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Bei einer Vielzahl von Analysen des
Genoms, z.B. des menschlichen Genoms, spielen sogenannte Einzelpunktmutationen
(engl.: single nucleotide polymorphisms = SNPs) eine bedeutende
Rolle. So sind viele genetisch bedingte Erkrankungen wie z.B. hereditäre Haemochromatose
auf solche SNPs zurückzuführen. Im
einfachsten Fall lassen sich solche SNPs mittels PCR oder Sequenzieren
des entsprechenden Gens nachweisen. Liegen die Bereiche von Interesse
aber weiter auf dem Gen auseinander als nur ein paar hundert Basenpaare
so ist dies mittels Sequenzieren nicht mehr so einfach möglich oder
zumindest wesentlich teurer. Bei komlexeren Mutationen kann es zudem
dazu kommen dass Bereiche des Gens im DNA-Sequencer nicht mehr auswertbar
sind. Liegen auf einem Gen mehrere mögliche SNPs vor so wird die
Analyse mittels PCR sehr schwierig und auch wiederum sehr teuer.
So gab es schon lange Bestrebungen die Analyse von SNPs zu parallelisieren.
Ein solches Verfahren stellen z.B. die Oligonukleotid-Microarrays
dar. Auf diesen Microarrays sind diverse kurze DNA-Fragmente (Oligonukleotide)
gebunden, bei denen sich in der Mitte des Stranges die Base befindet,
die für
den gesuchten SNP komplementär
ist. Aufgrund der daraus resultierenden Unterschiede in den Schmelzpunkten
mit der DNA des Analyten kann man nun feststellen ob die 100 % komplementäre DNA gebunden
hat oder nicht. Die übliche
Erkennung liegt im Vergleich der Signalstärken zwischen den perfect matches
(100% komplementär)
und des SNP-mismatches (ca 5% Fehlbindung). Diese Analysen wurden
zumeist durch Hybridisieren der DNA an die Chips bei einer festen Temperatur
durchgeführt
und anschließend
wurde dann die Bindungsintensität
gemessen und verglichen. Wird eine Vielzahl von SNPs auf einem Chip gleichzeitig
analysiert, so ist es fast nicht möglich alle Sonden auf die gleiche
Analysetemperatur anzupassen, vor allem auch die Methoden zur Berechnung des
Schmelzpunktes für
DNA-Hybride nicht den gemessenen Werten entsprechen. Aus diesem
Grund braucht man bessere Methoden um große Mengen an SNPs sicher zu
messen. Solche Methoden lassen sich vor allem durch Bestimmung des
Schmelzpunktes der Hybride auf dem Chip generieren. Ideal sind dazu
Geräte
geeignet mit denen diese Analysen realtime durchgeführt werden
können
wie z.B. der ATR-Reader der von der Fraunhofer Gesellschaft {FHG-IPM)
entwickelt worden ist {siehe 1).
Allerdings zeigt sich die Methode der ATR-Readeranalyse als relativ
aufwendig, da hierbei die Schmelzkurven der Nukleinsäuren analysiert
werden um dabei die sogenannten Schmelzpunkte (Tm) der Nukleinsäurehybride
zu ermitteln. Dazu müssen
die Schmelzpunkte von DNA-Sonden berechnet werden und anschließend experimentell
nachbestimmt werden. Insbesondere wird durch diese Technik das Design
der Chips bei vielen Sonden pro Chip relativ schwierig.
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Die Erfindung beschreibt den überraschenden
Befund, dass zur Analyse von SNPs auf ATR-Chips kein Sondendesign im eigentlichen
Sinne notwendig ist, sondern es ausreicht, diese Sonden in einer
vorgewählten
Länge,
die sich vorzugsweise von Sonde zu Sonde nicht zu sehr unterscheidet
und dann die Schmelzpunktkurve jeweils aufzunehmen. Anschließend werden
die Kurven der Wildtypsonden und mit den Sonden der eventuell auftretenden
Mutanten verglichen. Dieser Vergleich wird durch die Substraktion
der Schmelzpunktkurve der Wildtyp-Sonde von der Schmelzpunktkurve
einer oder mehrerer Mutationen erreicht. Das Ergebnis wird als Graph
dargestellt (siehe
2).
