DE10296942T5

DE10296942T5 - Therapeutische Zusammensetzung, welche die Immunitätsreaktion verändert

Info

Publication number: DE10296942T5
Application number: DE10296942T
Authority: DE
Inventors: Birgit C. Arlington Schultes; Christopher F. Charlestown Nicodemus
Original assignee: ALTAREX CORP EDMONTON; Altarex Corp
Current assignee: Altarex Medical Corp
Priority date: 2001-03-21
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2004-11-18
Also published as: GB2390811B; CA2441393A1; GB2390811A; GB0324503D0; AU2002335932B2; WO2002076384A2; ES2293751B1; ES2293751A1; US20050031619A1; WO2002076384A3

Abstract

Verfahren zum Verlängern des Überlebens eines Krebspatienten, umfassend:
Identifizieren eines Patienten, welcher CA125-Gehalte von etwa 35 Einheiten/ml oder weniger aufweist, und
dem Patienten einen xenogenen, für CA125-Antigen spezifischen Antikörper verabreichen.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, welche einen erhöhten, therapeutischen Effekt haben, in dem sie die Immunogenität der aktiven Komponente verändern, ohne die Antigenität der aktiven Komponente zu verringern. Typischerweise wird ein vorteilhafter, therapeutischer Effekt abgeleitet davon, dass der Zustand des Immunsystems verändert wird, und für einige Ausführungen der Erfindung, z.B. Krebsimmunotherapie, wird Immunogenität induziert, aktiviert oder erhöht. Die Erfindung betrifft auch Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren einer Immunitätsreaktion eines Wirts, insbesondere zur Behandlung von Krebs. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwenden Bindungsmittel, wie etwa Antikörper, um eine Immunitätsreaktion auf ein vorbestimmtes Antigen zu erzeugen.
Technischer Hintergrund
In Wirbeltieren kooperieren die Mechanismen von natürlicher und spezifischer Immunität innerhalb eines Systems von Wirtsabwehr, dem Immunsystem, um fremde Eindringlinge zu eliminieren. Die Hypothese, dass das Immunsystem fähig sein sollte, Tumore zu erkennen und daher im Kampf gegen Krebs eingesetzt werden könnte, war eine Triebkraft hinter außergewöhnlichen Bemühungen vieler Immunologen. Dieser Ansatz ist attraktiv aufgrund der einzigartigen Fähigkeiten des Immunsystems, spezifisch betroffene Zellen zu zerstören, während normales Gewebe zumeist verschont wird. Außerdem ist bekannt, dass die anfängliche Immunitätsreaktion ein Langzeitgedächtnis hinterlässt, das dazu dient, vor der gleichen Krankheit in der Zukunft zu schützen. Keine medikamentöse Behandlung von Krebs kann solche Spezifität oder Gedächtnis für sich beanspruchen. Eine immunotherapeutische Strategie für die Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten oder Zuständen beinhaltet, dass eine oder mehrere Komponenten des Immunsystems eine komplexe Kaskade biologischer Reaktionen auslöst mit Schwerpunkt auf der Eliminierung eines fremden Moleküls vom Wirt. Wirbeltiere haben zwei breite Klassen von Immunitätsreaktionen: Antikörperreaktionen oder humorale Immunität oder zellenvermittelte Immunitätsreaktionen oder zelluläre Immunität.
Humorale Immunität wird durch B-Lymphocyten bereitgestellt, welche nach Proliferation und Differentiation Antikörper produzieren (Proteine, welche auch als Immunoglobuline bekannt sind), welche in Blut und Lymphflüssigkeit zirkulieren. Diese Antikörper binden spezifisch an das Antigen, das sie induziert hat. Bindung durch den Antikörper inaktiviert die fremde Substanz, z.B. ein Virus, durch Blockierung der Fähigkeit der Substanz, an Rezeptoren auf einer Zielzelle zu binden oder durch Anziehung von Komplementen oder Killerzellen, die den Virus angreifen. Die humorale Reaktion stellt primär Abwehr gegen die extrazellulären Phasen von bakteriellen und viralen Infektionen bereit. Bei humoraler Immunität kann Serum allein die Reaktion transferieren, und die Effektoren der Reaktion sind Proteinmoleküle, typischerweise löslich, genannt Antikörper. Lymphocyten produzieren diese Antikörper und bestimmen dadurch die Spezifität der Immunität; es ist diese Reaktion, welche die Effektorglieder des Immunsystems ordnet. Zellen und Proteine, wie etwa Antikörper, welche mit Lymphocyten interagieren, spielen kritische Rollen bei sowohl der Präsentation von Antigen als auch bei der Übermittlung immunologischer Funktionen.
Individuelle Lymphocyten reagieren auf einen begrenzten Satz strukturell verwandter Antigene. Wie in größerem Detail später dargestellt, ist diese Funktion strukturell definiert durch die Gegenwart von Rezeptoren auf der Oberflächenmembran des Lymphocyten, welche spezifisch für Bindungsstellen (Determinanten oder Epitope) auf dem Antigen sind.
Lymphocyten unterscheiden sich voneinander nicht nur in der Spezifität ihrer Rezeptoren, sondern auch in ihren Funktionen. Eine Klasse von Lymphocyten, B-Zellen, sind Präkursoren von Antikörper ausscheidenden Zellen und fungieren als Vermittler der humoralen Immunitätsreaktion.
Eine weitere Klasse von Lymphocyten, T-Zellen, nehmen wichtige Regulationsfunktionen wahr und sind Vermittler der zellulären Immunitätsreaktion. Die zweite Klasse von Immunitätsreaktionen, zelluläre Immunität, umfasst die Produktion von spezialisierten Zellen, z.B. T-Lymphocyten, welche mit fremden Antigenen auf der Oberfläche von anderen Wirtszellen reagieren. Die zelluläre Immunitätsreaktion ist besonders effektiv gegen Pilze, Parasiten, intrazelluläre virale Infektionen, Krebszellen und andere Fremdstoffe. Tatsächlich spielt die Mehrheit der T-Lymphocyten eine regulierende Rolle in der Immunität, wobei sie dahingehend wirken, die Reaktionen anderer weißer Blutzellen zu verstärken oder zu unterdrücken. Diese Zellen, genannt Helfer-T-Zellen und Suppressor-T-Zellen, werden kollektiv als regulierende Zellen bezeichnet. Andere T-Lymphocyten, genannt cytotoxische T-Zellen, töten z.B. virusinfizierte Zellen oder Tumorzellen. Sowohl cytotoxische T-Zellen als auch B-Lymphocyten sind direkt in der Verteidigung gegen Infektionen involviert und werden kollektiv als Effektorzellen bezeichnet. Es gibt eine Anzahl von intrazellulären Signalen, welche für die T-Zellenaktivierung wichtig sind. Unter normalen Umständen zersetzt sich ein Antigen oder wird gespalten, um so Antigenfragmente oder Peptide auszubilden. Antigenfragmenten T-Zellen zu präsentieren, ist die prinzipielle Funktion von MHC-Molekülen, und die Zellen, welche diese Funktion ausüben, werden Antigen-präsentierende Zellen (APC: einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen).
Der zeitliche Ablauf einer Immunitätsreaktion ist weiter unterteilt in die kognitive oder Erkennungsphase, während welcher spezifische Lymphocyten das fremde Antigen erkennen; die Aktivierungsphase, während welcher spezifische Lymphocyten auf das fremde Antigen reagieren, und die Effektorphase, während welcher Antigen-aktivierte Lymphocyten die Prozesse vermitteln, welche notwendig sind, um die Antigen-tragenden Zielzellen zu eliminieren. Lymphocyten sind Immunzellen, die darauf spezialisiert sind, spezifische Immunitätsreaktionen zu vermitteln und zu steuern. T-Zellen und B-Zellen werden erst morphologisch unterschiedlich, wenn sie durch ein Antigen stimuliert wurden.
Der Einfang und die Verarbeitung eines Antigens durch APCs ist essentiell für die Induktion einer spezifischen Immunitätsreaktion. APCs fangen Antigene durch spezifische Rezeptoren ein, wie etwa Fc-Rezeptoren oder Mannose-Rezeptoren, oder die APCs nicht spezifisch Antigen phagocytieren. Der Einfang durch spezifische Rezeptoren ist effizienter; Antigene können besser präsentiert, wenn sie z.B. mit einem Antikörper komplexiert sind. Ein solcher Komplex kann dadurch gebildet werden, dass ein Antikörper zu einem zirkulierenden Antigen (z.B. PSA oder CA125) injiziert wird, und die Immunkomplexe können auf dendritischen Zellen und Makrophagen durch die Fc-Rezeptoren angesetzt werden, welche auf diesen Zellen vorhanden sind. Die hohe Anzahl von Fc-Rezeptoren auf Neutrophilen kann diesen Prozess jedoch wesentlich limitieren.
Immunotherapie basiert auf dem Prinzip der Induktion oder Aktivierung des Immunsystems, unerwünschte Zellen, wie etwa neoplastische Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Die Schlüsselelemente in jeder Immunotherapie sind, das Wirtsimmunsystem zu induzieren oder zu veranlassen, erst ein Molekül als ein unerwünschtes Ziel zu erkennen, und dann das System zu induzieren, eine Reaktion gegen dieses Molekül zu initiieren. In gesunden Wirten erkennt das Immunsystem Oberflächenmerkmale eines Moleküls, welches nicht ein normaler Bestandteil des Wirts ist (d.h. dem Wirt fremd ist). Wenn die Erkennungsfunktion einmal ausgelöst ist, muss der Wirt dann eine Reaktion gegen dieses besondere, fremde Molekül richten.
Sowohl das Erkennungs- als auch das Reaktionselement des Immunsystems involviert eine hochkomplexe Kaskade biologischer Reaktionen. In den meisten immunologisch begründeten Störungen ist wenigstens einer der Schritte in der Erkennungsphase oder wenigstens einer der Schritte in der Reaktionsphase gestört. Praktisch jede Störung in jedem dieser komplexen Wege führt zu einer verringerten Reaktion oder zum Fehlen jeglicher Reaktion. Die Unfähigkeit des Immunsystems, einen wachsenden Tumor zu zerstören, wurde, unter anderen Faktoren, der Gegenwart von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) zugerechnet, welche immunologische Toleranz und/oder Immununosuppression induzieren. In einigen Arten von Krebs z.B. bringt der Krebs den Wirt durch einen Trick dazu, die fremde Krebszelle als einen normalen Bestandteil zu akzeptieren, und stört so die Erkennungsphase des Immunsystems. Ein immunologischer Ansatz zur Krebstherapie umfasst Modifizierung der Wirt-Tumor-Beziehung, so dass das Immunsystem induziert wird oder seine Reaktion auf die TAAs verstärkt. Bei Erfolg kann Induktion oder Amplifikation des Immunsystems zu Tumorrückgang, Tumorabstoßung und gelegentlich zur Heilung des Tumors führen.
Antigenität und Immunogenität
Wie hierin verwendet, wird das Antigen dann als antigenisch bezeichnet, wenn ein Bindungsmittel ein Antigen erkennen kann, d.h. an ein Antigen binden oder mit diesem interagieren kann. Wenn das Immunsystem auch eine aktive Reaktion gegen das Antigen aufbringen kann, wird ein Komplex, welcher das Antigen enthält, ein Teil des Komplexes oder das Bindungsmittel selbst als immunogen, d.h. als Immunitätsreaktion auslösend bezeichnet.
Die herkömmliche Definition eines Antigens ist eine Substanz (wie etwa ein Antikörper oder ein Antigen), welche in einem Wirbeltierwirt die Bildung eines spezifischen Antikörpers oder die Generierung einer spezifischen Population von Lymphocyten hervorrufen kann, welche mit der Substanz reaktiv sind. Wie es in der Wissenschaft jedoch häufig geschieht, ist es jetzt bekannt, dass diese Definition unvollständig, wenn auch zutreffend, ist. Es ist z.B. jetzt bekannt, dass auch einige Krankheitszustände die Immunitätsreaktion des Wirts unterdrücken oder inaktivieren, und die Substanz, von welcher erwartet würde, dass sie einen Antikörper hervorruft oder spezifische Lymphocyten generiert, dies nicht tut. Daher sind nicht alle Antigene fähig, eine menschliche Immunitätsreaktion auszulösen.
Typischerweise basiert die Fähigkeit des Antikörpers, das Antigen zu binden, auf hochkomplementären Strukturen. Das heißt, die Gestalt des Antikörpers muß Strukturen enthalten, welche von den Strukturen auf dem Antigen komplementär sind. Der Teil des Antigens, an welchen ein Antikörper bindet, wird die "antigene Determinante" oder "Epitop" genannt. Daher sind Antigene Moleküle, welche ein oder mehr Epitope tragen, welche durch spezifische Rezeptoren in einem Immunsystem erkannt werden können; eine Eigenschaft, welche als Antigenität bezeichnet wird.
Immunogenität bezeichnet die Eigenschaft, das Immunsystem zu stimulieren, um eine spezifische Reaktion hervorzurufen. Daher sind alle Immunogene Antigene; nicht jedoch umgekehrt. Obwohl ein Immunsystem ein Antigen erkennen kann (z.B. an einen T- oder B-Zellen-Rezeptor bindet), reagiert es nicht auf das Antigen, wenn nicht das Antigen oder ein Antigen-enthaltender Komplex auch eine Immunitätsreaktion auslösend ist.
Eine Immunitätsreaktion auf ein spezielles Antigen wird wesentlich beeinflusst durch die Struktur und Aktivität des Antigens selbst sowie vielfältigen anderen Faktoren. In einigen Fällen ist das Immunsystem nicht fähig, eine Immunitätsreaktion auf ein spezielles Antigen hervorzurufen; ein Zustand, welcher als Toleranz bezeichnet wird.
Beim Beeinflussen, ob ein Antigen immunogen oder immunotolerant ist, ist eine wichtige Eigenschaft des Antigens der Grad an Unterschied zwischen dem Antigen und ähnlichen Molekülen innerhalb des Wirts. Am meisten immunogene Antigene sind diejenigen, welche keine Homologen in dem Wirt haben, d.h. solche, die am meisten "fremd" sind. Andere Faktoren, welche Immunogenität fördern, umfassen höheres Molekulargewicht, größere molekulare Komplexität, den richtigen Antigendosisbereich, die Art (Route) der Verabreichung, das Alter des Wirts und die genetische Zusammensetzung des Wirts (einschließlich des Antigens während der Fötusentwicklung ausgesetzt sein).
Wie bereits oben angesprochen, können Antigene ein oder mehrere Epitope oder Bindungsstellen haben, welche durch spezifische Rezeptoren des Immunsystems erkannt werden. Epitope können durch die primäre Struktur eines Moleküls (genannt ein sequentielles Epitop) gebildet werden oder können durch Teile des Moleküls ausgebildet werden, welche getrennt von der Primärstruktur sind und in der sekundären oder tertiären Struktur des Moleküls nebeneinander liegen (genannt ein Konformationsepitop). Einige Epitope, z.B. verborgene Epitope (cryptic epitopes) sind in der dreidimensionalen Struktur des nativen Antigens versteckt und lösen erst eine Immunitätsreaktion aus, nachdem eine Konformationsänderung im Antigen Zugang zum Epitop durch die speziellen Rezeptoren des Immunsystems bereitstellt. Einige Antigene, z.B. Tumor-assoziierte Antigene, wie etwa Eierstockkrebs- oder Brustkrebsantigene haben multiple Antikörper-Bindungsstellen. Diese Antigene werden "multi-epitopische" Antigene genannt.
Ein wichtiges Merkmal und eine wichtige Funktion eines umfassenden, therapeutischen Reagenzes ist die Fähigkeit, Erkennung und Reaktion auf ein Antigen zu initiieren, um eine zelluläre und humorale Reaktion (einzeln oder beide) auf das Antigen zu induzieren und die Immunogenität eines solchen Moleküls zu verstärken, ohne seine Antigenität zu beeinflussen.
Antikörper tragen drei Hauptkategorien von Antigen-spezifischen Determinanten – isotypisch, allotypisch und idiotypisch – von welchen jedes durch seinen Ort auf dem Antikörpermolekül definiert ist. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung konzentrieren wir und lediglich auf die idiotypische Kategorie.
Idiotypische Determinanten oder Idiotope sind Marker für den V-Bereich eines Antikörpers, einen relativ großen Bereich, welcher mehrere Idiotope umfassen kann, von welchen jedes fähig ist, mit einem unterschiedlichen Antikörper zu interagieren. Der Satz von Idiotopen, welcher auf einem einzelnen Antikörper-V-Bereich exprimiert ist, konstituiert den Antikörperidiotyp. Ein Antikörper (Ab1), dessen Antigen-kombinierende Stelle (Paratop) mit einer Antigendeterminante auf einen anderen Antikörper-V-Bereich (Idiotop) interagiert, wird als anti-idiotypischer Antikörper (Ab2) bezeichnet. Daher umfasst ein Ab2-Antikörper eine Antigen-bindende Stelle, welche auch eine Antikörper-bindende Stelle ist. Ein Teil solcher anti-idiotypischen Antikörper (d.h. Ab2_) identifiziert ein Epitop innerhalb des Paratops des idiotypischen Antikörpers und präsentiert so ein "internes" Bild des Epitops, welches durch den idiotypischen Antikörper auf dem Tumor-assoziierten Antigen identifiziert wird. Das Phänomen, einen anti-idiotypischen Antikörper zu produzieren, welcher das interne Bild des Antigens trägt, kann die Verwendung von Antikörpern erlauben, um das Antigen als ein Immunogen zu ersetzen. Für eine graphische Repräsentierung dieser Typen von Antikörpern und deren Interaktion sei auf 1 verwiesen.
Bei Tumoren, welche Antigene haben, gibt es wenigstens vier Theorien, warum die Immunitätsreaktion einen Tumor nicht zu zerstören vermögen kann:
1. es gibt keine B-Zellen oder cytotoxische T-Lymphocyten (CTL), welche fähig sind, den Tumor zu erkennen;
2. es gibt keine TH-Zellen, welche fähig sind, den Tumor zu erkennen;
3. TS-Zellen werden vor TH-Zellen aktiviert und hindern so B-Zellen und CTL-Aktivierung, und
4. die Gene, welche Tumorproliferation regulieren, können von Geburt an präsent sein, so dass der Wirt die Genprodukte nicht als "fremd" behandelt.
"Passive Immuntherapie" umfasst, dass Antikörper einem Patienten verabreicht werden. Antikörpertherapie wird herkömmlicherweise als passiv charakterisiert, da der Patient nicht die Quelle der Antikörper ist. Der Begriff passiv ist jedoch irreführend, da der Patient anti-idiotypische, sekundäre Antikörper produzieren kann, welche wiederum eine Immunitätsreaktion hervorrufen können, welche kreuzreaktiv mit dem ursprünglichen Antigen ist. "Aktive Immuntherapie" umfasst, dass einem Patienten ein Antigen in der Form einer Impfung verabreicht wird, um so eine schützende Immunitätsreaktion hervorzurufen. Genetisch modifizierte Tumorzellimpfungen, welche mit Cytokine-exprimierenden Genen transfektiert sind, und co-stimulierende Moleküle werden auch verwendet, um die Unzulänglichkeit der tumorspezifischen Immunitätsreaktion zu verringern.
Wenn ein spezifischer Antikörper aus einem Tier als ein Immunogen in ein geeignetes, zweites Tier injiziert wird, wird der injizierte Antikörper eine Immunitätsreaktion hervorrufen (z.B. Antikörper gegen die injizierten Antikörper produzieren –"anti-Antikörper"). Einige dieser anti-Antikörper sind spezifisch für die einzigartigen Epitope (Idiotope) des variablen Bereichs (domain) der injizierten Antikörper (anti-idiotypische Antikörper). Andere sind spezifisch für die Epitope der konstanten Bereiche der injizierten Antikörper und sind daher als anti-isotypische Antikörper bekannt.
Die verschiedenartigen Interaktionen, welche auf idiotypischen Determinanten basieren, genannt das idiotypische Netzwerk, basiert auf der Immunogenität der variablen Bereiche von Immunoglobulinmolekülen (Ab1), welche das Immunsystem stimulieren, anti-idiotypische Antikörper (Ab2) zu generieren, von welchen einige Antigen-Epitope ("internes Bild") des ursprünglichen Antigens nachahmen. Die Gegenwart interner Bild-Antikörper (Ab2_) im Kreislauf kann wiederum die Produktion von anti-anti-idiotypischen Antikörpern (Ab3) induzieren, von welchen manche Strukturen umfassen, welche mit dem ursprünglichen Antigen reagieren.
Die "Netzwerk"-Theorie legt dar, dass Antikörper, welche anfänglich während einer Immunitätsreaktion produziert wurden, einzigartige, neue Epitope tragen, welchen gegenüber der Organismus nicht tolerant ist und daher Produktion sekundärer Antikörper (Ab2) hervorruft, welche gegen die Idiotypen der primären Antikörper (Ab1) gerichtet sind. Diese sekundären Antikörper haben in ähnlicher Weise einen Idiotyp, welcher die Produktion von tertiären Antikörpern (Ab3) verringert, und so weiter. Ab1 → Ab2 → Ab3.
In anderen Worten kann eine Form eines anti-idiotypischen Antikörpers ein Ersatzantigen sein.
Zwei therapeutische Anwendungen sind aus der Netzwerktheorie entstanden:
1. Verabreichung von Ab1, welches sich als ein Antigen verhält, und Ab2-Produktion durch den Wirt induziert, und
2. Verabreichung von Ab2, welches das Tumorantigen funktional imitiert.

