DE10332117A1

DE10332117A1 - Process for the preparation of a carrier with immobilized viruses and use of such a carrier

Info

Publication number: DE10332117A1
Application number: DE10332117A
Authority: DE
Inventors: Hansjürgen Dr. Volkmer; Frank Dr. Weise; Thomas Dr. Joos
Original assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Current assignee: NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2004-12-02
Also published as: DK1599727T3

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren sowie die Verwendung von derartigen Trägern. Dabei wird zunächst ein Trägermaterial bereitgestellt und anschließend zumindest eine Oberfläche des Trägermaterials zur Bildung der funktionalisierten Oberfläche beschichtet, vorzugsweise mit einem Nitrocellulosematerial. In einem nächsten Schritt wird eine Lösung, welche vorzugsweise infektiöse Viren enthält, auf die funktionalisierte Oberfläche aufgebracht, wonach es den Viren anschließend ermöglicht wird, sich an die funktionalisierte Oberfläche über einen Zeitraum vorzugsweise von 10 Minuten bis 36 Stunden anzuhaften. Die Oberfläche wird danach ggf. mit einem Fluid bedeckt.A method is described for producing a carrier with a functionalized surface suitable for the immobilization of viruses and with preferably infectious viruses immobilized on the functionalized surface, and the use of such carriers. First, a carrier material is provided and then at least one surface of the carrier material is coated to form the functionalized surface, preferably with a nitrocellulose material. In a next step, a solution, which preferably contains infectious viruses, is applied to the functionalized surface, after which the viruses are then allowed to adhere to the functionalized surface over a period of preferably from 10 minutes to 36 hours. The surface is then possibly covered with a fluid.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit einer funktionalisierten Oberfläche, ferner Träger, die durch dieses Verfahren hergestellt werden, sowie Verwendungen der durch dieses Verfahren hergestellten Träger.The The invention relates to a method for producing a carrier a functionalized surface, further carrier, produced by this process, and uses the carrier produced by this method.

Träger mit einer funktionalisierten Oberfläche finden insbesondere im Gebiet der Medizintechnik und der Bioanalytik ihre Anwendung, sowie insbesondere dort, wo der Bedarf an schnellen, reproduzierbaren und empfindlichen Analyseverfahren besteht. Verfahren zur Herstellung von Trägern mit funktionalisierten Oberflächen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.Carrier with a functionalized surface take place especially in the field of medical technology and bioanalytics their application, and especially where the need for fast, reproducible and sensitive analysis procedures. Manufacturing process of carriers with functionalized surfaces are well known in the art.

Insbesondere für analytische Methoden in der Biologie und für die medizinische Diagnostik spielen heutzutage Träger mit funktionalisierten Oberflächen eine herausragende Rolle. Bei den Trägern handelt es sich um miniaturisierte, mikrostrukturierte Funktionselemente mit einer Vielzahl von biologischen und/oder technischen Komponenten, z.B. mit auf einer Oberfläche immobilisierten Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können, sowie mit einer Matrix bzw. einem Trägermaterial. Die „funktionalisierte" Oberfläche des Trägers weist dabei in der Regel Moleküle mit funktionellen Gruppen auf, welche an „Fängermoleküle" binden, die mit anderen (Bio-)Molekülen, den „Liganden", in Wechselwirkung treten.In particular for analytical Methods in and for biology Medical diagnostics play a role nowadays functionalized surfaces an outstanding role. The carriers are miniaturized, microstructured functional elements with a variety of biological and / or technical components, e.g. with immobilized on a surface biomolecules that can serve as specific interaction partners, as well as with a matrix or a carrier material. The "functionalized" surface of the carrier usually has molecules with functional groups, which bind to "capture molecules", which interact with other (bio) molecules, the "ligands" to step.

Eine Vielzahl von Biomoleküle ist dabei auf den Trägeroberflächen angeordnet, so dass eine Vielzahl verschiedener (bspw. genetischer) Informationen parallel und aus einer Probe untersucht werden kann.A Variety of biomolecules is arranged on the carrier surfaces, so that a lot of different (e.g. genetic) information can be examined in parallel and from one sample.

Biomoleküle, die als solche bindenden Agenzien auf den Trägern angeordnet sind, sind in der Biotechnologie zu einem wichtigen Werkzeug geworden. Beispiele für Fängermoleküle, die auf Trägern als „Spots" angeordnet werden, sind bspw. Nucleinsäuren, wie DNA oder RNA, ferner Proteine oder Peptide, wie bspw. Antigene, Antikörper und Rezeptoren, Polysacharide, Lectine oder sogar ganze Zellen, wobei diese Substanzen in einer bestimmten Anordnung („Arrays") auf einer festen Trägeroberfläche oder in einem virtuellen Array auf adressierbaren beads angeordnet sind. Derartige Arrays können bspw. bei der Entdeckung von Genen, der Genom-Forschung, in der Diagnostik, Bioanalytik und bei dem Screenen nach neuen bioaktiven Verbindungen eingesetzt werden. Eine wichtige Verwendung der Arrays ist die Analyse der differentiellen Genexpression, bei welcher die Expression von Genen in unterschiedlichen Zellen, typischerweise die zu untersuchende Zelle im Vergleich zu einer Kontrolle, verglichen wird. Dabei werden die Unterschiede in der Expression verschiedener Gene identifiziert. Weiterhin ist die Messung vieler verschiedener Liganden aus geringen Probenmengen wichtig.Biomolecules that as such binding agents are arranged on the carriers has become an important tool in biotechnology. Examples for capture molecules that on carriers arranged as "spots", are, for example, nucleic acids, such as DNA or RNA, furthermore proteins or peptides, such as, for example, antigens, antibody and receptors, polysaccharides, lectins or even whole cells, these substances in a certain arrangement ("arrays") on a solid Carrier surface or are arranged in a virtual array on addressable beads. Such arrays can For example, in the discovery of genes, genome research, in the Diagnostics, bioanalytics and when screening for new bioactive Connections are used. An important use of the arrays is the analysis of differential gene expression, in which the Expression of genes in different cells, typically the cell to be examined compared to a control becomes. The differences in expression are different Genes identified. Furthermore, the measurement is many different Ligands from small sample amounts important.

Die genannten Arrays, bzw. deren Verwendung sind demnach moderne Verfahren, mit denen eine weitgehend automatisierte und miniaturisierte Parallelanalyse von Einzelprozessen möglich ist.The arrays mentioned, or their use are therefore modern methods, with which a largely automated and miniaturized parallel analysis of individual processes possible is.

Ein anderes Anwendungsbeispiel für die oben erwähnten Träger mit immobilisierten Biomolekülen ist bspw. die Verwendung solcher Träger zum Nachweis, zur Isolierung oder Charakterisierung von Zellen in einer Lösung. So kann bspw. untersucht werden, welche Zellen in einer Probe an bestimmte immobilisierte Biomoleküle binden und welche nicht, wobei als Biomoleküle z.B. Nucleinsäuren oder Proteine eingesetzt werden können.On another application example for the above mentioned carrier with immobilized biomolecules is, for example, the use of such carriers for detection, for isolation or characterization of cells in a solution. For example, can be examined which cells are immobilized in a sample to certain biomolecules bind and which do not, whereby as biomolecules e.g. Nucleic acids or Proteins can be used.

Eine weitere Möglichkeit, Träger mit immobilisierten Biomolekülen in der Biotechnologie einzusetzen, ist bspw. das Verfahren, wie es in der US-Patentanmeldung US 2002/0006664 von Sabatini beschrieben ist. Darin wird ein Verfahren und ein Träger offenbart, bei welchem zunächst DNA-Bruchstücke sowie in Plasmidvektoren klonierte DNA auf einer Trägerobefläche als Spots angeordnet und immobilisiert werden. In einem nächsten Schritt werden Zellen auf diese Trägeroberfläche ausgesät und die auf der Trägeroberfläche immobilisierte DNA wird anschließend in die Zellen eingeschleust, ein Vorgang der von den Erfindern dieses Verfahrens als „reverses Transfektions-Verfahren" bezeichnet wird.A another way carrier with immobilized biomolecules To use in biotechnology is, for example, the process of how described in Sabatini's US patent application US 2002/0006664 is. A method and a carrier are disclosed therein, in which first DNA fragments as well as DNA cloned in plasmid vectors on a carrier surface as Spots are arranged and immobilized. The next step will be Cells sown on this support surface and the immobilized on the carrier surface DNA is then smuggled into the cells, a process invented by the inventors Process as "reverse Transfection method " becomes.

Ein großer Nachteil dieses bekannten, Verfahrens zur reversen Transfektion ist jedoch, dass die Zellen nicht nur an die immobilisierten Spots binden, sondern die Trägeroberfläche auch außerhalb der Spots besiedeln. Demnach müssen im Stand der Technik in einem weiteren Schritt stets die Zellen identifiziert werden, welche mit dem genetischen Material in Kontakt gekommen sind.On greater Disadvantage of this known method for reverse transfection is, however, that the cells are not only attached to the immobilized spots bind, but also the support surface outside populate the spots. So must in the prior art, the cells always in a further step be identified which are in contact with the genetic material came.

Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, dass nur solche Zellen verwendet werden können, die mit Plasmiden leicht transfizierbar sind.Another disadvantage is the fact that only those cells can be used that with Plasmids are easily transfected.

Ferner besteht allgemein hier die große Gefahr, dass bestimmte Zellen aus einem Zellgemisch nicht selektiv isoliert werden können, da verschiedene Zellen zwischen den Spots binden können.Further there is generally the big one here Risk that certain cells from a cell mixture are not selective can be isolated because different cells can bind between the spots.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Träger mit neuen Biomolekülen sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung bereitzustellen, mit welchem die o.g. Nachteile überwunden werden können.In front Against this background, it is an object of the present invention, one carrier with new biomolecules and to provide a method for its production, with which the above Disadvantages are overcome can.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit einer funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisier ten, vorzugsweise infektiösen Viren gelöst, welches die folgenden Schritt aufweist:

(a) Bereitstellen eines Trägermaterials;
(b) Beschichten von zumindest einer Oberfläche des Trägermaterials zur Erzeugung einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche;
(c) Aufbringen einer Lösung, welche vorzugsweise infektiöse Viren enthält, auf die funktionalisierte Oberfläche;
(d) Anhaftenlassen der Viren an die funktionalisierte Oberfläche für einen Zeitraum von vorzugsweise 10 Minuten bis 36 Stunden;
(e) ggf. Bedecken der Oberfläche mit einem Fluid.

