DE10309169B4

DE10309169B4 - Recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidases, process for their preparation and their use

Info

Publication number: DE10309169B4
Application number: DE10309169A
Authority: DE
Inventors: Götz Dr. Hofhaus; Thomas Prof. Dr. Lisowsky
Original assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Current assignee: DUESSELDORF H HEINE, University of; Heinrich Heine Universitaet Duesseldof
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2010-04-08
Anticipated expiration: 2023-03-01
Also published as: DE10309169A1; WO2004076669A3; WO2004076669A2

Abstract

Rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidase, in der mindestens ein Cysteinrest der Aminosäuresequenz derart mutiert wurde, dass das Absorptionsmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist, wobei die Sulfhydryloxidase Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae ist und der Cysteinrest an Position 30 durch einen Serinrest ersetzt wurde.Recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidase in which at least one cysteine residue of the amino acid sequence has been mutated such that the absorption maximum is changed compared to the wild-type protein, wherein the sulfhydryl oxidase Erv1p is from Saccharomyces cerevisiae and the cysteine residue at position 30 has been replaced by a serine residue.

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen, in denen mindestens ein Cysteinrest derart mutiert wurde, dass dies zu einer Veränderung des Absorptionssmaximums im Vergleich zum Wildtypprotein führt, wobei die Sulfhydryloxidase Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae ist und der Cysteinrest an Position 30 durch einen Serinrest ersetzt wurde, die korrespondierenden Nukleinsäuremoleküle sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Proteine als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen und deren Übertragung auf Substrate sowie als regulierbare Indikatoren für Redoxreaktionen.The The invention relates to recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidases, in which at least one cysteine residue has been mutated in such a way that this to a change of the absorption maximum compared to the wild-type protein, where the sulfhydryl oxidase Erv1p from Saccharomyces cerevisiae is and the cysteine residue at position 30 has been replaced by a serine residue, the corresponding nucleic acid molecules as well a process for their preparation. Furthermore, the invention relates the use of these proteins as biocatalysts for the synthesis of disulfide bonds and their transmission on substrates and as regulatable indicators of redox reactions.

Sulfhydryloxidasen sind Enzyme, welche die Einführung von Disulfidbrückenbindungen in Proteinsubstrate katalysieren (Übersicht in [1]; [2–3]). Dabei werden Thio-Verbindungen (R-SH) nach der folgenden Gleichung in die korrespondierenden Disulfid-Verbindungen umgesetzt werden: 2 R-SH + O₂ → R-S-S-R + H₂O₂. Sulfhydryl oxidases are enzymes that catalyze the introduction of disulfide bonds into protein substrates (reviewed in [1]; [2-3]). Thio compounds (R-SH) are converted into the corresponding disulfide compounds according to the following equation: 2 R-SH + O ₂ → RSSR + H ₂ O ₂ .

Prinzipiell unterscheidet man zwischen Metalloproteinen (eisen- oder kupferhaltig) und FAD(Flavinadenindinukleotid)abhängigen Sulfhydryloxidasen, wobei die Erfindung letztere Gruppe betrifft.in principle a distinction is made between metalloproteins (containing iron or copper) and FAD (flavin adenine dinucleotide) dependent sulfhydryl oxidases, the invention relates to the latter group.

FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen zeichnen sich gegenüber anderen Enzymen, die Dithiol/Disulfid-Transferreaktionen katalysieren, dadurch aus, dass sie Disulfidbindungen de novo synthetisieren können. Neben FAD als nicht-kovalent gebundenem Cofaktor ist den Vertretern dieser Gruppe gemein, dass sie (1) als Homodimere vorliegen, (2) Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor verwenden und (3) in ihrer Sequenz ein konserviertes CXXC-Motiv besitzen (C = Cystein, X = beliebige Aminosäure), das an der primären Redoxreaktion beteiligt ist (Übersicht in [1]; [4]). Die beiden bislang am besten untersuchten Vertreter dieser Klasse sind die Quiescin-Sulfhydryloxidasen aus Huhn und Mensch (Übersicht in [1]).FAD-dependent sulfhydryl oxidases stand opposite each other other enzymes that catalyze dithiol / disulfide transfer reactions, by being able to synthesize disulfide bonds de novo. Next FAD as a non-covalently bound cofactor is the representative of these Group in common that they (1) are present as homodimers, (2) oxygen use as a terminal electron acceptor and (3) in their sequence have conserved CXXC motif (C = cysteine, X = any amino acid), the at the primary Redox reaction is involved (overview in [1]; [4]). The two best-studied representatives so far this class are the quiescin sulfhydryl oxidases from chicken and Human (Overview in [1]).

Eine eigene Untergruppe innerhalb der FAD-abhängigen Sulfhydryloxidasen stellt die Familie der Erv/Alr-Sulfhydryloxidasen dar, die nach Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae sowie dessen humanem Homolog Alrp benannt ist (Übersicht in [1]). Diese beiden Enzyme sind auch die ersten dieser Gruppe, deren DNA- und Proteinsequenzen bekannt sind [5, 6]. Ihre Aktivität ist essentiell für das Überleben der Zellen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Biogenese von Mitochondrien, insbesondere hinsichtlich einer intakten Membranmorphologie, sowie in der Versorgung cytoplasmatischer Proteine mit Eisen/Schwefel-Clustern, die in den Mitochondrien gebildet werden (Übersicht in [1]; [7]). Im endoplasmatischen Reticulum von Saccharomyces cerevisiae wurde vor kurzem eine zweite Sulfhydryloxidase gefunden, die als Erv2p bezeichnet wurde [8, 9].A own subgroup within the FAD-dependent sulfhydryl oxidases the family of Erv / Alr sulfhydryl oxidases According to Erv1p from Saccharomyces cerevisiae and its human Homolog Alrp is named (overview in [1]). These two enzymes are also the first of this group, whose DNA and protein sequences are known [5, 6]. Their activity is essential for survival the cells. They play an important role in the biogenesis of Mitochondria, especially with respect to an intact membrane morphology, as well as in the supply of cytoplasmic proteins with iron / sulfur clusters, which are formed in the mitochondria (overview in [1]; [7]). In the endoplasmic Reticulum of Saccharomyces cerevisiae has recently become a second Sulfhydryl oxidase, which has been termed Erv2p [8, 9].

Die C-terminalen Domänen von Erv1p und Erv2p, die das redoxaktive Zentrum und die FAD-Bindedomäne enthalten, sind einander sehr ähnlich (30% Identität). Sie sind insbesondere durch ein konserviertes YPCXXC-Motiv (Y = Tyrosin, P = Prolin, C = Cystein, X = beliebige Aminosäure) gekennzeichnet, das für die enzymatische Aktivität sowie die Interaktion mit FAD essentiell ist. Bei Erv1p entspricht dieses Motiv den Aminosäureresten 128–133.The C-terminal domains Erv1p and Erv2p, which contain the redox-active center and the FAD binding domain, are very similar to each other (30% identity). They are characterized in particular by a conserved YPCXXC motif (Y = Tyrosine, P = proline, C = cysteine, X = any amino acid), that for the enzymatic activity as well as the interaction with FAD is essential. At Erv1p corresponds this motif the amino acid residues 128-133.

