DE10307732A1

DE10307732A1 - Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen

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Publication number: DE10307732A1
Application number: DE2003107732
Authority: DE
Inventors: Andrea Dr. Sättler; Claudia Jassoy; Regine Scholtyssek; Silke Nieveler; Karl-Heinz Dr. Trebesius; Claudia Dr. Beimfohr; Ingrid Bergmaier
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA; Vermicon AG
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA; Vermicon AG
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2004-08-26

Abstract

Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen, ein Verfahren zum Nachweis der Mikroorganismen sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen, ein Verfahren zum Nachweis der Mikroorganismen, sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Der Nachweis von Mikroorganismen wird bis heute in überwiegendem Maße serologisch oder mikroskopisch durchgeführt. Dabei sind die Methoden nicht empfindlich genug, um geringe Mengen an Mikroorganismen direkt nachzuweisen. Daher wurde dem Nachweis bisher ein Kultivierungsschritt vorgeschaltet, bei dem die Mikroorganismen vermehrt wurden. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass einige der Mikroorganismen gar nicht auf den zur Verfügung stehenden Nährböden anwachsen, und somit auch nicht nachgewiesen werden können. Untersuchungen an verschiedensten Umweltproben belegen, dass z. Z. nur zwischen 0,1 bis 14% aller Bakterien kultivierbar sind. Insbesondere zur Analyse der Zusammensetzung einer komplexen Biozönose haben sich kultivierungsabhängige Verfahren als ungeeignet erwiesen. Abhängig von den gewählten Kultivierungsbedingungen wird nämlich die Vermehrung derjenigen Mikroorganismen begünstigt, welche an diese Kultivierungsbedingungen besonders gut angepasst sind, wodurch es zu einer starken Verzerrung der in der Ausgangsprobe herrschenden Populationsverhältnisse kommt. Eine quantitative Analyse der Mikroorganismen ist aufgrund dieser Populationsverschiebungen gar nicht möglich. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahren besteht darin, dass die heute bekannten Kultivierungsverfahren teilweise sehr langwierig sind und nicht selten in ihrem Ergebnis nicht eindeutig sind. Auf diese Weise kommt es sowohl zu falsch positiven als auch zu falsch negativen Analyseergebnissen.
Aufgrund der beschriebenen Nachteile der Kultivierung haben moderne Methoden der Mikroorganismenbestimmung alle ein gemeinsames Ziel: Sie versuchen die Nachteile der Kultivierung zu umgehen, indem sie keine Kultivierung mehr benötigen.
Beispiele moderner Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen sind DNA- (Desoxyribonukleinsäure) bzw. RNA- (Ribonukleinsäure) basierte Hybridisierungs- oder Amplifikationsmethoden. Unter dem Begriff Hybridisierung ist insbesondere die Bildung einer Doppelhelix aus zwei einzelsträngigen, komplementären Oligo- oder Polynukleotiden zu verstehen. Eine Hybridisierung kann dabei insbesondere sowohl zwischen zwei DNA oder zwei RNA-Molekülen, aber auch zwischen DNA- und RNA-Molekülen entstehen. Die verschiedenen Moleküle hybridisieren nur dann, wenn die Zielsequenzen in einem ausreichenden Maße komplementär zueinander sind.

Die komplementären Zielsequenzen für den Nachweis können auch immobilisiert sein, wie dies auf sogenannten DNA-Chips häufig getan wird. In der Gebrauchsmusterschrift DE 201 10 013 wird ein solcher Träger (DNA-Chip) zur Diagnose und Therapie oraler Erkrankungen, insbesondere Parodontitis, beansprucht. Auf diesem Träger sind Oligonukleotide immobilisiert, die komplementär zu bekannten Referenzsequenzen bestimmter Bakterien oder Viren sind, welche in der Mundflora vorkommen. Aufgrund der Komplementarität können die auf diesem Genchip aufgebrachten Oligonukleotide mit den entsprechenden Referenzsequenzen unter bestimmten Bedingungen hybridisieren. Nachteilig bei diesem Träger ist, dass die Mikroorganismen entweder durch Kultivierung vermehrt werden müssen oder die genetische Information aus den vorhandenen Proben vor der Hybridisierung auf dem Chip amplifiziert werden muss. Eine Quantifizierung der ursprünglich in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen ist daher ebenfalls nicht möglich.

Eine bekannte Amplifikationsmethode ist die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Bei der PCR wird mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Mikroorganismengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z.B. mittels eines DNA-Fragmente auftrennenden Agarose-Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Auch können diverse in der untersuchten Probe vorhandene Stoffe eine Inhibierung des DNA amplifizierenden Enzyms, der Taq-Polymerase, herbeiführen. Dies ist eine häufige Ursache falsch negativer Ergebnisse. Eine Weiterführung der PCR-Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Mikroorganismen und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und dadurch verursachte falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden und schließlich die Gefahr falsch negativer Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen.

Zu Beginn der 90er Jahre wurde ein Verfahren zur in situ-Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden entwickelt, das in vielen Umweltproben erfolgreich zum Einsatz gekommen ist (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 762). Das Verfahren wurde "FISH" (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) genannt und macht sich den Umstand zunutze, dass die in jeder Zelle vorkommenden ribosomalen Ribonukleinsäuren (RNAs) sowohl hochkonservierte als auch variable, d.h. gattungs- oder sogar artspezifische Sequenzen aufweisen. Gegen diese Sequenzbereiche können komplementäre Oligonukleotide hergestellt werden, die zusätzlich mit einem detektierbaren Marker versehen werden können. Mittels dieser sogenannten Nukleinsäuresonden können Mikroorganismenarten, -gattungen oder -gruppen hochspezifisch direkt in der Probe identifiziert und bei Bedarf auch visualisiert oder quantifiziert werden. Diese Methode ist das einzige Verfahren, das eine verzerrungsfreie Darstellung der tatsächlichen in situ- Verhältnisse der Biozönose darstellt. Sogar bisher nicht-kultivierte und demnach nicht beschriebene Mikroorganismen können identifiziert werden.

Bei der FISH dringen Sonden in die in der untersuchten Probe vorhandenen Zellen ein. Sofern ein Mikroorganismus der Art, Gattung oder Gruppe, für welche die Sonden entwickelt wurden, in der untersuchten Probe vorhanden ist, binden die Sonden in der Mikroorganismenzelle an ihre Zielsequenz, und die Zellen können aufgrund der Markierung der Sonden detektiert werden.

Die Vorteile der FISH-Technik gegenüber den weiter oben beschriebenen Methoden zur Mikroorganismenidentifizierung (Kultivierung, PCR) sind vielfältig.

Erstens können mit Sonden zahlreiche Mikroorganismen detektiert werden, die mittels traditioneller Kultivierung gar nicht erfasst werden. Während durch die Kultivierung maximal nur 15 % der Bakterienpopulation einer Probe sichtbar gemacht werden können, erlaubt die FISH-Technik in vielen Proben eine Detektion bis zu 100 % der Bakteriengesamtpopulation. Zweitens ist die Detektion von Mikroorganismen mittels der FISH-Technik sehr viel schneller als mittels Kultivierung. Benötigt die Identifizierung von Mikroorganismen mittels Kultivierung oft mehrere Tage, so vergehen von der Probennahme bis zur Mikroorganismenidentifizierung sogar auf Artebene mittels der FISH-Technik nur wenige Stunden. Drittens können im Gegensatz zu einem Kultivierungsmedium Sonden in ihrer Spezifität fast beliebig frei gewählt werden. Einzelne Arten können genauso gut mit einer Sonde erfasst werden, wie ganze Gattungen oder Mikroorganismengruppen. Viertens können Mikroorganismenarten oder ganze Mikroorganismenpopulationen direkt in der Probe exakt quantifiziert werden. Fünftens können Assoziationen und Vergesellschaftungen verschiedener Mikroorganismen in einer Probe visualisiert werden.