This object is achieved according to the invention by a method for producing a carrier with a functionalized surface and with, preferably infectious, viruses immobilized on the functionalized surface, which comprises the following step:

(a) providing a carrier material;
(b) coating at least one surface of the carrier material to produce a functionalized surface suitable for the immobilization of viruses;
(c) applying a solution, which preferably contains infectious viruses, to the functionalized surface;
(d) allowing the viruses to adhere to the functionalized surface for a period of preferably 10 minutes to 36 hours;
(e) optionally covering the surface with a fluid.

Ferner wird die Aufgabe gelöst durch einen Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren, sowie durch Verwendungen eines Trägers mit immobilisierten Viren, die infektiös oder nicht-infektiös sein können.Further the task is solved by a carrier with one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and with, preferably infectious, viruses immobilized on the functionalized surface, and by using a carrier with immobilized viruses, the infectious or non-infectious could be.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst.The the object underlying the invention is thereby completely achieved.

Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen einen Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit an der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten Viren herstellen, mit welchem Zellen gezielt an Spots auf dem Trägermaterial immobilisiert werden konnten. Die Erfinder konnten dabei zeigen, dass sich der Träger, bzw. die Immobilisierung der Viren, als stabil erwies, und dass die Viren noch über einen längeren Zeitraum infektiös waren und Zellen binden konnten.The Inventors were able to carry out a carrier with one for immobilization in their own experiments functionalized surface suitable for viruses and with the functionalized Immobilized surface Produce viruses with which cells target spots on the carrier material could be immobilized. The inventors were able to show that the carrier, or the immobilization of the viruses, proved to be stable, and that the viruses are still over a longer one Period infectious and could bind cells.

Im Stand der Technik war es bisher nicht möglich, infektiöse Viren an Oberflächen eines Trägers zu immobilisieren. Vielmehr galt allgemein eine über viele Tage andauernde Lagerung bzw. Immobilisierung von Viren anders als in infizierten Zellen als selbst bei tiefen Temperaturen instabil und somit als unmöglich (siehe bspw. Davis et al., „Microbiology", 3. Auflage, 1985, S. 1094). Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können nun Träger hergestellt werden, auf welchen infektiöse Viren immobilisiert vorliegen. Dabei konnten die Erfinder ferner zeigen, dass die erfindungsgemäß hergestellten Träger über längere Zeit bei Raumtemperaturen gelagert werden können und funktionsfähig bleiben, die Viren also ihre Bindungsfähigkeit und Infektiösität behalten.in the Up to now it was not possible to use infectious viruses on surfaces of a carrier to immobilize. Rather, storage over many days was generally considered or immobilization of viruses differently than in infected cells as unstable even at low temperatures and therefore impossible (see e.g. Davis et al., "Microbiology", 3rd Edition, 1985, P. 1094). With the method according to the invention can now carrier are produced on which infectious viruses are immobilized. The inventors were also able to show that those produced according to the invention Long-term wearer can be stored at room temperature and remain functional, so the viruses their binding ability and keep infectiousness.

Im Stand der Technik waren bisher keine Träger mit derart immobilisierten Viren bekannt, die nach der Immobilisierung noch in der Lage sind, an Zellen zu binden. Schon Arrays von nicht-infektiösen Viren bieten viele neue Anwendungsmöglichkeiten, bei denen die Bindung zwischen Viren und Zellen untersucht wird.in the Up to now there have been no prior art carriers with such immobilized Viruses known that are still able after immobilization bind to cells. Arrays of non-infectious viruses already offer many new ones Applications, in which the binding between viruses and cells is examined.

Bei den neuen Trägern ist weiter von Vorteil, dass die Viren den Gentransfer in bzw. die Transduktion von Zellen ermöglichen, die schwer oder gar nicht transfizierbar sind. Dies sind z.B. Zellen, die von hoher Relevanz sind wie bspw. Primäre Zellen. Mit den erfindungsgemäß hergestellten Trägern ist es somit möglich, im Vergleich zur Plasmidtransfektion nach Sabatini das Spektrum an Zellen deutlich zu erhöhen, in die Gene transferiert werden können.at the new carriers Another advantage is that the viruses transfer the gene into or Enable transduction of cells that are difficult or impossible to transfect. These are e.g. cells, which are of high relevance, such as primary cells. With the manufactured according to the invention carriers is it possible compared to Sabatini's plasmid transfection the spectrum on cells to increase significantly into which genes can be transferred.

Die neuen Träger ermöglichen es, dass Zellen über Oberflächenrezeptoren an immobilisierte Viren binden können, die wiederum das Vermögen haben, diese Zellen zu infizieren. Wenn die Virussuspension in Reihen und Spalten in Arrayform aufgetragen wird, können in miniaturisierten und parallelisierten Formaten Zellen infiziert werden. Rekombinante immobilisierte Viren erlauben entsprechend einen miniaturisierten und parallelisierten Gentransfer sowie Genexpression in durch andere gentechnische Methoden nur schwer manipulierbaren Zellen.The new carriers make it possible for cells to bind to immobilized viruses via surface receptors, which in turn have the ability to infect these cells. If the virus suspension is applied in rows and columns in array form, cells can be infected in miniaturized and parallelized formats. Recombinant immobilized viruses accordingly allow miniaturized and parallelized gene transfer and gene expression in other genetic engineering methods only with difficulty pulsable cells.

Die Viren sind dabei in einzelnen Spots angeordnet, wobei verschiedene Spots verschiedene Virustypen oder -arten enthalten können. In einem Spot ist für die Transduktion von Zellen dabei die PFU, also die plaque forming units, die angibt, wie viele infektiöse Viruspartikel vorhanden sind, zu beachten.The Viruses are arranged in individual spots, with different ones Spots can contain different virus types or types. In a spot is for the transduction of cells thereby the PFU, i.e. the plaque forming units, which indicates how many infectious virus particles are present is notable.

Es ist mit den neuen Trägern erstmals auch möglich, Arrays von infektiösen aber auch nicht-infektiöse Viren bereitzustellen, die verschiedene Zellen spezifisch binden können. Dabei können auch verschiedene Virustypen und -arten immobilisiert werden, deren Bindefähigkeit an Zellen aus einer Probe untersucht wird, wobei wegen der Miniaturisierung und Parallelisierung mit geringen Probenmengen gearbeitet werden kann.It is with the new carriers for the first time also possible Arrays of infectious but also non-infectious viruses to provide that can specifically bind different cells. there can also different types and types of viruses are immobilized, their binding capacity is examined on cells from a sample, due to miniaturization and parallelization with small sample quantities can.

„Träger" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sowohl einen planaren Träger mit physikalisch zusammenhängender Oberfläche als auch ein virtuelles Array aus sog. Beads oder Mikrobeads, die zudem markiert und somit adressierbar sein können."Carrier" means in the frame the present application with both a planar carrier physically related surface as well as a virtual array of so-called beads or microbeads, which also marked and can therefore be addressable.

„Trägermaterial" bedeutet vorliegend einen Träger mit zumindest einer Oberfläche, auf welcher allgemein Biomoleküle wie Nukleinsäuren, Proteine, Zellen oder Viren immobilisiert werden können. Der Fachmann wird erkennen, dass hierbei eine Vielzahl an Trägermaterialien, die im Stand der Technik – bspw. im Gebiet der Bioanalytik – eingesetzt werden, für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.“Backing material” means here a carrier with at least one surface, on which generally biomolecules like nucleic acids, Proteins, cells or viruses can be immobilized. The Those skilled in the art will recognize that a large number of carrier materials, which in the prior art - for example. in the field of bioanalytics - used be for the inventive method are suitable.

„Funktionalisierte Oberfläche" bedeutet vorliegen jede Oberfläche, welche Moleküle mit funktionellen Gruppen aufweist, über welche die Bindung von Biomolekülen – bspw. Nukleinsäuren, Proteine, ganze Zellen usw. – vermittelt wird."Functionalized Surface "means present any surface, what molecules with functional groups via which the binding of Biomolecules - e.g. nucleic acids, Proteins, whole cells, etc. - mediated becomes.

„Eine für die Immobilisierung von Viren geeignete funktionalisierte Oberfläche" bedeutet vorliegend eine Oberfläche mit einer Beschichtung, die einerseits die Viren bindet, also immobilisiert, es andererseits aber ermöglicht, dass die Viruspartikel in oder an der Oberfläche noch leicht für Zellen zugänglich sind. Mit anderen Worten, die Viren sind noch so beweglich, dass sie sterisch an die Zelloberflächenrezeptoren gelangen können und sich gegenseitig dabei nicht behindern. Die funktionalisierte Oberfläche ermöglicht dies nach Erkenntnis der Erfinder insbesondere dann, wenn sie eine Art Maschenwerk bildet, in dem die Viruspartikel fest aber beweglich gebunden werden. Dies ist nach der überraschenden Erkenntnis der Erfinder beispielsweise mit einer Beschichtung aus Nitrocellulose oder Materialien mit ähnlichen Eigenschaften zu erreichen, wo die Viruspartikel bspw. über eine elektrostatische Wechselwirkung an einzelne Fasern gebunden werden, die eine gewisse Beweglichkeit in der Beschichtung aufweisen. Es sind aber auch andere Mechanismen einsetzbar, die es den immoblisierten Viren, die als Aggregate vorliegen können, erlauben, an die Zellen zu binden. Diese Bindung muss es im Falle eines gewünschten Gentransfers u.U. erlauben, dass die Viren internalisiert werden."One for immobilization functionalized surface suitable for viruses "in the present case means a surface with a coating that on the one hand binds the viruses, i.e. immobilizes them, on the other hand it enables that the virus particles in or on the surface are still easy for cells accessible are. In other words, the viruses are so agile that sterically to the cell surface receptors can get and not hinder each other. The functionalized surface makes this possible according to the inventors' knowledge, in particular if they have a kind Mesh forms in which the virus particles are firm but mobile be bound. This is, according to the surprising finding of Inventor for example with a coating of nitrocellulose or Materials with similar To achieve properties where the virus particles, for example electrostatic interaction is bound to individual fibers, which have a certain flexibility in the coating. It however, other mechanisms can be used that make it immobilized Viruses, which can exist as aggregates, allow them to reach the cells to tie. This binding must be there in case of a desired one Gene transfers may allow the viruses to be internalized.