Ein weiteres Charakteristikum dieser Enzyme ist ihre wenig konservierte N-terminale Domäne, die für die subzelluläre Lokalisation der Proteine, die Homodimerbildung sowie möglicherweise auch für die Substratinteraktion wichtig sind [10]. Erv1p weist in dieser Region ein zweites CXXC-Motiv auf (Aminosäuren 30–33), das Erv2p fehlt. Letzteres enthält allerdings an seinem C-Terminus ein möglicherweise funktionell homologes CGC-Motiv (G = Glycin). Die genauen strukturellen bzw. funktionellen Aufgaben, welche die einzelnen Cysteinreste in Erv1p bzw. Erv2p innehaben, sind bislang noch nicht völlig verstanden, werden aber derzeit intensiv untersucht.One Another characteristic of these enzymes is their little conserved N-terminal domain, the for the subcellular Localization of proteins, homodimer formation and possibly also for substrate interactions are important [10]. Erv1p points in this Region a second CXXC motif (amino acids 30-33), the Erv2p is missing. The latter contains however, at its C-terminus, a possibly functionally homologous CGC motif (G = glycine). The exact structural or functional tasks, which contain the individual cysteine residues in Erv1p or Erv2p, are not yet complete understood, but are currently being studied intensively.

In vielen Anwendungsbereichen, z. B. bei der Teigherstellung für Backwaren oder der Entfernung von Fremdaromen aus Milch oder Bier, ist die Oxidation freier Sulfhydrylgruppen zu Disulfiden erwünscht. Da enzymkatalysierte Reaktionen im Vergleich zum Einsatz unspezifischer Oxidationsmittel (etwa Wasserstoffperoxid, Perazide oder Bromide) keine unerwünschten Nebenprodukte bilden und die Reaktion auch wesentlich schneller abläuft, wurde die Verwendung von Sulfhydryloxidasen für zahlreiche Applikationen beschrieben.In many applications, eg. B. in the dough for baked goods or the removal of foreign flavors from milk or beer, is the Oxidation of free sulfhydryl groups to disulfides is desired. There enzyme-catalyzed reactions compared to the use of nonspecific Oxidizing agents (such as hydrogen peroxide, perazides or bromides) no unwanted By-products form and the reaction also much faster expires has been the use of sulfhydryl oxidases for numerous applications described.

Die Europäische Patentanmeldung EP 0 705 538 A1 offenbart eine Enzymzusammensetzung aus einer Sulfhydryloxidase und einer Hemicellulase zur Verbesserung der Teigeigenschaften von Brot und anderen Backwaren. Das US Patent 5,547,690 beschreibt eine weitere Enzymzusammensetzung, bestehend aus einer Sulfhydryloxidase und einer Glucoseoxidase, welche die rheologischen Eigenschaften, insbesondere die Stabilität, von Teigzubereitungen verbessert.The European patent application EP 0 705 538 A1 discloses an enzyme composition of a sulfhydryl oxidase and a hemicellulase for improving the dough properties of bread and other baked goods. The U.S. Patent 5,547,690 describes another enzyme composition consisting of a sulfhydryl oxidase and a glucose oxidase, which improves the rheological properties, in particular the stability, of dough preparations.

Die Deutsche Patentanmeldung DE 198 40 489 A1 beschreibt stabile Wirkstoffzubereitungen für Lebensmittel, Futtermittel oder pharmazeutische Anwendungen, bei denen der/die Wirkstoffe von einer Proteinschicht umgeben sind. Zur Herstellung dieser Zubereitungen wird das Hüllprotein enzymatisch quervernetzt, u. a. durch die Sulfhydryloxidasekatalysierte Synthese von Disulfidbrückenbindungen.The German patent application DE 198 40 489 A1 describes stable active compound preparations for food, feed or pharmaceutical applications in which the active substance (s) are surrounded by a protein layer. For the preparation of these preparations, the coat protein is enzymatically crosslinked, inter alia, by the sulfhydryl oxidase-catalyzed synthesis of disulfide bonds.

Bislang wurden Sulfhydryloxidasen hauptsächlich aus Milch bzw. aus verschiedenen Pilzen isoliert. U.S. Patent 4,087,328 beschreibt ein mehrstufiges, konventionelles Reinigungsverfahren für Sulfhydryloxidase aus Rohmilch von Kühen. Ein anderes Verfahren zur Reinigung von Sulfhydryloxidase aus dem Schimmelpilz Aspergillus niger ist im U.S. Patent 4,894,340 offenbart. Daneben wurde in der Europäischen Patentanmeldung EP 0 565 172 A1 auch ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung von Sulfhydryloxidasen aus filamentösen Pilzen, vorzugsweise wiederum aus Aspergillus spec., in biotechnologischem Maßstab offenbart.So far, sulfhydryl oxidases have been isolated mainly from milk or from different fungi. U.S. Patent 4,087,328 describes a multi-stage, conventional purification process for sulfhydryl oxidase from cow's raw milk. Another method of purifying sulfhydryl oxidase from the fungus Aspergillus niger is described in U.S. Pat U.S. Patent 4,894,340 disclosed. In addition, in the European patent application EP 0 565 172 A1 also discloses a recombinant process for the preparation of sulfhydryl oxidases from filamentous fungi, preferably again from Aspergillus spec., on a biotechnological scale.

Lisowsky et al. (Lisowsky et al. (2001) Digest Liver Dis. Vol. 33, S. 173–180) beschreiben eine rekombinante Mutante der humanen Sulfhydryloxidase Alrp, die an Position 145 anstelle eines Cysteinrestes einen Serinrest trägt. Diese Mutante besitzt allerdings keine Sulfhydryloxidase-Aktivität und zeigt keine FAD-Bindung.Lisowsky et al. (Lisowsky et al., (2001) Digest Liver Dis., Vol. 33, pp. 173-180) a recombinant human sulfhydryl oxidase alrp recombinant mutant at position 145 carries a serine residue instead of a cysteine residue. These However, mutant has no sulfhydryl oxidase activity and shows no FAD binding.

Gross et al. (Gross et al. (2002) Nat. Struct. Biol. Vol. 9, S. 61–67) beschreiben eine mutierte Erv2p Sulfhydryloxidase aus Saccharomyces cerevisiae, in die die Mutationen C121A, C124A, C121A/C124A, C176A, C178A und C176A/C178A eingeführt wurden.Big et al. (Gross et al. (2002) Nat. Struct. Biol. Vol. 9, pp. 61-67) a mutant Erv2p sulfhydryl oxidase from Saccharomyces cerevisiae, in which the mutations C121A, C124A, C121A / C124A, C176A, C178A and C176A / C178A introduced were.

Bislang war es allerdings nicht möglich, Sulfhydryloxidasen herzustellen, deren katalytische Aktivität reguliert werden kann, obwohl eine derartige enzymatische Steuerungsmöglichkeit von Redoxreaktionen für eine Vielzahl von Anwendungen in der Grundlagenforschung, aber z. B. auch. in der Lebensmitteltechnologie wünschenswert wäre.So far but it was not possible Produce sulfhydryl oxidases, which regulates their catalytic activity although such enzymatic control is possible of redox reactions for one Variety of applications in basic science, but z. B. also. in food technology would be desirable.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, die katalytische Aktivität von Sulfhydryloxidasen steuern zu können.task The invention therefore relates to the catalytic activity of sulfhydryl oxidases to be able to control.

Dieses Ziel wird durch die Bereitstellung einer neuartigen Sulfhydryloxidase gemäß Anspruch 1 erreicht. Bei dieser erfindungsgmäßen Sulfhydryloxidasen wurde mindestens ein Cysteinrest der Aminosäuresequenz derart mutiert, dass das Absorptionssmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist.This The aim is to provide a novel sulfhydryl oxidase according to claim 1 reached. In this erfindungsgmäßen sulfhydryl oxidase was at least one cysteine residue of the amino acid sequence mutated in such a way, that the absorption maximum is changed compared to the wild type protein.

