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Die
Erfindung bezieht sich auf den Nachweis der Bindungen von Analytmolekülen, beispielsweise Biopolymermolekülen, an
immobilisierten Fängersubstanzmolekülen.
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Die
Erfindung besteht darin, Halbleiter-Platten (Chips) mit elektrischen
Schaltkreisen in räumlicher
Nähe zur
Oberflächenbelegung
mit Fängersubstanzmolekülen zu verwenden,
und die Bindungen der Analytmoleküle an den Fängersubstanzmolekülen durch
mitgebundene elektrisch leitfähige
Nanopartikel zu belasten, so dass die Nanopartikel durch Erzeugung
von elektrochemischen Spannungen auf die elektrischen Schaltkreise
einwirken können
und somit die Bindungen der Analytmoleküle elektronisch nachweisbar
werden.
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Stand der Technik
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Es
handelt sich hier um das weite Feld der so genannten Chiparrays
mit kovalent gebundenen Fängersubstanzmolekülen für den Nachweis
affin bindender Biopolymermoleküle.
Die auf den Arrayfeldern gebundenen Fängersubstanzmoleküle können DNA-Moleküle („DNA-Chips"), Proteinmoleküle („Proteinchips") oder sonst geartete
Moleküle
mit affiner Bindungsfähigkeit
sein. Im Folgenden werden die Biopolymermoleküle als „Analytmoleküle", die Fängersubstanzmoleküle auf den
Chipfeldern einfach als „Sondenmoleküle" bezeichnet. Die
hybride oder affine Bindung der Analytmoleküle an den Sondenmolekülen findet
aus Lösungen
heraus statt, in denen die gesuchten Analytmoleküle vorkommen können, wobei
die Lösungen
mit der belegten Chipoberfläche
in direktem Kontakt stehen.
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Diese
Chiparrays mit Sondenmolekülen
werden für
das Studium der Bindungen (beispielsweise Kreuzreaktionen bei Antikörper-Bindungen),
besonders aber für
das selektive Einfangen von Analytmolekülen aus Körperflüssigkeiten und damit für die qualitative
und quantitative Analyse dieser Analytmoleküle selbst verwendet. In einigen
Fällen,
beispielsweise für
den Nachweis kennzeichnender DNA-Stränge von Infektionserregern,
grenzen sich die Analysen auf eine einfache Aussage über Anwesenheit
oder Abwesenheit des Infektionserregers ein. Durch die Vielzahl
von Sondenfeldern auf den Chiparrays kann eine Probe mit Körperflüssigkeit
gleichzeitig auf die Anwesenheit eines oder mehrerer unter sehr
vielen verschiedenen Arten von Infektionserregern nachgewiesen werden.
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Die
Analyseverfahren mit solchen Chiparrays werden auch als „zellenbasierte
Assays" bezeichnet
(cell-based assays); die Verfahren selbst häufig als „Screening".
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Die
Chiparrays können
aus Halbleitermaterial, wie beispielsweise aus Siliziumwafern, gefertigt sein,
aber es sind auch beliebige andere plattenförmigen Materialien als Grundlage
für die
Belegung mit Sondenmolekülen
möglich.
Es können
dazu verschiedenartige Gläser, Metalle
und sogar Kunststoffe verwendet werden. Halbleiter haben den Vorteil, dass
sich in ihnen auch mit mikrofabrikatorischen Verfahren elektrische
Schaltkreise einbringen lassen.
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Bei
den Chiparrays sind die verschiedenen Arten von Sondenmolekülen jeweils
festen Orten auf dem Chiparray zugeordnet. In der Druckschrift
WO 03/031979 A1 hingegen
sind die Sondenmoleküle auf
kodierten Mikropartikeln immobilisiert, die zufällig auf einem Substrat verteilt
sind. Die Zuordnung zu den jeweiligen Sondenmolekülen gelingt
dadurch, dass die Mikropartikel eindeutig kodiert sind und sich nur
jeweils eine Art von Sondenmolekül
auf einem Mikropartikel befindet.
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Als
Stand der Technik haben sich bisher für den Nachweis der Bindung
von Analytmolekülen
an Sondenmolekülen
nur wenige Verfahren eingeführt, die
hier nur sehr kurz dargelegt werden.
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Ein
Nachweis der Bindungen ist beispielsweise durch zusätzlich an
die Analytmoleküle
angebundene Fluoroszenzfarbstoffe möglich; ein solches Verfahren
erfordert Laserscanner oder Fluororeszenzmikroskope. Diese Geräte sind
jedoch kompliziert und teuer; die dafür geeigneten (patentierten) Fluoreszenzfarbstoffe
sind ebenfalls teuer.
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Ein
massenspektrischer Nachweis der affin gebundenen Analytmoleküle, beispielsweise
mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI)
nach Zugabe entsprechender Matrixsubstanzen, ist wegen des dazu
benötigten
Massenspektrosmeters ebenfalls recht aufwendig. Der massenspektrometrische
Nachweis hat allerdings den Vorteil, eine zusätzliche Bestätigung der
Identität der
Analytmoleküle
durch ihre Masse zu liefern.
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Ein
weiteres Verfahren, das zur Zeit in Entwicklung ist, besteht auf
der gleichzeitigen Anbindung der Analytmoleküle und größerer Massen, beispielsweise
durch Nanopartikel, auf geeigneten Schwingern für einen Nachweis der affinen
Bindungen durch akustische Oberflächenwellen (SAW = surface acoustic
waves), deren Frequenz belegungsabhängig ist.