Die Viruspartikel sollten dazu nicht-kovalent gebunden sein, wie es bspw. mit einer Beschichtung aus Nitrocellulose, die ggf. zusätzlich mit Collagen beschichtet ist, oder mit Beschichtungen erreicht wird, die eine dauerhafte positive Ladung auf der Oberfläche bewirken, wie dies bspw. bei den kommerziell erhältlichen „Superfrost (TM) Plus" Trägern der Fall ist, die von EMS, Electron Microscopy Sciences in ... vertrieben werden. Ferner sind mit Aminosilan beschichtete Oberflächen verwendbar, wie bspw. bei den kommerziell erhältlichen „GAPS II" Coated Slides", die von Corning Inc, Acton, Massachusetts, USA, vertrieben werden.The For this purpose, virus particles should be non-covalently bound, as is the case For example, with a coating of nitrocellulose, which may also include Collagen is coated, or is achieved with coatings, that create a permanent positive charge on the surface as is the case, for example, with the commercially available “Superfrost (TM) Plus” carriers of the Case is that distributed by EMS, Electron Microscopy Sciences in ... become. Surfaces coated with aminosilane can also be used, such as the commercially available "GAPS II" Coated Slides ", which are available from Corning Inc, Acton, Massachusetts, USA.

„Infektiös" bedeutet vorliegend, dass die Viren vor und nach der Immobilisierung in der Lage sind, Zellen zu infizieren, also das in den Viren enthaltene genetische Material, DNA oder RNA, bei Kontakt mit Zellen in diese einzuschleusen, sollte dies das Ziel einer Verwendung eines durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Trägers sein. Dabei ist in einem Spot auch darauf zu achten, dass die PFU hinreichend hoch ist, so dass genügend Bindungspunkte für die Adhäsion der an den immobilisierten Viren zu immobilisierenden Zellen vorhanden sind.In the present case, "infectious" means that the viruses are able before and after immobilization Infecting cells, that is, the genetic information contained in the viruses To introduce material, DNA or RNA into cells when they come into contact with them, this should be the aim of using a product produced by the method according to the invention carrier his. In a spot, it is also important to ensure that the PFU is sufficiently high that there are sufficient binding points for the adhesion of the cells to be immobilized on the immobilized viruses are.

„Nicht-infektiös" bedeutet dagegen, dass die Viren in der Lage sind, Zellen zu binden, ohne jedoch ihr genetisches Material in die gebundenen Zellen einzuschleusen."Non-infectious" means that the viruses are able to bind cells, but without their genetic Introduce material into the bound cells.

Der erfindungsgemäße Träger kann zu verschiedenen Zwecken eingesetzt werden, insbesondere zur Untersuchung der Wechselwirkung von in einer Lösung befindlichen Zellen mit den immobilisierten Viren. Mit einem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Träger kann bspw. erreicht werden, dass – nach Inkubation einer Zellen-enthaltenden Lösung – diese Zellen auf dem Träger auf Spots fokussiert werden, also nur an Stellen binden, an denen Viren immobilisiert vorliegen.The Carrier according to the invention can can be used for various purposes, especially for examination the interaction of cells in a solution with the immobilized viruses. With one according to the inventive method manufactured carrier can be achieved, for example, that - after incubation of a cell-containing Solution - this Cells on the support be focused on spots, i.e. only bind in places where Viruses are immobilized.

Die Erfinder konnten ferner in eigenen Versuchen zeigen, dass über die stabil immobilisierten Viren fremdes genetisches Material in Zellen eingeschleust werden konnte, welche an die Viren binden. Dies zeigte, dass die Viren durch das erfindungsgemäße Verfahren auch im immobilisierten Zustand infektiös bleiben.The Inventors were also able to show in their own experiments that the Stable immobilized viruses foreign genetic material in cells could be introduced, which bind to the viruses. This showed that the viruses are also immobilized by the method according to the invention Infectious condition stay.

Nach Immobilisierung der Viren auf der Trägeroberfläche kann der Träger zur Verhinderung der Austrocknung mit einem geeigneten Fluid bedeckt werden, bspw. mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Polyethylenglykol (PEG), Protein- oder Polysacharidlösungen.To The carrier can be used to immobilize the viruses on the carrier surface Prevent dehydration covered with a suitable fluid are, for example with phosphate-buffered saline (PBS), polyethylene glycol (PEG), protein or polysaccharide solutions.

In einer Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das Trägermaterial ein Material aufweist, das als Oberfläche für Zellkulturen geeignet ist und vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Zellkulturkunststoffe, Glas, Silicon, Polystyrol, ausgewählt ist.In one embodiment is preferred if the carrier material has a material that is suitable as a surface for cell cultures and preferably from the group comprising cell culture plastics, Glass, silicone, polystyrene.

Derartige Trägermaterialien haben sich im Stand der Technik als bewährt erwiesen und werden im Fachgebiet vielfältig angewandt. „Trägermaterial" im Sinne der vorliegenden Erfindung kann somit jedes Material sein, welches sich zur Durchführung dieses Verfahrens eignet, und welche im Stand der Technik für die Herstellung von ähnlichen Trägern verwendet werden, bspw. auch markierte Mikrobeads oder planare Zellkulturträger.such support materials have proven themselves in the state of the art and are used in the field diverse applied. "Backing material" in the sense of the present Invention can thus be any material that can be used to implement this Suitable method, and which in the prior art for the production of similar carriers are used, for example also labeled microbeads or planar cell culture carriers.

Insbesondere ist bevorzugt, wenn bei dem Verfahren das Trägermaterial mit einem Polykation, bspw. mit poly-L-Lysin oder Aminosilan vorbeschichtet ist, wobei Aminosilan auch selbst bereits eine für die Immobilisierung von Viren geeignete Oberfläche ist.In particular is preferred if in the process the carrier material is coated with a polycation, is precoated with poly-L-lysine or aminosilane, for example Aminosilane itself is already one for the immobilization of viruses suitable surface is.

Derart beschichtete Oberflächen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt und werden vielfach auch in medizinischen Fachgebieten verwendet. So kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Trägermaterial bspw. ein mit poly-L-Lysin vorbeschichteter gläserner Objektträger eingesetzt werden.so coated surfaces are well known in the prior art and in many cases are also used in medical specialties. So in the method according to the invention as a carrier material For example, a glass slide pre-coated with poly-L-lysine is used become.

Gläserne Objektträger werden bspw. von der Firma Sigma, Taufkirchen, Deutschland, unter der Bezeichnung PolyPrep vertrieben.Become glass slides for example from the company Sigma, Taufkirchen, Germany, under the name PolyPrep distributed.

Ferner ist bevorzugt, wenn die Lösung, welche die Viren enthält, Glycerol aufweist.Further is preferred if the solution, which contains the viruses Has glycerol.

Die Verwendung von Glycerol hat den Vorteil, dass die Viren im feuchten Zustand aktiv gehalten werden. Neben Glycerol sind dabei auch glycerolähnliche Verbindungen zum Einsatz in dem Verfahren denkbar, wie bspw. Trehalose, Sacharose sowie allgemein Stoffe, die Proteinlösungen stabilisieren können.The Use of glycerol has the advantage that the viruses are moist State to be kept active. In addition to glycerol, there are also glycerol-like ones Connections conceivable for use in the process, such as trehalose, Saccharose as well as substances in general that can stabilize protein solutions.

Ferner ist bevorzugt, wenn die in der Lösung vorliegenden Viren Adenoviren oder Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind. Hierbei sind insbesondere Adenoviren vom Serotyp 5 bevorzugt.Further is preferred when in solution existing viruses adenoviruses or adeno-associated viruses (AAV) are. Adenoviruses of serotype 5 are particularly preferred.

Die Erfinder haben erkannt, dass es bspw. durch die Verwendung von Adenoviren vom Serotyp 5 möglich ist, Zellen an die auf dem Trägermaterial immobilisierten Viren zu fokussieren. Im Stand der Technik galt bisher die Lagerung oder Immobilisierung von infektiösen Adenoviren außerhalb von Zellen oder lebenden Wirten als nicht möglich.The Inventors have recognized that, for example, through the use of adenoviruses of serotype 5 possible is cells attached to the on the substrate focus on immobilized viruses. Previously, the state of the art applied the storage or immobilization of infectious adenoviruses outside from cells or living hosts as not possible.

In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn die Viren gentechnisch verändert sind.In A further development of the method according to the invention is preferred when the viruses are genetically modified are.

Dies bedeutet, dass in die genetische Information der Viren Viren-fremde Sequenzen eingebaut sein können, die in den immobilisierten Zellen exprimiert werden. Die gentechnische Veränderung des Viren-Genoms kann dabei mit im Stand der Technik gebräuchlichen Verfahren durchgeführt werden. Die Viren sind dann sog. Vektoren, wobei in diesem Zusammenhang die Viren ausgewählt sind aus der Gruppe: Adenoviren und AAV.This means that in the genetic information of the viruses non-viruses Sequences can be built in, which are expressed in the immobilized cells. The genetic engineering change of the virus genome can also be used in the prior art Procedure carried out become. The viruses are then so-called vectors, in this context the viruses selected are from the group: Adenoviruses and AAV.

Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Viren eine Sequenz aufweisen, die für das Green-fluorescent-Protein codiert. Dieses Protein wurde von Prasher et al., „Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein", Gene 111:229-293 (1992), zum ersten Mal kloniert und hat sich in den verschiedensten Gebieten der Biologie und Medizintechnik als herausra gendes Reportergen bewährt, das anzeigt, ob eine Übertragung von genetischem Material aus den Viren in die Zellen erfolgt ist.In particular is preferred if the viruses have a sequence that is responsible for the green fluorescent protein coded. This protein was described by Prasher et al., "Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein ", Gene 111: 229-293 (1992), cloned for the first time and has emerged in various Fields of biology and medical technology as an outstanding reporter gene proven, that indicates whether a transmission of genetic material from the viruses into the cells.

Als Reportergene geeignet sind ferner bspw. β-Galaktosidase, Luciferase, alkalische Phosphatase, Peroxidase.As Reporter genes are also suitable, for example, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase, peroxidase.

Ferner ist bevorzugt, wenn als Virus-enthaltende Lösung ein Überstand von Virus-infizierten Zellen eingesetzt wird, und insbesondere ein Überstand, der vor dem Aufbringen auf die funktionalisierte Oberfläche gereinigt und/oder auf konzentriert wird.Further is preferred if a supernatant from virus-infected as the virus-containing solution Cells are used, and especially a supernatant that is applied prior to application cleaned on the functionalized surface and / or focused on.

Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass die Immobilisierung sich als besonders stabil erwies, wenn die Viren-Lösung, die aus dem Überstand von infizierten Zellen gewonnen wurde, vor der Aufbringung gereinigt und/oder aufkonzentriert wurde. Eine Aufreinigung des Viren-Materials, bzw. des Zellkulturüberstandes kann bspw. durch eine Dichtegradientenzentrifugation, insbesondere eine Cäsiumchlorid (CsCl)-Dichtegradientenzentrifugation, erreicht werden. Auch die gereinigten und anschließend immobilisierten Viren waren trotz der oben beschriebenen kruden Behandlung auch über einen längeren Zeitraum hinweg noch infektiös. Dies war nach dem bisherigen Stand der Technik nicht zu erwarten.The Inventors were able to show in their own experiments that immobilization proved to be particularly stable when the virus solution that from the supernatant recovered from infected cells, cleaned prior to application and / or was concentrated. A purification of the virus material, or the cell culture supernatant can, for example, by density gradient centrifugation, in particular a cesium chloride (CsCl) density gradient, can be achieved. Even the cleaned and then immobilized viruses were over one despite the crude treatment described above longer Still infectious over time. This was not to be expected from the prior art.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn vor Schritt (c) Rinderserumalbumin auf die funktionalisierte Oberfläche aufgebracht wird.In one embodiment of the method according to the invention is preferred if bovine serum albumin is functionalized before step (c) surface is applied.

Die Erfinder haben erkannt, dass durch diese Maßnahme die Stabilität und Infektiosität der Viren weiter vorteilhaft verlängert werden konnte.The Inventors have recognized that this measure improves the stability and infectivity of the viruses further advantageously extended could be.

In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn der Zeitraum, in dem die Viren auf der funktionalisierten Oberfläche anhaften, 15 bis 20 Stunden beträgt.In A further development of the method according to the invention is preferred if the period in which the viruses adhere to the functionalized surface Is 15 to 20 hours.

Dieser von den Erfindern in einigen Versuchen gewählte Zeitraum erwies sich für eine ausreichende Anhaftung der Viren als geeignet, dennoch sind auch kürzere Zeiträume für eine Beschleunigung des Verfahrens möglich.This The period chosen by the inventors in some trials proved sufficient adhesion viruses are suitable, but there are also shorter periods for accelerating the procedure possible.

Ferner ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wenn die Temperatur, bei welcher die Viren an die funktionalisierte Oberfläche anhaften, von –20°C bis +37°C, und insbesondere von 0°C bis +10°C beträgt.Further is in the inventive method preferred if the temperature at which the viruses functionalized to the surface cling, from -20 ° C to + 37 ° C, and in particular from 0 ° C is up to + 10 ° C.

In eigenen Versuchen der Erfinder wurde dabei ein niedriger Temperaturbereich ausgewählt, um eine Stabilisierung der Viren und somit deren Infektiosität zu gewährleisten. Die Temperatur liegt dabei vorzugsweise oberhalb des Gefrierpunktes der Suspension.In The inventors' own experiments showed a low temperature range selected, to ensure stabilization of the viruses and thus their infectivity. The temperature is preferably above freezing the suspension.

Die Erfindung betrifft ferner Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren, und insbesondere derartige Träger, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind.The The invention further relates to carriers with one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and with immobilized on the functionalized surface, preferably infectious Viruses, and in particular such carriers, by the method according to the invention are made.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten Viren zur Untersuchung von medizinischen Proben.The The invention further relates to the use of a carrier one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and with viruses immobilized on the functionalized surface Examination of medical samples.

Bei dieser erfindungsgemäßen Verwendung wird eine medizinische Probe mit einem Träger in Kontakt gebracht, auf dessen Oberfläche sich immobilisierte Viren befinden und anschließend die Reaktion zwischen Substanzen, die sich in der medizinischen Probe befinden, mit den auf der Trägeroberfläche immobilisierten Viren untersucht.at this use according to the invention a medical sample is brought into contact with a carrier its surface immobilized viruses and then the reaction between substances, which are in the medical sample with the viruses immobilized on the carrier surface examined.

Dieses Verwendung bietet den Vorteil, dass medizinische Proben bspw. mit virusspezifischen Nachweismolekülen – in der Regel Antikörper – versetzt werden können. Diese Reaktion kann anschließend im Rahmen eines Hochdurchsatzverfahrens auf die Bindung an die immobilisierten Viren untersucht werden.This Use offers the advantage that medical samples can be used, for example virus-specific detection molecules - in the Antibody rule - offset can be. This reaction can then as part of a high-throughput process for binding to the immobilized Viruses are examined.

Unter „medizinischer Probe" wird in diesem Zusammenhang eine Probe verstanden, die für diagnostische oder therapeutische Zwecke relevante Zellen, Antikörper oder allgemein Proteine enthalten, deren Bindungsfähigkeit an die immoblisisierten Viren getestet werden soll.Under “medical Sample "will be in this Connected a sample understood that for diagnostic or therapeutic Purpose relevant cells, antibodies or generally contain proteins, their binding ability to be tested on the immobilized viruses.

Ein Einsatzgebiet der neuen Träger ist dabei das Durchmustern von Bibliotheken von gentechnisch veränderten Viren, insbesondere Adenoviren, auf ihre Zelladhäsionsfähigkeit. Diese Viren können dabei auf einen veränderten Tropismus gescreent werden, wenn also die Hüllproteine genetisch verändert werden, um die Viren für ein neues Zielgewebe spezifisch zu machen. Diese Viren werden insbesondere in der Gentherapie eingesetzt, wenn in bestimmte Zielgewebe genetisches Material eingeschleust werden soll, wobei das Nachbargewebe für die Transduktion nicht zugänglich sein soll.On Field of application of the new carrier is the screening of libraries of genetically modified ones Viruses, especially adenoviruses, on their cell adhesion ability. These viruses can to a changed one Tropism, so if the coat proteins are genetically modified, to the viruses for to make a new target tissue specific. These viruses in particular used in gene therapy when genetic in certain target tissues Material is to be introduced, using the neighboring tissue for transduction inaccessible should be.

Wenn die Viren Phagen sind, können die neuen Träger auch für Phagendisplay eingesetzt werden. Auf der Hülle von Bakteriophagen werden dabei z.B. unterschiedliche Antikörperfragmente exprimiert, deren Bindungsfähigkeit an Zellen oder an Proteine getestet wird.If the viruses are phages the new carriers also for Phage display can be used. Be on the shell of bacteriophages doing e.g. expressed different antibody fragments, their binding ability is tested on cells or on proteins.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten Viren zur Charakterisierung von Zellen und/oder zur Untersuchung von Zelladhäsion.Further The invention relates to the use of a carrier with a for immobilization functionalized surface suitable for viruses and with on the functionalized surface immobilized viruses for the characterization of cells and / or for the investigation of cell adhesion.

Auch bei dieser Verwendung wird eine Zellsuspension mit einem Träger in Kontakt gebracht, auf dessen Oberfläche Viren immobilisiert sind, und anschließend die Reaktion der in der Suspension vorliegenden Zellen mit den Viren analysiert.Also in this use, a cell suspension is contacted with a carrier brought on its surface Viruses are immobilized, and then the reaction of those in the Suspension of the cells analyzed with the viruses.

Hier wird z.B. die Zelladhäsion getestet, entweder für bestimmte Zellen gegen viele verschiedene Viren oder für bestimmte Viren gegen viele verschieden Zellen.Here e.g. the cell adhesion tested, either for certain cells against many different viruses or for certain Viruses against many different cells.

Die Charakterisierung von Zellen ist insbesondere für analytische Fragestellungen bedeutsam. Vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist hierbei die Spezifität der Wechselwirkung der viralen Liganden mit den zellulären Rezeptoren. So können ggf. aus einem Zellgemisch die zu untersuchenden Zellen, bzw. diejenigen Zellen, die an die immobilisierten Viren binden, ohne Schwierigkeiten auch aus kleinen Ausgangsmengen angereichert werden.The Characterization of cells is particularly useful for analytical questions significant. This is advantageous in the use according to the invention the specificity the interaction of the viral ligands with the cellular receptors. So can if necessary, the cells to be examined or those from a cell mixture Cells that bind to the immobilized viruses with no difficulty can also be enriched from small initial quantities.

In dieser Verwendung nachgeschalteten Verfahren können die angereicherten Zellen für eine Vielzahl weiterführender Untersuchungen eingesetzt werden, wie bspw. zur Untersuchung des Stoffwechsels oder der Reaktion auf äußere Reize, Umwelteinflüsse, etc.In this enriched cells can use this method for one Variety of advanced Investigations are used, such as for examining the Metabolism or the reaction to external stimuli, environmental influences, etc.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, infektiösen Viren zum Transfer genetischen Materials in Zellen.The The invention further relates to the use of a carrier one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and with infectious viruses immobilized on the functionalized surface for the transfer of genetic material into cells.

Hier wird zusätzlich zu der oben bereits angesprochenen Zelladhäsion auch noch der Gentransfer getestet bzw. ausgenutzt.Here will be additional in addition to the cell adhesion mentioned above, gene transfer tested or exploited.

Insbesondere ist diese Verwendung bevorzugt, wenn folgende Schritte durchgeführt werden:

(a) Bereitstellen eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten infektiösen Viren, und
(b) In-Kontakt-Bringen des Trägers mit einer Suspension, welche Zellen enthält.

This use is particularly preferred if the following steps are carried out:

(a) providing a carrier with a functionalized surface suitable for the immobilization of viruses and with infectious viruses immobilized on the functionalized surface, and
(b) contacting the carrier with a suspension containing cells.

Diese Verwendung bietet den Vorteil, dass ein automatisierter, miniaturisierter, paralleler Gentransfer ermöglicht wird. Durch die Immobilisierung von Viren können auch primäre Zellen mit genetischem Material transfiziert werden. Von Interesse sind hierbei bspw. auch Gene, die nicht aus dem Genrepertoire der Viren stammen: So kann bspw. in die Viren Genmaterial eingefügt werden, die Viren anschließend an die Trägeroberfläche immobilisiert werden, und anschließend die zu transfizierenden Zellen auf den Träger gegeben werden.This Use offers the advantage that an automated, miniaturized, parallel gene transfer enabled becomes. By immobilizing viruses, primary cells can also be transfected with genetic material. Are of interest for example also genes that do not come from the genre repertoire of viruses: For example, genetic material can be inserted into the viruses, the viruses can then be added immobilizes the carrier surface and then the cells to be transfected are placed on the carrier.