Die Erfindung beruht dabei auf der überraschenden Entdeckung, dass der Austausch bestimmter Cysteinreste in der Aminosäuresequenz der Sulfhydryloxidase Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae nicht nur die Enzymaktivität und die Homodimerbildung beeinflusste, sondern auch eine Farbveränderung des Proteins zur Folge hatte. FAD-abhängige Sulfhydryloxidasen erscheinen aufgrund des gebundenen FAD-Cofaktors gelb. Infolge des Austausches eines einzelnen Cysteinrests ist jedoch eine Farbänderung zu beobachten und so wurde u. a. ein schwarzes Protein erhalten, das weiterhin katalytisch aktiv war.The Invention is based on the surprising Discovery that the replacement of certain cysteine residues in the amino acid sequence the sulfhydryl oxidase Erv1p from Saccharomyces cerevisiae not only the enzyme activity and influenced homodimer formation, but also a color change of the protein. FAD-dependent sulfhydryl oxidases appear due to the bound FAD cofactor yellow. However, as a result of the replacement of a single cysteine residue is a color change to watch and so u. a. get a black protein, which was still catalytically active.

Ferner wurde festgestellt, dass die Farbgebung reversibel durch Einstellung des Redoxpotentials gesteuert werden kann. Da sich so Redoxreaktionen sehr leicht anhand der Farbänderung verfolgen lassen, sind die Enzyme der Erfindung ideale Werkzeuge zur gezielten Steuerung von Redoxreaktionen.Further It was found that the coloring reversible by setting the redox potential can be controlled. Because of redox reactions very easy by the color change The enzymes of the invention are ideal tools for targeted control of redox reactions.

Bei den modifizierten Sulfhydryloxidasen der Erfindung ist das Absorptionsmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert. Das Absorptionsmaximum bezeichnet die Wellenlänge (”Farbe”) des Lichtes, bei der eine Substanz beim Durchleuchten die Intensität am stärksten reduziert. Licht anderer Wellenlängen wird besser durchgelassen. Im sichtbaren Licht erscheint dadurch die Substanz in der Komplementärfarbe zu ihrem Absorptionsmaximum. Eine Veränderung des Absorptionsmaximums gemäß der Erfindung umfasst dabei alle Veränderungen des Absorptionsverhaltens, die eine Farbänderung des Sulfhydryloxidase-Proteins zur Folge haben.at the modified sulfhydryl oxidases of the invention is the absorption maximum across from the wild-type protein. The absorption maximum denotes the wavelength ("color") of the light at which a Substance when candling the intensity is the most reduced. Light of others wavelength is better passed. In visible light appears through it the substance in the complementary color to their absorption maximum. A change in the absorption maximum according to the invention includes all changes of the absorption behavior, which is a color change of the sulfhydryl oxidase protein have as a consequence.

Die Sulfhydryloxidasen gemäß der Erfindung können mit Hilfe rekombinanten DNA-Technologie hergestellt werden, die eine vollständige Kontrolle der Sequenz und damit auch der Eigenschaften eines bestimmten Enzyms erlaubt. Mutationen können sehr einfach unter Verwendung etablierter Standardverfahren [20] in die Aminosäuresequenz eingeführt werden.The Sulfhydryl oxidases according to the invention can be prepared using recombinant DNA technology, the a complete Control of the sequence and thus the properties of a particular Enzyme allowed. Mutations can very simple using established standard methods [20] in the amino acid sequence introduced become.

In den rekombinanten Sulfhydryloxidasen der Erfindung wurde der Cysteinrest in Position 30 durch einen Serinrest ersetzt. Bislang konnte jedoch seitens der Erfinder noch nicht abschließend geklärt werden, ob die spezifische Einführung eines Serinrests in die Aminosäuresequenz in direktem Zusammenhang mit den beobachteten Farbänderungen der mutierten Proteine steht. Es sollte entsprechend dem Verständnis der Erfinder deshalb möglich sein, auch durch Substitution eines oder mehrerer Cysteinreste durch andere Aminosäuren Farbänderungen der mutierten Proteine hervorzurufen, so z. B. durch den Austausch von Cystein gegen Alanin oder Threonin, die beide zu Serin ähnliche Eigenschaften besitzen. Daneben könnte dies aber durchaus auch durch die Einführung z. B. eines Arginin- oder eines Leucinrests anstelle eines Cysteinrests bewirkt werden.In the recombinant sulfhydryl oxidases of the invention, the cysteine residue at position 30 was replaced by a serine residue. So far, however, the inventors have not been able to conclusively clarify whether the specific introduction of a serine residue into the amino acid sequence is directly related to the observed color changes of the mutated proteins. It should therefore be possible according to the understanding of the inventors to cause by substitution of one or more cysteine residues by other amino acids color changes of the mutated proteins, such. By the replacement of cysteine with alanine or threonine, which both have similar properties to serine. In addition, but this could well by introducing z. As an arginine or a leucine residue instead of a cysteine residue can be effected.

Grundsätzlich können alle in einer bestimmten Sulfhydryloxidase vorkommenden Cysteinreste gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden jedoch ein oder mehrere Cysteinreste ersetzt, die redoxreaktiv sind. Unter ”redoxreaktiven” Cysteinresten versteht man erfindungsgemäß dabei diejenigen Reste, die im Verlauf der katalytischen Reaktion einen Zyklus aus Oxidation und Reduktion durchlaufen und dabei eine Disulfidbrücke ausbilden. Beispiele für redoxreaktive Cysteinreste sind etwa C130 und C133 in Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae.In principle, everyone can cysteine residues present in a given sulfhydryl oxidase against another amino acid be replaced. In preferred embodiments of the invention However, one or more cysteine residues are replaced, the redox reactive are. Under "redox-reactive" cysteine residues is understood according to the invention those radicals which in the course of the catalytic reaction a Run through cycle of oxidation and reduction and thereby form a disulfide bridge. examples for redox-reactive cysteine residues are about C130 and C133 in Erv1p Saccharomyces cerevisiae.

Die Erfindung schließt ferner Sulfhydryloxidasen ein, die sich von der als ”Wildtyp” anerkannten Sequenz aufgrund von alternativem Splicing einer gemeinsamen prä-mRNA unterscheiden, aber nach wie vor katalytisch aktiv sind.The Invention includes and sulfhydryl oxidases other than those recognized as "wild type" Differentiate sequence due to alternative splicing of a common pre-mRNA, but still catalytically active.

Bei den rekombinanten Sulfhydryloxidasen der Erfindung handelt es sich um Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID. Nr. 1), wobei der redoxaktive Cysteinrest an Position 30 durch ein Serin ersetzt wurde. Insbesondere betrifft die Erfindung das Enzym mit einer Cystein → Serin-Mutation an Position 30 (C30S; SEQ ID Nr. 2). Ebenfalls offenbart werden Enzyme mit einer Cystein → Serin-Mutation an Position 130 (C130S; SEQ ID Nr. 3).at The recombinant sulfhydryl oxidases of the invention are to Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 1), wherein the redox-active cysteine residue at position 30 has been replaced by a serine. Especially For example, the invention relates to the enzyme having a cysteine → serine mutation at position 30 (C30S; SEQ ID NO: 2). Also disclosed Enzymes with a cysteine → serine mutation at position 130 (C130S; SEQ ID NO: 3).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die rekombinante Sulfhydryloxidase ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an ihrem N-Terminus und/oder C-Terminus, das eine einfache Detektion und/oder Reinigung des Proteins er-möglicht. Geeignete Epitope sind zum Beispiel das myc-Epitop, das FLAG-Epitop, das His₆-Epitop oder das HA-Epitop.In another preferred embodiment of the invention, the recombinant sulfhydryl oxidase contains a protein or peptide affinity epitope at its N-terminus and / or C-terminus which allows for easy detection and / or purification of the protein. Suitable epitopes are, for example, the myc epitope, the FLAG epitope, the His ₆ epitope or the HA epitope.

Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle (DNA und RNA), die Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche die erfindungsgemäßen Sulfhydryloxidasen kodieren. Da es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes möglich ist, bestimmte Codons durch andere Codons zu ersetzen, welche die gleiche Aminosäure kodieren, ist die Erfindung nicht auf ein spezifisches Nukleinsäuremolekül beschränkt, das eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodiert, sondern schließt alle Nukleinsäuremoleküle ein, die eine funktionelle Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren.Further the invention relates to nucleic acid molecules (DNA and RNA), the nucleic acid sequences which encode the sulfhydryl oxidases according to the invention. Because it is possible because of the degeneracy of the genetic code replace certain codons with other codons that are the same amino acid the invention is not limited to a specific nucleic acid molecule which a sulfhydryl oxidase according to the invention encodes, but closes all nucleic acid molecules, which encode a functional sulfhydryl oxidase according to the invention.

Die Erfindung schließt ferner Nukleinsäuremoleküle ein, die sich aufgrund von alternativem Splicing eines gemeinsamen prä-mRNA Moleküls von der als ”Wildtyp” anerkannten Sequenz unterscheiden. Derartige Splicing-Mechanismen umfassen die alternative Verwendung von Exons (i. e. Nukleinsäuresequenzen, die eine Aminosäuresequenz kodieren), die alternative Anordnung von Exons sowie das ”Nicht-entfernen” von Introns (i. e. intervenierende Sequenzen, die normalerweise keine Aminosäuresequenz kodieren) aus dem mRNA-Molekül.The Invention includes also nucleic acid molecules, due to alternative splicing of a common pre-mRNA molecule of the recognized as "wild type" Differentiate sequence. Such splicing mechanisms include the alternative use of exons (i.e., nucleic acid sequences having an amino acid sequence encode), the alternative arrangement of exons and the "non-removal" of introns (i) Intervening sequences that do not normally have an amino acid sequence encode) from the mRNA molecule.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kodieren die Nukleinsäuremoleküle die rekombinante Sulfhydryloxidase Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID. Nr. 1), in der der redoxaktive Cysteinrest an Position 30 durch einen Serinrest ersetzt wurde. Besonders bevorzugt werden Nukleinsäuresequenzen, die von Erv1p aus Sacharomyces cerevisiae abgeleitet sind und die für eine Cystein → Serin-Mutation an Position 30 (C30S; SEQ ID Nr. 2) kodieren. Ebenfalls offenbart werden Nukleinsäuren, die eine Cystein → Serin-Mutation an Position 130 (C130S; SEQ ID Nr. 3) kodieren.In preferred embodiments In the invention, the nucleic acid molecules encode the recombinant sulfhydryl oxidase Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 1), in which the redox-active Cysteine residue at position 30 has been replaced by a serine residue. Particularly preferred are nucleic acid sequences derived from Erv1p from Sacharomyces cerevisiae and those responsible for a cysteine → serine mutation at position 30 (C30S; SEQ ID NO: 2). Also disclosed are nucleic acids which a cysteine → serine mutation at position 130 (C130S; SEQ ID NO: 3).

Ein hier offenbartes Nukleinsäuremolekül kann ”operativ” mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.One Nucleic acid molecule disclosed herein may be used "operatively" with a linked to regulatory sequence, to allow the expression of the nucleic acid molecule.

Ein Nukleinsäuremolekül wird als ”fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz” bezeichnet, wenn es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente ”operativ” mit der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in Prokaryonten aus dem Promotor per se besteht, i. e. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise 5' nicht-kodierende Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die –35/-10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5'-Capping-Elemente in Eukaryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren Zusätzlich können auch die 3' nicht-kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription, der Polyadenylierung o. ä. beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.A nucleic acid molecule is said to be "capable of expressing a nucleic acid sequence" if it comprises sequence elements that contain information regarding the regulation of transcription and / or translation, and these elements are "operably linked" to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. An operative linkage is a linkage in which the regulatory sequence elements and the protein coding sequence are linked such that gene expression is possible. The exact nature of the regulatory regions required for gene expression can vary between different species. In general, however, these regions include a promoter that is derived from prokaryotes in the Promoter per se, ie DNA elements that control transcription initiation, as well as DNA elements that regulate the onset of translation after their transcription into mRNA. Such promoters normally include 5 'non-coding sequences involved in the initiation of transcription and translation, such as the -35 / -10 elements and the Shine-Dalgarno element in prokaryotes or the TATA box, CAAT- Sequences and 5'-capping elements in eukaryotes. These regions may also contain enhancer or repressor elements as well as translated signal sequences to direct the native polypeptide chain into a specific compartment of the host cell. Additionally, the 3 'non-coding regions may contain regulatory elements that interfere with the termination of transcription, polyadenylation or the like are involved. If these termination sequences are not or only insufficiently functional in a particular host cell, they can be replaced by signals that are sufficiently functional in the particular cell.

Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum Beispiel der lacUV5-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Promotor.One Nucleic acid molecule according to the invention may therefore have a regulatory sequence, in particular a promoter sequence include. In another preferred embodiment, the nucleic acid molecule according to the invention comprises a promoter sequence and a transcription termination sequence. suitable prokaryotic promoters are, for example, the lacUV5 promoter or the T7 promoter. Examples of suitable eukaryotic Promoters are the SV40 promoter or the CMV promoter.

Die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können ferner in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren oder künstlichen Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und der Nukleinsäuresequenz, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodiert, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt. Eine große Zahl geeigneter Vektoren, z. B. pBluescript, pUC18, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich.The Nucleic acid molecules according to the invention can further contained in a vector or other cloning vehicle such as phages, phagemids, cosmids, baculoviruses or artificial Chromosomes. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule is in one Vector, in particular in an expression vector. Such a Expression vector can be in addition to the regulatory described above Sequences and the nucleic acid sequence, the one sulfhydryl oxidase according to the invention encoded, replication and Include control sequences derived from an organism which compatible with the host used for expression, as well as at least one selection marker that has a selectable phenotype transmits a transformed cell. A size Number of suitable vectors, e.g. PBluescript, pUC18, pET or pcDNA3, is described in detail and commercially available.

DNA-Moleküle, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz einer solchen Sulfhydryloxidase enthält, können in eine entsprechende Wirtszelle transformiert werden, die zur Expression dieser DNA-Moleküle geeignet ist. Die Transformation kann dabei mit Hilfe etablierter Standardverfahren [20] durchgeführt werden. Die Erfindung betrifft daher auch eine Wirtszelle, die ein hier offenbartes Nukleinsäuremolekül enthält.DNA molecules that a sulfhydryl oxidase according to the invention and in particular a vector encoding the coding sequence contains such Sulfhydryloxidase, can in a corresponding Host cell suitable for expression of these DNA molecules is. The transformation can be done using established standard methods [20] become. The invention therefore also relates to a host cell comprising contains here disclosed nucleic acid molecule.

Die transformierten Wirtszellen werden in der Folge unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression der Nukleotidsequenzen, die eine Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung kodieren, geeignet sind. Die verwendeten Wirtszellen können prokaryontischen Ursprungs sein, wie z. B. Escherichia coli (E. coli) oder Bacillus subtilis, oder eukaryontischen Ursprungs, wie etwa Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 oder High5 Insektenzellen, immortalisierte Säugetierzelllinien (z. B. HeLa-Zellen oder CHO-Zellen) oder primäre Säugetierzellen.The transformed host cells are subsequently subjected to conditions cultured for expression of the nucleotide sequences, a Sulfhydryl oxidase according to the invention encode, are suitable. The host cells used can be prokaryotic Origin, such. Escherichia coli (E. coli) or Bacillus subtilis, or eukaryotic origin, such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 or High5 insect cells, immortalized Mammalian cell lines (eg HeLa cells or CHO cells) or primary mammalian cells.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung.The The invention also relates to a method for recombinant production a sulfhydryl oxidase according to the invention.

Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

(a) Klonieren eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Sulfhydryloxidase kodiert, in einen geeigneten Vektor, und
(b) Einbringen des in (a) erhaltenen rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Zellextrakt.

