren mit dem Zielmolekül, (c) Abtrennen der Nukleinsäuren, die nicht mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten sind,
  • (d) Abtrennen der Nukleinsäure(n), die mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten ist/sind, von dem Zielmolekül,
  • (e) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (d) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind,
  • (f) Amplifizieren der Nukleinsäure aus Schritt (d),
  • (g) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (f), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (f) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind,
  • (h) optional Sequenzieren der aus Schritt (d) oder Schritt (f) erhaltenen Nukleinsäure(n),
dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt (f) in einer ersten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt:
  • (faa) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Ribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst,
  • (fab) Bereitstellen eines ersten Adaptermoleküls, wobei das erste Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht und wobei der erste Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Ribonukleinsäure ist und der zweite Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 5'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges einen Überhang liefert, wobei der Überhang zumindest teilweise zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist,
  • (fac) Bereitstellen eines zweiten Adaptermoleküls, wobei das zweite Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurestrang eine Phosphatgruppe an der 5'-Position des Ribose- oder Desoxyriboseteils des 5'-terminalen Nukleotids trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon und wobei der zweite Nukleinsäurestrang eine Spaltstelle aufweist, die bei Spaltung des Nukleinsäurestranges ein erstes Spaltprodukt und ein zweites Spaltprodukt liefert, wobei das erste Spaltprodukt das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls ist, das zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure
  • (fad) Ligieren des ersten und des zweiten Adaptermoleküls an die zu amplifizierende Nukleinsäure, um ein Ligationsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten,
  • (fae) Durchführen einer reversen Transkription, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten,
  • (faf) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten,
  • (fag) optional Spalten eines Stranges des Reaktionsproduktes aus Schritt (faf), wobei der Strang derjenige ist, der komplementär ist zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure, um ein Transkriptionsausgangsprodukt zu erhalten, und
  • (fah) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt, um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten.
oder in einer zweiten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt:
  • (fba) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste Primersequenz und eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und eine zweite Primerbindungssequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst,
  • (fbb) Durchführen einer reversen Transkription an der in Schritt (fba) bereitgestellten zu amplifiziernden Nukleinsäure, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei als Primer der zweite Strang des zweiten Adaptermoleküls verwendet wird,
  • (fbc) Durchführen einer Zweitstrangsynthese unter Verwendung des ersten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls und des zweiten Stranges des zweiten Adaptenmoleküls, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten,
  • (fbd) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Reaktionsprodukt aus Schritt
  • (fbc), um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten.
In a first aspect, the object is achieved according to the invention by a method for the selection of a nucleic acid binding to a target molecule, in particular aptamers, comprising the steps:
  • (a) providing a heterogeneous population of nucleic acids, in particular D-nucleic acids, wherein each nucleic acid has an area with a randomized sequence and at least one constant sequence and the population-forming nucleic acids in the randomized sequence differ,
  • (b) contacting the population of nucleic acids with the target molecule, (c) separating the nucleic acids that have not interacted with the target molecule,
  • (d) separating the nucleic acid (s) interacting with the target molecule from the target molecule,
  • (e) optionally repeating steps (a) to (d), wherein the nucleic acid (s) of step (d) are the heterogeneous ones Form or are included in this population,
  • (f) amplifying the nucleic acid from step (d),
  • (g) optionally repeating steps (a) to (f), wherein the nucleic acid (s) of step (f) form or are contained in the heterogeneous population,
  • (h) optionally sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or step (f),
characterized in that the amplification step (f) in a first alternative is carried out by the following steps:
  • (faa) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a ribonucleic acid and at the 5 'end comprises a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined partial sequence and between the first defined partial sequence and the second defined partial sequence an intermediate sequence wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence,
  • (fab) providing a first adapter molecule, wherein the first adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand and wherein the first nucleic acid strand is preferably a ribonucleic acid and the second nucleic acid strand is preferably a deoxyribonucleic acid and the 5 'end of the second nucleic acid strand provides an overhang, wherein the overhang is at least partially complementary to the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof,
  • (fc) providing a second adapter molecule, wherein the second adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand carries a phosphate group at the 5 'position of the ribose or deoxyribose part of the 5'-terminal nucleotide, and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and the 3 'end of the second nucleic acid strand is at least partially complementary to the second defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof and wherein the second nucleic acid strand has a cleavage site which upon cleavage of the nucleic acid strand is a first cleavage product and provides a second cleavage product, wherein the first cleavage product is the 3 'end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule that is at least partially complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified
  • (fad) ligating the first and second adapter molecules to the nucleic acid to be amplified to obtain a ligation product as a reaction product,
  • (fae) performing a reverse transcription to obtain a reverse transcription product as a reaction product,
  • (faf) optionally performing a second-strand synthesis to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a reaction product,
  • (fag) optionally columns of a strand of the reaction product of step (faf), wherein the strand is the one that is complementary to the nucleic acid to be amplified to obtain a transcriptional starting product, and
  • (fah) performing a transcription reaction on the transcriptional output to obtain a transcription product.
or in a second alternative by the following steps:
  • (fba) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is a ribonucleic acid and at the 5 'end a first primer sequence and a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined partial sequence and a second primer binding sequence and between the first defined partial sequence and the second defined subsequence comprises an intermediate sequence, wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence,
  • (fbb) performing a reverse transcription on the nucleic acid to be amplified provided in step (fba) in order to obtain a reverse transcription product as a reaction product, using as primer the second strand of the second adapter molecule,
  • (fbc) performing a second-strand synthesis using the first nucleic acid strand of the first adapter molecule and the second strand of the second adapten molecule to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a reaction product,
  • (fbd) performing a transcription reaction on the reaction product of step
  • (fbc) to obtain a transcription product.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass das Transkriptionsprodukt eine Nukleinsäure, bevorzugterweise eine einzelsträngige Nukleinsäure, ist, wobei

  • – die Nukleinsäure identisch ist mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure, und/oder
  • – die Nukleinsäure identisch ist mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure und am 3'-Ende ein zusätzliches Nukleotid aufweist.
In one embodiment of the first aspect it is provided that the transcription product is a nucleic acid, preferably a single-stranded nucleic acid, wherein
  • - The nucleic acid is identical to the nucleic acid to be amplified, and / or
  • - The nucleic acid is identical to the nucleic acid to be amplified and at the 3 'end has an additional nucleotide.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass ein drittes Adaptermolekül bereitgestellt wird, bevorzugterweise in Schritt (fac), wobei das dritte Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurestrang am 5'-Ende ein 5'-Phosphat trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon, und wobei der zweite Nukleinsäurestrang eine Spaltstelle aufweist, die bei Spaltung des Nukleinsäurestranges ein erstes Spaltprodukt und ein zweites Spaltprodukt liefert, wobei das erste Spaltprodukt das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des dritten Adaptermoleküls ist, das zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei der erste Nukleinsäurestrang am 5'-Ende um ein Nukleotid kürzer ist als der erste Strang des zweiten Adaptermoleküls und der zweite Nukleinsäurestrang des dritten Adaptermoleküls an der Spaltstelle ein universelles Nukleobasen-Analogon, bevorzugterweise ein universelles Ribonukleotid bevorzugtererweise ein Inosin aufweist, das mit dem zusätzlichen Nukleotid der Nukleinsäuren, die zusätzlich am 3'-Ende zumindest ein zusätzliches Nukleotid aufweisen, basenpaart, und das dritte Adaptermolekül an die zu amplifizierende Nukleinsäure in Schritt (fad) ligiert wird, um ein Ligationsprodukt zu erhalten.In an embodiment of the first aspect provides that a third adapter molecule provided is, preferably in step (fac), wherein the third adapter molecule of a double-stranded nucleic acid a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand at the 5 'end carries a 5'-phosphate and the second nucleic acid strand a deoxyribonucleic acid is and the 3'-end of the second nucleic acid strand at least partially complementary is to the second defined subsequence of the to be amplified nucleic acid or a part thereof, and wherein the second nucleic acid strand has a cleavage site which upon cleavage of the nucleic acid strand provides a first cleavage product and a second cleavage product, wherein the first cleavage product the 3'-end of the second nucleic acid strand of the third adapter molecule is at least partially complementary to the second defined Partial sequence of the nucleic acid to be amplified, wherein the first nucleic acid strand at the 5'-end one Nucleotide shorter is as the first strand of the second adapter molecule and the second nucleic acid strand of the third adapter molecule at the cleavage site, a universal nucleobase analog, preferably a universal ribonucleotide more preferably has an inosine, that with the extra Nucleotide of the nucleic acids, the additional at the 3'-end at least an additional Having nucleotide, basepair, and the third adapter molecule to the to be amplified nucleic acid in step (fad) to obtain a ligation product.

In einer weiteren Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste Primersequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls von Schritt (fab) und/oder die zweite Primerbindungssequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls von Schritt (fac) und/oder die zweite Primerbindungsstelle der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des dritten Adaptermoleküls von Schritt (fac).In a further embodiment of the first aspect, it is provided that the first primer sequence of nucleic acid of step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the first adapter molecule of step (fab) and / or the second primer binding sequence of nucleic acid of step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the second adapter molecule of step (fac) and / or the second primer binding site of the nucleic acid of Step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the third adapter molecule from step (fac).

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt (fad) und/oder Schritt (faf) oder Schritt (fbc) durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, wobei zum Ligationsprodukt neben dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls noch ein PCR-Primermolekül verwendet wird, wobei das PCR-Primermolekül zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder zum ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls.In an embodiment of the first aspect, it is provided that the transcription starting product according to step (fad) and / or step (faf) or step (fbc) by a polymerase chain reaction is obtained, wherein the ligation product in addition to the second strand of nucleic acid of the second adapter molecule another PCR primer molecule is used, wherein the PCR primer molecule at least partially identical is to the first defined subsequence of the to be amplified nucleic acid and / or to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass der erste Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls mindestens zwei Promotoren umfasst.In an embodiment of the first aspect, it is provided that the first nucleic acid strand of the first adapter molecule comprises at least two promoters.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass die mindestens zwei Promotoren mindestens zwei verschiedene Promotoren sind.In an embodiment of the first aspect, it is provided that the at least two promoters at least are two different promoters.

In einer weiteren Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass die Promotoren einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Promotoren für eine RNA-Polymerase, bevorzugterweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase umfasst.In a further embodiment the first aspect provides that the promoters individually and independently selected from each other are from the group promoters for an RNA polymerase, preferably T7, T3 or SP6 RNA polymerase.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass bei der Transkription das 5'-Monophosphat des ersten Nukleotids, bevorzugterweise Guanosin-5'-monophosphat und/oder modifizierte Guanosin-5'-Monophosphate als Starternukleotid eingesetzt wird.In an embodiment In the first aspect it is envisaged that during transcription the 5'-monophosphate the first nucleotide, preferably guanosine 5'-monophosphate and / or modified guanosine 5'-monophosphates is used as a starter nucleotide.

In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass das Starternukleotid im Überschuss, bevorzugterweise im zwei- bis zehnfachen Überschuss, bevorzugtererweise im vier- bis achtfachen Überschuss gegenüber dem jeweiligen Nukleotid-5'-Triphosphat eingesetzt wird.In a preferred embodiment of the first aspect, it is provided that the starter nucleotide in excess, preferably in a 2- to 10-fold excess, more preferably in four to eight times the surplus across from the respective nucleotide 5'-triphosphate used becomes.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die doppelsträngige Ribonukleinsäure, die einzelsträngige Ribonuk leinsäure, doppelsträngige modifizierte Ribonukleinsäure und einzelsträngige modifizierte Ribonukleinsäure umfasst.In an embodiment of the first aspect, it is provided that the nucleic acid is selected from the group, the double-stranded ribonucleic acid, the single-stranded ones Ribonucleic acid, double-stranded modified ribonucleic acid and single-stranded modified ribonucleic acid includes.

In einer weiteren Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass in 5'-Richtung zumindest einer der zumindest-beiden Promotoren, bevorzugterweise in 5'-Richtung des am meisten 5'-terminal gelegenen Promotors, zusätzliche Basen angeordnet sind, um den Schmelzpunkt des in der Zweitstrangsynthese eingesetzten Primers zu erhöhen, wobei als Primer der erste Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls verwendet wird und ein DNA-Primer hinzugefügt wird, dessen Sequenz der Sequenz des ersten Stranges des ersten Adapters entspricht und dessen 3'-Ende bevorzugterweise zusätzlich eine Sequenz umfasst, die identisch ist mit der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure.In a further embodiment of the first aspect it is provided that in the 5 'direction of at least one of the at least two promoters, preferably in the 5' direction of the most 5'-terminal promoter, additional bases are arranged to the melting point of in primer used the first strand of nucleic acid of the first adapter molecule and a DNA primer is added whose sequence corresponds to the sequence of the first strand of the first adapter and whose 3 'end preferably additionally comprises a sequence, the iden Table is with the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass die Zweitstrangsynthese direkt im Anschluss an die Ligation ohne vorherige Aufreinigung erfolgt.In an embodiment of the first aspect, it is provided that the second-strand synthesis immediately after the ligation without prior purification he follows.

In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Selektion einer an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäure, insbesondere Aptamere, umfassend die Schritte:

  • (a) Bereitstellen einer heterogenen Population von Nukleinsäuren, insbesondere D-Nukleinsäuren, wobei eine jede Nukleinsäure einen Bereich mit einer randomisierten Sequenz und zumindest einer konstanten Sequenz aufweist und sich die die Population ausbildenden Nukleinsäuren in der randomisierten Sequenz unterscheiden,
  • (b) Inkontaktbringen der Population von Nukleinsäuren mit dem Zielmolekül,
  • (c) Abtrennen der Nukleinsäuren, die nicht mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten sind,
  • (d) Abtrennen der Nukleinsäure(n), die mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten ist/sind, von dem Zielmolekül,
  • (e) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (d) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind,
  • (f) Amplifizieren der Nukleinsäure aus Schritt (d),
  • (g) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (f), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (f) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind,
  • (h) optional Sequenzieren der aus Schritt (d) oder Schritt (f) erhaltenen Nukleinsäure(n),
dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt (f) in einer ersten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt:
  • (faa) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst,
  • (faaa) Phosphorylieren des 5'-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure, sofern die in Schritt (faa) bereitgestellte zu amplifizierende Nukleinsäure kein Phosphat am 5'-Ende aufweist,
  • (fab) Bereitstellen eines ersten Adaptermoleküls, wobei das erste Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht und wobei der erste Nukleinsäurestrang und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 5'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges einen Überhang liefert, wobei der Überhang zumindest teilweise zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist,
  • (fac) Bereitstellen eines zweiten Adaptermoleküls, wobei das zweite Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurstrang ein 5'-Phosphat trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon,
  • (fad) Ligieren des ersten und des zweiten Adaptermoleküls an die zu amplifizierende Nukleinsäure, um ein Ligationsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wo bei bevorzugterweise der zweite Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls an das Ligationsprodukt hybridisiert wird oder an dieses hybridisiert vorliegt,
  • (fae) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese des Reaktionsprodukts aus Schritt (fad), um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Transkriptionsausgangsprodukt zu erhalten,
  • (faf) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt aus Schritt (fae) oder an dem Reaktionsprodukt aus Schritt (fad), um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten,
  • (fag) Bereitstellen eines Primermoleküls, wobei das Primermolekül einen ersten Bereich umfasst, der zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder einen in 5'-Richtung daran anschließenden zweiten Bereich, der an seinem 3'-Ende eine Spaltstelle aufweist oder vollständig aus Ribonukleinsäurebausteinen aufgebaut ist, und zumindest teilweise identisch ist zu der Sequenz des ersten Stranges des ersten Adaptermoleküls, und Anhybridisieren des Primermoleküls an das Transkriptionsprodukt,
  • (fah) Durchführen einer reversen Transkription an dem Transkriptionsprodukt, an das das Primermolekül hybridisiert vorliegt, um ein reverses Transkriptionsprodukt zu erhalten, und
  • (fai) optional Durchführung einer Spaltung an der Spaltstelle des Primermoleküls.
oder und in einer zweiten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt:
  • (fba) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und in 5'-3'-Richtung eine Primersequenz, eine erste definierte Teilsequenz, eine Zwischensequenz, eine zweite definierte Teilsequenz und eine Primerbindungssequenz aufweist, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst,
  • (fbb) Erzeugen eines Transkriptionsausgangsproduktes, wobei an die Primerbindungssequenz am 3'Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure aus Schritt
  • (fba) der zweite Strang des zweiten Adaptermoleküls aus Schritt (fac) hybridisiert wird,
  • (fbc) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt, um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten,
  • (fbd) Bereitstellen eines Primermoleküls, wobei das Primermolekül dem ersten Strang des ersten Adaptermolekül entspricht, und
  • (fbe) Durchführen einer reversen Transkription an dem Transkriptionsprodukt, an das das Primermolekül hybridisiert vorliegt, um ein reverses Transkriptionsprodukt zu erhalten.
In a second aspect, the object is achieved according to the invention by a method for the selection of a nucleic acid binding to a target molecule, in particular aptamers, comprising the steps:
  • (a) providing a heterogeneous population of nucleic acids, in particular D-nucleic acids, wherein each nucleic acid has an area with a randomized sequence and at least one constant sequence and the population-forming nucleic acids in the randomized sequence differ,
  • (b) contacting the population of nucleic acids with the target molecule,
  • (c) separating the nucleic acids that did not interact with the target molecule,
  • (d) separating the nucleic acid (s) interacting with the target molecule from the target molecule,
  • (e) optionally repeating steps (a) to (d), wherein the nucleic acid (s) of step (d) form or are contained in the heterogeneous population,
  • (f) amplifying the nucleic acid from step (d),
  • (g) optionally repeating steps (a) to (f), wherein the nucleic acid (s) of step (f) form or are contained in the heterogeneous population,
  • (h) optionally sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or step (f),
characterized in that the amplification step (f) in a first alternative is carried out by the following steps:
  • (faa) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a deoxyribonucleic acid and at the 5 'end comprises a first defined subsequence, at the 3' end a second defined subsequence and between the first defined subsequence and the second defined subsequence comprises an intermediate sequence wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence,
  • (faaa) phosphorylating the 5 'end of the nucleic acid to be amplified, if the nucleic acid to be amplified provided in step (faa) has no phosphate at the 5' end,
  • (fab) providing a first adapter molecule, wherein the first adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand and wherein the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and the 5 'end of the second nucleic acid strand provides an overhang the overhang is at least partially complementary to the first defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof,
  • (fac) providing a second adapter molecule, wherein the second adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand carries a 5'-phosphate and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and the 3'-end of the second Nucleic acid strand is at least partially complementary to the second defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof,
  • (fad) ligating the first and the second adapter molecule to the nucleic acid to be amplified in order to obtain a ligation product as reaction product, where preferably the second nucleic acid strand of the second adapter molecule is hybridized to or hybridized to the ligation product,
  • (fae) optionally performing a second-strand synthesis of the reaction product of step (fad) to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a transcription starting product,
  • (faf) performing a transcription reaction on the transcriptional starting product of step (fae) or on the reaction product of step (fad) to obtain a transcription product,
  • (fag) providing a primer molecule, wherein the primer molecule comprises a first region which is at least partially identical to the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified and / or a second region adjoining in the 5 'direction at its 3' end has a cleavage site or is constructed entirely from ribonucleic acid building blocks, and is at least partially identical to the sequence of the first strand of the first adapter molecule, and hybridizing the primer molecule to the transcription product,
  • (fah) performing a reverse transcription on the transcription product to which the primer molecule is hybridized to obtain a reverse transcription product, and
  • (fai) optionally performing a cleavage at the cleavage site of the primer molecule.
or, and in a second alternative, by the following steps:
  • (fba) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a deoxyribonucleic acid and in the 5'-3 'direction a primer sequence, a first defined partial sequence, an intermediate sequence, a second defined partial sequence and a primer binding sequence, wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence,
  • (fbb) generating a transcription starting product, wherein the primer binding sequence at the 3 'end of the nucleic acid to be amplified from step
  • (fba) the second strand of the second adapter molecule from step (fac) is hybridized,
  • (fbc) performing a transcription reaction on the transcription starting product to obtain a transcription product,
  • (fbd) providing a primer molecule, wherein the primer molecule corresponds to the first strand of the first adapter molecule, and
  • (fbe) performing a reverse transcription on the transcription product to which the primer molecule is hybridized to obtain a reverse transcription product.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste Primersequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls von Schritt (fab) und/oder die zweite Primerbindungssequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen komplemetär, bevorzugterweise komplementär ist zu der am 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls von Schritt (fac) angeordneten Promotorsequenz.In an embodiment of the second aspect, it is provided that the first primer sequence the nucleic acid of step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the first adapter molecule of step (fab) and / or the second primer binding sequence of nucleic acid of step (fba) is essentially complementary, preferably complementary to the at the 3'-end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule from step (fac) arranged promoter sequence.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt (fbb) das Ergebnis einer Zweitstrangsynthese ist und der Zweitstrang bevorzugterweise durch Verlängerung des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls hergestellt wird.In an embodiment of the second aspect, it is provided that the transcription starting product according to step (fbb) is the result of a second-strand synthesis and the second-strand preferably by extension of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule will be produced.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt (fad) und/oder Schritt (fae) oder Schritt (fbb) durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, wobei bevorzugterweise zum Ligationsprodukt neben dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls noch ein PCR-Primermolekül verwendet wird, wobei das PCR-Primermolekül zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder zum ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls.In an embodiment of the second aspect, it is provided that the transcription starting product according to step (fad) and / or step (fae) or step (fbb) by a polymerase chain reaction is obtained, wherein preferably the ligation product in addition the second nucleic acid strand of the second adapter molecule another PCR primer molecule is used, wherein the PCR primer molecule at least partially identical is to the first defined subsequence of the to be amplified nucleic acid and / or to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule.

In einer weiteren Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass das reverse Transkriptionsprodukt einer alkalischen Spaltung unterzogen wird.In a further embodiment of the second aspect, it is provided that the reverse transcription product subjected to alkaline cleavage.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass der zweite Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls mindestens zwei Promotoren umfasst.In an embodiment of the second aspect, it is provided that the second nucleic acid strand of the second adapter molecule comprises at least two promoters.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass die mindestens zwei Promotoren mindestens zwei verschiedene Promotoren sind.In an embodiment of the second aspect provides that the at least two promoters at least are two different promoters.

In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass die Promotoren einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Promotoren für eine RNA-Polymerase, bevorzugterweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase umfasst.In a preferred embodiment of the second aspect, it is provided that the promoters individually and independent selected from each other are from the group promoters for an RNA polymerase, preferably T7, T3 or SP6 RNA polymerase.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass das Phosphorylieren in Schritt (faaa) durch eine Kinasierung erfolgt.In an embodiment of the second aspect, it is provided that the phosphorylation in Step (faaa) is done by a Kinasierung.

In einer weiteren Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass in 5'-Richtung des Promotors zusätzliche Basen angeordnet sind, um den Schmelzpunkt des in der Zweitstrangsynthese eingesetzten Primers zu erhöhen.In a further embodiment of the second aspect, it is provided that in the 5 'direction of the promoter additional Bases are arranged to the melting point of in the second-strand synthesis increase the primer used.

In einer Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die doppelsträngige DNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige modifizierte DNA und einzelsträngige modifizierte DNA umfasst.In an embodiment of the second aspect, it is provided that the nucleic acid is selected from the group, the double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded modified DNA and single-stranded modified DNA.

In einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspektes ist vorgesehen, dass die Zweit- strangsynthese direkt im Anschluss an die Ligation ohne vorherige Aufreinigung erfolgt.In a preferred embodiment of the second aspect, it is provided that the second-strand synthesis immediately after the ligation without prior purification he follows.

In einem dritten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Selektion einer an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäure, insbesondere Aptamere, umfassend die Schritte:

  • (a) Bereitstellen einer heterogenen Population von Nukleinsäuren, insbesondere D-Nukleinsäuren, wobei eine jede Nukleinsäure einen Bereich mit einer randomisierten Sequenz und zumindest einer konstanten Sequenz aufweist und sich die die Population ausbildenden Nukleinsäuren in der randomisierten Sequenz unterscheiden,
  • (b) Inkontaktbringen der Population von Nukleinsäuren mit dem Zielmolekül,
  • (c) Abtrennen der Nukleinsäuren, die nicht mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten sind,
  • (d) Abtrennen der Nukleinsäure(n), die mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten ist/sind, von dem Zielmolekül,
  • (e) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (d) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind,
  • (f) Amplifizieren der Nukleinsäure aus Schritt (d),
  • (g) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (f), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (f) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind,
  • (h) optional Sequenzieren der aus Schritt (d) oder Schritt (f) erhaltenen Nukleinsäure(n),
dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt (f) in einer ersten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt:
  • (faa) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Ribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst,
  • (faaa) Phosphorylieren des 5'-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure, sofern die in Schritt (faa) bereitgestellte zu amplifizierende Nukleinsäure kein Phosphat am 5'-Ende aufweist
  • (fab) Bereitstellen eines ersten Adaptermoleküls, wobei das erste Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht und wobei der erste Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und der zweite Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 5'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges einen Überhang liefert, wobei der Überhang zumindest teilweise zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist,
  • (fac) Bereitstellen eines zweiten Adaptermoleküls, wobei das zweite Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurestrang eine Phosphatgruppe an der 5'-Position des Ribose- oder Desoxyriboseteils des 5'-terminalen Nukleotids trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon und wobei der zweite Nukleinsäurestrang eine Spaltstelle aufweist, die bei Spaltung des Nukleinsäurestranges ein erstes Spaltprodukt und ein zweites Spaltprodukt liefert, wobei das erste Spaltprodukt das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls ist, das zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure
  • (fad) Ligieren des ersten und des zweiten Adaptermoleküls an die zu amplifizierende Nukleinsäure, um ein Ligationsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (fae) Durchführen einer reversen Transkription, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten,
  • (faf) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Transkriptionsausgangsprodukt zu erhalten,
  • (fag) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt, um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten,
  • (fah) Durchführen einer Nukleinsäuresynthesereaktion unter Verwendung von modifizierten Nueklosidtriphosphaten, insbesondere 2'-F-Nukleosidtriphosphaten, ausgehend von dem Transkriptionsprodukt von Schritt (fag), wobei ein Syntheseprimer verwendet wird, wobei der Syntheseprimer einen ersten Bereich umfasst, der zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder einen in 5'-Richtung daran anschließenden zweiten Bereich, der an seinem 3'-Ende eine Spaltstelle aufweist oder vollständig aus Ribonukleinsäurebausteinen aufgebaut ist, und zumindest teilweise identisch ist zu der Sequenz des ersten Stranges des ersten Adaptermoleküls,
  • (fai) optional Umsetzen des Reaktionsproduktes aus Schritt (fag), bevorzugterweise unter Verwendung alkalischen Bedingungen und/oder Hitze, bevorzugterweise um eine im wesentlichen zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure identische Nukleinsäure zu erhalten,
oder in einer zweiten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt:
  • (fba) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist und in 5'-3'-Richtung eine Primersequenz, eine erste definierte Teilsequenz, eine Zwischensequenz, eine zweite definierte Teilsequenz und eine Primerbindungssequenz aufweist, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst,
  • (fbb) Durchführen einer reversen Transkription an der in Schritt (fba) bereitgestellten zu amplifiziernden Nukleinsäure, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei als Primer der zweite Strang des zweiten Adaptermoleküls verwendet wird,
  • (fbc) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei der Zweitstrang bevorzugterweise im wesentlichen komplementär ist zu dem in Schritt (fbb) erhaltenen Reaktionsprodukt der reversen Transkriptase,
  • (fbd) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Reaktionsprodukt aus Schritt (fbb) oder (fbc), um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten, und
  • (fbe) Durchführen einer Nukleinsäuresynthesereaktion ausgehend von dem Transkriptionsprodukt von Schritt (fbd), wobei ein Syntheseprimer verwendet wird, wobei der Syntheseprimer aus dem ersten Strang des ersten Adaptermoleküls besteht unter Verwendung von modifizierten Nueklosidtriphosphaten, insbesondere 2'-F-Nukleosidtriphosphaten.
In a third aspect, the object is achieved according to the invention by a method for the selection of a nucleic acid binding to a target molecule, in particular aptamers, comprising the steps:
  • (a) providing a heterogeneous population of nucleic acids, in particular D-nucleic acids, wherein each nucleic acid has an area with a randomized sequence and at least one constant sequence and the population-forming nucleic acids in the randomized sequence differ,
  • (b) contacting the population of nucleic acids with the target molecule,
  • (c) separating the nucleic acids that did not interact with the target molecule,
  • (d) separating the nucleic acid (s) interacting with the target molecule from the target molecule,
  • (e) optionally repeating steps (a) to (d), wherein the nucleic acid (s) of step (d) form or are contained in the heterogeneous population,
  • (f) amplifying the nucleic acid from step (d),
  • (g) optionally repeating steps (a) to (f), wherein the nucleic acid (s) of step (f) form or are contained in the heterogeneous population,
  • (h) optionally sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or step (f),
characterized in that the amplification step (f) in a first alternative is carried out by the following steps:
  • (faa) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a ribonucleic acid and at the 5 'end comprises a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined partial sequence and between the first defined partial sequence and the second defined partial sequence an intermediate sequence wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence,
  • (faaa) phosphorylating the 5'-end of the nucleic acid to be amplified, provided that the nucleic acid to be amplified in step (faa) has no phosphate at the 5'-end
  • (fab) providing a first adapter molecule, wherein the first adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand and wherein the first nucleic acid strand is preferably a deoxyribonucleic acid and the second nucleic acid strand is preferably a deoxyribonucleic acid and the 5 'end of the second nucleic acid strand provides an overhang, wherein the overhang is at least partially complementary to the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof,
  • (fc) providing a second adapter molecule, wherein the second adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand carries a phosphate group at the 5 'position of the ribose or deoxyribose part of the 5'-terminal nucleotide, and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and the 3 'end of the second nucleic acid strand is at least partially complementary to the second defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof and wherein the second nucleic acid strand has a cleavage site which upon cleavage of the nucleic acid strand is a first cleavage product and provides a second cleavage product, wherein the first cleavage product is the 3 'end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule that is at least partially complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified
  • (fad) ligating the first and second adapter molecules to the nucleic acid to be amplified to obtain a ligation product as a reaction product, (fae) performing a reverse transcription to obtain a reverse transcription product as a reaction product,
  • (faf) optionally performing a second-strand synthesis to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a transcription starting product,
  • (fag) performing a transcription reaction on the transcription starting product to obtain a transcription product,
  • (fah) performing a nucleic acid synthesis reaction using modified nucleotide triphosphates, especially 2'-F nucleoside triphosphates, starting from the transcription product of step (fag), using a synthesis primer, the synthesis primer comprising a first region that is at least partially identical to the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified and / or a second region adjoining it in the 5 'direction, which has a cleavage site at its 3' end or is constructed completely from ribonucleic acid building blocks, and is at least partially identical to the sequence of the first strand the first adapter molecule,
  • (fai) optionally reacting the reaction product from step (fag), preferably using alkaline conditions and / or heat, preferably to obtain a nucleic acid substantially identical to the nucleic acid to be amplified,
or in a second alternative by the following steps:
  • (fba) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is a ribonucleic acid and has in the 5'-3 'direction a primer sequence, a first defined partial sequence, an intermediate sequence, a second defined partial sequence and a primer binding sequence, wherein the intermediate sequence the includes randomized sequence,
  • (fbb) performing a reverse transcription on the nucleic acid to be amplified provided in step (fba) in order to obtain a reverse transcription product as a reaction product, using as primer the second strand of the second adapter molecule,
  • (fbc) optionally performing a second-strand synthesis to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a reaction product, wherein the second-strand is preferably substantially complementary to the reaction product of the reverse transcriptase obtained in step (fbb),
  • (fbd) performing a transcription reaction on the reaction product of step (fbb) or (fbc) to obtain a transcription product, and
  • (fbe) performing a nucleic acid synthesis reaction starting from the transcription product of step (fbd) using a synthesis primer, said synthesis primer consisting of the first strand of the first adapter molecule using modified nucleotide triphosphates, especially 2'-F nucleoside triphosphates.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste Primersequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls von Schritt (fab) und/oder die zweite Primerbindungssequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen komplementär, bevorzugterweise komplementär ist zu der am 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls von Schritt (fac) angeordneten Promotorsequenz.In an embodiment of the third aspect, it is provided that the first primer sequence the nucleic acid of step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the first adapter molecule of step (fab) and / or the second primer binding sequence of nucleic acid of step (fba) is substantially complementary, preferably complementary to the at the 3'-end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule from step (fac) arranged promoter sequence.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt Reaktionsprodukt gemäß Schritt (faf) oder Schritt (fbc) durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, wobei bevorzugterweise zum Ligationsprodukt neben dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls noch ein PCR-Primermolekül verwendet wird, wobei das PCR-Primermolekül zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder zum ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls.In an embodiment of the third aspect, it is provided that the transcription starting product according to step Reaction product according to step (faf) or step (fbc) obtained by a polymerase chain reaction is, preferably the ligation product in addition to the second nucleic acid strand of the second adapter molecule still a PCR primer molecule used is, wherein the PCR primer molecule at least partially identical to the first defined subsequence the nucleic acid to be amplified and / or to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule.

In einer weiteren Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass der zweite Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls mindestens zwei Promotoren umfasst.In a further embodiment of the third aspect, it is provided that the second nucleic acid strand of the second adapter molecule comprises at least two promoters.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die mindestens zwei Promotoren mindestens zwei verschiedene Promotoren sind.In an embodiment of the third aspect provides that the at least two promoters at least are two different promoters.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die Promotoren einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Promotoren für eine RNA-Polymerase, bevorzugterweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase umfasst.In an embodiment of the third aspect, it is provided that the promoters individually and independent selected from each other are from the group promoters for an RNA polymerase, preferably T7, T3 or SP6 RNA polymerase.

In einer weiteren Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die doppelsträngige FNA und einzelsträngige FNA umfasst.In a further embodiment of the third aspect, it is provided that the nucleic acid is selected from the group, the double-stranded FNA and single-stranded Includes FNA.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das Reaktionsprodukt der Nukleinsäuresynthesereaktion einer alkalischen Spaltung unterzogen wird.In an embodiment of the third aspect, it is provided that the reaction product of Nucleic acid synthesis reaction subjected to alkaline cleavage.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das Phosphorylieren in Schritt (faaa) durch eine Kinasierung erfolgt.In an embodiment of the third aspect, it is provided that the phosphorylation in Step (faaa) is done by a Kinasierung.

In einer Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass in 5'-Richtung des Promotors zusätzliche Basen angeordnet sind, um den Schmelzpunkt des in der Zweitstrangsynthese eingesetzten Primers zu erhöhen.In an embodiment of the third aspect, it is provided that additional in the 5 'direction of the promoter Bases are arranged to the melting point of in the second-strand synthesis increase the primer used.

In einer weiteren Ausführungsform des dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die Zweitstrangsynthese direkt im Anschluss an die Ligation ohne vorherige Aufreinigung erfolgt.In a further embodiment of the third aspect, it is provided that the second-strand synthesis directly following the ligation without prior purification.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass zumindest einer der beiden Promotoren so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die identisch zur ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und der zweite Promotor so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die identisch ist zu der die Promotorsequenz des 3' von dem zweiten Promotor angeordnetens Promotor umfassenden Sequenz des ersten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls.In an embodiment of the first aspect, it is provided that at least one of the two Promoters are arranged so that the transcripts match the sequence begin to be identical to the first defined subsequence of amplifying nucleic acid and the second promoter is arranged so that the transcripts begin with the sequence that is identical to that of the promoter sequence of the 3 'of the second promoter arranged promoter comprising sequence of the first nucleic acid strand of the first adapter molecule.

In einer Ausführungsform des zweiten und dritten Aspektes ist vorgesehen, dass zumindest einer der beiden Promotoren so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die komplementär zur zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und der zumindest zweite Promotor so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die identisch ist zu der die Promotorsequenz des 3' von dem zweiten Promotor angeordneten Promotors umfassenden Sequenz des zweiten Stranges des zweiten Adaptermoleküls.In an embodiment of the second and third aspects, it is provided that at least one of the two promoters is arranged so that the transcripts begin with the sequence that is complementary to the second defined subsequence the nucleic acid to be amplified and the at least second promoter is arranged such that the Transcripts start with the sequence that is identical to the one Promoter sequence of the 3 'of Sequence comprising the second promoter arranged promoter of the second strand of the second adapter molecule.

In einer Ausführungsform des ersten Aspektes ist vorgesehen, dass das 5'-tenminale Nukleotid der zu amplifizierenden Nukleinsäure ein 5'-Phosphat trägt.In an embodiment In the first aspect, it is provided that the 5'-terminal nucleotide of the to be amplified nucleic acid a 5'-phosphate wearing.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die Spaltstelle durch eine Restriktionsenzymschnittstelle bereitgestellt wird und das Spalten durch ein Restriktionsenzym erfolgt.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, the cleavage site is provided by a restriction enzyme cleavage site and columns are cleaved by a restriction enzyme.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die Spaltstelle ausgebildet wird durch ein Ribonukleotid.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, the cleavage site is formed by a ribonucleotide.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist, das Ribonukleotid in dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls das erste Nukleotid 5' von dem Bereich ist, der zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon; und/oder wenn die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure oder eine modifizierte Desoxyribonukleinsäure und/oder eine teilweise oder vollständig 2'-F-modifizierte Nukleinsäure ist, das Ribonukleotid in dem als Primermolekül verwendeten Nukleinsäurestrang das erste Nukleotid 5' von der ersten definierten Teilsequenz ist.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, the nucleic acid to be amplified is a ribonucleic acid, the ribonucleotide in the second nucleic acid strand of the second adapter molecule is the first one Nucleotide 5 'of the area that is at least partially complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified or a part of it; and / or when the nucleic acid to be amplified is a deoxyribonucleic acid or a modified deoxyribonucleic acid and / or a partial or completely 2'-F-modified nucleic acid is the ribonucleotide in the nucleic acid strand used as a primer molecule the first nucleotide 5 'of the first defined subsequence.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass zumindest eines der 3'-Enden zumindest eines der Adaptermoleküle blockiert ist, um eine Verlängerung der Adaptermoleküle bei einer Zweitstrangsynthese zu vermeiden.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that at least one of the 3 'ends at least one of the adapter molecules is blocked to an extension the adapter molecules to avoid in a second strand synthesis.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls und/oder des ersten Nukleinsäurestranges des zweiten und/oder des dritten Adaptermoleküls blockiert ist.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that the 3'-end of the second nucleic acid strand of the first adapter molecule and / or the first nucleic acid strand of the second and / or the third adapter molecule is blocked.

In einer weiteren Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass das Blockieren dadurch erfolgt, dass das 3'-terminale Nukleotid des Adaptermoleküls ein 3'-Desoxynukleotid, bevorzugterweise ein 2'-3'-Didesoxynukleotid ist.In a further embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, in that the blocking is effected by the 3'-terminal nucleotide of the adapter molecule being a 3'-deoxynucleotide, preferably a 2'-3'-dideoxynucleotide is.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, dass eine basengepaarte Stammstruktur ausgebildet ist, bevorzugtererweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugterweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that the first defined subsequence and the second defined Partial sequence are at least partially complementary, preferably so far complementary are that a base-paired stem structure is formed, more preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, preferably at a temperature of about 37 ° C.

In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, dass eine basengepaarten Helix ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Beriech von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugtererweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.In a preferred embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that the first defined subsequence and the second defined Partial sequence are at least partially complementary, preferably so far complementary are that a base-paired helix is formed, preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, more preferably at a temperature of about 37 ° C.

In einer noch bevorzugteren Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste definierte Teilsequenz mindestens 4 Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz mindestens 4 Nukleotide umfasst.In a more preferred embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that the first defined partial sequence is at least 4 nucleotides and the second defined partial sequence comprises at least 4 nucleotides.

In einer bevorzugtereren Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die zweite definierte Teilsequenz mindestens 6 Nukleotide umfasst.In a more preferred embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, the second defined partial sequence comprises at least 6 nucleotides.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste definierte Teilsequenz n + m Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz n Nukleotide umfasst, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 10000, bevorzugterweise von 4 bis 7 ist, und m eine ganze Zahl von 2 bis 1000 ist, bevorzugterweise von 2 bis 6 ist.In one embodiment of the first and / or second and / or third aspect, it is provided that the first defined partial sequence comprises n + m nucleotides and the second defined partial sequence n nucleotides, where n is an integer from 4 to 10,000, preferably from 4 to 7 is, and m is an integer from 2 to Is 1000, preferably from 2 to 6.

In einer Ausführurgsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass die randomisierte Nukleotidsequenz eine Länge von 20 bis 10000 Nukleotiden, bevorzugterweise von 30 bis 60 Nukleotiden und bevorzugtererweise von 25 bis 40 Nukleotiden aufweist.In a Ausführurgsform of the first and / or second and / or third aspect is provided, that the randomized nucleotide sequence has a length of 20 to 10,000 nucleotides, preferably from 30 to 60 nucleotides, and more preferably from 25 to 40 nucleotides.