Die Lage dieser Kurve gibt nun an welcher Genotyp vorliegt. Eine
sichere Zuordnung ist vor allem durch den Vergleich mit Referenzdaten
zu erreichen. Dies führt
insbesondere bei der Verwendung von Sequenzen, die zur Analyse auf
einem normalen DNA-Microarray nicht geeignet sind, zu entscheidenden Vorteilen
bei der Analyse. Die Nachweissicherheit für Punktmutationen wird signifikant
erhöht
und die Analyse ist sehr einfach zu automatisieren. Außerdem lassen
sich somit Chips viel schneller entwickeln, da keine Anpassung an
parallele Analysen, die bei einer festgelegten Hybridisierungstemperatur
arbeiten, stattfindet. Somit reicht es aus, die Sonden mit einer
fixen Länge
zu berechnen und auf dem ATR-Chip zu immobilisieren (bzw. zu synthetisieren).
Vorzugsweise befindet sich die zu untersuchende Base (Mutation)
in der Mitte der DNA-Sondensequenz.
Bei der Verwendung eines dermaßen
hergestellten Chips genügt
es nun die Proben-DNA, welche vorzugsweise mit einem Fluorophoren
markiert sein muss, an den Chip zu hybridisieren. Anschließend wird
der Chip in Stufen von 1°C von
beispielsweise 30°C
auf 80°C
erwärmt.
Nach jedem Temperaturschritt wird das Signal an jeder Sonde aufgezeichnet
und abgespeichert. Nach Erreichen des oberen gewählten Temperaturbereiches ist
folglich eine komplette Schmelzpunktkurve aufgenommen. Die Daten
der zu untersuchenden Variationen (Mutationen} werden werden dann
mit den Daten der sog. Wildtyp-Sequenz verglichen. Dazu werden die Daten
der Variationen von den Daten der Wildtyp-Sequenz substrahiert.
Ist die analysierte DNA homozygot für den Wildtyp so wird resultierende
Kurve im Bereich des Schmelzpunktes der DNA positive Werte aufweisen,
zumindest aber signifikant positivere Werke als im Falle einer heterozygoten
Probe. Ist die Probe heterozygot, so wird die resultierende Kurve
Idealerweise sich einer Geraden entlang des Nullpunktes annähern. Ist
die Probe für
die mutierte DNA homozygot, so ist der Schmelzpunkt an der Sonde
der mutierten DNA (dort liegt eine 100%ige Bindung vor} höher als
der Schmelzpunkt an der Sonde für
den Wildtyp (dort liegt keine 100%ige Bindung vor). Folglicherweise
ist die Kurve die durch Substraktion der Schmelzkurven errechnet
wird durch einen Ausschlag in Richtung der negativen y-Achse gekennzeichnet.
Die Lage dieser Kurven beschreibt explizit die Zusammensetzung der
Proben-DNA bezüglich der
zu untersuchenden Mutation. Diese Art der Untersuchung findet bevorzugt
in einem Apparat statt, wie er z.B. in der
EP0001248948 beschrieben wird. Die
Sensoren sind bevorzugt Wellenleiterchips bei denen es sich um objektträgerförmige Chips
handeln kann, in die über
eine Kante das Anregungslicht für eine
TIRF-Anregung eingekoppelt wird. Es kann sich dabei aber auch um
Chips handeln, die in Form von Dünnfilmwellenleitern
geschaffen sind. Solche Dünnfilmwellenleiterchips
sind z.B. Tantalpentoxid beschichtete Glasobjektträger in die
das Licht über
optische Gitter eingekoppelt wird. DNA-Sondenmoleküle werden
auf solchen Chips vorzugsweise über
chemische Haftvermittler wie z.B. Silane oder Polymerbeschichtungen
gebunden. Solche Verbindungen sind beispielsweise in der
EP 1132739 B1 beschrieben.
Verfahren zur Beschichtung von Trägern mit Polymerschichten sind
beispielsweise in der
EP 1176422 beschrieben.
Zur Bindung an solche Oberflächen
geeignten DNA-Sonden werden vorzugsweise mit einem Polythymidin-Spacer
der aus mindestens 10 Thymidinmolekülen besteht, versehen. Die Sondenmoleküle werden
bevorzugt kovalent gekoppelt. Dazu geeignete Methoden werden in
der
EP 1144677 beschrieben.
Die Herstellung von geeigneten Proben und die Markierung ist beispielsweise
in der WO 01/53822 und bei Lehr (Lehr 2002) beschrieben.