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Das
Verfahren der Plasmonresonanzspektrometrie, das ebenfalls zum Nachweis
der affinen Bindungen von Analytmolekülen an Sondenmolekülen verwendet
wird, bedarf jeweils etwas größerer Flächen für die flache
Reflektion des Lichts, so dass es bisher nicht gelungen ist, für diese
Art des Nachweises Arrays mit größeren Anzahlen
an Feldern zu produzieren. Die Vorteile liegen darin, auch die Kinetik
des Bindevorgangs messen zu können.
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Aus
dem Stand der Technik ist eine Vielzahl von Verfahren bekannt, bei
denen die Bindung von Analytmolekülen an Sondenmolekülen elektrisch ausgelesen
wird, indem Partikel zusammen mit den Analytmolekülen an die
Sondenmoleküle
anbinden.
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In
der Patentschrift
DE
198 60 547 C1 sind die Partikel elektrisch leitfähig. Im
Fall einer Bindung ändern
die leitfähigen
Partikel den elektrischen Widerstand zwischen zwei Elektroden, was
durch das Anlegen einer äußeren Spannung
gemessen werden kann. Aus der Patent schrift
US 5,284,748 und der Veröffentlichung
von Park et al. („Array-based
Electrical Detection of DNA with Nanoparticle Probes", Science, 2002,
Vol. 295, S. 1503–1506)
ist ein ähnliches Verfahren
bekannt. Allerdings werden hier die Partikel nach ihrer Anbindung
zusätzlich
mit einer leitfähigen
Schicht überzogen,
wodurch eine Signalverstärkung
erreicht wird. Die leitfähige
Schicht kann in einem Elektrolyten durch eine elektrochemische Abscheidung
auf den metallischen Partikeln aufgebracht werden.
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Neben
der Änderung
des elektrischen Widerstandes (Leitfähigkeit) bzw. des Stromflusses beim
Anlegen einer äußeren Spannung
können
die Partikel auch andere elektromagnetische Eigenschaften aufweisen,
die als elektrische Signale ausgelesen werden können. In den Patentschriften
US 4,219,335 und
US 5,922,537 werden die
Kapazitätsänderung
und die magnetische Wirkung von Partikeln zum Nachweis von Bindungen
verwendet. In der Druckschrift
WO 97/45740 A1 wird die Änderung des magnetischen Widerstandes
eines Bauelementes in einem elektrischen Schaltkreis detektiert,
wobei die Sondenmoleküle
auf dem Bauelement immobilisiert sind. In der Veröffentlichung
von Cai et al. („Electrochemical
detection of DNA hybridization based an silver-enhanced gold nanoparticle
label", Analytica
Chimica Acta, 2002, Vol. 469, S. 165–172) binden die Analytmoleküle zusammen
mit Nanopartikel aus Gold an eine Elektrode. Auf den gebundenen
Nanopartikeln wird durch eine elektrochemische Reaktion Silber abgeschieden.
Die Elektrode wird danach mit Hilfe der zyklischen Voltammetrie
vermessen und eine entsprechende Modifikation nach Anbindung und
elektrochemischer Abscheidung nachgewiesen.
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Aus
der Druckschrift
DE
197 51 706 A1 ist des Weiteren bekannt, dass gebundene
Partikel in Kontakt mit einer Feld erzeugenden Elektrode gebracht
werden, um den Einfluss der Partikel auf das elektrische Nahfeld
der Elektrode zu verstärken.
Insbesondere werden dabei magnetische Partikel eingesetzt, die mit
Hilfe eines äußeren magnetischen Felds
zur Elektrode bewegt werden.
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Der
Verwendung von Chiparrays, die gleichzeitig die Anwesenheit oder
Abwesenheit von hunderten oder tausenden von verschiedenartigen
Analytsubstanzen durch Belegung mit verschiedenartigen Sondenmolekülen nachweisen
können,
wird eine große
Zukunft vorausgesagt. Die bisherigen Leseverfahren sind aber noch
zu kompliziert. Es besteht daher Bedarf für ein einfaches Verfahren der möglichst
direkten Auslesbarkeit von Bindungen der Analytmoleküle. Eine
einfache Auslesemöglichkeit für affine
Bindungen wäre
aber nicht nur für
Chiparrays mit vielen Feldern interessant, sondern auch für einzelne
Felder, die beispielsweise nacheinander mit verschiedenartigen Liganden
beschickt werden können.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, durch das
sich eine Bindung von Analytmolekülen an immobilisierten Sondenmolekülen auf
einem Chip in einfacher und preiswerter Weise und mit hoher Empfindlichkeit
direkt als elektrisches Signal auslesen lässt.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung besteht in einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs
1. Günstige
Ausführungsformen
sind durch die weiteren Ansprüche
gegeben.
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Es
ist der Kerngedanke der Erfindung, zusammen mit den Analytsubstanzen
in an sich bekannter Weise elektrisch leitfähige Nanopartikel an die oberflächengebundenen
Sondenmoleküle
anzubinden sowie durch die metallische Oberfläche der angebundenen Nanopartikel,
durch eine metallische Gegenelektrode und durch einen geeigneten
Elektrolyten ein galvanisches Element zu erzeugen, wobei durch Kontakt
der Nanopartikel mit der Schaltkreisoberfläche abseits der Gegenelektrode
ein Stromfluss in der Schaltkreisoberfläche zur Gegenelektrode hin erzeugt
wird, wodurch die Anbindung der Analytmoleküle elektrisch messbar wird.