Die Entwicklung der "Netzwerk"-Theorie hat Forscher dazu gebracht, direkte Verabreichung von exogen produzierten anti-idiotypischen Antikörpern vorzuschlagen, d.h. Antikörpern, welche gegen den Idiotyp eines anti-Tumor- Antikörpers gerichtet sind. Ein solcher Ansatz ist in US-Patent 5,053,224 (Koprowski et al.) offenbart. Koprowski nimmt an, dass der Körper des Patienten anti-Antikörper produziert, welche nicht nur diese anti-idiotypischen Antikörper erkennen, sondern auch das ursprüngliche Tumorepitop.

Herkömmliche anti-idiotypische Antikörper werden durch Intraspezies- oder Interspeziesimmunisierung mit einem gereinigten Antigen-spezifischen Pool von Antikörpern oder einem monoklonalen Antikörper gemacht. Das resultierende Antiserum wird dann extensiv gegen ähnliche Moleküle mit dem gleichen konstanten Bereich absorbiert, um Antikörper mit anti-C_HC_L-Spezifitäten zu entfernen. Siehe z.B. Briles, et al.; "Idiotypic Antibodies," "Immunochemical Techniques" (New York, Academic; Colowich and Kaplan, Eds., 1985). Die Produktion von anti-ID-Antikörpern gegen Selbst-Idiotope war eine der ersten Schlüsselvoraussagen der Netzwerktheorie [Rodkey, S., "J. Exp. Med.", 130: 712–719 (1974)].

Von einem menschlichen anti-idiotypischen, monoklonalen Antikörper (Ab2) wurde gezeigt, dass er anti-Tumor-zelluläre Reaktionen in Tieren induziert und das Überleben von Patienten mit metastatischem Darmkrebs zu verlängern scheint. Siehe Durrant, L.G. et al., "Enhanced Cell-Mediated Tumor Killing in Patients Immunized with Human Monoclonal Anti-Idiotypic-Antibody 105AD7", "Cancer Research", 54: 4837–4840 (1994). Die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern (Ab2) zur Immunotherapie von Krebs ist auch Gegenstand eines Übersichtsartikels von Bhattacharya-Chatterje et al.; "Cancer Immunol. Immunother.", 38: 75–82 (1994).

Idiotope auf Lymphrezeptoren können in einigen Fällen externe Antigene nachahmen, aufgrund der extensiven Mannigfaltigkeit des Immunsystems. Diese Idee hat viele Versuche hervorgerufen, das interne Bild eines fremden Antigens, nachgeahmt durch die Idiotypen von T- oder B-Rezeptoren, um als Ziel für anti-idiotypische Antikörper zu agieren. Auf diese Weise ist es vorgeschlagen worden, dass anti-idiotypische Antikörper Populationen von T- oder B-Zellen induzieren können, welche das extrinsische (oder lösliche) Antigen binden können. Solche anti-idiotypischen Antikörper können als Impfungen verwendet werden, von welchen viele in Greenspan, N.S und Bona, C.A, "The FASEB-Journal", 7: 437–444 (1992) aufgelistet sind.

Die Fähigkeit, Immunitätsreaktionen nach oben oder unten zu regulieren und potentiell autoreaktive, immunokompetente Zellen zu steuern, ist lebenswichtig für normale Immunfunktion und Überleben. Regulierungsmechanismen umfassen die Induktion von klonaler Anergie (durch unpassende Antigen-präsentierende Zellen), periphere klonale Löschung/Apoptose, Cytokine (z.B. transformierende Wachstums-Faktor-Beta(TGF-_) oder IL-10)-induzierte Nichtreaktionsfähigkeit, "Veto"-Zellen, autoreaktive cytolytische T-Zellen und sowohl nicht-spezifische als auch Antigen-spezifische T-Suppressorzellen. Wenigstens in der Theorie stellt jeder dieser Regulationsmechanismen eine mechanistische Basis für "therapeutische Intervention" bereit.

Zusätzlich zur Krebsimmuntherapie ist die Kontrolle von abnormalen, akuten und chronischen Entzündungsreaktionen auch eine der wichtigsten Herausforderungen in der Medizin. Typische Beispiele von akuten und chronischen Entzündungen umfassen Atopie, Urticaria, Asthma, autoimmune hemolytische Anämie, rheumatische Arthritis, systemische lupus erythematosus, granulomatöse Krankheiten, Tuberkulose und Lepra.

Wie die obig beschriebene Tumorimmunitätsreaktion ist das Ziel der Entzündungsreaktion die Eliminierung schädlicher Stoffe. Weiterhin wird die Behandlung von autoimmunen, entzündlichen Krankheiten manchmal kompliziert durch autoimmune Faktoren, welche den Wirt daran hindern, schädliche Stoffe zu eliminieren, was zu persistenten oder chronischen, entzündlichen Reaktionen oder Zuständen führt.

Gegenwärtig ist bestimmt worden, dass essentielle Vorgänge bei der Entwicklung von Entzündungen eine zelluläre Reaktion umfassen, welche Neutrophile und Makrophagen involviert, spezifisch "rolling", Aktivierung und Adhäsion von Neutrophilen an Endothelium durch Selektine-Kohlehydrat-Ligand-Interaktion (und kann neutrophile Extravasation umfassen).

Therapeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von Entzündungen umfassen Stoffe, welche an einen oder mehrere Entzündungsmediatoren binden. Zum Beispiel können Antikörper, welche für Selektin-Kohlehydratliganden spezifisch sind und Selektin-Kohlehydrat-Ligand-Bindung inhibieren, wichtige Antientzündungsziele für die Entwicklung von therapeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Entzündungen sein.