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In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung wird
die Oberfläche
des Trägers
mit einem UV-reaktiven Polymer beschichtet. Dieses Polymer wird
dann durch Bestrahlung des beschichteten Trägers mit UV-Licht auf der Oberfläche kovalent
gekoppelt. Auf Polymerträgern
können
solche Polymerdünnschichten
durch "Dipcoating" in einer verdünnten Lösung (analog
EP 1176422 ) aufgebracht
werden. DNA-Moleküle
können
auf diesen Oberflächen mittels
Polythymidinspacern und UV-Grosslinken aufgebracht werden. Besonders
bevorzugt sind dabei Copolymere mit einer beschränkten Hydrophilie, negativ
geladenen Gruppen und Benzophenongruppen zum Verbinden der Poymerschicht
mit der Oberfläche.
Beispielsweise ist ein Poylmer aus Metacrylsäure, Styrol und Benzophenonmethacrylat
mit diesen Eigenschaften versehen. Selbstverständlich sind auch andere Copolymere
und im besonderen Blockcopolymere geeignet. Sollen diese Polymerschichten auf
Glas oder andere anorganische Substrate aufgebracht werden, so ist
es sinnvoll diese Substrate vorher zu silanisieren um die Haftung
der Polymerlagen zu verbessern. Eine solche Silanisierung ist z.B.
in der
EP 1132739 und
in der
EP 1176422 beschrieben.
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Geeignete Träger zur Analyse können auch integrierte
Systeme (
DE 10245435.3 wie
z.B. CMOS-Chips mit zusätzlich
aufgebrachten Wellenleiterstrukturen) sein. Diese Wellenleiter befinden
sich bevorzugt mit über
den Optosensoren mittel einer dünnen
Schicht mit einem Substrat von geringerer optischer Dichte als der
Wellenleiter, mit dem Optochip verbunden.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind die Biomoleküle
auf Polymer-Polymer Dünnfilmwellenleitern
aufgebracht. Solche Wellenleiter bestehen aus einem Trägerpolymer
mit einer geringen optischen Dichte und einem Wellenleiterpolymer
mit einer hohen optischen Dichte. So z.B. einem Polymer wie es zur
Herstellung von Kunststoffbrillengläsern benutzt wird. Geeignete
Polymere von entsprechend geringer optischer Dichte sind dem Fachmann
hinreichend bekannt.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird der Chip nach einer Messung mit Puffer gespült und erhitzt, so dass die
gebundenen Nukleinsäuren
weitgehend entfernt werden. Danach kann der Chip erneut verwendet
werden. Neben Erhitzen kann der Chip auch durch denaturierende Agenzien wie
z.B. 0,1% NaOH regeneriert werden. Dieses Verfahren ermöglicht es
auch den Chip Referenznukleinsäuren
zu hybridisieren um so jeden Chip vor, während oder nach der Messung
zu kalibrieren. Auf diese Weise ist es möglich die Messwerte von verschieden Experimenten
miteinander zu vergleichen und individuelle Unterschiede, die z.B.
in der Herstellung der Chips begründet liegen können herauszurechnen. Weiterhin
ermöglicht
dieses Verfahren die Qualitätskontrolle
der Chips während
des Einsatzes und erlaubt die Feststellung ob ein Chip noch für weitere Experiment
geeignet ist oder nicht.
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Sollten für solche Experimente Chips
verwendet werden, bei denen die initiale Hybridisisierung nicht
vollständig
aufgelöst
werden kann, so können
solche Chips durch Blockieren mit einer unmarkierten Probe, die
an alle Nukleinsäuresonden
bindet, abgesättigt
werden, so dass nach dem eigentlichen Experiment und der Ablösung der
hybridisierten Proben kein Restfluoreszenzsignal zurückbleibt.
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Beispiele
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Detektion der Mutation
H63D des Haemochromatosegens
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Mutation H63D: Der Rasenaustausch
eines Cytosin gegen ein Guanin (C→G; Transversion) an Position
187 im Exon 2 des HFE-Gens führt
zu einem Aminosäureaustausch
eines Histidin zu Asparaginsäure
an Position 63 des HFE-Proteins. Diese Mutation wird in der Literatur
als H63D bezeichnet {Feder et al 1996)
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Bei der Mutation H63D handelt es
sich mit dem Austausch eines Cytosins gegen ein Guanin um eine Transversion.
Dabei wird eine Pyrimidin- gegen eine Purinbase ausgetauscht und
es kommt zu einer sterischen Hinderung an der Stelle der Basenfehlpaarung.
Da sich bei den bei Transversionen vorliegenden Basenfehlpaarungen
auch keine Bindung ausbilden kann, sind diese leichter detektierbar.