This procedure includes the following steps:

(a) cloning a nucleic acid molecule encoding a sulfhydryl oxidase into a suitable vector, and
(b) introducing the recombinant vector obtained in (a) into a suitable host cell or cell extract.

Schritt (a) kann dabei mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, das nur die Sulfhydryloxidase kodiert. Alternativ kann er aber auch mit einem Nukleinsäuremolekül durchgeführt werden, in dem die Sulfhydryloxidase operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist. Optional kann das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung auch mit einem Fusionspartner verknüpft sein, wie etwa einem Affinitätsepitop, das eine einfache Reinigung und/oder Detektion des rekombinanten Proteins erlaubt. Die Expression der so klonierten Nukleinsäuremoleküle kann in einer rekombinanten Zelle oder einem Zellextrakt erfolgen, die/der alle für die Transkription und Translation erforderlichen Faktoren enthält.step (a) can be carried out with a nucleic acid molecule containing only the sulfhydryl oxidase coded. Alternatively, however, it can also be carried out with a nucleic acid molecule, in which the sulfhydryl oxidase is operatively linked to a regulatory Sequence linked is. Optionally, the nucleic acid molecule according to the invention also be associated with a fusion partner, such as an affinity epitope a simple purification and / or detection of the recombinant protein allowed. The expression of the thus-cloned nucleic acid molecules can in a recombinant cell or cell extract, all of them for the Transcription and translation factors required.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, die mindestens eine rekombinante Sulfhydryloxidase gemäß der Erfindung enthält. Die Zusammensetzung kann dabei ausschließlich Sulfhydryloxidasen umfassen, aber auch weitere enzymatisch aktive Proteine enthalten, wie z. B. Lipoxygenasen, Proteindisulfidisomerasen, Lysyloxidasen, Tyrosinoxidasen, Hemicellulasen oder Glucoseoxidasen. Ferner kann die Zusammensetzung je nach Verwendungszweck auch Trägerstoffe (z. B. Stärke, Laktose, Gelatine, Fette, Wachse, Öle oder Polyole), verschiedenen Zusatzstoffe (etwa Füllstoffe, Stabilisierungsmittel, Emulgiermittel oder Konservierungsmittel, Puffersubstanzen, Lösungsmittel oder Lösungsvermittler) oder Transportvehikel umfassen. Die Zusammensetzung kann in fester Form vorliegen, z. B. lyophilisiert oder kristallin, oder aber gelöst, z. B. als Suspension oder Emulsion.The invention further relates to a composition containing at least one recombinant sulfhydryl contains loxidase according to the invention. The composition may comprise exclusively Sulfhydryloxidasen, but also contain other enzymatically active proteins, such as. Lipoxygenases, protein disulfide isomerases, lysyl oxidases, tyrosine oxidases, hemicellulases or glucose oxidases. Furthermore, the composition may also comprise excipients (eg starch, lactose, gelatin, fats, waxes, oils or polyols), various additives (for example fillers, stabilizers, emulsifiers or preservatives, buffer substances, solvents or solubilizers) or transport vehicles, depending on the intended use , The composition may be in solid form, e.g. B. lyophilized or crystalline, or dissolved, z. B. as a suspension or emulsion.

Außerdem wird die Verwendung der rekombinanten Sulfhydryloxidasen als Biokatalysatoren für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen sowie deren Übertragung auf Substrate offenbart, z. B. auf Dithiothreitol, Cystein oder Homocystein. Im Vergleich zu herkömmlichen Sulfhydryloxidasen besitzen die gentechnologisch modifizierten Enzymen der Erfindung den entscheidenden Vorteil, dass sie regulierbar sind, und diese Regulation anhand von Farbänderungen des Proteins leicht verfolgt werden kann. Die Steuerung der Farbgebung des Proteins erfolgt dabei reversibel durch Einstellung des Redoxpotentials über Dithiothreitol, ß-Mercaptoethanol bzw. über Luftsauerstoff. Dadurch wird es möglich, eine Disulfidbindung gezielt auf ein bestimmtes Substratmolekül zu übertragen und die Reaktion anhand der Farbänderung des Proteins zu verfolgen.In addition, will the use of the recombinant sulfhydryl oxidases as biocatalysts for the synthesis of disulfide bonds and their transmission disclosed on substrates, for. B. on dithiothreitol, cysteine or Homocysteine. Compared to conventional sulfhydryl oxidases own the genetically engineered enzymes of the invention the decisive advantage that they are regulable, and these Regulation based on color changes of the protein can be easily traced. The control of the coloring The protein is reversible by adjusting the redox potential on dithiothreitol, ß-mercaptoethanol or atmospheric oxygen. This will make it possible to selectively transfer a disulfide bond to a specific substrate molecule and the reaction by the color change to track the protein.

Die Besonderheit der Erv1/Alr Sulfhydryloxidasen ist ihre Substratspezifität für Dithiole mit einem definierten Abstand, da sie so in der zellulären Umgebung unabhängig vom Glutathionspiegel gezielte Disulfidbrücken einfügen können. Jüngste Untersuchungen der Erfinder zeigen folgende Reihenfolge von künstlichen in vitro Substraten: Thioredoxin (reduziertes CXXC) > Dithiothreitol > Di-Mercaptoethanol Lysozym (reduziert) > Cystein. Demzufolge scheinen Erv/Alr Sulfhydryloxidasen eine starke Präferenz für Dithiole in Proteinen mit einem genau definierten Abstand zu haben. Thioredoxin der Haupt-Redoxregulator der Zelle bei den aufgeführten Phänomenen. Dabei wirkt Erv/Alrp als Thioredoxin-Oxidase und kann so in die Regulation eingreifen.The A special feature of Erv1 / Alr sulfhydryl oxidases is their substrate specificity for dithiols at a defined distance, as they are so in the cellular environment independently can insert targeted disulfide bridges from the glutathione level. Recent investigations of the inventors show the following sequence of artificial in vitro substrates: Thioredoxin (reduced CXXC)> dithiothreitol> di-mercaptoethanol Lysozyme (reduced)> cysteine. As a result, Erv / Alr sulfhydryl oxidases appear to have a strong preference for dithiols to have in proteins with a well-defined distance. thioredoxin the main redox regulator of the cell in the listed phenomena. Erv / Alrp acts as a thioredoxin oxidase and can thus in the Intervene regulation.

Die Enzyme der Erfindung können z. B. klinisch bei der Entwicklung diagnostischer Reagenzien und Testsysteme von Bedeutung sein. Reduziertes Thioredoxin ist z. B. ein essentieller Cofaktor der intrazellulären Signalübertragung, der Steuerung von Apoptose und Nekrosenbildung sowie der Modulation der Fragilität roter Blutkörperchen. Auch als Antioxidationsmittel ist es von großer Bedeutung. Die dabei stattfindende Oxidation schützt u. a. das vaskuläre Endothel vor einer Schädigung durch freie Radikale. Die gezielte Steuerung bzw. der Nachweis einer erfolgten Disulfidbrückenbildung können daher für die Diagnose, aber auch Therapie einer Reihe von Krankheiten vorteilhaft sein Die rekombinanten Sulfhydryloxidasen der Erfindung können ferner als regulierbare Sensoren/Indikatoren für Redoxreaktionen verwendet werden. So kann z. B. die Sauerstoffkonzentration des Mediums über das Redoxpotential die Farbe des Proteins beeinflussen.The Enzymes of the invention may z. For example, clinically in the development of diagnostic reagents and test systems be significant. Reduced thioredoxin is z. B. an essential Cofactor of intracellular signal transmission, the control of apoptosis and necrosis formation as well as the modulation the fragility red blood cells. Also, as an antioxidant, it is of great importance. The taking place Oxidation protects u. a. the vascular Endothelium from damage by free radicals. The targeted control or the proof of a done disulfide bridge formation can therefore for the diagnosis, but also therapy of a number of diseases beneficial The recombinant sulfhydryl oxidases of the invention may further be used as regulatable sensors / indicators for redox reactions become. So z. B. the oxygen concentration of the medium over the Redox potential affects the color of the protein.