In einer weiteren Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass bei dem Verfahren die Amplifikation ausschließlich gemäß der ersten Alternative durchgeführt wird.In a further embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that in the method the amplification exclusively according to the first Alternative is performed.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass bei dem Verfahren die Amplifikation ausschließlich gemäß der zweiten Alternative durchgeführt wird.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that in the method the amplification exclusively according to the second Alternative performed becomes.

In einer Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass bei dem Verfahren die Amplifikation gemäß der ersten Alternative im regelmäßigen oder unregelmäßigem Wechsel mit der Amplifikation gemäß der zweiten Alternative durchgeführt wird.In an embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that in the method the amplification according to the first alternative in regular or irregular change with the amplification according to the second Alternative performed becomes.

In einer weiteren Ausführungsform des ersten und/oder zweiten und/oder dritten Aspektes ist vorgesehen, dass bei dem Verfahren mindestens einmal die Amplifikation gemäß der ersten Alternative und mindestens einmal die Amplifikation gemäß der zweiten Alternative durchgeführt wird.In a further embodiment of the first and / or second and / or third aspect is provided, that in the method at least once the amplification according to the first Alternative and at least once the amplification according to the second Alternative performed becomes.

In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von L-Nukleinsäwe, die an ein Zielmolekül binden, umfassend die Schritte gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 55, wobei

  • – die heterogene Population von Nukleinsäuren eine heterogenen Population von D-Nukleinsäuren ist,
  • – das Zielmolekül die optische Antipode des Zielmoleküls der herzustellenden L-Nukleinsäure ist,
  • – Sequenzieren der aus Schritt (d) oder (f) erhaltenen Nukleinsäure(n), wobei diese bevorzugterweise mit der optischen Antipode des Zielmoleküls der herzustellenden L-Nukleinsäwe in Wechselwirkung getreten ist/sind; und
  • – Synthese von L-Nukleinsäure(n), die in ihrer Sequenz mit den in Schritt (f) für die D-Nukleinsäure(n) ermittelten Sequenzen) identisch sind.
In a fourth aspect, the object is achieved according to the invention by a method for producing L-Nukleinsäwe that bind to a target molecule, comprising the steps according to a method according to any one of claims 1 to 55, wherein
  • The heterogeneous population of nucleic acids is a heterogeneous population of D-nucleic acids,
  • The target molecule is the optical antipode of the target molecule of the L-nucleic acid to be produced,
  • - Sequencing of the nucleic acid (s) obtained from step (d) or (f), which has preferably interacted with the optical antipode of the target molecule of the L-Nukleinsäwe to be produced; and
  • Synthesis of L-nucleic acid (s) identical in sequence with the sequences determined in step (f) for the D-nucleic acid (s).

In einem fünften Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, dass eine basengepaarten Stammstruktur ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugtererweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.In a fifth Aspect the object is achieved according to the invention by a nucleic acid comprising in the 5'-3 'direction a first defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined subsequence, wherein the first defined subsequence and the second defined subsequence are at least partially complementary, are preferably complementary so far that a base-paired Root structure is formed, preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, more preferably one Temperature of about 37 ° C.

In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, eine basengepaarten Helix ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugtererweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.In a sixth aspect, the object is achieved by a nucleic acid comprising in the 5'-3 'direction a first defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined subsequence, wherein the first defined subsequence and the second defined subsequence are at least partially complementary, Preferably, as far as complementary, a base-paired Helix is formed, preferably at a temperature in the Range from about 20 to about 40 ° C, more preferably at a temperature of about 37 ° C.

In einem siebten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die Nukleinsäure eine basengepaarten Stammstruktur ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugterweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.In a seventh aspect, the object is achieved by a nucleic acid comprising in the 5'-3 'direction a first defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined subsequence, wherein the nucleic acid is a base-paired parent structure is formed, preferably at a temperature in the range from about 20 to about 40 ° C, preferably at a temperature of about 37 ° C.

In einer Ausführungsform des siebten Aspektes ist vorgesehen, dass die Stammsttuktur vollständig oder teilweise durch die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsquenz ausgebildet ist.In an embodiment of the seventh aspect, it is provided that the parent structure is complete or partly by the first defined subsequence and the second defined subsequence is formed.

In einem achten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die Nukleinsäure eine basengepaarten Helix ausgebildet, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugterweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.In an eighth aspect, the object is achieved by a nucleic acid comprising in the 5'-3 'direction a first defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined partial sequence, wherein the nucleic acid is a base-paired helix formed, preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, preferably at a temperature of about 37 ° C.

In einer Ausführungsform des achten Aspektes ist vorgesehen, dass die basengepaarte Helix teilweise oder vollständig ausgebildet ist durch die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz.In an embodiment of the eighth aspect, it is envisaged that the base-paired helix partially or completely is formed by the first defined subsequence and the second defined subsequence.

In einer Ausführungsform des fünften und/oder sechsten und/oder siebten und/oder achten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste definierte Teilsequenz mindestens 4 Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz mindestens 4 Basenpaare umfasst.In an embodiment of the fifth and / or sixth and / or seventh and / or eighth aspect provided that the first defined partial sequence at least 4 nucleotides and the second defined partial sequence comprises at least 4 base pairs.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die zweite definierte Teilsequenz mindestens 6 Nukleotide umfasst.In a preferred embodiment is provided that the second defined subsequence at least 6 nucleotides.

In einer Ausführungsform des fünften und/oder sechsten und/oder siebten und/oder achten Aspektes ist vorgesehen, dass die erste definierte Teilsequenz n + m Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz n Nukleotide umfasst, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 10.000, bevorzugterweise von 4 bis 7 ist, und m eine ganze Zahl von 2 bis 1.000 ist, bevorzugterweise von 2 bis 6 ist.In an embodiment of the fifth and / or sixth and / or seventh and / or eighth aspect provided that the first defined subsequence n + m nucleotides and the second defined partial sequence comprises n nucleotides, wherein n is an integer from 4 to 10,000, preferably from 4 to 7 and m is an integer of 2 to 1,000, preferably from 2 to 6.

In einer Ausführungsform des fünften und/oder sechsten und/oder siebten und/oder achten Aspektes ist vorgesehen, dass die randomisierte Nukleotidsequenz eine Länge von 20 bis 10000 Nukleotiden, bevorzugterweise von 30 bis 60 Nukleotiden und bevorzugtererweise von 25 bis 40 Nukleotiden aufweist.In an embodiment of the fifth and / or sixth and / or seventh and / or eighth aspect provided that the randomized nucleotide sequence is a length of 20 to 10,000 nucleotides, preferably from 30 to 60 nucleotides and more preferably from 25 to 40 nucleotides.

In einer Ausführungsform des fünften und/oder sechsten und/oder siebten und/oder achten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure am 5'-Ende der ersten definierten Teilsequenz und/oder am 3'-Ende der zweiten definierten Teilsequenz eine weitere Sequenz aufweisen.In an embodiment of the fifth and / or sixth and / or seventh and / or eighth aspect provided that the nucleic acid at the 5'-end of the first defined subsequence and / or at the 3 'end of the second defined subsequence have another sequence.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die weitere Sequenz am 5'-Ende im wesentlichen identisch ist zur Sequenz des ersten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls und/oder die weitere Sequenz am 3'-Ende im wesentlichen identisch ist zur Sequenz des ersten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls.In a preferred embodiment it is provided that the further sequence at the 5 'end is substantially identical to Sequence of the first nucleic acid strand of the first adapter molecule and / or the further sequence at the 3'-end is substantially identical to the sequence of the first nucleic acid strand of the second adapter molecule.

In einem neunten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäurepopulation umfassend mindestens zwei Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 57 bis 68, wobei sich zumindest zwei Mitglieder der Population in ihrer randomisierten Nukleotidsequenz unterscheiden, bevorzugterweise zumindest an einer Position ihrer randomisierten Nukleotidsequenz unterscheiden.In a ninth aspect, the object is achieved by a nucleic acid population comprising at least two nucleic acids according to any one of claims 57 to 68, wherein at least two members of the population in their differentiate randomized nucleotide sequence, preferably at least at one position of its randomized nucleotide sequence differ.

In einer Ausführungsform des neunten Aspektes ist vorgesehen, dass zumindest zwei Mitglieder der Population eine unterschiedlich lange randomisierte Nukleotidsequenz aufweisen.In an embodiment of the ninth aspect, it is provided that at least two members the population a different length randomized nucleotide sequence exhibit.

In einer weiteren Ausführungsform des neunten Aspektes ist vorgesehen, dass die Nukleinsäurepopulation etwa zwischen 1012 und 1018, bevorzugterweise etwa zwischen 1014 und 1016 verschiedene Nukleinsäuren umfassen.In a further embodiment of the ninth aspect, it is provided that the nucleic acid population comprise approximately between 10 12 and 10 18 , preferably between approximately 10 14 and 10 16, different nucleic acids.

In einem zehnten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer oder mehrerer der Nukleinsäure gemäß dem achten Aspekt und/oder einer oder mehrerer der Nukleinsäurepopulationen gemäß dem neunten Aspekt in einem Verfahren gemäß einem der Aspekte eins bis vier.In A tenth aspect of the object is achieved by the use of one or more of the nucleic acids according to the eighth aspect and / or one or more of the nucleic acid populations according to the ninth Aspect in a method according to the aspects one to four.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass es – im Gegensatz zu den Verfahren im Stand der Technik – möglich ist, um die Amplifikationssequenzen verkürzte Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren oder die Amplifikationssequenzen tra genden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren zu identifizieren, wobei es die – durch die definierten Teilsequenzen vorgegebene – Struktur der in der Selektion eingesetzten Nukleinsäuren ermöglicht die Amplifikationssequenzen tragenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren – unter Erhaltung ihrer Bindungseigenschaften – um die Amplifikationssequenzen zu reduzieren.Of the The present invention is based on the surprising finding that that it - im Unlike the methods in the prior art - it is possible to amplify the sequences shortened Target molecule-binding nucleic acids or the amplification sequences have target molecule-binding nucleic acids to identify, whereby it - by the defined partial sequences predetermined - structure the nucleic acids used in the selection allows the amplification sequences carrying target molecule binding Nucleic acids - under Maintaining their binding properties - around the amplification sequences to reduce.

Weiterhin ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, während der Durchführung der Verfahren zur Identifizierung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure sowohl – mindestens einmalig – mit um die Amplifikationssequenzen verkürzten als auch mit den die Amplifikationssequenzen tragenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren zu arbeiten, d. h. zu selektieren und somit am Ende des Verfahrens Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren zu generieren, die ohne das Vorhandensein der Amplifikationssequenzen das Zielmolekül mit gleicher Güte erkennen.Farther it is according to the present Invention possible, while the implementation the method of identifying target molecule-binding nucleic acid both - at least once - with shortened by the amplification sequences as well as with the To amplification sequences carrying target molecule-binding nucleic acids work, d. H. to select and thus at the end of the procedure Target molecule-binding nucleic acids too generate without the presence of the amplification sequences the target molecule with equal quality detect.

Schließlich ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, dass bei Verwendung von um die Amplifikationssequenzen verkürzten Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren das erfindungsgemäße Verfahren ohne Aufreinigungsschritte durchzuführen und erst die Transkriptionsprodukte, vor deren weiterer Verwendung in einer nächsten Selektions-Runde im Rahmen des SELEX-Verfahrens, einer Aufreinigung unterzogen werden. Bevorzugterweise erfolgt diese Aufreinigung durch Gelreinigung.Finally, according to the present invention, it is possible that when using target molecule-binding nucleic acids shortened by the amplification sequences, the inventive method without Perform purification steps and first the transcription products, before further use in a next round of selection in the SELEX process, a purification are subjected. Preferably, this purification is carried out by gel purification.

Weitere Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren bestehen darin, dass im Rahmen der Herstellung Zielmolekül-bindender DNA-Nukleinsäuren die DNA-Amplifikation zum größten Teil durch eine Transkriptionsreaktion und nicht durch eine PCR zu bewerkstelligen, sowie die Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren aus vollständig modifizierter RNA identifiziert und hergestellt werden können.Further Advantages of the method according to the invention consist in that in the context of production target-binding DNA nucleic acids the DNA amplification for the most part by a transcription reaction and not by a PCR, as well as the target molecule binding nucleic acids out completely modified RNA can be identified and produced.

Dabei weist die um die Amplifikationssequenzen verkürzte Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren am 5'- Ende und am 3'-Ende jeweils kurze definierte Sequenzen auf, die für die Ligation der Amplifikationssequenzen, also für die Basenpaarung der Adaptermoleküle erforderlich sind. Zwischen diesen definierten 5'-terminalen und 3'-terminalen definierten Teilse quenzen, ist eine weitere Sequenz von Nukleotiden angeordnet, die hierin auch als Zwischensequenz bezeichnet wird. In der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Aptameren im Rahmen des SELEX-Prozesses lassen sich damit überraschenderweise eine Vielzahl von Vorteilen realisieren. Ein derartiger Vorteil wird dadurch begründet, dass die Zwischensequenz in einer bevorzugten Ausführungsform als randomisierte Sequenz ausgebildet ist und damit die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Nukleinsäure ist, die im Rahmen der Nukleinsäure-Bibliothek und deren Verwendung im SELEX-Prozess anwendbar ist, und damit die Zwischensequenz jene Sequenz ist, die letzten Endes die an das Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure liefern soll. Dadurch, dass die am 5'- und 3'-Enden vorhandenen, für die Ligation der Amplifikationssequenzen erforderlichen definierten Sequenzen, hierin auch als erste und zweite definierte Teilsequenz bzw. als fixierte Teilsequenzen bezeichnet, nur sehr kurz sind, ist eine Beteiligung dieser definierten Teilsequenzen am Bindungsereignis der Nukleinsäure an das Zielmolekül vergleichsweise unwahrscheinlich. Selbst falls diese auftritt, ist sie aufgrund der geringen Länge der definierten Sequenzen nicht sehr störend. Gleichzeitig kann mit der Gestaltung der zu amplifizierenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure und dem erfindungsgemäßen Verfahren erheblich Einfluss genommen werden auf die grundsätzliche Länge der im Rahmen des SELEX-Verfahrens erhaltenen, an das Zielmo- lekül bindenden Nukleinsäuren, da in Abhängigkeit von der Länge des randomisierten Bereiches der Nukleinsäure(n), hier der Zwischensequenz, die Länge der an das Zielmolekül bindende Nukleinsäure wesentlich beeinflusst werden kann. Bei Verwendung der bisherigen Nukleinsäure-Konstrukte, die neben dem randomisierten Bereich auch typischerweise an beiden Enden Primer-Bindungssequenzen aufwiesen, wurde wie eingangs berichtet immer wieder beobachtet, dass auch diese Bereiche die Bindung an das Zielmolekül vermittelten. In einem jeden Fall verringert sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Notwendigkeit, die Nukleinsäuren biophysikalisch zu charakterisieren und dann in rationalen und halbrationalen Ansätzen zu verkürzen, bevor sie synthetisch darstellbar sind.there has the target molecule binding truncated around the amplification sequences nucleic acids at the 5'-end and at the 3'-end respectively short defined sequences for the ligation of the amplification sequences, ie for the Base pairing of adapter molecules required are. Between these defined 5'-terminal and 3'-terminal defined subsections, another sequence of nucleotides is arranged herein as well is called a cutscene. In the application of the method according to the invention for the production of aptamers in the context of the SELEX process surprisingly so realize a multitude of advantages. Such an advantage is justified by that the cutscene in a preferred embodiment is designed as a randomized sequence and thus the nucleic acid to be amplified nucleic acid is that under the nucleic acid library and their use in the SELEX process is applicable, and thus the Intermediate sequence is that sequence which ultimately binds to the target molecule nucleic acid should deliver. By having the 5 'and 3' ends present for ligation the amplification sequences required defined sequences, herein also as the first and second defined subsequence or as fixed part sequences are called, are only very short, is one Participation of these defined subsequences in the binding event the nucleic acid to the target molecule relatively unlikely. Even if this occurs is they due to the small length the defined sequences are not very disturbing. At the same time can with the design of the target molecule-binding nucleic acid to be amplified and the inventive method be significantly influenced on the fundamental Length of obtained by the SELEX process, binding to the target molecule nucleic acids, there in dependence of the length the randomized region of the nucleic acid (s), here the intermediate sequence, the length of the to the target molecule binding nucleic acid can be significantly influenced. When using the previous one Nucleic acid constructs, which in addition to the randomized area also typically at both Ends had primer binding sequences was reported initially Again and again observed that even these areas bind to the target molecule mediated. In any case, reduces with the inventive method the need for the nucleic acids biophysically and then in rational and semi-national approaches To shorten, before they are synthetically representable.

Die Amplifikationssequenzen tragendenen Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren weisen dagegen am 5'-Ende und am 3'-Ende der fixierten Teilsequenzen zusätzlich die Amplifikationssequenzen auf, die für die Durchführung der Amplifikationsschritte – ohne vorherige Ligation von Adaptermolekülen – erforderlich sind. Diese Amplifikationssequenzen sind Sequenz-identisch mit den Amplifikationssequenzen, die an die Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren ohne Amplifikationssequenzen mittels der Adapter angehängt werden.The Have target-binding nucleic acids carrying amplification sequences on the other hand at the 5'-end and at the 3'-end of the fixed partial sequences in addition the amplification sequences necessary for the implementation of Amplification steps - without prior ligation of adapter molecules - are required. These Amplification sequences are sequence identical to the amplification sequences, that bind to the target molecule nucleic acids without amplification sequences are attached by means of the adapter.

Durch die Auswahl der fixierten Teilsequenzen und der Amplifikationssequenzen werden in ihrem randomisierten Bereich Sequenz-identische Nukleinsäuren, die die Amplifikationssequenzen tragen oder denen sie fehlen, das Zielmolekül mit gleichen Eigenschaften erkennen. Das Vorhandensein der Amplifikationssequenzen hat keinen Einfluß auf das Bindungsereignis. Sie können somit ggf. entfernt werden, um synthetisch darstellbare, d. h. vergleichsweise kurze Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren zu generieren.By the selection of the fixed partial sequences and the amplification sequences In their randomized area, sequence-identical nucleic acids, the carry the amplification sequences or lacking the target molecule with the same Recognize properties. The presence of the amplification sequences has no influence on the binding event. You can thus optionally removed to synthetically representable, d. H. comparatively short target-binding nucleic acids to generate.

Da der Einfluß dieser Amplifikationssequenzen auf die Bindung der Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure durch das hierin offenbarte Verfahren, das das Entfernen der Amplifikationssequenzen vor dem Bindungsereignis und dem Anhängen der Amplifikationssequenzen an die Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren danach umfasst, ausgeschlossen wird, können synthetisch darstellbare Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren gewährleistet werden. Das gilt einerseits dann, wenn die Bindung an das Target nur mit Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren ohne Amplifikationssequenzen durchgeführt wird. Andererseits werden auch dann synthetisch darstellbare Zielmolekül-bindende Nukleinsäure identifiziert, wenn die Bindung an das Target zumindest einmalig mit Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren ohne Amplifikationssequenzen bei mehrfacher Verwendung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren mit Amplifikationssequenzen im Laufe der Selektion durchgeführt wird.There the influence of this Amplification sequences on the binding of the target molecule binding nucleic acid by the method disclosed herein, removing the amplification sequences before the binding event and attaching the amplification sequences to the target molecule binding Nucleic acids afterwards includes, is excluded ensures synthetically representable target-binding nucleic acids become. On the one hand, this applies when binding to the target only with target-binding nucleic acids without Amplification sequences performed becomes. On the other hand, then synthetically representable target-binding nucleic acid identified when binding to the target at least once with target-binding nucleic acids without amplification sequences with multiple use of target-binding nucleic acids with amplification sequences in the course of selection is performed.

Die chemisch-synthetische Darstellbarkeit von Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren ist vor allem bei RNA oder RNA-Hybriden aus mehreren Gründen notwendig: Zum einen benötigen Aptamere zur Erhöhung ihrer Stabilität in biologischen Medien zusätzliche Modifikationen. Die im Stand der Technik verfügbaren RNA-Polymerssen, tolerieren zwar 2'-modifizierte Pyrimidinnukleotidtriphosphate, nicht aber 2'-modifiziertes Guanosintriphosphat, da es hier in der in vitro Transkription zu Initiationsproblemen kommt. Des weiteren sind 2'-Fluoro-substituierte Purinnukleotide und – nukleoside synthetisch schwerer darstellbar als 2'-F-Pyrimidinnukleotide und -nukleoside. Dadurch werden aus in vitro Selektionen mit modifizierten Bibliotheken, die nukleaseresistenter als kanonische RNA-Bibliotheken sind, lediglich RNA-Hybride gewonnen. Welche der Purine noch nachträglich, durch Austausch mit 2'-Methoxy- oder 2'-Allylpurinen gegen Nukleasen geschützt werden können, ohne dass die Bindungsfähigkeit an das Selektions-Zielmolekül verloren geht oder übermäßig stark eingeschränkt wird, muss experimentell durch ein Screening ermittelt wer den. Dabei müssen Moleküle synthetisch mit Modifikationen an allen möglichen Purinen hergestellt und auf Bindung getestet werden. Mit diesem Prozess kann also erst begonnen werden, wenn eine Länge von ca. 60 Nukleotiden unterschritten worden ist. Verkürzungsexperimente, die zu synthetisch darstellbaren verkürzten Aptameren führen, sind allerdings langwierig und haben manchmal nicht den gewünschten Ausgang, da eben nicht sicher ist, ob die identifizierten Sequenzen überhaupt verkürzt werden können.The chemical-synthetic representability of ribonucleic acids and deoxyribonucleic acids is necessary especially for RNA or RNA hybrids for several reasons: Firstly, aptamers require Increasing their stability in biological media additional modifications. Although the RNA polymers available in the prior art tolerate 2'-modified pyrimidine nucleotide triphosphates, they do not tolerate 2'-modified guanosine triphosphate, since initiation problems occur here in the in vitro transcription. Furthermore, 2'-fluoro-substituted purine nucleotides and nucleosides are synthetically harder to image than 2'-F-pyrimidine nucleotides and nucleosides. As a result, only RNA hybrids are obtained from in vitro selections with modified libraries that are more nuclease resistant than canonical RNA libraries. Which of the purines can be subsequently protected by exchange with 2'-methoxy or 2'-allyl purines against nucleases without the binding ability to the selection target molecule is lost or excessively limited, must be determined experimentally by screening who the , In doing so, molecules must be synthesized with modifications to all possible purines and tested for binding. Thus, this process can only be started when it has fallen below a length of about 60 nucleotides. Shortening experiments, which lead to synthetically representable truncated aptamers, are however tedious and sometimes do not have the desired outcome, since it is not certain whether the identified sequences can ever be shortened.

Bevor aber keine 2'-Modifikationen angebracht sind, können sinnvolle Experimente in biologischen Medien nur sehr eingeschränkt durchgeführt werden, weil die Aptamere schnell von extrazellulären RNasen zerschnitten werden.Before but no 2'-modifications are attached, can meaningful experiments in biological media are carried out only to a very limited extent, because the aptamers are rapidly cut by extracellular RNases.

Auch Spiegelmere müssen synthetisch hergestellt werden, bevor ihre Bindung an das natürliche Target beispielsweise in biophysikalischen Assays, Zellassays oder Tierexperimenten gezeigt werden kann. Spiegelmere bestehen aus L-RNA oder L-DNA, für deren Synthese noch keine Enzyme identifiziert worden sind.Also Spiegelmers need be synthesized before their binding to the natural target for example in biophysical assays, cell assays or animal experiments can be shown. Spiegelmers consist of L-RNA or L-DNA, for their Synthesis no enzymes have yet been identified.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren ist die chemisch-synthetische Darstellbarkeit von Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren sofort nach der Identifizierung (Spiegel-) Target-bindender Sequenzen möglich. Die erfindungsgemäßen Verfahren senken also den Zeitraum bis zur Identifizierung biologisch aktiver Aptamere/Spiegelmere erheblich. Darüber hinaus besteht bei Anwendung dieser Verfahrens nicht das Risiko, durch eine fehlgeschlagende Verkürzung möglicherweise nie die biologische Aktivität eines Aptamers/Spiegelmers zeigen zu können.With The method described here is the chemical-synthetic representability of ribonucleic acids and deoxyribonucleic acids Immediately after identifying (mirroring) target-binding sequences. The inventive method thus reduce the period until the identification of biologically active aptamers / spiegelmers considerably. About that In addition, there is no risk of using this method a failed shortening possibly never the biological activity of an aptamer / spiegelmers show.

Des weiteren ist es aus weiteren Gründen zwingend erforderlich, möglichst kurze Aptamere/Spiegelmere mit guter Targetbindung zur Verfügung zu haben, sobald größere Mengen davon gebraucht werden (z.B. für Tierexperimente, klinischen Studien, Therapeutika am Markt und als Adsorbermaterialien). Jedes zusätzliche Nukleotid erhöht nicht nur den Rohstoffverbrauch, sondern senkt auch die Ausbeute in der Synthese und erschwert die Reinigung. Wenn die Moleküle mit den hierin beschriebenen Verfahren selektiert wurden, sind sie in der Regel bereits 30 Nukleotide kürzer als herkömmliche Aptamere/Spiegelmere.Of others are for other reasons mandatory, if possible short aptamers / spiegelmers with good target binding available too have, as soon as larger quantities used (e.g., for Animal experiments, clinical studies, therapeutics on the market and as Adsorber). Every additional one Nucleotide increases not only the consumption of raw materials, but also reduces the yield in the synthesis and complicates the purification. If the molecules with the They have been selected in the methods described herein Usually already 30 nucleotides shorter as conventional Aptamers / Spiegelmers®.

Einzelsträngige DNA-Oligonukleotide können – in Analogie zu einzelsträngigen RNAs – Zielstrukturen erkennen und an sie binden (Bock et al., Selection of single stranded DNA molecules that bind and inhibit thrombin, Nature (1992), 355: 564–6; Green et al., Inhibitory DNA ligands to platelet derived growth factor B-chain, Biochemistry (1196), 35: 14413–24; Leva et al., GnRH binding RNA and DNA Spiegelmers: a novel approach toward GnRH antagonism, Chem Biol (2002), 9: 351–9). Man bezeichnet sie daher auch als DNA-Aptamere. DNA-Aptamere haben im Gegensatz zu solchen Aptameren, welche Ribonukleotide enthalten, den Vorteil, dass sie laugenstabil und autoklavierbar sind. Dies ist von großem Vorteil, wenn das Aptamer beispielsweise in Chromatographiesäulen als Affinitätsmatrix eingesetzt werden soll, die durch ein „Cleaning in Place"-Verfahren regeneriert werden soll. Hier kommen im allgemeinen verdünnte Laugen zum Einsatz. Für Anwendungen im medizinischen Bereich, wie z.B. extrakorporale Adsorber zur Blutwäsche, ist Sterilität eine unverzichtbare Bedingung. Daher ist hier eine Sterilisation, evtl. auch zur Wiederverwendung nötig. Die gängigste Methode ist die Autoklavierung. Gleichermaßen gelten die oben für RNA und Spiegelmere dargestellten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens auch für DNA. Des weiteren sind die Reaktionsabfolgen – auch ohne das Anhängen und Entfernen der Adaptermoleküle, insbesondere der jeweils ersten Nukleinsäurestränge davon, wobei die ersten Nukleinsäurestränge als Primerbindungsstellen in der reversen Transkription, in der Zweitstrangsynthese, insbesondere in der PCR, und als Promotor für die RNA-Polymerase dienen und daher auch als Amplifikationssequenzen bezeichnet werden – gegenüber den Technologien des Standes der Technik von Vorteil, da am Ende keine Gelreinigung zur Strangtrennung nötig ist.Single-stranded DNA oligonucleotides can - in analogy to single-stranded RNAs - recognize target structures and bind to them (Bock et al., Selection of single stranded DNA molecules that bind and inhibit thrombin, Nature (1992), 355: 564-6; Green et al., Inhibitory DNA ligands to platelet derived growth factor B-chain, Biochemistry (1196), 35: 14413-24; Leva et al., GnRH binding RNA and DNA Spiegelmers: a novel approach towards GnRH antagonism, Chem Biol (2002), 9: 351-9). They are called therefore also as DNA aptamers. DNA aptamers have, in contrast to such aptamers, which contain ribonucleotides, the advantage that they are alkali-stable and autoclavable. This is great Advantage, if the aptamer, for example, in chromatography columns than affinity matrix is to be used, which regenerates by a "cleaning in place" method shall be. Dilute alkalis are generally used here. For applications in the medical field, e.g. extracorporeal adsorber for blood washing, is sterility an indispensable condition. Therefore, here is a sterilization, possibly also necessary for reuse. The most common method is autoclaving. equally apply the above for RNA and Spiegelmere illustrated advantages of the method according to the invention also for DNA. Furthermore, the reaction sequences - even without attaching and Removing the adapter molecules, in particular the respective first nucleic acid strands thereof, wherein the first Nucleic acid strands as Primer binding sites in reverse transcription, in the second-strand synthesis, especially in the PCR, and serve as a promoter for the RNA polymerase and therefore also be referred to as amplification sequences - compared to the State-of-the-art technologies are advantageous, as there are none at the end Gel purification is necessary for strand separation.

Infolge der oben beschriebenen Eigenschaften, stellt das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren eine Optimierung des SELEX-Verfahrens dar. Durch die hierin offenbarte Reaktionsführung umfassend die Herstellung von Zielmolekül-bindendenden Nukleinsäuren mit und ohne Amplifikationssequenzen während des Selektionsschritts zur Identifizierung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren, deren Amplifikationssequenzen keinen Einfluß auf die Bindung an das Zielmolekül haben, und bei Verwendung der Ligation die mangelnden Aufreiningungsschritte, sind die erfindungsgemä- ßen Verfahren zudem automatisierbar durchführbar. Unter automatisierter Durchführung wird hierbei verstanden, dass das Verfahren unter Anwendung eines Automaten, beispielsweise eines Roboters durchgeführt wird. Dabei kann vorgesehen sein, dass ein oder mehrere der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens von einem Automaten oder einem Robotor durchgeführt werden. Die einzelnen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind so ausgestaltet, dass sie problemlos von einem Laborrobotor durchgeführt werden können.Owing to the above-described properties, the method according to the invention for the production of target-molecule binding nucleic acids is an optimization of the SELEX method. By the reaction method disclosed herein, the production of target-binding nucleic acids with and without amplification sequences during the selection step for the identification of target molecule. binding Nucleic acids whose amplification sequences have no influence on the binding to the target molecule, and the lack of Aufreiningungsschritte when using the ligation, the inventive method can also be carried out automatable. In this case, automated implementation is understood to mean that the method is carried out using a machine, for example a robot. It can be provided that one or more of the steps of the method according to the invention are performed by a machine or a robot. The individual steps of the method according to the invention are designed so that they can be easily performed by a laboratory robot.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Zielmolekül-bindende Nukleinsäure bevorzugterweise eine einzelsträngige Ribonukleinsäure, eine teilweise einzelsträngige oder vollständig modifizierte einzelsträngige Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure ist. Eine modifizierte Nukleinsäure ist dabei eine solche, die beispielsweise an der 2'-Position des Ribose- bzw. Desoxyriboseanteils des Nukleotids ein Fluor-Atom oder eine Amino-Gruppe aufweist. Eine weitere Form der Modifikation sind Modifikationen der Basenanteile der Nukleotide, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, wie z.B. beschrieben bei Kusser (W. Kusser (2000); Reviews in Molecular Biotechnology, 74, 27–38) Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass alle Kombinationen der vorstehenden Nukleinsäuren als Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren im Rahmen des SELEX-Verfahrens oder des Verfahrens zur Herstellung von L-Nukleinsäuren, die an ein Zielmolekül binden, wie beispielsweise beschrieben in der internationalen Patentanmeldung WO 98/08856, verwendet werden können.It is within the scope of the present invention that the target molecule binding nucleic acid preferably a single-stranded one ribonucleic acid, a partially single-stranded one or completely modified single-stranded ribonucleic acid or a deoxyribonucleic acid is. A modified nucleic acid is one which, for example, at the 2'-position of the ribose or Deoxyriboseanteils of the nucleotide, a fluorine atom or a Having amino group. Another form of modification are modifications of the base portions the nucleotides known to those skilled in the art such as. described by Kusser (W.Kusser (2000); Reviews in Molecular Biotechnology, 74, 27-38) It is within the scope of the present invention that all combinations the above nucleic acids as a target-binding nucleic acids in the context of the SELEX process or the manufacturing process of L-nucleic acids, to a target molecule bind, as described for example in the international patent application WO 98/08856 can be used.

In Abhängigkeit von der zu amplifizierenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation eine unterschiedliche Anzahl und Abfolge von Schritten umfassen. Die Möglichkeit, dass einer oder mehrere der Schritte nicht notwendigerweise ausgeführt werden müssen, um die erfindungsgemäßen Verfahren erfolgreich durchführen zu können, wurde hierin in der Beschreibung der Verfahrens mit der Bezeichnung „optional" aufgezeigt. Es ist im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet, im Lichte der vorliegenden Erfindung in Abhängigkeit von der Art der zu amplifizierenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure die konkrete Abfolge an Schritten zu bestimmen und durchzuführen.In dependence from the target molecule-binding nucleic acids to be amplified the inventive method for amplification, a different number and sequence of steps include. The possibility, that one or more of the steps are not necessarily performed have to, to the inventive method successfully perform to be able to has been demonstrated herein in the description of the method entitled "optional." It is within the knowledge of professionals in the field, in the light of the present invention depending on the type of amplifying target-binding nucleic acid to determine and execute the concrete sequence of steps.

Die Abfolge der einzelnen Reaktionsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bei der Verwendung von RNA-Bibliotheken in 2, bei der Verwendung von DNA-Bibliotheken in 8 sowie von FNA in 18 gezeigt. Bis auf die Kinasierung (5'Phosphorylierung), die nur bei der Verwendung von DNA nötig sein kann, kommen bevorzugterweise alle Reaktionsschritte bei beiden Varianten vor, allerdings unterscheidet sie sich, wie in den 2, 8 und 18 gezeigt, in ihrer Reihenfolge.The sequence of the individual reaction steps of the method according to the invention is in the use of RNA libraries in 2 when using DNA libraries in 8th as well as FNA in 18 shown. Except for the kinase (5'Phosphorylierung), which may be necessary only when using DNA, preferably all the reaction steps in both variants, but it differs, as in the 2 . 8th and 18 shown in their order.

Die hierin offenbarten Adaptermoleküle können einzeln oder in beliebiger Kombination Ge- genstand eines Kits für die Amplifikation von Nukleinsäuren sein. Derartige Kits können zusätzlich oder alternative eine oder mehrere der folgenden Komponenten des weiteren enthalten: Adaptermoleküle mit einer oder mehreren verschiedenen ersten definierten Teilsequenzen sowie einer oder mehreren verschiedenen zweiten definierten Teilsequenzen, Ligase, reverse Transkriptase, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, R&DNA-Polymerase, Restriktionsenzym, Maßlösungen für Lauge und Säure sowie Pufferlösung.The herein disclosed adapter molecules can individually or in any desired combination of a kit for the amplification of nucleic acids be. Such kits can additionally or alternatively one or more of the following components of the further included: Adapter molecules with one or more different first defined subsequences and one or more different second defined subsequences, Ligase, reverse transcriptase, DNA polymerase, RNA polymerase, R & DNA polymerase, Restriction enzyme, custom solutions for lye and acid as well as buffer solution.

Die Ligation zwischen der zu amplifizierenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure und den Adaptermolekülen, wie sie hierin bei den erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugterweise verwendet werden, die erforderlich ist für die reverse Transkription, die optionale Zweitstrangsynthese, die optionale Polymerasekettenreaktion und die Transkription, wobei die Reihenfolge der aufgeführten Reaktionen für RNA und DNA unterschiedlich ist, mit dem Ziel der Amplifizierung der interessierenden Nukleinsäure, ist in einem zyklischen Prozess wie der SELEX-Technologie von zentraler Bedeutung.The Ligation between the target molecule-binding to be amplified nucleic acid and the adapter molecules, as herein preferred in the methods of the invention which is required for reverse transcription, the optional second-strand synthesis, the optional polymerase chain reaction and the transcription, with the order of the reactions listed for RNA and DNA is different, with the aim of amplifying the nucleic acid of interest, is more central in a cyclic process such as SELEX technology Importance.

Bei der SELEX-Technologie werden geringe Nukleinsäuremengen (fmol bis maximal zweistellig pmol), die von der Selektionsmatrix eluiert wurden, einer enzymatischen Reaktion unterworfen, deren Erfolg über ihre Vervielfältigung in der PCR und der in vitro-Transkription entscheidet. Aus Gründen der Ausbeute ist eine sog. sticky-end Ligation, d.h. eine Ligation zweier doppelsträngiger Moleküle, deren Enden sich zumindest teilweise überlappen, bevorzugt. Eine sticky-end Ligation ist auch insoweit von Vorteil, als dass diese im Gegensatz zu einer blunt-end Ligation bei 25°C und nicht bei 4°C abläuft. Bei einer so geringen Temperatur gestaltet es sich schwierig, an strukturierte Moleküle die nötigen Primersequenzen anzuligieren. Die sticky-end Ligation erfordert zur Ligation einzelsträngiger Nukleinsäuren eine Oligonukleotidmatrix, die im vorliegenden Falle mit den erfindungsgemäßen Adaptern, die bereitgestellt wird. Zwischen der zu amplifizierenden verkürzten Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure, die sowohl aus einer Zwischensequenz, die im Falle der Durchführung eines SELEX-Verfahren als randomisierter Bereich bezeichnet wird, als auch aus fixierten Teilsequenzen am 5'-Ende und 3'-Ende besteht, die hierin auch als definierte Teilsequenzen bezeichnet wird, und den entsprechenden Adapter-Molekülen wird ein stabiler Komplex ausgebildet, so dass die DNA-Ligase – bei entsprechender 5'-Phosphorylierung der zu amplifizie renden Nukleinsäure und des ersten Stranges des zweiten und ggf. dritten Adaptermoleküls – die Adaptermoleküle mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure verknüpfen kann.In the SELEX technology, small amounts of nucleic acid (fmol to a maximum of two-digit pmol) eluted from the selection matrix are subjected to an enzymatic reaction, the success of which is determined by their amplification in the PCR and the in vitro transcription. For reasons of yield, a so-called sticky-end ligation, ie a ligation of two double-stranded molecules whose ends overlap at least partially, is preferred. Sticky-end ligation is also advantageous in that, unlike blunt-end ligation, it proceeds at 25 ° C and not at 4 ° C. At such a low temperature, it is difficult to label the necessary primer sequences on structured molecules. The sticky-end ligation requires an oligonucleotide matrix for ligation of single-stranded nucleic acids, which in the present case is provided with the adapters according to the invention. Between the truncated target-molecule-binding nucleic acid to be amplified which consists of both a cut-off sequence, which is referred to as a randomized region in the case of carrying out a SELEX method, as well as of fixed partial sequences at the 5'-end and 3'-end, which are herein Also referred to as defined subsequences, and the corresponding Adapter molecules is formed a stable complex, so that the DNA ligase - with appropriate 5'-phosphorylation of the nucleic acid to be amplified and the first strand of the second and possibly third adapter molecule - can link the adapter molecules with the nucleic acid to be amplified.

Die Auswahl der konkret zu verwendenden Ligasen ist dabei im Rahmen des Könnens des Durchschnittsfachmannes. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Experimente durchgeführt zur Bestimmung geeigneter Ligasen. Eine besonders bevorzugte Ligase ist die T4-DNA-Ligase, ganz besonders bevorzugt eine hochkonzentrierte T4-DNA-Ligase, wie hierin in den Beispielen offenbart ist.The Selection of the specific ligases to be used is within the scope of ability the average expert. In the context of the present invention experiments were carried out for the determination of suitable ligases. A particularly preferred ligase is T4 DNA ligase, most preferably a highly concentrated one T4 DNA ligase as disclosed herein in the examples.

Die definierten Teilsequenzen der zu amplifizierenden Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure befinden sich am 5'-Ende und am 3'-Ende der Zwischensequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das 5'-Ende neun und das 3'-Ende sieben definierte Nukleotide als definierte Teilsequenz auf, die abhängig voneinander ausgewählt werden. Die definierten Teilsequenzen sind derart ausgestaltet, dass die sieben am 3'Ende liegenden mit den sieben Nukleotiden, die direkt 5' von der Zwischensequenz, die bevorzugterweise eine randomisierte Sequenz ist, liegen, hybrisieren, so dass die zwei 5'-terminalen Nukleotide der definierten Teilsequenz am 5'-Ende ungepaart vorliegen. Durch die Hybridisierung der jeweils sieben komplemtären Nukleotide des 5'- und des 3'-Endes der definierten Teilsequenz – die zwei 5'-terminalen Nukleotide ausgenommen – bildet sich eine stabile Helix aus, an die sich der randomisierte Bereich anschließt. Im Falle der Zielmolekülbindenden Nukleinsäure mit Amplifikationssequenzen bildet sich diese Helix gleichermaßen aus so, dass die Struktur der an der Bindung beteiligten Region identisch zu der Zielmolekülbindenden Nukleinsäure ohne Amplifikationssequenzen ist, wie dies auch beispielhaft in 1 dargestellt ist.The defined partial sequences of the target molecule-binding nucleic acid to be amplified are located at the 5 'end and at the 3' end of the intermediate sequence of the nucleic acids to be amplified. In a preferred embodiment, the 5 'end has nine and the 3' end seven defined nucleotides as a defined partial sequence, which are selected depending on each other. The defined partial sequences are designed such that the seven lying at the 3 'end with the seven nucleotides lying directly 5' of the intermediate sequence, which is preferably a randomized sequence, hybrisieren so that the two 5'-terminal nucleotides of the defined Partial sequence at the 5'-end unpaired. The hybridization of each of the seven complementary nucleotides of the 5'- and 3'-end of the defined subsequence - excluding the two 5'-terminal nucleotides - forms a stable helix, followed by the randomized region. In the case of the target molecule-binding nucleic acid with amplification sequences, this helix likewise forms such that the structure of the region involved in the binding is identical to the target molecule-binding nucleic acid without amplification sequences, as also exemplified in US Pat 1 is shown.