Im Gegensatz zur PCR weist die FISH zuverlässig nur lebende Mikroorganismen nach. Falsch positive Ergebnisse durch nackte DNA oder tote Mikroorganismen wie bei der PCR sind bei der FISH ausgeschlossen. Des weiteren sind falsch negative Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen ebenso ausgeschlossen wie falsch positive Ergebnisse infolge von Kontaminationen.

Die FISH-Technik ist demnach ein überragendes Werkzeug, um Mikroorganismen schnell und äußerst spezifisch direkt in einer Probe nachzuweisen. Sie ist im Gegensatz zu Kultivierungsverfahren eine direkte Methode und erlaubt darüber hinaus auch eine Quantifizierung der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen.

Die menschliche Haut beispielsweise ist mit ca. 2 m² Fläche eines der größten von Mikroorganismen bewohnten menschlichen Körperorgane. Im Laufe der Evolution hat sich eine enge Beziehung zwischen dem Wirt und seinen mikrobiellen Bewohnern entwickelt. Die von der Haut über verschiedene Körperdrüsen zur Verfügung gestellten Nährstoffe werden von Mikroorganismen verstoffwechselt. Die dadurch verursachte Ansäuerung der Hautoberfläche verhindert die Ansiedelung von pathogenen Mikroorganismen.

Die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen kann aber auch unerwünschte Folgen haben. So ist die Entstehung von Körpergeruch, Schuppenbildung und die Entwicklung verschiedener Hautkrankheiten auf die Aktivität von Mikroben zurückzuführen.

Prinzipiell sind alle Mikroorganismen zur Hautflora zu rechnen, die von der Haut isoliert werden können. Dabei können nach Price (Price P.B. The bacteriology of the normal skin: A new quantitative test applied to a study of the bacterial flora and the disinfectant action of mechanical cleansing. J Infect Dis. 63: 301–318. 1938.) zwei unterschiedliche Gruppen unterschieden werden.

a) Residente Flora: Mikroorganismen, die sich auf der menschlichen Haut vermehren können oder bei der Untersuchung von Hautproben in hoher Anzahl oder mit einem hohen Anteil regelmäßig gefunden werden. Es wird postuliert, dass die oben genannten Eigenschaften durch die feste Verankerung dieser residenten Mikroorganismen mit der Haut zustande kommen (Anheftung).
b) Transiente Flora: Mikroorganismen, die sich auf der menschlichen Haut nicht vermehren können bzw. bei Untersuchungen nur unregelmäßig und in geringen Anzahlen/Anteilen gefunden werden. Diese Mikroorganismen liegen der Theorie nach frei, nicht an Hautbestandteile adhäriert, vor.

Ein genauerer Kenntnisstand vor allem der residenten Flora der Haut ist insbesondere im Hinblick auf die Suche nach neuen medizinischen oder kosmetischen Wirkstoffen wichtig. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroorganismen können darüber hinaus ein breiteres Verständnis der Zusammenhänge zwischen gesunder Haut und ihren Erkrankungen eröffnen und die Entwicklung von besseren Wirkstoffen, Therapien oder Arzneimitteln ermöglichen. Auch die gezielte Beeinflussung relevanter Hautmikroorganismen durch Kosmetikprodukte, wie Deodorants, Cremes u.a., setzt die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion des Mikro-Ökosystems Haut voraus.

Es besteht daher ein Bedarf an als Nukleinsäuresonden für weitere, eher verbreitetere Mikroorganismen geeigneten Oligonukleotiden, die so neue Einsatzgebiete erschließen können. Insbesondere besteht ein Bedarf für Sonden zum Nachweis solcher Mikroorganismen, die mit Menschen und/oder Tieren in Kontakt kommen können, z.B. in Lebensmitteln, Abwässern, Umweltproben oder von der Hautoberfläche.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen oder Mikroorganismengruppen bereitzustellen, die eine schnelle sowie ggf. quantitative Bestimmung dieser Mikroorganismen in einer Probe gewährleisten und darüber hinaus in der Lage sind, einzelne oder Gruppen von Spezies von Mikroorganismen auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von anderen Mikroorganismen sicher zu detektieren.

Dies wird gelöst durch die Bereitstellung von Oligonukleotiden zum Nachweis von Mikroorganismen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus:

i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen, und
ii) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter i) zumindest in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94% der Nukleotide übereinstimmen, und
iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und ii) genannten Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und
iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

sowie durch ein Verfahren zur Verwendung dieser Oligonukleotide und ein Kit zur Anwendung des Verfahrens.

Im erfindungsgemäßen Zusammenhang sind unter dem Begriff "Mikroorganismengruppe" mindestens zwei Arten von Mikroorganismen zu verstehen, die entweder der gleichen Gattung angehören oder eine sehr ähnliche rRNA aufweisen. Eine erfindungsgemäße Mikroorganismengruppe kann beispielsweise auch alle Spezies einer Gattung enthalten.

Erfindungsgemäß sind neben den Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen sowie solchen Oligonukleotiden, die mit diesen zumindest in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94% der Nukleotide übereinstimmen, auch solche Oligonukleotide umfasst, die sich von den genannten Oligonukleotiden ableiten, wobei sie um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder deletiert sind.

Es ist insbesondere auch möglich, dass am 3' und/oder am 5' Ende der genannten Oligonukleotide 1 bis 40, vorzugsweise 1 bis 25, insbesondere 1 bis 15 Nukleotide angehängt sind.

Ebenfalls ist es weiterhin erfindungsgemäß möglich, Oligonukleotide einzusetzen, die sich von den genannten Oligonukleotide insbesondere dadurch ableiten lassen, dass die Sequenz um 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere ein bis drei, beispielsweise ein oder zwei Nukleotide deletiert ist.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform sind die nachzuweisenden Mikroorganismen ausgewählt sind aus den Gattungen Corynebacterium, Peptostreptococcus und/oder Sporomusa.

Die Mikroflora der Haut ist bisher nur durch die bekannten Kultivierungsmethoden untersucht worden. Dabei wurden durch den bereits erwähnten methodischen Mangel nur kultivierbare Bakterien oder Pilze nachgewiesen. Beispielsweise wurden folgende Spezies gefunden: Corynebacterium minutissimum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. callunae, C. lipophiloflavum, C. pseudotuberculosis, C. glucuronolyticum, C. striatum, C. xerosis, C. jekeium, Anaerococcus hydrogenialis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii und A. vaginalis.

Einige der Spezies dieser und anderer Gattungen können vorteilhafterweise mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden nicht nur qualitativ, sondern darüber hinaus auch noch quantitativ nachgewiesen werden. Diese quantitativen Informationen können vor allem für Tests von Wirkstoffen oder die Frühdiagnose von Hauterkrankungen von Nutzen sein. Die genannten Mikroorganismengattungen können des weiteren auch in anderen Proben vorkommen, so beispielsweise in Lebensmitteln, klinischem Untersuchungsmaterial oder Umweltproben. Darüber hinaus ist es nun mittels der erfindungsgemäßen Oligonukleotide möglich, bestimmte Spezies einer Gattung neben anderen Mikroorganismenspezies nachzuweisen, auch wenn diese der gleichen Gattung angehören.

Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter „Haut" die menschliche und/oder tierische Haut oder Schleimhaut sowie die Anhangsgebilde der Haut (Haare, Haarfollikel, Nägel, Drüsen) zu verstehen.

Nach einer besonderen Ausführungsform trägt das Oligonukleotid einen detektierbaren Macker, insbesondere einen Fluoreszenzmarker, der insbesondere kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist. Die Nachweisbarkeit der erfolgten Hybridisierung des Oligonukleotids mit der Zielsequenz ist eine Voraussetzung für die Identifizierung und ggf. Quantifizierung der Mikroorganismen. Insbesondere wird dies häufig durch eine kovalente Bindung eines detektierbaren Markers an das Oligonukleotid erreicht. Als detektierbare Marker werden häufig fluoreszierende Gruppen, z.B. Cy-2, Cy-3 oder Cy-5 (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), FITC (Fluoresceinisothiocyanat), CT (5,(6)-Carboxytetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (Tetramethylrhodamin-5,6-isothiocyanat (Molecular Probes Inc., s.o.) oder FLUOS (5,(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)). Alternativ werden chemolumineszierende Gruppen oder radioaktive Markierungen, z.B. 35S, 32P, 33P, 125J, verwendet. Nachweisbarkeit kann aber auch gegeben sein durch Kopplung des Oligonukleotids mit einem enzymatisch aktiven Molekül, beispielsweise alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Peroxidase, Meerettichperoxidase, β-D-Galaktosidase oder Glukoseoxidase. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrats umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Enzyme	Chromogene
Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase	4-Methylumbelliferylphosphat () Bis(4-Methylumbelliferylphosphat), () 3-O-Methylfluorescein, Flavon-3-), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz

Peroxidase Tyraminhydrochlorid (*),	Tyraminhydrochlorid (), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (), p-Hydroxyphenethylalkohol (), 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-Sulfonsäure) (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (), 3,3'-Dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
Meerrettichperoxidase	H₂O₂ + Diammoniumbenzidin H₂O₂ + Tetramethylbenzidin
β-D-Galaktosidase	o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid
Glukoseoxidase	ABTS, Glukose und Thiazolylblau

Schließlich ist es möglich, die Oligonukleotide so zu gestalten, dass an ihrem 5'- oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15–50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Oligonukleotid erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Oligonukleotide mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.

Insbesondere wird der enzymatische Marker aus einer Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, ausgewählt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Oligonukleotidkombination zum Nachweis von Mikroorganismen enthaltend mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehrere der genannten Oligonukleotide.

Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter einer Oligonukleotidkombination eine Zusammensetzung zu verstehen, die mindestens ein oder mehrere Oligonukleotide, beispielsweise in einer Lösung (z.B. einer Pufferlösung) oder Mischung (z.B. im lyophilisierten Zustand), enthält. Darüber hinaus können die Oligonukleotide auch von einander getrennt (z.B. in unterschiedlichen Gefäßen), nebeneinander (beispielsweise auf einem Chip oder in einem Kit) vorliegen.

Erfindungsgemäße Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen sind ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus

i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen, und
ii) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter i) zumindest in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94% der Nukleotide übereinstimmen, und
iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und ü) genannten Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und
iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide ermöglichen den spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Genera Corynebacterium, Peptostreptococcus sowie des Sporomusa-Taxons.

Folgende Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden ergeben sich erfindungsgemäß:
Beispielsweise ist die Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden jeweils aus einer der Gruppen i), ii) oder iii) darunter zu verstehen.

Die Kombinationen von ein oder mehreren Oligonukleotiden aus mindestens zwei der Gruppe, also z.B. aus Gruppe i) mit ein oder mehreren Oligonukleotiden aus der Gruppe ii), analog dazu auch solche aus der Gruppe i) mit iii) sowie ii) mit iii) sind erfindungsgemäß mit umfasst.

Ebenso sind die Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus allen Gruppen erfindungsgemäß möglich.

Die erfindungsgemäße Oligonukleotidkombination ist daher geeignet, eine Mikroorganismenspezies oder eine Mikroorganismengruppe nachzuweisen. Dazu werden beispielsweise zum Nachweis von bestimmten Spezies von Corynebacterium ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß i) ausgewählt.

Darüber hinaus kann aber vorteilhafterweise durch die geeignete Zusammenstellung der Oligonukleotidkombination (gemäß den o.g. Kombinationsmöglichkeiten) der Nachweis von Spezies und/oder Gruppen von Mikroorganismen der verschiedenen genannten Gattungen gleichzeitig und/oder nebeneinander durchgeführt werden. Beispielsweise kann mit einer geeigneten Oligonukleotidkombination der Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß i)) gleichzeitig und/oder nebeneinander zum Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Peptostreptococcus (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß iii)) stattfinden. Die möglichen Kombinationen können dadurch individuell an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden.

Wichtig für die Auswahl der Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen ist insbesondere, daß eine geeignete komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Geeignet ist eine Sequenz dann, wenn sie einerseits spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist und andererseits überhaupt zugänglich ist für das eindringende Oligonukleotid, also nicht etwa durch ribosomale Proteine oder rRNA-Sekundärstrukturen maskiert wird. Bereits Fuchs und Mitarbeiter (B. M. Fuchs, G. Wallner, W. Beisker, I. Schwippl, W. Ludwig, and R. Amann. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64 (12): 4973–4982.) konnten zeigen, dass eine Vielzahl von Oligonukleotiden, die aufgrund von Primärsequenzdaten entwickelt wurden, in einem in situ Hybridisierungsansatz nicht oder nur eingeschränkt verwendet werden können. Die Abdeckung von potentiellen Oligonukleotidbindungsstellen durch rRNA-Sekundärstrukturmotive beziehungsweise ribosomale Proteine wird als Begründung für das unbefriedigende Bindungsverhalten der genannten Oligonukleotide aufgeführt. Solche unzugänglichen Bereiche sind für jeden Organismus unterschiedlich und müssen für jeden Mikroorganismus neu erforscht werden. Daher erschließt sich die Sequenz für ein Oligonukleotid mit gutem Bindungsverhalten, auch für einen Fachmann, keineswegs aus der Primärsequenz der rRNA und kann folglich auch nicht über Consensus-Sequenz-Suchprogramme erschlossen werden.

Durch die erfinderische Auswahl einer definierten Sequenz kann eine Mikroorganismenart, eine Mikroorganismengattung oder eine Mikroorganismengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einem Oligonukleotid von 15 Nukleotiden über 100 % der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Oligonukleotidkombination:

i) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 1 bis 8 angegebenen Sequenz, und
b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und
c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und
d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. und/oder
ii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen aus dem Sporomusa-Taxon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 09 angegebenen Sequenz, und
b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und
c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und
d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. und/oder
iii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 10 bis 15 angegebenen Sequenzen, und
b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und
c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und
d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 01 bis 08 angegebenen Sequenzen.

Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. coyleiae, C. afermentans, C. „genitalium", C. mucifaciens, C. amycolatum, C. „tuberculostearicum" und C. riegelii.