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Die Sonden zur Detektion der Mutation
H63D tragen an zentraler Stelle der spezifischen Sequenz ein C (wt-Sonde)
bzw. ein G (mut-Sonde). Die Proben-DNA trägt an der entsprechenden Stelle
ein G (wt-Probe; H63D (+/+)), ein C (mut-Probe; H63D (–/–)) bzw.
zu 50% ein G und 50% ein C (het-Probe; H63D (+/–))
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Daraus ergeben sich bei der Detektion
folgende Basenpaarungen bzw. Fehlpaarungen an zentraler Stelle der
Sondenpaare:
- Bei Hybridisierung mit einer wt-Probe:
wtSonde-wtProbe:
C≡G
mutSonde-wtProbe:
G G
- Bei Hybridisierung mit einer mut-Probe:
wtSonde-mutProbe:
C C
mutSonde-mutProbe: G≡C
- Bei Hybridisierung mit einer het-Probe: (etwa gleiche Signalintensität an wt-
und mut-Sonde)
wtSonde-wtProbe (und wtSonde-mutProbe): C≡G (und
C C)
mutSonde-mutProbe (und mutSonde-wtProbe): G≡C (und
G G)
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1) Herstellen der Sensorchips
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Auf PMMA Träger der Dimension 76 × 25 × 1 mm mit
einer seitlichen Kante von 70° zum
Einkopplen des Anregungslichtes werden mit einem Top-Spot Drucker
(oder einem anderen geeigneten Gerät (Lehr 2002) Oligonukleotide
aufgedruckt. Als Druckpuffer wird eine 5%ige DMSO Lösung in
Wasser verwendet. Die Oligonukleotide liegen dabei in einer Konzentration
von 10 μM
vor. Die Oligonukleotide bestehen aus einer Erkennungssequenz der
Ziel-DNA von 17 Nukleotiden Länge
und der gesuchten Mutation in der Mitte der Sequenz. An dem 5"-Ende des Oligonukleotides befindet sich
ein Polythymidinstrang vonmindestens 10 Nukleotiden Länge. Zum Immobilisieren
der Oligonukleotide werden die frisch bedruckten Chips für 10 Minuten
in einem UV-Crosslink-Ofen (Stratalinker, Stratagene) für 10 Minuten mit
UV-Licht einer Wellenlänge
von 260 nm bestrahlt. Anschließend
mit Wasser dem ein Detergenz zugesetzt ist (0,1% SDS) gründlicg gespült, mit
detilliertem Wasser nachgespült
und im Stickstoffstrom trockengeblasen.
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2) Schmelzkurven für die Mutation
H63D
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Zur Messung der Schmelzkurven zur
Detektion der Mutation H63D wurden Chips mit einem 17mer Sondenpaar
(63_17wt und 63_17mut) hergestellt. Die Chips wurden im TIRF-Meßgerät mit DNA-Proben
der verschiedenen Ausprägungen
(a) wt-Probe, b) mut-Probe, c) het-Probe) hybridisiert, gefärbt und
das Dissoziationsverhalten von dem Sondenpaar gemessen. Die Fluoreszenzintensitäten an der
wt- und mut-Sonde wurden dazu über
ein Temperaturspektrum von 20°C–80°C in 2°C-Schritten
beobachtet und in den folgenden Diagrammen dargestellt.
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3) DNA-Aufreinigung aus
Blut
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Die DNA-Aufreinigung wurde aus 10ml
humanem Blut mittels des "nucleon
extraction and purification kit" der
Firma Amersham Biotech durchgeführt.
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4) Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration
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Zur genauen Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen
wurde die Absorption von UV-Strahlung
der Wellenlänge
260 und 280nm durch eine Nukleinsäurelösung, gegen das jeweilige Lösungsmittel,
in einem Spektralphotometer gemessen. Eine Aa260-Einheit
entspricht dabei einer Doppelstrang-DNA-Konzentration von 50μg/ml, und
einer Einzelstrang-DNA- Konzentration
von 33μg/ml.
Das Verhältnis
der Absorptionen bei 260 und 280nm ist ein Indikator für die Reinheit
der DNA. Er nimmt bei optimaler Reinheit einen Wert von 1,8 an.
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5) Amplifizieren und Markieren
der DNA
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Polymerasekettenreaktion Polymerase Chain
Reaction PCR) (Multis et al.,1986) Mit Hilfe der PCR ist es möglich, aus
einer geringen Menge an DNA einen gezielten Abschnitt zwischen zwei
bekannten Sequenzen zu vervielfältigen.