Die elektronischen Schaltkreise sind bevorzugt in Halbleiteroberflächen eingearbeitet,
sie werden im Folgenden als „Schaltkreisoberflächen" bezeichnet.
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Die
Sondenmoleküle
können
sich auf der Schaltkreisroberfläche
selbst befinden, sie können sich
aber auch auf einer Oberfläche
eines beliebigen Körpers
befinden, der der Halbleiteroberfläche gegenübersteht. Diese Oberfläche werde
im Folgenden mit „Gegenfläche" bezeichnet. Die
beiden Oberflächen,
Schaltkreisoberfläche
und Gegenfläche,
sind dabei bevorzugt eben und planparallel zueinander ausgebildet.
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Die
Nanopartikel sollen elektrisch leitend sein, beispielsweise durch
einen metallischen Kern oder durch eine metallische Oberfläche. Die
Nanopartikel können
dann auf elektrische Weise (also nicht mechanisch, wie bei akustischen
Oberflächenwellen) auf
die elektrischen Schaltkreise der Schaltkreisoberfläche eine
Wirkung ausüben.
Durch diese Einwirkung können
die Bindungen von analytischen Molekülen an die Sondenmoleküle durch
eine Veränderung
im Verhalten der Schaltkreise auslesbar werden. Dabei können die
Nanopartikel einerseits bereits an die Analytsubstanzen gebunden
sein. – Andererseits
ist es aber vorteilhaft, in einem ersten Schritt erst die Analytmoleküle an die
Sondenmoleküle
zu binden, und dann in einem zweiten Schritt die Nanopartikel, die
ebenfalls mit Fängersubstanzen belegt
sind, über
eine zweite affine Bindung an die jetzt immobilisierten Analytsubstanzen
zu binden. Diese Fängermoleküle auf den
Nanopartikeln werden zur Wahrung der Eindeutigkeit im Folgenden
als „Haftmoleküle" bezeichnet. Dieses
Mehrschritt-Verfahren kann im zweiten Schritt durch weitere Zugabe von
Flüssigkeit,
die die mit Haftmolekülen
belegten Nanopartikel enthält,
oder auch durch Austausch der Flüssigkeiten
durchgeführt
werden. Für
die Messung kann es zweckmäßig sein,
in einem dritten Schritt die ungebundenen Nanopartikel durch Austausch
der Flüssigkeiten
wieder zu entfernen.
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Es
können
die Nanopartikel mit einem edlen Metall wie beispielsweise Silber
metallisiert sein; sie bilden mit zugeführter Elektrolytflüssigkeit,
die etwas lösliches
Silbersalz enthält,
und mit einer Gegenelektrode aus einem unedleren Metall wie beispielsweise Zink
auf einem Teil der Schaltkreisoberfläche ein galvanisches Element,
das ein Potential zwischen Nanopartikel und Gegenelektrode auf der
Schaltkreisoberfläche
aufbaut. Um einen Strom in der Schaltkreisoberfläche fließen zu lassen, ist es notwending,
die Nanopartikel mit der Schaltkreisoberfläche in elektrisch leitenden
Kontakt zu bringen.
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Ist
beispielseise der Kern des Nanopartikels magnetisierbar, so kann
das Nanopartikel durch eine magnetische Kraft kontaktierend an die
Schaltkreisoberfläche
(abseits der Gegenelektrode) gedrückt werden. Es fließt dann
ein Strom durch die Schaltkreisoberfläche zur Gegenelektrode, welcher
auf die Schaltkreise der Schaltkreisoberfläche einwirken kann, beispielsweise
auf die Steuergitter von Feldeffekt-Transistoren.
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Es
können
aber auch elektronenleitende Kettenmoleküle zwischen Schaltkreisoberfläche und Nanopartikel
angeordnet werden, beispielsweise durch Anbindung langer, einseitig
kovalent angebundener Polyacethylenketten (ein Polyen) zwischen den
Sondenmolekülen,
so dass das Spannungspotential der Nanopartikel direkt durch die
elektronenleitenden Moleküle
auf das Steuergitter eines Feldeffekt-Transistors einwirkt. Diese
Art der Einwirkung ist sehr empfindlich, bereits ein einziges gebundenes Nanopartikel
kann eine messbare Wirkung erzeugen.
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Befinden
sich die Sondenmoleküle
auf einer der Schaltkreisoberfläche
gegenüberliegenden
Körperoberfläche, der
Gegenfläche,
so kann auch die gesamte Gegenfläche
auf die Schaltkreisoberfläche gedrückt werden,
um die Kontakte der Schaltkreisoberfläche mit den Nanopartikeln herzustellen.
In diesem Fall sollte die Gegenfläche mit den Sondenfeldern bevorzugt
aus einem isolierenden Material bestehen, oder es sollten zumindest
die leitenden Unterlagen der Sondenfelder voneinander isoliert sein.
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Im
Falle des Nachweises von bestimmten DNA-Sequenzen in der Analytflüssigkeit
kann auch eine PCR-Reaktion vorgeschaltet werden. Diese kann auch
in einer Kammer stattfinden, deren eine Wand durch die Schaltkreisoberfläche gebildet
wird. Die andere Wand kann eine Wand aus Glas oder Halbleiter sein,
in die entsprechende Heizelemente für die Heizzyklen der PCR-Reaktion
integriert sind. Die PCR-Reaktion kann beispielsweise im ersten Schritt
von Mehrschritt-Verfahren integriert sein.