Ohne darauf festgelegt werden zu wollen, scheint es so zu sein, dass die minimale Länge des der Ligation zur Verfügung stehenden Teils der fixierten Teilsequenz am 5'-Ende zwei Nukleotide beträgt, besonders dann, wenn es sich bei der zu amplifizierenden Nukleinsäure um eine DNA handelt. In dem Falle, dass es sich bei der zu amplifizierenden Nukleinsäure um eine Ribonukleinsäure handelt, wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Länge des der Ligation zur Verfügung stehenden Teils der fixierten Teilsequenz am 5'-Ende bevorzugterweise 4 Nukleotide lang sein soll. Diese Erkenntnis ist in Übereinstimmung mit der gewählten Transkriptions-Initiationssequenz, die für gleichmäßig hohe Transkriptionsausbeu ten für alle Moleküle sorgt. Würde sich an den T7 RNA-Polymerase Promotor, der zumindest teilweise in den Adaptermolekülen enthalten ist und für die Transkription der zu amplifizierenden Nukleinsäure verwendet wird, direkt der randomisierte Bereich anschließen, hätten Moleküle, die auf GG-Purin beginnen, in der Transkription einen Amplifikationsvorteil (Milligan, J. F. and O. C. Uhlenbeck (1989). Methods Enzymol 180: 51–62.), was nicht im Sinne einer in vitro-Selektion ist. Die optimale Länge des der Ligation zur Verfügung stehenden Teils der fixierten Teilsequenz am 5'-Ende beträgt – hervorgerufen durch die induzierte helicale Struktur der Zielmolekül-bindenden Nukleinsäure in diesem Bereich – vier bis 6 Nukleotide.Without To be determined, it seems that the minimum length of the ligation available standing part of the fixed partial sequence at the 5 'end is two nucleotides, especially then if the nucleic acid to be amplified is a DNA acts. In the case that it is in the to be amplified nucleic acid to a ribonucleic acid acted, was surprisingly found that the length of the ligation available standing part of the fixed partial sequence at the 5 'end, preferably 4 nucleotides should be long. This finding is consistent with the transcriptional initiation sequence chosen, the for evenly high Transcription effusions for all molecules provides. Would be to the T7 RNA polymerase promoter, at least partially in the adapter molecules is included and for used the transcription of the nucleic acid to be amplified will directly join the randomized area, molecules that start on GG-purine would have an amplification advantage in transcription (Milligan, J.F. and O.C. Uhlenbeck (1989). Methods Enzymol 180: 51-62.), Which not in the sense of an in vitro selection. The optimal length of the the ligation available standing portion of the fixed partial sequence at the 5'-end - caused by the induced helical structure of the target molecule binding Nucleic acid in this area - four to 6 nucleotides.

Hinsichtlich des 3'-Endes wurde überraschend festgestellt, dass für die 3'-Ligation, bevorzugterweise 4–6 und bevorzugtererweise sechs Nukleotide waren.Regarding the 3'-end was surprising found that for the 3'-ligation, preferably 4-6 and more preferably six nucleotides.

Sequenzen, die als erste fixierte Teilsequenz und/oder als zweite fixierte Teilsequenz im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind im Beispielteil offenbart. Diese Sequenzen können im Rahmen der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung als solches verwendet werden.sequences the first fixed partial sequence and / or the second fixed one Partial sequence can be used in the context of the present invention can, are disclosed in the examples section. These sequences may be in the frame the various aspects of the present invention as such be used.

Bevorzugterweise werden aus Gründen der Stabilität DNA-basierte Adaptermoleküle verwendet. Im Rahmen einer RNA-Amplifikation ist der erste Strang des ersten Adaptermoleküls bevorzugterweise ein Ribo-Oligonukleotid, da dies sich mit höherer Effizienz an das 5'-Ende der RNA-Bibliothek ligieren läßt und für die reverse Transkriptase ein geeignetes Substrat darstellt.preferably, be for reasons stability DNA-based adapter molecules used. As part of an RNA amplification is the first strand of the first adapter molecule Preferably, a ribo-oligonucleotide, as this with higher efficiency to the 5'-end of the Ligate RNA library and reverse Transcriptase represents a suitable substrate.

Im folgenden werden die „Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren ohne Amplifikationsesequenzen" auch als „kurze Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren" bezeichnet.in the following are the "target molecule binding nucleic acids without amplification sequences "also as "short Target molecule-binding Nucleic acids ".

Gleichermaßen wird für „Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren mit Amplifikationssequenzen" der Begriff „lange Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren" verwendet. Des weiteren wird der obigen Nomenklatur folgend die Formulierung „lange-Bibliotheken" bzw. „kurze Bibliotheken" benutzt. Des weiteren wird vollständig modifizierte RNA, insbesondere vollständig 2'-F-modifizierte Nukleinsäure als „FNA" bezeichnet.Equally will for "target-binding nucleic acids with amplification sequences "the Term "long Target molecule-binding Nucleic acids. "Further Following the above nomenclature, the phrase "long libraries" or "short libraries" is used Libraries "used. Furthermore, it is completely modified RNA, in particular completely 2'-F-modified nucleic acid referred to as "FNA".

Selektion von Zielmolekül-bindenden RNA-Nukleinsäurenselection of target-binding RNA nucleic acids

Eine überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Reaktionsabfolge sowohl zur Identifizierung von kurzen Zielmolekül-bindenden RNA-Nukleinsäuren als auch der langen Zielmolekül-bindenden RNA-Nukleinsäure geeignet ist, wobei die durch die definierten Teilsequenzen vorgegebene Struktur es ermöglichen soll, die langen Zielmolekül-bindenden RNA-Nukleinsäuren – unter Erhaltung ihrer Bindungseigenschaften – um die Amplifikationssequenzen zu reduzieren.A surprising Effect of the method according to the invention is that the reaction sequence both for identification of short target-binding RNA nucleic acids as also the long target-binding RNA nucleic acid is suitable, wherein the predetermined by the defined subsequences Structure enable it intended to bind the long target molecule RNA Nucleic Acids - Under Maintaining their binding properties - around the amplification sequences to reduce.

Weiterhin hat der vorliegende Erfinder überraschenderweise festgestellt, dass es möglich ist, während der Durchführung des Verfahrens zur Identifizierung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren sowohl – mindestens einmalig – mit kurzen RNA- Bibliotheken als auch mit langen RNA-Bibliotheken zu arbeiten und somit am Ende des Verfahrens kurze Zielmolekülbindende Nukleinsäuren zu generieren, die ohne das Vorhandensein der Amplifikationssequenzen das Zielmolekül mit gleicher Güte erkennenFarther the present inventor has surprisingly found that it is possible is while the execution of the method for the identification of target-binding nucleic acids both - at least once - with short RNA libraries as well as with long RNA libraries work and thus at the end of the procedure short Zielmolekülbindende nucleic acids generate without the presence of the amplification sequences the target molecule with equal quality detect

Desweiteren hat der vorliegende Erfinder erkannt, dass bei Verwendung der kurzen RNA-Bibliothek das Verfahren ohne Aufreinigungsschritte durchgeführt werden kann und erst die Transkriptionsprodukte, vor deren weiterer Verwendung in einer nächsten Selektions-Runde im Rahmen des SELEX-Verfahrens, einer Aufreinigung unterzogen werden. Bevorzugterweise erfolgt diese Aufreinigung durch Gelreinigung.Furthermore the present inventor has realized that when using the short RNA library that Procedure without purification steps can be performed and only the Transcription products, before further use in a next round of selection undergo purification as part of the SELEX process. Preferably, this purification is carried out by gel purification.

Der grundsätzliche Ablauf der Amplifikationsreaktion bei Verwendung von kurzen RNA-Bibliotheken, bestehend aus 5'-Ligation von Adaptermolekülen, 3'-Ligation von Adaptermolekülen, reverser Transkription, optionaler Zweitstrangsynthese, optionaler PCR, Verkürzung des Transkriptionsausgangsproduktes durch alkalische Hydrolyse und Transkription, ist in 2 auf der linken Seite in der Einbindung in eine Selektionsrunde des SELEX-Verfahrens dargestellt. Der grundsätzliche Ablauf der Amplifikationsreaktion bei Verwendung von RNA-Bibliotheken mit Amplifikationssequenzen, bestehend aus, reverse Transkription, optionale Zweitstrangsynthese, optionale PCR und Transkription, ist in 2 auf der rechten Seite dargestellt. Die reverse Transkription, die optionale Zweitsstrangsysnthese und die optionale PCR werden sowohl mit der langen RNA-Bibliothek als auch mit der nach der Ligation die Amplifikationssequenzen tragende kurze RNA-Bibliothek unter Verwendung der gleichen Primer durchgeführt so, dass das Transkriptionsausgangsprodukt nach diesen Schritten der Reaktionsabfolge identisch ist. Die Verkürzung des Transkriptionsausgangsproduktes und die Verwendung der geeigneten RNA-Polymerase in der folgenden Transkriptionsreaktion ermöglicht die Herstellung einer kurzen RNA-Bibliothek, wie beispielhaft in 2 dargestellt.The basic sequence of the amplification reaction using short RNA libraries, consisting of 5'-ligation of adapter molecules, 3'-ligation of adapter molecules, reverse transcription, optional second-strand synthesis, optional PCR, shortening of the transcription starting product by alkaline hydrolysis and transcription, is described in 2 on the left side in the integration into a selection round of the SELEX process. The basic sequence of the amplification reaction using RNA libraries with amplification sequences consisting of, reverse transcription, optional second-strand synthesis, optional PCR and transcription is described in 2 shown on the right. Reverse transcription, optional second strand synthesis, and optional PCR are performed using both the long RNA library and the short RNA library carrying the amplification sequences following the ligation using the same primers such that the transcriptional starting product after these steps is identical to the reaction sequence is. The shortening of the transcriptional starting product and the use of the appropriate RNA polymerase in the following transcription reaction allows for the production of a short RNA library, as exemplified in US Pat 2 shown.

Wie aus 3 beispielhaft ersichtlich, sind für die Ligation der Amplifikationssequenzen an die verkürzte RNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen sind die Adaptermoleküle von entscheidender Bedeutung.How out 3 By way of example, the adapter molecules are of crucial importance for the ligation of the amplification sequences to the truncated RNA library without amplification sequences.

Bei der Ausgestaltung des ersten Adaptermoleküls das hierin auch als Forward Adapter be- zeichnet wird, ist es grundsätzlich möglich, dass der erste Nukleinsäurestrang, der hierin auch als Forward Ligat bezeichnet wird, eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure ist. Die Verwendung einer Ribonukleinsäure ist insbesondere dann von Vorteil, wenn das zu amplifizierende Molekül eine modifizierte oder unmodifizierte RNA ist und eine Zweitstrangsynthese vorgesehen ist. Grundsätzlich ist es auch möglich und damit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die Transkriptionsreaktion ohne vorher ablaufende Zweitstrangsynthese durchzuführen. In diesem Falle muss nur der Promotorbereich für die jeweils zu verwendenden RNA-Polymerase doppelsträngig sein. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass man sich einen Schritt spart. Es wird in dieser Ausführungsform lediglich das Forward Ligat oder der Forward Primer, d.h. der erste Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls, oder der am 3'-Ende noch die am 5'-Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure vorhandene erste definierte Teilsequenz erweiterte Nukleinsäurestrang, bzw. eine dazu komplementäre Sequenz umfasst, an die cDNA hybridisiert. Falls Forward Ligat, d.h. der erste Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls aus DNA besteht, kann auch dieser Schritt entfallen. Der zweite Strang des ersten Adaptermoleküls (Forward Matrix) besteht bevorzugterweise aus DNA.at the embodiment of the first adapter molecule herein also as Forward Adapter, it is in principle possible that the first nucleic acid strand, which is also referred to herein as forward ligate, a ribonucleic acid or a deoxyribonucleic acid is. The use of a ribonucleic acid is in particular of Advantage if the molecule to be amplified is a modified or unmodified RNA is and a second-strand synthesis is provided. Basically it also possible and thus in the context of the present invention, the transcription reaction without previously performing second strand synthesis. In In this case, only the promoter area needs to be used for each RNA polymerase double-stranded be. The advantage of this embodiment is that you save a step. It will be in this embodiment only the forward ligate or the forward primer, i. the first nucleic acid strand the first adapter molecule, or at the 3'-end still the 5'-end the nucleic acid to be amplified existing first defined subsequence extended nucleic acid strand, or a complementary thereto Sequence hybridized to the cDNA. If Forward Ligat, i.e. the first nucleic acid strand of the first adapter molecule DNA, this step can be omitted. The second Strand of the first adapter molecule (Forward Matrix) is preferably made of DNA.

Der erste Strang, der hierin auch als Reverse Ligat bezeichnet wird, des zweiten Adaptermoleküls, das hierin auch als Reverse Adapter 1 bezeichnet wird, besteht bevorzugterweise aus DNA-Molekülen, der zweite Strang der hierin auch als Reverse Matrix bezeichnet wird, besteht dagegen mindestens an den Positionen, die zur zweiten fixierten (definierten) Teilse- quenz komplementär sind, wobei es ausreichend ist, wenn der Überhang aus DNA ist und der sich 5' ausschließende Bereich alkalisch hydrolisiert werden kann. Im zweiten Strang des zweiten Adaptermoleküls ist eine Spaltstelle vorhanden, die so ausgestaltet ist, dass nach Spaltung mindestens ein erstes und ein zweites Spaltprodukt entsteht, wobei das erste Spaltprodukt ein solches ist, das mit der zweiten definierten Teilsequenz basenpaart bzw. zu dieser komplementär ist. Dadurch wird gewährleistet, dass das Transkriptionsprodukt genau die gleiche Länge aufweist wie die zu kurze Zielmolekül-bindendene Nukleinsäure, sieht man von denjenigen Transkripten ab, die eine am 3'-Ende um ein Nukleotid verlängerter Sequenz infolge der Eigenschaft der meisten RNA-Polymerasen, am Ende des Transkriptes noch unspezifisch ein Nukleotid anzufügen, aufweisen. Eine Möglichkeit, eine entsprechend spezifische Spaltung herbeizuführen besteht darin, dasjenige Nukleotid als Ribonukleotid auszubilden, das sich im zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls unmittelbar 5' an den Bereich des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls anschließt, der mit der zweiten definierten Teilsequenz der kurzen Zielmolekül-bindendenen Nukleinsäure basenpaart bzw. komplementär ist.The first strand, also referred to herein as reverse ligate, of the second adapter molecule, also referred to herein as reverse adapter 1, is preferably made of DNA molecules, the second strand, also referred to herein as the reverse matrix, is at least present the positions which are complementary to the second fixed (defined) subsequence, it being sufficient if the overhang is of DNA and the 5 'exclusive region can be hydrolyzed alkaline. In the second strand of the second adapter molecule, a cleavage site is present which is designed so that after cleavage at least a first and a second cleavage product is formed, wherein the first cleavage product is one which is base paired or complementary to the second defined subsequence. This will be guaranteed If the transcription product is exactly the same length as the too short target molecule-binding nucleic acid, one avoids those transcripts which have a nucleotide extended sequence at the 3 'end due to the property of most RNA polymerases at the end of the Transkriptes still unspecifically attach a nucleotide. One way to bring about a correspondingly specific cleavage is to form that nucleotide as a ribonucleotide which immediately adjoins the second nucleic acid strand of the second adapter molecule in the second nucleic acid strand of the second adapter molecule, which binds to the second defined partial sequence of the short target molecule Nucleic acid is base paired or complementary.

Alternativ kann die Spaltung unter Verwendung von Restriktionenzymen erfolgen. Dabei wird die Restriktionsenzymerkennungsstelle und/oder die Schnittstelle so angeordnet, dass der zweite Nukleinsäurestrang an der oben beschriebenen Stelle gespalten wird.alternative the cleavage can be done using restriction enzymes. In this case, the restriction enzyme recognition site and / or the interface arranged so that the second nucleic acid strand on the above described Part is split.

Im Folgenden werden die Teilschritte der erfindungsgemäßen Verfahren weiter erläutert, wobei aus Gründen der Vereinfachung direkt Bezug genommen wird auf die hierin beigefügten Zeichnungen. Dabei entspricht ds Forward Adapter dem ersten Adaptermolekül, Forward Ligat dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls, Forward Matrix dem zweiten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls, ds Reverse Adapter 1 dem zweiten Adaptermolekül, Reverse Ligat dem ersten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls, Rev Primer Ribo U, hierin gelegentlich auch wegen seiner Funktion in der Ligation als Reverse Matrix bezeichnet, dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls und ds Reverse Adapter 2 dem dritten Adaptermolekül, n + 1 Reverse Ligat dem ersten Nukleinsäurestrang des dritten Adaptermoleküls und n + 1 Rev Mat. Ribo I dem zweiten Nukleinsäurestrang des dritten Adaptermoleküls.in the The following are the partial steps of the method according to the invention explained further, being for reasons For simplicity, reference is made to the drawings attached hereto. Ds Forward Adapter corresponds to the first adapter molecule, Forward Ligate the first strand of nucleic acid the first adapter molecule, Forward matrix the second nucleic acid strand of the first adapter molecule, reverse Adapter 1 to the second adapter molecule, reverse ligate to the first nucleic acid strand the second adapter molecule, Rev Primer Ribo U, here occasionally also because of its function in the ligation referred to as reverse matrix, the second strand of nucleic acid of the second adapter molecule and ds reverse adapter 2 to the third adapter molecule, n + 1 Reverse ligate the first nucleic acid strand of the third adapter molecule and n + 1 Rev Mat. Ribo I the second nucleic acid strand of the third adapter molecule.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die 3'-Enden der Adaptermoleküle bevorzugterweise blockiert. Durch diese Blockierung der 3'-Enden der Adaptermoleküle, die nicht später in der Reversen Transkriptionsreaktion oder Polymerase Kettenreaktion als Primer genutzt werden sollen, werden unerwünschte PCR- Artefakte unterdrückt. Somit können arbeits- und zeitintensive Reinigungsschritte gespart werden. Des weiteren wird der Concatemerbildung in der Ligation entgegengewirkt.in the Within the scope of the present invention, the 3 'ends of the adapter molecules are preferably blocked. By blocking the 3 'ends of the adapter molecules, the not later in the reverse transcription reaction or polymerase chain reaction are to be used as primers, unwanted PCR artifacts are suppressed. Consequently can labor-intensive and time-consuming Cleaning steps are saved. Furthermore, the Concatemerbildung counteracted in the ligation.

Die grundsätzliche Konzeption geeigneter Adaptermoleküle im Sinne der Bestimmung der jeweiligen Nukleinsäuresequenzen kann durch bioinformatische Methoden, beispielsweise unter Verwendung des Programmes Oligos 8.2 (Ruslan Kalendar, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki, Finnland) ermittelt werden. Bevorzugte Adapter sind allerdings durch die hierin offenbarten Verfahren und Untersuchungen ermittelt worden.The fundamental Conception of suitable adapter molecules within the meaning of the determination the respective nucleic acid sequences can by bioinformatic methods, for example, using of the Oligos 8.2 program (Ruslan Kalendar, Institute of Biotechnology, university Helsinki, Finland). However, preferred adapters are by the methods and investigations disclosed herein.

Die Sequenz des Forward Ligates und somit auch des Forward-Primers wird durch den T3- und den T7-RNA-Polymerase-Promotor, die hintereinander angeordnet sind, dominiert.The Sequence of the forward ligate and thus the forward primer is through the T3 and the T7 RNA polymerase promoter arranged in tandem, dominated.

Die Reverse Matrix, die in ihrer Sequenz dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls entspricht und identisch ist zum Reverse Primer, dient neben der Stabilisierung der zu ligierenden Komplexe auch als Primer für die anschließende reverse Transkription im gleichen Reaktionsgefäß. Zur späteren Abspaltung der 3'-Primer-Region des Reverse-Stranges vor der in vitro-Transkription wird zur Herstellung einer kurzen RNA-Bibliothek ein DNA-Reverse-Primer mit einem Ribonukleotid an der zu spaltenden Stelle eingesetzt. Durch eine alkalische Spaltung an dieser Stelle kann selektiv der Gegenstrang, welcher für die RNA-Polymerase als Templat dient, an der gewünschten Stelle gespalten werden. Dadurch entstehen 3' verkürzte RNA-Transkripte, wie dies in 7 auf der linken Seite dargestellt ist.The reverse matrix, which in its sequence corresponds to the second nucleic acid strand of the second adapter molecule and is identical to the reverse primer, serves in addition to the stabilization of the complexes to be ligated as a primer for the subsequent reverse transcription in the same reaction vessel. For later cleavage of the 3 'primer region of the reverse strand prior to in vitro transcription, a DNA reverse primer with a ribonucleotide at the site to be cleaved is used to make a short RNA library. By an alkaline cleavage at this point, the complementary strand, which serves as template for the RNA polymerase, can be selectively cleaved at the desired site. This results in 3 'truncated RNA transcripts, as shown in 7 is shown on the left side.

Um eine Hybridisierung des abgespaltenen Teils des Reverse Primers an den Forward Strang und damit ein eventuelles Überlesen der Spaltstelle durch die T3- bzw. T7-RNA-Polymerase zu verhindern, wird in einer bevorzugten Ausführungsform noch ein zweites Ribonukleotid in den Primer eingebaut, das dann zu einer weiteren Fragmentierung desselben führt. Die entstandenen Bruchstücke sollten bei 37°C, d.h. Transkriptionsbedingungen nicht mehr am Forward-Strang hybridisiert sein.Around a hybridization of the cleaved portion of the reverse primer to the forward strand and thus a possible over-reading of the cleavage site To prevent the T3 or T7 RNA polymerase is in a preferred embodiment a second ribonucleotide is incorporated into the primer, which is then leads to a further fragmentation of the same. The resulting fragments should at 37 ° C, i.e. Transcriptional conditions no longer hybridized to the forward strand be.

Durch die in vitro-Transkription entstehen neben den RNA-Molekülen, die dem Templat-Strang oder Matrizen-Strang komplementär sind, zu 50% auch um ein beliebiges Nukleotid verlängerte Transkripte, die sogenannten N + 1-Transkripte. N + 2-Transkripte wurden von den vorliegenden Erfindern nicht beobachtet (Kao et al. A simple and efficient method to transcribe RNAs with reduced 3' heterogeneity, Methods (2001) Mar; 23(3): 201–5; Kao et al., A simple and efficient method to reduce nontemplated nucleotide addition at the 3 terminus of RNAs transcribed by T7 RNA polymerase, RNA, (1999) Sep; 5(9): 1268–72). Selbst wenn sie auftreten würden, könnten sie unter Anwendung der hierin im Zusanunenhang mit den N + 1-Transkripten beschriebenen Mittel, Strategien und insbesondere Adaptermoleküle behandelt werden. Dieses Auftreten unterschiedlicher Transkripte, in der Literatur als 3'-Mikroheterogenitäten bezeichnet, erforderte eine Lösung, da die 3'-Ligation, die insbesondere für die hierin beschriebenen Kreisprozeß-Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich ist, nur bei perfekt komplementären Sequenzen vonstatten geht, wie beispielsweise dargestellt in 3.By in vitro transcription arise in addition to the RNA molecules that are complementary to the template strand or template strand, 50% also to any nucleotide-elongated transcripts, the so-called N + 1 transcripts. N + 2 transcripts were not observed by the present inventors (Kao et al., A simple and efficient method to transcribe RNAs with reduced 3 'heterogeneity, Methods (2001) Mar; 23 (3): 201-5; Kao et al. , A simple and efficient method for reducing nontemplated nucleotide addition at the 3 terminus of RNAs transcribed by T7 RNA polymerase, RNA, (1999) Sep; 5 (9): 1268-72). Even if they did occur, they could be described using the herein described in connection with the N + 1 transcripts described means, strategies and in particular adapter molecules are treated. This appearance of different transcripts, referred to in the literature as 3 'microheterogeneities, required a solution, since the 3' ligation required particularly for the herein described circular process embodiments of the methods of the invention occurs only in perfectly complementary sequences, such as for example, shown in 3 ,

Die Verwendung des universellen Nukleotides 2'-desoxy-Inosin stellt eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform dar, wie auch in 3 dargestellt, wo Inosin an Stelle von 2'-desoxy-Inosin dargestellt ist. Das ebenfalls getestete 5-Nitroindol zeigte nicht die gewünschten Ligationsausbeuten. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass 5-Nitroindol mehr durch die Förderung von Base-Stacking als universelle Base wirkt, während Inosin reguläre Wasser- stoffbrücken mit seinem Komplement ausbildet und somit das DNA-Rückgrad in einer natürlicheren Konformation belässt (Berger, Wu et al. 2000, 28(15): 2911–4; Loakes, D. (2001). Nucleic Acids Res 29(12): 2437–47). Mit einem Gemisch aus regulären ds Reverse-Adaptern und den 2'-desoxy-Inosin enthaltenen ds N + 1-Reverse-Adaptern konnten schließlich Ligationsausbeuten von 80 % erzielt werden, wie beispielsweise dargestellt in 16. Diese blieben auch erhalten, wenn 2'-desoxy Inosin gegen Ribo-Inosin ausgetauscht wird, um eine bessere Spaltungseffizienz nach der PCR zu gewährleisten.The use of the universal nucleotide 2'-deoxy-inosine represents a very particularly preferred embodiment, as well as in US Pat 3 where inosine is shown instead of 2'-deoxy-inosine. The 5-nitroindole also tested did not show the desired ligation yields. It is currently believed that 5-nitroindole acts more as a universal base by promoting base stacking, while inosine forms regular hydrogen bridges with its complement, leaving the DNA backbone in a more natural conformation (Berger, Wu et al 2000, 28 (15): 2911-4; Loakes, D. (2001) Nucleic Acids Res 29 (12): 2437-47). With a mixture of regular ds reverse adapters and the ds N + 1 reverse adapters containing 2'-deoxy-inosine, ligation yields of 80% could be achieved, as shown in 16 , These were also conserved when 2'-deoxy inosine was replaced with ribo-inosine to ensure better cleavage efficiency after PCR.

Das Problem der Mikroheterogenitäten ist somit zu berücksichtigen für den Fall, dass das Transkriptionsprodukt bzw. die amplifizierte Nukleinsäure wiederum oder in einem weiteren Amplifikationsschritt eingeführt bzw. verwendet werden soll.The Problem of microheterogeneities is therefore to be considered for the Case that the transcription product or the amplified nucleic acid turn or introduced in a further amplification step or should be used.

Wie in 4 beispielhaft dargestellt, kann die reverse Transkriptionsreaktion (RT) der in 3 ligierten kurzen RNA-Bibliothek unter Bedingungen durchgeführt werden, wie sie den Fachleuten bekannt und beispielsweise hierin in Beispiel 3 beschrieben ist.As in 4 exemplified, the reverse transcription reaction (RT) of the in 3 ligated short RNA library under conditions known to those skilled in the art and described for example in Example 3 herein.

Wie in 5 beispielhaft dargestellt, kann die reverse Transkriptionsreaktion (RT) der langen RNA-Bibliothek unter Bedingungen durchgeführt werden, wie sie den Fachleuten bekannt und beispielsweise hierin in Beispiel 3 beschrieben ist.As in 5 By way of example, the reverse transcription reaction (RT) of the long RNA library may be performed under conditions known to those skilled in the art and described, for example, in Example 3 herein.

Wie aus 6 beispielhaft ersichtlich, stellt die Polymerase Kettenreaktion (PCR) stellt eine Form der Zweitstrangsynthesereaktion dar und erfolgt im Anschluss an die reverse Transkription, erfindungsgemäß bevorzugterweise ohne vorherige Aufreinigung oder Aufkonzentrierung. Die PCR erfolgt für die lange und die kurze RNA-Bibliothek mit identischem Primern. Durch die Verwendung von 3'-geblockten Adaptermolekülen wurden PCR-Artefakte verhindert. Die PCR wurde in den meisten Fällen, wie in Beispiel 4 beschrieben, über 15 Zyklen gefahren. Als Polymerase wurde Taq DNA-Polymerase von Roche eingesetzt.How out 6 By way of example, the polymerase chain reaction (PCR) represents a form of the second-strand synthesis reaction and takes place following the reverse transcription, preferably without prior purification or concentration according to the invention. PCR is performed for the long and short RNA library with identical primers. The use of 3'-blocked adapter molecules prevented PCR artifacts. The PCR was run in most cases as described in Example 4 for 15 cycles. The polymerase used was Roche's Taq DNA polymerase.

Weitere Zweitstrangsynthesereaktionen sind die Auffüllreaktionen mit dem Klenow-Fragment oder dem Stoffel-Fragment, die den Fachleuten bekannt und beispielsweise be- schrieben sind in Sambrock, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Cold Spring Harbor.Further second strand synthesis reactions are the replenishment reactions with the Klenow fragment or the Stoffel fragment known to those skilled in the art and described, for example, in Sambrock, J., Fritsch, EF, Maniatis, T., Molecular Cloning, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Cold Spring Harbor.

Wenn am Ende der Amplifikationseaktion eine kurzen RNA-Bibliothek für die Selektion zur Verfügung gestellt werden soll, wird, wie in 7 beispielhaft dargestellt, im Anschluss an die PCR der größte Teil des Reverse Primers, der im Reverse Strang inkorporiert worden war, durch eine alkalische Spaltung der Phosphodiesterbindungen im Nukleinsäurerückgrat entfernt. Die Reaktion findet beispielsweise in 0,3 M NaOH innerhalb von 10 min bei 95°C statt. Die DNA wird aus der beispielsweise mit HCl neutralisierten und mit 0,1 M NaOAc gepufferten Lösung beispielsweise mit Ethanol gefällt. Die Spaltstelle befindet sich 3' von den im Reverse Primer eingebauten RiboUs bzw. RiboIs, wie dies in 7 dargestellt ist. Der verkürtze Reverse Strang, der als Templat für die folgende Transkriptionsreaktion dienend nun die komplementären Sequenzen zum Forward Primer, der die Promotorsequenzen der T7 und T3 Polymerase enthält, die beiden fixierten Teilsequenzen und den randomisierten Bereich umfasst. Die alkalische Spaltung hat im Gegensatz zu einem Restriktionsverdau den Vorteil, dass nicht im randomisierten Bereich an den zufällig passenden Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen geschnitten wird. Ein weiterer Vorteil gegenüber einem Verdau mit Restriktionsenzymen ist die Tatsache, dass Restriktionsenzyme in der Regel doppelsträngiges Substrat benötigen, in der PCR in späteren Zyklen aber verstärkt auch Einzelstränge auftreten.If a short RNA library is to be provided for selection at the end of the amplification reaction, as described in 7 exemplified, following PCR, most of the reverse primer incorporated in the reverse strand is removed by alkaline cleavage of the phosphodiester bonds in the nucleic acid backbone. The reaction takes place, for example, in 0.3 M NaOH within 10 min at 95 ° C. The DNA is precipitated from, for example, neutralized with HCl and buffered with 0.1 M NaOAc solution, for example, with ethanol. The cleavage site is 3 'of the RiboUs or riboIs incorporated in the reverse primer, as shown in FIG 7 is shown. The restricted reverse strand, which serves as a template for the following transcription reaction, now comprises the complementary sequences to the forward primer containing the T7 and T3 polymerase promoter sequences, the two fixed partial sequences and the randomized region. Alkaline cleavage, unlike restriction digestion, has the advantage that it does not cut in the randomized region on the randomly appropriate restriction enzyme recognition sequences. Another advantage over digestion with restriction enzymes is the fact that restriction enzymes usually require double-stranded substrate, but PCR also increasingly affects single strands in later cycles.

In der nachfolgenden in vitro-Transkription wird der in der PCR oder Zweitstrangsynthese erzeugte Reverse-Strang, im Falle der kurzen RNA-Bibliothek (ohne Amplifikationssequenzen) ein um die Reverse Primer Sequenz verkürzter Reverse-Strang, in RNA umgeschrieben. Die Reaktion läuft bevorzugterweise 2–16 h bei 37°C mit T7 oder T3 RNA-Polymerase, welche kommerziell, beispielsweise von Stratagene, erhältlich sind. Andere Quellen für derartige Enzyme sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Durch die vorgesehene Lage der T7 und T3 RNA-Polymerase-Promotoren in der 5'-Primerregion wird:

  • a) – bei Verwendung einer T7 Polymere – die Amplifikationssequenz am 5'-Ende der RNA-Bibliothek nicht,
  • b) oder – bei Verwendung der T3 Polymerse – nur der T7 Promoterbereich derselben transkribiert.
In the following in vitro transcription, the reverse strand generated in the PCR or second strand synthesis, in the case of the short RNA library (without amplification sequences), a reverse strand shortened by the reverse primer sequence, is transcribed into RNA. The reaction preferably proceeds for 2-16 hours at 37 ° C with T7 or T3 RNA polymerase, which are commercially available, for example, from Stratagene. Other sources of such enzymes are known to those skilled in the art. The proposed location of the T7 and T3 RNA polymerase promoters in the 5 'primer region will:
  • a) - when using a T7 polymers - the amplification sequence at the 5'-end of the RNA library,
  • b) or - when using the T3 polymer - only the T7 promoter region of the same transcribed.

Gleiches gilt bei der Verwendung anderer Promotorpaarungen.The same applies when using other promoter pairs.

Schon in der T7 Transkription wird die entstehende kurze RNA-Bibliothek für die spätere Ligation vorbereitet. Durch den Zusatz von 5'-Guanosinmonophosphat (GMP) als Starternukleotid in der in vitro-Transkription trägt der weitaus größte Teil der entstehenden RNA-Moleküle eine 5'-Phosphatgruppe, die eine Voraussetzung für die Ligation ist. Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass ein 8-facher Überschuss an GMP über GTP (32 mM : 4 mM) der Transkriptionsausbeute keinen Abbruch tut. Durch diesen Kunstgriff kann man sich aufwändige enzymatische Schritte, wie Dephosphorylierung und Kinasierung, die nie quantitativ ablaufen und Reinigungsschritte erfordern, ersparen. Die Aufreinigung des solchermaßen erhaltenen in vitro-Transkriptionsproduktes kann beispielsweise durch ein denaturierendes Polyacrylamidgel erfolgen. Die Bande des Transkriptes kann sodann weiterbehandelt werden und ggf. weiteren Reinigungsschritten, wie beispielsweise einer Ethanolfällung, unterzogen werden. Das solchermaßen erhaltene Transkriptionsprodukt stellt sodann eine zu amplifizierende Nukleinsäure dar, die erfindungsgemäß weiter behandelt oder entsprechend in Selektions-Verfahren wie dem SELEX-Verfahren verwendet werden kann. Im Falle der Verwendung der T3 Polymerse zur Herstellung einer RNA-Bibliothek, die die Amplifikationssequenzen enthält, ist der Zusatz von GMP nicht notwendig, da das 5'-Ende der entstehenden RNA-Moleküle keiner Ligation zugeführt werden muss.Nice in T7 transcription, the resulting short RNA library for the latter Ligation prepared. By the addition of 5'-guanosine monophosphate (GMP) as starter nucleotide in the in vitro transcription by far the largest part the resulting RNA molecules one 5'-phosphate group, the one requirement for the ligation is. The present inventors have surprisingly found that an 8-fold excess to GMP over GTP (32 mM: 4 mM) does not detract from the transcription yield. Through this trick you can take elaborate enzymatic steps, such as dephosphorylation and kinasing, which never occur quantitatively and cleaning steps require, spare. The purification of the thus obtained in vitro transcription product, for example by a denaturing polyacrylamide gel. The gang of the Transcript can then be treated further and possibly further Purification steps, such as an ethanol precipitation, subjected become. That way obtained transcription product then provides a to be amplified nucleic acid which is the invention further treated or as appropriate in selection procedures such as the SELEX method can be used. In case of using the T3 polymer for producing an RNA library containing the amplification sequences contains the addition of GMP is not necessary because the 5 'end of the resulting RNA molecules none Ligation be supplied got to.

Alternativ zu GMP, das zur Herstellung von zur Ligation vorbereiteten RNA-Molekülen, die dann eine 5'-Monophosphatgruppe tragen, benutzt wird, können weitere über die 5'-Phosphatgruppe hinaus modifizierte GMPs Verwendung finden. Durch die modifizierten 5'-Phosphatgruppen können Linker, bspw. ein Amino-Linker, eingeführt werden, an denen folgend weitere Modifikationen vorgenommen werden könnnen (Seelig B. und Jäschke A. (1999) Bioconjug Chem. May–Jun; 10(3): 371–8). Durch diese Modifikationen kann bspw. eine PEGylierung (PEG = Polyethylengylcol mit üblicherweise 20.000 – 40.000 Da) der verkürzten RNA-Bibliothek vorgenommen werden. Insbesondere die PEGylierung von Oligonukleotiden stellt eine übliche Modifikation dar, um die in vivo Verfügbarkeit der Oligonukloetide zu verbessern (Watson, S. R. et al. (2000). Antisense & Nucleic Acid Drug Development 10: 63–75; Ostendorf et al. (1999) Journal of Clinical Investigation 104 (7): 913–923). Durch die in vitro Selektion identifizierte Zielmolekül-bindende Sequenzen können jedoch ihre Bin- dungseigenschaften durch diese nachträglich vorgenommenen Modifikationen – Linker plus PEG – vermindern bzw. verlieren. Solche Sequenzen sind dann für eine mögliche therapeutsche Anwendung nicht nutzbar. Das hier beschriebene Verfahren erlaubt es diese Modifikationen einzuführen, und zunächst zu beobachten inwieweit die durch den Selektionsprozess angereicherte Bibliothek mit bzw. ohne diese Modifikationen das Zielmolekül binden. Durch die eingeführten Modifikationen ist das 5'-Ende der verkürzten RNA ohne Amplifikationssequenzen jedoch keiner direkten Ligation zugänglich.alternative GMP used to make RNA molecules prepared for ligation, the then a 5'-monophosphate group wear, used, can more about the 5'-phosphate group addition use modified GMPs. By the modified 5'-phosphate groups, linkers, for example an amino linker, introduced which further modifications are made below könnnen (Seelig B. and Jäschke A. (1999) Bioconjug Chem. May-Jun; 10 (3): 371-8). By these modifications, for example, a PEGylation (PEG = Polyethylengylcol with usually 20,000 - 40,000 There) the shortened RNA library are made. In particular, the PEGylation of oligonucleotides is a common modification to the in vivo availability oligonucleotides (Watson, S.R. et al., 2000). Antisense & Nucleic Acid Drug Development 10: 63-75; Ostendorf et al. (1999) Journal of Clinical Investigation 104 (7): 913-923). By however, the target-molecule-binding sequences identified in vitro selection can their binding properties through these subsequently made modifications - linker plus PEG - reduce or to lose. Such sequences are then for a potential therapeutic application not usable. The method described here allows this To introduce modifications and first to observe to what extent the enriched by the selection process Library with or without these modifications bind the target molecule. Through the introduced Modifications is the 5'-end the shortened RNA without amplification sequences but no direct ligation accessible.

Um die Amplifikationssequenzen anzuligieren ist eine Abwandlung des oben beschriebenen Verfahrens nötig. Nach der Ligation der Reverse Primer Bindungsstelle mittels der beschriebenen Reverse Adapter 1 und 2 und der nachfolgenden reversen Transkription schliesst sich die Ligation der Forward Primer Bindungstelle an die durch die reverse Transkription hergestelle cDNA an. Dazu wird an das 3'-Ende der cDNA ein 5'-phosphoryliertes Ligat mit der Sequenz der Forward Primer Bindungsstelle mit Hilfe einer Matrix, die dem Ligat komplemetär ist und an seinem 3'-Ende die Sequenz der 5'-terminalen fixierten Teilsequenz der ver- kürzten RNA-Bibliothek aufweist, ligiert.Around To apply the amplification sequences is a modification of necessary procedure described above. After ligation of the reverse primer binding site by means of described reverse adapter 1 and 2 and the following reverse Transcription closes the ligation of the forward primer binding site to the cDNA produced by the reverse transcription. To gets to the 3'-end the cDNA is a 5'-phosphorylated Ligate with the sequence of the forward primer binding site using a matrix completing the ligate and the sequence at its 3 'end the 5'-terminal fixed subsequence of the shortened RNA library ligated.