Zusätzlich zu dem oben gesagten gibt es andere Fälle, in denen ein anti-idiotypischer Modus der Induktion einer Reaktion nützlich sein kann. Wenn ein gegebenes Epitop eines Proteins diskontinuierlich ist und aus einem dreidimensionalen Falten resultiert, kann ein anti-ID produziert werden, welches diese Struktur nachahmen würde. Weiter gibt es bei der Immunisierung gegen latente und/oder immunosuppressive Viren die Möglichkeit wohlbekannter, schädlicher Effekte, welche nicht durch die Verwendung abgeschwächter Viren lösbar sind (z.B. Mumps, Masern, Rubella und HIV). Die Verwendung von anti-ID-Induktion von schützender Immunität kann diese schädlichen Effekte vermeiden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Zusammensetzung zum Erzeugen einer humoralen und/oder einer zellulären Immunitätsreaktion durch Verabreichung eines Bindungsmittels, welches spezifisch an ein vorbestimmtes, lösliches Antigen bindet. Erfindungsgemäß ändert der Bindungsmittel-lösliches-Antigen-Komplex den immunogenen Zustand des Wirts durch Generierung neuer Immunogene, welche vom Immunsystem erkannt werden können. Dies führt zu einer humoralen und/oder einer zellulären Reaktion. In einer Ausführungsform umfasst die Immunitätsreaktion eine anti-Tumor-Reaktion und/oder Zelltötung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein umfassendes Verfahren zur Behandlung bestimmter Krankheiten und Zustände, welche umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf: Abzielen auf (Targeting) ein vorbestimmtes Antigen, vorzugsweise ein multi-epitopisches Antigen und/oder vorzugsweise löslich; Verabreichen eines Bindungsmittels, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers, und Induzieren einer umfassenden Immunitätsreaktion gegen die Krankheit oder den Zustand, welcher das Antigen erzeugt hat, auf welches abgezielt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung induziert das Bindungsmittel oder der Bindungsmittel/Antigenkomplex die Erzeugung einer humoralen Reaktion, welche teilweise durch die Produktion von anti-Antigen (z.B. Antitumor oder Antientzündung-) Antikörper, Ab3 und/oder Ab1c offensichtlich wird, und/oder die Produktion einer zellulären Reaktion induziert, wie teilweise durch die Produktion von T-Zellen offensichtlich wird, welche für das Bindungsmittel, den Bindungsmittel/Antigenkomplex und/oder das Antigen spezifisch sind.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren und Zusammensetzungen zum Ändern des immunogenen Zustands des Wirtsorganismus. Durch Veränderung des immunogenen Zustands erhöhen, verringern oder erhalten die Zusammensetzung und Verfahren der vorliegenden Erfindung den immunogenen Zustand des Wirts. Ein Beispiel dafür, wie ein therapeutischer Nutzen erzielt werden kann durch Erhöhung der Immunogenität umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf Handlungen für Krebs oder einige infektiöse Krankheiten. Ein Beispiel für eine Herabsetzung der Immunogenität umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf Behandlungen für rheumatische Arthritis. Ein Beispiel für die Aufrechterhaltung von Immunogenität umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf zusätzliche Behandlungen für Patienten, welche nach einer anfänglichen Reaktion tolerant auf Antigene geworden sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erniedrigen die Verfahren und Zusammensetzungen nicht die Antigenität der aktiven Komponente in der therapeutischen Zusammensetzung.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren und Zusammensetzungen zum Erhöhen der gesamten Wirtsreaktion auf eine Krankheit oder Zustand. Die Verfahren und Zusammensetzungen rufen einen therapeutischen Nutzen für den Empfänger hervor.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine therapeutische Zusammensetzung, welche einen aktiven Wirkstoff oder Bindungsmittel umfasst, welcher/s spezifisch an ein vorbestimmtes, lösliches Antigen bindet, wobei das Bindungsmittel bei Bindung an das Antigen einen Komplex bildet, welcher sowohl antigenisch als auch immunisierend ist.

Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindungen können auch eine oder mehrere Schritte oder Substanzen umfassen, welche die gesamte Immunogenität erhöhen.

Die therapeutischen Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindungen sind geeignet für die Behandlung jeglicher Krankheit oder Krebs, welche/r ein lösliches Antigen erzeugt, vorzugsweise ein multi-epitopisches Antigen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Entwerfen (Designen) neuer, therapeutischer Wirkstoffe und umfasst Auswahl eines löslichen Antigens, vorzugsweise eines Antigens, welches als multi-epitopisch bestimmt wurde, und Auswahl eines Bindungsmittels, welches spezifisch an das Antigen bindet und so einen Komplex bildet. Erfindungsgemäß führen das Bindungsmittel, der Bindungsmittel/Antigenkomplex und/oder das Antigen zur Erzeugung einer humoralen und/oder zellularen Reaktion in vivo. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung führt das Verfahren zum Entwerfen eines neuen, therapeutischen Wirkstoffs zu einem Bindungsmittel oder dem Bindungsmittel/Antigenkomplex, welches/r die Erzeugung einer humoralen Reaktion induziert, wie es teilweise durch die Produktion von Antitumor- oder Antientzündungsantikörpern, Ab3 und/oder Ab1c, offensichtlich wird, und/oder die Produktion einer zellulären Reaktion induziert, wie teilweise durch die Erzeugung von T-Zellen offensichtlich wird, welche spezifisch für das Bindungsmittel, den Bindungsmittel/Antigenkomplex und/oder das Antigen sind.

Obwohl einige Wissenschaftler gezeigt haben, dass Antigen-spezifische Antikörper die Immunitätsreaktion auf solche Antigene verstärken können, welche in einer komplexen Form vorliegen, ist die vorliegende Erfindung die erste, die demonstriert, dass die Injektion eines Antikörpers gegen ein einzelnes Epitop eine multi-epitopische Immunitätsreaktion bei Krebspatienten induzieren kann, vorausgesetzt, dass die Sera der Patienten das entsprechende Antigen enthielten. Die vorliegende Erfindung zeigt auch, dass diese Antikörperinjektion die Immunitätsreaktion des Patienten in solcher Weise ändern kann, dass das Selbstprotein CA125 jetzt durch das Immunsystem erkannt werden kann.

Die Stimulierung von T-Zellen, welche mit subdominanten oder verborgenen Epitopen von Selbst-Proteinen reaktiv sind, ist als ein wichtiger Faktor bei der Induzierung von Immunität auf ein vorbestimmtes Antigen vorgeschlagen worden, z.B. ein Antigen, welches bei einer Krankheit oder einem Zustand, wie etwa Krebs oder Autoimmunität, eine Rolle spielt. Antikörper-verstärkte oder -veränderte Präsentation eines Antigens, wie etwa CA125, in einem Antikörperkomplex, z.B. an MAb-B43.13 gebunden, durch B-Zellen (Antikörper-spezifisch) oder Makrophagen oder dendritischen Zellen (beide Fc-Rezeptor vermittelt) kann dazu führen, dass Peptide dem Immunsystem präsentiert werden, welche unterschiedlich sind von denen, welche durch die Präsentation des Antigens allein erhalten werden. Das kann zur genügenden Gegenwart von Antigen-spezifischen Peptiden aus subdominanten oder verborgenen Epitopen führen, welche wiederum T-Zellen niedriger Affinität stimulieren können, welche klonaler Vernichtung im Thymus entkommen sind oder T-Zellen wieder stimulieren, welche unterdrückt waren. Die Immunitätsreaktion, welche durch exogene Verabreichung eines Antikörpers zu einem zirkulierenden Selbst-Antigen kann daher mit der verglichen werden, welche bei Autoimmunkrankheiten beobachtet wird. Das kann auch erklären, warum die Gegenwart von Immunkomplexen von Antigen mit autologen, menschlichen Antikörpern oft nicht mit verbessertem Überleben korreliert. Menschliche B-Zellen erkennen bevorzugt immundominante Epitope des Antigens, was zur Präsentation von Epitopen führt, gegen welche T-Zellen während der fötalen Entwicklung ausgebildet wurden. Murine Antikörper auf der anderen Seite erkennen immundominante Epitope bei Mäusen, welche nicht notwendigerweise äquivalent mit den menschlichen, immundominanten Epitopen sind.

Der Einfang und die Verarbeitung eines Antigens, z.B. PSA, durch B-Zellen kann auch durch die Interaktion des Membran-gebundenen Ab2 mit den anti-Antigen/Antigen(z.B. anti-PSA/PSA)-Komplexen vorkommen, und auf ähnliche Weise durch die Interaktion von Membran-gebundenem Ab3 mit dem Antigen (komplexiert oder nicht mit dem anti-PSA-Antikörper).

Obwohl die Anmelder nicht an eine besondere Funktionsfähigkeitstheorie gebunden sein möchten, wird geglaubt, dass die beobachtete, immunologische Reaktion, welche durch die vorliegende Erfindung erreicht wird, auf eine Interaktion zwischen einem neu gebildeten Antigen und dem Immunsystem des menschlichen Patienten zurückgeführt werden kann. Wie obig angemerkt, umfasst ein Teil der Immunitätsreaktion Induktion der Produktion von anti-(anti-idiotypischen) Antikörpern durch den Patienten. Innerhalb dieses Satzes von anti(anti-idiotypischen)-Antikörpern sind diejenigen, die direkt komplementär zum Paratop eines anti-idiotypischen Antikörpers sind. Es wird weiterhin geglaubt, dass das Paratop des anti-idiotypischen Antikörpers ein "internes" Bild des Tumorzellenepitops präsentiert, welches durch den idiotypischen Antikörper identifiziert (d.h. selektiv gebunden) wird, und daher binden die anti-(anti-idiotypischen) Antikörper auch das Tumorantigen. Im Effekt induziert das vorliegende Verfahren eine immunologische Reaktion auf das erste Antigen, z.B. ein Tumorantigen, durch Präsentation eines zweiten Antigens (dem Paratop des anti-idiotypischen Antikörpers, welches Homologien mit dem Tumorantigen teilt), einem Teil von den resultierenden Antikörpern des Patienten.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Änderung von Immunogenität in einer Art, welche einen günstigen oder therapeutischen, wünschenswerten Effekt hervorruft. Wie hierin verwendet und wie in mehr Details unten beschrieben, ist eine günstige oder wünschenswerte Immunitätsreaktion eine solche, welche ein therapeutisch wünschenswertes Resultat erzielt. Eine günstige, therapeutische Reaktion umfasst typischerweise die Aktivierung des Immunsystems und/oder einer oder mehrerer seiner Komponenten, Induktion des Immunsystems und/oder einer oder mehrerer seiner Komponenten und/oder eine T-Zellen-Immunitätsreaktion und/oder eine humorale Immunitätsreaktion und/oder Reduktion der Tumorbelastung und/oder eine Zunahme der Überlebenszeit und/oder dergleichen. Bei z.B. einem Krebs, wie etwa Eierstockkrebs, umfasst eine günstige oder wünschenswerte Immunitätsreaktion die Produktion eines Antikörpers, welcher mit einem zuvor nicht immunoreaktiven Eierstockkrebs-Antigen immunoreagiert. In diesem Beispiel ist die Immunitätsreaktion auf ein Antigen erhöht. In einem anderen Beispiel für einen Zustand, wie etwa Entzündung, umfasst eine günstige oder wünschenswerte Immunitätsreaktion die Produktion eines Antikörpers, welcher mit einem zuvor immunoreaktiven Antigen immunoreagiert, so dass dieses nicht-immunoreaktiv wird. In diesem Beispiel wird die Immunitätsreaktion verringert. Bei Transplantation attackiert das Immunsystem MHC-verschiedenes Donorgewebe, was zur Abstoßung des Transplantats führt; bei Autoimmunkrankheit attackiert es normales Gewebe, und bei Allergien ist das Immunsystem hyperempfindlich gegenüber andernfalls harmlosen Antigenen aus der Umwelt. Es ist jetzt anerkannt, dass Immunosuppressivtherapie geeignet zur Behandlung jeder dieser Krankheiten ist.

Beschreibung der Figuren

1 ist eine graphische Darstellung der verschiedenen Typen von Antikörpern und deren struktureller Beziehung zueinander und zu einem Antigen.

2 zeigt die Produktion von Ab2 in Reaktion auf die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung.

3 zeigt die Produktion von B-Zellen in Reaktion auf die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Legende:
offene Balken, 0,1 μg oder kU pro ml;
gestrichelte Balken, 1 μg oder kU pro ml;
geschlossene Balken, 10 μg oder kU pro ml.

4 zeigt, dass ein Bindungsmittel/Antigenkomplex eine Immunitätsreaktion stimuliert.
Legende:
offene Balken, 0,1 μg oder kU pro ml;
gestrichelte Balken, 1 μg oder kU pro ml;
geschlossene Balken, 10 μg oder kU pro ml.

5 zeigt die Fähigkeit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, Immunogenität seines Zielantigens zu erhöhen.
Legende:
•, MAb 43.13;
☐, MAb 43.13 plus CA125;
>, CA125.

6 zeigt die Charakterisierung von anti-CA125-Antikörpern von Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde. Anti-CA125-positive Proben wurden auf Inhibierung ihrer Bindung an CA125 (Festphase) durch CA125, MAb-B43.13 scFv, MAb-B27.1 F(ab') oder MAb M11 F(ab') getestet. Einzelkettige MAb-B43.13, F(ab') MAb-B27.1 und F(ab')M11 wurden bei den Inhibierungssstudien verwendet, um nicht-spezifische Inhibierung des Fc-Teils des Antikörpers zu vermeiden, sowie Kreuzreaktivität durch HAMA. Um als signifikant eingestuft zu werden, musste die Inhibierung mindestens 15% betragen.

7 zeigt eine humorale Reaktion, hervorgerufen durch einen anti-MCV-1-Antikörper.

8 zeigt eine humorale Reaktion, hervorgerufen durch eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, welche auf Brustkrebs gerichtet ist.

9 zeigt, dass Alt-3- und Alt-2-Bindungsmittel bei Komplement-vermittelter Cytotoxizität effektiv ist.

10 zeigt die Verringerung an gastro-intestinalem Tumorvolumen nach Verabreichung eines anti-CA-19.9-Antikörpers.

11 zeigt die Ergebnisse und Charakteristika eines anti-inflammatorischen anti-CA-19-Antikörpers.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren und Zusammensetzung zum Ändern der Immunogenität, welche/s zur Induzierung oder Vermittlung einer umfassenden Immunitätsreaktion führt.

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Erhöhen der Immunogenität einer verabreichten Zusammensetzung durch Zielauswahl, Aktivierungsmethodologien und durch Liefersysteme, welche, in Kombination, entweder zelluläre oder humorale Immunität oder beides induzieren.