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Über einen
magnetisierbaren Kern werden die Nanopartikel („magnetic beads") durch äußere Magnetfelder
manipulierbar. Sie lassen sich beispielsweise von den Sondenfeldern
abziehen, wenn es sich um reine adhäsive Bindungen handelt, und nicht
um affine Bindungen der Haftmoleküle mit deutlich höheren Bindungsenergien.
Auch lässt
sich die Flüssigkeit
mit den Nanopartikeln mit magnetischen Wirbelfeldern umrühren, um
die extrem langsame Diffusionsbewegung der Nanopartikel, die zu
extrem langsamen Reaktionsgeschwindigkeiten der affinen Bindungen
zu den immobilisierten Analytmolekülen führt, durch wie auch immer geartete
Wirbelströme
in der Flüssigkeit
zu unterstützen.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
die indirekte Anbindung eines Nanopartikels 7 an eine Oberfläche 1.
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Links: Über eine
flexible Brücke 2 ist
eine DNA-Sonde 3 an die Oberfläche 1 kovalent angebunden.
Ein Analytmolekül 4 bindet
durch Hybridisierung an die DNA-Sonde 3. Das Nanopartikel 7 trägt über eine
flexible Brücke 6 das
Haftmolekül 5,
das benachbart zur Sonde 3 an das Analytmolekül 4 bindet.
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Rechts:
Hier ist das Nanopartikel 7, das mit Strepatividin 10 belegt
ist, an die Biotin-Gruppe 9 des Analytmoleküls 8 gebunden.
Das Analytmolekül 8 wird
in einem vorausgehenden Schritt während der PCR-Vervielfätigung durch
biotinylierte Primer mit der Biotin-Gruppe 9 versehen.
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2 zeigt
links die Anbindung von Nanopartikeln 14 über Analyt-
und Sondenmoleküle 15 an eine
Gegenfläche 16,
die sich gegenüber
einer Schaltkreisfläche 11 mit
einer Gegenelektrode 12 und einer Kontaktstelle 13 befindet.
Rechts ist die Kontaktierung durch Andrücken der Gegenfläche 16 an
die Schaltkreisfläche 11 gezeigt.
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Besonders günstige Ausführungsformen
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Die
Erfindung besteht darin, zusammen mit den Analytmolekülen auch
elektrisch leitfähige
Nanopartikel an die Sondenmoleküle
anzubinden, und die Nanopartikel durch Stromerzeugung elektrische
Wirkungen auf nahebei angeordnete elektrische Schaltkreise ausüben zu lassen.
Die Nanopartikel können Durchmesser
im Bereich von etwa 20 Nanometer bis etwa 10 Mikrometer haben; in
Einzelfällen
auch darüber
oder darunter. Als Grundlage für
die Schaltkreise werden üblicherweise
Siliziumwafer verwendet, in die die Schaltkreise mit üblichen
mikrofabrikatorischen Verfahren wie beispielsweise Ionenimplantation
und Ionenätzen,
aber auch durch maskengesteuerte Manipulationen, eingearbeitet sind.
Die Nanopartikel üben
stromerzeugend (nach Aufbau von elektrochemischen Spannungen und
Kontaktierung) elektrische Wirkung auf die elektronischen Schaltkreise
aus, wodurch die Bindungen von analytischen Molekülen über die
mitangebundenen Nanopartikel durch eine Veränderung im Steuerverhalten
der Schaltkreise messbar und daher einfach auslesbar werden.
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Es
soll hier noch einmal die hier verwendete Nomenklatur dargelegt
werden: Die Zielmoleküle, beispielsweise
Biopolymere, deren Bindung an oberflächengebundene Fängermoleküle gemessen
werden sollen, werden hier als „Analytmoleküle" bezeichnet. Die
oberflächengebundenen
Fängermoleküle heißen hier „Sondenmoleküle" – zur Unterscheidung von den
Fängermolekülen auf
den Nanopartikeln. Eine Fläche,
die mit gleichartigen Sondenmolekülen belegt ist, heißt ein „Sondenfeld". Die Sondenfelder
können
sich auf der „Schaltkreisoberfläche" oder aber auf einer
der Schaltkreisoberfläche
gegenüberstehenden „Gegenfläche" befinden. Die Fängermoleküle auf den
Nanopartikeln, die in Mehrschritt-Verfahren gebraucht werden, werden
hier zur Unterscheidung als „Haftmoleküle" bezeichnet, obwohl
es sich um Fängermoleküle mit gleichen
Funktionen wie die Sondenmoleküle
handeln kann.
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Unter „kovalenten
Bindungen" verstehen
wir hier wie üblich
die Hauptvalenzbindungen (80 bis 550 kJ/mol), während wir unter „affinen
Bindungen" die Nebenvalenzbindungen
(8 bis 20 kJ/mol, Assoziationen, Dipol-Dipol-Bindungen, van-der-Waals-Bindungen,
Wasserstoffbrückenbindungen
u. dergl.) verstehen. Es werden mit den hier geschilderten Verfahren in
der Regel die affinen Bindungen von Analytmolekülen zu kovalent angebundenen
Sondenmolekülen auf
Sondenfeldern gemessen. Die affinen Bindungen sind in der Regel
leicht zu reversieren, so dass eine mehrfache Benutzung der Sondenfelder
möglich wird.