Der Transkription und den dabei verwendeten Enzymen kommt eine zentrale Bedeutung zu Hier entsteht aus einer zumindest im Promotorbereich doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure ein Transkript. Dieses kann sein:

  • 1. eine modifizierte oder teilweise modifizierte Ribonukleinsäure a.) 2'-Fluoro-RNA b.) 2'-Amino-RNA c.) basenmodifizierte RNA, 2'-F-RNA, 2'-NH2-RNA.
  • 2. eine unmodifizierte Ribonukleinsäure
The transcription and the enzymes used are of central importance. Here, a transcript arises from a double-stranded deoxyribonucleic acid, at least in the promoter region. This can be:
  • 1. a modified or partially modified ribonucleic acid a.) 2'-fluoro-RNA b.) 2'-amino-RNA c.) Base-modified RNA, 2'-F-RNA, 2'-NH 2 -RNA.
  • 2. an unmodified ribonucleic acid

Für die verschiedenen gewünschten Transkriptionsprodukte kommen unterschiedliche RNA- bzw. RNA/DNA-Polymerasen zum Einsatz:

  • 1.) für zuckermodifizierte RNA: "SP6 R&DNA Polymerase" und "T7 R&DNA Polymerase" (Epicentre) bzw. den in einem Kit „MODIscript" (Ambion) enthaltenen T7 und T3 Polymerasen
  • 2.) für unmodifizierte RNA: T7 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase, SP6 RNA-Polymerase.
Different RNA or RNA / DNA polymerases are used for the various desired transcription products:
  • 1.) for sugar-modified RNA: "SP6 R & DNA Polymerase" and "T7 R & DNA Polymerase" (Epicenter) the T7 and T3 polymerases contained in a Kit "MODIscript" (Ambion)
  • 2.) for unmodified RNA: T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase.

Die "SP6 R&DNA Polymerase" und "T7 R&DNA Polymerase" (von Epicentre) ist beschrieben in: Souza, R. and Padilla, R. (1995) EMBO J. 14 (18), 4609f; Padilla, R. and Souza, R. (1999) Nucl. Acid Res. 27 (6), 1561f, und im US-Patent U.S. 5,849,546 . Die anderen Polymerasen sind ebenfalls kommerziell erhältlich (z.B. Ambion, Stratagene).The "SP6 R & DNA Polymerase" and "T7 R & DNA Polymerase" (from Epicenter) are described in: Souza, R. and Padilla, R. (1995) EMBO J. 14 (18), 4609f; Padilla, R. and Souza, R. (1999) Nucl. Acid Res. 27 (6), 1561f, and in the US patent US 5,849,546 , The other polymerases are also commercially available (eg Ambion, Stratagene).

In dem hier dargestellten Verfahren ist – durch die Verwendung mindestens zweier verschiedener hintereinander geschalteter Promotoren für RNA-Polymerasen – darauf zu achten, in welcher Kombination die Promotoren angeordnet sind, da nicht alle Polymerasen nur spezifisch für ihre Promotoren sind sondern auch andere Promotoren nutzen können, wie bspw. die T7 RNA Polymerase. Sie ist auch in der Lage vom T3 Promotor zu transkribieren, allerdings unter reduzierten Ausbeuten. Das bedeutet, dass in der Transkriptionsreaktion zwei Klassen unterschiedlich langer RNA-Moleküle entstehen können. Die eine trägt einen Teil der Forward Primer Sequenz, die andere nicht. Wenn die erwünschten Transkriptionsprodukte mittels Gelreinigung von dem unerwünschten Produkt abgtrennt werden, kann das Verfahren wie beschrieben durchgeführt werden. Dann sollte es sogar möglich sein, mit zwei identischen Promotoren zu arbeiten. Die Entstehung von zwei verschieden langen RNA-Molekülen macht aber eine gewünschte Automatiserung des Prozesses unmöglich, da hier die Aufreinigung allein durch ein Molekularsieb erfolgt. Eine Abtrennng der beiden verschieden langen RNA-Moleküle ist dadurch nicht möglich.In the method described here is - by the use of at least two different sequentially switched promoters for RNA polymerases - on it to pay attention to the combination of the promoters because not all polymerases are specific for their promoters but can also use other promoters, such as the T7 RNA polymerase. She is also capable of the T3 Promoter to transcribe, but under reduced yields. This means that in the transcription reaction two classes are different long RNA molecules can arise. One wears one part of the forward primer sequence, the other not. If the desired Transcription products by gel purification of the unwanted Product can be separated, the process can be carried out as described. Then it should even be possible be to work with two identical promoters. The genesis of two different length RNA molecules but makes a desired automation of the process impossible since Here the purification is carried out solely by a molecular sieve. A Separation of the two different length RNA molecules is not possible.

Selektion von Zielmolekül-bindenden DNA-Nukleinsäurenselection of target-binding DNA nucleic acids

Die Reaktionsfolge der Amplifikation bei der Verwendung von DNA unterscheidet sich von der bei Verwendung RNA und ist in 8 detailliert wiedergegeben.The reaction sequence of amplification in the use of DNA is different from that when using RNA and is in 8th reproduced in detail.

Eine überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Reaktionsabfolge sowohl zur Identifizierung von kurzen Zielmolekül-bindenden DNA-Nukleinsäuren als auch von langen Zielmolekül-bindenden DNA-Nukleinsäure dient, wobei die durch die definierten Teilsequenzen vorgegebene Struktur es ermöglichen soll, die langen Zielmolekül-bindenden DNA-Nukleinsäuren – unter Erhaltung ihrer Bindungseigenschaften – um die Amplifikationssequenzen zu reduzieren.A surprising Effect of the method according to the invention is that the reaction sequence both for identification of short target-binding DNA nucleic acids as also of long target-binding DNA nucleic acid serves, wherein the predetermined by the defined partial sequences structure make it possible intended to bind the long target molecule DNA Nucleic Acids - Under Maintaining their binding properties - around the amplification sequences to reduce.

Überraschenderweise hat der vorliegende Erfinder festgestellt, dass es ermöglicht ist, während der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von Zielmolekülbindenden Nukleinsäuren sowohl – mindestens einmalig – mit kurzen DNA- Bibliotheken als auch mit langen DNA-Bibliotheken zu arbeiten und somit am Ende des Verfahrens kurze Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren zu generieren, die ohne das Vorhandensein der Amplifikationssequenzen das Zielmolekül mit gleicher Güte erkennen.Surprisingly the present inventor has found that it is possible to while the implementation the method according to the invention for the identification of target-binding nucleic acids both - at least once - with short DNA libraries as well as working with long DNA libraries and thus, at the end of the procedure, short target molecule-binding nucleic acids generate without the presence of the amplification sequences the target molecule with equal quality detect.

Weiterhin hat der vorliegende Erfinder überraschenderweise festgestellt, dass bei Verwendung der kurzen DNA-Bibliothek das Verfahren ohne Aufreinigungsschritte durchgeführ werden kann und erst die Transkriptionsprodukte, vor deren weiterer Verwendung in einer nächsten Selektions-Runde im Rahmen des SELEX-Verfahrens, einer Aufreinigung unterzogen werden. Bevorzugterweise erfolgt diese Aufreinigung durch Gelreinigung.Farther the present inventor has surprisingly found that when using the short DNA library the Process can be carried out without purification steps and only the Transcription products, before further use in a next round of selection undergo purification as part of the SELEX process. Preferably, this purification is carried out by gel purification.

Schließlich hat der vorliegende Erfinder festgestellt, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren die DNA-Amplifikation zum größten Teil durch eine Transkriptionsreaktion und nicht durch eine PCR ermöglicht wird.Finally has the present inventor found that by the inventive method the DNA amplification for the most part by a transcription reaction and not by PCR.

Ein Vorteil des DNA-Amplifikationsschrittes im Kontext des SELEX-Verfahrens, wie in Fig. 8-dargestellt, ist zum Beispiel der, dass im Vergleich zum Stand der Technik (Williams KP, Liu XH, Schumacher TN, Lin HY, Ausiello DA, Kim PS, Bartel DP: Bioactive and nucleaseresistant L-DNA ligand of vasopressin. Proc Natl Acad Sci USA (1997), 94: 11285–90.) nicht die PCR als letzter Amplifikationsschritt vorgesehen ist. Daher ist keine präparative Gelreinigung der DNA, also Gelreinigung und Eluieren aus dem Gel und Fällung, wie im Stand der Technik beschrieben, nötig. Üblicherweise werden die beiden DNA-Stränge, die in der PCR geschrieben werden, voneinander getrennt, indem ein Strang vorher durch Spaltung eines Ribo-Primers verkürzt wird. Präparative Gelreinigungen sind nicht gut automatisierbar.One Advantage of the DNA amplification step in the context of the SELEX process, For example, as shown in Fig. 8-, that in comparison to the prior art (Williams KP, Liu XH, Schumacher TN, Lin HY, Ausiello DA, Kim PS, Bartel DP: Bioactive and nucleaseresistant L-DNA ligand of vasopressin. Proc Natl Acad Sci USA (1997), 94: 11285-90.) not the PCR is provided as the last amplification step. Therefore, no preparative Gel purification of the DNA, ie gel purification and elution from the gel and precipitation, as described in the prior art, necessary. Usually, the two DNA strands, which are written in the PCR, separated from each other by a Strand is previously shortened by cleavage of a ribo-primer. preparative Gel cleanings are not easy to automate.

Eine andere bereits beschriebene Möglichkeit der Strangtrennung beruht auf der Verwendung eines biotinylierten Primers. Das PCR-Produkt wird dann auf Streptavidin-Partikeln immobilisiert und der Strang, der den biotinylierten Primer nicht enthält, wird mittels Natronlauge, Erhitzen o.ä. eluiert. Die Kapazität der Partikeln ist oft recht beschränkt, da auch biotinylierte aber nicht-inkorporierte Primer Biotinbindungsstellen besetzen. Außerdem leiden die Partikeln (engl. beads) häufig unter den alkalischen Bedingungen bzw. Hitze, so dass Streptavidin oder andere Partikeln-Bestandteile zusammen mit dem DNA-Strang eluiert werden. Diese müssen dann erst wieder abgetrennt werden, z.B. durch eine nicht gut automatisierbare Phenol/Chloroform-Extraktion.Another possibility of strand separation already described is based on the use of a biotinylated primer. The PCR product is then immobilized on streptavidin particles and the strand, which does not contain the biotinylated primer, by means of sodium hydroxide solution, heating o.ä. eluted. The capacity of the parti often is quite limited since biotinylated but unincorporated primers also occupy biotin binding sites. In addition, the beads often suffer from the alkaline conditions or heat, so that streptavidin or other particulate matter is eluted along with the DNA strand. These must then be separated again, for example by a not easily automatable phenol / chloroform extraction.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die DNA für die jeweils folgende Selektionsrunde nicht nur durch präparative PCR, sondern durch PCR und in vitro Transkription hergestellt wird. Daher werden weniger PCR-Zyklen benötigt. Da die PCR einen starken Selektionsdruck ausübt und bei hoher Zyklenzahl häufig PCR-Artefakte, sog. Amplifikationsparasiten auftreten, ist dies von großem Nutzen.One Another advantage of the method according to the invention is that the DNA for the following selection round not only by preparative PCR, but by PCR and in vitro transcription is produced. Therefore, fewer PCR cycles are needed. Since the PCR has a strong Selection pressure exerts and at high number of cycles frequently PCR artifacts, so-called amplification parasites occur, this is of great Use.

Der grundsätzliche Ablauf der Amplifikationsreaktion bei Verwendung von kurzen DNA-Bibliotheken ohne Amplifikationssequnezen, bestehend aus Kinasierung, 5'-Ligation von Adaptermolekülen, 3'-Ligation von Adaptermolekülen, optionaler Zweitstrangsynthese, opti onaler PCR, Transkription, reverser Transkription und die Verkürzung des reversen Transkriptionsprodukts durch alkalische Hydrolyse ist in 8 auf der linken Seite in der Einbindung in eine Selektionsrunde des SELEX-Verfahrens dargestellt. Der grundsätzliche Ablauf der Amplifikationsreaktion bei Verwendung von langen DNA-Bibliotheken mit Amplifikationssequenzen, bestehend aus, optionaler Zweitstrangsynthese, optionaler PCR, Transkription und reverser Transkription ist in 8 auf der rechten Seite dargestellt. Die optionale Zweitsstrangsysnthese und die optionale PCR werden in den beiden Varianten mit den gleichen Primern durchgeführt, so dass das Transkriptionsausgangsprodukt nach diesen Schritten der Reaktionsabfolge identsich ist. Die Verwendung der geeigneten RNA-Polymerase in der Transkriptionsreaktion und die folgende Verkürzung des reversen Transkriptionsproduktes (cDNA) ermöglicht die Herstellung einer kurzen DNA-Bibliothek.The basic sequence of the amplification reaction using short DNA libraries without Amplifikationssequnezen, consisting of kinase, 5'-ligation of adapter molecules, 3'-ligation of adapter molecules, optional second-strand synthesis, opti onal PCR, transcription, reverse transcription and the shortening of the reverse transcription product by alkaline hydrolysis is in 8th on the left side in the integration into a selection round of the SELEX process. The basic sequence of the amplification reaction using long DNA libraries with amplification sequences consisting of, optional second-strand synthesis, optional PCR, transcription and reverse transcription is described in 8th shown on the right. The optional second-strand synthesis and optional PCR are carried out in the two variants with the same primers so that the transcriptional starting product after these steps in the reaction sequence is identical. The use of the appropriate RNA polymerase in the transcription reaction and the subsequent truncation of the reverse transcription product (cDNA) allows the preparation of a short DNA library.

Wie aus 8 beispielhaft ersichtlich, wird zunächst eine Bibliothek einzelsträngiger DNA, beispielsweise durch eine Oligonukleotidsynthese, oder eine durch den vorhergehenden Selektionsschritt angereicherte Bibliothek einzelsträngiger DNA bereitgestellt. Das Design der Bibliotheken erlaubt es während der Selektion sowohl mit einer kurzen Bibliothek oder einer üblicherweise verwendeten, langen Bibliothek zu arbeiten. Beiden Bibliotheken sind in ihrem randomisierten Bereich und in der fixierten Teilsequenz identisch. Der randomisierte Bereich umfasst in der Regel einen definiert ausgewählten Sequenzraum. Die 5'- und 3'- terminalen Teilsequenzen sind so ausgewählt, dass sie eine Helix von je 7 miteinander hybridisierenden Nukleotiden ausbildet. Der lange Bibliothek umfasst zusätzlich die Sequenzen für die nach dem Selektionschritt folgenden Reaktionen wie die PCR, in vitro Transkription und reverse Transkription. Der kurzen Bibliothek fehlen diese Sequenzen. Sie werden vor den Amplifikationsreaktionen mittels einer matrixunterstützten Ligation am 5'- und am 3'-Ende angefügt. Um diese Ligation zu ermöglichen, sind am 5'-Ende mindestens zwei freie, nicht an der Helix beteiligte Nukleotide nötig.How out 8th By way of example, a library of single-stranded DNA, such as by oligonucleotide synthesis, or a single-stranded DNA library enriched by the previous selection step, is first provided. The design of the libraries allows to work with both a short library or a commonly used, long library during selection. Both libraries are identical in their randomized area and in the fixed partial sequence. The randomized area usually includes a defined sequence space. The 5 'and 3' terminal partial sequences are selected such that they form a helix of 7 mutually hybridizing nucleotides. The long library additionally comprises the sequences for the reactions following the selection step, such as PCR, in vitro transcription and reverse transcription. The short library lacks these sequences. They are added before the amplification reactions by means of a matrix-assisted ligation at the 5 'and at the 3' end. To facilitate this ligation, at least two free nucleotides not involved in the helix are needed at the 5 'end.

Falls die im Selektionschritt isolierte kurze DNA-Bibliothek noch keine 5'-terminalen Monophosphate trägt, müssen diese angefügt werden, wie in 9 beispielhaft dargestellt. Die Reaktion erfolgt bevorzugterweise in Ligase-Puffer (Fermentas T4-DNA Ligase-Puffer) unter Zugabe von ATP und T4 Polynukleotidkinase (Invitrogen).If the short DNA library isolated in the selection step does not yet carry any 5'-terminal monophosphates, these must be added, as in 9 exemplified. The reaction is preferably carried out in ligase buffer (Fermentas T4 DNA ligase buffer) with the addition of ATP and T4 polynucleotide kinase (Invitrogen).

Wie in 10 beispielhaft dargestellt, werden zu dem Reaktionsansatz der 5'-Phosphorylierung aus 9 nach Ablauf der Reaktionszeit, beispielsweise 45 min, 37°C, zwei doppelsträngige DNA-Adapter hinzugefügt. Die Adapter zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine überhängende Ligationsmatrix tragen, welche zu einem Teil der fixierten Teilsequenzen der Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen komplementär ist. Das Reverse Ligat, also der erste Strang des zweiten Adaptermoleküls, ist 5'-phosphoryliert, um die Ligation an das 3'-Ende der DNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen zu ermöglichen (das 5'-Phosphat kann gleich bei der Oligonukleotidsynthese angefügt werden). Die Reverse Matrix, die identisch ist mit dem Reverse-Primer in der Zweitstrangsynthese/PCR, zeichnet sich überdies dadurch aus, dass sie zwei, hintereinanderliegende, starke Promotorsequenzen für RNA-Polymerasen enthält, wie in 13 beispielhaft dargestellt. Beispielsweise die T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase-Promotoren. Der Promotoren sind so angeordnet, dass, je nachdem welche der zu den beiden Promotoren zugehörige RNA-Polymerase verwendet wird,

  • a) – ber Verwendung der T3 Polymerase – das Transkriptionsprodukt am 5'-Ende den T7 Promotorbereich enthält, um als Templat für die reverse Transkription zur Herstellung einer langen DNA-Bibliothek zu dienen.
  • b) – ber Verwendung der T7 Polymerase – das Transkriptionsprodukt am 5'-Ende mit der einen fixierten Teilsequenz zu beginnen, um als Templat für die reverse Transkription zur Herstellung einer kurzen DNA-Bibliothek zu dienen
As in 10 exemplified, to the reaction approach of 5'-phosphorylation 9 at the end of the reaction time, for example 45 min, 37 ° C., two double-stranded DNA adapters are added. The adapters are characterized by the fact that they carry an overhanging ligation matrix, which is complementary to a part of the fixed part sequences of the library without amplification sequences. The reverse ligate, the first strand of the second adapter molecule, is 5'-phosphorylated to allow ligation to the 3'-end of the DNA library without amplification sequences (the 5'-phosphate can be added in the same oligonucleotide synthesis). The reverse matrix, which is identical to the reverse primer in the second strand synthesis / PCR, is further distinguished by the fact that it contains two, one behind the other, strong promoter sequences for RNA polymerases, as in 13 exemplified. For example, the T7, T3 or SP6 RNA polymerase promoters. The promoters are arranged so that, depending on which of the two promoters associated RNA polymerase is used,
  • a) Using T3 polymerase, the transcription product at the 5 'end contains the T7 promoter region to serve as a template for reverse transcription to produce a long DNA library.
  • b) - using T7 polymerase - to start the transcription product at the 5 'end with the one fixed partial sequence to serve as a template for the reverse transcription to produce a short DNA library

Die Forward Matrix und das Reverse Ligat, d.h. der zweite Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküles und der erste Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls können am jeweiligen 3'-Ende blockiert sein, um unerwünschte Ligationsprodukte und Mispriming in der PCR dieser Konstrukte zu verhindern. Dies ist insbesondere bei der Amplifikation von Nukleinsäurebibliotheken nützlich, da in diesem Fall häufig zu diesen Sequenzen komplementäre Sequenzen irgendwo im randomisierten Bereich, d.h. beispielsweise in der Zwischensequenz auftreten können. Die Blockierung kann so aussehen, dass das 3'-terminale Nukleotid ein 3'-Desoxynukleotid ist. In unserem Falle ist es ein 2'-3'-Didesoxynukleotid.The Forward matrix and the reverse ligate, i. the second nucleic acid strand of the first adapter molecule and the first nucleic acid strand of the second adapter molecule can at the respective 3'-end be blocked to unwanted Ligation products and Mispriming in the PCR of these constructs too prevent. This is especially true in the amplification of nucleic acid libraries useful, because in this case often complementary to these sequences Sequences somewhere in the randomized area, i. for example can occur in the cutscene. The blocking can look like that the 3'-terminal Nucleotide is a 3'-deoxynucleotide. In our case it is a 2'-3'-dideoxynucleotide.

Nach Zugabe der Ligase (z. B. T4 DNA-Ligase von Fermentas) erfolgt die Ligation der Amplifikationssequenzen (Forward Ligat und Reverse Ligat) innerhalb von 2–12 h bei 16°C.To Addition of the ligase (eg T4 DNA ligase from Fermentas) takes place Ligation of Amplification Sequences (Forward Ligate and Reverse Ligate) within 2-12 h at 16 ° C.

Nach der Ligation der Amplifikationssequenzen an die kurze DNA-Bibliothek aus 10 kann die DNA mittels PCR amplifiziert werden, wie in 11 beispielhaft dargestellt. Es ist keine Aufreinigung zwischen den Reaktionsschritten Ligation und PCR nötig. Es werden die noch fehlenden Primer, dNTPs, PCR-Puffer, und eine thermostabile DNA-Polymerase (z.B. Taq DNA-Polymerase) hinzugefügt. Der Forward Primer entspricht dabei dem Forward-Ligat oder einem Teil davon, kann er optional an seinem 3'-Ende um die definierte Teilsequenz am 5'-Ende der zu amplifizierenden ssDNA erweitert sein und wird hierin auch als PCR-Primermolekül bezeichnet. Der Reverse Primer enttpricht der Reverse Matrix und enthält die Sequenzen für den T3 und den T7 RNA-Polymerase Promotor.After ligation of the amplification sequences to the short DNA library 10 For example, the DNA can be amplified by PCR as in 11 exemplified. No purification between the reaction steps ligation and PCR is necessary. It adds the missing primers, dNTPs, PCR buffer, and a thermostable DNA polymerase (eg Taq DNA polymerase). The forward primer corresponds to the forward ligate or a part thereof, it may optionally be extended at its 3 'end by the defined partial sequence at the 5' end of the ssDNA to be amplified and is also referred to herein as PCR primer molecule. The reverse primer is averse to the reverse matrix and contains the sequences for the T3 and T7 RNA polymerase promoters.

Statt der PCR kann auch eine Zweitstrangsynthese, z.B. mit Klenow- oder Stoffel-Fragment, durchgeführt werden, wobei hierin eine PCR auch als Zweitstrangsynthese bezeichneet wird.Instead of the PCR can also be a second strand synthesis, e.g. with Klenow or Stoffel fragment, performed in which a PCR is also referred to as a second-strand synthesis becomes.

Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden.The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead can also be continued directly with the in vitro transcription.

Weisen die im Selektionschritt isolierten Zielmolekül-bindenden DNA-Nukleinsäuren die fixierten Teilsequenzen, den randomisierten Bereich und die Amplifikationssequenzen auf, kann die DNA direkt mittels PCR amplifiziert werden, wie in 12 beispielhaft dargestellt. Es werden dazu die Primer, dNTPs, PCR-Puffer, und eine thermostabile DNA-Polymerase (z.B. Taq DNA-Polymerase) hinzugefügt. Der Forward Primer kann optional an seinem 3'-Ende um die definierte Teilsequenz am 5'-Ende des randomiserten Bereichs zu amplifizierenden ssDNA erweitert sein und wird hierin auch als PCR-Primermolekül bezeichnet. Der Forward und Reverse Primer sind identisch mit denen, die für die PCR der; durch Ligation um die Amplifikationsequenzen verlängerten, kurzen Bibliothek verwendet werden, wie beispielhaft dargestellt in 11.If the target-molecule-binding DNA nucleic acids isolated in the selection step have the fixed partial sequences, the randomized region and the amplification sequences, the DNA can be amplified directly by means of PCR, as described in US Pat 12 exemplified. For this purpose, the primers, dNTPs, PCR buffer, and a thermostable DNA polymerase (eg Taq DNA polymerase) are added. The forward primer may optionally be extended at its 3 'end by the defined partial sequence at the 5' end of the randomized region to be amplified ssDNA and is also referred to herein as PCR primer molecule. The forward and reverse primers are identical to those used for PCR; by ligation around the amplification sequences of the extended, short library, as exemplified in 11 ,

Statt der PCR kann auch eine Zweitstrangsynthese, z.B. mit Klenow- oder Stoffel-Fragment, durchgeführt werden, wobei hierin eine PCR auch als Zweitstrangsynthese bezeichneet wird.Instead of the PCR can also be a second strand synthesis, e.g. with Klenow or Stoffel fragment, performed in which a PCR is also referred to as a second-strand synthesis becomes.

Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden.The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead can also be continued directly with the in vitro transcription.

Die Produkte der Ligation oder der optionalen PCR oder der optionalen Zweitstrangsynthese werden nun durch eine in vitro in 13 beispielhaft dargestellte Transkription, z.B. mit T3/T7/SP6 RNA-Polymerase (Stratagene, Ambion oder andere) in RNA umgeschrieben. Ein Strang liefert etwa 20–100 RNA-Kopien. Außerdem werden Puffer und NTPs benötigt. Falls genug PCR-Produkt vorhanden ist, bedarf auch dieser Schritt keiner Aufreinigung. Es können bis zu 20 % (v/v) PCR-Produkt/Zweitstrangsynthese in die Transkription eingesetzt werden. Wird direkt der Ligationsansatz verwendet, kann bis zu 40 % (v/v) eingesetzt werden.The products of ligation or optional PCR or optional second strand synthesis are now described by in vitro in 13 exemplified transcription, eg with T3 / T7 / SP6 RNA polymerase (Stratagene, Ambion or others) transcribed into RNA. One strand provides about 20-100 RNA copies. In addition, buffers and NTPs are needed. If enough PCR product is available, this step also needs no purification. Up to 20% (v / v) PCR product / second strand synthesis can be used in the transcription. If the ligation mixture is used directly, up to 40% (v / v) can be used.

Der in der Zweitsstrangssynthese/PCR verwendete Reverse-Primer, in der Ligation auch als Reverse Matrix eingesetzt, zeichnet sich dadurch aus, dass er zwei hintereinanderliegende, starke Promotorsequenzen für RNA-Polymerasen enthält. Beispielsweise die T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase-Promotoren. Hier sind der T7 und der T3 Promotor dargestellt. Die Promotoren sind so angeordnet, dass je nachdem welche der zu den beiden Promotoren zugehörige RNA-Polymerase verwendet wird, die Transkription mit der definierten Teilsequenz am 3'-Ende eines jeden zu amplifizierenden DNA-Stranges (wenn die T7 Polymerase verwendet wird) oder zusätzlich zu dieser definierten Teilsequenz die an diese definierte Teilsequenz anschließende dem T7 Promotor komplementäre Sequenz (wenn die T3 Polymerase verwendet wird) beginnt. Um also eine lange Bibliothek für die nächste Selektionsrunde zu erhalten, wird die T3 Polymerase verwendet. Das entstehende Transkriptionsprodukt ist um die T3 Promotorsequenz verkürzt und enthält somit an seinem 5'-Ende die T7 Promotorsequenz. Soll in die Selektionsrunde eine kurze Bibliothek verwendet werden, so wird die T7 Polymerase verwendet. Das Transkriptionsprodukt liegt dann folglich – im Gegensatz zum Transkriptionsausgangsprodukt – um den T3 und den T7 Promotorbereich verkürzt vor.The reverse primer used in the second-strand synthesis / PCR, also used as reverse matrix in the ligation, is characterized in that it contains two strong promoter sequences for RNA polymerases lying one behind the other. For example, the T7, T3 or SP6 RNA polymerase promoters. Here are the T7 and the T3 promoter shown. The promoters are arranged so that, depending on which of the two promoters associated RNA polymerase is used, the transcription with the defined partial sequence at the 3 'end of each DNA strand to be amplified (if the T7 polymerase is used) or additionally to this defined partial sequence, the T7 promoter complementary sequence subsequent to this defined partial sequence (when the T3 polymerase is used) begins. So to get a long library for the next round of selection, the T3 polymerase is used. The resulting transcription product is truncated by the T3 promoter sequence and thus contains at its 5 'end the T7 promoter sequence. If a short library is to be used in the selection round, the T7 polymerase is used. The transcription product is then - as opposed to the transcriptional output product - shortened by the T3 and the T7 promoter area.

Die RNA-Moleküle, des mit der T7 Polymerase transkribierten Ausgangsproduktes aus 13, werden anschließend unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, der mindestens ein Ribonukleotid direkt 5' von der fixierten Teilsequenz an seinem 3'-Enden enthält, sowie mit Puffer, dNTPs und Reverser Transkriptase, z.B. Superscript II (Gibco Life Technologies), in komplementäre DNA (cDNA) überführt werden, wie beispielhaft in 14 dargestellt. Die Sequenzen der erhaltenen cDNA entsprechen den zu amplifizierenden DNA-Strängen und enthalten die fixierten Teilsequenzen, den randomisierten Bereich zuzüglich der Amplifikationssequenz am 5'-Ende.The RNA molecules of the transcribed with the T7 polymerase starting product 13 are then amplified into complementary DNA with the addition of a forward synthesis primer containing at least one ribonucleotide directly 5 'to the fixed partial sequence at its 3' ends, as well as with buffer, dNTPs and reverse transcriptase eg Superscript II (Gibco Life Technologies) (cDNA), as exemplified in 14 shown. The sequences of the cDNA obtained correspond to the DNA strands to be amplified and contain the fixed partial sequences, the randomized region plus the amplification sequence at the 5 'end.

Die Bereiche des Forward Synthese Primers, die 5' vor der fixierten Teilsequenz liegen, werden nun durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen (310 mM NaOH, 95°C, 10 min als beispielhafte Reaktionsbedingungen) abgespalten. Gleichzeitig werden die RNA-Stränge verdaut. Falls weitere Ribonukleotide in den Forward Synthese Primer inkorporiert wurden, wird dieser in mehrere Teile zerfallen, die dann bei Ethanolfällung mit linearem Polyacrylamid als Carrier im Überstand verbleiben (beschrieben bei Gaillard C, Strauss F: Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Ebenfalls möglich ist eine Aufreinigung über ein geeignetes Molekularsieb (z.B. Microcon YM 10 von Amicon/Millipore). Falls eine Gelreinigung der ssDNA durchgeführt wird, würden die Primerbruchstücke nicht mit dem längeren ssDNA-Strang co-migrieren.The Areas of the Forward Synthesis Primer 5 'before the fixed part sequence, are now by addition of lye and optionally heating (310 mM NaOH, 95 ° C, 10 min as exemplary reaction conditions). simultaneously become the RNA strands digested. If more ribonucleotides in the forward synthesis primer This will be divided into several parts, the then with ethanol precipitation with remain linear polyacrylamide as a carrier in the supernatant (described at Gaillard C, Strauss F: Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Also possible is a purification over a suitable molecular sieve (e.g., Microcon YM 10 ex Amicon / Millipore). If gel purification of the ssDNA is performed, the primer fragments would not with the longer one co-migrate ssDNA strand.

Bevorzugterweise wird vor einer Fällung oder einer weiteren Reinigung der Ansatz der alkalischen Spaltung zunächst mit HCl, NaOAc, oder NH4OAc auf den gewünschten pH-Wert (z.B. pH 5,3) eingestellt. Ein Übersäuern ist zu verhindern, da sonst die DNA dazu neigt zu depuri- nieren. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen.Preferably, prior to precipitation or further purification, the alkaline cleavage approach is first adjusted to the desired pH (eg, pH 5.3) with HCl, NaOAc, or NH 4 OAc. Acidification should be avoided, otherwise the DNA tends to depurinate. This completes the amplification cycle.

Alternativ zur Abspaltung durch allcalischen Verdau kann der Teil des Forward Synthese Primers, der 5' von der definierten Teilsequenz der ursprünglichen DNA liegt und abgespalten werden muss, mit einem Restriktionsenzym abgespalten werden. Bei Verwendung einer RNAse H-positiven reversen Transkriptase (z.B. Avian Myeloblastosis Virus, AMV, Reverse Transkriptase, Promega) empfiehlt sich ein Verdau mit einem Restriktionsenzym, das auch ssDNA schneidet (z.B. Hha I, Hin P1 I oder Mnl I, alle von New England Biolabs [siehe Catalog & Technical Reference 2002/2003, Seiten 47 und 247]). Auf diese Weise bleibt ein 5'-Monophosphat zurück, so dass vor der nächsten Ligation keine Kinasierung nötig ist. Die Fällung erfolgt mit linearem Polyacrylamid oder Filtration über Molekularsieb oder Gelreinigung.alternative For splitting off by Allcalic digestion, the part of the forward Synthesis of Primer, the 5 'of the defined partial sequence of the original DNA is located and split off must be cleaved with a restriction enzyme. at Use of an RNAse H positive reverse transcriptase (e.g., Avian Myeloblastosis virus, AMV, reverse transcriptase, Promega) digestion with a restriction enzyme that also cuts ssDNA (e.g., Hha I, Hin P1 I or Mnl I, all from New England Biolabs [see Catalog & Technical Reference 2002/2003, pages 47 and 247]). This way it stays a 5'-monophosphate back, so that before the next Ligation no kinasing necessary is. The precipitation is carried out with linear polyacrylamide or filtration over molecular sieve or gel purification.

Alternativ ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass zummindest der DNA-Strang in der Heteroduplex aus RNA und komplementärer DNA von einem Restriktionsenzym direkt 5' von der ersten fixierten Teilsequenz geschnitten wird.alternative is in one embodiment provided that at least the DNA strand in the heteroduplex out RNA and complementary DNA from a restriction enzyme directly 5 'to the first fixed partial sequence is cut.

Die RNA-Moleküle, des mit der T3 Polymerase transkribierten Ausgangsproduktes aus 13, werden anschließend unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, sowie Puffer, dNTPs und Reverser Transkriptase, z.B. Superscript II (Gibco Life Technologies), in komplementäre DNA (cDNA) überführt werden, wie beispielhaft in 15 dargestellt. Die Sequenzen der erhaltenen cDNA entsprechen den zu amplifizierenden DNA-Strängen umfassend die fixierten Teilsequenzen, den randomisierten Bereich zuzüglich der Amplifikationssequenzen am 5'- und 3'-Ende.The RNA molecules of the transcribed with the T3 polymerase starting product 13 , are then converted into complementary DNA (cDNA) with the addition of a forward synthesis primer, as well as buffers, dNTPs and reverse transcriptase, eg Superscript II (Gibco Life Technologies), as exemplified in US Pat 15 shown. The sequences of the cDNA obtained correspond to the DNA strands to be amplified comprising the fixed partial sequences, the randomized region plus the amplification sequences at the 5 'and 3' ends.

Die RNA-Stränge werden nun durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen (310 mM NaOH, 95°C, 10 min als beispielhafte Reaktionsbedingungen) verdaut. Die enstehenden Ribonukleotide können durch Ethanolfällung mit linearem Polyacrylamid als Carrier abgetrennt werdeb, da sie im Überstand verbleiben (beschrieben bei Gaillard C, Strauss F: Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Ebenfalls möglich ist eine Aufreinigung über ein geeignetes Molekularsieb (z.B. Microcon YM 10 von Amicon/Millipore). Um überschüssige, nicht in den cDNA Strang eingebaute Forward Synthese Primer abzutrennen, kann eine Gelreinigung der ssDNA durchgeführt werden. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen.The RNA strands are now by addition of lye and optionally heating (310 mM NaOH, 95 ° C, 10 min as exemplary reaction conditions). The resulting Ribonucleotides can by ethanol precipitation separated with linear polyacrylamide as a carrier, since they in the supernatant remain (described by Gaillard C, Strauss F: ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Also possible is a purification over a suitable molecular sieve (e.g., Microcon YM 10 ex Amicon / Millipore). To excess, not separate Forward Synthesis Primer built into the cDNA strand, a gel purification of the ssDNA can be carried out. This is the amplification cycle closed.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation von DNA bietet u.a. den Vorteil, dass keine präparative Gelreinigung, also Gelreinigung und Eluieren aus dem Gel und Fällung, nötig ist. Diese ist normalerweise unverzichtbar, um die beiden DNA-Stränge, die in der PCR geschrieben werden voneinander zu trennen, wobei ein Strang vorher durch Spaltung eines Ribo-Primers verkürzt wird. Präparative Gelreinigungen sind nicht gut automatisierbar.The inventive method for amplification of DNA provides i.a. the advantage that no preparative Gel purification, ie gel purification and elution from the gel and precipitation, is necessary. This is usually indispensable to the two DNA strands, the written in the PCR are to be separated from each other, with a Strand is previously shortened by cleavage of a ribo-primer. preparative Gel cleanings are not easy to automate.

Selektion von Zielmolekül-bindenden FNA-Nukleinsäurenselection of target-binding FNA nucleic acids

Die Reaktionsfolge der Amplifikation bei der Verwendung von FNA unterscheidet sich von der bei Verwendung DNA und RNA und ist in 18 detailliert wiedergegeben.The reaction sequence of amplification in the use of FNA differs from that in use of DNA and RNA and is in 18 reproduced in detail.

Eine überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Reaktionsabfolge sowohl zur Identifizierung von kurzen Zielmolekül-bindenden FNA-Nukleinsäuren als auch von langen Zielmolekül-bindenden FNA-Nukleinsäure dient, wobei die durch die definierten Teilsequenzen vorgegebene Struktur es ermöglichen soll, die langen Zielmolekül-bindenden FNA-Nukleinsäuren – unter Erhaltung ihrer Bindungseigenschaften – um die Amplifikationssequenzen zu reduzieren.A surprising Effect of the method according to the invention is that the reaction sequence both for identification of short target-binding FNA nucleic acids as also of long target-binding FNA nucleic acid serves, wherein the predetermined by the defined partial sequences structure make it possible intended to bind the long target molecule FNA nucleic acids - under Maintaining their binding properties - around the amplification sequences to reduce.

Überraschenderweise hat der vorligende Erfinder festgestellt, dass das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, während der Durchführung des Verfahrens zur Identifizierung von Zielmolekül-bindenden Nukleinsäuren sowohl – mindestens einmalig – mit kurzen FNA- Bibliotheken als auch mit langen FNA-Bibliotheken zu arbeiten und somit am Ende des Verfahrens kurze Zielmolekül-bindende Nukleinsäuren zu generieren, die ohne das Vorhandensein der Amplifikationssequenzen das Zielmolekül mit gleicher Güte erkennen.Surprisingly the disclosing inventor has found that the inventive method it allows while the implementation of the method for the identification of target-binding nucleic acids both - at least once - with short FNA libraries as well as with long FNA libraries work and thus at the end of the procedure short target-binding nucleic acids generate without the presence of the amplification sequences the target molecule with equal quality detect.

Überraschenderweise hat der vorligende Erfinder desweiteren festgestellt, dass das erfndungsgemäße Verfahren bei Verwendung der kurzen FNA-Bibliothek ohne Aufreinigungsschritte durchgeführt werden kann und erst die Transkriptionsprodukte, vor deren weiterer Verwendung in einer nächsten Selektions-Runde im Rahmen des SELEX-Verfahrens, einer Aufreinigung unterzogen werden. Bevorzugterweise erfolgt diese Aufreinigung durch Gelreinigung.Surprisingly the present inventor further determined that the method according to the invention when using the short FNA library without purification steps carried out and only the transcription products, before their further Use in a next Selection round as part of the SELEX process, a purification be subjected. Preferably, this purification is carried out by Gel purification.

Schließlich hat der vorligende Erfinder festgestellt, dass das erfndungsgemäße Verfahren generell zur Identifizierung von Zielmolekül-bindenden FNA-Nukleinsäuren führt.Finally has the present inventor found that the erfndungsgemäße method generally leads to the identification of target-binding FNA nucleic acids.

Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass mittels einer reversen Transkriptase-Aktivität, hierin im folgenden auch als reverse Transkriptase bezeichnet, vollständig modifizierte Oligonukleotide und insbesondere vollständig 2'-F-modizierte Oligonukleotide hergestellt werden können. Dazu wird lediglich ein Revers-komplementärer Gegenstrang der zu synthetisierenden Sequenz aus RNA oder DNA oder 2'-Amino-modifizierter Nukleinsäure oder FNA, d. h. 2'-Fluoro-modifizierte Nukleinsäure, oder aus einem Gemisch aus diesen und ein geeigneter Primer für die FNA-Synthese benötigt, der an den Gegenstrang hybridisieren kann und hierin auch als Forward-Synthese-Primer oder FS-Primer bezeichnet wird. Sollen während des Selektionsschritt im Rahmen des beschriebenen Verfahrens Zielmolekül-bindende Nukleinsäure mit Amplifikationssequenzen verwendet werden, ist dieser Primer ebenfalls aus FNA. Alternativ kann während des Selektionsschritts mit Zielmolekülbindenden Nukleinsäure ohne Amplifikationssequenzen gearbeitet werden. Zur Synthese dieser Nukleinsäuren wird ein FS-Primer aus RNA oder auch ein in seiner Sequenz identischer Primer aus DNA benutzt werden, dessen 3'-terminales Nukleotid ein Ribonukleotid ist, das nach der FNA-Synthese durch RNasen oder alkalische Hydrolyse zerstört wird. Optional kann der Primer weitere Ribonukleotidbausteine beinhalten.The present inventors have surprisingly found that by means of a reverse transcriptase activity, herein hereinafter also referred to as reverse transcriptase, fully modified Oligonucleotides and in particular completely 2'-F-modified oligonucleotides produced can be. For this purpose, only a reverse-complementary strand of the to be synthesized Sequence of RNA or DNA or 2'-amino-modified nucleic acid or FNA, d. H. 2'-Fluoro-modified Nucleic acid, or a mixture of these and a suitable primer for FNA synthesis needed which can hybridize to the opposite strand and herein also as a forward synthesis primer or FS primer is called. Should during the selection step as part of the method described target molecule-binding nucleic acid with Amplification sequences are used, this primer is also from FNA. Alternatively, during of the selection step with target-binding nucleic acid without Amplification sequences are worked. For the synthesis of these nucleic acids is an FS primer from RNA or a primer identical in its sequence be used from DNA whose 3'-terminal Nucleotide is a ribonucleotide that after FNA synthesis by RNases or alkaline hydrolysis is destroyed. Optionally, the Primer further Ribonukleotidbausteine include.