Umgekehrt kann aber auch die Farbe des Proteins durch Änderung des Redoxpotentials variiert werden. Die Enzyme gemäß der Erfindung können demnach auch als redox-regulierte Pigmente verwendet werden. Ein Protein der Erfindung kann z. B. zwischen zwei Glasscheiben eingebracht werden, welche mit Elektroden verbunden sind: Durch elektrische Steuerung des Redoxpotentials kann das Protein die Glasfläche einfärben und somit als Lichtschutz fungieren.Vice versa but can also change the color of the protein by changing the redox potential be varied. The enzymes according to the invention can therefore also be used as redox-regulated pigments. One Protein of the invention may e.g. B. introduced between two glass panes which are connected to electrodes: By electrical Controlling the redox potential, the protein can stain the glass surface and thus act as a sunscreen.

Da die hier offenbarten Enzyme nach den bislang vorliegenden Ergebnissen für Zellen nicht toxisch zu sein scheinen, sollten sie auch in vivo als Lichtschutzfaktor einsetzbar sein, da sich die Lichtdurchlässigkeit von Zellen wiederum über das Redoxpotential regulieren lässt.There the enzymes disclosed herein according to the results available so far for cells They also seem to be non-toxic in vivo as a sun protection factor be used, since the light transmission of cells in turn on the Regulate redox potential.

Die rekombinanten Enzyme der Erfindung, und insbesondere die C30S-Variante von Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID Nr. 2) können weiterhin als Akzeptormoleküle in Resonanzenergietransfer(RET)-Applikationen zur Bestimmung von Abständen zwischen Makromolekülen eingesetzt werden. Beispiele derartiger Verfahren sind Fluoreszenz-RET (FREI) und Biolumineszenz-RET (BREI) [17, 18]. Das Prinzip beruht dabei auf dem strahlungslosen Transfer von Lichtenergie von einem direkt angeregten Donormolekül auf ein sich in der Nähe befindliches Akzeptormoleül. Damit ein Energietransfer stattfinden kann, müssen die Emmissions- bzw. Absorptionsspektren von Donor bzw. Akzeptor überlappen. Aufgrund seiner schwarzen Farbe und des breiten Absorptionsspektrums kann die Q30S-Variante von Erv1p als universelle Akzeptordomäne eingesetzt werden, die sich mit einem beliebigen Donormolekül kombinieren lässt.The recombinant enzymes of the invention, and in particular the C30S variant of Erv1p from Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 2) may continue as acceptor molecules in resonance energy transfer (RET) applications for the determination of intervals between macromolecules be used. Examples of such methods are fluorescence RET (FREE) and bioluminescent RET (BREI) [17, 18]. The principle is based doing so on the nonradiative transfer of light energy from one directly excited donor molecule on a nearby located acceptor molecule. For an energy transfer to take place, the emission or absorption spectra must overlap by donor or acceptor. Due to its black color and wide absorption spectrum can use the Q30S variant of Erv1p as a universal acceptor domain which can be combined with any donor molecule.

Die Erfindung wird ferner durch die folgenden nichteinschränkenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.The Invention is further characterized by the following non-limiting Figures and examples illustrated.

Dabei zeigt 1 die Expression von Wildtyp(WT)-Erv1p sowie verschiedener mutierter Varianten (C = Cystein, S = Serin). Die gereinigten Proteine (vgl. auch Beispiel 1) tragen an ihrem C-Terminus jeweils ein His₆-Affinitätsepitop, das sowohl eine schnelle Reinigung als auch den immunchemischen Nachweis erlaubt. Pro Spur wurden 200 ng gereinigtes Protein mit (+) bzw. ohne (–) 20 mM DTT im Probenpuffer auf 4%–12% nicht-reduzierende SDS-Polyacrylamiggele (Novex/Invitrogen) aufgetragen. Die Proteine wurden über einen primären anti-His₅ Antikörper und einen AP-gekoppelten sekundären Antikörper chemiluminometrisch nachgewiesen.It shows 1 the expression of wild-type (WT) -Erv1p and various mutated variants (C = Cysteine, S = serine). The purified proteins (see also Example 1) carry at their C-terminus in each case a His ₆ -affinity epitope, which allows both rapid purification and immunochemical detection. Per track, 200 ng of purified protein with (+) or no (-) 20 mM DTT was loaded into 4% -12% non-reducing SDS polyacrylamide gels (Novex / Invitrogen) in the sample buffer. The proteins were detected chemiluminometrically via a primary anti-His ₅ antibody and an AP-coupled secondary antibody.

2 zeigt die Bestimmung der in vitro-Aktivität von Wildtyp(WT)-Erv1p sowie verschiedener mutierter Varianten. Die Enzymaktivität der gereinigten Proteine (vgl. auch Beispiel 2) wurde photometrisch mit DTT (entsprechend 50 nmol reduzierte Thiol-Gruppen) als Substrat gemessen. Der Substratumsatz wurde dabei pro proteingebundenes FAD-Molekül (gemäß der spektroskopischen Bestimmung) angegeben. Die Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten. 2 shows the determination of the in vitro activity of wild-type (WT) -Erv1p and various mutant variants. The enzyme activity of the purified proteins (see also example 2) was measured photometrically with DTT (corresponding to 50 nmol reduced thiol groups) as substrate. The substrate conversion was reported per protein-bound FAD molecule (according to the spectroscopic determination). The results represent the means ± standard deviation from three independent experiments.

3 zeigt die unterschiedlichen Färbungen von gereinigtem Wildtyp(WT)-Erv1p sowie verschiedener mutierter Varianten. Aufgrund von unterschiedlicher Expression in E. coli variieren die Proteinkonzentrationen der einzelnen Lösungen. Erv1p (5.9 mg/ml), C30S (36 mg/ml), C33S (10.8 mg/ml), C130S (14.1 mg/ml), C133S (4.1 mg/ml), C159S (9.9 mg/ml), C176S (6.0 mg/ml) und ΔN-Erv1p (4.1 mg/ml). 3 shows the different stains of purified wild-type (WT) -Erv1p and various mutant variants. Due to different expression in E. coli, the protein concentrations of the individual solutions vary. Erv1p (5.9 mg / ml), C30S (36 mg / ml), C33S (10.8 mg / ml), C130S (14.1 mg / ml), C133S (4.1 mg / ml), C159S (9.9 mg / ml), C176S ( 6.0 mg / ml) and ΔN-Erv1p (4.1 mg / ml).

4 zeigt Spektren für Wildtyp(WT)-Erv1p sowie die beiden Cystein → Serin Varianten C30S und C130S. Die gereinigten Proteine wurden in einem Zeiss S10 Dioden-Array Photometer in einem Wellenlängebereich von 320 nm bis 700 nm analysiert (vgl. auch Beispiel 3). Die verwendeten Proteinlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 2.2 mg/ml (Erv1p), 5.1 mg/ml (C30S) und 4.2 mg/ml (C130S). Da der FAD-Gehalt der Proben unterschiedlich ist, und auch die molaren Absorptionskoeffizienten für die mutierten Proteine variieren können, werden die Spektren nur qualitativ bewertet. 4 shows spectra for wild-type (WT) -Erv1p as well as the two cysteine → serine variants C30S and C130S. The purified proteins were analyzed in a Zeiss S10 diode array photometer in a wavelength range from 320 nm to 700 nm (see also Example 3). The protein solutions used had the following concentrations: 2.2 mg / ml (Erv1p), 5.1 mg / ml (C30S) and 4.2 mg / ml (C130S). Since the FAD content of the samples is different, and also the molar absorption coefficients for the mutated proteins can vary, the spectra are evaluated only qualitatively.