Die vorliegende Erfindung schließt die Entdeckung ein, dass Bindung eines Bindungsmittel an ein Antigen, wie etwa ein multi-epitopisches Tumor-assoziiertes Antigen, die Immunogenität des Immunogens erhöht, während seine Antigenität erhalten bleibt, und zur Erzeugung einer humoralen und/oder zellulären Reaktion auf das Immunogen führt. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vermitteln typischerweise eine Fähigkeit des Wirts, eine Immunitätsreaktion auf ein zuvor nicht-immunisierendes (nicht-immunogenes) Antigen zu erzeugen, d.h. ein Antigen, welches das Immunsystem nicht stimuliert, eine effektive Wirtsimmunitätsreaktion zu erzeugen. Auf diese Weise kann das Wirtsimmunsystem eine günstige und vorzugsweise effektive Immunitätsreaktion auf das zuvor unerkannte Antigen erkennen und initiieren.

In gewissen Ausführungsformen der Erfindung ist das Bindungsmittel ein nicht-markiertes Bindungsmittel, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, und, am meisten bevorzugt, ein photoaktivierter, monoklonaler Antikörper. Das Antigen, welches im größeren Detail unten definiert ist, kann jedes immunotolerante Antigen sein, vorzugsweise ein Tumor-assoziiertes Antigen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der photoaktivierte Antikörper ein intakter Antikörper, welcher gebrochene Schwefel-Schwefelbindungen zwischen den schweren und leichten Ketten des Antikörpers aufweist.

Eine Zusammensetzung und ein Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Verabreichen eines Bindungsmittels, welches spezifisch an ein vorbestimmtes Antigen bindet, um einen Komplex zu bilden, wobei der Komplex immunisierend (immunogen) ist. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Immunogenität offensichtlich durch die Produktion und/oder Induktion von anti-idiotypischen Antikörpern (Ab2), anti-anti-Antikörpern (Ab3), Antikörpern auf den Komplex, Antikörpern auf das Antigen (Ab1c, welches austauschbar mit Ab3' verwendet ist), cytotoxische Lymphocyten, wie etwa Killer-T-Zellen oder natürliche Killer(NK)-Zellen und/oder T-Zellen-Proliferation.

Eine Zusammensetzung und Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Verabreichen einer effektiven Menge eines Bindungsmittels, welches spezifisch an ein vorbestimmtes Antigen bindet, wobei das Antigen vorzugsweise in vivo in einer großen Menge vorhanden ist, das Bindungsmittel an das Antigen binden lassen und Induzieren der Erzeugung einer günstigen Immunitätsreaktion gegen das Antigen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Zusammensetzungen und Verfahren, welche zur Induzierung einer günstigen Immunitätsreaktion führen, insbesondere da, wo ein Fachmann nicht erwarten würde, eine Antigen-spezifische Immunitätsreaktion aufzufinden, z.B. Tumor-assoziierte Antigene ("Selbst"-)Antigene.

Eine zusätzliche Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch ein modifiziertes Antigen umfassen, wobei ein lösliches, vorzugsweise multi-epitopisches Antigen modifiziert ist durch Bindung an ein Bindungsmittel. Ein zusätzliches Verfahren der vorliegenden Erfindung kann Herstellung des modifizierten Antigens und/oder Verwendung des modifizierten Antigens zum Erreichen eines therapeutischen Effekts umfassen, z.B. Herstellung, Induzierung oder Inhibierung einer Immunitätsreaktion gegen das Antigen.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Verfahren und Zusammensetzung alle Bindungsmittel, wie hierin definiert, mit Ausnahme von B43.13-Antikörpern. Zum Beispiel kann ein Verfahren und eine Zusammensetzung der Erfindung eine Zusammensetzung umfassen, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches frei von oder im wesentlichen frei von B43.13-Antikörpern ist.

Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Eierstockkrebs, umfassend ein Bindungsmittel, welches spezifisch an ein Eierstockkrebsantigen, wie etwa CA125, bindet, wobei das Bindungsmittel B43.13-Antikörper ausschließt, wobei der Komplex zwischen dem Bindungsmittel und dem Antigen immunogen ist.

In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren einer Wirtsimmunitätsreaktion gegen ein multi-epitopisches in-vivo-Antigen bereit, wie etwa ein Tumorantigen oder ein Nicht-Tumorantigen, gegenwärtig im Wirtsserum, wobei das Antigen vorzugsweise keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen des Antigens mit einer Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches spezifisch an ein erstes Epitop auf dem Antigen bindet, und das Bindungsmittel ein Bindungsmittel/Antigenpaar ausbilden lassen, wobei eine Wirtsimmunitätsreaktion gegen ein zweites Epitop auf dem Antigen hervorgerufen wird. Die vorliegende Erfindung umfasst in-Kontakt-Bringen eines Antigens, vorzugsweise eines löslichen Antigens, mit einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung, und Reagieren-lassen eines Bindungsmittels in der Zusammensetzung mit dem Antigen. Erfindungsgemäß erzeugt Bindung des Antigens mit dem Bindungsmittel Wirtserkennung des Antigens. Erzeugen einer Wirtserkennung wiederum führt zur Initiierung einer Immunitätsreaktion gegen das Antigen.

In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren einer Immunitätsreaktion gegen ein Antigen bereit, welches keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Verfahren umfasst: Dem Wirt eine geringe Dosis oder eine kleine Menge eines Bindungsmittels verabreichen, welches ein Epitop einer löslichen Form des Antigens bindet. In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Induzieren einer Immunitätsreaktion gegen ein Antigen bereit, welches keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Verfahren umfasst: Dem Wirt ein Bindungsmittel verabreichen, welches ein Epitop einer löslichen Form des Antigens bindet, unter Verwendung einer geringen Dosis von Bindungsmittel, vorzugsweise einer Dosis, welche nicht ADCC erzeugt und/oder Antikörper-vermittelte Toxizität induziert. In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst eine geringe Dosis von Bindungsmittel von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Wirts. In einigen Ausführungsformen der Erfindung ist das Antigen ein zelluläres Antigen. ADCC wird bestimmt durch Inkubation von ⁵¹Cr-markierten Tumorzellen mit einem erfindungsgemäßen Bindungsmittel und Zusatz frischer, menschlicher PBMCs, gefolgt von Inkubation für vier Stunden und Messung spezifischer Lysis. ADCC wird als nicht gegenwärtig betrachtet, wenn spezifische Lysis weniger als 15% beträgt. Wie hierein verwendet, bezieht sich Antikörper-vermittelte Toxizität auf klinische Toxizität, von der spezifische Indikatoren umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf abnormale Serumchemien, beschränkte Nierenfunktion und Zeichen und Symptome von Serumkrankheit (serum sickness) oder Anaphylaxie.

In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, welches dem Wirt intravenöses Verabreichen von einem Bindungsmittel umfasst, welches ein Epitop einer löslichen Form eines zellulären Antigens bindet.

In gewissen Ausführungsformen umfasst die Wirtsimmunitätsreaktion eine zelluläre und humorale Immunitätsreaktion. In gewissen Ausführungsformen umfasst die Wirtsimmunitätsreaktion eine zelluläre Reaktion. In gewissen Ausführungsformen umfasst die Wirtsimmunitätsreaktion eine humorale Reaktion. In gewissen Ausführungsformen ist das Antigen ein lösliches Antigen. In bestimmten Ausführungsformen ist das Bindungsmittel ein Antikörper. In gewissen Ausführungsformen ist der Antikörper ein muriner, monoklonaler Antikörper. In gewissen Ausführungsformen induziert der Antikörper nicht Antikörper-vermittelte Toxizität, z.B. isotypisch induzierte HAMA-Toxizität, beim Wirt. In gewissen Ausführungsformen ist das Antigen mit einer menschlichen Krankheit oder pathologischem Zustand assoziiert. In gewissen Ausführungsformen ist die Krankheit oder der pathologische Zustand Krebs. In gewissen Ausführungsformen ist das Bindungsmittel photoaktiviert. In gewissen Ausführungsformen umfasst die humorale Reaktion anti-idiotypische Antikörper. In gewissen Ausführungsformen beträgt die Menge an Bindungsmittel wenigstens 0,1 μg und vorzugsweise bis zu 2 mg, weiter bevorzugt zwischen 1 μg und 200 μg pro kg Körpergewicht des Wirts.

In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches für ein erstes Epitop aus einem multi-epitopischen Antigen spezifisch ist, welches ein Tumor-assoziiertes Antigen oder nicht-Tumor-assoziiertes Antigen sein kann und im Wirtsserum gegenwärtig ist, wobei das Antigen vorzugsweise keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Bindungsmittel spezifisch an ein erstes Epitop auf dem Antigen bindet und ein Bindungsmittel/Antigenpaar bildet, wobei eine Wirtsimmunitätsreaktion gegen ein zweites Epitop auf dem Antigen hervorgerufen wird. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Bindungsmittel ein Antikörper, bevorzugt ein aktivierter Antikörper und am meisten bevorzugt ein photoaktivierter Antikörper.

In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung bereit, welche eine geringe Dosis eines Bindungsmittels umfasst, welches ein Antigen, vorzugsweise ein lösliches oder zelluläres Antigen, bindet, welches keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Bindungsmittel spezifisch an das Antigen bindet und eine Immunitätsreaktion gegen das Antigen induziert. Vorzugsweise beträgt die geringe Dosis eines Bindungsmittels von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Wirts.

In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung bereit, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches eine lösliche Form eines zellulären Antigens bindet, welches keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Bindungsmittel spezifisch an das Antigen bindet und eine Immunitätsreaktion gegen das Antigen induziert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen Zusammensetzungen, welche intravenös verabreicht werden, kein zusätzliches Hilfsmittel (Adjuvans). In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung zur subkutanen Verabreichung bereit, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches ein Epitop einer löslichen Form eines zellulären Antigens bindet, wobei das Antigen keine Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, wobei das Bindungsmittel spezifisch an das Epitop bindet und eine Immunitätsreaktion gegen die Zelloberflächenform des Antigens induziert. Wie hierin verwendet, bezeichnet eine "lösliche Form eines zellulären Antigens" eine zirkulierende Form eines Antigens, welches auch auf einer Zelloberfläche exprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen Zusammensetzungen, welche subkutan verabreicht werden, vorzugsweise zusätzliches Hilfsmittel.

In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Verlängern des Überlebens eines Krebspatienten bereit. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient ein Eierstockkrebspatient. Das Verfahren gemäß dieser Ausführungsform umfasst Identifizierung eines Patienten mit CA125-Gehalten von etwa 35 Einheiten pro ml oder weniger und dem Patienten einen xenogenen Antikörper, welcher spezifisch für CA125-Antigen ist, verabreichen. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml, weiter bevorzugt von etwa 9,5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen beträgt der Gehalt von CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten pro ml bis etwa 9,5 Einheiten pro ml. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein muriner Antikörper. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper muriner, monoklonaler Antikörper B43.13. In einigen, bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper in einer geringen Dosis, am meisten bevorzugt von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Patienten, verabreicht.

In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Verlängern der Zeit bis zum Rückfall der Krankheit bei einem Krebspatient bereit, folgend auf anfängliche Behandlung mit Chemotherapie und/oder Operation. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient ein Eierstockkrebspatient. Das Verfahren gemäß dieser Ausführungsform umfasst Identifizieren eines Patienten, welcher anfänglicher Behandlung unterzogen wurde und CA125-Gehalte von etwa 35 Einheiten pro ml und weniger hat und dem Patienten einen xenogenen Antikörper, welcher spezifisch für CA125-Antigen ist, verabreichen. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml, bevorzugter von etwa 9,5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten pro ml bis etwa 9,5 Einheiten pro ml. In einigen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein muriner Antikörper. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper muriner, monoklonaler Antikörper B43.13. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper in einer niedrigen Dosis verabreicht, am meisten bevorzugt von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Patienten. Überraschenderweise reagieren mehr als 50% solcher Patienten auf diese Behandlung, mit einer mittleren Zeit bis zum Rückfall von 18,9 Monaten bei Patienten mit Ab2-Gehalten von wenigstens 100 Einheiten, verglichen mit ungefähr 7,4 Monaten bei Patienten mit Ab2-Gehalten von unter 100 Einheiten.

In gewissen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Verlängern des Überlebens bei einem Krebspatienten bereit, folgend auf anfängliche Behandlung mit Chemotherapie und/oder Operation. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient ein Eierstockkrebspatient. Das Verfahren gemäß dieser Ausführungsformen umfasst: Identifizieren eines Patienten, welcher anfänglicher Behandlung unterzogen wurde, und CA125-Gehalt von etwa 35 Einheiten pro ml oder weniger aufweist und dem Patienten einen xenogenen Antikörper, welcher spezifisch für CA25-Antigen ist, verabreichen. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen beträgt der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml, mehr bevorzugt von etwa 9,5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen beträgt der Gehalt an CA125-Antigenen von etwa 5 Einheiten pro ml bis etwa 35 Einheiten pro ml. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein muriner Antikörper. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper muriner, monoklonaler Antikörper B43.13. In gewissen, bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper in einer geringen Dosis verabreicht; am meisten bevorzugt von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Patienten.

Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen, dass diese Ausführungsformen allein oder in Kombination verwendet werden können.

Gemäß der Erfindung glauben die Erfinder, dass die Interaktion zwischen dem Antigen und dem Bindungsmittel effektiv ein zuvor nicht exponiertes oder unterdrücktes Epitop dem Immunsystem des Patienten präsentiert, um zu erzeugen: 1. eine humorale Reaktion, welche zu menschlichen anti-Tumor-Antikörpern führt, welche durch den injizierten Antikörper inhibierbar oder nicht inhibierbar sein können, aber definitiv inhibierbar durch einen Antikörper sind, welcher an ein Epitop bindet, welches von einem Epitop verschieden ist, welches mit dem injizierten Bindungsmittel reaktiv ist, und 2. eine zellvermittelte Reaktion, welche zur Produktion Antigen-spezifischer T-Zellen führt.

Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen, dass ein Aspekt von jedweder, auf Antikörpern basierender Immuntherapie die Interaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper ist. Auch der Erfolg, die Effizienz und Nützlichkeit dieses Bindungsgeschehens umfasst typischerweise eine Mannigfaltigkeit von manchmal miteinander verflochtenen Faktoren. Im Allgemeinen umfassen diese Faktoren, sind jedoch nicht beschränkt auf die Bindungskapazität des Bindungsmittels, Immunogenität des Bindungsmittels, Zugänglichkeit des Antigens, Zugänglichkeit des Epitops des Antigens, den Grad an Komplementarität zwischen dem Paratop des Bindungsmittels und dem Epitop des Antigens, die Wirkung des Bindungsgeschehens auf dem Komplex, die Fähigkeit des Komplexes, eine Immunitätsreaktion zu induzieren, und das Ausmaß, zu welchem die Immunitätsreaktion aktiviert wird. Es ist beabsichtigt, dass diese Faktoren zur Bestimmung eines geeigneten oder wünschenswerten Bindungsmittels und/oder vorbestimmten Antigens beitragen und zur Natur und Effizienz der daraus resultierenden Immunitätsreaktion.

Das Zusammenspiel dieser verschiedenen Überlegungen, wie von der vorliegenden Erfindung gelehrt, kann zu effizienten, therapeutischen Medikamenten führen. Im Fall von B43.13 und der Behandlung von Eierstockkrebs ist ein spezifisches Beispiel, welches verwendet wird, um das allgemeine Prinzip zu beweisen, ohne dadurch die Erfindung einzuschränken, ist B43.13 ein muriner Antikörper, so dass dessen Heterogenität in einem menschlichen System zu seiner Immunogenität beiträgt. Weiterhin ist CA125, das Zielantigen, ein lösliches, Tumor-assoziiertes Antigen und dadurch einem Bindungsmittel zugänglich. Das Bindungsgeschehen zwischen B43.13 und CA125 ist solcher Natur, dass ein oder mehrere Epitope auf dem Komplex für Komponenten des Immunsystems erhältlich werden, wodurch eine Immunitätsreaktion induziert wird, wo zuvor keine war (oder so gering, dass kein therapeutischer Nutzen abgeleitet werden konnte). Weiterhin erzeugte das Bindungsgeschehen Zugang zu einem Epitop aus dem Komplex, welcher geeignet zum Induzieren von sowohl humoraler als auch zellulärer Immunitätsreaktion geeignet war, wodurch eine umfassende Immunitätsreaktion induziert wurde, welche selbst eine günstige Immunitätsreaktion ist. Was B43.13 betrifft, trugen alle diese individuellen Elemente zur (An-)Erkennung der Verwendung von B43.13 bei, die Immunitätsreaktionskaskade zu induzieren, welche bei der Behandlung von Eierstockkrebs effektiv ist.

Wie oben angemerkt, glauben die Erfinder, dass ein wichtiger Aspekt der Induzierung oder Vermittlung einer zellulären und humoralen Reaktion paarweise in der Erhöhung der Immunogenität des Bindungsmittel-Antigenkomplexes liegt, während dessen Antigenität erhalten bleibt. Wie weiter unten und in den Beispielen detaillierter beschrieben, kann eine Erhöhung der Immunogenität bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung von Antigenität durch ein oder mehrere der folgenden erreicht werden:

1. Verabreichung einer Dosis von Bindungsmittel, welche im Vergleich zur Dosis für andere therapeutische Zusammensetzungen gering ist;
2. Ausbilden eines Bindungsmittel-Antigenkomplexes in vivo oder ex vivo;
3. Photoaktivierung des Bindungsmittels vor Verabreichung;
4. Verabreichung des Bindungsmittels in einer Mikrosphäre, einem Liposom, einer Nanosphäre oder Mizelle;
5. Konjugieren des Bindungsmittels an ein photodynamisches Mittel, wie etwa Hypocrellin B, und
6. Konjugieren des Bindungsmittels an Immuneffektoren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung, welche einen vorbestimmten Antikörper umfasst, welcher spezifisch an ein vorbestimmtes Tumorantigen bindet, verwendet, um ein vom Tumor erzeugtes, lösliches Antigen zu binden. Wenn das lösliche Antigen einmal gebunden ist, erkennt das Immunsystem das Antigen als "fremd" und ruft eine Immunitätsreaktion gegen das Antigen oder gegen das an das Antigen gebundene Bindungsmittel hervor. Antigene, welche immunisierend gemacht werden können, sind potentiell nützlich bei der Induzierung oder Aktivierung einer Immunitätsreaktion, was zu therapeutischen und möglicherweise prophylaktischen Nutzen führt.

Eine jede Komposition, welche ein erfindungsgemäßes Bindungsmittel umfasst, kann verwendet werden, um eine in-vivo-Immunitätsreaktion zu initiieren. Die Zusammensetzungen können ein oder mehr Hilfsstoffe, ein oder mehrere Trägerstoffe, ein oder mehrere Arzneimittelträger, ein oder mehrere Stabilisierungsmittel, ein oder mehrere Abbildungsreagenzien, ein oder mehrere Effektoren, ein oder mehrere photodynamische Mittel und/oder physiologisch akzeptable Salzlösung enthalten. Allgemein sind zusätzlich Hilfsstoffe Substanzen, die mit einem Immunogen gemischt werden, um eine ausgeprägtere Immunitätsreaktion hervorzurufen. Kontrollimpfungen ohne das zusätzliche Hilfsmittel führten zu einer humoralen Immunitätsreaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die ein Bindungsmittel umfassende Zusammensetzung kein zusätzliches Hilfsmittel.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst eine geeignete Zusammensetzung ein Bindungsmittel, welches an ein lösliches Antigen bindet, um einen Komplex auszubilden, welcher selbst antigenisch und immunisierend ist. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Komplex ein Antigen, welches einen günstigen oder wünschenswerten, therapeutischen Effekt induziert.

Die Zusammensetzung kann auch pharmazeutisch akzeptable Trägermaterialien umfassen.

Pharmazeutisch akzeptierte Trägermaterialien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Salzlösung, steriles Wasser, phosphatgepufferte Salzlösung und dergleichen. Andere Puffermittel, Dispergiermittel und inerte, nicht-toxische Substanzen, welche für die Zufuhr an einem Patienten geeignet sind, können in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfasst sein. Die Zusammensetzungen können Lösungen sein, welche zur Verabreichung geeignet sind und sind typischerweise steril und frei von unerwünschtem, partikulärem Material. Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche Sterilisierungstechniken sterilisiert werden.

Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung rufen die Verfahren und Zusammensetzungen sowohl eine humorale als auch zelluläre Reaktion hervor. Fachleute auf diesem Gebiet werden anerkennen, dass Bestimmen, dass eine humorale und/oder zelluläre Reaktion erzeugt wurde, leicht gezeigt werden kann durch Testen auf Strukturen, welche mit jeder Reaktion assoziiert sind. Beispielsweise umfasst ein Nachweis einer Erzeugung einer humoralen Reaktion, ist jedoch nicht beschränkt auf die Produktion von Ab2 und Ab3. Ähnlich umfasst ein Nachweis für die Erzeugung einer zellulären Reaktion, ist jedoch nicht beschränkt auf die Produktion von T2- und/oder T3-Zellen.

BINDUNGSMITTEL

Die Bindungsmittel der vorliegenden Erfindung binden ein interessierendes Antigen, und das resultierende, immunisierende Paar oder der resultierende, immunisierende Komplex kann verwendet werden, um eine Immunitätsreaktion vorzubereiten oder zu initiieren, typischerweise auf ein anderes Epitop auf dem Komplex oder einen Teil des Komplexes. Das Epitop, welches zuvor keine effektive Immunitätsreaktion hervorrief, initiiert, wenn es durch Agenten des Immunsystems erkannt wird, die Immunsystemkaskade, welche zu einer günstigen Immunitätsreaktion führt, vorzugsweise einer effektiven Immunitätsreaktion; wie hierin verwendet, bedeutet eine effektive Wirtsimmunitätsreaktion Besserung oder Eliminierung der Krankheit oder des Zustandes, welche/r das Antigen hervorruft.

Ein Bindungsmittel (BA), wie hierin verwendet, bezeichnet einen Bestandteil eines bindenden Paars, einschließlich eines immunologischen Paars, z. B. eine Bindungsgruppe, welche fähig ist, an ein Antigen zu binden, vorzugsweise ein einzelnes Epitop, welches auf dem Antigen exprimiert ist, wie etwa ein vorbestimmtes Tumorantigen. In einigen Ausführungsformen der Erfindung bildet das Bindungsmittel, wenn es an das Antigen gebunden ist, einen immunisierenden Komplex aus. Beispiele für Bindungsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: monoklonale Antikörper ("MAb"), vorzugsweise IgG1-Antikörper; chimäre monoklonale Antikörper ("C-MAb"); humanisierte Antikörper; genetisch modifizierte, monoklonale Antikörper ("G-MAb"); Fragmente von monoklonalen Antikörpern (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf "F(Ab)₂", "F(Ab)" und "Dab"); Einzelketten, welche den reaktiven Teil von monoklonalen Antikörpern repräsentieren ("SC-MAb"); Antigen-bindende Peptide; Tumor-bindende Peptide; ein Protein, einschließlich Rezeptorproteine; Peptide; Polypeptide; Glycoprotein; Lipoprotein, oder dergleichen, z.B. Wachstumsfaktoren; Lymphokine und Cytokine; Enzyme, Immunmodulatoren; Hormone, z.B. Somatostatin; jegliches der obigen, verbunden mit einem Molekül, welches eine Effektorfunktion vermittelt, und Mimika (mimics) oder Fragmente von jeglichem der obigen. Das Bindungsmittel kann mit Markierung versehen oder unmarkiert sein.

Ein erfindungsgemäßes Bindungsmittel ist vorzugsweise ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Der Antikörper umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf native oder "nackte" Antikörper und modifizierte Antikörper, wie etwa aktivierte Antikörper, z.B. chemisch aktivierte oder photoaktivierte Antikörper. Wie hierin verwendet, bezeichnet nativ einen natürlichen oder normalen Antikörper; "nackt" bezeichnet das Entfernen einer nicht nativen Gruppe, z.B. Entfernen der Markierung von einem markierten Antikörper. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Bindungsmittel ein Ab1-Antikörper, welcher die Produktion eines oder mehrerer Moleküle induziert, welche eine Immunitätsreaktion umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf ein oder mehr der folgenden: Moleküle, welche mit einer zellulären Reaktion assoziiert sind (Cytokine, Chemokine, cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) und natürliche Killerzellen (NK)) und/oder Moleküle, welche mit einer humoralen Reaktion assoziiert sind [Ab3, Ab1c (manchmal als Ab3' bezeichnet)].

Fachleute auf diesem Gebiet sind fähig, eine Vielzahl von Antikörperderivaten herzustellen. Zum Beispiel offenbaren Jones et al., "Nature", 321: 522–525 (1986) Ersetzen der CDRs von menschlichem Antikörper mit denen eines Mausantikörpers. Marx diskutiert in "Science", 229: 455–456 (1985) chimäre Antikörper, welche variable Bereiche der Maus und konstante Bereiche des Menschen aufweisen. Rodwell diskutiert in "Nature", 342: 99–100 (1989) Niedrig-Molekulargewicht-Erkennungselemente, welche von Antikörper-CDR-Information abgeleitet sind. Clackson diskutiert in "Br.J. Rheumatol." 3052: 36–39 (1991) genetisch modifizierte, monoklonale Antikörper, einschließlich Fv-Fragmentderivaten, Einzelkettenantikörpern, Fusionsprotein-Chimären-Antikörpern und humanisierten Nagetierantikörpern. Reichman et al. offenbaren in "Nature", 332: 323–327 (1988) einen menschlichen Antikörper, auf welchem hypervariable Bereiche einer Ratte transplantiert sind. Verhoeyen et al. lehren in "Science", 239: 1534–1536 (1988) Transplantieren einer Mausantigenbindungsstelle auf einen menschlichen Antikörper. Bispezifische Antikörper sind im Fachbereich ebenfalls bekannt.

Verfahren zum Herstellen und Erhalten eines Antikörpers sind Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst Immunisierung eines jeglichen Tiers, welches fähig ist, eine verwendbare Immunitätsreaktion auf das Antigen hervorzurufen, wie etwa eine Maus, Ratte, Ziege, Schaf, Hase oder ein anderes, geeignetes Versuchstier. Im Fall eines monoklonalen Antikörpers können Antikörper-produzierende Zellen des immunisierten Tiers mit "unsterblichen" oder "immortalisierten", menschlichen oder Tierzellen fusioniert werden, um ein Hibrid zu erhalten, welches den Antikörper produziert. Wenn gewünscht, können die Gene, welche eine oder mehrere der Immunoglobulinketten verschlüsseln, geklont werden, so dass der Antikörper in verschiedenen Wirtszellen produziert wird, und wenn gewünscht, können die Gene mutiert werden, um so die Sequenz und damit die immunologischen Charakteristika des erzeugten Antikörpers zu verändern. Fragmente von Bindungsmitteln können durch herkömmliche Techniken erhalten werden, wie etwa durch proteolytische Verdauung des Bindungsmittels unter Verwendung von Pepsin, Papain oder dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Techniken, in welchen DNA, welche das gewünschte Fragment verschlüsselt, geklont wird und in einer Vielzahl von Wirten exprimiert wird. Bestrahlen einer jeglichen der zuvor genannten Einheiten, z.B. mit ultraviolettem Licht, verstärkt die Immunitätsreaktion auf das Antigen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Effektorfunktionen, welche CDC oder ADCC vermitteln, benötigt. Verschiedene Bindungsmittel, Antikörper, Antigene und Verfahren zum Herstellen, Isolieren und Verwenden der Bindungsmittel sind in US-Patent 4,471,057 (Koprowski), US-Patent 5,075,218 (Jette et al.), US-Patent 5,506,343 (Kufe) und US-Patent 5,683,674 (Tylor-Papadimitriou et al.) beschrieben, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Zudem sind viele dieser Antikörper kommerziell von Centocor, Abbott Laboratories, Commissariat à L'energie Atomique, Hoffmann-LaRoche, Inc., Sorin Biomedica, und FujiRebio erhältlich. Die bevorzugten Bindungsmittel der vorliegenden Erfindung, murine monoklonale Antikörper, können gemäß herkömmlicher Techniken, welche den Fachleuten wohlbekannt sind, hergestellt werden. Hybridproduktion in Nagetieren, insbesondere in Mäusen, ist eine sehr gut etablierte Prozedur und ist bevorzugt. Stabile, murine Hybride stellen eine unbegrenzte Quelle von Antikörpern ausgewählter oder vorbestimmter Charakteristika bereit. Typischerweise kann ein monoklonaler Antikörper unter Verwendung jeglicher Technik hergestellt werden, welche für die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellreihen in Kultur sorgt. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die Hybridtechniken, welche ursprünglich von Kohler und Milstein beschrieben wurden ["Nature", 256: 495–497 (1975)]; die menschliche B-Zellen-Hybridtechnik [Kozbor et al., "Immunology Today", 4: 72 (1983)], und die EBV-Transformationstechnik [Cole et al., "Monoklonaler Antikörper und Krebstherapie", Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96 (1985)].