Den unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Zielmolekülbindenden Nukleinsäuren ist dabei eigen, dass es sich infolge der Modifikation um nuklease- resistente Nukleinsäuren handelt, was für deren Anwendung in biologischen Systemen oder Prozessen besonders vorteilhaft ist. Unter biologischen Systemen werden hierin in besonderen Ausführungsformen unter anderem verstanden: Reaktionsansätze mit biologischem Material, Zell-, Gewebe- und Organaufschlüsse, Zellen, Gewebe, Organe und Organismen, einschließlich aber nicht darauf beschränkt einzellige und mehrzellige Organismen, Menschen, Tieren und Pflanzen und Proben davon.The produced using the method according to the invention Target molecule-binding nucleic acids is peculiar that, as a result of the modification, it resistant nucleic acids is acting for what their application in biological systems or processes especially is advantageous. Biological systems are used herein in particular embodiments understood among other things: reaction approaches with biological material, Cell, tissue and organ reveals, Cells, tissues, organs and organisms, including but not limited to unicellular and multicellular organisms, humans, animals and plants and samples from that.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch dessen Implementation in den sog. SELEX-Prozess, wie er beispielsweise in dem europäischen Patent EP 533 838 beschrieben ist. Somit ist es unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von Nukleinsäuren möglich, mit dem SELEX-Prozess ein Zielmolekül bindende Oligonukleotide, nukleaseresistente Aptamere und Ribozyme zu generieren, die vollständig aus 2'-modifizierten Nukleotiden bestehen. Dies verlängert ihre Lebensdauer in Milieus, die RNasen und DNasen enthalten, wie z.B. biologischen Flüssigkeiten, und ermöglicht eine Erweiterung ihrer Einsatzmöglichkeiten, beispielsweise längere Halbwertszeit im Blut und anderen biologischen Flüssigkeiten, im Magen-Darm-Trakt, in Zellen und Geweben.The inventive method also allows its implementation in the so-called. SELEX process, as for example in the European patent EP 533 838 is described. Thus, using the method according to the invention for synthesizing nucleic acids, it is possible to use the SELEX process to generate a target molecule-binding oligonucleotides, nuclease-resistant aptamers and ribozymes which consist entirely of 2'-modified nucleotides. This prolongs their life in environments containing RNases and DNases, such as biological fluids, and allows their uses to be extended, such as longer half-life in the blood and other biological fluids, in the gastrointestinal tract, in cells and tissues.

Insgesamt erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Herstellung von Zielmolekülbindenden Nukleinsäuren mit bzw. aus modifizierten Nukleosidphosphaten, insbesondere 2'-F-modifizierten Nukleosidphosphaten, wobei der Anteil an Abbruchprodukten sehr gering ist bei einem sehr hohen Anteil an Vollängenprodukten. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren ist darin zu sehen, dass die Mutationsrate gering ist und sie den Einbau aller und nicht nur einzelner modifizierter Nukleotide erlauben.Overall, the inventive method allows the production of target-binding nucleic acids with or from modified nucleoside phosphates, in particular 2'-F-modified Nukleosidphos phate, wherein the proportion of demolition products is very low with a very high proportion of full-length products. A further advantage of the methods according to the invention is that the mutation rate is low and they allow the incorporation of all and not only individual modified nucleotides.

Obwohl die Ausführung hierin insbesondere am Beispiel der Verwendung von 2'-Fluoro-modifizierten Nukleosidphosphate dargestellt wurden, sind die Verfahren gemäß der vorlie- genden Erfindung nicht auf diese beschränkt, sondern sind grundsätzlich auf alle hierin beschriebenen modifizierten Nukleosidphosphate anwendbar.Even though execution herein in particular using the example of the use of 2'-fluoro-modified nucleoside phosphates are the methods of the present invention not limited to this, but are basically to all modified nucleoside phosphates described herein.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten reversen Transkriptasen sind dabei in bevorzugten Ausführungsformen RNA-abhängige reverse Transkriptasen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch in Verbindung mit DNA-Matrizen oder FNA-Matrizen verwendet werden.The in the context of the present invention used reverse transcriptases are in preferred embodiments RNA-dependent reverse transcriptases, within the scope of the present invention also used in conjunction with DNA templates or FNA templates become.

Wie hierin in bevorzugten Ausführungsformen verwendet, bezeichnet der Begriff „reverse Transkriptase" eine jegliche enzymatische Aktivität, die in der Lage ist, ausgehend von einem (+) RNA Strang, der als Templat verwendet wird, einen komplementären (–) DNA Strang zu synthetisieren. Sie ist eine RNA-gerichtete DNA-Polymerasse (Stryer, 1995). Für die Durchführung der hierin offenbarten Verfahren geeignete reverse Transkriptasen sind insbesondere auch jene, wie sie in der nachstehenden Tabelle angegeben sind.As herein in preferred embodiments used, the term "reverse transcriptase" refers to any enzymatic Activity, which is capable of starting from a (+) RNA strand, as Template is used to synthesize a complementary (-) DNA strand. It is an RNA-directed DNA polymerase (Stryer, 1995). For the implementation of Methods disclosed herein are suitable reverse transcriptases especially those as indicated in the table below are.

Figure 00550001
Figure 00550001

Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass auch DNA-Polymerasen, sofern sie die in den Verfahren erforderliche enzymatische Aktivität, d.h. insbesondere die Aktivität einer reversen Transkriptase, aufweisen, im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Derartige DNA-Polymerasen sind beispielsweise bakterielle DNA-Polymerasen mit reverser Transkriptase-Aktivität wie beispielsweise die in der obigen Tabells angeführten Enzyme von Thermus thermophilus und Carboxyhydrothermus hydrogenofor mans. Weitere besonders bevorzugte reverse Transkriptasen sind solche, welche keine RNA-seH-Aktivität aufweisen.there It is within the scope of the present invention that also DNA polymerases, provided that they provide the enzymatic activity required in the processes, i. especially the activity a reverse transcriptase, in the context of the inventive method can be used. Such DNA polymerases are for example bacterial DNA polymerases with reverse Transcriptase activity such as the enzymes listed in the above table by Thermus thermophilus and carboxyhydrothermal hydrogenofor mans. Further particularly preferred reverse transcriptases are those which have no RNA seH activity.

Hinsichtlich der Verwendung der verschiedenen hierin offenbarten reversen Transkriptasen ist anzumerken, dass Mischungen der einzelnen reversen Transkriptasen verwendet werden können. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die einzelne reverse Transkriptase in ihrer Wildtyp-Form oder in mutierter Form oder einer Mischung davon entweder alleine oder mit einer oder mehreren anderen reversen Transkriptasen, sei es in der Wildtyp-Form, in einer mutierten Form oder einer Mischung davon, verwendet werden.Regarding the use of the various reverse transcriptases disclosed herein It should be noted that mixtures of the individual reverse transcriptases can be used. It is within the scope of the present invention that the individual reverse transcriptase in its wild-type or mutated form or a mixture thereof either alone or with one or more other reverse transcriptases, whether in the wild-type form, in a mutated form or a mixture thereof.

Wie hierin verwendet, bezeichnet die Begrifflichkeit „im Wesentlichen" im Zusammenhang mit der Beschreibung einer Nukleinsäure, die im Wesentlichen aus einer bestimmten Spezies von Nukleosidphosphaten besteht, in einer Ausführungsform dass die jeweilige Nukleinsäure vollständig aus den jeweiligen Nukleosidphosphaten bestehen kann, aber auch in bestimmtem Umfang andere Nukleosidphosphate, beispielsweise solche, die eine andere oder keine Modifikation aufweisen, in der Nukleinsäure enthalten sein können. Beispiele dafür, dass eine bestimmte Nukleinsäure aus lediglich im Wesentlichen bestimmten modifizierten Nukleosidphosphaten besteht, können dadurch begründet werden, dass die Ausgangsmaterialien, d. h. die einzelnen eingesetzten Nukleosidphosphate infolge Verunreinigungen nicht in einem jeden Falle die entsprechende Modifikation aufweisen. Darüber hinaus ist es im Rahmen der Kenntnisse des Fachmanns auf dem Gebiet zu bestimmten, wie umfangreich der Gehalt an jenen Nukleosidphosphaten in einer Nukleinsäure vorhanden sein dürfen, die verschieden sind von der Mehrzahl der in der Nukleinsäure enthaltenen modifizierten Nukleosidphosphaten.As used herein, the terminology "substantially" in the context of describing a nucleic acid consisting essentially of a particular species of nucleoside phosphates, in one embodiment, denotes that the particular nucleic acid may consist entirely of the particular nucleoside phosphates, but also to a limited extent Other nucleoside phosphates, for example those which have a different or no modification, may be present in the nucleic acid Examples of the fact that a particular nucleic acid consists of only substantially certain modified nucleoside phosphates may be justified by the fact that the starting materials, ie the individual ones used Nucleoside phosphates due to impurities in each case the corresponding Mo have difikation. In addition, it is within the knowledge of those skilled in the art to determine how much the content of those nucleoside phosphates may be present in a nucleic acid other than the majority of the modified nucleoside phosphates contained in the nucleic acid.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können die Nukleosidtriphosphate alle modifiziert sein oder nur jeweils eine Spezies oder auch ein bestimmter Anteil einer einzelnen Spezies modifiziert sein oder mehrere Spezies anteilig modifiziert sein. Bevorzugte Nukleosidtriphosphate sind dabei 2'-F-ATP, 2'-F-CTP, 2'-F-GTP, 2'-F-TTP und 2'-F-UTP sowie das Nukleosidtriphosphat der Universalbase Inosin 2'-F-ITP. Diese können beliebig gegen 2'-dNTPs ausgetauscht werden.in the In connection with the present invention, the nucleoside triphosphates all be modified or only one species or one be modified or certain proportion of a single species several species may be proportionally modified. Preferred nucleoside triphosphates are 2'-F-ATP, 2'-F-CTP, 2'-F-GTP, 2'-F-TTP and 2'-F-UTP and the Nucleoside triphosphate of the universal base inosine 2'-F-ITP. These can be exchanged for any 2'-dNTPs.

Der grundsätzliche Ablauf der Amplifikationsreaktion bei Verwendung von kurzen DNA-Bibliotheken ohne Amplifikationssequnezen, bestehend aus Kinasierung, 5'-Ligation von Adaptermolekülen, 3'-Ligation von Adaptermolekülen, reverser Transkription, optionaler Zweitstrangsynthese, optionaler PCR, Transkription, FNA-Synthse und die Verkürzung des Produkts der FNA-Synthesedurch alkalische Hydrolyse ist in 18 auf der linken Seite in der Einbindung in eine Selektionsrunde des SELEX-Verfahrens dargestellt. Der grundsätzliche Ablauf der Amplifikationsreaktion bei Verwendung von langen FNA-Bibliotheken mit Amplifikationssequenzen, bestehend aus, reverser Transkription, optionaler Zweitstrangsynthese, optionaler PCR, Transkription, FNA-Synnthese und alkalischer Hydrolyse ist in 18 auf der rechten Seite dargestellt. Die optionale Zweitsstrangsysnthese und die optionale PCR werden in den beiden Varianten mit den gleichen Primern durchgeführt, so dass das Transkriptionsausgangsprodukt nach diesen Schritten der Reaktionsabfolge identsich ist. Die Verwendung der geeigneten RNA-Polymerase in der Transkriptionsreaktion und die folgende Verkürzung der FNA-Synthese ermöglicht die Herstellung einer kurzen FNA-Bibliothek, wie beispielhaft in 18 dargestellt.The basic sequence of the amplification reaction using short DNA libraries without Amplifikationssequnezen consisting of kinase, 5'-ligation of adapter molecules, 3'-ligation of adapter molecules, reverse transcription, optional second-strand synthesis, optional PCR, transcription, FNA synthesis and the truncation of the product of the FNA synthesis by alkaline hydrolysis is in 18 on the left side in the integration into a selection round of the SELEX process. The basic sequence of the amplification reaction using long FNA libraries with amplification sequences consisting of, reverse transcription, optional second-strand synthesis, optional PCR, transcription, FNA synthesis and alkaline hydrolysis is described in U.S. Pat 18 shown on the right. The optional second-strand synthesis and optional PCR are carried out in the two variants with the same primers so that the transcriptional starting product after these steps in the reaction sequence is identical. The use of the appropriate RNA polymerase in the transcription reaction and the consequent shortening of the FNA synthesis allows for the production of a short FNA library, as exemplified in US Pat 18 shown.

Zunächst wird, wie beispielhaft in 18 dargestellt, eine Bibliothek einzelsträngiger FNA, beispielsweise durch eine Oligonukleotidsynthese, oder eine durch den vorhergehenden Selektionsschritt angereicherte Bibliothek einzelsträngiger FNA bereitgestellt. Das Design der Bibliotheken erlaubt es während der Selektion sowohl mit einer kurzen Bibliothek oder einer üblicherweise verwendeten, langen Bibliothek zu arbeiten. Beiden Bibliotheken sind in ihrem randomisierten Bereich und in der fixierten Teilsequenz identisch. Der randomisierte Bereich umfasst in der Regel einen definiert ausgewählten Sequenzraum. Die 5'- und 3'- terminalen Teilsequenzen sind so ausgewählt, dass sie eine Helix von je 7 miteinander hybridisierenden Nukleotiden ausbildet. Der lange Bibliothek umfasst zusätzlich die Sequenzen für die nach dem Selektionschritt folgenden Reaktionen wie die PCR, in vitro Transkription und reverse Transkription. Der kurzen Bibliothek fehlen diese Sequenzen. Sie werden vor den Amplifikationsreaktionen mittels einer matrixunterstützten Ligation am 5'- und am 3'-Ende angefügt. Um diese Ligation zu ermöglichen, sind am 5'-Ende mindestens zwei freie, nicht an der Helix beteiligte Nukleotide nötig.First, as exemplified in 18 , provided a library of single-stranded FNA, for example, by oligonucleotide synthesis, or a single-stranded FNA library enriched by the previous selection step. The design of the libraries allows to work with both a short library or a commonly used, long library during selection. Both libraries are identical in their randomized area and in the fixed partial sequence. The randomized area usually includes a defined sequence space. The 5 'and 3' terminal partial sequences are selected such that they form a helix of 7 mutually hybridizing nucleotides. The long library additionally comprises the sequences for the reactions following the selection step, such as PCR, in vitro transcription and reverse transcription. The short library lacks these sequences. They are added before the amplification reactions by means of a matrix-assisted ligation at the 5 'and at the 3' end. To facilitate this ligation, at least two free nucleotides not involved in the helix are needed at the 5 'end.

Falls die im Selektionschritt isolierte kurze FNA-Bibliothek noch keine 5'-terminalen Monophosphate trägt, müssen diese angefügt werden, wie beispielhaft in 19 dargestellt. Die Reaktion erfolgt bevorzugterweise in Ligase-Puffer (Fermentas T4-DNA Ligase-Puffer) unter Zugabe von ATP und T4 Polynukleotidkinase (Invitrogen).If the short FNA library isolated in the selection step does not yet carry any 5'-terminal monophosphates, these must be added as exemplified in US Pat 19 shown. The reaction is preferably carried out in ligase buffer (Fermentas T4 DNA ligase buffer) with the addition of ATP and T4 polynucleotide kinase (Invitrogen).

Zu dem Reaktionsansatz der 5'-Phosphorylierung aus 19 werden, wie beispielhaft in 20 dargestellt, nach Ablauf der Reaktionszeit, beispielsweise 45 min, 37°C, zwei doppelsträngige DNA-Adapter hinzugefügt. Die Adapter zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine überhängende Ligationsmatrix tragen, welche zu einem Teil der fixierten Teilsequenzen der Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen komplementär ist. Das Reverse Ligat, also der erste Strang des zweiten Adaptermoleküls, ist 5'-phosphoryliert, um die Ligation an das 3'-Ende der FNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen zu ermöglichen (das 5'-Phosphat kann gleich bei der Oligonukleotidsynthese angefügt werden). Die Reverse Matrix, die identisch ist mit dem Reverse-Primer in der reversen Transkription und der Zweitstrangsynthese/PCR, zeichnet sich überdies dadurch aus, dass sie zwei, hintereinanderliegende, starke Promotorsequenzen für RNA-Polymerasen enthält (siehe 23). Beispielsweise die T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase-Promotoren. Der Promotoren sind so angeordnet, dass, je nachdem welche der zu den beiden Promotoren zugehörige RNA-Polymerase verwendet wird,

  • a) – der Verwendung der T3 Polymerase – das Transkriptionsprodukt am 5'-Ende den T7 Promotorbereich enthält, um als Templat für die reverse Transkription zur Herstellung einer langen FNA-Bibliothek zu dienen.
  • b) – der Verwendung der T7 Polymerase – das Transkriptionsprodukt am 5'-Ende mit der einen fxierten Teilsequenz zu beginnen, um als Templat für die reverse Transkription zur Herstellung einer kurzen FNA-Bibliothek zu dienen
To the reaction of 5'-phosphorylation 19 be as exemplified in 20 shown at the end of the reaction time, for example, 45 min, 37 ° C, two double-stranded DNA adapter added. The adapters are characterized by the fact that they carry an overhanging ligation matrix, which is complementary to a part of the fixed part sequences of the library without amplification sequences. The reverse ligate, that is, the first strand of the second adapter molecule, is 5'-phosphorylated to allow ligation to the 3 'end of the FNA library without amplification sequences (the 5'-phosphate can be readily added in oligonucleotide synthesis). The reverse matrix, which is identical to the reverse primer in the reverse transcription and the second strand synthesis / PCR, is further distinguished by the fact that it contains two, one after the other, strong promoter sequences for RNA polymerases (see 23 ). For example, the T7, T3 or SP6 RNA polymerase promoters. The promoters are arranged so that, depending on which of the two promoters associated RNA polymerase is used,
  • a) - the use of T3 polymerase - the transcription product at the 5 'end contains the T7 promoter region to serve as a template for the reverse transcription to produce a long FNA library.
  • b) - the use of T7 polymerase - to start the transcription product at the 5 'end with the one fxierten subsequence to serve as a template for the reverse transcription to produce a short FNA library

Die Forward Matrix und das Reverse Ligat, d.h. der zweite Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküles und der erste Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls können am jeweiligen 3'-Ende blockiert sein, um unerwünschte Ligationsprodukte und Mispriming in der PCR dieser Konstrukte zu verhindern. Dies ist insbesondere bei der Amplifikation von Nukleinsäurebibliotheken nützlich, da in diesem Fall häufig zu diesen Sequenzen komplementäre Sequenzen irgendwo im randomisierten Bereich, d.h. beispielsweise in der Zwischensequenz auftreten können. Die Blockierung kann so aussehen, dass das 3'-terminale Nukleotid ein 3'-Desoxynukleotid ist. In unserem Falle ist es ein 2'-3'-Didesoxynukleotid.The Forward matrix and the reverse ligate, i. the second nucleic acid strand of the first adapter molecule and the first nucleic acid strand of the second adapter molecule can at the respective 3'-end be blocked to unwanted Ligation products and Mispriming in the PCR of these constructs too prevent. This is especially true in the amplification of nucleic acid libraries useful, because in this case often complementary to these sequences Sequences somewhere in the randomized area, i. for example can occur in the cutscene. The blocking can look like that the 3'-terminal Nucleotide is a 3'-deoxynucleotide. In our case it is a 2'-3'-dideoxynucleotide.

Nach Zugabe der Ligase (z. B. T4 DNA-Ligase von Fermentas) erfolgt die Ligation der Amplifikationssequenzen (Forward Ligat und Reverse Ligat) innerhalb von 2–12 h bei 16°C.To Addition of the ligase (eg T4 DNA ligase from Fermentas) takes place Ligation of Amplification Sequences (Forward Ligate and Reverse Ligate) within 2-12 h at 16 ° C.

Nach der Ligation der Amplifikationssequenzen an die kurze FNA-Bibliothek aus 20, wird die FNA unter Verwendung des Reverse Primers in DNA (cDNA) umgeschrieben und kann dann mittels PCR amplifiziert werden, wie beispielhaft in 21 dargestellt. Es ist keine Aufreinigung zwischen den Reaktionsschritten Ligation, reversen Transkription und PCR nötig. In die PCR werden die noch fehlenden Primer, dNTPs, PCR-Puffer, und eine thermostabile DNA-Polymerase (z.B. Taq DNA-Polymerase) hinzugefügt. Der Forward Primer entspricht dabei dem Forward-Ligat oder einem Teil davon, kann er optional an seinem 3'-Ende um die definierte Teilsequenz am 5'-Ende der zu amplifizierenden FNA erweitert sein und wird hierin auch als PCR-Primermolekül bezeichnet. Der Reverse Primer enstpricht der Reverse Matrix und enthält die Sequenzen für den T3 und den T7 RNA-Polymerase Promotor.After ligation of the amplification sequences to the short FNA library 20 , the FNA is rewritten into DNA (cDNA) using the reverse primer and can then be amplified by PCR, as exemplified in 21 shown. There is no need for purification between the ligation, reverse transcription and PCR reaction steps. In the PCR, the missing primer, dNTPs, PCR buffer, and a thermostable DNA polymerase (eg Taq DNA polymerase) are added. The forward primer corresponds to the forward ligate or a part thereof, it may optionally be extended at its 3 'end by the defined partial sequence at the 5' end of the FNA to be amplified and is also referred to herein as PCR primer molecule. The reverse primer corresponds to the reverse matrix and contains the sequences for the T3 and the T7 RNA polymerase promoter.

Statt der PCR kann auch eine Zweitstrangsynthese, z.B. mit Klenow- oder Stoffel-Fragment, durchgeführt werden, wobei hierin eine PCR auch als Zweitstrangsynthese bezeichneet wird.Instead of the PCR can also be a second strand synthesis, e.g. with Klenow or Stoffel fragment, performed in which a PCR is also referred to as a second-strand synthesis becomes.

Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden.The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead can also be continued directly with the in vitro transcription.

Weisen die im Selektionschritt isolierten Zielmolekül-bindenden FNA-Nukleinsäuren die fixierten Teilsequenzen, den randomisierten Bereich und die Amplifikationssequenzen auf, kann die FNA direkt in der reversen Transkription unter Verwendung des Reverse Primers in DNA umgeschrieben und dann mittels PCR amplifiziert werden, wie beispielhaft in 22 dargestellt. In die PCR werden dazu die Primer, dNTPs, PCR-Puffer, und eine thermostabile DNA-Polymerase (z.B. Taq DNA-Polymerase) hinzugefügt. Der Forward Primer kann optional an seinem 3'-Ende um die definierte Teilsequenz am 5'-Ende des randomiserten Bereichs zu amplifizierenden FNA erweitert sein und wird hierin auch als PCR-Primermolekül bezeichnet. Der Forward und Reverse Primer sind identisch mit denen, die für die PCR der; durch Ligation um die Amplifikationsequenzen verlängerten, kurzen Bibliothek verwendet werden, wie auch beispielhaft in 21 dargestellt.If the target-molecule-binding FNA nucleic acids isolated in the selection step have the fixed partial sequences, the randomized region and the amplification sequences, the FNA can be directly transcribed into DNA using the reverse primer in reverse transcription and then amplified by PCR, as exemplified in US Pat 22 shown. For this purpose, the primers, dNTPs, PCR buffers, and a thermostable DNA polymerase (eg Taq DNA polymerase) are added to the PCR. The forward primer may optionally be extended at its 3 'end by the defined partial sequence at the 5' end of the randomized region to be amplified FNA and is also referred to herein as the PCR primer molecule. The forward and reverse primers are identical to those used for PCR; by ligation around the amplification sequences extended short library, as well as exemplified in 21 shown.

Statt der PCR kann auch eine Zweitstrangsynthese, z.B. mit Klenow- oder Stoffel-Fragment, durchgeführt werden, wobei hierin eine PCR auch als Zweitstrangsynthese bezeichneet wird.Instead of the PCR can also be a second strand synthesis, e.g. with Klenow or Stoffel fragment, performed in which a PCR is also referred to as a second-strand synthesis becomes.

Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden.The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead can also be continued directly with the in vitro transcription.

Die Produkte der Ligation oder der optionalen PCR oder der optionalen Zweitstrangsynthese werden nun durch eine in vitro Transkription, z.B. mit T3/T7/SP6 RNA-Polymerase (Stratagene, Ambion oder andere) in RNA umgeschrieben, wie beispielhaft in 23 dargestellt. Ein Strang liefert etwa 20–100 RNA-Kopien. Außerdem werden Puffer und NTPs benötigt. Falls genug PCR-Produkt vorhanden ist, bedarf auch dieser Schritt keiner Aufreinigung. Es können bis zu 20 % (v/v) PCR-Produkt/Zweitstrangsynthese in die Transkription eingesetzt werden. Wird direkt der Ligationsansatz verwendet, kann bis zu 40 % (v/v) eingesetzt werden.The products of ligation or optional PCR or optional second strand synthesis are now transcribed into RNA by in vitro transcription, eg, with T3 / T7 / SP6 RNA polymerase (Stratagene, Ambion, or others), as exemplified in U.S. Pat 23 shown. One strand provides about 20-100 RNA copies. In addition, buffers and NTPs are needed. If enough PCR product is available, this step also needs no purification. Up to 20% (v / v) PCR product / second strand synthesis can be used in the transcription. If the ligation mixture is used directly, up to 40% (v / v) can be used.

Der in der reversen Transkription und Zweitsstrangssynthese/PCR verwendete Reverse-Primer, in der Ligation auch als Reverse Matrix eingesetzt, zeichnet sich dadurch aus, dass er zwei hintereinanderliegende, starke Promotorsequenzen für RNA-Polymerasen enthält. Beispielsweise die T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerse-Promotoren. Hier sind der T7 und der T3 Promotor dargestellt. Die Promotoren sind so angeordnet, dass je nachdem welche der zu den beiden Promotoren zugehörige RNA-Polymerse verwendet wird, die Transkription mit der defnierten Teilsequenz am 3'-Ende eines jeden zu amplifizierenden FNA-Stranges (wenn die T7 Polymerase verwendet wird) oder zusätzlich zu dieser definierten Teilsequenz die an diese definierte Teilsequenz anschließende dem T7 Promotor komplementäre Sequenz (wenn die T3 Polymere verwendet wird) beginnt. Um also eine lange Bibliothek für die nächste Selektionsrunde zu erhalten, wird die T3 Polymerase verwendet. Das entstehende Transkriptionsprodukt ist um die T3 Promotorsequenz verkürzt und enthält somit an seinem 5'-Ende die T7 Promotorsequenz. Soll in die Selektionsrunde eine kurze Bibliothek verwendet werden, so wird die T7 Polymerase verwendet. Das Transkriptionsprodukt liegt dann folglich – im Gegensatz zum Transkriptionsausgangsprodukt – um den T3 und den T7 Promotorbereich verkürzt vor.The reverse primer used in reverse transcription and second strand synthesis / PCR, also used as reverse matrix in the ligation, is characterized in that it contains two strong promoter sequences for RNA polymerases lying one behind the other. For example, the T7, T3 or SP6 RNA polymerase promoters. Here are the T7 and the T3 promoter shown. The promoters are arranged so that, depending on which of the RNA polymers belonging to the two promoters is used, transcription with the defned partial sequence at the 3 'end of each FNA strand to be amplified (if the T7 polymerase is used) or additionally to this defined partial sequence, the T7 promoter complementary sequence subsequent to this defined partial sequence (when the T3 polymers is used) begins. So to get a long library for the next round of selection, the T3 polymerase is used. The resulting transcription product is truncated by the T3 promoter sequence and thus contains at its 5 'end of the T7 promoter sequence. If a short library is to be used in the selection round, the T7 polymerase is used. The transcription product is then - in contrast to the transcriptional starting product - shortened by the T3 and the T7 promoter region.

Die RNA-Moleküle, des mit der T7 Polymerase transkribierten Ausgangsproduktes aus 23, werden anschließend unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, der mindestens ein Ribonukleotid direkt 5' von der fixierten Teilsequenz an seinem 3'-Enden enthält, sowie mit Puffer, FNTPs und Reverser Transkriptase, z.B. Superscript II (Gibco Life Technologies), in komplementäre FNA überführt werden, wie beispielhaft in 24 dargestellt. Die Sequenzen der erhaltenen FNA entsprechen den zu amplifizierenden FNA-Strängen und enthalten die fixierten Teilsequenzen, den randomisierten Bereich zuzüglich der Amplifikationssequenz am 5'-Ende.The RNA molecules of the transcribed with the T7 polymerase starting product 23 "are then ligated into complementary FNA with the addition of a forward synthesis primer containing at least one ribonucleotide directly 5 'to the fixed partial sequence at its 3' ends, as well as Buffer, FNTPs and reverse transcriptase eg Superscript II (Gibco Life Technologies) be converted as exemplified in 24 shown. The sequences of the FNA obtained correspond to the FNA strands to be amplified and contain the fixed partial sequences, the randomized region plus the amplification sequence at the 5 'end.

Die Bereiche des Forward Synthese Primers, die 5' vor der fixierten Teilsequenz liegen, werden nun durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen (310 mM NaOH, 95°C, 10 min als beispielhafte Reaktionsbedingungen) abgespalten. Gleichzeitig werden die RNA-Stränge verdaut. Falls weitere Ribonukleotide in den Forward Synthese Primer inkorporiert wurden, wird dieser in mehrere Teile zerfallen, die dann bei Ethanolfällung mit linearem Polyacrylamid als Carrier im Überstand verbleiben (beschrieben bei Gaillard C, Strauss F: Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Ebenfalls möglich ist eine Aufreinigung über ein geeignetes Molekularsieb (z.B. Microcon YM 10 von Amicon/Millipore). Falls eine Gelreinigung der FNA durchgeführt wird, würden die Primerbruchstücke nicht mit dem längeren FNA-Strang co-migrieren.The Areas of the Forward Synthesis Primer 5 'before the fixed part sequence, are now by addition of lye and optionally heating (310 mM NaOH, 95 ° C, 10 min as exemplary reaction conditions). simultaneously become the RNA strands digested. If more ribonucleotides in the forward synthesis primer This will be divided into several parts, the then with ethanol precipitation with remain linear polyacrylamide as a carrier in the supernatant (described at Gaillard C, Strauss F: Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Also possible is a purification over a suitable molecular sieve (e.g., Microcon YM 10 ex Amicon / Millipore). If a gel purification of the FNA is performed, the primer fragments would not with the longer FNA strand co-migrate.

Bevorzugterweise wird vor einer Fällung oder einer weiteren Reinigung der Ansatz der alkalischen Spaltung zunächst mit HCl, NaOAc, oder NH4OAc auf den gewünschten pH-Wert (z.B. pH 5,3) eingestellt. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen.Preferably, prior to precipitation or further purification, the alkaline cleavage approach is first adjusted to the desired pH (eg, pH 5.3) with HCl, NaOAc, or NH 4 OAc. This completes the amplification cycle.

Die RNA-Moleküle, des mit der T3 Polymerase transkribierten Ausgangsproduktes aus 23, werden anschließend unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, der aus FNA besteht, sowie Puffer, FNTPs und Reverser Transkriptase, z.B. Superscript II (Gibco Life Technologies), in komplementäre FNA überführt werden, wie beispielhaft in 25 dargestellt. Die Sequenzen der erhaltenen FNA entsprechen den zu amplifizierenden FNA-Strängen umfassend die fixierten Teilsequenzen, den randomisierten Bereich zuzüglich der Amplifikationssequenzen am 5'- und 3'-Ende.The RNA molecules of the transcribed with the T3 polymerase starting product 23 , are then converted into complementary FNA by addition of a forward synthesis primer consisting of FNA, as well as buffers, FNTPs and reverse transcriptase, eg Superscript II (Gibco Life Technologies), as exemplified in US Pat 25 shown. The sequences of the FNA obtained correspond to the FNA strands to be amplified comprising the fixed partial sequences, the randomized region plus the amplification sequences at the 5 'and 3' ends.

Die RNA-Stränge werden nun durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen (310 mM NaOH, 95°C, 10 min als beispielhafte Reaktionsbedingungen) verdaut. Die enstehenden Ribonukleotide können durch Ethanolfällung mit linearem Polyacrylamid als Carrier abgetrennt werdeb, da sie im Überstand verbleiben (beschrieben bei Gaillard C, Strauss F: Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Ebenfalls möglich ist eine Aufreinigung über ein geeignetes Molekularsieb (z.B. Microcon YM 10 von Amicon/Millipore). Um überschüssige, nicht in den FNA Strang eingebaute Forward Synthese Primer abzutrennen, kann eine Gelreinigung der FNA durchgeführt werden. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen.The RNA strands are now by addition of lye and optionally heating (310 mM NaOH, 95 ° C, 10 min as exemplary reaction conditions). The resulting Ribonucleotides can by ethanol precipitation separated with linear polyacrylamide as a carrier, since they in the supernatant remain (described by Gaillard C, Strauss F: ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier. Nucleic Acids Res (1990), 18: 378). Also possible is a purification over a suitable molecular sieve (e.g., Microcon YM 10 ex Amicon / Millipore). To excess, not to separate into the FNA strand built forward synthesis primer a gel purification of the FNA can be performed. This is the amplification cycle closed.

Die Erfindung wird anhand der Figuren und Beispiele sowie des Sequenzprotokolls weiter erläutert werden, aus denen sich weitere Aspekte, Merkmale, Ausführungsformen, Anwendungen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigtThe Invention will be with reference to the figures and examples and the sequence listing be explained further, which gives further aspects, features, embodiments, applications and Advantages of the invention result. It shows

1 Eine schematische Darstellung der durch das Verfahren bereitgestellten – kurzen oder langen – RNA oder DNA-Bibliotheken, deren Bindung an das Zielmolekül allein durch die fixierten Teilsequenzen und den randomisierten Bereich gewährleistet werden sol; 1 A schematic representation of the provided by the process - short or long - RNA or DNA libraries whose binding to the target molecule only by the fixed part sequences and the randomized area should be guaranteed;

2 Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen eines SELEX-Verfahrens, beginnend mit der aus der vorherigen Selektionsrunde gewonnenen RNA; 2 Flowchart of the method according to the invention in the context of a SELEX method, starting with the RNA obtained from the previous round of selection;

3 ein Reaktionsschema für die Ligation von Transkripten der kurzen RNA-Bibliothek mit 3'-Mikroheterogenitäten; 3 a reaction scheme for the ligation of transcripts of the short RNA library with 3 'microheterogeneities;

4 ein Reaktionsschema für die reverse Transkription der lierten kurzen RNA-Bibliothek; 4 a reaction scheme for the reverse transcription of the assembled short RNA library;

5 ein Reaktionsschema für die reverse Transkription der langen RNA-Bibliothek; 5 a reaction scheme for reverse transcription of the long RNA library;

6 ein Reaktionsschema für die PCR der langen und kurzen RNA-Bibliothek; 6 a reaction scheme for PCR of the long and short RNA library;

7 ein Reaktionsschema für die optionale alkalische Hydrolyse und in vitro Transkription der langen und kurzen RNA-Bibliothek; 7 a reaction scheme for the optional alkaline hydrolysis and in vitro transcription of the long and short RNA library;

8 Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen eines SELEX-Verfahrens, beginnend mit der aus der vorherigen Selektionsrunde gewonnenen DNA; 8th Flowchart of the method according to the invention in the context of a SELEX method, starting with the DNA obtained from the previous round of selection;

9 ein Reaktionsschema für die Kinasierung der DNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen; 9 a reaction scheme for the kinasing of the DNA library without amplification sequences;

10 ein Reaktionsschema für die Ligation der kinasierten kurzen DNA-Bibliothek; 10 a reaction scheme for the ligation of the kinased DNA short library;

11 ein Reaktionsschema für die PCR der kurzen DNA-Bibliothek; 11 a reaction scheme for PCR of the short DNA library;

12 ein Reaktionsschema für die PCR der langen DNA-Bibliothek; 12 a reaction scheme for PCR of the long DNA library;

13 ein Reaktionsschema für die in vitro Transkription der kurzen und langen DNA-Bibliothek; 13 a reaction scheme for in vitro transcription of the short and long DNA library;

14 ein Reaktionsschema für die reverse Transkription der kurzen DNA-Bibliothek und der Verkürzung der cDNA durch alkalische Hydrolyse; 14 a reaction scheme for the reverse transcription of the short DNA library and the shortening of the cDNA by alkaline hydrolysis;

15 ein Reaktionsschema für die reverse Transkription der langen DNA-Bibliothek; 15 a reaction scheme for the reverse transcription of the long DNA library;

16 zeigt die Ligation der kurzen Bibliothek unter der Verwendung der beschriebenen Adaptermoleküle (nähere Beschreibung siehe in Beispiel 1) 16 shows the ligation of the short library using the adapter molecules described (see description in Example 1 for further details)

17 zeigt den Einfluß der Promotoren von T3 und der T7 RNA Polymerase auf die Transkriptionsinitiation durch die T3 und T7 RNA-Polymerase (nähere Beschreibung siehe in Beispiel 2) 17 shows the influence of the promoters of T3 and the T7 RNA polymerase on the transcription initiation by the T3 and T7 RNA polymerase (for further description see Example 2)

18 Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen eines SELEX-Verfahrens, beginnend mit der aus der vorherigen Selektionsrunde gewonnenen FNA; 18 Flowchart of the method according to the invention in the context of a SELEX method, starting with the FNA obtained from the previous round of selection;

19 ein Reaktionsschema für die Kinasierung der FNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen; 19 a reaction scheme for the kinase of the FNA library without amplification sequences;

20 ein Reaktionsschema für die Ligation der kinasierten kurzen FNA-Bibliothek; 20 a reaction scheme for the ligation of the kinased short FNA library;

21 ein Reaktionsschema für die PCR der kurzen FNA-Bibliothek; 21 a reaction scheme for the PCR of the short FNA library;

22 ein Reaktionsschema für die PCR der langen FNA-Bibliothek; 22 a reaction scheme for the PCR of the long FNA library;

23 ein Reaktionsschema für die in vitro Transkription der kurzen und langen FNA-Bibliothek; 23 a reaction scheme for in vitro transcription of the short and long FNA library;

24 ein Reaktionsschema für die FNA-Synthese der kurzen FNA-Bibliothek und der Verkürzung der FNA durch alkalische Hydrolyse; 24 a reaction scheme for the FNA synthesis of the short FNA library and the shortening of the FNA by alkaline hydrolysis;

25 ein Reaktionsschema für die FNA-Synthese der langen FNA-Bibliothek; Im Folgenden werden die verschiedenen Aspekte der Erfindung soweit sie in den Figuren dargestellt sind, unter Bezug auf diese Figuren näher erläutert, wobei die bei den konkreten Verfahren dargestellten Maßnahmen und Merkmale auch für sich und einzeln genommen im Zusammenhang mit den verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die nachfolgenden detaillierten Beschreibungen werden zu Zwecken der Veranschaulichung und nicht der Beschränkung gegeben. 25 a reaction scheme for the FNA synthesis of the long FNA library; In the following, the various aspects of the invention as illustrated in the figures are explained in more detail with reference to these figures, wherein the measures and features illustrated in the specific methods also taken individually and in isolation in connection with the various aspects of the present invention can be. The following detailed descriptions are given for purposes of illustration and not of limitation.