Hierzu sind zwei Oligonukleotidprimer nötig, die gegenläufig an die
komplementären
Stränge
einer bekannten DNA-Sequenz binden. Des weiteren müssen neben der
zu amplifizierenden Sequenz die Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und
dTTP zugegeben werden sowie die Taq-Polymerase, die in der Lage
ist, den DNA-Strang von den Primern aus zu verlängern.
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Grundlegende Schritte der PCR sind:
- Denaturierungsphase: hier wird die doppelsträngige DNA
bei 94–95°C zu Einzelsträngen aufgeschmolzen.
- Annealingphase: Die Primer lagern sich bei einer Temperatur,
die nahe der Schmelztemperatur Tm der Primer liegt an die einzelsträngige DNA
an.
- Extensionsphase: Bei 72°C
erfolgt die Verlängerung
der Primer und dadurch die Synthese eines DNA-Doppelstrangs mit
Hilfe der Taq-Polymerase und den zugesetzten Nukleotiden. Durch
Wiederholung dieser 3 Schritte bis zu 50 mal ist es möglich eine
sehr hohe Kopienzahl des gewünschten Sequenzabschnittes
zu erhalten.
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6) Markierung der PCR
mittels Biotin
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In die PCR können neben den natürlich vorkommenden
Nukleotiden auch modifizierte Nukleotide eingebaut werden. Den Nukleotiden
können
z.B. Fluoreszenzfarbstoffe oder Biotin angehängt sein, wobei sich biotinylierte
Nukleotide sehr viel einfacher und effizienter einbauen lassen als
z.B. Cy5-markierte Nukleotide. Um das PCR-Produkt auf dem Chip mit
Streptavidin-Cy5 nachweisen zu können,
wurde Biotin-l6-dUTP in die DNA eingebaut. Dabei wurde das Biotin-dUTP
anstelle von dTTP eingebaut.
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7) PCR-Ansatz für die biotinylierte
Multiplex-PCR zur Detektion von Hämochromatose
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Ansatzt in einem Volumen von 25μl. Zur Amplifikation
wurde ein Standardprogramm für
kurze DNA-Amplikons verwendet
| Template
DNA | 100nM |
| Primer1Fw | 0,5μM |
| Primer1Rev | 0,5μM |
| Primer2Fw | 0,5μM |
| Primer2Rev | 0,5μM |
| dNTP's (ohne dTTP) | 0,1mM |
| dTTP | 0,08mM |
| BiotindUTP | 0,06mM |
| MgCh2 | 2,5mM |
| 10 × Puffer | 1:10
Verd. |
| HotStarTaq | 0,25U |
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7) Herstellen von DNA-Einzelsträngen
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Zur Herstellung von DNA-Einzelsträgen wurden
PCR-Produkte verwendet, die mit einem thioatmodifizierten Primen
und einem nicht-modifizierten Primer hergestellt wurden. Diese PCR-Produkte
wurden in einem Volumen von 25μl
mit 1 μl
T7 Gen 6 Exonuklease der Firma Amersham versetzt und 30min bei 37°C inkubiert.
Zum Beenden der Reaktion wurde der Ansatz für 10min bei 85°C erhitzt.
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8) Hybridisierung
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Die Hybridisierung erfolgte durch
die Zugabe der amplifizierten Probe in Hybridisierungspuffer auf das
Meßfeld
des Sensorchips. Die Hybridisierungslösung wurde im TIRF-Meßgerät direkt
in eine Hybridisierungsküvette
gegeben. Anschließend
wurden die Träger
in der Hybridisierungsküvette
des TIRF-Geräts
für einige
Sekunden mit handelsüblichen
Waschpuffer gespült.
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9) Färbung
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Das Anfärben der gebundenen biotinylierten PCR-Fragmente
erfolgte durch Inkubation mit einem Streptavidin-Cy5-Konjugat. Die
Stammlösung
wurde nach Herstellerangaben in Färbepuffer aufgenommen. Diese
wurde direkt in die Hybridisierungsküvette des TIRF-Meßgeräts gegeben.
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10) Fluoreszenzmessung
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Der Träger wurden im Analysator mit
Laserlicht bestrahlt. Der verwendete Fluoreszenzfarbstoff Cy5 (siehe
Abb.) absorbiert laut Herstellerangaben (Amersham Biotech) bei %max
= 649nm und emittiert bei λmax = 670nm. Das emittierte Licht wurde mit einer
CCD-Kamera aufgenommen
und das entstandene Bild mit den einzelnen Fluoreszenzpunkten ausgewertet.