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Es
werde hier zunächst
dargelegt, wie die Nanopartikel im physikalisch-chemischen Teil
des Verfahrens in an sich bereits bekannter Weise zusammen mit den
affin bindenden Analytmolekülen
an Oberflächen
in räumlicher
Nähe zur
Schaltkreisoberfläche
gebunden werden, danach wird beschrieben, wie die Nanopartikel auf
die Schaltkreise elektrisch einwirken können, um im elektronisch messenden Teil
des Verfahrens die Lesbarkeit der affinen Bindungen zu bewirken.
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Es
können
die Analytsubstanzen bereits an die Nanopartikel gebunden sein,
bevor sie mit den Sondenmolekülen
reagieren.
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Hier
ein Beispiel, das die Untersuchung des Bindungsverhaltens eines
als Target untersuchten Proteinmoleküls zum Ziel hat: Für Tests
mit Hunderten von einschlägigen
Ligandentypen aus Bibliotheken können
die Liganden bereits alle an Nanopartikel angebunden sein. Die Liganden
können
beispielsweise einem elektronischen Chip mit direkt kovalent angebundenen
Targetmolekülen,
die hier als Sondenmoleküle
fungieren, zeitlich nacheinander zugeführt werden. Es folgt dann jeweils
die Messung einer eventuellen Bindung der Liganden. Da die Bindung der
Liganden nicht kovalent, sondern nur reversibel affin ist, können die
Liganden danach wieder abgelöst
werden. Die Chipoberfläche
ist dann frei für
den Test des nächsten
Liganden. Dieser Test kann leicht automatisiert werden.
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Für Schaltkreisoberflächen (oder
gegenüberstehenden
Gegenflächen)
mit vielen Sondenfeldern, die mit unterschiedlichen Sondenmolekülen belegt
sind, erscheint es vorteilhaft, ein Mehrschritt-Verfahren anzuwenden.
In einem ersten Schritt werden die Analytsubstanzen an die Sondensubstanzen
gebunden, und in einem zweiten Schritt werden die Nanopartikel,
die mit Haftmolekülen
belegt sind, über eine
zweite affine Bindung an die jetzt immobilisierten Analytsubstanzen
gebunden. Dieses Mehrschritt-Verfahren kann nach dem ersten Schritt
durch weitere Zugabe von Flüssigkeit,
die die Nanopartikel enthält,
oder auch durch Austausch der Flüssigkeiten durchgeführt werden.
Für die
Messung ist es in der Regel zweckmäßig, in einem dritten Schritt
die ungebundenen Nanopartikel durch Austausch der Flüssigkeiten
und entsprechendes Waschen wieder zu entfernen. Es kann sich in
einem vierten Schritt auch ein partielles oder vollständiges Trocknen
anschließen.
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Hier
ein Beispiel für
ein Mehrschritt-Verfahren, das sich auf den Nachweis von DNA-Hybridisierungen
bezieht: Auf den Sondenfeldern können
als Sondenmoleküle
DNA-Stränge
kovalent gebunden sein (nicht nur hier, sondern auch in der Literatur
häufig
als „Sonden" bezeichnet), die
entsprechende Gegenstränge
analytischer DNA aus der Analytlösung binden.
Eine solche Sonde befindet sich für gewöhnlich auf einem flexiblen
Stiel aus einem Polymermolekül,
das einerseits an der festen Oberfläche, andererseits an der DNA-Sonde
kovalent gebunden ist. Dieser Aufbau erleichtert die Hybridisierung
des gegensträngigen
Analytmoleküls
aus der Analytflüssigkeit.
Zum Hybridisieren wird eine optimale Temperatur eingestellt, die
einerseits die Diffusion der Analytmoleküle erleichtert, und andererseits
gerade noch die Hybridisierung mit den richtigen Gegensträngen ermöglicht,
um Hybridisierungen mit solchen Gegensträngen, die in ihrer Sequenz
nicht vollkommen der Sequenz der Sonden entsprechen, also Fehlstellen enthalten,
zu vermeiden. Nach der Hybridisierung wird die Analytlösung mit
einer Lösung
ausgetauscht, die die Nanopartikel enthält. Auf diesen Nanopartikeln
sind, wiederum über
flexible Brückenpolymere, als
Haftmoleküle
kovalent DNA-Stränge
angebunden, die benachbart zu den DNA-Sonden auf den jetzt immobilisierten
DNA-Analytmolekülen
hybridisieren. Wegen der langsamen Diffusion der Nanopartikel muss
mit einer längeren
Zeit für
die Hybridisierung gerechnet werden, wobei durch vorsichtiges Umrühren eine
Beschleunigung des Vorgangs erzielt werden kann. Durch den Vorgang
der doppelten Hybridisierung werden die Nanopartikel indirekt an
die Chipoberfläche
gebunden. Dieses Verfahren ist im Prinzip bekannt.
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Das
Verfahren kann insbesondere für
eine Spezies-Erkennung für
Tiere, Pflanzen oder Mikroorganismen verwendet werden. Die gesuchte
Spezies wird dabei dadurch bestimmt, dass charakteristische Sequenzen
ihrer DNA (oder RNA) als Sondensequenzen auf der Sondenfeldern und
als Haftsubstanzsequenzen auf den Nanopartikeln verwendet werden.
Es können
so beispielsweise Infektions-Erreger erkannt werden. Es kann festgestellt
werden, ob das Fleisch in einer Wurst von Rind, Pferd, Esel, Giraffe
oder Känguru
stammt. Auch gentechnische Veränderungen
von Pflanzen oder Tieren können festgestellt
werden, wenn die Sequenzen der Veränderungen bekannt sind.
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Die
Isolierung und Aufbereitung der DNA für solche Analysen ist bekannt.