Kurz gefasst kann ein erfindungsgemäßer, monoklonaler Antikörper durch Immunisierung eines Tiers, typischerweise einer Maus, mit einem Immunogen, z.B. einem Antigen, wie etwa CA125, hergestellt werden. Die Erfindung umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf die Verwendung eines Peptidsegments, das ein spezifisches Epitop und vorbestimmte Aminosäuresequenz umfasst. Diese Peptide können synthetisiert oder optional an ein Trägerprotein, wie etwa Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), konjugiert werden, und als ein Immunogen verwendet werden.

Dem Vorgang wird dann durch Erhalt immunisierter Lymphzellen, gefolgt (z.B. Milzlymphocyten) von den immunisierten Tieren, Vereinigen der Lymphzellen mit einer immortalisierten Zelle (z.B. einem Myelom oder einem Heteromyelom), um Hybridzellen zu erzeugen, welche in Kultur unbegrenzt vermehrt werden können, und dann Screenen der Hybridzellen, um solche zu identifizieren, welche monoklonale Antikörper erzeugen, welche mit dem Zielepitop reagieren.

Die resultierenden Hybride können durch jegliche von einer Vielzahl Assays ausgewählt werden, z.B. die zum Binden von Ab2 oder zum Inhibieren von Ab1-Binden an Tumorzellen. Zum Beispiel kann das Bindungsstellenepitop oder Peptidsequenzen, welche das Epitop umfassen, auf Polyethylennadeln oder einem anderen Träger synthetisiert und/oder immobilisiert werden. Der geeignete, monoklonale Antikörper kann dann bestimmt werden durch seine Kapazität, das immobilisierte Peptid zu binden, wie durch ELISA unter Verwendung eines markierten Antikörpers detektiert (markiert z.B. mit Peroxidase).

Wenn gewünscht, können murine oder andere Tierantikörper humanisiert werden, durch ein jegliches einer Anzahl von Verfahren, welche im Fachbereich wohlbekannt sind. Zum Beispiel verwendeten Reichmann et al. ["Nature", 322: 323–327 (1988)] rekombinante DNA-Methodologie, um die sechs hypervariablen Bereiche aus den schwerkettigen und leichtkettigen, variablen Domänen an menschlichem Antikörper mit den hypervariablen Bereichen von den Nagetierantikörpern zu ersetzen. Die umgeformten, menschlichen Antikörper haben die Affinität der ursprünglichen Antikörper aufgrund der Gegenwart der ursprünglichen, hypervariablen Bereiche, aber hätten alle anderen Charakteristika eines menschlichen Körpers.

Eine der am vielversprechendsten Ansätze der Tumorimmuntherapie ist die Verwendung von Antikörperfragmenten oder Antikörperfragmenten mit Effektordomänen, um auf Tumorzellen abzuzielen und diese zu töten. Einzelkettige Fv(scFv) wurde als ein rekombinantes Fusionsprotein genetisch modifiziert, welches aus einer schwerkettigen (Vh) und einer leichtkettigen (V1) variablen Domäne steht, welche durch einen artifiziellen Linker und eine Effektordomäne verbunden sind.

In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden die erfindungsgemäßen Bindungsmittel aktiviert, bevorzugt durch chemische oder photodynamische Ansätze. Bevorzugte, chemische Ansätze umfassen organische Reduktionsmittel, wie etwa Formamidinsulfonsäure, anorganische Reduktionsmittel, Quecksilberion, Zinnion, Cyanidion, Natriumcyanoborohydrid und Natriumborohydrid, Thiolaustauschreagenzien, wie etwa Dithiothreitol, Mercaptoethanol und Mercaptoethanolamin, und Proteinreduktionsmittel, wie etwa Thioredoxin. Verwendung dieser Reagenzien führt zu einer Reduktion einiger Disulfide innerhalb des Bindungsmittels, um ein Bindungsmittel mit einigen Sulfhydrylgruppen zu erzeugen.

Die Gegenwart solcher Gruppen kann die tertiäre Struktur des Bindungsmittels verändern. Eine solche, strukturelle Veränderung kann die Immunoreaktivität des Bindungsmittels modulieren. Eine solche Modulation kann zu einer verbesserten, anti-idiotypischen Reaktion und/oder zellulären Reaktionen in einem Individuum führen, welchem das Bindungsmittel verabreicht wurde.

In einigen bevorzugten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Bindungsmittel optional an photodynamische Mittel gekoppelt werden. Vorzugsweise erfolgt eine solche Kopplung durch kovalente Bindung oder durch liposomale Assoziation. Liposomale Assoziation wird bevorzugt durch Mischen des photodynamischen Mittels mit einem Bindungsmittel in Gegenwart eines liposombildenden Reagenzes erreicht. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße Bindungsmittel kovalent an das liposombildende Reagenz gebunden. Bevorzugte, photodynamische Mittel umfassen Hypocrelline, wie etwa Hypocrellin B, mehr bevorzugt animinierte Hypocrelline und Hypocrellinderivate.

In einer Ausführungsform der Erfindung enthält eine zur Behandlung eines Eierstocktumor-assoziierten Antigens geeignete Zusammensetzung ein Bindungsmittel, welches das CA125-Antigen bindet. Beispiele für Antikörper, welche an CA125 binden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf B43.13. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines jeglichen Bindungsmittels, welches nicht B43.13 ist, welches spezifisch an CA125 bindet und zu einer günstigen Immunitätsreaktion führt, z.B. M11. Diese und andere Beispiele für Antikörper sind offenbart in Nustad et al., "Tumor Biology", 17: 196–219 (1996) und Nap et al., "Tumor Biology", 17: 325–331 (1996).

In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung umfasst eine zur Behandlung von gastrointestinalem Krebs geeignete Zusammensetzung ein Bindungsmittel, welches das CA-19.9-Antigen bindet. Beispiele für Antikörper, welche an CA 19.9 binden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Alt-3, W25 (CIS Bio International), A3 (Shemyakin Inst. Biorg. Chem.) und NS116-NS-19.9 (Centocor), unter anderem. Diese und andere Beispiele für Antikörper sind in "Tumor Biology", 19: 390–420 (1998) offenbart.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Zusammensetzung, welche zur Behandlung von Brustkrebs geeignet ist, ein Bindungsmittel, welches das CA-15.3-Antigen bindet. Beispiele für Antikörper, welche an CA 15.3 binden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf SM-3, DF-3, DF3-P, Ma 552 und BC4E549. Diese und andere Beispiele für Antikörper sind offenbart in "Tumor Biology", 19: 21–29 (1998).

In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung umfasst eine zur Behandlung von Prostatakrebs geeignete Zusammensetzung ein Bindungsmittel, welches das Prostata-spezifische Antigen (PSA) bindet. Ein Beispiel für einen Antikörper, welcher an PSA bindet, umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf AR47.47.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst eine zur Behandlung von Entzündung geeignete Zusammensetzung ein Bindungsmittel, welches CA-19.9-Antigen bindet. Beispiele für Antikörper, welche an CA 19.9 binden und Entzündung verringern, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Alt-3- und Alt-4-Antikörper.

LÖSLICHES ANTIGEN

Ein vorbestimmtes Antigen kann ein jegliches, menschliches oder Säugetier-Antigen von klinischer Signifikanz sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung muss das vorbestimmte oder Ziel-Antigen fähig sein, ein Bindungsmittel zu binden. Fähig zu binden umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf eines oder mehrere der folgenden: Das Antigen kann löslich, zirkulierend, gegenwärtig, detektierbar sein und/oder eine Bindungsstelle umfassen, welche für ein verabreichtes Bindungsmittel zugänglich ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Antigen ein Tumor-assoziiertes Antigen (TAA). Im Fall von TAA kann der Krebs umfassen, ist jedoch nicht beschränkt auf Lunge, Darm, Rektum, Brust, Eierstock, Prostatadrüse, Kopf, Hals, Knochen, Immunsystem oder jegliche andere anatomische Stelle. Beispiele für Tumore und Tumormarker sind im US-Patent 5,075,218 aufgelistet.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können jeglichen Krebs involvieren, welcher ein lösliches, multi-epitopisches TAA produziert. Wie hierin verwendet, ist löslich zum Beschreiben eines jeglichen Antigens, welches in einer Körperflüssigkeit, d.h. Blut, Serum, Bauchwasser, Speichel, oder dergleichen, detektierbar ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugte Tumore solche, die: lösliche Tumorantigene ausstoßen, z.B. Tumor-assoziierte Antigene, welche in den Blutstrom ausgestoßen werden, im Gegensatz zu einem Oberflächenantigen oder einem intrazellulären Antigen; ein multi-epitopisches Tumorantigen aufweisen, und in einer Konzentration im Körperfluid des Patienten aufgefunden werden kann, welche höher ist als eine, die normalerweise in gesunden Kontrollen gegenwärtig ist und solch hoher Wert die Gegenwart der Krankheit bedeutet, jedoch keine signifikante Immunitätsreaktion initiiert hat.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das vorbestimmte Antigen ein Antigen, welches keine effektive Wirtsimmunitätsreaktion hervorruft, z.B. nicht effektiv darin ist, Tumorbelastungen zu verringern und/oder keinen therapeutischen Nutzen induziert (selbst wenn eine kleine Immunitätsreaktion hervorgerufen wird). Wie Fachleuten auf diesen Gebieten bekannt ist, besteht ein Verfahren zur Bestimmung, ob die Konzentration des TAA größer ist als in gesunden Individuen im Vergleichen der Konzentration des Patienten mit der einer gesunden Kontrollperson. Wenn die Konzentration des TAA höher ist als die gesunde Kontrolle, dann sagt die Konzentration des Patienten die Gegenwart oder Wiedererscheinung der Krankheit voraus.

Die Erfindung betrifft auch die Produktion eines modifizierten Antigens, typischerweise durch Produktion des modifizierten Antigens in vivo. Wie hierin verwendet, bezeichnet modifiziertes Antigen ein erstes Antigen, typischerweise für das Immunsystem unsichtbar, welches an ein Bindungsmittel bindet und das Bindungsmittelantigen selbst ein Antigen ist (das "zweite" Antigen), welches mit einem oder mehr Molekülen des Immunsystems immunoreaktiv ist.

Wie hierin verwendet, bezeichnet "Krankheit" die Handhabung, Diagnose und/oder Linderung jeglicher Säugetier-(einschließlich menschlicher)Krankheit, Leiden, Gebrechen oder Zustand. "Krankheit" umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf Krebs und seine Metastasen, wie etwa Hautkrebs; Geschwülste oder Tumore und deren Metastasen; Tumore und Tumorzellen, wie etwa Sarkome oder Karzinome, einschließlich verdichteter Tumore, blutübertragende und Tumore in Nasenluftwegen, Blase, Esophagus, oder Lunge, einschließlich der Bronchien; Viren, einschließlich Retroviren und HIV; infektiöse Krankheiten, wie etwa Hepatitis, einschließlich chronischer Hepatitis, wie etwa Hepatitis B; bakterielle Krankheiten; Pilzkrankheiten, und dermatologische Zustände oder Störungen, wie etwa Lesionen der Vulva, Keloide, Vitiligo, Schuppenflechte, gutartige Tumore, Endometriose, Barett's Esophagus, Tinea capitis, Flechtenamyloidose und Autoimmunkrankheiten, wie etwa rheumatische Arthritis. Beispielhafte lösliche, multi-epitopische Antigene sind obig beschrieben und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf CA125, CA 19.9, CA 15.3, polymorphisches Epithel-Muzin (PEM), CEA und Prostata-spezifisches Antigen.