In 1 sind die im Selektionsschritt des hier offenbarten in vitro Selektionprozesses verwendeten Oligonukleotid-Bibliotheken, die sich nur durch die angehängten (lange Bibliothek, rechte Seite) bzw. fehlenenden (kurze Bibliothek, linke Seite) Amplifikationssequenzen un- terscheiden, dargestellt. Beiden Bibliotheken sind in ihrem randomisierter Bereich und in ihren fixierten Teilsequenzen identisch, so dass man von „einer Bibliothek mit 2 Formen" sprechen kann Der randomisierte Bereich umfasst einen definiert ausgewählten Sequenzraum. Die fixierten Teilsequenzen ist so ausgewählt, dass sie eine Helix von je 7 miteinander hybridisierenden Nukleotiden ausbildet. Die lange Bibliothek umfasst zusätzliche Sequenzen für die verwendeten Primer in den nach dem Selektionschritt folgenden Reaktionen wie die reverse Transkription, PCR und in vitro Transkription. Der kurzen Bibliothek fehlen diese Sequenzen. Sie werden vor den Amplifikationsreaktionen mittels einer matrixunterstützten Ligation am 5'- und am 3'-Ende angefügt. Um diese Ligation zu ermöglichen, sind zusätzlich zu den fixierten Teilsequnezen am 5'-Ende zwei freie, nicht an der Helix beteiligte Nukleotide nötig, wobei das 5'-terminale Nukleotid 5'-phosphoryliert vorliegt. Das Design der Bibliotheken erlaubt es somit während der Selektion – z.B. im Wechsel – sowohl mit der kurzen Bibliothek (ohne Amplifikationssequenzen) oder der üblicherweise verwendeten langen Bibliothek (mit Amplifikationssequenzen) zu arbeitenIn 1 For example, the oligonucleotide libraries used in the selection step of the in vitro selection process disclosed herein, which differ only in the appended (long library, right side) and missing (short library, left side) amplification sequences, respectively. Both libraries are identical in their randomized domain and in their fixed subsequences, so that one can speak of "a library of 2 forms." The randomized region comprises a defined sequence space, and the fixed subsequences are selected such that they each have a helix of 7 The long library comprises additional sequences for the primers used in the reactions following the selection step, such as reverse transcription, PCR and in vitro transcription. The short library lacks these sequences. They are added before the amplification reactions by means of a matrix-assisted ligation at the 5 'and at the 3' end. In order to facilitate this ligation, in addition to the fixed subsequnces at the 5 'end, two free nucleotides not involved in the helix are required, with the 5'-terminal nucleotide being 5'-phosphorylated. The design of the libraries thus makes it possible to work during selection - eg in alternation - with both the short library (without amplification sequences) or the commonly used long library (with amplification sequences)

2 beschreibt den Ablauf der in vitro Selektion für die kurze RNA-Bibliothek (ohne Amplifikationssequenzen, linke Seite von 2) und der langen RNA-Bibliothek (mit Amplifikationssequenzen, rechte Seite). Für die kurze Bibliothek sind das folgende Reaktionen: Ligation der Amplifikationssequenzen an den aus der Selektion isolierten RNA-Sequenzen, reverse Transkription, PCR, alkalische Hydrolyse, in vitro Transkription und Selektion. Für die lange Bibliothek sind das folgende Reaktionen: Reverse Transkription der aus der Selektion isolierten RNA-Sequenzen, PCR, in vitro Transkription und Selektion. Die reverse Transkription und die PCR für die Bibliothek mit und ohne Amplifikationssequenzen werden mit identischen Oligonukleotiden (Primer) durchgeführt. Nach der PCR kann sich eine alkalische Hydrolyse anschließen, um das Templat für die Transkription der kurzen Bibliothek zu erhalten. Wird keine alkalische Hydrolyse des Templatstranges für die Transkription durchgeführt, ist das Produkt der Transkription die lange Bibliothek. 2 describes the course of in vitro selection for the short RNA library (without amplification sequences, left side of 2 ) and the long RNA library (with amplification sequences, right side). For the short library, the following reactions are: ligation of the amplification sequences on the RNA sequences isolated from the selection, reverse transcription, PCR, alkaline hydrolysis, in vitro transcription and selection. For the long library, the following reactions are: reverse transcription of the RNA sequences isolated from the selection, PCR, in vitro transcription and selection. Reverse transcription and PCR for the library with and without amplification sequences are performed with identical oligonucleotides (primers). After the PCR, alkaline hydrolysis may be followed to obtain the short library transcription template. If no alkaline hydrolysis of the template strand for transcription is performed, the product of transcription is the long library.

Wie in 3 dargestellt, besteht die aufgereinigte kurze RNA-Bibliothek prinzipiell aus einem randomisierten Bereich von in der Regel 30–40 nt, der 5' von der ersten fixierten Teilsequenz und der 3'-zweiten fixierten Teilsequenz eingerahmt ist.As in 3 In principle, the purified short RNA library consists of a randomized region of usually 30-40 nt, which is framed 5 'of the first fixed partial sequence and the 3' second fixed partial sequence.

Zur RNA werden in 20-fachern Überschuss doppelsträngige Adapter hinzugefügt. Sie bestehen je aus einem Ligat, welches mit der RNA-Bibliothek verknüpft werden soll, und einer Matrix, die mit dem überhängenden Ende mit der fixierten Teilsequenzen der RNA-Bibliothek Basenpaarungen eingehen kann. In der nun folgenden Ligation wird die RNA-Bibliothek mit dem Forward Ligat und dem Reverse Ligat verknüpft. Forward Matrix und Reverse Ligat sind bevorzugt am 3'-Ende geblockt (3' desoxy-Nukleotide), um später in der PCR nicht zu stören.to RNA will be in 20-fold excess double Adapters added. They each consist of a ligate, which is linked to the RNA library connected should be, and a matrix with the overhanging end with the fixed Subsequences of the RNA library can undergo base pairing. In The following ligation will be the RNA library with the forward Ligat and the reverse ligate linked. Forward matrix and reverse Ligat are preferred at the 3'-end blocked (3 'desoxy nucleotides), later not to interfere in the PCR.

Die zu ligierende RNA-Bibliothek besteht sich aus Transkripten mit 3'-Mikroheterogenitäten, wie sie bei einer Transkription, so auch einer Transkription im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, infolge der Eigenschaften der RNA-Polymerase beobachtet werden können, zusammen:

  • a) Aus der Transkription geht ein Gemisch aus RNAs mit der korrekten Länge (n-Transkripte) und RNAs mit einem angehängten Nukleotid (n + 1-Transkripte) hervor.
  • b) Um dieses Gemisch quantitativ am 3'-Ende ligieren zu können, muss auch ein Ge- misch an ds Reverse Adaptern angeboten werden, die das Anhängen des einen Nukleotides ausgleichen: ds Reverse Adapter 1 und ds Reverse Adapter 2. ds Reverse Adapter 2 besteht aus einem am 5'-Ende um 1 nt verkürztes Reverse Ligat (n + 1 Ligat) und trägt in der Reverse Matrix an der Stelle, die dem angehängten Nukleotid gegenüber zu liegen kommt, ein Inosin-Ribonukleotid (n + 1 Reverse Matrix Ribol). Von jedem der beiden doppelsträngigen Reverse Adapter wird ein 10-facher Überschuss in der Ligation eingesetzt (siehe Reaktiosschema in 3). Beide Reverse Matrizen können in der RT als cDNA-Primer dienen. Wenn in der kommenden Selektionsrunde mit einer kurzen Bibliothek gearbeitet werden soll, können sie auch in der PCR ohne Schaden primen. Die alkalische Spaltung läuft auch wie zuvor, da auch die n + 1 Reverse Matrix Ribo I alkalisch gespalten werden kann. Welches Nukleotid in der PCR dem Inosin gegenüber im Forward Strang eingebaut wurde, interessiert nicht, da der Forward Strang nicht von der RNA-Polymerase abgelesen wird. Im Falle von langen Bibliotheken sieht das anders aus, da ein Ribo I im Templat-Strang für die Transktiption im Transkriptionsprodukt an dieser Stelle zum Einbau eines zufälligen Nukleotides kommt. Allerdings ist diese Problematik zu vernachlässigen, da in der PCR-Reaktion ein großer Überschuß an Reverse Primer Ribo U zur Generierung eines „richtigen" Templatstranges führt.
The RNA library to be ligated consists of transcripts with 3 'microheterogeneities, as can be observed during transcription, as well as transcription in connection with the method according to the invention, owing to the properties of the RNA polymerase:
  • a) The transcription results in a mixture of RNAs of the correct length (n transcripts) and RNAs with an attached nucleotide (n + 1 transcripts).
  • b) In order to be able to ligate this mixture quantitatively at the 3 'end, a mixture of the reverse adapters must also be offered, which compensate for the attachment of the one nucleotide: ds reverse adapter 1 and ds reverse adapter 2. ds reverse adapter 2 consists of a 1 nt truncated reverse ligate (n + 1 ligate) at the 5 'end and carries an inosine ribonucleotide (n + 1 Reverse Matrix Ribol) in the reverse matrix at the point opposite the attached nucleotide ). From each of the two double-stranded reverse adapters, a 10-fold excess is used in the ligation (see Reaction Scheme in FIG 3 ). Both reverse templates can serve as cDNA primers in the RT. If you want to work with a short library in the upcoming round of selection, you can also prime in the PCR without harm. The alkaline cleavage proceeds as before, as well as the n + 1 reverse matrix ribo I can be cleaved alkaline. Which nucleotide was incorporated into the inosine in the forward strand in the PCR is not of interest because the forward strand is not read by the RNA polymerase. In the case of long libraries, the situation is different, since a ribo I in the template strand for the transcription in the transcription product at this point for incorporation of a random nucleotide. However, this problem is negligible, since in the PCR reaction a large excess of reverse primer Ribo U leads to the generation of a "correct" template strand.

Wie in 4 dargestellt dient in der sich direkt anschließenden Reversen Transkription (RT) der ligierten kurzen RNA-Bibliothek die Reverse Matrix als Primer für die cDNA-Synthese. Die Forward Matrix stört die cDNA-Synthese nicht, da sie so kurz designed wurde, dass sie bei 50°C abfällt.As in 4 shown used in the directly following reverse transcription (RT) of the ligated short RNA library, the reverse matrix as a primer for cDNA synthesis. The forward matrix does not interfere with cDNA synthesis because it has been designed so short that it drops at 50 ° C.

Wie in 5 dargestellt kann die lange RNA-Bibliothek nach der Aufreinigung im Anschluß der Selektion direkt in die Reverse Transkription (RT) eingesetzt werden. Dabei dient der Reverse Primer, der identisch ist mit der Reversen Matrix, als Primer für die cDNA-Synthese.As in 5 shown the long RNA library can be used directly after the purification in the follow-up of the selection in the reverse transcription (RT). The reverse primer, which is identical to the reverse matrix, serves as primer for the cDNA synthesis.

Wie in 6 dargestellt, kann ohne Aufreinigung die RT aus 4 und 5 in die PCR eingebracht werden. Zusätzliche Primer (Forward Primer und Reverse Primer Ribo U) werden hinzugefügt. In der PCR entstehen aus der cDNA viele Kopien. Diese bestehen idealerweise aus doppelsträngiger DNA. Die Reaktion ist für die lange und kurze RNA-Bibliothek identisch.As in 6 shown, can without purification, the RT off 4 and 5 be introduced into the PCR. Additional primers (Forward Primer and Reverse Primer Ribo U) are added. In the PCR ent are many copies of the cDNA. These are ideally made of double-stranded DNA. The reaction is identical for the long and short RNA library.

Wie in 7 dargestellt, kann die nächste Selektionsrunde mit einer RNA-Bibliothek mit oder ohne Amplifikationssequenzen durchgeführt werden. Im Falle der RNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen wird der Reverse Strang des PCR-Produkts durch alkalische Hydrolyse gespalten. Die selektive alkalische Spaltung an dieser Stelle ist möglich, da der eingebaute Reverse-Primer (und auch die identische Reverse Matrix, die in der PCR noch aus der Ligation vorhanden war) an dieser Stelle ein Ribonukleotid trägt. Durch diesen Schritt wird das Templat der RNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen um den dem Reverse Ligat komplementären Teil des Reverse Primers verkürzt.As in 7 shown, the next round of selection can be carried out with an RNA library with or without amplification sequences. In the case of the RNA library without amplification sequences, the reverse strand of the PCR product is cleaved by alkaline hydrolysis. The selective alkaline cleavage at this point is possible because the built-in reverse primer (and also the identical reverse matrix, which was still present in the PCR from the ligation) carries a ribonucleotide at this point. This step shortens the template of the RNA library without amplification sequences around the reverse-ligate-complementary part of the reverse primer.

Nach einer Ethanolfällung wird die DNA (PCR-Produkt) mit Hilfe einer RNA-Polymerase in RNA umgeschrieben. Das Forward Ligat und dementsprechend auch der Forward Primer tragen zu diesem Zwecke zwei RNA-Polymerase-Promotorsequenzen. Da die Transkription erst downstream von der Promotorsequenz beginnt, findet sich ein Teil oder das ganze Ligat nicht im Transkript (RNA) wieder, je nachdem welche RNA Polymerase verwendet wird. In der Transkription wird der Reverse Strang des PCR-Produktes abgelesen. Daher terminiert die Transkription da, wo der Templatstrang zu Ende ist, im Fall der langen RNA-Bibliothek ist das die Stelle, wo der Reverse Primer gespalten wurde. Die Transkription kann in Anwesenheit eines Überschusses an Guanosin-5'-monophosphat (GMP) durchgeführt werden. Dieses kann nur als Starternukleotid eingebaut werden. Daher beginnt der weitaus größte Anteil der Transkripte mit einem Guanosinmonophosphat statt einem Guanosintriphosphat. Durch diesen Kunstgriff ist die Herstellung der kurzen RNA-Bibliothek zwingend notwendig, da somit die RNA später, nach erfolgter Selektion, direkt ligiert werden kann, ohne erst dephosphoryliert, Phenol-Chloroform-extrahiert und kinasiert werden zu müssen. Um eine kurze RNA- Bibliothek herzustellen, wird der nach der PCR durch die alkalische Hydrolyse verkürzte Reverse Strang unter Verwendung des direkt am 5'-Ende des randomisierten Bereichs liegenden T7 Promotors mit einer T7 Polymerase mit GMP als Starternukleotid transkribiert. Die Transkription zur Herstellung einer RNA-Bibliothek mit Amplifikationssequenzen wird dagegen mit dem nach der PCR unbehandelten Reverse Strang mit der T3 RNA-Polymerase durchgeführt. Eine Verwendung von GMP ist nicht nötig.To an ethanol precipitate is the DNA (PCR product) using an RNA polymerase in RNA rewritten. The Forward Ligat and accordingly the Forward Primers carry two RNA polymerase promoter sequences for this purpose. Since transcription begins only downstream of the promoter sequence, is a part or the whole ligate not found in the transcript (RNA) again, depending on which RNA polymerase is used. In the Transcription is read off the reverse strand of the PCR product. Therefore, transcription terminates where the template strand ends is, in the case of the long RNA library that is the place where the Reverse primer was cleaved. Transcription can be in the presence a surplus on guanosine 5'-monophosphate (GMP) become. This can only be installed as starter nucleotide. Therefore By far the largest share begins the transcripts with a guanosine monophosphate instead of a guanosine triphosphate. By this trick is the production of the short RNA library imperative, since the RNA is subsequently used after selection, can be directly ligated without first dephosphorylated, phenol-chloroform extracted and to be kinased. To a short RNA library After the PCR, the product is prepared by alkaline hydrolysis shortened Reverse strand using the directly located at the 5 'end of the randomized area T7 promoter with a T7 polymerase with GMP as starter nucleotide transcribed. Transcription to produce an RNA library with amplification sequences on the other hand, with the untreated after the PCR Reverse strand performed with the T3 RNA polymerase. A Use of GMP is not necessary.

8 beschreibt den Ablauf der in vitro Selektion für kurze DNA-Bibliotheken (ohne Amplifikationssequenzen, linke Seite von 8) und für lange DNA-Bibliotheken (mit Amplifikationssequenzen, rechte Seite). Für die kurze DNA-Bibliothek sind das folgende Reaktionen: Ligation der Amplifikationssequenzen an den aus der Selektion isolierten Sequenzen, PCR, in vitro Transkription, reverse Transkription, alkalische Hydrolyse und Selektion. Für die langen DNA-Bibliothek sind das folgende Reaktionen: PCR der aus der Selektion isolierten Sequenzen, in vitro Transkription, reverse Transkription, alkalische Hydrolyse der RNA und Selektion. Die reverse Transkription und die PCR für lange und kurze Bibliothek werden mit identischen Oligonukleotiden (Primer) durchgeführt. Für die in vitro Transkription wird je nachdem, ob eine lange oder kurze Bibliothek hergestellt werden soll, die jeweilige RNA-Polymerase verwendet. Nach der reverse Transkription – unter Verwendung eines entsprechend designten Forward Synthese Primers – kann sich eine alkalische Hydrolyse anschließen, um somit die kurze Bibliothek zu erhalten. 8th describes the course of in vitro selection for short DNA libraries (without amplification sequences, left side of 8th ) and for long DNA libraries (with amplification sequences, right side). For the short DNA library, the following reactions are: ligation of the amplification sequences to the sequences isolated from the selection, PCR, in vitro transcription, reverse transcription, alkaline hydrolysis and selection. For the long DNA library, the following are reactions: PCR of the sequences isolated from the selection, in vitro transcription, reverse transcription, alkaline hydrolysis of the RNA, and selection. Reverse transcription and long and short library PCR are performed with identical oligonucleotides (primers). For in vitro transcription, depending on whether a long or short library is to be produced, the respective RNA polymerase is used. After reverse transcription - using a suitably designed forward synthesis primer - alkaline hydrolysis may be followed to obtain the short library.

Wie in 9 dargestellt besteht die aufgereinigte kurze DNA-Bibliothek prinzipiell aus einem randomisierten Bereich von in der Regel 30–40 nt, der 5' von der ersten fixierten Teilsequenz und 3' von der zweiten definierten Teilsequenz eingerahmt ist. Falls die zu amplifizierende kurze DNA-Bibliothek noch keine 5' terminalen Monophosphate trägt, müssen diese durch Kinasierung angefügt werden.As in 9 As shown, the purified short DNA library consists principally of a randomized region of usually 30-40 nt, which is framed 5 'of the first fixed partial sequence and 3' of the second defined partial sequence. If the short DNA library to be amplified does not yet carry 5 'terminal monophosphates, they must be added by kinase.

Wie in 10 dargestellt können zu dem Ansatz der Kinasierung nach Ablauf der Reaktionszeit zwei doppelsträngige DNA-Adapter hinzugefügt werden. Diese werden auch als ds Forward Adapter und ds Reverse Adapter bezeichnet. Die Adapter zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine überhängende Ligationsmatrix, welche zu dem jeweils passenden Ende der zu amplifizierenden kurze DNA-Bibliothek teilweise komplementär ist, trägt. Das Reverse Ligat ist 5'-phosphoryliert, um die Ligation an das 3'-Ende der DNA zu ermöglichen, wobei das 5'- Phosphat gleich bei der Oligonukleotidsynthese angefügt werden kann. Die Reverse Matrix (=Reverse Primer) zeichnet sich überdies dadurch aus, dass sie eine zwei starke Promotore- quenz für zwei unterschiedliche RNA-Polymerasen enthält. Die Anordnung der Promotoren findet sich in 13.As in 10 As shown, two double-stranded DNA adapters may be added to the kinase approach at the end of the reaction time. These are also known as ds forward adapters and ds reverse adapters. The adapters are characterized in that they carry an overhanging ligation matrix, which is partially complementary to the respective matching end of the short DNA library to be amplified. The reverse ligate is 5'-phosphorylated to allow ligation to the 3'-end of the DNA, with the 5'-phosphate being readily added in oligonucleotide synthesis. In addition, the reverse matrix (= reverse primer) is characterized by the fact that it contains a two-strong promoter sequence for two different RNA polymerases. The arrangement of the promoters can be found in 13 ,

Forward Matrix und Reverse Ligat können am jeweiligen 3'-Ende blockiert sein, um unerwünschte Ligationsprodukte und Mispriming in der PCR dieser Konstrukte zu verhindern.Forward Matrix and reverse ligate can at the respective 3'-end be blocked to unwanted Ligation products and Mispriming in the PCR of these constructs too prevent.

Nach Zugabe der Ligase, beispielsweise der T4 DNA-Ligase von Fermentas, erfolgt die Ligation der Primerbindungsstellen (Ligate).To Addition of the ligase, for example the T4 DNA ligase from Fermentas, the ligation of the primer binding sites (ligates) takes place.

Wie in 11 dargestellt kann kann die ligierte kurze DNA-Bibliothek mittels PCR amplifiziert werden. Es ist keine Aufreinigung zwischen Ligation und PCR nötig. Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden.As in 11 As shown, the ligated short DNA library can be amplified by PCR. There is no need for purification between ligation and PCR. The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead, it is also possible to continue directly with the in vitro transcription.

Wie in 12 dargestellt kann die lange DNA-Bibliothek nach der an die Selektion sich anschließende Aufreinigung mittels PCR amplifiziert werden. Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden. Die verwendeten Primer sind identisch mit denen, die für die ligierte kurze Bibliothek verwendet werden (siehe 11).As in 12 shown, the long DNA library can be amplified after the subsequent purification to the selection by PCR. The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead, it is also possible to continue directly with the in vitro transcription. The primers used are identical to those used for the ligated short library (see 11 ).

Wie in 13 dargestellt werden die ligierte kurze oder die lange DNA-Bibliothek oder die Produkte der optionalen PCR oder der optionalen Zweitstrangsynthese nun durch eine in vitro Transkription in RNA umgeschrieben und dabei ein zweites Mal vervielfältigt. Der Benutzer des beschriebenen Verfahrens muss sich an dieser Stelle der Reaktionsabfolge entscheiden, ob er in der folgenden Selektionsrunde mit einer langen oder kurzen DNA-Bibliothek arbeiten möchte. Hier sind der T7 und der T3 Promotor dargestellt. Die Promotoren sind so angeord- net, dass je nachdem welche der zu den beiden Promotoren zugehörige RNA-Polymerase verwendet wird, die Transkription mit der definierten Teilsequenz am 3'-Ende eines jeden zu amplifizierenden DNA-Stranges (wenn die T7 Polymerase verwendet wird) oder zusätzlich zu dieser definierten Teilsequenz die an diese definierte Teilsequenz anschließende dem T7 Promotor komplementäre Sequenz (wenn die T3 Polymerase verwendet wird) beginnt. Um also eine lange Bibliothek für die nächste Selektionsrunde zu erhalten, wird die T3 Polymerase verwendet. Das entstehende Transkriptionsprodukt ist um die T3 Promotorsequenz verkürzt und enthält somit an seinem 5'-Ende die T7 Promotorsequenz. Soll in die Selektionsrunde eine kurze Bibliothek verwendet werden, so wird die T7 Polymerase verwendet. Das Transkriptionsprodukt liegt dann folglich – im Gegensatz zum Transkriptionsausgangsprodukt – um den T3 und den T7 Promotorbereich verkürzt vor.As in 13 The ligated short or long DNA library or the products of the optional PCR or the optional second-strand synthesis are now transcribed into RNA by an in vitro transcription and duplicated a second time. The user of the described method must decide at this point in the reaction sequence whether he would like to work in the following selection round with a long or short DNA library. Here are the T7 and the T3 promoter shown. The promoters are arranged so that, depending on which of the two promoters associated RNA polymerase is used, the transcription with the defined partial sequence at the 3 'end of each DNA strand to be amplified (if the T7 polymerase is used) or in addition to this defined partial sequence, the sequence complementary to the T7 promoter (when the T3 polymerase is used) is followed by the T7 promoter sequence. So to get a long library for the next round of selection, the T3 polymerase is used. The resulting transcription product is truncated by the T3 promoter sequence and thus contains at its 5 'end the T7 promoter sequence. If a short library is to be used in the selection round, the T7 polymerase is used. The transcription product is then - in contrast to the transcriptional starting product - shortened by the T3 and the T7 promoter region.

Wie in 14 dargestellt können die RNAs für die Herstellung der DNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen nun unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, der mindestens ein Ribonukleotid direkt 5' von der fixierten Teilsequenz enthält, in komplementäre DNA (cDNA) überführt werden. Die Sequenzen der cDNA entsprechen den zu amplifizierenden DNA-Strängen mit zusätzlichen Nukleotiden am jeweiligen 5'-Ende.As in 14 As shown, the RNAs for the preparation of the DNA library without amplification sequences can now be converted into complementary DNA (cDNA) by adding a forward synthesis primer which contains at least one ribonucleotide directly 5 'to the fixed partial sequence. The sequences of the cDNA correspond to the DNA strands to be amplified with additional nucleotides at the respective 5 'end.

Der Bereich des Forward Synthese Primers, der 5' vor der fixierten Teilsequenz liegt, wird nun durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen abgespalten. Gleichzeitig werden die RNA-Stränge verdaut. Danach schließt sich eine Reinigung (z.B. eine Ethanolfällung) an. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen und die kurze DNA-Bibliothek kann wieder mit dem Zielmolekül in Kontakt gebracht werden (Selektion).Of the Area of the forward synthesis primer 5 'ahead of the fixed part sequence, is now eliminated by the addition of lye and optionally heating. simultaneously the RNA strands are digested. After that closes a purge (e.g., an ethanol precipitate). This is the amplification cycle closed and the short DNA library can come back in contact with the target molecule be brought (selection).

Wie in 15 dargestellt können die RNAs für die Herstellung der lange DNA-Bibliothek nun unter Zugabe eines Forward Synthese Primers in komplementäre DNA (cDNA) überführt werden. Durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen werden die RNA-Stränge verdaut. Danach schließt sich eine Reinigung (z.B. eine Ethanolfällung) an. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen und die kurze DNA-Bibliothek kann wieder mit dem Zielmolekül in Kontakt gebracht werden (Selektion).As in 15 As shown, the RNAs for the preparation of the long DNA library can now be converted into complementary DNA (cDNA) by adding a forward synthesis primer. By adding lye and optionally heating the RNA strands are digested. This is followed by a purification (eg an ethanol precipitation). Thus, the amplification cycle is closed and the short DNA library can be brought back into contact with the target molecule (selection).

18 beschreibt den Ablauf der in vitro Selektion für kurze FNA-Bibliotheken (ohne Amplifikationssequenzen, linke Seite von 8) und für lange FNA-Bibliotheken (mit Amplifikationssequenzen, rechte Seite). Für die kurze FNA-Bibliothek sind das folgende Reaktionen: Ligation der Amplifikationssequenzen an den aus der Selektion isolierten Sequenzen, reverse Transkription, PCR, in vitro Transkription, FNA-Synthese, alkalische Hydrolyse und Selektion. Für die langen FNA-Bibliothek sind das folgende Reaktionen: Reverse Transkription der Selektion isolierten Sequenzen, PCR, in vitro Transkription, reverse Transkription, alkalische Hydrolyse der RNA und Selektion. Die reverse Transkription und die PCR für lange und kurze Bibliothek werden mit identischen Oligonukleotiden (Primer) durchgeführt. Für die in vitro Transkription wird je nachdem, ob eine lange oder kurze Bibliothek hergestellt werden soll, die jeweilige RNA-Polymerase verwendet. Nach der FNA-Synthese – unter Verwendung eines entsprechend designten Forward Synthese Primers – kann sich eine alkalische Hydrolyse anschließen, um somit die kurze Bibliothek zu erhalten. 18 describes the course of in vitro selection for short FNA libraries (without amplification sequences, left side of 8th ) and for long FNA libraries (with amplification sequences, right side). For the short FNA library, the following are reactions: ligation of the amplification sequences on the selection isolated sequences, reverse transcription, PCR, in vitro transcription, FNA synthesis, alkaline hydrolysis and selection. For the long FNA library are the following reactions: reverse transcription of the selection of isolated sequences, PCR, in vitro transcription, reverse transcription, alkaline hydrolysis of the RNA and selection. Reverse transcription and long and short library PCR are performed with identical oligonucleotides (primers). For in vitro transcription, depending on whether a long or short library is to be produced, the respective RNA polymerase is used. Following FNA synthesis, using a suitably designed forward synthesis primer, alkaline hydrolysis may be followed to obtain the short library.

Wie in 19 dargestellt besteht die aufgereinigte kurze FNA-Bibliothek prinzipiell aus einem randomisierten Bereich von in der Regel 30–40 nt, der 5' von der ersten fixierten Teilsequenz und 3' von der zweiten definierten Teilsequenz eingerahmt ist. Falls die zu amplifizierende kurze FNA-Bibliothek noch keine 5' terminalen Monophosphate trägt, müssen diese durch Kinasierung angefügt werden.As in 19 As shown, the purified short FNA library consists principally of a randomized region of usually 30-40 nt, which is framed 5 'of the first fixed partial sequence and 3' of the second defined partial sequence. If the short FNA library to be amplified does not yet carry 5 'terminal monophosphates, they must be added by kinase.

Wie in 20 dargestellt werden zu dem Ansatz der Kinasierung nach Ablauf der Reaktionszeit zwei doppelsträngige DNA-Adapter hinzugefügt. Diese werden auch als ds Forward Adapter und ds Reverse Adapter bezeichnet. Die Adapter zeichnen sich dadurch aus, dass sie eine überhängende Ligationsmatrix, welche zu dem jeweils passenden Ende der zu amplifizie- renden kurze FNA-Bibliothek teilweise komplementär ist, trägt. Das Reverse Ligat ist 5'-phosphoryliert, um die Ligation an das 3'-Ende der FNA zu ermöglichen, wobei das 5'-Phosphat gleich bei der Oligonukleotidsynthese angefügt werden kann. Die Reverse Matrix (=Reverse Primer) zeichnet sich überdies dadurch aus, dass sie eine zwei starke Promotorsequenz für zwei unterschiedliche RNA-Polymerasen enthält. Die Anordnung der Promotoren findet sich in 23.As in 20 are presented to the approach of kinasing at the end of the reaction time two double-stranded DNA adapters added. These are also known as ds forward adapters and ds reverse adapters. The adapters are characterized in that they carry an overhanging ligation matrix, which is partially complementary to the respectively fitting end of the short FNA library to be amplified. The reverse ligate is 5'-phosphorylated to allow ligation to the 3'-end of the FNA, with the 5'-phosphate being readily added in oligonucleotide synthesis. In addition, the reverse matrix (= reverse primer) is characterized in that it contains a two-strong promoter sequence for two different RNA polymerases. The arrangement of the promoters can be found in 23 ,

Forward Matrix und Reverse Ligat können am jeweiligen 3'-Ende blockiert sein, um unerwünschte Ligationsprodukte und Mispriming in der PCR dieser Konstrukte zu verhindern.Forward Matrix and reverse ligate can at the respective 3'-end be blocked to unwanted Ligation products and Mispriming in the PCR of these constructs too prevent.

Nach Zugabe der Ligase, beispielsweise der T4 DNA-Ligase von Fermentas, erfolgt die Ligation der Primerbindungsstellen (Ligate).To Addition of the ligase, for example the T4 DNA ligase from Fermentas, the ligation of the primer binding sites (ligates) takes place.

Wie in 21 dargestellt kann nun die ligierte kurze DNA-Bibliothek mittels reverser Transkription – unter Verwendung des Reverse Primers – in DNA umgeschrieben und mittels PCR amplifiziert werden. Es ist keine Aufreinigung zwischen Ligation, reverser Transkription und PCR nötig. Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden.As in 21 The ligated short DNA library can now be transcribed into DNA by reverse transcription - using the reverse primer - and amplified by PCR. There is no need for purification between ligation, reverse transcription and PCR. The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead, it is also possible to continue directly with the in vitro transcription.

Wie in 22 dargestellt kann die lange FNA-Bibliothek kann nach der an die Selektion sich anschließende Aufreinigung mittels reverser Transkription – unter Verwendung des Reverse Primers – in DNA umgeschrieben und mittels PCR amplifiziert werden. Die PCR-Reaktion oder Zweitstrangsynthese ist optional. Stattdessen kann auch direkt mit der in vitro Transkription fortgefahren werden. Die verwendeten Primer sind identisch mit denen, die für die ligierte kurze Bibliothek verwendet werden, wie in 21 beispielhaft gezeigt).As in 22 The long FNA library can be transcribed into DNA after the selection following purification by reverse transcription - using the reverse primer - and amplified by PCR. The PCR reaction or second strand synthesis is optional. Instead, it is also possible to continue directly with the in vitro transcription. The primers used are identical to those used for the ligated short library, as in 21 shown by way of example).

Wie in 23 dargestellt werden die ligierte kurze oder die lange FNA-Bibliothek oder die Produkte der optionalen PCR oder der optionalen Zweitstrangsynthese nun durch eine in vitro Transkription in RNA umgeschrieben und dabei ein zweites Mal vervielfältigt. Der Benutzer des beschriebenen Verfahrens muss sich an dieser Stelle der Reaktionsabfolge entscheiden, ob er in der folgenden Selektionsrunde mit einer langen oder kurzen FNA-Bibliothek arbeiten möchte. Hier sind der T7 und der T3 Promotor dargestellt. Die Promotoren sind so angeordnet, dass je nachdem welche der zu den beiden Promotoren zugehörige RNA-Polymerase verwendet wird, die Transkription mit der definierten Teilsequenz am 3'-Ende eines jeden zu amplifizierenden DNA-Stranges (wenn die T7 Polymerase verwendet wird) oder zusätzlich zu dieser definierten Teilsequenz die an diese definierte Teilsequenz anschließende dem T7 Promotor komplementäre Sequenz (wenn die T3 Polymerase verwendet wird) beginnt. Um also eine lange Bibliothek für die nächste Selektionsrunde zu erhalten, wird die T3 Polymerase verwendet. Das entstehende Transkriptionsprodukt ist um die T3 Promotorsequenz verkürzt und enthält somit an seinem 5'-Ende die T7 Promotorsequenz. Soll in die Selektionsrunde eine kurze Bibliothek verwendet werden, so wird die T7 Polymerase verwendet. Das Transkriptionsprodukt liegt dann folglich – im Gegensatz zum Transkriptionsausgangsprodukt – um den T3 und den T7 Promotorbereich verkürzt vor.As in 23 represented the ligated short or long FNA library or the products of the optional PCR or the optional second-strand synthesis are now transcribed by an in vitro transcription into RNA, thereby duplicated a second time. The user of the described method must decide at this point in the reaction sequence whether he wants to work in the following round of selection with a long or short FNA library. Here are the T7 and the T3 promoter shown. The promoters are arranged so that, depending on which of the two promoters associated RNA polymerase is used, the transcription with the defined partial sequence at the 3 'end of each DNA strand to be amplified (if the T7 polymerase is used) or additionally to this defined partial sequence, the T7 promoter complementary sequence subsequent to this defined partial sequence (when the T3 polymerase is used) begins. So to get a long library for the next round of selection, the T3 polymerase is used. The resulting transcription product is truncated by the T3 promoter sequence and thus contains at its 5 'end the T7 promoter sequence. If a short library is to be used in the selection round, the T7 polymerase is used. The transcription product is then - in contrast to the transcriptional starting product - shortened by the T3 and the T7 promoter region.

Wie 24 dargestellt können die RNAs für die Herstellung der kurze FNA-Bibliothek nun unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, der mindestens ein Ribonukleotid direkt 5' von der fixierten Teilsequenz enthält, in komplementäre FNA überführt werden. Die Sequenzen der FNA entsprechen den zu amplifizierenden FNA-Strängen mit zusätzlichen Nukleotiden am jeweiligen 5'-Ende.As 24 As shown, the RNAs for the preparation of the short FNA library can now be converted into complementary FNA with the addition of a forward synthesis primer containing at least one ribonucleotide directly 5 'to the fixed partial sequence. The sequences of the FNA correspond to the FNA strands to be amplified with additional nucleotides at the respective 5 'end.

Der Bereich des Forward Synthese Primers, der 5' vor der fixierten Teilsequenz liegt, wird nun durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen abgespalten. Gleichzeitig werden die RNA-Stränge verdaut. Danach schließt sich eine Reinigung (z.B. eine Ethanolfällung) an. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen und die kurze FNA-Bibliothek kann wieder mit dem Zielmolekül in Kontakt gebracht werden (Selektion).Of the Area of the forward synthesis primer 5 'ahead of the fixed part sequence, is now eliminated by the addition of lye and optionally heating. simultaneously the RNA strands are digested. After that closes a purge (e.g., an ethanol precipitate). This is the amplification cycle closed and the short FNA library can be back in contact with the target molecule be brought (selection).

Wie in 25 dargestellt können die RNAs für die Herstellung der lange FNA-Bibliothek nun unter Zugabe eines Forward Synthese Primers, der aus FNA besteht, in komplementäre FNA überführt werden. Durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen werden die RNA-Stränge verdaut. Danach schließt sich eine Reinigung (z.B. eine Ethanolfällung) an. Damit ist der Amplifikationszyklus geschlossen und die kurze FNA-Bibliothek kann wieder mit dem Zielmolekül in Kontakt gebracht werden (Selektion).As in 25 As shown, the RNAs for the production of the long FNA library can now be converted into complementary FNA with the addition of a forward synthesis primer consisting of FNA. By adding lye and optionally heating the RNA strands are digested. This is followed by a purification (eg an ethanol precipitation). Thus, the amplification cycle is closed and the short FNA library can be brought back into contact with the target molecule (selection).

Beispiel 1: Ligation der kurzen BibliothekExample 1: Ligation of short library

Zur Evaluierung der im Rahmen der Erfindung benutzen Ligation wurden Experimente mit 0,5 pmol oder 1 pmol zu ligierender RNA durchgeführt. Das 5'-Phosphat war zuvor teilweise gegen ein 32P-Phosphat ausgetauscht worden (Kinasierung). Die Ligationsausbeuten wurden über denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Quantifizierung mittels Phosphorimager (BioRad Molecular Imager Fx, Quantifizierungssoftware Quantity One 4.2, KodakScreens) vorgenommen.To evaluate the ligation used in the invention, experiments were performed with 0.5 pmol or 1 pmol of RNA to be ligated. The 5'-phosphate had previously been partially exchanged for a 32 P-phosphate (kinase). Ligation yields were measured by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and phosphorimager quantification (BioRad Molecular Imager Fx, Quantifying Software Quantity One 4.2, KodakScreens).

Die hochkonzentrierte, hierin verwendete T4-DNA Ligase von MBI-Fermentas (30 Weiss units/μl) hat den Vorteil, dass auch bei den hier verwendeten hohen Ligase-Konzentrationen nicht zu viel Glycerin aus der Enzym-Stocklösung in den Reaktionsansatz eingebracht wird, was inhibierend wirken würde.The highly concentrated, T4 DNA ligase from MBI fermentase used herein (30 white units / μl) has the advantage that even at the high ligase concentrations used here not too much glycerol from the enzyme stock solution in the reaction mixture is introduced, which would inhibit.

In 16 ist dazu die Ligation einer kurzen RNA-Bibliothek dargestellt. Das durch die zwei am 5'-Ende nicht hybridisierten Nukeotiden „freie" 5'-Ende ließ sich unter den beschriebenen zu 83% ligieren, das für die den Reverse Adapter 1 und 2 wenig zugängliche 3'-Ende dagegen – bei alleiniger Anwesenheit der Reverse Adapter – lediglich (38%). Befinden sich jedoch der Forward Adapter und die beiden Reverse Adapter im Ligationsansatz, beträgt die Liagtion sausbeute ca. 83%. Dies ist vermutlich dadurch zu erklären, dass durch eine erfolgreiche 5'-Ligation die aneinander hybridisierten terminalen Teilssequenzen „aufklappen" und somit auch der 3'-Bereich der RNA-Bibliothek besser zugänglich ist.In 16 For this purpose, the ligation of a short RNA library is shown. The nucleotides "free"5'-end unhybridized by the 5'-end could be ligated to 83% of those described, whereas the 3'-end, which is less accessible to the reverse adapters 1 and 2, could be ligated - in the sole presence of the Reverse Adapters - only (38%) However, if the Forward Adapter and the two Reverse Adapters are in the ligation approach, the Liagtion is approximately 83%, presumably due to a successful 5'-ligation that hybridized to each other "unfold" terminal partial sequences and thus the 3 'region of the RNA library is more accessible.

Für die Ligation wurden in Vorversuchen letztendlich 2 Ansätze mit unterschiedlichen (Templatemenge)/(Reaktionsvolumen + Enzymmenge)-Verhältnissen bestimmt.For the ligation were in preliminary experiments ultimately 2 approaches with different (template amount) / (reaction volume + Enzyme amount) ratios certainly.