Um die Diffusion der sehr langen DNA-Stränge und die Dehybridisirung der
DNA-Doppelstränge
vor der Analyse zu erleichtern, kann die DNA durch entsprechende
Enzyme (Endonucleasen) in kürzere
Stränge
verdaut werden. Andererseits können
geeignete Abschnitte der DNA durch Polymerase Chain Reactions (PCR)
vermehrt werden, bevor sie der Analyse durch die Chips zugeführt werden.
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Bei
PCR-amplifizierter DNA können
die zur Vervielfachung verwendeten Primer auch einseitig mit Biotingruppen
abgeschlossen werden (bei der Herstellung der Primeroligos werden
die Primer meist über
eine Biotin-Bindung immobilisiert, so dass bei einer Bestellung
von biotinylierten Primern keine zusätzlichen Kosten anfallen).
Das Biotin geht mit den Primer endständig in die vervielfachten
Analytmoleküle
ein. Nach der Hybridisierung der Analytmoleküle an den Sondenmolekülen auf
dem Chip können
dann Nanopartikel zugegeben werden, die in bekannter Weise mit Streptadivin
in kovalenter Bindung zur Nanopartikeloberfläche belegt sind. Da Streptavidin
sofort mit den Biotingruppen bindet, werden so die Nanopartikel
indirekt an die Chipoberfläche
gebunden. Statt des bekannten Bindungspaares Biotin-Streptavidin
können
selbstredend auch beliebige andere Bindungspaare verwendet werden.
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Ein
anderes Beispiel für
ein Mehrschritt-Verfahren bezieht sich auf den Nachweis bestimmter Proteine
in der Analytflüssigkeit.
Dabei wird von Antikörpern
Gebrauch gemacht, die spezifisch bestimmte Proteine über so genannte „Bindungsmotive" auf der Oberfläche affin
binden. Auf den Sondenfeldern sind als Sondenmoleküle in diesem
Verfahren Antikörper
gebunden, die aus der Analytflüssigkeit
alle Proteine binden, die ein entsprechendes Bindungsmotiv besitzen.
Die dann im nächsten
Schritt zugegebenen Nanopartikel haben als Haftmoleküle ebenfalls
Antikörper
gebunden, die aber an ein gegenständiges, zweites Bindungsmotiv
der bereits gebundenen Proteine binden. Zweckmäßigerweise sind die Antikörper, die
als Haftmoleküle
auf den Nanopartikeln sitzen, weniger spezifisch und selektiv und
binden an einer großen
Anzahl von Proteinen, jedoch nicht auf den als Sondenmolekülen aufgebrachten Antikörpern. Auch
hier werden die Nanopartikel indirekt an die Oberfläche der
Sondenfelder gebunden.
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Auch
in diesem Fall der Proteine kann, wenn gewünscht, durch eine zweifach
selektive Bindung mit selektiven Sondenmolekülen und selektiven Haftmolekülen eine
außerordentlich
starke Selektivität und
damit ein sehr sicherer Nachweis des gesuchten Analytproteins erzeugt
werden.
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Die
Nanopartikel können
insbesondere auch einen magnetisierbaren Kern enthalten („magnetic beads"); sie werden dadurch
durch äußere Magnetfelder
manipulierbar. Die Nanopartikel lassen sich beispielsweise durch
stark inhomogene Magnetfelder von der Sondenfeldern abziehen, wenn
es sich um rein adhäsives
Haften handelt und nicht um affine Bindungen mit deutlich höheren Bindungsenergien. Damit
kann das Waschen der Sondenfelder und Wegspülen nichtgebundener Nanopartikel
unterstützt
werden. Auch lässt
sich die Flüssigkeit
mit den Nanopartikeln mit magnetischen Wirbelfeldern umrühren, um
die extrem langsame Diffusionsbewegung der Nanopartikel, die zu
extrem langsamen Reaktionsgeschwindigkeiten der affinen Bindungen
zu den immobilisierten Analytmolekülen führt, durch wie auch immer geartete
magnetische Wirbelströme
in der Flüssigkeit
zu unterstützen.
Die Nanopartikel können
auch an einer gegenüberliegenden
Wand gesammelt werden, wenn beispielsweise die Flüssigkeit
ausgetauscht werden soll, ohne die Nanopartikel zu verlieren.
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Es
kann mit den Nanopartikeln eine elektrochemische Zelle (ein galvanisches
Element) aufgebaut werden, deren Spannung nach Kontaktierung auf
die Schaltungen des Chips einwirkt. Dazu können die Nanopartikel beispielsweise
mit einem edlen Metall wie etwa Silber metallisiert sein. Mit einer
dazu passenden Gegenelektrode aus einem unedlen Metall wie beispielsweise
Zink auf einem Fleck der Schaltkreisoberfläche und einer Zugabe von etwas Silbernitrat
zur Flüssigkeit
bildet sich ein galvanisches Element mit einer Ruhespannung von
etwa 1,5 Volt, wobei die Nanopartikel den positiven Pol bilden und
die Verzinkung den negativen Pol. Zinkmoleküle gehen dabei als positiv
geladene Zinkionen vom Zinkflecken der Chipoberfläche in Lösung und
veranlassen positiv geladene Silberionen zur Ausscheidung auf der
Silberelektrode der Nanopartikel. Es fließt ein Strom positiver Ladungen
vom Zink zum Silber, bis der Aufbau der vollen Spannung erreicht
ist. Es ist dazu nur außerordentlich
wenig Silbernitrat erforderlich, da insgesamt praktisch kein Strom
fließt (nur
der so genannte Verschiebungsstrom).