Es sei angemerkt, dass viele dieser Krankheiten und/oder Zustände teilweise dadurch charakterisiert sind, dass sie Symptome oder biologische Prozesse einschließen, welche mit Entzündungen zu tun haben. Viele Typen von immunübertragener Entzündung, einschließlich chronischer und akuter Entzündung, und viele Typen von Arthritis, einschließlich rheumatische Arthritis, und viele Typen von Krebs exprimieren oder involvieren die gleichen oder ähnliche Kohlehydratliganden. Beispielhafte Liganden umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Sle^a und Sle^x. Eine Ausführungsform der Erfindung umfasst Zusammensetzungen, welche teilweise ein oder mehr Bindungsmittel umfassen, welche/s an einen Kohlehydratliganden bindet/n. Diese Zusammensetzungen sind gegen jegliche Krankheit oder jeglichen Zustand effektiv, welcher oder welche den Kohlehydratliganden als Teil des metabolischen Wegs umfasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf rheumatische Arthritis, Kollagen-induzierte Arthritis, adjuvante Arthritis und Pristan-induzierte Arthritis. Nur zu Zwecken dieses Aspekts der Erfindung bezeichnet eine "effektive Wirtsimmunitätsreaktion" Eliminierung schädlicher Faktoren und dadurch Eliminierung einer hartnäckigen oder chronischen, entzündlichen Reaktion oder entzündlichen Zustands. Ein hoher Gehalt an Antigen, wie hierin verwendet, ist ein variabler Begriff, welcher teilweise vom Typ von Antigen abhängt und/oder dem Typ der Krankheit oder des Zustandes und/oder dem Stadium der Krankheit oder des Zustandes. Zum Beispiel werden Fachleute auf diesem Gebiet erkennen, dass ein hoher Gehalt bedeuten kann, dass eine Mehrzahl von Krebs-positiven Patienten, z.B. über 50% oder über etwa 80% einen gewissen Gehalt an zirkulierendem Antigen aufweisen. Zum Beispiel legt das gegenwärtige Verständnis des Grundes für Eierstockkrebs nahe, dass 80% oder mehr der Patienten mit mehr als 35 U/ml von CA125-Antigen in ihrem Blutstrom ein statistisch signifikant höheres Risiko zur Entwicklung von Eierstockkrebs haben. Ein hoher Gehalt kann auch hinsichtlich der Menge definiert werden, welcher genügt, um eine gesamte, vorbestimmte Dosis von Bindungsmittel vollständig oder im wesentlichen vollständig zu binden. Ein hoher Gehalt kann auch als eine Schwellen-Quantität von zirkulierendem Antigen definiert werden, welche von Fachleuten als ein hoher Gehalt anerkannt wird. Ein hoher Gehalt kann auch diejenige Menge umfassen, welche die Krankheit voraussagt. Ein hoher Gehalt kann auch eine Menge oder Konzentration von Antigen umfassen, welche höher ist als das, was für diesen Patienten normal wäre oder für die Krankheit oder den Zustand. Effektive Behandlung ist erhältlich für Patienten mit so wenig wie fünf Einheiten CA125 pro ml.

Ein Verfahren einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Bestimmen der Menge an vorbestimmtem Antigen im Patienten, z.B. zirkulierend im Patienten, und wenn die Menge an Antigen ein hoher Gehalt ist, dann Verabreichen einer Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes Bindungsmittel umfasst. Ein bevorzugteres Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Bestimmen der Menge an zirkulierendem, vorbestimmtem Antigen im Patienten, und, wenn die Menge größer ist als eine Menge, welche die Krankheit voraussagt, weiter bevorzugt dreimal größer, dann Verabreichen einer Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes Bindungsmittel umfasst. Zum Beispiel umfasst ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Bestimmen der Menge an zirkulierendem CA125, und wenn die Menge größer ist als etwa 5 Einheiten pro ml und weiter bevorzugt größer als 105 Einheiten pro ml, dann Verabreichen einer Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes Bindungsmittel umfasst, z.B. B43.13 umfassend. Die verabreichte Zusammensetzung kann eine geringe Dosis von Bindungsmittel umfassen.

Wie im Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung angemerkt, kann der potentielle Effekt der Injektion eines Bindungsmittels, wie etwa eines Antikörpers, extrem komplex sein und kann typischerweise verschiedene Aktionsmechanismen umfassen. Wie hierin verwendet, stehen Ab3 und Ab1c für zwei solche verschiedene Mechanismen, welche individuell und/oder kollektiv einen nützlichen Effekt hervorrufen. In dem Ab3-Weg kann ein Ab1-Antikörper, welcher fähig ist, an ein vorbestimmtes Antigen zu binden, die Produktion eines anti-idiotypischen Antikörpers (Ab2) induzieren, welcher ein Epitop des Antigens nachahmt. Der anti-idiotypische Antikörper wiederum kann die Produktion von anti-anti-idiotypischen Antikörpern (Ab3) induzieren, welche fähig sind, das gleiche Epitop auf dem Antigen zu binden wie der Ab1-Antikörper. Ein Nachweis für diesen Weg umfasst ein kompetitives Assay zwischen Ab1 und Ab3, da der Ab1-Antikörper und der Ab3-Antikörper um das gleiche Epitop des Antigens konkurrieren.

Bei dem Ab1c-Weg bindet der Ab1-Antikörper an das Antigen, um so einen Komplex auszubilden. Dieser Komplex ist selbst ein Antigen und wird manchmal hierin als ein "modifiziertes Antigen" oder zweites Antigen beschrieben. Der Komplex kann die Produktion von anti-Antigen-Antikörper (Ab1c) induzieren, welcher fähig ist, ein anderes Epitop auf dem Antigen zu binden, als das, welches durch den Ab1-Antikörper gebunden ist. Nachweise für diesen Weg umfassen ebenfalls kompetitive Assays, aber Vergleich des inhibitorischen Effekts auf Ab1c durch Antikörper, welche an verschiedene Epitope auf dem Antigen binden oder Fehlen von Inhibierung mit Ab1.

Zusätzlich zum Produzieren von Ab3 und/oder Ab1c, was typischerweise mit einer humoralen Immunitätsreaktion assoziiert ist, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch einen therapeutischen Nutzen durch Induzierung einer zellulären Immunitätsreaktion (zellvermittelte Immunität) hervorrufen, wie im Abschnitt zum Hintergrund beschrieben. Sowohl die zelluläre als auch die humorale Reaktion involvieren indirekte Mechanismen zum Ändern der Immogenität des Wirts.

Zusammenfassungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch direkte Mechanismen zum Töten unerwünschter Zellen, wie etwa Krebszellen, initiieren. Zum Beispiel bei Antikörper-abhängiger, zellvermittelter Cytotoxizität (ADCC) kann ein AB1-Antikörper, welcher durch seine Fab-Region an ein vorbestimmtes Antigen gebunden ist, an den Fc-Rezeptor eines Lymphocyten durch die Fc-Region des Ab1-Antikörpers binden. Eine solche Mitwirkung zwischen einem Antikörper und Immunsystemzellen produziert eine Effektorfunktion, welche Tumorzellen, infektiöse Stoffe und allogenische Zellen auflösen kann. Andere, indirekte Mechanismen involvieren Komplement-vermittelte Cytotoxizität (CDC), Apoptose, (Neutralisierung von immunosuppressiven Tumor-assoziierten Antigenen), Induktion von Cytokinen und/oder Chemokinen, Neutralisierung immunosuppressiver Moleküle und Neutralisierung von Antiadhäsionsmolekülen unter anderem.

Wie hierin verwendet, involviert ein umfassender Ansatz zur Bereitstellung eines therapeutischen Nutzens ein oder mehr oder alle der folgenden: Zelluläre Immunität und die Moleküle, die bei ihrer Produktion involviert sind; humorale Immunität und die Moleküle, welche bei deren Produktion involviert sind; ADCC-Immunität und die Moleküle, welche bei deren Produktion involviert sind; CDC-Immunität und die Moleküle, welche bei deren Produktion involviert sind; natürliche Killerzellen, und Cytokine und Chemokine, und die Moleküle und Zellen, welche bei deren Produktion involviert sind. Ein Fachmann wird erkennen, dass eine nützliche Immunitätsreaktion (und dadurch Überkommen einer Immunotoleranz) durch eine Anzahl von Wegen bestimmt werden kann. Aktivierung der multiplen Zweige des Immunsystems kann z.B. dadurch bestimmt werden, dass die Antigen-spezifischen Immunitätsreaktionen vor und nach Behandlung bestimmt werden, oder durch Messen der Verringerung oder Verbesserung von Tumorbelastung und/oder Tumorgröße oder durch Bestimmen einer erhöhten Überlebenszeitspanne.

Spezifische Nachweise für die Induzierung einer nützlichen Immunitätsreaktion oder Bereitstellen eines therapeutischen Nutzens würde einen oder mehr der folgenden beinhalten:

1. Eine humorale Reaktion auf den verabreichten Antikörper (Ab1), einschließlich Nachweis von HAMA und/oder Ab2;
2. Eine humorale Reaktion auf das Antigen, einschließlich Nachweis für das Auftreten von Antigen-spezifischen Antikörpern auf den selben und/oder verschiedenen Epitopen auf dem Antigen als dem Epitop für das Bindungsmittel (z.B. Ab3 und/oder Ab1c);
3. Antikörper-abhängige Cytotoxizität, einschließlich Nachweis, dass Serum nach Injektion mit einem Antigen-spezifischen Antikörper-Titer Tumorabtötung vermittelt, wenn das Serum mit Peripherblut-monoklonalen Zellen und Tumorzellzielen relativ zum Prä-Injektions-Basislinienserum inkubiert ist;
4. Komplement-abhängige Cytotoxizität, einschließlich Nachweis, dass nach der Injektion Serum, welches mit Komplement-enthaltendem Plasma, kombiniert wurde, Tumorzellziele relativ zum Prä-Injektions-Basislinienserum tötet;
5. Natürliche-Killerzellen-Aktivität, einschließlich verstärktem Tumorzellen-Töten durch Peripherblut-monoklonale-Zellen (enthaltend NK-Zellen) in Blutproben nach Injektion, welche entnommen wurden vor dem Auftreten einer messbaren Antikörper-Reaktion auf das TAA relativ zu mononuklearen Zellen im peripheren Blut vor der Behandlung;
6. Antigen-verstärkte Cytotoxizität, einschließlich verstärkter Tötung von Tumorzellzielen durch mononukleare Zellen von peripherem Blut (in der Anwesenheit von TAA-positiven Tumorzellen) relativ zu Gehalten vor der Verabreichung, und
7. Zelluläre Immunität, einschließlich Augenscheinlichkeit von T-Zellen-Proliferation oder Tumorzellenauflösung nach der Injektion relativ zu vor der Injektion.

Weiterhin kann Augenscheinlichkeit einer nützlichen Immunitätsreaktion eine Demonstration umfassen, dass der Bindungsmittel-Antigen-Komplex zu einer aktiveren T-Zellen-Proliferationsreaktion führt als die Reaktion auf entweder das Bindungsmittel oder das Antigen alleine (in PBMC nach der Behandlung gegenüber vor der Behandlung). Ein Fachmann wird auch erkennen, dass diese Batterie von Beweisen zeigt, dass die Zusammensetzungen und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verschiedene, unterschiedliche Immunsystemwege induzieren, und dass diese verschiedenen Wege variierende, relative Wichtigkeit für einen bestimmten Patienten haben, in Abhängigkeit der spezifischen Immunkonstitution des Individuums.

IMMUNOGENITÄTSVERSTÄRKER

1. GERINGE DOSIS

Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Zusammensetzung, welche das Bindungsmittel umfasst, in einer Menge verabreicht werden, welche genügend ist, das Antigen zu erkennen und zu binden, wie etwa ein vorbestimmtes Tumor-assoziiertes Antigen (TAA), und weiter bevorzugt ein lösliches, multi-epitopisches Antigen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Dosis genügend, um eine nützliche und vorzugsweise effektive Immunitätsreaktion gegen das Antigen zu erzeugen oder hervorzurufen; siehe Beispiel 17. Eine immunologische oder therapeutisch effektive oder akzeptable Menge von Bindungsmittel ist eine Menge, welche genügend ist, ein vorbestimmtes Antigen in vivo oder ex vivo zu binden, und fähig ist, eine effektive Immunitätsreaktion auf das Antigen auszulösen. Die Reaktion kann Zellen inhibieren oder töten, z.B. Tumorzellen, welche ein neu zugängliches Epitop tragen und präsentieren, wodurch die Krankheit oder der Zustand, welche/r das Antigen produziert, verbessert oder eliminiert wird. Die Immunitätsreaktion kann in Form einer humoralen Reaktion vorliegen, einer zellvermittelten Reaktion oder beidem. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Dosis des monoklonalen Antikörpers geringer als die Dosis, welche nötig ist, ADCC oder CDC auf das verabreichte Bindungsmittel zu produzieren.

Die Konzentration oder Dosis des Proteins in der Zusammensetzung kann weit variieren, z.B. von weniger als etwa 0,01% bis etwa 15 bis 20%, bezogen auf das Gewicht.

Wie zuvor bemerkt, wird die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht, welche genügend ist, eine Immunitätsreaktion gegen das Antigen zu stimulieren. Mengen, welche für diese Verwendung effektiv sind, hängen teilweise von der Schwere der Krankheit und dem Zustand des Immunsystems des Patienten ab. Allgemein umfasst die Zusammensetzung in etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg oder mehr Proteinmittel pro kg Körpergewicht, übliche Dosen von etwa 1 μg bis etwa 200 μg pro kg Körpergewicht, was von Fachleuten auf diesem Gebiet als eine geringe Dosis anerkannt wird. Weiterhin werden Fachleute auf diesem Gebiet die verschiedenen Erwägungen, welche angestellt werden zum Bestimmen einer geeigneten Dosis, erkennen und zu evaluieren wissen. Die Konzentration ist üblicherweise mindestens 0,5%; jegliche Menge kann ausgewählt werden, primär basierend auf Flüssigkeitsvolumen, Viskosität, Antigenität etc., gemäß der besonderen Verabreichungsart.

Ein Verfahren und eine Zusammensetzung einer Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Zusammensetzung, welche eine geringe Dosis eines Bindungsmittels umfasst, wobei geringe Dosis eine Menge bezeichnet, die weniger als etwa 2 mg pro kg Körpergewicht und noch mehr bevorzugt zwischen etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht beträgt, und wobei die Verabreichung der Zusammensetzung, welche eine geringe Dosis von Bindungsmittel umfasst, eine nützliche Immunitätsreaktion induziert.

2. PHOTOAKTIVIERUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Antikörper photoaktiviert werden. In einigen Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf die Herstellung von Antikörpern unter Verwendung von UV-Licht, so dass die Immunogenität des gesamten Antikörpers erhöht wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Erhöhung der Immunogenität auf die Erhöhung der Erkennung und/oder Reaktion auf einen anti-idiotypischen und/oder anti-isotypischen Antikörper. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erhöht das Verfahren die Immunogenität des Immunogens, ohne seine Antigenität zu ändern oder nachteilig zu beeinflussen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann es nützlich sein, eine erhöhte Reaktion zu erzeugen, um einen therapeutischen Nutzen zu erzeugen. Zum Beispiel kann es gemäß der vorliegenden Erfindung es wünschenswert sein, UV-exponierte Antikörper einem Krebspatienten zu verabreichen, mit dem spezifischen Zweck, eine Immunitätsreaktion auf den UV-exponierten Antikörper zu erzeugen (d.h. anti-idiotypische Antikörper zu produzieren). Diese Reaktion kann einen therapeutischen Vorteil über die humoralen und zellulären Konsequenzen, welche auf die Krebszellen gerichtet sind, bereitstellen. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung weist das UV-exponierte Protein erhöhte Immunogenität auf und kann daher nützlich als ein Therapeutikum für eine Krankheit sein.