Beispiel 1example 1

Klonierung und Reinigung von rekombinanten Erv1p-Varianten aus Saccharomyces cerevisiaeCloning and purification of recombinant Erv1p variants from Saccharomyces cerevisiae

Die cDNAs für das vollständige ERV1-Gen sowie eine 5'-terminal verkürzte Variante (ΔN-Erv1p; entspricht Aminosäure 73–189 des Wildtyps) wurden mittels etablierter Standardverfahren [20] amplifiziert und als NdeI/XhoI-Fragmente in den Vektor pET24a(+) (Novagen) kloniert [5]. Der rekombinante Vektor, der die vollständige cDNA-Sequenz kodierte, wurde im folgenden zur oligonukleotid-gerichteten Mutagenese (”Excite” PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit/Stratagene) verwendet. Die zur Einführung der einzelnen Mutationen (C = Cystein, S = Serin) verwendeten Primer (jeweils vorwärts/rückwärts) haben die folgenden Sequenzen:

The cDNAs for the complete ERV1 gene as well as a 5'-terminally truncated variant (ΔN-Erv1p, corresponding to wild-type amino acid 73-189) were amplified by established standard methods [20] and inserted into the vector pET24a (+) as NdeI / XhoI fragments ) (Novagen) [5]. The recombinant vector encoding the complete cDNA sequence was subsequently used for oligonucleotide-directed mutagenesis ("Excite" PCR Site-Directed Mutagenesis Kit / Stratagene). The primers (forward / backward) used to introduce each mutation (C = cysteine, S = serine) have the following sequences:

Die Identität der mutierten Sequenzen wurde anhand von Restriktions- bzw. Sequenzanalysen verifiziert.The identity of the mutated sequences was determined by restriction and sequence analyzes Verified.

Die gereinigten Plasmide (Plasmid Purification Kit/QIAGEN) wurden in E. coli BL21(+) (Novagen) transformiert und amplifiziert [20]. Die Reinigung der einzelnen Proteine erfolgte über ein His₆-Affinitätsepitop (in der Sequenz von pET24a(+) kodiert) an deren C-Termini. Die Reinigung wurde mit Hilfe von Ni²⁺ NTA-Agarose unter nativen Bedingungen in Phosphatpuffer (50 mM NaCl, 50 mM KH₂PO₄, 10 mM Imidazol, pH 7.5) nach Herstelleranweisung (QIAGEN) durchgeführt. Die Homogenität der Proteinpräparationen wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Analyse verifiziert. Dazu wurden jeweils 200 ng Protein in 4%–12% nicht-reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen (Novex/Invitrogen) aufgetrennt. Die Bildung von Protein-Dimeren (oder -Multimeren) wurde durch Zugabe bzw. Weglassen von DTT (20 mM) im Probenpuffer untersucht (siehe 1).The purified plasmids (Plasmid Purification Kit / QIAGEN) were transformed into E. coli BL21 (+) (Novagen) and amplified [20]. The individual proteins were purified by His ₆ affinity epitope (encoded in the sequence of pET24a (+)) at their C-termini. Purification was carried out using Ni ²⁺ NTA agarose under native conditions in phosphate buffer (50 mM NaCl, 50 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mM imidazole, pH 7.5) according to the manufacturer's instructions (QIAGEN). The homogeneity of the protein preparations was verified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western analysis. 200 ng protein were separated into 4% -12% non-reducing SDS-polyacrylamide gels (Novex / Invitrogen). The formation of protein dimers (or multimers) was assayed by adding or omitting DTT (20 mM) in the sample buffer (see 1 ).

Aus 1 ist ersichtlich, dass die N-terminal verkürzte Erv1p ausschließlich als Monomer, das Wildtypprotein jedoch als eine Mischung aus Monomeren und Dimeren vorliegt. Dies zeigt, dass die N-terminale Domäne für die Bildung von Dimeren entscheidend ist. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen findet man mit Ausnahme von C133S keine Monomere. Die mutierten Proteine C30S, C33S und in geringerem Maße C130S liegen vornehmlich als Dimere vor, d. h. zumindest die beiden Cysteinreste an Position 30 bzw. 33 sind an der Dimerbildung beteiligt. Das Vorliegen hochmolekularer Proteinmultimere bei den Varianten C133S, C159S und C176S deutet hingegen eine unspezifische Aggregation dieser Proteine an.Out 1 It can be seen that the N-terminally shortened Erv1p is present exclusively as a monomer, but the wild-type protein as a mixture of monomers and dimers. This shows that the N-terminal domain is crucial for the formation of dimers. Under non-reducing conditions, with the exception of C133S, no monomers are found. The mutated proteins C30S, C33S and to a lesser extent C130S are present predominantly as dimers, ie at least the two cysteine residues at positions 30 and 33 are involved in dimer formation. The presence of high molecular weight protein multimers in the variants C133S, C159S and C176S, however, indicates a nonspecific aggregation of these proteins.

Beispiel 2Example 2

Analyse der in vitro-Enzymaktivität von Erv1p-VariantenAnalysis of the in vitro enzyme activity of Erv1p variants

Zur Aktivitätsbestimmung wurden die Konzentrationen der einzelnen Proteine auf 10 pmol proteingebundenes FAD pro 100 µl Reaktionsansatz eingestellt.to activity determination The concentrations of each protein were protein bound to 10 pmol FAD per 100 μl Reaction batch adjusted.

Die Enzymreaktion wurde in PBS (68 mM NaCl, 75 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.5, der 3 mM EDTA enthält) mit DTT als Substrat (entsprechend 50 nmol reduzierter Thiolgruppen) durchgeführt. Für jede Messung wurde ein 100 µl Aliquot dieser Reaktionsmischung entnommen. Zur Bestimmung des Thiolgehalts wurden die Aliquots mit 800 µl PBS und 100 µl DTNB-Lösung (5,5'-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure, Ellman's Reagens; Endkonzentration 10 mM) versetzt. Nach 2 min Inkubation wurde die Extinktion bei 412 nm gemessen und der Thiolgehalt berechnet (molarer Extinktionskoeffizient 14 mM^–1 cm^–1 [21]). Der Thiolgehalt in der Ausgangsmischung wurde in einer Probe ohne Enzymzugabe ermittelt. Der Substratumsatz wurde pro proteingebundenes FAD-Molekül angegeben. Die in 2 dargestellten Ergebnisse repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten.The enzyme reaction was carried out in PBS (68 mM NaCl, 75 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 3 mM EDTA) with DTT as substrate (corresponding to 50 nmol of reduced thiol groups). For each measurement, a 100 μl aliquot of this reaction mixture was taken. To determine the thiol content, the aliquots were treated with 800 μl of PBS and 100 μl of DTNB solution (5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, Ellman's reagent, final concentration 10 mM). After incubation for 2 min, the absorbance at 412 nm was measured and the thiol content calculated (molar extinction coefficient 14 mM ^-1 cm ^-1 [21]). The thiol content in the starting mixture was determined in a sample without enzyme addition. Substrate turnover was reported per protein-bound FAD molecule. In the 2 The results presented represent the means ± standard deviation from three independent experiments.

Die mutierten Proteine zeigen unter in vitro Bedingungen keine (C130S, C133S) oder nur eine stark verminderte (C30S, C33S, C159S, C176S) Enzymaktivität, sodass alle sechs getesteten Cysteinreste für die volle Aktivität der Erv1p-Sulfhydryloxidase wichtig zu sein scheinen. Die Aktivität der N-terminal verkürzten Erv1p ist erstaunlicherweise mit der des Wildtypproteins vergleichbar. Eine weitere Studie [19] hat jedoch gezeigt, dass das verkürzte Protein den Wildtyp in vivo nicht ersetzen kann.The mutant proteins show no in vitro conditions (C130S, C133S) or only a strongly reduced one (C30S, C33S, C159S, C176S) Enzyme activity, so that all six tested cysteine residues are responsible for the full activity of Erv1p sulfhydryl oxidase seem important. The activity of N-terminal truncated Erv1p is surprisingly comparable to that of the wild-type protein. However, another study [19] has shown that the truncated protein can not replace the wild type in vivo.