Vorteilhafterweise werden folgende Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz von diesen Oligonukleotiden nicht erfasst: Clostridium acetobutylicum, Eubacterium yurii und Fusobacterium nucleatum. Ebenfalls nicht erfasst werden die folgenden Bakterien, welche zur Hautmikroflora gehören: Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter calcoaceticus und Streptococcus pyogenes. Dies ist ein besonderer Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 01 angegebenen Sequenz zum Nachwies von einer Gruppe von Mikroorgansimen aus der Gattung Corynebacterium eingesetzt, die von C. „tuberculostearicum bzw. der Gruppe um den Stamm mit der Bezeichnung CDC G5840 und solchen Mikroorganismen gebildet wird, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen. Darunter sind solche Mikroorganismen zu verstehen, die sehr eng mit dem Mikroorganismus verwandt sind bzw. deren rRNA ein hohes Maß an Identität aufweist und/oder insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt mit der rRNA der genannten Mikroorganismen vollständig oder nahezu vollständig (d.h. mit einer Abweichung von ein oder mehreren, bevorzugt ein bis drei Nukleotiden) übereinstimmen.

Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. „tuberculostearicum" und die Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. minutissimum, C. diphteriae, C. striatum, C. xerosis, C. „fastidiosum"; C. camporealensis, C. accolens und C. „pseudogenitalium" sowie C. afermentans, C. jeikeium, C. durum, C. mucifaciens, C. renale, C. riegelii, C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird für den spezifischen Nachweis von C. amycolatum und mit dieser Art eng verwandte Spezies die Sonde mit der unter SEQ ID NO. 02 angegebenen Sequenz eingesetzt. Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. amycolatum, und solche Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen, und die insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt der rRNA nur wenige, bevorzugt keine Fehlpaarungen aufweist. ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. „asperum", C. jeikeium, C. bovis, C. freneyi, C. afermentans, C. durum, C. matruchotii, C. mucifaciens, C. renale, C. glutamicum, und C. xerosis sowie C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. minutissimum, C. ammoniagenes, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. riegelii, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 03 angegebenen Sequenz zum Nachweis von bestimmten Spezies von Mikroorganismen, insbesondere der Gattung Corynebakterium eingesetzt, welche mit der unter Seq ID No 16 angegebenen Teilsequenz der 16 S rRNA zumindest in 60 %, bevorzugt in mindestens 70 %, besonders bevorzugt in mindestens 80 % und ganz besonders bevorzugt in mindestens 90%, beispielsweise mindestens 95 % der Nukleotide übereinstimmen. Ebenso sind davon solche Mikroorganismenspezies. umfasst, deren 16 S rRNA-Teilsequenz um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder deletiert sind.

Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise die angegebenen Spezies der Gattung Corynebacterium, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: „C. genitalium", C. mucifaciens, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. afermentans, C. pseudogenitalium und C. lipophiloflavum sowie C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 05 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. afermentans eingesetzt.

Diese Sonden detektieren vorteilhafterweise C. afermentans und solche Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine zu diesen Spezies sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. „genitalium", C. mucifaciens, C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. riegelii, C. thomssenii. C. pseudogenitalium und C. lipophiloflavum sowie C. amycolatum, C. jeikeium, C.

durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 07 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae und/oder „C. genitalium" eingesetzt Diese Sonden detektieren vorteilhafterweise C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae und „C. genitalium" sowie solcher Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine zu diesen Spezies sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. xerosis, C. jeikeium, C. urealyticum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. striatum, C. accolens, C. renale, C. ammoniagenes und C. kutscheri sowie C. glucuronolyticum, C. camporealensis, C. pseudotuberculosis, C. durum, C. minutissimum, C. lipophiloflavum, C. callunae und C. thomssenii.

Diese Oligonukleotide detektieren darüber hinaus ebenfalls folgende Mikroorganismen nicht, die zwar nicht zur Gattung Corynebacterium gehören, aber eine ähnliche rRNA aufweisen: Nanomurea fastidiosa, Micromonospora echinospora, Abiotropha elegans und Arcanobacterium pyogenes.

Besonders bevorzugt wird für den spezifischen Nachweis von C. riegelii die Sonde mit der unter SEQ ID NO. 08 angegebenen Sequenz eingesetzt.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 09 angegebenen Sequenz zum Nachweis von bestimmten Mikroorganismen des Sporomusa-Taxons, bevorzugt die eine Untergruppe des Sporomusa-Taxons bildenden Mikroorganismen der Gattungen Phascolarctobacterium und Acidaminococcus sowie solchen Mikroorganismen, die eine sehr ähnliche rRNA wie die genannten Mikroorganismen aufweisen, eingesetzt.

Das angegebene Oligonukleotid detektiert mindestens die Spezies Acidaminococcus fermentans, Phascolarctobacterium faecium sowie mit diesen eng verwandte Mikroorganismen mit sehr ähnlicher rRNA, aber nicht die folgenden Mikroorganismen: Veillonella spec. Halobacillus halophilus, Sporomusa paucivorans, Macrococcus caseolyticus, Anaeromusa acidaminophila, Halocella cellulosilytica, Peptostreptococcus anaerobius, Succiniclasticum ruminis und Succinispira mobilis.

Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Peptostreptococcus bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 10 bis 15 angegebenen Sequenzen.

Die unter dem Gattungsnamen „Peptostreptococcus" bekannten Bakterien können nach neuesten Erkenntnissen verschiedenen Untergruppen, nämlich den Gattungen Anaerococcus, Peptoniphilus bzw. Finegoldia, zugeordnet werden.

Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der zu dem Oberbegriff „Peptostreptococcus" gehörenden Gattungen Anaerococcus, Peptoniphilus bzw. Finegoldia: P. assaccharolyticus, P. lacrimalis, P. hareii, F. magnus, A. tetradius, A. hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, und A. vaginalis.

Vorteilhafterweise werden die nachfolgend genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zu den Peptostreptokokken gehören, nicht erfasst: Micromonas micros, Helcococcus kunzii, Helcococcus ovis.

Besonders bevorzugt sind die Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 10 und 11 angegebenen Sequenzen. Diese Oligonukleotide detektieren mindestens die folgenden Spezies der Gattung Peptoniphilus: Peptoniphilus assaccharolyticus, P. hareii, P. indolicus (insbesondere den Stamm ATCC 29427) sowie P, lacrimalis.

Dabei werden folgende Spezies mit ähnlicher rRNA von diesen Oligonukleotiden nicht nachgewiesen: Pseudomonas saccharophila, Variovorax paradoxus, Finegoldia magna, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Gallicola baranese, Atopobium parvulum, Veilonella dispar, Pseudomonas putida sowie Spezies der Gattungen Anaerococcus und Corynebacterium.

Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 12 angegebenen Sequenz. Dieses Oligonukleotid detektiert mindestens die Spezies Finegoldia magna sowie solche Mikroorganismen, die in ihrer rRNA-Sequenz dazu sehr ähnlich sind, während folgende Mikroorganismen gleichzeitig nicht nachgewiesen werden können: Anaerococcus hydrogenalis, Peptostreptococcus anaerobius, Peptoniphilus lacrimalis, Staphylococcus epidermidis, Halocella cellulosilytica, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Veilonella dispar, Pseudomonas putida sowie andere Spezies der Gattungen Anaerococcus, Corynebacterium sowie Peptoniphilus.