Die Umwandlung von graphischen Daten der Fluoreszenzintensitäten in Zahlenwerte
wurde mit einem kommerziell verfügbaren
Computerprogramm durchgeführt.
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11) Analyse von Schmelzkurven
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Zur Analyse von Schmelzkurven wurden
alle Schritte in der Hybridisierungsküvette im Analysegerät durchgeführt. Die
Hybridisierung der amplifizierten, biotinylierten, einzelsträgigen DNA-Probe
erfolgte bei 20°C
für 15min–2h an die
Sonden des Sensorchips. Unter diesen wenig stringenten Bedingungen wird
die Probe mit hoher Hybridisierungseffizienz an den Chip gebunden.
In der darauffolgenden Färbereaktion
wurden die an die Sonden gebundenen biotinylierten Proben-DNA-Fragmente
mit einer Streptavidin-Cy5-Lösung
für 5min
angefärbt.
Darauf erfolgte unter gradueller Temperaturerhöhung durch die Aufnahme vieler
Einzelbilder.
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Beschreibung
der Abbildungen
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1 beschreibt
die TIRF-Messoptik. Laserlicht aus einer Halbleiterlaserdiode (1)
wird durch eine Linse (2) fokussiert (3) und auf
die Einkoppelkante eines TIRF-Messchips (4) gestrahlt.
Auf der Oberfläche
dieses Chips befinden sich Biomoleküle (5, 6),
die mit einem Lumineszenzfarbstoff markiert sind. Innerhalb des
evaneszenten Feldes werden die Lumineszenzfarbstoffe angeregt und
geben Lumineszenzlicht ab (5, 7), das mittels
geeigneter Detektoren aufgefangen werden kann. Lumineszenzfarbstoffe,
die ausserhalb des evaneszenten Feldes sind, werden Lumineszenzfarbstoffe
nicht angeregt (6) und geben dementsprechend kein Licht
ab. Das Fluoreszenzlicht (7) kann mittels handelsüblicher
CCD- oder CMOS-
Kameras aufgezeichnet werden.
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2:
Die Abbildung zeigt die erfindungsgemäße Analyse von drei Experimenten
im Vergleich zueinander. Bei der oberen Kurve wurde als Analyt eine
DNA verwendet, die nur Wildtyp-Allele enthält. Durch Vergleich der Schmelzpunktkurven
die an den Sonden für
die Wildtyp-DNA und die zu untersuchende mutierte DNA aufgenommen
wurden erhält
man eine Differenzenkurve. Um diese zu erhalten wird zuerst die
aufgenommene Schmelzpunktkurve errechnet. Dazu wird der hybridiserte
Chip von 20°C
auf 80°C
in Schritten von 2°C
erhitzt. Bei Erreichen der Temperatur wird der Chip mit der Kamera
aufgenommen und das Bild der Fluoreszenz abgespeichert. Anschließend wird
das Signal der Fluoreszenzbilder verschiedener Temperaturstufen
ausgewertet. Dazu wird die Signalintensität an den Punkten, an denen die
Sonden immobilisiert sind, quantifiziert. Gleichzeitig werden Referenzpunkte
auf dem Chip ausgewertet, an denen fluoreszenzmarkierte DNA immobiliert
ist. Dieses Signal nimmt beim Erhitzen des Chips ab (da das Fluoreszenzsignal
durch Wärme
reduziert wird).
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Diese Abnahme wird prozentual bestimmt und
die aufgenommenen Signalkurven werden um diese Abnahme korrigiert.
Nach erfolgter Korrektur wird nun das Signal der Sonde der gesuchten
Mutation von der Sonde der Wildtyp-DNA subtrahiert. Das Ergebnis
wird als Graph aufgetragen. Die mittlere Kurve stellt den Fall dar,
wenn im Analyt sowohl Wildtyp-DNA als auch mutierte DNA vorhanden
ist. Die Kurve bildet dann im Idealfall eine Gerade entlang des
Nullpunktes. Die untere Kurve stellt nun den Fall dar, wenn im Analyt
nur mutierte DNA vorhanden ist. Die Differenz der Bindungskurve
von Wildtyp-DNA zur Bindungskurve der mutierten DNA ist negantiv, da
die mutierte DNA mit wesentlich geringerer Bindungsenergie an die
Wildtyp-Sonde bindet, als diese an die Sonde der mutierten DNA-Sequenz
bindet.