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Das
Potential zwischen versilberten Nanopartikeln in der Elektrolyflüssigkeit
und verzinkter Gegenelektrode auf der Chipoberfläche kann nicht direkt über induzierte
Spiegelladungen auf die Schaltkreise an anderer Stelle der Chipoberfläche einwirken,
da die Nanopartikel vollkommen von Ionen anderer Polarität umgeben
sind und nach außen
in der Flüssigkeit
spannungslos erscheinen.
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Es
ist daher erforderlich, einen elektrisch leitenden Kontakt der Nanopartikel
zu ausgewählten Stellen
der Schaltkreise in der Halbleiteroberfläche herzustellen, von denen
aus dann ein geringer Strom zur Zinkelektrode fließen kann.
Diese besonderen Stellen der Schaltkreise werden hier als „Kontaktstellen" bezeichnet. Die
Kontaktstellen haben eine bessere Leitfähigkeit als ihre Umgebung,
sie sind über besonders
dotierte Bahnen, die auch von Steuerelektroden unterbrochen sein
können,
mit den Zinkflecken verbunden. Der hier fließende Strom, der gegebenfalls
wieder nur ein Verschiebungsstrom mit sehr geringer Ladungsverschiebung
ist, kann zur Steuerung der Schaltkreise benutzt werden, beispielsweise über den
bekannten Induktionseinfluss auf die Steuergitterelektroden von
Feldeffekt-Transistoren. Diese Art der Einwirkung ist sehr empfindlich,
bereits ein einziges gebundenes Nanopartikel kann eine messbare
Wirkung erzeugen.
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Die
kovalente Anbindung der Haftmoleküle auf den Silberoberflächen der
Nanopartikel über Thio-Verbindungen
ist bekannt und braucht hier nicht beschrieben zu werden.
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Die
Herstellung eines elektrisch leitenden Kontaktes kann in verschiedener
Weise hergestellt werden: Einmal über die Verwendung von elektronenleitenden
Kettenmolekülen,
die auf den Kontaktstellen der Chipoberfläche angebunden sind, zum anderen
durch einen direkten Berührungskontakt
des Nanopartikels mit der Kontaktstelle auf der Schaltkreisoberfläche, der
beispielseise durch magnetische oder mechanische Kräfte durch
gegendrückende Körper hergestellt
werden kann. Der elektrische Kontakt mit der Schaltkreisoberfläche kann
auch durch metallische Whisker oder andere elektrisch leitende Protrusionen
auf der Schaltkreisoberfläche
oder auf der Nanopartikeloberfläche
hergestellt werden. Elektrisch leitende Protrusionen können auch
in Verbindung mit magnetischen Feldern oder mechanischen Kräften zur
Kontaktierung dienen.
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Die
elektronenleitenden Moleküle
können
in den Sondenfeldern (die dann mit den Kontaktstellen identisch
sind) zwischen den Sondenmolekülen
angeordnet sein, sie können
sich aber auch allein auf den Kontaktstellen befinden, wobei dann
die Sondenfelder auf gegenüberliegenden
Körperoberflächern, den
Gegenflächen,
liegen. Als elektrisch leitende Moleküle kommen Kettenmoleküle aus der Gruppe
der Polgene in Betracht, die abwechselnd aus Einfach- und Doppelbindungen
bestehen und deren π-Elektronenwolken
sich jeweils so überlappen,
dass ein Elektronenstrom längs
der Molekülkette
fließen
kann. Sie können
beispielsweise aus Acetylen polymerisiert werden. Die Kettenmoleküle können, wenn
sie zwischen den Sondenmolekülen
an die Schaltkreisoberfläche
angebunden sind, in ihrer Länge
so gewählt
werden, dass sie bis zu den Nanopartikein reichen. Für einen
Abstand von etwa 50 Nanometern sind etwa 300 Kettenglieder erforderlich. Ihr
Aufbau erfolgt zweckmäßigerweise
durch gliedweise Synthese auf der Schaltkreisoberfläche selbst.
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Bei
guter Isolierung der vielen Schaltkreise eines Chiparrays gegeneinander
und guter Ausbildung der Schalkreise unter Einbeziehung der Zinkflecken
und Kontaktstellen ist selbst bei Ausbildung vieler galvanischer
Zellen auf dem Chiparray keine gegenseitige Beeinflussung der Schaltkreise
(Übersprechen)
zu gewärtigen,
da die Kontaktstellen und die Zinkflecken einander zugeordnet sind
und ein Spannungsaufbau an einem Schaltkreis nicht auf andere Schaltkreise
einwirkt, obwohl sich die ionenleitende Flüssigkeit über alle Schaltkreise gleichmäßig erstreckt.
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Sollte
es für
eine gut separierte Messung zweckmäßig sein, die einzelnen Felder
des Arrays auf der Schaltkreisoberfläche so voneinander zu trennen,
so ist ebenfalls möglich.