Besonders bevorzugt sind die Oligonukleotide mit der unter SEQ ID NO. 13–15 angegebenen Sequenzen. Diese Oligonukleotide detektieren jeweils mindestens die folgenden Spezies der Peptostreptokokken: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii, Anaerococcus tetradius und A. vaginalis.

Vorteilhafterweise werden die nachfolgend genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Peptostreptococcus gehören, nicht erfasst: Peptoniphilus lacrimalis, Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magnus sowie Ruminococcus productus, Brevibacterium epidermidis, Abiotropha elegans und Clostridium hastiforme.

Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 14 angegebenen Sequenz im erfindungsgemäßen Kit enthalten. Dieses Oligonukleotid detektiert mindestens die folgenden Spezies der unter den Gattungsbegriff „Peptostreptococcus" fallenden Mikroorganismen:, Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii und A. vaginalis.

In der folgenden Tabelle 2 sind die Sequenzen der Oligonukleotide mit der Bezugsnummer des Sequenzprotokolls zusammengefasst: Tabelle 2

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Oligonukleotidkombination zusätzlich mindestens ein Oligonukleotid zum Nachweis von anderen Mikroorganismenspezies, -gruppen oder -gattungen enthält.

Besonders geeignet ist eine Oligonukleotidkombination, die zusätzlich ein oder mehrere Oligonukleotide enthält, die eine größere Gruppe der nachzuweisenden Mikroorganismen detektieren kann. Beispielsweise kann es sinnvoll, zuerst solche Proben mit einer oder mehreren Sonden vorab zu identifizieren, die Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium enthalten, und anschließend die positiven Proben spezifisch auf einzelne Mikroorganismenspezies oder -gruppen innerhalb der Gattung Corynebacterium zu untersuchen. Oligonukleotide, die insbesondere auch in Kombination für den Nachweis von vielen verschiedenen Spezies der Gattung Corynebacterium, bevorzugt für den Nachweis der hautrelevanten Spezies der Gattung Corynebacterium, eingesetzt werden können, sind in der deutschen Patentanmeldung DE 10232776.9 offenbart Ebenso ist es bevorzugt, dass die Oligonukleotidkombination zusätzlich ein oder mehrere, weitere Oligonukleotide zum Nachweis von Spezies der Gattungen Staphylococcus, Veillonella, Malassezia und/oder Propionibacterium enthält. Vorteilhafterweise können dann verschiedene hautrelevanten Mikroorganismen gleichzeitig bzw. parallel in einer Probe, insbesondere in einem einzigen Prozeß bzw. Verfahren, nachgewiesen werden. Geeignet sind wiederum insbesondere solche Oligonukleotide, wie sie in der deutschen Patentanmeldung DE 10232776.9 offenbart sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren umfassend die folgenden Schritte:

a) Entnahme einer Probe
b) Fixierung der in der genommenen Probe enthaltenen Mikroorganismen
c) Inkubieren der fixierten Mikroorganismen mit mindestens einem Oligonukleotid, um eine Hybridisierung herbeizuführen
d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide und
e) Detektieren und ggf. Quantifizieren der mit den Oligonukleotiden hybridisierten Mikroorganismen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Fixieren" der Mikroorganismen eine Behandlung verstanden, mit der die Mikroorganismenhülle für Oligonukleotide durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Oligonukleotiden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung oder ähnliches.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die „Hybridisierung" die fixierten Zellen mit insbesondere fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden inkubiert. Diese können ggf. nach Penetration der Zellhülle sich an die dem Oligonukleotid entsprechende Zielsequenz binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.

Die Oligonukleotide werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer geeigneten Hybridisierungslösung eingesetzt. Geeignete Zusammensetzungen dieser Lösung sind dem Fachmann wohlbekannt. Eine solche Hybridisierungslösung enthält beispielsweise Formamid in einer Konzentration zwischen 0 % und 80 %, bevorzugt von 0–45 %, besonders bevorzugt von 20 % bis 40 % und hat z.B. eine Salzkonzentration (bei dem Salz handelt es sich bevorzugt um NaCl) zwischen 0,1 Mol/l und 1,5 Mol/l, bevorzugt zwischen 0,5 und 1,0 Mol/l, besonders bevorzugt 0,9 Mol/l. Weiterhin ist enthalten i.a. ein Detergens (i.d.R. SDS) in einer Konzentration zwischen 0,001 % und 0,2 %, bevorzugt 0,005 % bis 0,1 %, besonders bevorzugt von 0,01 %. Zum Puffern der Lösung ist eine geeignete Puffersubstanz (z.B. Tris-HCl, Na-Citrat, HEPES, PIPES o.a.) enthalten, üblicherweise in einer Konzentration zwischen 0,01 Mol/l und 0,1 Mol/l, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Mol/l bis 0,05 Mol/l, besonders bevorzugt von 0,02 Mol/l. Der pH-Wert der Hybridisierungslösung liegt in der Regel zwischen 6,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 7,0 und 8,0, besonders bevorzugt um 8,0.

Weitere Zusatzstoffe können zum Einsatz kommen, z.B. fragmentierte Lachsspermien-DNA oder Blocking-Reagenzien zur Verhinderung von Hintergrundrauschen der Hybridisierungsreaktion oder auch Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon oder Dextransulfat zur Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion. Des weiteren können auch Substanzen zugegeben werden, welche die DNA aller in der Probe enthaltenen lebenden und/oder Organismen anfärben (z.B. DAPI, 4',6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid). Solche Zusätze sind dem Fachmann sämtlich wohlbekannt und können in den bekannten und üblichen Konzentrationen zugegeben werden.

Die Konzentration des Oligonukleotids in der Hybridisierungslösung ist abhängig von der Art ihrer Markierung und der Anzahl der Zielstrukturen. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Anzahl der Oligonukleotide die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist zu bedenken, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Konzentration der Oligonukleotide sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5–500 ng/μl liegen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Konzentration beträgt 1–10 ng jedes verwendeten Oligonukleotids pro μl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt es zwischen 10 μl und 1000 μl, besonders bevorzugt beträgt es zwischen 20 μl und 40 μl.

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform können zusammen mit markierten Oligonukleotiden auch unmarkierte Oligonukleotide eingesetzt werden. Bevorzugt dient die Inkubation von Proben mit unmarkierten neben markierten Oligonukleotiden der Erhöhung der Spezifität der Sonden. Es ist beispielsweise möglich, nah verwandte Spezies von Mikroorganismen dadurch zu unterscheiden, dass für eine nicht nachzuweisende, mit einer nachzuweisenden Spezies nahe verwandte Mikroorganismenart ein Oligonukleotid eingesetzt wird, die unter den gewählten Bedingungen besser mit der Zielsequenz der rRNA hybridisiert als die markierte Sonde. Eine Kompetition von zwei oder mehr Oligonukleotiden um die Hybridisierung an die Zielsequenz führt dazu, dass die unmarkierte Sonde vorwiegend mit der rRNA des nicht nachzuweisenden Mikroorganismus hybridisiert. Eine Bindung der markierten Sonde und somit ein falsch-positives Ergebnis werden dadurch verhindert. Der spezifische Nachweis von bestimmten Mikroorganismenspezies oder Mikroorganismengruppen wird dadurch vor allem auch in Gegenwart eng verwandter Spezies mit einer sehr ähnlichen rRNA-Sequenz ermöglicht.