Ligation der Amplifikationssequenzen an die kurze RNA Bibliothek:Ligation of the amplification sequences to the short RNA library:

Ansätze bis 5 pmol:Batches up to 5 pmol:

Volumen des Ansatzes: 14 μl pro 1 pmolRNA-Template

Figure 00740001
Volume of the batch: 14 μl per 1 pmol RNA template
Figure 00740001

Ansätze ab 5 pmol:Batches from 5 pmol:

Volumen des Ansatzes: 14 μl pro 5 pmolRNA-Template

Figure 00740002
Volume of the batch: 14 μl per 5 pmol RNA template
Figure 00740002

Figure 00750001
Figure 00750001

Verwendet wurden dazu folgende Oligonukleotide:
kinasierte RNA: FJ 7.34 bih P1-LIG RNA (5'-GGACGCTGC-N34-GCAGCGT),
FJ 7.34 bih P1-LIG F Ligat (5'-GGG AGT AAT ACG ACT CAC TAT A)
FJ 7.34 bih P1-LIG F Matrix (5'-GCG TCC TAT AGT GAG TCG T)
FJ 7.34 bih P1-LIG Rev Ligat (5'-pA ACC TGA GGA TCA CTC GC)
FJ 7.34 bih P1-LIG N + 1 Rev Ligat (5'-pACC TGA GGA TCA CTC GC)
FJ 7.34 bih P1-LIG Rev Matrix rI (5'-GC GAG TGA UCC TCA GGT rI ACG CTG)
FJ 7.34 bih P1-LIG Rev Primer rI (5'GC GAG TGA UCC TCA GGT rI AC)The following oligonucleotides were used:
kinased RNA: FJ 7.34 bih P1-LIG RNA (5'-GGACGCTGC-N 34 -GCAGCGT),
FJ 7.34 bih P1-LIG F ligate (5'-GGG AGT AAT ACG ACT CAC ACT A)
FJ 7.34 bih P1-LIG F matrix (5'-GCG TCC TAT AGT GAG TCG T)
FJ 7.34 bih P1-LIG Rev Ligat (5'-pA ACC TGA GGA TCA CTC GC)
FJ 7.34 bih P1-LIG N + 1 Rev Ligat (5'-pACC TGA GGA TCA CTC GC)
FJ 7.34 bih P1-LIG Rev Matrix rI (5'-GC GAG TGA UCC TCA GGT rI ACG CTG)
FJ 7.34 bih P1-LIG Rev primer rI (5'GC GAG TGA UCC TCA GGT rI AC)

Beispiel 2: Test der Promotorspezifität der T3 und T7 RNA-PolymeraseExample 2: Test of promoter specificity of T3 and T7 RNA polymerase

Um die Promotorspezifiät zu überprüfen, wurden 2 verschiedene Templatstränge (DNA Reverse Stränge) verwendet, die am 3'-Ende des randomisierten Bereichs die dem T3 oder T7 Promotor komplemtären Bereich aufweisen. Unter Verwendung der Forward Primer, die die Promotorsequenz enthaltenen, wurden die Templatstränge unter den entsprechenden Bedingungen der PCR (wie in Beispiel 4) unter Durchführung eines Zyklus (eine sogenannte „Fillin"-Reaktion) doppelsträngig gemacht. Die Doppelstränge wurden durch Ethanolfällung entsalzt und unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungnen jeweils mit T3 und T7 RNA Polymerase transkribiert.Around the promoter specificity to be checked 2 different template strands (DNA reverse strands) used that at the 3'-end of the randomized area completing the T3 or T7 promoter area exhibit. Using the forward primer containing the promoter sequence contained, the template strands were among the corresponding Conditions of PCR (as in Example 4) to perform a cycle (a so-called "fillin" reaction) double-stranded. The double strands were by ethanol precipitation desalted and under the conditions described in Example 6 each transcribed with T3 and T7 RNA polymerase.

Wie Fig. in 17 zu erkennen ist, kann die T3 RNA-Polymerase gut zwischen T3 und T7 RNA-Polymerase Promotor unterscheiden, es entsteht ein einziges Produkt, dass einer Transkripti- onsinitiation am T3 Promoror entspricht. Die T7 RNA Polymerase initiierte dagegen von beiden Promotoren eine Transkription. Es entstehen jedoch überwiegend Transkripte der erwarteten Länge.As As can be seen in Figure 17, the T3 RNA polymerase may well intervene T3 and T7 RNA polymerase Differentiate promoter, it creates a single product that one Transcription initiation at T3 promoror corresponds. The T7 RNA Polymerase, on the other hand, initiated transcription from both promoters. However, it mostly arises Transcripts of the expected length.

Verwendet wurden dazu folgende Nukleotide:
T3 F Primer
(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA)
T3-Pool Rev Strang
(5'-GTGGAACCGACAACTTGTGC-N40-TCTCCCTTTAGTGAGGGTTAATT)
DE 40 Reverse Strang
(5'-GTG GAA CCG ACA GTG GTA CGT G N40 CAC GAG TGA AGT CTG AGC TCC)
Forward Primer DE 40T7
(5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG AGC TCA GAC TTC ACT CG)The following nucleotides were used:
T3 F primer
(5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA)
T3 pool Rev strand
(5'-GTGGAACCGACAACTTGTGC-N 40 -TCTCCCTTTAGTGAGGGTTAATT)
EN 40 reverse strand
(5'-GTG GAA CCG ACA GTG GTA CGT GN 40 CAC GAG TGA AGT CTG AGC TCC)
Forward primer DE 40T7
(5'-TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG AGC TCA GAC TTC ACT CG)

Beispiel 3: Durchführung der Reversen Transkription bei Verwendung von RNA-BibliothekenExample 3: Implementation of Reverse transcription when using RNA libraries

Die Reverse Transkription (RT) läuft unter Verwendung von Superscript II (Invitrogen) nach dem intern modifizierten Temperaturprotokoll ab. Die Reverse Matrix (=Reverse Primer) und die N + 1 Reverse Matrix dient als Primer für die cDNA-Synthese.Reverse transcription (RT) is performed internally using Superscript II (Invitrogen) modified temperature protocol. The reverse matrix (= reverse primer) and the N + 1 reverse matrix serve as primers for the cDNA synthesis.

Die Reverse Transkription findet

  • a) bei kurzen Bibliotheken direkt im Anschluss an die Ligation statt.
  • b) bei langen Bibliotheken im Anschluss an der sich der Selektion anschließenden Aufreinigung der RNA statt.
The reverse transcription takes place
  • a) for short libraries immediately after the ligation.
  • b) for long libraries following the subsequent purification of the RNA following selection.

Bei größeren Stoffmengen müssen mehrere Parallelansätze gemacht werden. Die Größe des rT-Ansatzes bei kurzen Bibliotheken ist durch die unterschiedlich konzentrierten Ligationsansätze bestimmt (Ligation bis 5 pmol/Ligation ab 5 pmol).at larger amounts of substance have to several parallel approaches be made. The size of the rT approach at short libraries is differentiated by the different Ligation mixtures determined (ligation to 5 pmol / ligation from 5 pmol).

Eckpunkte für die RT sind:

Figure 00760001
Cornerstones for the RT are:
Figure 00760001

Die Temperaturbedingungen sind:
20 min @ 51°C
10 min @ 54°C
bis zur Weiterbehandlung @ 4°CThe temperature conditions are:
20 min @ 51 ° C
10 min @ 54 ° C
until further treatment @ 4 ° C

Beispiel 4: Durchführung der Polymerase Kettenreaktion und der optionalen alkalischen Spaltung bei der Verwendung von RNA-BibliothekenExample 4: Implementation of Polymerase chain reaction and optional alkaline cleavage when using RNA libraries

Eckpunkte für die PCR sind:

Figure 00770001
Key points for the PCR are:
Figure 00770001

Alkalische Hydrolyse zur Herstellung einer RNA-Bibliothek ohne Amplifikationssequenzen:Alkaline hydrolysis to Preparation of an RNA library without amplification sequences:

Im Anschluss an die PCR wird der (R)-Strang des PCR-Produkts an der Ribo-Schnittstelle alkalisch verdaut.in the Following the PCR, the (R) strand of the PCR product at the Ribo-digested alkaline.

Das Standardrezept für die alkalische Spaltung des Reverse-Stranges sieht wie folgt aus:

Figure 00780001

  • – 10 min @ 95°C im PCR-Block, auf 4°C abkühlen, auf Eis weiterarbeiten
    Figure 00780002
  • – pH-Wert überprüfen, soll zwischen pH 5 und pH 6 liegen.
The standard recipe for alkaline cleavage of the reverse strand is as follows:
Figure 00780001
  • - 10 min @ 95 ° C in the PCR block, cool to 4 ° C, continue working on ice
    Figure 00780002
  • - Check the pH should be between pH 5 and pH 6.

Nach der optionalen alkalischen Hydrolyse wird das PCR-Produkt aus der aus der Lösung gefällt oder die DNA auf anderem Wege abgetrennt oder bei der Herstellung des Puffers für die folgende Transkriptionsreaktion die aus der PCR beziehungsweise aus der alkalischen Hydrolyse stammmenden Salze berücksichtigt. In der Regel wurde die Probe nach der alkalischen Hydrolyse mit Ethanol gefällt.To the optional alkaline hydrolysis is the PCR product from the out of the solution like or the DNA is separated by other means or in the preparation of the buffer for the following transcription reaction from the PCR or taking into account salts derived from alkaline hydrolysis. In Usually the sample became after the alkaline hydrolysis with ethanol like.

Beispiel 6: Erzeugung von 5'-phosphorylierter RNA und Entfernung der 5'-Amplifikationssequenzen durch in vitro-Transkription zur Herstellung von kurzen RNA-BibliothekenExample 6: Generation of 5'-phosphorylated RNA and removal of the 5 'amplification sequences by in vitro transcription for the production of short RNA libraries

In der nachfolgenden in vitro-Transkription wird der in der PCR erzeugte und durch alkalische Hydrolyse verkürtzen Reverse-Strang in RNA umgeschrieben. Die Reaktion läuft 2–16 h bei 37°C mit T7 RNA-Polymerase von Stratagene. Durch die Lage des T7 RNA-Polymerase-Promotors in der 5'-Primenegion (siehe Sequenzen) wird diese nicht transkribiert. Gleichzeitig wird schon in der T7-Transkription die entstehende RNA-Bibliothek für die spätere Ligation vorbereitet. Durch den Zusatz von Guanosin-5'-monophosphat (GMP) als Starternukleotid in der in vitro-Transkription trägt der weitaus größte Teil der entstehenden RNA-Moleküle eine 5'-Phosphatgruppe, die eine Voraussetzung für die Ligation ist. Es stellte sich heraus, dass ein 8-facher Überschuss an GMP über GTP (32 mM : 4 mM) der Transkriptionsausbeute keinen Abbruch tut. Durch diesen Kunstgriff kann man sich aufwändige enzymatische Schritte, wie Dephosphorylierung und Kinasierung, die nie quantitativ ablaufen und Reinigungsschritte erfordern, ersparen.In the following in vitro transcription, the reverse strand generated in the PCR and shortened by alkaline hydrolysis is transcribed into RNA. The reaction proceeds at 37 ° C. for 2-16 h with Stratagene T7 RNA polymerase. The location of the T7 RNA polymerase promoter in the 5 'prime region (see sequences) does not transcribe it. At the same time, the resulting RNA library is already being prepared for subsequent ligation in T7 transcription. By the addition of guanosine 5'-monophosphate (GMP) as the starter nucleotide in in vitro transcription, the vast majority of the resulting RNA molecules carry a 5'-phosphate group, which is a prerequisite for ligation. It turned out that an 8-fold excess of GMP via GTP (32 mM: 4 mM) does not detract from the transcription yield. This artifice eliminates the need for expensive enzymatic steps, such as dephosphorylation and kinasing, which never occur quantitatively and require purification steps.

Das verbliebene DNA-Templat kann im Anschluss an die in vitro-Transkription mit 20 units DNAse I (Sigma) innerhalb von 20 min bei 37°C verdaut werden. Nach Zugabe von Loading Buffer (7M urea, Xylene cyanol, Bromphenolblau) wird der Ansatz denaturiert und über ein 10 %iges denaturierendes Polyacrylamidgel aufgereinigt. Die Bande des Transkriptes wird per UV-Shadowing aus dem Gel ausgeschnitten und mittels „Crush and Soak" eluiert. Das resultierende Eluat wird Ethanol-präzipitiert und das Pellet nach einmaligem Waschen mit eiskaltem 70 %igen Ethanol in Wasser resuspendiert. Die so gewonnene 5'-phosphorylierte RNA-Bibliothek wird in die folgende Selektionsrunde eingesetzt.The remaining DNA template may be following in vitro transcription with 20 units DNAse I (Sigma) within 20 min at 37 ° C digested become. After addition of Loading Buffer (7M urea, xylene cyanol, Bromophenol blue), the batch is denatured and denatured over a 10% denaturing Polyacrylamide gel purified. The gang of the transcript is per UV Shadowing cut out of the gel and using "Crush and Soak "elutes. The resulting eluate is ethanol precipitated and the pellet after once washed with ice-cold 70% ethanol in water. The thus obtained 5'-phosphorylated RNA library is used in the following selection round.

Die Transkription wurde unter Verwendung der folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: Für RNA Transkription:

Figure 00790001
Txn-Puffer (10x): 800 mM HEPES/KOH pH7.5, 220 mM Magnesiumchlorid, 10 mM SpermidinTranscription was performed using the following reaction conditions: For RNA transcription:
Figure 00790001
Txn buffer (10x): 800 mM HEPES / KOH pH 7.5, 220 mM magnesium chloride, 10 mM spermidine

Für 2'-Fluoro Transkription:

Figure 00790002
For 2'-fluoro transcription:
Figure 00790002

Die in vitro-Transkription läuft 8–16 h bei 37°C.The in vitro transcription is ongoing 8-16 h at 37 ° C.

Beispiel 6: Erzeugung von RNA langen RNA-Bibliotheken durch in vitro-TranskriptionExample 6: Generation of RNA-long RNA libraries by in vitro transcription

Mit einer in vitro-Transkription wird der in der PCR erzeugte Reverse-Strang in RNA umgeschrieben. Die Reaktion läuft 2–16 h bei 37°C mit T3 RNA-Polymerase von Ambion. Durch die Lage des T3 RNA-Polymerase-Promotors in der 5'-Primerregion (siehe Sequenzen) wird diese nicht transkribiert. Die Sequnez des T7 RNA-Polymerase-Promotors, der sich in 3'-Richtung anschließt, findet sich jedoch im Transkript wieder.With In vitro transcription becomes the reverse strand generated in the PCR transcribed into RNA. The reaction proceeds at 37 ° C for 2-16 h with T3 RNA polymerase from Ambion. By the location of the T3 RNA polymerase promoter in the 5 'primer region (see sequences) this is not transcribed. The Sequnez of the T7 RNA polymerase promoter extending in the 3 'direction connects, but is found in the transcript again.

Das verbliebene DNA-Templat kann im Anschluss an die in vitro-Transkription mit 20 units DNAse I (Sigma) innerhalb von 20 min 37°C verdaut werden. Nach Zugabe von Loading Buffer (7M urea, Xylene cyanol, Bromphenolblau) wird der Ansatz denaturiert (5 min @ 95°C) und über ein 10 %iges denaturierendes Polyacrylamidgel aufgereinigt. Die Bande des Transkriptes wird per UV-Shadowing aus dem Gel ausgeschnitten und mittels „Crush and Soak" eluiert. Das resultierende Eluat wird Ethanol-präzipitiert und das Pellet nach einmaligem Waschen mit eiskaltem 70 %igen Ethanol in Wasser resuspendiert. Die so gewonnene 5'-phosphorylierte RNA-Bibliothek wird in die folgende Selektionsrunde eingesetzt.The remaining DNA template can be digested at 37 ° C. within 20 min following in vitro transcription with 20 units of DNAse I (Sigma). After addition of Loading Buffer (7M urea, xylene cyanol, bromophenol blue), the mixture is denatured (5 min @ 95 ° C) and purified over a 10% denaturing polyacrylamide gel. The band of the transcript is UV-shadowed from the gel and eluted by "crush and soak." The resulting eluate is ethanol precipitated and the pellet resuspended after washing with ice-cold 70% ethanol in water. -phosphorylierte RNA library is used in the following selection round.

Die Transkription wurde unter Verwendung der folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: Für RNA Transkription:

Figure 00800001
Txn-Puffer (10x): 800 mM HEPES/KOH pH7.5, 220 mM Magnesiumchlorid, 10 mM SpermidinTranscription was performed using the following reaction conditions: For RNA transcription:
Figure 00800001
Txn buffer (10x): 800 mM HEPES / KOH pH 7.5, 220 mM magnesium chloride, 10 mM spermidine

Für 2'-Fluoro Transkription:

Figure 00810001
For 2'-fluoro transcription:
Figure 00810001

Die in vitro-Transkription läuft 8–16 h bei 37°C.The in vitro transcription is ongoing 8-16 h at 37 ° C.

Beispiel 7: Herstellung der verwendeten initialen kurzen RNA-BibliothekExample 7: Preparation the initial short RNA library used

Zunächst wurde an einem Standard-Oligonukleotid-Synthesizer eine DNA-Bibliothek herge- stellt. Diese besteht aus dem Reverse Strang, der die komplementären Bereiche zu einem Teil der Forward Primer Bindungsregion, die auch den T7-Promotor enthält, zum randomisierten Bereich und zu den definierten Teilsequenzen enthält. Die Synthese des Reverse Stranges wurde aus zwei Gründen gewählt:

  • 1. Um diesen ohne vorherige PCR-Amplifikation, bei der die Bibliothek schon vor der ersten Selektionsrunde an Komplexität einbüßen würde, transkribieren zu können. Durch einfaches Hinzufügen des Forward Primers wurde der T7 RNA-Polymerase-Promotorbereich und die ersten 2 zu transkribierenden Nukleotide doppelsträngig gemacht. Dies reichte überraschenderweise für eine Transkription mit T7 RNA Polymerase mit hohen Ausbeuten aus.
  • 2. Da in der ersten Selektionsrunde nur wenige Kopien von jedem potenziellen Aptamer in der RNA-Bibliothek vorhanden sind, ist eine quantitative Amplifikation der Eluate in der PCR hier von besonderer Wichtigkeit. Daher sollten Mikroheterogenitäten am 3'-Ende der in vitro-transkribierten RNA von vornherein ausgeschlossen werden. Diese können zu leichten Mismatches in der PCR führen, wenn gegenüber dem Inosin ein C oder T eingebaut wird, welche nicht gut mit dem Ribo U an der entsprechenden Stelle des Reverse Primers paaren. Um selbst diese, sicher nicht gravierende Fehlerquelle auszuschalten, wurden bereits im synthetisch hergestellten Reverse Strang die beiden 5'-terminalen Nukleotide als 2'-OMethyl-Nukleotide synthetisiert. Dies führt zu einer sauberen Termination der nascenten RNA-Moleküle in der in vitro-Transkription (Kao, Zheng et al. 1999; Kao, Rudisser et al. 2001).
First, a DNA library was prepared on a standard oligonucleotide synthesizer. This consists of the reverse strand, which contains the complementary regions to a portion of the forward primer binding region, which also contains the T7 promoter, to the randomized region and to the defined partial sequences. The synthesis of the reverse strand was chosen for two reasons:
  • 1. To be able to transcribe it without prior PCR amplification, in which the library would lose complexity even before the first round of selection. By simply adding the forward primer, the T7 RNA polymerase promoter region and the first 2 nucleotides to be transcribed were made double-stranded. Surprisingly, this was sufficient for transcription with T7 RNA polymerase in high yields.
  • 2. Since only a few copies of each potential aptamer are present in the RNA library in the first round of selection, quantitative amplification of the eluates in the PCR is of particular importance here. Therefore, microheterogeneities at the 3 'end of the in vitro transcribed RNA should be ruled out from the outset. These can lead to slight mismatches in the PCR if a C or T is inserted opposite the inosine, which does not mate well with the ribo U at the corresponding position of the reverse primer. In order to eliminate even this, certainly not serious source of error, the two 5'-terminal nucleotides were synthesized as 2'-OMethyl nucleotides already in the synthetically prepared reverse strand. This leads to a clean termination of nascent RNA molecules in in vitro transcription (Kao, Zheng et al., 1999; Kao, Rudisser et al., 2001).

Beispiel 8: Herstellung der verwendeten initialen langen RNA-BibliothekExample 8: Preparation the initial long RNA library used

Zunächst wurde an einem Standard-Oligonukleotid-Synthesizer eine DNA-Bibliothek hergestellt. Diese besteht aus dem Reverse Strang, der die komplementären Bereiche zur Forward Primer Bindungsregion, die auch den T3-Promotor (und den T7 Promotor, der hier für die Transkription nicht benötigt wird) enthält, zum randomisierten Bereich und zu den definierten Teilsequenzen enthält. Die Synthese des Reverse Stranges wurde aus folgendem Grund gewählt:
Um diesen ohne vorherige PCR-Amplifikation, bei der die Bibliothek schon vor der ersten Selektionsrunde an Komplexität einbüßen würde, transkribieren zu können. Durch einfaches Hinzufügen des Forward Primers wurde der T3 RNA-Polymerase-Promotorbereich, die 3' des T3-Promotorbereichs liegenden Sequenzen und die ersten 2 zu transkribierenden Nukleotide doppelsträngig gemacht. Dies reichte überraschenderweise für eine Transkription mit der T3 RNA Polymerase mit hohen Ausbeuten aus.First, a DNA library was made on a standard oligonucleotide synthesizer. This consists of the reverse strand, which contains the complementary regions to the forward primer binding region, which also contains the T3 promoter (and the T7 promoter, which is not required for transcription here), to the randomized region and to the defined partial sequences. The synthesis of the reverse strand was chosen for the following reason:
In order to be able to transcribe this without prior PCR amplification, in which the library would lose complexity even before the first round of selection. By simply adding the forward primer, the T3 RNA polymerase promoter region, the sequences 3 'of the T3 promoter region, and the first 2 nucleotides to be transcribed were made double-stranded. Surprisingly, this was sufficient for transcription with T3 RNA polymerase in high yields.

Beispiel 9: Konstruktion von Adaptermolekülen zur Aufnahme von PromotorbereichenExample 9: Construction of adapter molecules for inclusion of promoter areas

Das Konzept zur Konstruktion von Adaptermolekülen kann sowohl bei Verwendung von DNA als auch bei RNA eingesetzt werden. Das Forward Ligat und der Forward Primer für RNA-Bibliotheken, und der Reverse Primer/Reverse Matrizen für DNA-Bibliotheken enthalten dementsprechend die Promotorsequenzen für die Enzyme der Wahl: Verschiedene RNA Polymerasen und ihre Promotor Consensus Sequenzen

Figure 00820001
Figure 00830001
The concept of adapter molecule design can be used with both DNA and RNA. The forward ligate and forward primer for RNA libraries, and the reverse primer / reverse templates for DNA libraries accordingly contain the promoter sequences for the enzymes of choice: various RNA polymerases and their promoter consensus sequences
Figure 00820001
Figure 00830001

Beispiel 10: 5'-Phosphorylierung und Ligation von kurzen DNA-BibliothekenExample 10: 5'-Phosphorylation and ligation of short DNA libraries

Wenn die zu amplifizierende kurzen DNA-Bibliotheken kein 5'-Monophosphat trägt, muss sie zunächst phosphoryliert werden, um am 5'-Ende ligiert werden zu können. 5'-Phosphorylierung

Figure 00830002
If the short DNA library to be amplified does not carry 5'-monophosphate, it must first be phosphorylated to be able to be ligated at the 5'-end. 5'-phosphorylation
Figure 00830002

Die 5'-phosphorylierte DNA kann direkt in den Ligationsansatz überführt werden.The 5'-phosphorylated DNA can be transferred directly into the ligation mixture.

Ligationligation

Volumen des Ansatzes: 14 μl pro 1 pmolDNA- Template

Figure 00830003
Volume of the batch: 14 μl per 1 pmol of DNA template
Figure 00830003

Figure 00840001
Figure 00840001

Beispiel 11: Durchführung der Polymerase Kettenreaktion von DNA-BibliothekenExample 11: Implementation of Polymerase chain reaction of DNA libraries

Die PCR-Reaktion der langen DNA-Bibliothek wird mit den identischen Primern und unter den identischen Reaktionsbedingungen durchgeführt wie für die aus der Ligation kommenden kurzen DNA-Bibliothek.The PCR reaction of the long DNA library is identical to the one Primers and performed under the identical reaction conditions as for the from the ligation coming short DNA library.

Eckpunkte für die PCR sind:

Figure 00840002
Key points for the PCR are:
Figure 00840002

Die PCR ist optional, wenn genug DNA als Templat für die Transkriptionsreaktion vorliegt.The PCR is optional if enough DNA is used as a template for the transcription reaction is present.

Beispiel 12: Durchführung der in vitro Transkription von DNA-BibliothekenExample 12: Implementation of in vitro transcription of DNA libraries

Die in vitro Transkription wird für die Herstellung einer langen und kurzen Bibliothek unter Verwendung unterschiedlichen RNA-Polymerasen durchgeführt. Das Länge und Aufbau des zu transkribierenden PCR-Produkts sind in beiden Fällen identisch.

  • • Zur Herstellung einer langen Bibliothek wird die T3 Polymerase verwendet.
  • • Zur Herstellung einer kurzen Bibliothek wird die T7 Polymerase verwendet.
In vitro transcription is performed for the preparation of a long and short library using different RNA polymerases. The length and structure of the PCR product to be transcribed are identical in both cases.
  • • T3 polymerase is used to make a long library.
  • • T7 polymerase is used to make a short library.

Transkription (100 μl Ansatz)

Figure 00850001
Transcription (100 μl batch)
Figure 00850001

Beispiel 13: Reverse Transkription und optionaler alkalischer Verdau oder optionaler Restriktionsverdau zur Herstellung von DNA-BibliothekenExample 13: Reverse transcription and optional alkaline digestion or optional restriction digestion for the production of DNA libraries

Die RNAs können nun unter Zugabe des jeweiligen Forward Synthese-Primers, der

  • a) mindestens ein Ribonukleotid direkt 5' von der fixierten Teilsequenz an ihren 3'-Enden enthält (das gilt für die Herstellung von kurze DNA-Bibliotheken),
  • b) komplett aus DNA bestehen (das gilt für die Herstellung von langen DNA-Bibliotheken),
in komplementäre DNA (cDNA) überführt werden.The RNAs can now with the addition of the respective forward synthesis primer, the
  • a) contains at least one ribonucleotide directly 5 'from the fixed partial sequence at its 3' ends (this applies to the production of short DNA libraries),
  • b) consist entirely of DNA (this applies to the production of long DNA libraries),
be converted into complementary DNA (cDNA).

Eckpunkte für die RT sind:

Figure 00850002
Cornerstones for the RT are:
Figure 00850002

Figure 00860001
Figure 00860001

Die Temperaturbedingungen sind:
20 min @ 51 °C
10 min @ 54°CThe temperature conditions are:
20 min @ 51 ° C
10 min @ 54 ° C

Alkalischer Verdau des RNA-Templats und optional der Riboschnittstelle im synthetisierten DNA-StrangAlkaline digestion of the Synthesized RNA template and optionally the ribo in the DNA strand

Wenn eine kurze DNA-Bibliothek erzeugt werden soll werden die Bereiche des Forward Synthese Primers, die 5' vor der fixierten Teilsequenz liegen, durch Zugabe von Lauge und ggf. Erhitzen (310 mM NaOH, 95°C, 10 min) abgespalten. Gleichzeitig werden die RNA-Templat-Stränge hydrolysiert.If A short DNA library should be generated which will be the areas of the forward synthesis primer located 5 'in front of the fixed part sequence, by addition of lye and optionally heating (310 mM NaOH, 95 ° C, 10 min) cleaved. At the same time, the RNA template strands are hydrolyzed.

Falls eine lange DNA-Bibliothek erzeugt werden soll, wurde mit einem komplett aus DNA bestehenden Forward Synthese Primer gearbeitet, der nicht durch die Lauge hydrolysiert wird.If A long DNA library was to be created with a complete worked out of DNA forward synthesis primer, not is hydrolyzed by the brine.

Das Protokoll für die alkalische Spaltung der RNA und des DNA-Stranges sieht wie folgt aus:

Figure 00860002

  • – 10 min @ 95°C im PCR-Block, auf 4°C abkühlen, auf Eis weiterarbeiten
    Figure 00860003
  • – pH-Wert überprüfen, soll zwischen pH 5 und pH 6 liegen.
The protocol for the alkaline cleavage of the RNA and DNA strand is as follows:
Figure 00860002
  • - 10 min @ 95 ° C in the PCR block, cool to 4 ° C, continue working on ice
    Figure 00860003
  • - Check the pH should be between pH 5 and pH 6.

Nach der Abtrennung der Nukleotide und Primerfragmente können die DNA-Biliotheken können nun erneut in den Selektionsprozess eingesetzt werden.To the separation of the nucleotides and primer fragments, the DNA libraries can now be used again in the selection process.

Restriktion des 5'-Endes der cDNA mit Mnl IRestriction of the 5 'end of the cDNA with Mnl I

Der Restriktion des 5'-Endes ist nur im Fall der kurzen DNA-Bibliothek nötig und ist eine Alternative zum alkalischen Verdau. Bei der langen DNA-Bibliothek ist eine Spaltung 5' von dre ersten fixierten Teilsequenz nicht erforderlich.Of the Restriction of the 5'-end is only necessary in the case of the short DNA library and is an alternative to alkaline digestion. The long DNA library is a split 5 'of dre first fixed partial sequence not required.

Falls ein Restriktionsverdau durchgeführt wird, müssen die Forward-Primer/Forward Synthe- se DNA-Primer dementsprechend angepasst sein.If a restriction digest was performed will have to the forward primer / forward synthesis DNA primer accordingly be adjusted.

Mnl I schneidet folgende Sequenz auch an einzelsträngiger DNA im rT-Ansatz.mnl I also cuts the following sequence on single-stranded DNA in the rT approach.

5'...CCTC(N)7'...3'

Figure 00870001
5 '... CCTC (N) 7 ' ... 3 '
Figure 00870001

Die Temperaturbedingungen sind:
5 min @ 95°C, Hitzeinaktivierung der reversen Transkriptase, vor Zugabe von BSA und Restriktionsenzym.
1 h @ 37°C
20 min @ 65°CThe temperature conditions are:
5 min @ 95 ° C, heat inactivation of reverse transcriptase, before addition of BSA and restriction enzyme.
1 h @ 37 ° C
20 min @ 65 ° C

Das Restriktionsenzym kann über einen Enzymfilter (z.B. Micropure-EZ, Millipore) abgetrennt werden, fall dies erforderlich ist.The Restriction enzyme can be over an enzyme filter (e.g., Micropure EZ, Millipore) may be separated this is required.

Beispiel 17: Sequenzen, wie sie im Rahmen der Erfidung verwendet wurdenExample 17: sequences, as used in the context of the invention

Die nachfolgenden Sequenzen können im Rahmen der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung verwendet werden.The subsequent sequences can used in the various aspects of the present invention become.

RNA-Bibliothek P1

Figure 00880001
RNA library P1
Figure 00880001

RNA-Bibliothek P2x

Figure 00880002
RNA library P2x
Figure 00880002

Figure 00890001
Figure 00890001

DNA-Bibliothek

Figure 00890002
DNA library
Figure 00890002

FNA-Bibliothek

Figure 00900001
FNA library
Figure 00900001

In der vorliegenden Beschreibung wird auf verschiedene Literaturstellen verwiesen, die hier aus Übersichtsgründen zusammengefasst dargestellt sind und deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.

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In the present specification, reference is made to various references, which are hereby summarized for the sake of clarity and the disclosure of which is incorporated herein by reference.
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Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.The in the foregoing description, claims and drawings Features of the invention can both individually and in any combination to the realization be essential to the invention in its various embodiments.

Claims (72)