Mit der erfindungsgemäßen Verwendung besteht die Möglichkeit, jegliche genetische Information in die Zielzellen einzubringen, denn nach Anheftung der Zellen an die immobilisierten Viren schleusen diese ihr Genmaterial in die anhaftenden Zellen ein. Vorteilhafterweise werden dadurch nur diejenigen Zellen transfiziert, die auch an immobilisierte Viren anhaften. Ein derartiges Verfahren ist insbesondere für Zelltypen von Bedeutung, die dem klassischen, physikalischen Gentransfer nicht zugänglich sind.With the use according to the invention it is possible, bring any genetic information into the target cells, because after the cells have been attached to the immobilized viruses they insert their genetic material into the adherent cells. advantageously, only those cells are transfected that are also immobilized on Viruses attached. Such a method is particularly for cell types of importance that classic physical physical transfer does not accessible are.

Der Nachweis des Gentransfers kann bspw. durch die Reaktion der Zelle auf den Gentransfer mittels verschiedener Tests untersucht werden, wie bspw. visuell über Veränderungen der Morphologie, enzymatisch über Veränderungen des Stoffwechsels, immunologisch über Veränderung der den Zellstatus kennzeichnenden Zellprodukte, über die Expression von Reportergenen usw.The The gene transfer can be detected, for example, by the reaction of the cell be tested for gene transfer using various tests, such as visually changes the morphology, enzymatically via changes of metabolism, immunologically by changing the cell status characteristic cell products, about the expression of reporter genes etc.

Werden anstelle der natürlicherweise vorkommenden Viren solche verwendet, die gentechnisch verändert worden sind, besteht die Möglichkeit, jedwede genetische Information in die Zelle einzubringen.Become instead of the naturally occurring viruses used those that have been genetically modified there is a possibility to bring any genetic information into the cell.

Die Transfektion von Zellen mit DNA ist zwar bereits von Sabatini et al. (siehe US-Patentanmeldung US 2002/0006664 A1) beschrieben worden. Hier jedoch erfolgt die Transfektion der Zellen durch Verwendung von DNA, welche in einem Expressionsvektor vorliegt, wobei eine Mischung mit einem Trägerprotein vorzugsweise Gelatine) verwendet wird, welche auf dem Trägermaterial immobilisiert wird. Eine Immobilisierung von Viren, welche zu transduzierende DNA aufweisen, ist nicht beschrieben oder vorgeschlagen.The transfection of cells with DNA has already been described by Sabatini et al. (see US patent application US 2002/0006664 A1). Here, however, the cells are transfected by use of DNA which is present in an expression vector, using a mixture with a carrier protein, preferably gelatin), which is immobilized on the carrier material. Immobilization of viruses which have DNA to be transduced has not been described or suggested.

Bei Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendungen ist bevorzugt, wenn die Zellen eukaryontische Zellen sind, und zwar insbesondere primäre Zellen oder immortalisierte Zellen.at embodiments of the uses according to the invention is preferred when the cells are eukaryotic cells especially primary Cells or immortalized cells.

Die erfindungsgemäße Verwendung zum Gentransfer ist vor allem bei primären Zellen eine herausragende Methode, um diese Zellen zu transduzieren, da der Gentransfer in diese Zellen mit herkömmlichen Verfahren bekanntermaßen schwierig ist.The use according to the invention for gene transfer is particularly outstanding in primary cells Method to transduce these cells because the gene transfer in these cells with conventional Process known is difficult.

Andererseits können auch Bakteriophagen immobilisiert und bspw. Bakterien transduziert werden. Als Anwendung ist hier die Expressionskontrolle beim Screenen auf erfolgten Gentransfer zu nennen. Es können aber auch Bibliotheken von Phagen auf ihre Fähigkeit untersucht werden, an Zelloberflächenrezeptoren zu binden, wie es bspw. für Phagendisplay eingesetzt werden kann.on the other hand can also immobilized bacteriophages and, for example, transduced bacteria become. Expression control when screening is used here to call for gene transfer. But libraries can also from phages to their ability be examined on cell surface receptors to tie as it is for Phage display can be used.

Allgemein ist bevorzugt, wenn für die erfindungsgemäßen Verwendungen ein Träger eingesetzt wird, der nach dem oben erwähnten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist.Generally is preferred if for the uses according to the invention A carrier is used by the above-mentioned method according to the invention is made.

Die Erfindung betrifft ferner allgemein ein Verfahren zur Einschleusung von DNA oder RNA in eine pro- bzw. eukaryontische Zelle, mit den Schritten:

(a) Aufbringen einer Virus-enthaltenden Lösung auf einen Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche,
(b) Anhaftenlassen der Lösung auf der Oberfläche, und
(c) Aufbringen von einer Suspension, welche Zellen enthält, auf die Oberfläche, um die Zellen mit der in den Viren enthaltenden DNA oder RNA zu transduzieren.

The invention further relates generally to a method for introducing DNA or RNA into a pro- or eukaryotic cell, comprising the steps:

(a) applying a virus-containing solution to a support with a functionalized surface suitable for the immobilization of viruses,
(b) allowing the solution to adhere to the surface, and
(c) applying a suspension containing cells to the surface to transduce the cells with the DNA or RNA contained in the viruses.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet die herausragende Möglichkeit, genetisches Material schnell und effizient in Zellen einzuschleusen. Dieses Verfahren ist im Vergleich zu dem bekannten Verfahren, bei welchem die zu transfizierende DNA direkt auf dem Träger immobilisiert vorliegt, günstiger, da vorliegend die Zellen spezifisch auf die Spots fokussiert werden, d.h. nur an Stellen auf dem Träger binden, an welchen die Viren immobilisiert sind.The inventive method offers the outstanding opportunity inject genetic material into cells quickly and efficiently. This method is compared to the known method which immobilizes the DNA to be transfected directly on the carrier available, cheaper, since in the present case the cells are specifically focused on the spots, i.e. only in places on the carrier bind to which the viruses are immobilized.

Hierbei ist insbesondere bevorzugt, wenn ein Träger verwendet wird, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist.in this connection is particularly preferred if a carrier is used, which according to the inventive method is made.

Die Erfinder konnten durch eigene Versuche zeigen, dass durch erfindungsgemäß hergestellte Träger mit immobilisierten Viren genetisches Material in Zellen eingeschleust werden kann, welche bspw. in einer Suspension auf den Träger gegeben werden. Ein derartiges Verfahren und ein dazu einzusetzender Träger waren im Stand der Technik bisher nicht bekannt, da die Immobilisierung von Viren und eine stabile Lagerung bisher nicht möglich war.The Inventors were able to show by their own experiments that those produced according to the invention Carrier with immobilized viruses genetic material introduced into cells can be placed on the carrier, for example in a suspension become. Such a method and a carrier to be used were in Previously not known, since the immobilization of Viruses and stable storage were previously not possible.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Lagern von vorzugsweise infektiösen Viren auf einem Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und insbesondere auf einem Träger, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist.The The invention further relates to a method for storing preferably infectious Viruses on a medium with one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and especially on a carrier, that according to the inventive method is made.

Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, dass es möglich ist, Viren für einen längeren Zeitraum auf einem Träger stabil zu immobilisieren, ohne dass sie ihre Fähigkeit, an Zellen zu binden, oder ihre Infektiosität verlieren. Eine Lagerung von infektiösen Viren außerhalb von Zellen oder entsprechenden lebenden Wirten, war – wie oben erwähnt – bisher im Stand der Technik nicht bekannt.The Inventors have been able to show in their own experiments that it is possible Viruses for a longer one Period on a support immobilize stably without losing their ability to bind to cells or their infectivity to lose. Storage of infectious viruses outside of cells or equivalent living hosts was - as above mentioned - so far not known in the prior art.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It it is understood that the above and the following still to be explained Features not only in the specified combination, but also can also be used alone without the scope of the present Leaving invention.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden den nachfolgenden Beispielen und den beigefügten Figuren dargestellt und erläutert. Es zeigen:embodiments The invention will be the following examples and the accompanying figures shown and explained. Show it:

1a eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Trägers in einer perspektivischen Ansicht; 1a a schematic representation of a carrier according to the invention in a perspective view;

1b eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Trägers aus 1a in Draufsicht; 1b a schematic representation of the carrier according to the invention 1a in top view;

2a fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von infizierten bzw. nicht infizierten HEK293-Zellen nach 7 Tagen; 2a fluorescence micrographs of infected or uninfected HEK293 cells after 7 days;

2b fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen infizierter bzw. nicht infizierter HEK293-Zellen nach 14 Tagen; 2 B fluorescence microscopic images of infected or uninfected HEK293 cells after 14 days;

3 eine Kollage verschiedener Ausschnitte der Fluoreszenz eines Spots einer Kammer; 3 a collage of various sections of the fluorescence of a spot in a chamber;

4 fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen infizierter primärer Zellen; und 4 fluorescence micrographs of infected primary cells; and

5-9 Aufnahmen wie in 2a und 2b, jedoch für weitere Oberflächen. 5 - 9 Recordings like in 2a and 2 B , but for other surfaces.

Beispiel 1example 1

Funktionalisierung der Oberfläche des Trägermaterialsfunctionalization the surface of the carrier material

Kommerziell erhältliche, mit poly-L-Lysin vorbeschichtete gläserne Objektträger (PolyPrep, Sigma, Taufkirchen, Deutschland) wurden mit Nitrocellulose beschichtet. Dazu wurden die Objektträger für 2 Minuten in ein mit in Methanol gelöster Nitrocellulose (2,5 mg/ml) gefülltes Tauchbad gegeben. Anschließend wurden die Träger unter sterilen Bedingungen getrocknet. Auf diese Weise wurde die funktionalisierte Oberfläche für die nachfolgende Immobilisierung der Viren hergestellt.Commercially available, glass slides precoated with poly-L-lysine (PolyPrep, Sigma, Taufkirchen, Germany) were coated with nitrocellulose. To do this, the slides for 2 minutes in one with dissolved in methanol Nitrocellulose (2.5 mg / ml) filled Given immersion. Subsequently became the bearers dried under sterile conditions. In this way, the functionalized surface for the subsequent immobilization of the viruses.