Beispielsweise ist es erfindungsgemäß geeignet, zusammen mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 3 das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 4 einzusetzen. Dabei wird bevorzugterweise das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 3 markiert und das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 4 unmarkiert eingesetzt. Somit kann die Mikroorganismenspezies, deren 16 S rRNA Sequenz die unter SEQ ID No. 16 angegebene Sequenz beinhaltet, problemlos nachgewiesen werden, ohne, dass C. afermentans gleichzeitig detektiert wird (vergleiche Analyseergebnis im Beispiel).

Ebenfalls kann es erfindungsgemäß geeignet sein, Oligonukleotide der SEQ ID No. 5 und 6 gemeinsam einzusetzen. Während das Oligonukleotid mit der SEQ ID No. 5 markiert als Sonde eingesetzt wird, um C. afermentans, C. ammoniagenes und/oder C. thomssenii zu detektieren, maskiert das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 6 die sehr ähnliche Zielsequenz der Mikroorganismenspezies, deren 16 S rRNA Sequenz die unter SEQ ID No. 16 angegebene Sequenz beinhaltet.

Weiterhin kann das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 8 als unmarkierter Kompetitor gemeinsam mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 7 eingesetzt werden. Damit gelingt der Nachweis der folgenden, sich im phylogenetischen Stammbaum nahestehenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. afermentans, C. genitalium, C. mucifaciens, C. coyleiae, ohne, dass gleichzeitig die Corynebacterium-Spezies C. riegelii, die eine sehr ähnliche rRNA aufweist, nachgewiesen wird.

Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44°C und 48°C, besonders bevorzugt 46°C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Oligonukleotiden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.

Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Oligonukleotide entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001–0,1 % eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01 % bevorzugt wird, sowie Tris-HCl oder eine andere geeignete Puffersubstanz in einer Konzentration von 0,001–0,1 Mol/l, bevorzugt 0,02 Mol/l, enthalten, wobei der pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise um 8,0 liegt. Das Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 Mol/l bis 0,9 Mol/l, bevorzugt von 0,01 Mol/l bis 0,9 Mol/l, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl-Konzentration von 0,07 Mol/l. Des weiteren kann die Waschlösung EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 Mol/l beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.

Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Oligonukleotide erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44°C bis 52°C, bevorzugt von 44°C bis 50°C und besonders bevorzugt bei 44°C bis 48°C für eine Dauer von 10–40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.

Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung des verwendeten Oligonukleotids möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u.a.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind vielfältig.

Ein besonderer Vorteil ist die Geschwindigkeit dieses Nachweisverfahrens. Während die traditionelle Kultivierung bis zu sieben Tage für den Nachweis benötigt, liegt das Ergebnis nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb von drei Stunden vor. Dies ermöglicht erstmals eine begleitende diagnostische Kontrolle der Wirkungen und unerwünschten Wirkungen einer angewandten Behandlung. Hier ist weiterhin vorteilhaft, dass das erfinderisch bereitgestellte Verfahren es ermöglicht, alle genannten Mikroorganismen gleichzeitig nachzuweisen, was einen weiteren Zeitvorteil bedeutet, da alle Schritte von der Probenahme bis zur Auswertung nur einmal durchgeführt werden müssen.

Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen.

Ein weiterer Vorteil ist die Tatsache, dass durch die erfinderisch bereitgestellten Oligonukleotide nunmehr erstmals auch solche Mikroorganismen beispielsweise der Hautmikroflora nachgewiesen werden können, die von den traditionellen Nachweisverfahren bislang nicht erfasst wurden. Dabei können je nach Spezifität des Oligonukleotids bzw. der verwendeten Oligonukleotide unterschiedlichste Gruppen von Mikroorganismen detektiert werden. Es ist einerseits möglich große Gruppen von Mikroorganismen, aber auch kleinere Untergruppen, die eine enge Verwandtschaft aufweisen, und sogar einzelne Spezies spezifisch, neben anderen, auch nahe verwandten Mikroorganismenspezies nachzuweisen.

Weiterhin ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, im Falle des positiven Signals, über die Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde, eine Einordnung von unbekannten Mikroorganismenspezies in den phylogenetischen Stammbaum vorzunehmen oder solche Zuordnungen, die aufgrund von biochemischen Nachweisen vorgenommen wurde, zu bestätigen.

Ein weiterer Vorteil ist die hohe Spezifität der Oligonukleotide. Es können sowohl spezifisch bestimmte Gattungen oder Gruppen von Mikroorganismen nachgewiesen werden als auch hochspezifisch einzelne Spezies einer Gattung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe in Schritt a) des Verfahrens gewonnen

i) von der Hautoberfläche,
ii) aus Lebensmitteln,
iii) aus der Umwelt, insbesondere aus Wasser, Boden oder Luft,
iv) aus Abwasser oder aus einem Biofilm,
v) aus medizinischem Untersuchungsmaterial, oder
vi) aus einem pharmazeutischen oder kosmetischen Produkt.

Im Rahmen dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe von der Hautoberfläche durch die Ablösung von Mikroorganismen der Hautflora mittels einer Detergenslösung vom zu untersuchenden Areal gewonnen.

Ein wesentlicher Vorteil besteht beispielsweise darin, dass nun erstmals der gleichzeitige Nachweis dieser medizinisch und kosmetisch relevanten Mikroorganismen der Hautmikroflora möglich ist. So können durch Verwendung unterschiedlicher Marker für die Oligonukleotide ganz nach Bedarf alle, mehrere oder einzelne Mikroorganismengruppen oder -spezies parallel nachgewiesen und dabei klar voneinander unterschieden werden. Auch können so erstmals die Populationsverhältnisse dieser Mikroorganismengruppen oder -spezies und die zwischen ihnen bestehenden Wechselwirkungen analysiert werden. Dies eröffnet erstmals die Möglichkeit zur eindeutigen Diagnose und gezielten Behandlung von medizinisch und/oder kosmetisch relevanten Hautproblemen. Es ist nun erstmals möglich, die Auswirkungen einer medizinischen Therapie oder kosmetischen Behandlung auf die Gesamtmikroflora der Haut zu erfassen. Mögliche Wirkungen ebenso wie unerwünschte Wirkungen einer Behandlung können so früh erkannt und in der weiteren Behandlung verstärkt bzw. unterbunden werden.

Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen. Erstmalig können somit Erkenntnisse bezüglich der absoluten und relativen quantitativen Verhältnisse der genannten Mikroorganismen der Hautmikroflora gewonnen werden. Dies ermöglicht vor, während und nach einer medizinischen oder kosmetischen Behandlung die Überprüfung des Erfolgs sowie aller Auswirkungen dieser Behandlung. In diesem Zusammenhang ist weiterhin von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausschließlich lebende Mikroorganismen erfasst.

Bei der Probennahme von der Haut des Probanden wird die Haut in Kontakt mit einer Detergenslösung gebracht, die die Ablösung der Mikroorganismen von der Hautoberfläche erleichtern soll. Bevorzugt werden physiologisch unbedenkliche Detergenzien, wie z. B. Tween oder Triton, in Konzentrationen von etwa 0,01–1 Gew.-% eingesetzt. Ein pH-Wert zwischen 5 und 10, insbesondere zwischen 7 und 9, z. B. 8, hat sich als günstig erwiesen.