Verfahren zur Selektion einer an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäure, insbesondere Aptamere, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer heterogenen Population von Nukleinsäuren, insbesondere D-Nukleinsäuren, wobei eine jede Nukleinsäure einen Bereich mit einer randomisierten Sequenz und zumindest einer konstanten Sequenz aufweist und sich die die Population ausbildenden Nukleinsäuren in der randomisierten Sequenz unterscheiden, (b) Inkontaktbringen der Population von Nukleinsäuren mit dem Zielmolekül, (c) Abtrennen der Nukleinsäuren, die nicht mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten sind, (d) Abtrennen der Nukleinsäure(n), die mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten ist/sind, von dem Zielmolekül, (e) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (d) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind, (f) Amplifizieren der Nukleinsäure aus Schritt (d), (g) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (f), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (f) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind, (h) optional Sequenzieren der aus Schritt (d) oder Schritt (f) erhaltenen Nukleinsäure(n), dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt (f) in einer ersten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt: (faa) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Ribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst, (fab) Bereitstellen eines ersten Adaptermoleküls, wobei das erste Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht und wobei der erste Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Ribonukleinsäure ist und der zweite Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 5'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges einen Überhang liefert, wobei der Überhang zumindest teilweise zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist, (fac) Bereitstellen eines zweiten Adaptermoleküls, wobei das zweite Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurestrang eine Phosphatgruppe an der 5'-Position des Ribose- oder Desoxyriboseteils des 5'-terminalen Nukleotids trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon und wobei der zweite Nukleinsäurestrang eine Spaltstelle aufweist, die bei Spaltung des Nukleinsäurestranges ein erstes Spaltprodukt und ein zweites Spaltprodukt liefert, wobei das erste Spaltprodukt das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls ist, das zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure (fad) Ligieren des ersten und des zweiten Adaptermoleküls an die zu amplifizierende Nukleinsäure, um ein Ligationsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (fae) Durchführen einer reversen Transkription, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (faf) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (fag) optional Spalten eines Stranges des Reaktionsproduktes aus Schritt (faf), wobei der Strang derjenige ist, der komplementär ist zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure, um ein Transkriptionsausgangsprodukt zu erhalten, und (fah) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt, um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten. oder in einer zweiten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt: (fba) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste Primersequenz und eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und eine zweite Primerbindungssequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst, (fbb) Durchführen einer reversen Transkription an der in Schritt (fba) bereitgestellten zu amplifiziernden Nukleinsäure, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei als Primer der zweite Strang des zweiten Adaptermoleküls verwendet wird, (fbc) Durchführen einer Zweitstrangsynthese unter Verwendung des ersten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls und des zweiten Stranges des zweiten Adaptermoleküls, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (fbd) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Reaktionsprodukt aus Schritt (fbc), um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten.A method for selecting a nucleic acid that binds to a target molecule, in particular aptamers, comprising the steps: (a) providing a heterogeneous population of nucleic acids, in particular D-nucleic acids, wherein each nucleic acid has an area with a randomized sequence and at least one constant sequence and discriminating the population-forming nucleic acids in the randomized sequence, (b) contacting the population of nucleic acids with the target molecule, (c) separating the nucleic acids that did not interact with the target molecule, (d) separating the nucleic acid (s), (e) optionally repeating steps (a) through (d), wherein the nucleic acid (s) of step (d) form or are contained within the heterogeneous population , (f) amplifying the nucleic acid from step (d), (g) optionally repeating steps (a) to (f), wherein the nucleic acid (s) of step (f) form or are contained in the heterogeneous population, (h) optionally sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or step (f), characterized in a first alternative, the amplification step (f) is carried out by the following steps: (faa) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a ribonucleic acid and at the 5 'end a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined subsequence and between the first defined subsequence and the second defined subsequence comprises an intermediate sequence, wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence, (fab) providing a first adapter molecule, wherein the first adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, and wherein the first nucleic acid strand is preferably a ribonucleic acid is acidic and the second nucleic acid strand is preferably a deoxyribonucleic acid and the 5'-end of the second nucleic acid strand provides an overhang, wherein the overhang is at least partially complementary to the first defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof, (fc) providing a second An adapter molecule, wherein the second adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand carries a phosphate group at the 5 'position of the ribose or deoxyribose part of the 5'-terminal nucleotide and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and the 3 'end of the second strand of nucleic acid is at least partially complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified or a portion thereof and wherein the second strand of nucleic acid has a cleavage site which upon cleavage g of the nucleic acid strand provides a first cleavage product and a second cleavage product, wherein the first cleavage product is the 3'-end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule that is at least partially complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified (fad), ligating the first and (fae) performing a reverse transcription to obtain a reverse transcription product as a reaction product, (faf) optionally performing a second-strand synthesis to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a reaction product (fag) optionally columns of a strand of the reaction product of step (faf), wherein the strand is the one that is complementary to the nucleic acid to be amplified to obtain a transcriptional starting product, and (fah) performing a transcript iptionsreaktion on the transcription starting product to obtain a transcription product. or in a second alternative by the following steps: (fba) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is a ribonucleic acid and at the 5 'end a first primer sequence and a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined partial sequence and a second primer binding sequence and between the first defined partial sequence and the second defined partial sequence comprises an intermediate sequence, wherein the intermediate sequence randomizes (fbb) performing a reverse transcription on the nucleic acid to be amplified provided in step (fba) to obtain a reverse transcription product as a reaction product using as a primer the second strand of the second adapter molecule, (fbc) performing a second strand synthesis using the first nucleic acid strand of the first adapter molecule and the second strand of the second adapter molecule to obtain a double stranded second strand synthesis product as a reaction product, (fbd) performing a transcription reaction on the reaction product of step (fbc) to obtain a transcription product. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Transkriptionsprodukt eine Nukleinsäure, bevorzugterweise eine einzelsträngige Nukleinsäue, ist, wobei – die Nukleinsäure identisch ist mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure, und/oder – die Nukleinsäure identisch ist mit der zu amplifizierenden Nukleinsäure und am 3'-Ende ein zusätzliches Nukleotid aufweist.Method according to claim 1, characterized in that the transcription product is a nucleic acid, preferably a nucleic acid single Nukleinsäue, is, where - the nucleic acid is identical to the nucleic acid to be amplified, and / or - the nucleic acid identical is with the nucleic acid to be amplified and at the 3 'end an additional Having nucleotide. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein drittes Adaptermolekül bereitgestellt wird, bevorzugterweise in Schritt (fac), wobei das dritte Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurestrang am 5'-Ende ein 5'-Phosphat trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon, und wobei der zweite Nukleinsäurestrang eine Spaltstelle aufweist, die bei Spaltung des Nukleinsäurestranges ein erstes Spaltprodukt und ein zweites Spaltprodukt liefert, wobei das erste Spaltprodukt das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des dritten Adaptermoleküls ist, das zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei der erste Nukleinsäurestrang am 5'-Ende um ein Nukleotid kürzer ist als der erste Strang des zweiten Adaptermoleküls und der zweite Nukleinsäurestrang des dritten Adaptermoleküls an der Spaltstelle ein universelles Nukleobasen-Analogon, bevorzugterweise ein universelles Ribonukleotid bevorzugtererweise ein Inosin aufweist, das mit dem zusätzlichen Nukleotid der Nukleinsäuren, die zusätzlich am 3'-Ende zumindest ein zusätzliches Nukleotid aufweisen, basenpaart, und das dritte Adaptermolekül an die zu amplifizierende Nukleinsäure in Schritt (fad) ligiert wird, um ein Ligationsprodukt zu erhalten.Method according to claim 2, characterized in that that a third adapter molecule is provided, preferably in step (fac), wherein the third adapter molecule from a double-stranded nucleic acid consists of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand at 5'-end carries a 5'-phosphate and the second nucleic acid strand a deoxyribonucleic acid is and the 3'-end of the second nucleic acid strand at least partially complementary is to the second defined subsequence of the to be amplified nucleic acid or a part thereof, and wherein the second nucleic acid strand has a cleavage site which upon cleavage of the nucleic acid strand provides a first cleavage product and a second cleavage product, wherein the first cleavage product the 3'-end of the second nucleic acid strand of the third adapter molecule is at least partially complementary to the second defined Partial sequence of the nucleic acid to be amplified, wherein the first nucleic acid strand at the 5'-end one Nucleotide is shorter as the first strand of the second adapter molecule and the second nucleic acid strand of the third adapter molecule at the cleavage site, a universal nucleobase analog, preferably a universal ribonucleotide more preferably has an inosine, that with the extra Nucleotide of the nucleic acids, the additional at the 3'-end at least an additional Having nucleotide, basepair, and the third adapter molecule to the to be amplified nucleic acid in step (fad) to obtain a ligation product. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Primersequenz der Nukleinsäue von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls von Schritt (fab) und/oder die zweite Primerbindungssequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls von Schritt (fac) und/oder die zweite Primerbindungsstelle der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des dritten Adaptermoleküls von Schritt (fac).Method according to one of claims 1 to 3, characterized that the first primer sequence of the nucleic acid of step (fba) substantially identical, preferably identical to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule of step (fab) and / or the second primer binding sequence of nucleic acid of step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the second adapter molecule of step (fac) and / or the second primer binding site of the nucleic acid of Step (fba) is substantially identical, preferably identical is with the first strand of nucleic acid of the third adapter molecule from step (fac). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt (fad) und/oder Schritt (faf) oder Schritt (fbc) durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, wobei zum Ligationsprodukt neben dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls noch ein PCR-Primennolekül verwendet wird, wobei das PCR-Primermolekül zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder zum ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the transcription starting product according to step (fad) and / or step (faf) or step (fbc) obtained by a polymerase chain reaction is, wherein the ligation product in addition to the second strand of nucleic acid of the second adapter molecule another PCR priming molecule is used, wherein the PCR primer molecule at least partially identical is to the first defined subsequence of the to be amplified nucleic acid and / or to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls mindestens zwei Promotoren umfasstMethod according to one of claims 1 to 5, characterized that the first nucleic acid strand of the first adapter molecule comprises at least two promoters Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Promotoren mindestens zwei verschiedene Promotoren sind.Method according to Claim 6, characterized that the at least two promoters are at least two different Promoters are. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotoren einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Promotoren für eine RNA-Polymerase, bevorzugterweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase umfasst.Method according to claim 6 or 7, characterized the promoters are selected individually and independently of each other from the group who promoters for an RNA polymerase, preferably T7, T3 or SP6 RNA polymerase includes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Transkription das 5'-Monophosphat des ersten Nukleotids, bevorzugterweise Guanosin-5'-monophosphat und/oder modifizierte Guanosin-5'-Monophosphate als Starternukleotid eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 7, characterized that during transcription the 5'-monophosphate the first nucleotide, preferably guanosine 5'-monophosphate and / or modified guanosine 5'-monophosphates as Starter nucleotide is used. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Starternukleotid im Überschuss, bevorzugterweise im zwei- bis zehnfachen Überschuss, bevorzugtererweise im vier- bis achtfachen Überschuss gegenüber dem jeweiligen Nukleotid-5'-Triphosphat eingesetzt wird.Method according to claim 9, characterized in that that the starter nucleotide in excess, preferably in a 2- to 10-fold excess, more preferably in four to eight times the surplus over the respective nucleotide 5'-triphosphate is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die doppelsträngige Ribonukleinsäure, die einzelsträngige Ribonukleinsäure, doppelsträngige modifizierte Ribonukleinsäure und einzelsträngige modifizierte Ribonukleinsäure umfasst.Method according to one of claims 1 to 10, characterized that the nucleic acid selected is from the group that contains double-stranded ribonucleic acid single ribonucleic acid, double modified ribonucleic acid and single-stranded modified ribonucleic acid includes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in 5'-Richtung zumindest einer der zumindest-beiden Promotoren, bevorzugterweise in 5'-Richtung des am meisten 5'-terminal gelegenen Promotors, zusätzliche Basen angeordnet sind, um den Schmelzpunkt des in der Zweitstrangsynthese eingesetzten Primers zu erhöhen, wobei als Primer der erste Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls verwendet wird und ein DNA-Primer hinzugefügt wird, dessen Sequenz der Sequenz des ersten Stranges des ersten Adapters entspricht und dessen 3'-Ende bevorzugterweise zusätzlich eine Sequenz umfasst, die identisch ist mit der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure.Method according to one of claims 1 to 11, characterized that in the 5 'direction at least one the at least two promoters, preferably in the 5 'direction of the am most 5'-terminal located promoter, additional Bases are arranged to the melting point of the used in the second-strand synthesis Increase primers, wherein the primer used is the first nucleic acid strand of the first adapter molecule is added and a DNA primer whose sequence is the sequence of the first strand of the first Adapters corresponds and its 3 'end preferably in addition comprises a sequence identical to the first one defined Partial sequence of the nucleic acid to be amplified. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zweitstrangsynthese direkt im Anschluss an die Ligation ohne vorherige Aufreinigung erfolgt.Method according to one of claims 1 to 11, characterized that the second-strand synthesis is directly following the ligation done without prior purification. Verfahren zur Selektion einer an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäure, insbesondere Aptamere, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer heterogenen Population von Nukleinsäuren, insbesondere D-Nukleinsäuren, wobei eine jede Nukleinsäure einen Bereich mit einer randomisierten Sequenz und zumindest einer konstanten Sequenz aufweist und sich die die Population ausbildenden Nukleinsäuren in der randomisierten Sequenz unterscheiden, (b) Inkontaktbringen der Population von Nukleinsäuren mit dem Zielmolekül, (e) Abtrennen der Nukleinsäuren, die nicht mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten sind, (d) Abtrennen der Nukleinsäure(n), die mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten ist/sind, von dem Zielmolekül, (e) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (d) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind, (f) Amplifizieren der Nukleinsäure aus Schritt (d), (g) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (f), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (f) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind, (h) optional Sequenzieren der aus Schritt (d) oder Schritt (f) erhaltenen Nukleinsäure(n), dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt (f) in einer ersten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt: (faa) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst, (faaa) Phosphorylieren des 5'-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure, sofern die in Schritt (faa) bereitgestellte zu amplifizierende Nukleinsäure kein Phosphat am 5'-Ende aufweist, (fab) Bereitstellen eines ersten Adaptermoleküls, wobei das erste Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht und wobei der erste Nukleinsäurestrang und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 5'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges einen Überhang liefert, wobei der Überhang zumindest teilweise zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist, (fac) Bereitstellen eines zweiten Adaptermoleküls, wobei das zweite Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurstrang ein 5'-Phosphat trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon, (fad) Ligieren des ersten und des zweiten Adaptermoleküls an die zu amplifizierende Nukleinsäure, um ein Ligationsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei bevorzugterweise der zweite Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls an das Ligationsprodukt hybridisiert wird oder an dieses hybridisiert vorliegt, (fae) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese des Reaktionsprodukts aus Schritt (fad), um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Transkriptionsausgangsprodukt zu erhalten, (faf) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt aus Schritt (fae) oder an dem Reaktionsprodukt aus Schritt (fad), um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten, (fag) Bereitstellen eines Primermoleküls, wobei das Primermolekül einen ersten Bereich umfasst, der zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder einen in 5'-Richtung daran anschließenden zweiten Bereich, der an seinem 3'-Ende eine Spaltstelle aufweist oder vollständig aus Ribonukleinsäurebausteinen aufgebaut ist, und zumindest teilweise identisch ist zu der Sequenz des ersten Stranges des ersten Adaptermoleküls, und Anhybridisieren des Primermoleküls an das Transkriptionsprodukt, (fah) Durchführen einer reversen Transkription an dem Transkriptionsprodukt, an das das Primermolekül hybridisiert vorliegt, um ein reverses Transkriptionsprodukt zu erhalten, und (fai) optional Durchführung einer Spaltung an der Spaltstelle des Primermoleküls. oder und in einer zweiten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt: (fba) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und in 5'-3'-Richtung eine Primersequenz, eine erste definierte Teilsequenz, eine Zwischensequenz, eine zweite definierte Teilsequenz und eine Primerbindungssequenz aufweist, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst, (fbb) Erzeugen eines Transkriptionsausgangsproduktes, wobei an die Primerbindungssequenz am 3'Ende der zu amplifizierenden Nukleinsäure aus Schritt (fba) der zweite Strang des zweiten Adaptermoleküls aus Schritt (fac) hybridisiert wird, (fbc) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt, um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten, (fbd) Bereitstellen eines Primermoleküls, wobei das Primermolekül dem ersten Strang des ersten Adaptermolekül entspricht, und (fbe) Durchführen einer reversen Transkription an dem Transkriptionsprodukt, an das das Primermolekül hybridisiert vorliegt, um ein reverses Transkriptionsprodukt zu erhalten.A method for selecting a nucleic acid that binds to a target molecule, in particular aptamers, comprising the steps: (a) providing a heterogeneous population of nucleic acids, in particular D-nucleic acids, wherein each nucleic acid has an area with a randomized sequence and at least one constant sequence and discriminating the population-forming nucleic acids in the randomized sequence, (b) contacting the population of nucleic acids with the target molecule, (e) separating the nucleic acids that did not interact with the target molecule, (d) separating the nucleic acid (s), (e) optionally repeating steps (a) through (d), wherein the nucleic acid (s) of step (d) form or are contained within the heterogeneous population , (f) amplifying the nucleic acid from step (d), (g) optionally repeating steps (a) to (f), wherein the nucleic acid (s) of step (f) form or are contained in the heterogeneous population, (h) optionally sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or step (f), characterized in a first alternative, the amplification step (f) is carried out by the following steps: (faa) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a deoxyribonucleic acid and at the 5 'end a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined subsequence and between the first defined subsequence and the second defined subsequence comprises an intermediate sequence, wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence, (faaa) phosphorylating the 5'-end of the nucleic acid to be amplified, provided that in step (faa) provided to be amplified nucleic acid no phosphate at the 5 'end, (fab) providing a first adapter molecule, wherein the first Adapt in which the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and the 5'-end of the second nucleic acid strand provides an overhang, wherein the overhang at least partially to the first defined part of the subsequence (2f) complementing nucleic acid or a part thereof, (fc) providing a second adapter molecule, wherein the second adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand carries a 5'-phosphate and the second nucleic acid strand carries a deoxyribonucleic acid and the 3 'end of the second nucleic acid strand is at least partially complementary to the second defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof, (fad) ligating the first and the second ad adapter molecule to the nucleic acid to be amplified to obtain a ligation product as a reaction product, preferably wherein the second nucleic acid strand of the second adapter molecule is hybridized to or hybridized to the ligation product, (fae) optionally performing a second-strand synthesis of the reaction product of step (fad), (faf) performing a transcription reaction on the transcriptional starting product of step (fae) or on the reaction product of step (fad) to obtain a transcriptional product, to obtain a transcriptional starting double-stranded synthesis product (fag) providing a primer molecule, wherein the primer molecule comprises a first region which is at least partially identical to the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified and / or a second region adjoining in the 5 'direction at its 3' end has a cleavage site or is made up entirely of ribonucleic acid building blocks, and is at least partially identical to the sequence of the first strand of the first adapter molecule, and hybridizing the primer molecule to the transcription product, (fah) performing a reverse transcription on the transcription product to which the primer molecule is hybridized to obtain a reverse transcription product, and (fai) optionally performing cleavage at the cleavage site of the primer molecule. or and in a second alternative by the following steps: (fba) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a deoxyribonucleic acid and in the 5'-3 'direction a primer sequence, a first defined partial sequence, an intermediate sequence, a second (fbb) generating a transcriptional starting product, wherein the primer binding sequence at the 3 'end of the nucleic acid to be amplified from step (fba), the second strand of the second adapter molecule from step (fac) (fbc) performing a transcription reaction on the transcription starting product to obtain a transcription product, (fbd) providing a primer molecule, wherein the primer molecule corresponds to the first strand of the first adapter molecule, and (fbe) performing a reverse transcription on the tran The product of the invention, to which the primer molecule has hybridized, in order to obtain a reverse transcription product. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Primersequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls von Schritt (fab) und/oder die zweite Primerbindungssequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen komplemetär, bevorzugterweise komplementär ist zu der am 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls von Schritt (fac) angeordneten Promotorsequenz.Method according to claim 14, characterized in that that the first primer sequence of the nucleic acid of step (fba) substantially identical, preferably identical to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule of step (fab) and / or the second primer binding sequence of nucleic acid of step (fba) is essentially complementary, preferably complementary to the at the 3'-end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule from step (fac) arranged promoter sequence. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt (fbb) das Ergebnis einer Zweitstrangsynthese ist und der Zweitstrang bevorzugterweise durch Verlängerung des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls hergestellt wird.Method according to claim 14 or 15, characterized that the transcription starting product according to step (fbb) the result a second strand synthesis and the second strand is preferably by renewal of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule will be produced. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt (fad) und/oder Schritt (fae) oder Schritt (fbb) durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, wobei bevorzugterweise zum Ligationsprodukt neben dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls noch ein PCR-Primermolekül verwendet wird, wobei das PCR-Primermolekül zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder zum ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls.Method according to one of claims 14 to 16, characterized in that the transcription starting product according to step (fad) and / or step (fae) or step (fbb) obtained by a polymerase chain reaction is, preferably the ligation product in addition to the second nucleic acid strand of the second adapter molecule another PCR primer molecule is used, wherein the PCR primer molecule at least partially identical is to the first defined subsequence of the to be amplified nucleic acid and / or to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das reverse Transkriptionsprodukt einer alkalischen Spaltung unterzogen wird.Method according to one of claims 14 to 17, characterized that the reverse transcription product of an alkaline cleavage is subjected. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls mindestens zwei Promotoren umfasst.Method according to one of claims 14 to 18, characterized that the second strand of nucleic acid of the second adapter molecule comprises at least two promoters. Verfahren nach Anspruch 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Promotoren mindestens zwei verschiedene Promotoren sind.Method according to claims 14 to 19, characterized that the at least two promoters are at least two different Promoters are. Verfahren nach Anspruch 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotoren einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Promotoren für eine RNA-Polymerase, bevorzugterweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase umfasst.Method according to claims 14 to 20, characterized the promoters are selected individually and independently of each other from the group who promoters for an RNA polymerase, preferably T7, T3 or SP6 RNA polymerase includes. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Phosphorylieren in Schritt (faaa) durch eine Kinasierung erfolgt.Method according to one of claims 14 to 21, characterized that the phosphorylation in step (faaa) by a kinase he follows. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass in 5'-Richtung des Promotors zusätzliche Basen angeordnet sind, um den Schmelzpunkt des in der Zweitstrangsynthese eingesetzten Primers zu erhöhen.Method according to one of claims 14 to 22, characterized in that in the 5'-direction of the promoter additional bases are arranged to the melting point of the used in the second-strand synthesis increase primer. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die doppelsträngige DNA, einzelsträngige DNA, doppelsträngige modifizierte DNA und einzelsträngige modifizierte DNA umfasst.Method according to one of claims 14 to 22, characterized that the nucleic acid selected is from the group that has double-stranded DNA, single-stranded DNA, double modified DNA and single-stranded modified DNA. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Zweitstrangsynthese direkt im Anschluss an die Ligation ohne vorherige Aufreinigung erfolgt.Method according to one of claims 14 to 24, characterized that the second-strand synthesis is directly following the ligation done without prior purification. Verfahren zur Selektion einer an ein Zielmolekül bindenden Nukleinsäure, insbesondere Aptamere, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer heterogenen Population von Nukleinsäuren, insbesondere D-Nukleinsäuren, wobei eine jede Nukleinsäure einen Bereich mit einer randomisierten Sequenz und zumindest einer konstanten Sequenz aufweist und sich die die Population ausbildenden Nukleinsäuren in der randomisierten Sequenz unterscheiden, (b) Inkontaktbringen der Population von Nukleinsäuren mit dem Zielmolekül, (c) Abtrennen der Nukleinsäuren, die nicht mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten sind, (d) Abtrennen der Nukleinsäure(n), die mit dem Zielmolekül in Wechselwirkung getreten ist/sind, von dem Zielmolekül, (e) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (d), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (d) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind, (f) Amplifizieren der Nukleinsäure aus Schritt (d), (g) optional Wiederholen der Schritte (a) bis (f), wobei die Nukleinsäure(n) aus Schritt (f) die heterogene Population ausbilden oder in dieser enthalten sind, (h) optional Sequenzieren der aus Schritt (d) oder Schritt (f) erhaltenen Nukleinsäure(n), dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt (f) in einer ersten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt: (faa) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine Ribonukleinsäure ist und am 5'-Ende eine erste definierte Teilsequenz, am 3'-Ende eine zweite definierte Teilsequenz und zwischen der ersten definierten Teilsequenz und der zweiten definierten Teilsequenz eine Zwischensequenz umfasst, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst, (faaa) Phosphorylieren des 5'-Endes der zu amplifizierenden Nukleinsäure, sofern die in Schritt (faa) bereitgestellte zu amplifizierende Nukleinsäure kein Phosphat am 5'-Ende aufweist (fab) Bereitstellen eines ersten Adaptermoleküls, wobei das erste Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nuk leinsäurestrang besteht und wobei der erste Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und der zweite Nukleinsäurestrang bevorzugterweise eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 5'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges einen Überhang liefert, wobei der Überhang zumindest teilweise zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon komplementär ist, (fac) Bereitstellen eines zweiten Adaptermoleküls, wobei das zweite Adaptermolekül aus einer doppelsträngigen Nukleinsäure aus einem ersten und einem zweiten Nukleinsäurestrang besteht, wobei der erste Nukleinsäurestrang eine Phosphatgruppe an der 5'-Position des Ribose- oder Desoxyriboseteils des 5'-terminalen Nukleotids trägt und der zweite Nukleinsäurestrang eine Desoxyribonukleinsäure ist und das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges zumindest teilweise kom- plementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon und wobei der zweite Nukleinsäurestrang eine Spaltstelle aufweist, die bei Spaltung des Nukleinsäurestranges ein erstes Spaltprodukt und ein zweites Spaltprodukt liefert, wobei das erste Spaltprodukt das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls ist, das zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure (fad) Ligieren des ersten und des zweiten Adaptermoleküls an die zu amplifizierende Nukleinsäure, um ein Ligationsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (fae) Durchführen einer reversen Transkription, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, (faf) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Transkriptionsausgangsprodukt zu erhalten, (fag) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Transkriptionsausgangsprodukt, um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten, (fah) Durchführen einer Nukleinsäuresynthesereaktion unter Verwendung von modifizierten Nueklosidtriphosphaten, insbesondere 2'-F-Nukleosidtriphosphaten, ausgehend von dem Transkriptionsprodukt von Schritt (fag), wobei ein Syntheseprimer verwendet wird, wobei der Syntheseprimer einen ersten Bereich umfasst, der zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder einen in 5'-Richtung daran anschließen den zweiten Bereich, der an seinem 3'-Ende eine Spaltstelle aufweist oder vollständig aus Ribonukleinsäurebausteinen aufgebaut ist, und zumindest teilweise identisch ist zu der Sequenz des ersten Stranges des ersten Adaptermoleküls, (fai) optional Umsetzen des Reaktionsproduktes aus Schritt (fag), bevorzugterweise unter Verwendung alkalischen Bedingungen und/oder Hitze, bevorzugterweise um eine im wesentlichen zu der zu amplifizierenden Nukleinsäure identische Nukleinsäure zu erhalten, oder in einer zweiten Alternative durch die folgenden Schritte erfolgt: (fba) Bereitstellen der zu amplifizierenden Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist und in 5'-3'-Richtung eine Primersequenz, eine erste definierte Teilsequenz, eine Zwischensequenz, eine zweite definierte Teilsequenz und eine Primerbindungssequenz aufweist, wobei die Zwischensequenz die randomisierte Sequenz umfasst, (fbb) Durchführen einer reversen Transkription an der in Schritt (fba) bereitgestellten zu amplifiziernden Nukleinsäure, um ein reverses Transkriptionsprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei als Primer der zweite Strang des zweiten Adaptermoleküls verwendet wird, (fbc) optional Durchführen einer Zweitstrangsynthese, um ein doppelsträngiges Zweitstrangsyntheseprodukt als Reaktionsprodukt zu erhalten, wobei der Zweitstrang bevorzugterweise im wesentlichen komplementär ist zu dem in Schritt (fbb) erhaltenen Reaktionsprodukt der reversen Transkriptase, (fbd) Durchführen einer Transkriptionsreaktion an dem Reaktionsprodukt aus Schritt (fbb) oder (fbc), um ein Transkriptionsprodukt zu erhalten, und (fbe) Durchführen einer Nukleinsäuresynthesereaktion ausgehend von dem Transkriptionsprodukt von Schritt (fbd), wobei ein Syntheseprimer verwendet wird, wobei der Syntheseprimer aus dem ersten Strang des ersten Adaptermoleküls besteht unter Verwendung von modifizierten Nueklosidtriphosphaten, insbesondere 2'-F-Nukleosidtriphosphaten.A method for selecting a nucleic acid that binds to a target molecule, in particular aptamers, comprising the steps: (a) providing a heterogeneous population of nucleic acids, in particular D-nucleic acids, wherein each nucleic acid has an area with a randomized sequence and at least one constant sequence and discriminating the population-forming nucleic acids in the randomized sequence, (b) contacting the population of nucleic acids with the target molecule, (c) separating the nucleic acids that did not interact with the target molecule, (d) separating the nucleic acid (s), (e) optionally repeating steps (a) through (d), wherein the nucleic acid (s) of step (d) form or are contained within the heterogeneous population , (f) amplifying the nucleic acid from step (d), (g) optionally repeating steps (a) to (f), wherein the nucleic acid (s) of step (f) form or are contained in the heterogeneous population, (h) optionally sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or step (f), characterized in a first alternative, the amplification step (f) is carried out by the following steps: (faa) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is preferably a ribonucleic acid and at the 5 'end a first defined partial sequence, at the 3' end a second defined subsequence and between the first defined subsequence and the second defined subsequence comprises an intermediate sequence, wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence, (faaa) phosphorylating the 5'-end of the nucleic acid to be amplified, provided that in step (faa) provided to be amplified nucleic acid has no phosphate at the 5 'end (fab) providing a first adapter molecule, wherein the first adapter molecule ül consists of a double-stranded nucleic acid from a first and a second nucleic acid strand and wherein the first nucleic acid strand is preferably a deoxyribonucleic acid and the second nucleic acid strand is preferably a deoxyribonucleic acid and the 5'-end of the second nucleic acid strand provides an overhang, wherein the overhang at least partially the first defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified or a part thereof is complementary, (ff) providing a second adapter molecule, wherein the second adapter molecule consists of a double-stranded nucleic acid of a first and a second nucleic acid strand, wherein the first nucleic acid strand is a phosphate group on the 5 ' Position of the ribose or deoxyribose part of the 5'-terminal nucleotide and the second nucleic acid strand is a deoxyribonucleic acid and at least partially completing the 3'-end of the second nucleic acid strand The second nucleic acid strand has a cleavage site which, upon cleavage of the nucleic acid strand, yields a first cleavage product and a second cleavage product, wherein the first cleavage product is the 3'-end of the second nucleic acid strand the second adapter molecule is at least partially complementary to the second defined partial sequence of the nucleic acid to be amplified (fad) ligating the first and the second adapter molecule to the nucleic acid to be amplified to obtain a ligation product as a reaction product, (fae) performing a reverse transcription to obtain a reverse transcription product as a reaction product, (faf) optionally performing a second-strand synthesis to obtain a double-stranded second-strand synthesis product as a transcription starting product, (fag) performing a transcription reaction on the Transcription starting product to obtain a transcription product, (fah) performing a nucleic acid synthesis reaction using modified nucleotide triphosphates, in particular 2'-F nucleoside triphosphates, starting from the transcription product of step (fag) using a synthesis primer, the synthesis primer comprising a first region includes, the at least partially identical to the first defined subsequence of the nucleic acid to be amplified and / or a second region adjoining it in the 5 'direction, which has a cleavage site at its 3' end or is constructed completely from ribonucleic acid units, and is at least partially identical to the sequence of the first strand of the first adapter molecule, (fai) optionally reacting the reaction product of step (fag), preferably using alkaline conditions and / or heat, preferably to obtain a nucleic acid substantially identical to the nucleic acid to be amplified, or a second alternative by the following steps: (fba) providing the nucleic acid to be amplified, wherein the nucleic acid is a ribonucleic acid and in 5'-3 'direction a primer sequence, a first defined subsequence, an intermediate sequence, a second defined subsequence and a Primerbindungssequen z, wherein the intermediate sequence comprises the randomized sequence, (fbb) performing a reverse transcription on the nucleic acid to be amplified provided in step (fba) to obtain a reverse transcription product as a reaction product, using as a primer the second strand of the second adapter molecule (fbc) optionally performing a second strand synthesis to obtain a double stranded second strand synthesis product as a reaction product, the second strand preferably being substantially complementary to the reverse transcriptase reaction product obtained in step (fbb), (fbd) performing a transcription reaction on the reaction product of step (fbb) or (fbc) to obtain a transcription product; and (fbe) performing a nucleic acid synthesis reaction from the transcription product of step (fbd) using a synthesis primer, wherein the synthesis primer is selected from the first strand of the first An adapter molecule consists of modified nucleotide triphosphates, in particular 2'-F nucleoside triphosphates. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Primersequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen identisch, bevorzugterweise identisch ist mit dem ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls von Schritt (fab) und/oder die zweite Primerbindungssequenz der Nukleinsäure von Schritt (fba) im wesentlichen komplementär, bevorzugterweise komplementär ist zu der am 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls von Schritt (fac) angeordneten Promotorsequenz.Method according to claim 26, characterized in that that the first primer sequence of the nucleic acid of step (fba) substantially identical, preferably identical to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule of step (fab) and / or the second primer binding sequence of nucleic acid of step (fba) is substantially complementary, preferably complementary to the at the 3'-end of the second nucleic acid strand of the second adapter molecule from step (fac) arranged promoter sequence. Verfahren nach einem der Ansprüche Anspruch 26 und 27 dadurch gekennzeichnet, dass das Transkriptionsausgangsprodukt gemäß Schritt Reaktionsprodukt gemäß Schritt (faf) oder Schritt (fbc) durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, wobei bevorzugterweise zum Ligationsprodukt neben dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls noch ein PCR-Primermolekül verwendet wird, wobei das PCR-Primermolekül zumindest teilweise identisch ist zu der ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure und/oder zum ersten Nukleinsäurestrang des ersten Adaptermoleküls.Method according to one of claims claim 26 and 27 characterized in that the transcriptional starting product according to step Reaction product according to step (faf) or step (fbc) obtained by a polymerase chain reaction is, preferably the ligation product in addition to the second nucleic acid strand of the second adapter molecule another PCR primer molecule is used, wherein the PCR primer molecule at least partially identical is to the first defined subsequence of the to be amplified nucleic acid and / or to the first nucleic acid strand of the first adapter molecule. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptenmoleküls mindestens zwei Promotoren umfasst.Method according to one of claims 26 to 28, characterized that the second strand of nucleic acid of the second adapten molecule comprises at least two promoters. Verfahren nach Anspruch 26 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Promotoren mindestens zwei verschiedene Promotoren sind.Process according to claims 26 to 29, characterized in that that the at least two promoters are at least two different Promoters are. Verfahren nach Anspruch 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotoren einzeln und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Promotoren für eine RNA-Polymerase, bevorzugterweise T7, T3 oder SP6 RNA-Polymerase umfasst.Process according to claims 26 to 30, characterized in that the promoters are selected individually and independently of each other from the group who promoters for an RNA polymerase, preferably T7, T3 or SP6 RNA polymerase includes. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die doppelsträngige FNA und einzelsträngige FNA umfasst.Method according to one of claims 26 to 31, characterized that the nucleic acid selected is from the group, the double-stranded FNA and single-stranded FNA includes. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt der Nukleinsäuresynthesereaktion einer alkalischen Spaltung unterzogen wird.Method according to one of claims 26 to 32, characterized that the reaction product of the nucleic acid synthesis reaction of an alkaline Splitting is subjected. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Phosphorylieren in Schritt (faaa) durch eine Kinasierung erfolgt.Method according to one of Claims 26 to 33, characterized that the phosphorylation in step (faaa) by a kinase he follows. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass in 5'-Richtung des Promotors zusätzliche Basen angeordnet sind, um den Schmelzpunkt des in der Zweitstrangsynthese eingesetzten Primers zu erhöhen.Method according to one of claims 26 to 34, characterized in that in the 5'-direction of the promoter additional bases are arranged to the melting point of the used in the second-strand synthesis increase primer. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Zweitstrangsynthese direkt im Anschluss an die Ligation ohne vorherige Aufreinigung erfolgt.Method according to one of claims 26 to 35, characterized that the second-strand synthesis is directly following the ligation done without prior purification. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der beiden Promotoren so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die identisch zur ersten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und der zweite Promotor so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die identisch ist zu der die Promotorsequenz des 3' von dem zweiten Promotor angeordnetens Promotor umfassenden Sequenz des ersten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls.Method according to one of claims 1 to 13, characterized that at least one of the two promoters is arranged so that the transcripts start with the sequence that is identical to the first one defined Partial sequence of the nucleic acid to be amplified and the second promoter arranged so that the transcripts start with the sequence, which is identical to that of the promoter sequence of the 3 'of the second Promoter arranged promoter comprehensive sequence of the first nucleic acid strand of the first adapter molecule. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der beiden Promotoren so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die komplementär zur zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure ist und der zumindest zweite Promotor so angeordnet ist, dass die Transkripte mit der Sequenz beginnen, die identisch ist zu der die Promotorsequenz des 3' von dem zweiten Promotor angeordneten Promotors umfassenden Sequenz des zweiten Stranges des zweiten Adaptermoleküls.Method according to one of claims 14 to 36, characterized that at least one of the two promoters is arranged so that the transcripts begin with the sequence that is complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified and the at least second promoter is arranged so that the transcripts begin with the sequence that is identical to that of the promoter sequence of the 3 'of the second Promoter arranged promoter comprehensive sequence of the second Strands of the second adapter molecule. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und 37, dadurch gekennzeichnet, dass das 5'-terminale Nukleotid der zu amplifizierenden Nukleinsäure ein 5'-Phosphat trägt.Method according to one of claims 1 to 13 and 37, characterized characterized in that the 5'-terminal nucleotide the nucleic acid to be amplified a 5'-phosphate wearing. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltstelle durch eine Restriktionsenzymschnittstelle bereitgestellt wird und das Spalten durch ein Restriktionsenzym erfolgt.Method according to one of claims 1 to 39, characterized the cleavage site is provided by a restriction enzyme cleavage site and columns are cleaved by a restriction enzyme. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltstelle ausgebildet wird durch ein Ribonukleotid.Method according to one of claims 1 to 40, characterized the cleavage site is formed by a ribonucleotide. Verfahren nach Anspruch 41, wobei wenn die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist, das Ribonukleotid in dem zweiten Nukleinsäurestrang des zweiten Adaptermoleküls das erste Nukleotid 5' von dem Bereich ist, der zumindest teilweise komplementär ist zu der zweiten definierten Teilsequenz der zu amplifizierenden Nukleinsäure oder einem Teil davon; und/oder wenn die zu amplifizierende Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure oder eine modifizierte Desoxyribonukleinsäure und/oder eine teilweise oder vollständig 2'-F-modifizierte Nukleinsäure ist, das Ribonukleotid in dem als Primermolekül verwendeten Nukleinsäurestrang das erste Nukleotid 5' von der ersten definierten Teilsequenz ist.The method of claim 41, wherein when the to be amplified nucleic acid is a ribonucleic acid, the ribonucleotide in the second nucleic acid strand of the second adapter molecule is the first one Nucleotide 5 'of the area that is at least partially complementary to the second defined subsequence of the nucleic acid to be amplified or a part of it; and / or when the nucleic acid to be amplified is a deoxyribonucleic acid or a modified deoxyribonucleic acid and / or a partial or completely 2'-F-modified nucleic acid is the ribonucleotide in the nucleic acid strand used as a primer molecule the first nucleotide 5 'of the first defined subsequence. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der 3'-Enden zumindest eines der Adaptermoleküle blockiert ist, um eine Verlängerung der Adaptermoleküle bei einer Zweitstrangsynthese zu vermeiden.Method according to one of claims 1 to 42, characterized that at least one of the 3 'ends at least one of the adapter molecules is blocked to an extension the adapter molecules to avoid in a second strand synthesis. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass das 3'-Ende des zweiten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls und/oder des ersten Nukleinsäurestranges des zweiten und/oder des dritten Adaptermoleküls blockiert ist.Method according to claim 43, characterized in that that the 3'-end of the second nucleic acid strand of the first adapter molecule and / or the first nucleic acid strand of the second and / or the third adapter molecule is blocked. Verfahren nach einem der Ansprüche 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Blockieren dadurch erfolgt, dass das 3'-terminale Nukleotid des Adaptermoleküls ein 3'-Desoxynukleotid, bevorzugterweise ein 2'-3'-Didesoxynukleotid ist.Method according to one of claims 43 or 44, characterized in that the blocking takes place in that the 3'-terminal nucleotide of the adapter molecule is a 3'-deoxynucleotide, preferably a 2'-3'-dideoxynucleotide is. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, dass eine basengepaarte Stammstruktur ausgebildet ist, bevorzugtererweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugterweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.Method according to one of claims 1 to 45, characterized that the first defined subsequence and the second defined Partial sequence are at least partially complementary, preferably so far complementary are that a base-paired stem structure is formed, more preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, preferably at a temperature of about 37 ° C. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 46, bevorzugterweise Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, dass eine basengepaarten Helix ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Beriech von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugtererweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.Method according to one of claims 1 to 46, preferably Claim 46, characterized in that the first defined subsequence and the second defined partial sequence are at least partially complementary, are preferably complementary so far that a base-paired Helix is formed, preferably at a temperature in the From about 20 to about 40 ° C, more preferably at a temperature of about 37 ° C. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 47, bevorzugterweise Anspruch 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, dass die erste definierte Teilsequenz mindestens 4 Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz mindestens 4 Nukleotide umfasst.Method according to one of claims 1 to 47, preferably claim 46 or 47, characterized ge indicates that the first defined partial sequence comprises at least 4 nucleotides and the second defined partial sequence comprises at least 4 nucleotides. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite definierte Teilsequenz mindestens 6 Nukleotide umfasst.Method according to claim 48, characterized the second defined partial sequence comprises at least 6 nucleotides. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 47, bevorzugterweise Anspruch 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, dass die erste definierte Teilsequenz n + m Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz n Nukleotide umfasst, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 10000, bevorzugterweise von 4 bis 7 ist, und m eine ganze Zahl von 2 bis 1000 ist, bevorzugterweise von 2 bis 6 ist.Method according to one of claims 1 to 47, preferably Claim 46 or 47, characterized in that the first defined Partial sequence n + m nucleotides and the second defined partial sequence n nucleotides, where n is an integer from 4 to 10,000, preferably from 4 to 7, and m is an integer from 2 to 1000, preferably from 2 to 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass die randomisierte Nukleotidsequenz eine Länge von 20 bis 10000 Nukleotiden, bevorzugterweise von 30 bis 60 Nukleotiden und bevorzugtererweise von 25 bis 40 Nukleotiden aufweist.Method according to one of claims 1 to 50, characterized that the randomized nucleotide sequence has a length of 20 to 10,000 nucleotides, preferably from 30 to 60 nucleotides, and more preferably from 25 to 40 nucleotides. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahren die Amplifikation ausschließlich gemäß der ersten Alternative durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 51, characterized that in the method the amplification exclusively according to the first Alternative performed becomes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahren die Amplifikation ausschließlich gemäß der zweiten Alternative durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 51, characterized that in the method the amplification exclusively according to the second Alternative performed becomes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahren die Amplifikation gemäß der ersten Alternative im regelmäßigen oder unregelmäßigem Wechsel mit der Amplifikation gemäß der zweiten Alternative durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 51, characterized that in the method the amplification according to the first alternative in regular or irregular change with the amplification according to the second Alternative performed becomes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 51 und 54, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Verfahren mindestens einmal die Amplifikation gemäß der ersten Alternative und mindestens einmal die Amplifikation gemäß der zweiten Alternative durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 51 and 54, characterized characterized in that in the method at least once the amplification according to the first Alternative and at least once the amplification according to the second Alternative performed becomes. Verfahren zur Herstellung von L-Nukleinsäure, die an ein Zielmolekül binden, umfassend die Schritte gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 55, wobei – die heterogene Population von Nukleinsäuren eine heterogenen Population von D-Nukleinsäuren ist, – das Zielmolekül die optische Antipode des Zielmoleküls der herzustellenden L-Nukleinsäure ist, – Sequenzieren der aus Schritt (d) oder (f) erhaltenen Nukleinsäure(n), wobei diese bevorzugterweise mit der optischen Antipode des Zielmoleküls der herzustellenden L-Nukleinsäure in Wechselwirkung getreten ist/sind; und – Synthese von L-Nukleinsäure(n), die in ihrer Sequenz mit den in Schritt (f) für die D-Nukleinsäure(n) ermittelten Sequenzen) identisch sind.Process for the preparation of L-nucleic acid, the to a target molecule comprising the steps according to a method according to one the claims 1 to 55, where - the heterogeneous population of nucleic acids a heterogeneous population of D-nucleic acids is - the target molecule the optical antipode of the target molecule of the L-nucleic acid to be produced is, - Sequencing the nucleic acid (s) obtained from step (d) or (f), these preferably being interacts with the optical antipode of the target molecule of the L-nucleic acid to be produced entered / are; and - Synthesis L-nucleic acid (s), in their sequence with those determined in step (f) for the D-nucleic acid (s) Sequences) are identical. Nukleinsäure umfassen in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, dass eine basengepaarten Stammstruktur ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugtererweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.nucleic acid comprise a first in the 5'-3 'direction defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined subsequence, wherein the first defined subsequence and the second defined subsequence are at least partially complementary, are preferably complementary so far that a base-paired Root structure is formed, preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, more preferably one Temperature of about 37 ° C. Nukleinsäure umfassen in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz zumindest teilweise komplementär sind, bevorzugterweise soweit komplementär sind, eine basengepaarten Helix ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugtererweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.nucleic acid comprise a first in the 5'-3 'direction defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined subsequence, wherein the first defined subsequence and the second defined subsequence are at least partially complementary, Preferably, as far as complementary, a base-paired Helix is formed, preferably at a temperature in the Range from about 20 to about 40 ° C, more preferably at a temperature of about 37 ° C. Nukleinsäure umfassen in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die Nukleinsäure eine basengepaarten Stammstruktur ausgebildet ist, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugterweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.nucleic acid comprise a first in the 5'-3 'direction defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined subsequence, wherein the nucleic acid is a base-paired parent structure is formed, preferably at a temperature in the range from about 20 to about 40 ° C, preferably at a temperature of about 37 ° C. Nukleinsäure nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammstruktur vollständig oder teilweise durch die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsquenz ausgebildet ist.nucleic acid according to claim 59, characterized in that the trunk structure Completely or partly by the first defined subsequence and the second defined subsequence is formed. Nukleinsäure umfassen in 5'-3'-Richtung eine erste definierte Teilsequenz, eine randomisierte Sequenz und eine zweite definierte Teilsequenz, wobei die Nukleinsäure eine basengepaarten Helix ausgebildet, bevorzugterweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 °C, bevorzugterweise bei einer Temperatur von etwa 37 °C.Nucleic acids comprise in the 5'-3 'direction a first defined partial sequence, a randomized sequence and a second defined partial sequence, wherein the nucleic acid forms a base-paired helix, preferably at a temperature in the range of about 20 to about 40 ° C, preferably at a temperature of about 37 ° C. Nukleinsäure nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die basengepaarte Helix teilweise oder vollständig ausgebildet ist durch die erste definierte Teilsequenz und die zweite definierte Teilsequenz.nucleic acid according to claim 61, characterized in that the base-paired Helix partial or complete is formed by the first defined subsequence and the second defined subsequence. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 62, dadurch gekennzeichnet, dass die erste definierte Teilsequenz mindestens 4 Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz mindestens 4 Basenpaare umfasst.nucleic acid according to one of the claims 57 to 62, characterized in that the first defined subsequence at least 4 nucleotides and the second defined partial sequence at least 4 base pairs. Nukleinsäure nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite definierte Teilsequenz mindestens 6 Nukleotide umfasst.nucleic acid according to claim 63, characterized in that the second defined Partial sequence comprises at least 6 nucleotides. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 64, dadurch gekennzeichnet, dass die erste definierte Teilsequenz n + m Nukleotide und die zweite definierte Teilsequenz n Nukleotide umfasst, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 10.000, bevorzugterweise von 4 bis 7 ist, und m eine ganze Zahl von 2 bis 1.000 ist, bevorzugterweise von 2 bis 6 ist.nucleic acid according to one of the claims 57 to 64, characterized in that the first defined subsequence n + m nucleotides and the second defined partial sequence n nucleotides where n is an integer from 4 to 10,000, preferably from 4 to 7, and m is an integer from 2 to 1,000, preferably from 2 to 6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 65, dadurch gekennzeichnet, dass die randomisierte Nukleotidsequenz eine Länge von 20 bis 10000 Nukleotiden, bevorzugterweise von 30 bis 60 Nukleotiden und bevorzugtererweise von 25 bis 40 Nukleotiden aufweist.nucleic acid according to one of the claims 57 to 65, characterized in that the randomized nucleotide sequence a length from 20 to 10,000 nucleotides, preferably from 30 to 60 nucleotides and more preferably from 25 to 40 nucleotides. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 57 bis 66, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure am 5'-Ende der ersten definierten Teilsequenz und/oder am 3'-Ende der zweiten definierten Teilsequenz eine weitere Sequenz aufweisen.nucleic acid according to one of the claims 57 to 66, characterized in that the nucleic acid at the 5 'end of the first defined subsequence and / or at the 3 'end of the second defined subsequence have another sequence. Nukleinsäure nach Anspruch 67, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Sequenz am 5'-Ende im wesentlichen identisch ist zur Sequenz des ersten Nukleinsäurestranges des ersten Adaptermoleküls und/oder die weitere Sequenz am 3'-Ende im wesentlichen identisch ist zur Sequenz des ersten Nukleinsäurestranges des zweiten Adaptermoleküls.nucleic acid according to claim 67, characterized in that the further sequence essentially at the 5 'end is identical to the sequence of the first nucleic acid strand of the first adapter molecule and / or the further sequence at the 3'-end is substantially identical to the sequence of the first nucleic acid strand of the second adapter molecule. Nukleinsäurepopulation umfassend mindestens zwei Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 57 bis 68, wobei sich zumindest zwei Mitglieder der Population in ihrer randomisierten Nukleotidsequenz unterscheiden, bevorzugterweise zumindest an einer Position ihrer randomisierten Nukleotidsequenz unterscheiden.nucleic acid population comprising at least two nucleic acids according to any one of claims 57 to 68, at least two members of the population randomized in their own Distinguish nucleotide sequence, preferably at least one Differentiate the position of their randomized nucleotide sequence. Nukleinsäurepopulation nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Mitglieder der Population eine unterschiedlich lange randomisierte Nukleotidsequenz aufweisen.nucleic acid population according to claim 69, characterized in that at least two members of Population a differently long randomized nucleotide sequence exhibit. Nukleinsäurepopulation nach Anspruch 69 oder 70, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäurepopulation etwa zwischen 10E12 und 10E18, bevorzugterweise etwa zwischen 10E14 und 10E16 verschiedene Nukleinsäuren umfassen.nucleic acid population according to claim 69 or 70, characterized in that the nucleic acid population between about 10E12 and 10E18, preferably between about 10E14 and 10E16 different nucleic acids include. Verwendung einer oder mehrerer der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 66 bis 68 und/oder einer oder mehrerer der Nukleinsäurepopulationen nach einem der Ansprüche 69 bis 71 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 56.Use of one or more of the nucleic acid according to one of the claims 66 to 68 and / or one or more of the nucleic acid populations according to one of the claims 69 to 71 in a method according to one of claims 1 to 56th
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