Immobilisierung der VirenImmobilization of the viruses

a) Beschreibung des verwendeten Virenmodellsa) Description of the used viruses model

Als Modellsystem wurden kommerziell erhältliche, durch gentechnische Veränderung in ihrer Vermehrung auf spezielle Hilfszellen (HEK293) angewiesene Adenoviren des Serotyps 5 (AdEasy-1, Stratagene, La Jolla, USA) verwendet. Diese Viren weisen die Eigenschaft auf, ein breites Spektrum von Säugerzellen infizieren zu können, sie vermögen sich jedoch nicht in diesen Zellen zu vermehren. In diese Viren wurde über eine weitere gentechnische Veränderung ein fremdes Gen eingebracht, welches ein durch Fluoreszenz nachweisbares Produkt liefert, das Green Fluorescent Protein (im Folgenden GFP). Sowohl das Virus als auch das GFP finden in molekularbiologischen Laboratorien standardmäßig Verwendung. Das verwendete Virus wird im Folgenden AdEasy-CMV-GFP bezeichnet.As Model systems have been commercially available, through genetic engineering change propagation dependent on special auxiliary cells (HEK293) Serotype 5 adenoviruses (AdEasy-1, Stratagene, La Jolla, USA) used. These viruses have the property of a wide range of mammalian cells to be able to infect they can however, do not reproduce in these cells. Into these viruses was about another genetic modification introduced a foreign gene that is detectable by fluorescence The product supplies the Green Fluorescent Protein (hereinafter GFP). Both the virus and the GFP are found in molecular biological Laboratories use by default. The virus used is referred to below as AdEasy-CMV-GFP.

b) Präparation der Virenb) preparation of the viruses

Folgende Viruspräparationen wurden von den Erfindern zum Einsatz gebracht: Zum einen wurde virushaltiger Überstand infizierter HEK293-Zellen verwendet, zum anderen Viren, die aus diesem Zellüberstand über eine Dichtegradientenzentrifugation (Cäsiumchlorid-Gradient) auf gereinigt wurden. HEK293 (human embryonic kidney) -Zellen sind bspw. bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSMZ-Nummer ACC305 erhältlich. Die beiden Viruspräparationen wurden jeweils 1:1,3 mit Auftragspuffer verdünnt. Bei dem Auftragspuffer handelt es sich um eine 80-%ige Lösung von Glycerol in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).The following virus preparations were used by the inventors: on the one hand, virus-containing supernatant infected HEK293 cells, on the other hand, viruses that originate from this cell supernatant over a Density gradient centrifugation (cesium chloride gradient) on cleaned were. HEK293 (human embryonic kidney) cells are, for example, in the German collection for Microorganisms and cell cultures (DSMZ) available under DSMZ number ACC305. The two virus preparations were diluted 1: 1.3 with application buffer. With the order buffer it is an 80% solution of glycerol in phosphate buffered saline solution (PBS).

c) Immobilisierung der Viren in Array-Anordnungc) Immobilization of the Viruses in an array

Im Modellversuch wurden auf den Objektträgern (siehe oben) 8 beschickbare Kammern eingerichtet, indem desinfizierte Kunststoffgitter (FlexiPERM, Vivascience, Göttingen) sanft auf die Oberfläche gedrückt wurden. Zur Verhinderung von Kontakten zwischen den Kammern wurde die Auflagefläche der Gitter zuvor mit Petrolatum (Vaseline, Lever Fabergé, Hamburg) imprägniert.in the Model trials were 8 loadable on the slides (see above) Chambers set up by disinfected plastic grids (FlexiPERM, Vivascience, Göttingen) gently on the surface were pressed. To prevent contact between the chambers, the contact surface of the Grid previously with petrolatum (Vaseline, Lever Fabergé, Hamburg) impregnated.

In 1 ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Objektträgers schematisch dargestellt, wobei 1a eine perspektivische Ansicht und in 1b eine Draufsicht auf den Objektträger dargestellt ist. In den Figuren sind gleiche Elemente mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet. In den 1a und 1b ist mit 10 allgemein ein Objektträger dargestellt, mit einer Oberfläche 11 und mit einem auf der Oberfläche 11 aufgebrachten Gitteraufsatz 12. Die Oberfläche 11 des Objektträgers 10 wurde vor Aufbringung des Gitteraufsatzes 12 mit Nitrocellulose beschichtet. Der Gitteraufsatz 12 ist an seiner Unterseite mit einer Vaseline-Schicht versehen. Durch Aufbringen des Gitteraufsatzes 12 auf der mit der Nitrocellulose beschichteten Oberfläche 11 entstehen Kammern 14, deren Kontakt untereinander durch die Vaselineschicht unter dem Gitteraufsatz 12 verhindert wird.In 1 An embodiment of the slide according to the invention is shown schematically, wherein 1a a perspective view and in 1b a top view of the slide is shown. In the figures, the same elements are identified by the same reference symbols. In the 1a and 1b is With 10 generally depicted a slide with a surface 11 and with one on the surface 11 applied grille attachment 12 , The surface 11 of the slide 10 was before applying the grille attachment 12 coated with nitrocellulose. The grille attachment 12 has a petroleum jelly layer on the underside. By attaching the grille attachment 12 on the surface coated with the nitrocellulose 11 chambers are created 14 , their contact with each other through the vaseline layer under the grid attachment 12 is prevented.

In die Mitte der Kammern 14 erfolgte der Auftrag der in Suspension befindlichen Viren (Auftragsvolumen: 1 μl). Die Viren sedimentieren aufgrund ihrer Schwerkraft aus dieser Suspension auf die funktionalisierte Oberfläche, wo sie haften bleiben. Um der Sedimentation und dem Anheften der Viren genügend Zeit einzuräumen, wurden die Objektträger 18 Stunden bei 4°C gehal ten. Anschließend wurden die Kammern mit 500 μl PBS gefüllt, um ein Austrocknen zu verhindern. Anschließend wurden die Objektträger bei 37°C gelagert.In the middle of the chambers 14 the viruses in suspension were applied (application volume: 1 μl). Due to their gravity, the viruses sediment from this suspension onto the functionalized surface, where they adhere. To allow sufficient time for sedimentation and virus attachment, the slides were kept at 4 ° C. for 18 hours. The chambers were then filled with 500 μl of PBS to prevent drying out. The slides were then stored at 37 ° C.

Vor Aussaat der Zellen wurden die Kammern mit 500 μl PBS gewaschen, um möglicherweise wieder in Suspension gegangene Viren zu entfernen.In front Sowing the cells, the chambers were washed with 500 μl PBS to possibly remove viruses that have gone into suspension again.

Beispiel 2Example 2

Stabilität der immobilisierten VirenStability of the immobilized virus

Für die praktische Anwendbarkeit war es wichtig zu untersuchen, welche Stabilität die immobilisierten Viren unter gewöhnlichen Umgebungsbedingungen besaßen, da in der Regel davon auszugehen ist, dass eine räumliche und zeitliche Trennung der Immobilisierung der Viren und der Ansiedlung der Zellen erstrebt wird. Deshalb ist die Transport- und Lagerfähigkeit der mit den erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten Viren ein herausragendes Merkmal.For the practical Applicability, it was important to examine the stability of the immobilized virus under ordinary Had environmental conditions, since it can usually be assumed that a spatial and temporal separation of the immobilization of the viruses and the settlement of cells. That is why it can be transported and stored with the method according to the invention immobilized viruses an outstanding feature.

Für den Versuch wurden Viren (AdEasy-CMV-GFP) immobilisiert und nach 7- bzw. 14-tägiger Lagerung bei 37°C jeweils einmal 10⁵ HEK293-Zellen pro Kammer ausgesät. Der Nachweis der erfolgten Infektion erfolgte jeweils einen Tag nach der Aussaat der Zellen durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen: Infizierte Zellen, die das Gen des GFP aufgenommen hatten, wurden durch Laserlicht zur Fluoreszenz angeregt.For the experiment, viruses (AdEasy-CMV-GFP) were immobilized and after storage for 7 or 14 days at 37 ° C., 10 ⁵ HEK293 cells were sown once per chamber. The detection of the infection that occurred was carried out one day after the cells were sown by fluorescence microscopy: infected cells which had taken up the GFP gene were excited to fluoresce by laser light.

In den 2a und 2b sind die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen dieses Versuches dargestellt, wobei in der linken Spalte jeweils vier Objektträger (OT) in Durchlichtaufnahme und in der rechten in Fluoreszenzaufnahme gezeigt sind. Die Fluoreszenzaufnahmen sind zur besseren Darstellung invertiert.In the 2a and 2 B The fluorescence microscopic images of this experiment are shown, with four slides (OT) each being shown in transmitted light and in the right column in fluorescence. The fluorescence images are inverted for better illustration.

Tabelle 1

Table 1

Für den Versuch wurden vier verschiedene Ansätze durchgeführt: Auf einem Objektträger Nr. 1 wurde nur Auftragspuffer ohne Virussuspension aufgetragen (Negativkontrolle). Auf den Objektträgern Nr. 2 bis 4 wurden Viren verschiedener Präparationen immobilisiert: Auf den Objektträger Nr. 2 wurde der Überstand infizierter HEK293-Zellen gegeben, auf den Objektträger Nr. 3 Viren, die über einen Cäsiumchlorid-Gradienten aufgereinigt wurden, und auf den Objektträger Nr. 4 Viren, bei denen auf dem Spot Rinderserumalbumin (BSA, 0,5 μl, 1 mg/ml) vorgelegt wurde.For trying were four different approaches carried out: On a slide No. 1, only application buffer without virus suspension was applied (Negative control). Viruses were found on slides 2 to 4 different preparations immobilized: on the slide No. 2 became the supernatant infected HEK293 cells, placed on slide no. 3 viruses that over cleaned up a cesium chloride gradient and on the slide No. 4 viruses in which bovine serum albumin (BSA, 0.5 μl, 1 mg / ml) was submitted.

In der Tabelle 1 sind die Ergebnisse dieses Versuches dargestellt. Adenoviren der verschiedenen Präparationsstufen wurden in den Kammern immobilisiert und die Kammern zu den angegebenen Zeiten (am Tag 7 und am Tag 14 nach der Immobilisierung) mit Zellen beschickt. Im Falle von Cäsiumchlorid/BSA wurden 0,5 μl Rinderserumalbumin (1 mg/ml) vorgelegt und anschließend 1 μl Suspension aufgetragen. Die relativen Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 1 durch die folgenden Symbole klassifiziert:

–: keine Fluoreszenz
+: schwache Fluoreszenz
+++: starke Fluoreszenz.

The results of this experiment are shown in Table 1. Adenoviruses of different pre Separation stages were immobilized in the chambers and cells were loaded into the chambers at the times indicated (on day 7 and on day 14 after immobilization). In the case of cesium chloride / BSA, 0.5 μl of bovine serum albumin (1 mg / ml) were introduced and then 1 μl suspension was applied. The relative fluorescence intensities are classified in Table 1 by the following symbols:

-: no fluorescence
+: weak fluorescence
+++: strong fluorescence.