Um eine bessere Ablösung der Mikroorganismen zu erreichen, wird die Hautoberfläche mit Hilfe eines Schabeinstrumentes abgerieben. Es eignen sich dabei Stäbe unterschiedlicher Dicke, z. B. mit einem Durchmesser von 0,05 bis 1,5 cm, aus unterschiedlichen Materialien wie beispielsweise Glas, Metall oder Plastik. Ebenso sind Spatel aus den genannten Materialien mit einer abgerundeten Fläche geeignet. Bevorzugt finden Glasstäbe zwischen 0,4 und 0,8 cm Durchmesser oder Plastikspatel Verwendung. Ebenfalls günstig eingesetzt werden können beispielsweise Mundstücke von Glaspipetten, z. B. einer 5 ml Glaspipette. Als besonders geeignet hat es sich erwiesen, rauere Oberflächen über die Haut zu reiben, um die Ablösung zu erhöhen.

Insbesondere geeignet sind Plastikspatel mit rauer Oberfläche, beispielsweise ein Probenahmespatel aus Polyamid glasfaserverstärkt der Fa. Merck (Art. Nr. 231J2412, Doppelspatel, Länge 180 mm). Ebenfalls erfindungsgemäß geeignet sind Abreibungen mit Tupfern sowie die Probengewinnung durch Abklatschen mit viskoseren Medien oder auch Hautabrisse mit Klebefilmen (beispielsweise handelsübliche Haushaltsklebestreifen). Die Mikroorganismen können bei diesen Methoden beispielsweise durch Abwaschen mit einer entsprechenden Pufferlösung von diesen Gegenständen gewonnen werden. Das weitere Verfahren kann auch direkt auf dem Klebestreifen durchgeführt werden.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren auch bei der Kontrolle von Lebensmitteln angewendet. Insbesondere werden die Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt, Käse, Quark, Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren oder Fleischwaren entnommen.

Des weiteren können beispielsweise Umweltproben mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auf das Vorhandensein von Mikroorganismen untersucht werden. Diese Proben können hierzu aus Luft, Wasser oder aus dem Boden entnommen sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung medizinischer Proben eingesetzt werden. Es ist für die Untersuchung von Gewebeproben, z.B. Biopsiematerial aus der Lunge, Tumor- oder entzündliches Gewebe, aus Sekreten wie Schweiß, Speichel, Sperma und Ausfluss aus der Nase, Harnröhre oder Vagina sowie für Urin- oder Stuhlproben geeignet.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für das vorliegende Verfahren ist die Untersuchung von Abwässern, z.B. Belebtschlamm, Faulschlamm oder anaeroben Schlamm. Darüber hinaus ist es geeignet, Biofilme in industriellen Anlagen zu analysieren, sowie auch sich natürlicherweise bildende Biofilme oder bei der Abwasserreinigung bildende Biofilme zu untersuchen.

Auch die Untersuchung pharmazeutischer und kosmetischer Produkte, z.B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte etc. z.B. auf Kontamination mit Mikroorganismen ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Fixierung durch

i) denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen,
ii) quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, oder
iii) als Hitzefixierung

Insbesondere können die Mikroorganismen nach dem Fixieren auf einem Träger immobilisiert werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die fixierten Zellen der Mikroorganismen vor Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens permeabilisiert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Permeabilisierung" eine enzymatische Behandlung der Zellen verstanden. Durch diese Behandlung wird die Zellwand von Pilzen und gram-positiven Bakterien für die Oligonukleotide durchlässig gemacht. Hierfür geeignete Enzyme, deren geeignete Konzentrationen und für diese geeignete Lösungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Es versteht sich von selbst, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Analyse gram-negativer Bakterien geeignet ist; die enzymatische Behandlung zur Permeabilisierung wird dann entsprechend adaptiert, es kann auf diese dann auch ganz verzichtet werden.

Die Permeabilisierung der Zellen vor der Hybridisierung hat den Vorteil, dass die Oligonukleotide zwar in die Zellen eindringen können, die Ribosomen und somit die rRNA aber nicht aus den Zellen entweichen kann. Der große Vorteil dieser Technik der Ganzzellhybridisierung ist, dass die Morphologie der Bakterien intakt bleibt und man diese intakten Bakterien in situ, also in ihrem natürlichen Umfeld detektieren kann. Folglich können die Bakterien nicht nur quantifiziert werden, sondern auch eventuelle Assoziationen zwischen verschiedenen bakteriellen Gruppen nachgewiesen werden.

Ganz besonders bevorzugt kann die Permeabilisierung durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K, Pronase und Mutanoiysin erfolgen.

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein als Positivkontrolle geeignetes Oligonukleotid bereit gestellt. Ein solches Oligonukleotid ist dadurch gekennzeichnet, dass es möglichst viele, optimalerweise alle in der analysierten Probe enthaltenen Bakterien bzw. Eurkaryonten erfasst. Hierzu ist beispielsweise das von Amann et al., (1990) beschriebene Oligonukleotid EUB338 (Bakterien) bzw. das Oligonukleotid EUK (Eukaryonten) geeignet. Eine solche Positivkontrolle kann zur Überprüfung der ordnungsgemäßen Durchführung des angewendeten Verfahrens eingesetzt werden. Vor allem aber erlaubt sie die Bestimmung eines prozentualen Anteils der spezifisch nachgewiesenen Mikroorganismen gegenüber der Bakteriengesamtpopulation.

Bereitgestellt wird weiterhin ein Kit zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dieser Kit enthält als wichtigste Bestandteile die jeweiligen Hybridisierungslösungen mit den oben beschriebenen jeweils für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotiden. Weiterhin ist kann enthalten sein eine entsprechende Hybridisierungslösung ohne Oligonukleotide sowie die entsprechende Waschlösung oder ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung. Weiterhin können gegebenenfalls enthalten sein Enzymlösungen, Fixierungslösungen sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung. Gegebenenfalls sind Hybridisierungslösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle sowie einer Negativkontrolle (beispielsweise ohne oder mit nicht-hybridisierenden Oligonukleotiden) enthalten.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird das Kit zum Nachweis von Mikroorganismen der Hautmikroflora verwendet. So ist die Verwendung des Kits bei der Wirkstoffsuche, bei der Analyse der Mikroflora der Haut sowie bei der Testung der Wirkung von wirkstoffhaltigen Kosmetika vorteilhaft. Die Untersuchung von Proben sowohl von menschlicher als auch von tierischer Haut kann mit den erfindungsgemäßen Kits effizient und auch gegen einen hohen Hintergrund von anderen Mikroorganismen erfolgen.

Das folgende Beispiel soll die Endung beschreiben, ohne sie einzuschränken:
Nachweis von Mikroorganismen der Hautmikroflora
Probenahme:
Die Probenahme erfolgt mittels der Detergens-Waschmethode ((P. Williamson, A.M. Kligman. (1965) J. Invest. Derm., Vol. 45, No. 6).
Durchführung:

1. Der beidseitig offene Kunststoffzylinder wird mit der nicht beschädigten Seite auf die zu untersuchende Hautoberfläche gedrückt und mit 1,5 ml der Detergenslösung (eine physiologische Tween-Pufferlösung, pH 8,0 mit 0,523 KH₂PO₄ g/Liter, 16,73 KH₂PO₄ g/Liter, 8,50 NaCl g/Liter, 10,00 Tween 80 g/Liter und 1,00 Trypton g/Liter) gefüllt.
2. Mit einem der o.g. Schabegeräte wird die zu behandelnde Fläche 6x horizontal und 6x vertikal unter leichtem Druck abgerieben.
3. Die Prozedur wird nach Absaugen der Flüssigkeit wiederholt.