Es kann erreicht werden, dass der Elektrolyt für die Messphase keine über die
Felder hinweg durchgehende Flüssigkeitsschicht
mehr bildet. Das kann beispielsweise dadurch geschehen, dass die
einzelnen Arrayfelder voneinander durch schmale Gräben getrennt
sind, deren Wände
stark hydrophobisiert sind. Bei Bedeckung des Chips mit einer reichlichen
Menge wässriger
Flüssigkeit
bleiben diese Gräben
mit Luft gefüllt und
die Flüssigkeit
bildet ein durchgehendes Volumen. In dieser Vollflüssigkeitsphase
werden die Bindungen von Analytmolekülen, dann auch die Bindungen
der Nanopartkel vorgenommen. Bei Entfernung eines großen Teils
der Flüssigkeit
reißen
die Gräben auf;
es bleiben flache Flüssigkeitshügel auf
den durch die Sondenmolekülbelegungen
und die teilweise Verzinkung hydrophilen Arrayfeldern zurück. Befinden
sich in diesen Flüssigkeitshügeln versilberte Nanopartikel,
so bildet sich bei Zugabe von Silbersalzen ein galvanisches Element,
in Flüssigkeitshügeln ohne
Nanopartikel bildet sich dagegen kein solches elektrochemisches
Element.
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Sind
die Sondenmoleküle
auf einer der Schaltkreisoberfläche
gegenüberstehenden
Gegenfläche
angebracht, so können
sich auch räumlich voneinander
getrennte Flüssigkeitsfelder
bilden, die sich zwischen Schaltkreisoberfläche und Gegenfläche bilden.
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Die
Kontaktstellen, die mit den nach Bindungsreaktionen indirekt gebundenen
Nanopartikeln über
elektronenleitende Kettenmoleküle
oder über
direkten Kontakt in Verbindung stehen, können sich beispielsweise direkt über den
Steuergitterelektroden für
Feldeffekt-Transistoren befinden, während sich der verzinkte Teil
der Oberfläche
etwas seitab befindet. Es lädt
sich dann die Kontaktstelle nach Kontaktierung auf eine Spannung
von etwa 1,5 Volt auf. Das Feld dieser Spannung wirkt auf die hochempfindliche Steuergitterelektrode
ein und regelt den Stromfluss im Feldeffekt-Transistor. Die Polarität des galvanischen
Elementes bestimmt, ob der Transistor bei Anwesenheit der Nanopartikel
leitend wird oder sperrt. Möchte
man einen Effekt mit umgekehrter Polarität erzeugen, so können auch
die Nanopartikel mit einem unedlen Metall überzogen und die Schaltkreisoberfläche mit
einem edlen Metall bedeckt sein. Selbstredend können für die Bildung des galvanischen
Elements beliebige Paare von Metallen aus der elektrochemischen
Spannungsreihe verwendet werden, die Auswahl wird aber durch die
Chemie der Anbindung organischer Haftmoleküle an die Nanopartikel begrenzt.
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Wie
schon mehrfach betont, brauchen sich die Sondenmoleküle nicht
auf der Schaltkreisoberfläche
selbst zu befinden, sie können
sich auch auf der Gegenfläche
befinden. Die Kontaktierung der Nanopartikel zur Schaltkreisoberfläche kann
dann beispielsweise auch dadurch erfolgen, dass die gesamte Gegenfläche mit
den Nanopartikeln an die Schaltkreisoberfläche angedrückt wird. Die mit Sondenmolekülen belegte
Gegenfläche
ist zu diesem Zweck vorzugsweise aus isolierendem Material, wie
beispielsweise Glas oder Kunststoff, gefertigt. Es können die
auf dieser Gegenfläche
befestigten Nanopartikel oder die Analytmoleküle jedoch auch durch reversible
Reaktion von ihren Affinitätspartnern
gelöst werden
und dann durch magnetische Kräfte
durch die ruhende Flüssigkeit
zu den Kontaktstellen auf der Schaltkreisoberfläche gezogen werden. Die Aufhebung
der affinen Bindungen kann in bekannter Weise durch Temperaturerhöhung, durch Änderung
des pH-Wertes oder durch Verdrängungsreaktionen
bewirkt werden.
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Es
können
die Kontaktstellen auf der Schaltkreisoberfläche auch mit elektronenleitenden
Kettenmolekülen
belegt sein, die bis zu den Nanopartikeln auf den Sondenfeldern
der Gegenfläche
reichen.
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Im
Falle des Nachweises von vorbestimmt ausgewählten DNA-Sequenzen in der
Analytflüssigkeit
kann auch eine PCR-Reaktion für
die Analytsequenzen und ihre Umgebung vorgeschaltet werden. Diese
kann direkt in einer Kammer stattfinden, deren eine Wand durch die
Schaltkreisoberfläche
gebildet wird. Die andere Wand kann eine Wand aus Glas oder Halbleiter
sein, in die entsprechende Heizelemente für die Heizzyklen der PCR-Reaktion
integriert sind. Die PCR-Reaktion kann beispielsweise im ersten
Schritt von Mehrschritt-Verfahren
integriert sein.
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Dabei
ist es beispielsweise auch möglich,
in einer PCR-Reaktion die Sondensequenzen als Primer auf der Chipoberfläche und
die Haftsequenzen als Primer auf den Nanopartikeln durch die Hilfe
von passenden Analytmolekülen
jeweils so zu verlängern,
dass sie in komplementärer
Weise Strang und Gegenstrang bilden. Die Nanopartikel können dann magnetisch
festgehalten werden, um die überschüssige Analytflüssigkeit
mit Polymerase, Puffer und Nukleinsäuretriphosphatbausteinen zu
entfernen. Anschließend
wird die Hybridisierung der verlängerten Sondensequenzen
auf den Nanopartikeln mit den verlängerten Haftsequenzen auf der
Chipoberfläche vollzogen.
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Die
hier gegebenen Grundlagen der Erfindung erlauben es dem einschlägigen Fachmann,
das analytische Verfahren in vielfältiger Weise zu variieren und
zu verfeinern.