Bei aus dem Überstand infizierter HEK293-Zellen gewonnenen, nicht weiter aufgereinigten Viren konnte eine Fluoreszenz noch nach 7-tägiger Lagerung festgestellt werden, nicht jedoch, nachdem die Viren 14 Tage gelagert worden waren (siehe Objektträger 2, Zellauftrag nach Tag 7 und nach Tag 14; außerdem in 2a Objektträger 2 und 2b Objektträger 2). Die Haltbarkeit bzw. Stabilität der Viren wurde durch die Aufreinigung über die Dichtegradientenzentrifugation deutlich verbessert (siehe Objektträger Nr. 3 in den 2a und 2b, sowie in der Tabelle 1). Eine darüber hinausgehende Stabilisierung ließ sich durch Vorlage von Rinderserumalbumin erzielen (siehe Objektträger Nr. 4 in den 2a und 2b sowie in der Tabelle 1).In the case of viruses obtained from the supernatant of infected HEK293 cells and not further purified, fluorescence was still detectable after 7 days of storage, but not after the viruses had been stored for 14 days (see slide 2 , Cell application after day 7 and after day 14; also in 2a Slides 2 and 2 B Slide 2). The durability or stability of the viruses was significantly improved by purification using density gradient centrifugation (see slide no. 3 in the 2a and 2 B , as well as in Table 1). Stabilization beyond this could be achieved by presenting bovine serum albumin (see slide No. 4 in the 2a and 2 B and in Table 1).

Die Stabilität der Immobilisierung an sich, d.h. die Konstanz der Lokalisation der immobilisierten Viren auf den Spot, wird aus 3 ersichtlich, die für HEK 293-Zellen eine Kollage aus verschiedenen Ausschnitten der Fluoreszenz eines Spots einer Kammer am Tag 1 nach der Infektion darstellt: Fluoreszierende Zellen (zur besseren Darstellung invertiert) befinden sich, wie in der Figur zu erkennen ist, hauptsächlich innerhalb der kreisförmigen Spot-Fläche.The stability of the immobilization itself, ie the constancy of the location of the immobilized viruses on the spot, is determined 3 can be seen, which for HEK 293 cells represents a collage of different sections of the fluorescence of a spot in a chamber on day 1 after infection: fluorescent cells (inverted for better illustration) are, as can be seen in the figure, mainly within the circular one spot area.

Aus diesem Versuch lässt sich demnach schließen, dass die Viren durch ihre Immobilisierung nicht die Fähigkeit verlieren, Zellen zu infizieren und somit fremde genetische Information zu transferieren. Ferner zeigte sich, dass bei der Wahl geeigneter Immobilisierungsbedingungen die Infektiosität über mindestens zwei Wochen bestehen bleibt. Außerdem ist die Immobilisierung der Viren, bzw. die Stabilität ihrer Lokalisierung, innerhalb der ursprünglichen Spot-Fläche gewährleistet.Out lets try this therefore close that the viruses by their immobilization do not have the ability lose, infecting cells and hence foreign genetic information to transfer. It also showed that the choice was more suitable Immobilization conditions the infectivity over at least two weeks remains. Moreover is the immobilization of the viruses or the stability of them Localization guaranteed within the original spot area.

Die Erfinder konnten demnach zeigen, dass immobilisierte Adenoviren mindestens 14 Tage bei 37°C stabil waren und die Infektion von HEK293-Zellen inklusive Übertragung und Expression des Reportergens GFP ermöglichten.The Inventors were able to show that immobilized adenoviruses Stable at least 14 days at 37 ° C were and infection of HEK293 cells including transmission and expression of the reporter gene GFP.

Beispiel 3Example 3

Infektion von primären Zellen mit immobilisierten Vireninfection of primary Cells with immobilized viruses

Wie oben erwähnt, besteht der Vorteil der Verwendung von Viren als Mittel des Gentransfers in den gegenüber den klassischen, physikalischen Methoden deutlich erweitertem Spektrum manipulierbarer Zelltypen. Zu diesen nur viral effizient manipulierbaren Zellen zählen viele Primärzellen, also solche, die entweder nicht kultivierbar sind oder in der Kultur ihre charakteristischen Eigenschaften verlieren. Zur lebensnahen Untersuchung müssen diese Zellen stets frisch aus dem Gewebe isoliert werden, was eine einschneidende Begrenzung der verfügbaren Menge bedingt.How mentioned above, there is the advantage of using viruses as a means of gene transfer in the opposite the classical, physical methods with a clearly expanded spectrum manipulable cell types. These can only be manipulated with viral efficiency Count cells many primary cells, So those that are either not cultivable or in culture lose their characteristic properties. For real life Need investigation these cells are always freshly isolated from the tissue, which is a incisive limitation of the available quantity.

Als Beispiele für Primärzellen wurden in einem nächsten Versuch Mikrogliazellen aus dem Gehirn von 3 Tage alten Ratten einge setzt. Adenoviren (AdEasy-CMV-GFP) wurden wie oben beschrieben auf beschichtete Objektträger aufgebracht und immobilisiert. Nach 8 Tagen wurden pro Kammer 5 × 10⁴ Zellen (HEK293 als Positivkontrolle, Mikroglia als zu testende primäre Zellen) ausgesät.In a next experiment, microglial cells from the brain of 3-day-old rats were used as examples of primary cells. Adenoviruses (AdEasy-CMV-GFP) were applied to immobilized slides as described above and immobilized. After 8 days, 5 × 10 ⁴ cells (HEK293 as positive control, microglia as primary cells to be tested) were sown per chamber.

Nach zwei Tagen wurden fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen angefertigt (siehe 4). In der oberen Zeile sind Durchlicht (linke Spalte) und Fluoreszenzaufnahmen (rechte Spalte) für HEK 293-Zellen, in der unteren Zeile für Mikrogliazellen gezeigt. Die Belichtungszeit bei den Fluoreszenzaufnahmen betrug 5 Sekunden. Wie bereits im oben genannten Versuch gezeigt, ließ sich auch hier bei den HEK293-Zellen eine starke Fluoreszenz bei Anregung durch Laserlicht erkennen. Ferner waren auch bei den Mikrogliazellen vereinzelte fluoreszierende Zellen erkennbar.Fluorescence microscopic images were taken after two days (see 4 ). Transmitted light (left column) and fluorescence images (right column) for HEK 293 cells are shown in the upper line, and for microglial cells in the lower line. The exposure time for the fluorescence images was 5 seconds. As already shown in the above-mentioned experiment, a strong fluorescence could be seen in the HEK293 cells when excited by laser light. Furthermore, isolated fluorescent cells could be seen in the microglial cells.

Dieser Versuch zeigte, dass sich auch Mikrogliazellen, ebenso wie die Kontrollzellen, mit den immobilisierten Viren infizieren ließen. Damit konnte die prinzipielle Anwendbarkeit des Verfahrens auch bei den Primärzellen gezeigt werden, die den klassischen, physikalischen Gentransfermethoden nur schwer zugänglich sind.This The experiment showed that microglial cells, like the control cells, infected with the immobilized viruses. With that, the principal Applicability of the method can also be shown in the primary cells that the classic, physical gene transfer methods are difficult to access.

Beispiel 4Example 4

Abschätzung der Infektionseffizienz von primären Zellen mit immobilisierten VirenEstimation of Infection efficiency of primary Cells with immobilized viruses

Bei vielen Testsystemen ist es insbesondere bei einer kleinen Menge von zu testenden Zellen wichtig, dass die durch die Viren vermittelte genetische Information möglichst viele Zellen erreicht, weil sonst die zu messenden Effekte unterhalb der Nachweisgrenze fallen könnten. Daher ist es von grundsätzlicher Bedeutung, dass die Infektion nicht nur bei einer Minderheit von Zellen gelingt, sondern bei der überwiegenden Mehrheit. Die Effizienz der Infektion ist unter anderem davon abhängig, dass hinreichend viele immobilisierte Viren ihre Infektiosität behalten.at In many test systems, this is particularly the case with a small amount of cells to be tested important that those mediated by the viruses genetic information if possible reached many cells because otherwise the effects to be measured are below the detection limit could fall. Therefore it is more fundamental Meaning that the infection is not only in a minority of Cells succeed, but in the predominant Majority. The efficiency of the infection depends, among other things, on that A sufficient number of immobilized viruses retain their infectivity.

Um die Frage der Infektionseffizienz zu untersuchen, wurde der Versuch der Infektion von Mikrogliazellen wie oben erwähnt wiederholt. Auf zwei zufällig ausgewählten Bildausschnitten wurden bei 200facher Vergrößerung zunächst alle in der durch Lichtaufnahme sichtbaren Zellen gezählt und anschließend die in der Anregung von Laserlicht fluoreszierenden Zellen.Around The attempt was made to examine the question of infection efficiency repeated infection of microglial cells as mentioned above. On two randomly selected image sections were all at 200x magnification counted in the cells visible through light and then the in the excitation of laser fluorescent cells.

Die Auszählung ergab in einem Fall, dass von 66 Zellen 41 fluoreszierten, in dem anderen Fall fluoreszierten 32 Zellen von gezählten 54 Zellen. Damit lag die Effizienz für die Übertragung und Expression des Reportergens GFP bei Mikrogliazellen in einer Größenordnung von rund 60 %.The count found in one case that 41 of 66 cells fluoresced, in which in another case, 32 cells fluoresced out of 54 cells counted. With that lay the efficiency for the transfer and expression of the reporter gene GFP in microglial cells in one Magnitude of around 60%.

Damit konnte gezeigt werden, dass eine Mehrheit der angesiedelten Primärzellen dem viralen Gentransfer zugänglich war. Somit konnte die Einsatzfähigkeit des Verfahrens unter laboralltäglichen Bedingungen demonstriert werden.In order to could be shown that a majority of the primary cells located accessible to viral gene transfer was. So the usability the procedure under everyday laboratory Conditions are demonstrated.

Zusammenfassend konnte also gezeigt werden, dass Viren auf einer kleinen Immobilisierungsfläche (Spot) in Rasteranordnung auf funktionalisierten Oberflächen immobilisiert werden konnten und dass ihre Infektiosität für 14 Tage bei 37°C erhalten blieb.In summary could be shown that viruses on a small immobilization area (spot) could be immobilized in a grid arrangement on functionalized surfaces and that their infectivity for 14 Days at 37 ° C was preserved.

Durch die Infektion konnte das Fremdgen GFP, welches in das virale Genom integriert war, in Zellen übertragen und dort exprimiert werden. Die Infektion gelang nicht nur bei immortalisierten Zellen, wie es die HEK293-Zellen darstellen, sondern auch bei primären Zellen, und zwar mit einer Effizienz von 60 %.By the infection could be the foreign gene GFP, which is in the viral genome was integrated, transferred into cells and be expressed there. The infection was successful not only in immortalized Cells like the HEK293 cells, but also with primary cells, with an efficiency of 60%.