Die beiden Flüssigkeiten werden vereinigt. Ein Teil der Probe aus den beiden vereinigten Flüssigkeiten wird für den anschließenden Nachweis unter Verwendung von Oligonukleotiden verwendet, ein anderer Teil wird für den als Kontrolle dienenden, parallel durchgeführten Nachweis durch Kultivierung der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen verwendet.
Zum Ansetzen der Detergenslösung soll keimfreies Wasser (z. B. Millipore-Wasser) eingesetzt werden.
Fixierung:
Die entnommene Probe wird sodann mit einem Volumen absolutem Ethanol versetzt und zentrifugiert (Raumtemperatur, 8.000 U/min, 5 Minuten). Der Überstand wird verworfen und das Pellet in einem Volumen 1 × PBS-Lösung gewaschen. Abschließend wird das Pellet in 1/10 Volumen Fixierungslösung (50 % Ethanol) resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
Ein Aliquot der Zellsuspension wird auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken). Anschließend werden die Zellen vollständig dehydratisiert durch Aufbringen einer weiteren Fixierungslösung (Ethanol absolut) und erneut getrocknet (46°C, 3 min oder bis vollständig trocken).
Permeabilisierung:
Anschließend wird ein geeignetes Volumen einer geeigneten Enzymlösung aufgebracht und die Probe inkubiert (Raumtemperatur, 15 min). Dieser Schritt wird ggf. mit einer weiteren geeigneten Enzymlösung wiederholt.
Die Permeabilisierungslösung wird mit destilliertem Wasser entfernt und die Probe erneut vollständig getrocknet (Inkubation bei 46°C bis vollständig trocken). Anschließend werden die Zellen erneut vollständig dehydratisiert durch Aufbringen der Fixierungslösung (Ethanol absolut) und erneut getrocknet (46°C, 3 min oder bis vollständig trocken).
Hybridisierung:
Anschließend wird auf die fixierten, vollständig aufgeschlossenen und dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotide aufgebracht. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungslösung (ohne Oligonukleotide) befeuchteten Kammer (46°C, 90 min).
Waschen:
Anschließend wird der Objektträger in eine mit Waschlösung befüllte Kammer eingetaucht und inkubiert (46°C, 15 min).
Anschließend wird der Objektträger in eine mit destilliertem Wasser befüllte Kammer kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken).
Detektion:
Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Einbettmedium eingebettet. Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.
Analysenergebnis:
Von einer weiblichen Probandin wurde eine Mikroorganismen-Probe von der Haut mittels der oben beschriebenen Methode zur Probennahme genommen.
Aus einem Teil der Probe wurde ein Teil der 16 S rRNA-Sequenz eines Mikroorganismus isoliert, deren Sequenz noch nicht bekannt war, die sich aber der Gattung Corynebacterium zuordnen läßt. Diese Sequenz, anhand derer eine entsprechende Sonde (gemäß SEQ ID No. 03) entwickelt wurde, die diesen Mikroorganismus nachweisen kann, ist unter SEQ ID No. 16 im Sequenzprotokoll angegeben.
Ein weiterer Teil der Probe wurde mit der früher beschriebenen bakterienspezifischen Sonde EUB und mit den in der DE 102 32 776.9 beschriebenen Sonde für Corynebakterien (Sondengemisch zum Nachweis der hautrelevanten Corynebakterien, SEQ ID No. 07 bis 11, DE 102 32 776.9 ) hybridisiert.
Es wurde ein hoher Anteil an Corynebakterien durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der Gesamtzellzahl, die von der bakterienspezifischen Sonde erfasst worden war, festgestellt (ca. 73%).
Von den Corynebakterien dieser Probe hybridisierte ein kleiner Anteil von etwa 5% mit dem markierten Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 03, was durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der zuvor detektierten Corynebakterienzahl ermittelt werden konnte, wobei das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 4 gleichzeitg unmarkiert als Kompetitor mitzugesetzt wurde.
SEQUENCE LISTING

Claims

Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen, und ii) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter i) in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94% der Nukleotide übereinstimmen, und iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und ii) genannten Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus den Gattungen Corynebacterium, Peptostreptococcus und des Sporomusa-Taxons.
Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Oligonukleotid einen detektierbaren Marker trägt, der insbesondere kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 3, wobei der detektierbare Marker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus a) Fluoreszenzmarker, b) Chemolumineszenzmarker, c) radioaktiver Marker, d) enzymatisch aktive Gruppe, e) Hapten, f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäure.
Oligonukleotid nach Anspruch 4, wobei der enzymatische Marker aus einer Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, ausgewählt wird.
Oligonukleotidkombination zum Nachweis von Mikroorganismen enthaltend mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehrere Oligonukleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend i) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 1 bis 8 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. und/oder ü) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen aus dem Sporomusa-Taxon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 09 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. und/oder iii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 10 bis 15 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 1 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 5 bis 7, enthaltend ein, mehrere oder alle Oligonukleotide mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen.
Oligonukleotidkombination nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismenspezies, -gruppen oder -gattungen enthält.
Oligonukleotidkombination nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere Oligonukleotide zum Nachweis von Mikroorganismen der Gattungen Veillonella, Malassezia, Propionibacterium und/oder Staphylococcus enthält.
Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen insbesondere der Gattungen Corynebacterium, Peptostreptococcus oder des Sporomusa-Taxons durch in-situ-Hybridisierung, umfassend die folgenden Schritte: a) Entnahme einer Probe b) Fixierung der in der genommenen Probe enthaltenen Mikroorganismen c) Inkubieren der fixierten Mikroorganismen mit mindestens einem Oligonukleotid oder einer Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, um eine Hybridisierung herbeizuführen d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide e) Detektieren und ggf. Quantifizieren der mit den Oligonukleotiden hybridisierten Mikroorganismen.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Probe in a) gewonnen wird i) von der Hautoberfläche, ii) aus Lebensmitteln, iii) aus der Umwelt, insbesondere aus Wasser, Boden oder Luft, iv) aus Abwässern oder aus einem Biofilm, v) aus medizinischem Untersuchungsmaterial, oder vi) aus einem pharmazeutischen oder kosmetischen Produkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei die Fixierung durch i) denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen erfolgt, ii) quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd erfolgt, iii) wobei die Fixierung als Hitzefixierung erfolgt
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Mikroorganismen nach dem Fixieren auf einem Träger immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Mikroorganismen vor der Hybridisierung permeabilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Permeabilisierung erfolgt durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K, Pronase und Mutanolysin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig neben markierten Oligonukleotiden unmarkierte Oligonukleotide eingesetzt werden.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 17, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, vorzugsweise eine Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 6 bis 10.
Kit nach Anspruch 18, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine Hybrisierungslösung ohne Oligonukleotide enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Waschlösung oder ein Konzentrat der Waschlösung enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Permeabilisierungslösung enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Fixierungslösung enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Positivkontrolllösung enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei der Kit zusätzlich mindestens eine geeignete Negativkontrolllösung enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei der Kit zusätzlich eine Einbettlösung enthalt.
Verwendung i) eines Oligonukleotids oder einer Oligonukleotidkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10 ii) eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 17 und/oder iii) eines Kits nach einem der Ansprüche 18 bis 25 zum Nachweis und/oder der Quantifizierung von Mikroorganismen.