Beispiel 3Example 3

Spektroskopische Analyse von Erv1p-VariantenSpectroscopic analysis of Erv1p variants

Der Austausch von Cystein- gegen Serinreste hatte in einigen Fällen auch eine Veränderung der Proteinfärbung zur Folge (siehe 3). Während das Wildtypprotein und die N-terminal verkürzte Erv1p aufgrund des gebundenen FAD intensiv gelb erscheinen, führt eine Mutation an Position 30 zu einer Schwarzfärbung des Proteins, eine Mutation an Position 130 hingegen zu einer Orangefärbung. Erv1p(C159S) erscheint farblos, und die anderen drei Varianten (C33S, C133C und C176S) sind ähnlich dem Wildtyp gelb gefärbt.The replacement of cysteine with serine residues also resulted in a change in protein staining in some cases (see 3 ). Whereas the wild-type protein and the N-terminally shortened Erv1p appear intensely yellow due to the bound FAD, a mutation at position 30 leads to blackening of the protein, whereas a mutation at position 130 results in orange coloring. Erv1p (C159S) appears colorless, and the other three variants (C33S, C133C and C176S) are colored yellow, similar to the wild type.

Alle Farben verschwinden nach Reduktion der Proteine mit Dithionit. Nach Reoxidation in der Luft verfärben sich die Proteinlösungen gelb. Auch bei längerer Lagerung (über mehrere Tage) verändern sich die Farben der mutierten Proteine hin zum Gelb des Wildtyps, vermutlich ebenfalls durch Oxidation mit Luftsauerstoff. Im Stand der Technik gelang es nach einer derartigen Verfärbung nicht, die ursprüngliche Farbe eines mutierten Proteins wiederherzustellen.All Colors disappear after reduction of the proteins with dithionite. To Discolouring reoxidation in the air yourself the protein solutions yellow. Even with longer ones Storage (over several days) the colors of the mutated proteins towards the wild-type yellow, probably also by oxidation with atmospheric oxygen. In the state The technique did not succeed after such a discoloration, the original Restore color of a mutated protein.

Die Farbveränderungen der beiden Erv1p-Varianten C30S und C130S wurden in einem Zeiss S10 Dioden-Array Photometer im Detail untersucht. Es wurden Spektren in einem Wellenlängebereich von 320 nm bis 700 nm aufgenommen (vgl. 4). Die verwendeten Proteinlösungen hatten die folgenden Konzentrationen: 2.2 mg/ml (WT-Erv1p), 5.1 mg/ml (C30S) und 4.2 mg/ml (C130S). Da der FAD-Gehalt der Proben unterschiedlich ist, und auch die molaren Absorptionskoeffizienten für die mutierten Proteine variieren können, werden die Spektren nur qualitativ bewertet. Auffällig sind bei der C30S-Variante ein zusätzliches Absorptionsmaximum bei 580 nm sowie eine Verbreiterung der Absorption bei 460 nm (entspricht FAD) bei der C130S-Variante. Die Spektren aller anderen mutierten Proteine entsprechen dem Wildtypprotein (nicht gezeigt).The color changes of the two Erv1p variants C30S and C130S were examined in detail in a Zeiss S10 diode array photometer. Spectra were recorded in a wavelength range from 320 nm to 700 nm (cf. 4 ). The protein solutions used had the following concentrations: 2.2 mg / ml (WT-Erv1p), 5.1 mg / ml (C30S) and 4.2 mg / ml (C130S). Since the FAD content of the samples is different, and also the molar absorption coefficients for the mutated proteins can vary, the spectra are evaluated only qualitatively. Conspicuous in the C30S variant is an additional absorption maximum at 580 nm and a broadening of the absorption at 460 nm (equivalent to FAD) in the C130S variant. The spectra of all other mutant proteins correspond to the wild-type protein (not shown).

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SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENCE LISTING

Claims

Rekombinante, FAD-abhängige Sulfhydryloxidase, in der mindestens ein Cysteinrest der Aminosäuresequenz derart mutiert wurde, dass das Absorptionsmaximum gegenüber dem Wildtypprotein verändert ist, wobei die Sulfhydryloxidase Erv1p aus Saccharomyces cerevisiae ist und der Cysteinrest an Position 30 durch einen Serinrest ersetzt wurde.Recombinant, FAD-dependent sulfhydryl oxidase, in the at least one cysteine residue of the amino acid sequence has been mutated in such a way that the absorption maximum is changed compared to the wild type protein, wherein the sulfhydryl oxidase Erv1p from Saccharomyces cerevisiae is and the cysteine residue at position 30 has been replaced by a serine residue.

Die rekombinante Sulfhydryloxidase gemäß Anspruch 1, wobei die Sulflrydryloxidase die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 besitzt.The recombinant sulfhydryl oxidase according to claim 1, wherein the Sulflrydryloxidase the amino acid sequence of SEQ ID NO. 2 has.

Sulfhydryloxidase gemäß Anspruch 1 oder 2, die ein Protein- oder Peptidaffinitätsepitop an ihrem N- und/oder C-Terminus aufweist.A sulfhydryl oxidase according to claim 1 or 2, which is a Protein or peptide affinity epitope has at its N and / or C terminus.

Nukleinsäuremolekül, das eine Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1–3 kodiert.Nucleic acid molecule containing a Sulfhydryl oxidase according to one the claims 1-3 coded.

Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4, wobei das Nukleinsäuremolekül operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.Nucleic acid molecule according to claim 4, wherein the nucleic acid molecule is operative is linked to a regulatory sequence to expression of the nucleic acid molecule.

Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 5, wobei die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst.Nucleic acid molecule according to claim 5, wherein the regulatory sequence is a promoter sequence and a Transcription termination sequence.

Vektor enthaltend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 4–6.Vector containing a nucleic acid molecule according to one of claims 4-6.

Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 4–6 oder einen Vektor gemäß Anspruch 7 enthält.A host cell comprising a nucleic acid molecule according to any one of claims 4-6 or a vector according to claim 7 contains.

Verfahren zur Herstellung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1–3, das umfasst: (a) Klonieren eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Sulfhydryloxidase kodiert, in einen geeigneten Vektor, und (b) Einbringen des in (a) erhaltenen rekombinanten Vektors in eine geeignete Wirtszelle oder einen geeigneten Zellextrakt.Process for the preparation of a sulfhydryl oxidase according to one the claims 1-3, that includes: (a) cloning a nucleic acid molecule containing a sulfhydryl oxidase coded into a suitable vector, and (b) bringing in the in (a) obtained recombinant vector into a suitable host cell or a suitable cell extract.

Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1–3 als regulierbarer Biokatalysator für die Synthese von Disulfidbrückenbindungen und deren Übertragung auf Substrate.Use of a sulfhydryl oxidase according to one the claims 1-3 as adjustable biocatalyst for the synthesis of disulfide bonds and their transmission on substrates.

Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1–3 als Sensor/Indikator für Redoxreaktionen.Use of a sulfhydryl oxidase according to one the claims 1-3 as Sensor / indicator for Redox reactions.

Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1–3 als redox-reguliertes Pigment.Use of a sulfhydryl oxidase according to one the claims 1-3 as redox-regulated Pigment.

Verwendung einer Sulfhydryloxidase gemäß einem der Ansprüche 1–3 als Akzeptormolekül in Resonanzenergietransfer-Applikationen.Use of a sulfhydryl oxidase according to one the claims 1-3 as acceptor in resonance energy transfer applications.