Beispiel 5: Überprüfung weiterer OberflächenExample 5: Checking others surfaces

Unter den in den Beispielen 1 und 2 geschilderten Bedingungen wurden weitere funktionalisierte Oberfläche auf ihre Eignung getestet, Viren so immobilisieren zu können, dass sie infektiös bleiben.Under the conditions described in Examples 1 and 2 were further functionalized surface tested for their suitability to immobilize viruses in such a way that they infectious stay.

In den 5-9 zeigt die linke Spalte jeweils wieder Durchlichtaufnahmen, während die rechte Fluoreszenzaufnahmen zeigt, die zur besseren Darstellung invertiert wurden.In the 5 - 9 the left column shows transmitted light images again, while the right shows fluorescence images that have been inverted for better display.

5 zeigt Aufnahmen für zusätzlich mit Collagen beschichtete Objektträger, die wie in Beispiel 1 beschrieben mit Poly-L-Lysin vorbeschichtete gläserne Objektträger waren, die mit Nitrocellulose beschichtet waren. 5 shows images for additional slides coated with collagen, which, as described in Example 1, were glass slides precoated with poly-L-lysine and coated with nitrocellulose.

Die Aufnahmen aus 6 wurden für silanisierte Aldehyd-Objektträger gewonnen, die Aufnahmen aus 7 unter Verwendung von Superfrost (TM) Plus Adhesion Slides von Electron Microscopy Sciences, die Aufnahmen aus 8 unter Verwendung von Spot-On (TM) Proteinobjektträgern von Scandinavian Mictrobiodevices, und die Aufnahmen aus 9 unter Verwendung von GAPS II Coated Slides von Corning.The recordings from 6 were obtained for silanized aldehyde slides that were taken from 7 using Superfrost (TM) Plus Adhesion Slides from Electron Microscopy Sciences 8th using Spot-On (TM) protein slides from Scandinavian Mictrobiodevices, and the images from 9 using Corning's GAPS II Coated Slides.

Während bei den 5, 7 und 9 in der rechten Spalte jeweils fluoreszierende HEK 293-Zellen zu erkennen waren, ist dies bei den Aufnahmen aus den 6 und 8 nicht der Fall: Sowohl die silanisierten Aldehyd-Slides aus 6 als auch die Objektträger aus 8, bei denen eine kovalente Immobilisierung über Epsilon-Aminogruppen der Proteine erfolgt, zeigen keine Fluoreszenz.While with the 5 . 7 and 9 fluorescent HEK 293 cells were visible in the right column, this is the case with the images from the 6 and 8th not the case: both the silanized aldehyde slides out 6 as well as the slides 8th , in which covalent immobilization takes place via epsilon amino groups of the proteins, show no fluorescence.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Viren nicht kovalent gekoppelt sein dürfen, um auf dem Objektträger infektiös bleiben zu können.This Results show that the viruses are not covalently linked allowed to, around on the slide infectious to be able to stay.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit einer funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren, mit den folgenden Schritten: (a) Bereitstellen eines Trägermaterials; (b) Beschichten von zumindest einer Oberfläche des Trägermaterials zur Erzeugung einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche; (c) Aufbringen einer Lösung, welche vorzugsweise infektiöse Viren enthält, auf die funktionalisierte Oberfläche; (d) Anhaftenlassen der Viren an die funktionalisierte Oberfläche für einen Zeitraum von vorzugsweise 10 Minuten bis 36 Stunden; (e) ggf. Bedecken der Oberfläche mit einem Fluid.Process for producing a carrier with a functionalized surface and with the functio nalized surface immobilized, preferably infectious viruses, with the following steps: (a) providing a carrier material; (b) coating at least one surface of the carrier material to produce a functionalized surface suitable for the immobilization of viruses; (c) applying a solution, which preferably contains infectious viruses, to the functionalized surface; (d) allowing the viruses to adhere to the functionalized surface for a period of preferably 10 minutes to 36 hours; (e) optionally covering the surface with a fluid.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierte Oberfläche mit einem Material beschichtet ist, das die Viren nicht-kovalent bindet.A method according to claim 1, characterized in that the functionalized surface is coated with a material is that the virus binds non-covalently.

Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Material ausgewählt ist aus Nitrocellulose, Aminosilan und einem Material, das eine dauerhafte positive Ladung auf der Oberfläche bewirkt.A method according to claim 2, characterized in that the material is selected is made of nitrocellulose, aminosilane and a material that permanent positive charge on the surface.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial ein Material aufweist, das als Oberfläche für Zellkulturen geeignet ist und vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Zellkulturkunststoffe, Glas, Silicon, Polystyrol ausgewählt ist.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the backing material has a material that is suitable as a surface for cell cultures and preferably from the group comprising cell culture plastics, Glass, silicone, polystyrene selected is.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial mit einem Polykation, bspw. mit poly-L-Lysin oder Aminosilan vorbeschichtet ist.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that that the backing material precoated with a polycation, for example with poly-L-lysine or aminosilane is.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Virus-enthaltende Lösung, welche auf die funktionalisierte Oberfläche aufgebracht wird, eine Stoff enthält, der Proteinlösungen stabilisieren kann, wie bspw. Glycerol, Trehalose, und Sacharose.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that that the virus-containing solution, which is applied to the functionalized surface, a Contains fabric, of protein solutions can stabilize, such as glycerol, trehalose and sucrose.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Adenoviren oder Adenoassoziierte Viren (AAV) sind.Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that that the viruses are adenoviruses or adeno-associated viruses (AAV).

Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Adenoviren den Serotyp 5 aufweisen.A method according to claim 7, characterized in that the adenoviruses are serotype 5.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren gentechnisch verändert sind.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that that the viruses are genetically modified are.

Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren eine Sequenz aufweisen, die für das Greenfluorescent-Protein codiert.A method according to claim 9, characterized in that the viruses have a sequence that is relevant for the green fluorescent protein coded.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Virus-enthaltende Lösung ein Überstand Virus-infizierter Zellen eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that that as a virus-containing solution a supernatant Virus-infected cells is used.

Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Überstand vor Aufbringen auf die funktionalisierte Oberfläche gereinigt und/oder auf konzentriert wird.A method according to claim 11, characterized in that the supernatant cleaned and / or on before applying to the functionalized surface is concentrated.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (c) Rinderserumalbumin auf die funktionalisierte Oberfläche aufgebracht wird.Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that that functionalized bovine serum albumin before step (c) surface is applied.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitraum, in dem man die Viren auf der funktionalisierten Oberfläche anhaften lässt, 15 bis 20 Stunden beträgt.Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that that the period in which you functionalized the viruses on the surface cling to, Is 15 to 20 hours.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur, bei welcher man die Viren an die funktionalisierte Oberfläche anhaften lässt, –20°C bis +37°C beträgt.Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that that the temperature at which the viruses were functionalized surface adheres, is –20 ° C to + 37 ° C.

Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur 0°C bis 10°C beträgt.A method according to claim 15, characterized in that the temperature is 0 ° C up to 10 ° C is.

Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren.carrier with one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and with immobilized on the functionalized surface, preferably infectious Viruses.

Träger nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass er nach einem der Ansprüche 1 bis 16 hergestellt ist.carrier according to claim 17, characterized in that it according to one of the Expectations 1 to 16 is made.

Verwendung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren zur Untersuchung von medizinischen Proben.Using a carrier with one for immobilization functionalized surface suitable for viruses and with on the functionalized surface immobilized, preferably infectious viruses for examination of medical samples.

Verwendung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten, vorzugsweise infektiösen Viren zur Charakterisierung von Zellen und/oder zur Untersuchung von Zelladhäsion.Using a carrier with one for immobilization functionalized surface suitable for viruses and with on the functionalized surface immobilized, preferably infectious viruses for characterization of cells and / or to study cell adhesion.

Verwendung eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten infektiösen Viren zum Transfer genetischen Materials in Zellen.Using a carrier with one for immobilization functionalized surface suitable for viruses and with on the functionalized surface immobilized infectious Viruses for the transfer of genetic material into cells.

Verwendung nach Anspruch 21, mit den folgenden Schritten: (a) Bereitstellen eines Trägers mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche und mit auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten infektiösen Viren; (b) In-Kontakt-Bringen des Trägers mit einer Suspension, welche Zellen enthält.Use according to claim 21, comprising the following steps: (A) Deploy a carrier with one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface and with infectious viruses immobilized on the functionalized surface; (B) Bringing the wearer into contact with a suspension containing cells.

Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen pro- bzw, eukaryontische Zellen sind.Use according to one of claims 19 to 22, characterized in that that the cells are pro- or eukaryotic cells.

Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen primäre eukaryontische Zellen sind.Use according to claim 23, characterized in that the cells are primary are eukaryotic cells.

Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen immortalisierte Zellen sind.Use according to claim 23, characterized in that the cells are immortalized cells.

Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Bakteriophagen sind.Use according to claim 23, characterized in that the viruses are bacteriophages.

Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger eingesetzt wird, der nach einem der Ansprüche 1 bis 16 hergestellt ist.Use according to one of claims 19 to 26, characterized in that that a carrier is used, which is produced according to one of claims 1 to 16.

Verfahren zur Einschleusung von DNA oder RNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle, mit den Schritten: (a) Auf bringen einer Virus-enthaltenden Lösung auf einen Träger mit einer für die Immobilisierung von Viren geeigneten funktionalisierten Oberfläche, (b) Anhaftenlassen der Lösung auf der Oberfläche, (c) Aufbringen einer Suspension, welche Zellen enthält, auf die Oberfläche, um die Zellen mit der in den Viren enthaltenen DNA oder RNA zu transduzieren.Process for introducing DNA or RNA into a pro- or eukaryotic Cell, with the steps: (a) Bring on a virus-containing solution on a carrier with one for the immobilization of viruses suitable functionalized surface, (B) Allow the solution to adhere on the surface, (C) Applying a suspension containing cells to the surface in order to to transduce the cells with the DNA or RNA contained in the viruses.

Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger verwendet wird, der nach einem der Ansprüche 1 bis 16 hergestellt ist.A method according to claim 28, characterized in that a carrier is used, which is produced according to one of claims 1 to 16.

Verfahren zum Lagern von vorzugsweise infektiösen Viren, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf einem Träger mit einer funktionalisierten Oberfläche immobilisiert werden.Method for storing preferably infectious viruses, characterized in that they are functionalized on a support surface be immobilized.

Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger verwendet wird, der nach einem der Ansprüche 1 bis 16 hergestellt ist.A method according to claim 30, characterized in that a carrier is used, which is produced according to one of claims 1 to 16.