Die Proteinveränderungsvorgänge gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu einem modifizierten Protein mit erhöhtem, immunogenem Potential. Vielleicht wurde die Hydrophobizität/Hydrophilizität durch geringfügige Tryptophanspaltung (disruption) in Kombination mit Sulfhydrylerzeugung verändert, um seine Erkennung/Reaktion durch die Immunzellen zu verstärken. Es ist weiterhin möglich, dass der konstante Teil des Antikörpers Schlüssel-Aminosäuren-spezifische Veränderungen aufweist, welche Fc-vermittelte, Antigen-präsentierende Zell-Erkennung verstärkt.

Dies betrifft nicht Veränderungen im polymeren Zustand des Proteins, wodurch aggregierte Formen (wie sie für menschliche Immunoglobuline nach UV-Exponierung beobachtet wurden) auf phagocytische Zellen gerichtet werden, da das photoaktivierte Produkt seinen monomeren Zustand beibehält. Das schließliche Ausmaß von Präsentation und Reaktion des Antikörper/Antigen-Komplexes verbessert sich typischerweise als Folge der Photoaktivierung, wie durch HAMA-Reaktion von Antigen-positiven Patienten detektiert, welchen der photoaktivierte Antikörper injiziert wurde.

Prozesse für Photoaktivierung eines Bindungsmittels sind im Fachbereich extrem gut bekannt, und umfassen: den Antikörper Strahlung aussetzen, wobei der resultierende, veränderte Antikörper fähig ist, eine Immunreaktion zu erzeugen, wenn er einem Tier verabreicht wird, welches typischerweise fähig ist, eine Immunreaktion auf die native Form des Antikörpers zu erzeugen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Antikörper ultraviolettem Licht ausgesetzt. Typischerweise kann der Antikörper ultraviolettem Licht bei einer Wellenlänge von etwa 200 nm bis etwa 400 nm ausgesetzt werden, bei von etwa 0,1 bis etwa 1000 J/cm², während von etwa 1 bis etwa 180 Minuten (mehr bevorzugt etwa 10 bis etwa 30 Minuten). Tests, welche unter diesen Bedingungen durchgeführt wurden, zeigen, dass die Prozesse üblicherweise zu einem intakten oder ganzen Antikörper führen, welcher aktiviert wurde. Diese Tests legen nahe, dass der erfindungsgemäße Prozess Sulfhydrile zwischen den leichten und schweren Ketten des Antikörpers erzeugt.

3. ZUFUHRSYSTEM

Da einige Bindungsmittel, wie etwa Proteine, für sich genommen schwache Immunogene sind, kann deren Immunogenität durch Verabreichung in immunologischem Hilfsstoff und Antigen-Zufuhr-Systemen erhöht werden. Die Immunogenität einer spezifischen Zusammensetzung kann auch durch die Wahl des Zufuhrweges ("Route") erhöht oder optimiert werden. Zum Beispiel kann die Immunogenität von Zusammensetzungen, welche entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden und einen monoklonalen Antikörper umfassen, durch Auswahl eines Zufuhrweges erhöht werden, welcher den direkten Kontakt zwischen dem Bindungsmittel und dem Antigen erhöht. Der bevorzugte Weg ist intravenös, weiter bevorzugt mit Hilfsmittel. Fachleute auf diesem Gebiet sind mit den verschiedenen, zur Verfügung stehenden Möglichkeiten vertraut, und warum ein Weg für ein besonderes Bindungsmittel einem anderen vorgezogen wird.

Ein Fachmann wird auch erkennen, dass Liposome, Nanosphären, Mizellen oder Microsphären verwendet werden können, um die Zusammensetzung zu verabreichen, und dass eine solche Verabreichung die Immunogenität erhöhen kann.

4. PHOTOSENSIBILISATOREN

Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können einen oder mehr Photosensibilisatoren umfassen. Beispiele für Photosensibilisatoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fluorescein, Hämatoporphyrin-Derivate (z.B. Photofrin^®), Porphyrin-Derivate und Perylenchinoid-Pigmente. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Photosensibilisator die Verwendung von Perylenchinon(PQP)-Derivaten als photodynamischem Mittel und die Verwendung von PQP-Derivaten bei immunophotodynamischer Therapie (IPT).

Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit durch Verabreichen einer therapeutisch genügenden Menge mindestens eines PQP-Derivats, welches an ein Bindungsmittel gebunden ist, und Aktivieren des Konjugates; typischerweise durch Photoaktivierung des PQP-Derivats. Typischerweise kann das PQP-Derivat dadurch aktiviert werden, dass das Derivat einer bestimmten Lichtwellenlänge ausgesetzt wird. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Behandeln von Krebs, welches verstärkt wird in Gegenwart von Lichtwellenlängen zwischen etwa 400 nm und etwa 850 nm. Geeignete PQPs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, die in US-Seriennummer 08/782,048 offenbart sind, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das PQP Hypocrellin B, Moleküle abgeleitet von Hypocrellin B, und Zusammensetzungen, welche HB oder ein oder mehrere seiner Derivate umfassen.

Die erwünschten Charakteristika für einen PDT-Sensibilisator umfassen zumindest ein oder mehrere der folgenden Charakteristika: gute Absorption von Licht in einer Wellenlänge, welche in Gewebe bis zu einer gewünschten Tiefe eindringt (Absorption im 600-nm- bis 850-nm-Bereich dringt in die Haut viele Millimeter tief ein), Komponente sensitiv gegenüber pH inaktiv, niedrige Aktivität oder Aktivität, welche durch den für normales Gewebe charakteristischen pH zerstört wird, aber aktiv oder höhere Aktivität bei dem pH der zu behandelnden Zellen oder Organismen; eine aus dem Körper schnell ausscheidende Komponente, und, wenn eine Komponente zur Behandlung fester Tumore eingesetzt werden soll, sollte sie die Fähigkeit haben, entweder in Gegenwart und/oder Abwesenheit von Sauerstoff dem Problem von Tumorzellenhypoxie zu begegnen. Der Photosensibilisator sollte eine geringe Dunkel-Cytotoxizität aufweisen, und exzellente Photopotenzierung von zellulärem Schaden. Der PDT-toxische Effekt kann durch nekrotischen, apoptotischen Zelltod vermittelt werden oder durch die Stase des Tumorgefäßsystems oder -gefäßbetts.

5. EFFEKTOREN

Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches gebunden ist an oder verwendet wird mit einem oder mehreren Effektoren. Wie hierin verwendet, bezeichnet Effektor eine Substanz, welche die Aktivität des Bindungsmittels beeinflusst, ohne an die Substrat-(oder Antigen-)Bindungsstelle zu binden.

Ein konzeptionell direktes Verfahren zum Funktionalisieren rekombinanter Antikörper besteht in der sequentiellen Fusion des Antikörpergens mit dem Gen eines zweiten Proteins und Exprimieren des resultierenden Fusionsproteins als einem einzelnen Protein. Beispiele für zweite Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf:

a) Eine Signalverstärkungsgruppe, wie etwa eine Biotinmimetische-Sequenz, welche am C-Terminus des Bindungsmittels aufgrund der starken Affinität von Streptavidin-Biotin als ein Detektionsanhängsel eingeführt werden kann.
b) Liposome: Fusion bestimmter Aminosäuresequenzen (mit unter physiologischen Bedingungen negativen Ladungen) mit einem Bindungsmittel, wie etwa ein einzelkettiges Fv-B43.13. Daher kann das Fusionsprotein leicht durch Liposome gefangen werden.
c) Cytokin-Sequenzen (z.B. IL-2): IL-2 ist ein Lymphokin, welches primär durch T-Helfer-Lymphocyten synthetisiert und sekretiert wird, welche durch Stimulierung des T-Zellen-Rezeptor-Komplexes mit Antigen/MHC-Komplexen auf der Oberfläche Antigen-präsentierender Zellen aktiviert wurden. Die Reaktion von T-Helfer-Zellen auf Aktivierung ist Induktion der Expression von IL2 und IL2-Rezeptoren. IL2 besitzt eine Mannigfaltigkeit an anderen Aktivitäten, welche B-Zellen-Wachstum und -Differenzierung beeinflussen; Bildung von LAK-Zellen, und Erhöhung von NK-Zellen und Erhöhung ihrer cytolytischen Aktivität. Aufgrund der zentralen Rolle des IL2/IL2-Rezeptor-Systems bei der Vermittlung der Immunreaktion ist es offensichtlich, dass Manipulation dieses Systems wichtige, therapeutische Implikationen hat. IL2 hat sich schon als anti-Krebs-Medikament als vielversprechend herausgestellt, aufgrund seiner Fähigkeit, Proliferation und Aktivitäten Tumor-attackierender LAK- und TIL-Zellen zu stimulieren.
d) Toxin: Immunotoxine, hergestellt durch Anheften eines Toxins (z.B. Pseudonomas extoxin und Bakterien-RNase) an Antikörper oder Antikörper-Fragmente, um cytotoxische Moleküle zu produzieren, welche Ziel-Tumorzellen töten.
e) Enzyme: Ein Antikörper-gerichtetes Enzym-Pro-Medikament-Therapiesystem ist eine besonders attraktive, artifizielle Effektormethode. Bei diesem Ansatz wird ein Antikörper verwendet, um ein Enzym auf den Tumor abzuzielen und es dort zu behalten, während das Antikörper-Enzym-Konjugat aus normalem Gewebe ausscheidet. Ein nicht-toxisches Pro-Medikament wird dann verabreicht, und dieses wird durch das Enzym aktiviert, ein cytotoxisches Medikament am Ort des Tumors zu produzieren.
f) Radionuklid-Chelator: ein jegliches Peptid, welches an einen Radionuklid-Chelator bindet, z.B. Metallotheonein (MT). MT ist ein ubiquitäres, Metall-bindendes Protein von niedrigem Molekulargewicht, welches bei Metallmetabolismuns und Detoxifikation eine Rolle spielt. Säugetierformen von MT binden sieben Ionen in tetrahedralen Metallthiolat-Clustern, einschließlich Technetium und anderen Metallen, welche für zielgerichtete Radiodiagnose oder -therapie nützlich sind.
g) ein Phagocytose-Verstärker, z.B. Tuftsin. Tuftsin ist ein natürliches Tetrapeptid (Thr-Lys-Pro-Arg), bei welchem gefunden wurde, dass es mehrere biologische Aktivitäten aufweist, einschließlich Aktivierung von Makrophagen, Monocyten und Stimulierung von Phagocytose. Es hat ein breites Spektrum von immunoadjuvanten Aktivitäten, welche es auf Phagocyten, die polymorphonuklearen Leukocyten, die Monocyten und die Makrophage ausübt. In Tier- und Menschenstudien hat Tuftsin anti-Tumor- und anti-Infektions-Aktivität bei keiner detektierbaren Toxizität gezeigt.

Das Fusionsprotein scFv-Tuftsin wurde als ein rekombinantes Fusionsprotein definiert, welches aus einem, mittels eines künstlichen Linkers mit Tuftsin verbundenen scFv-Antikörper-Bindungs-Bereich besteht. Dieses bi-funktionelle Protein wurde entworfen, um höhere, spezifisch anti-idiotypische Immunogenität zu erreichen.

Verfahren

In einer Ausführungsform der Erfindung induziert MAb-B43.13, welches auf ein erstes Epitop auf dem multi-epitopischen Antigen CA125 gerichtet ist, eine Immunreaktion gegen CA125 durch ein oder mehrere Epitope auf dem CA125-Antigen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind jegliche der zweiten Epitope verborgene oder zuvor unzugängliche Epitope, welche exponiert werden oder für Interaktion mit einer Komponente der Immunsystemreaktion zur Verfügung stehen, nachdem MAb-B43.13 an das Antigen bindet. Verborgen oder zuvor unzugänglich bezieht sich auf ein Epitop oder eine Bindungsstelle auf dem vorbestimmten Antigen, welche/s das Immunsystem nicht aktiviert oder stimuliert, wenn das Antigen nicht durch ein erfindungsgemäßes Bindungsmittel gebunden ist.

Wie hierin verwendet, bezieht sich "verabreichen" auf jegliche Handlung, welche zu Exponierung oder In-Kontakt-Bringen einer Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel enthält, mit einer vorbestimmten Zelle, Zellen, oder Gewebe, typischerweise von Säugetieren, führt. Wie hierin verwendet, kann Verabreichen in vivo, in vitro oder ex vivo vorgenommen werden. Zum Beispiel kann eine Zusammensetzung durch Injektion oder durch ein Endoskop verabreicht werden. Verabreichen umfasst auch die direkte Applikation einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf Zellen. Zum Beispiel können während des Verlaufs einer Operation Tumorzellen exponiert werden. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können diese Zellen (oder Tumore) direkt einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung ausgesetzt werden, z.B. durch Waschen oder Spülen der Operationsstelle und/oder Zellen.

Für Krankheiten, welche teilweise dadurch charakterisiert werden können, dass sie ein Tumor-assoziiertes Antigen aufweisen, welches multi-epitopisch ist, umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung In-Kontakt-Bringen eines löslichen Antigens mit einem Bindungsmittel (BA), welches spezifisch an ein einzelnes Epitop auf dem multi-epitopischen, Tumor-assoziierten Antigen bindet.

Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren muss das Bindunsgmittel fähig sein, eine vorbestimmte Bindungsstelle oder einen vorbestimmten Rezeptor zu binden und kann dem Patienten auf jedem immunologisch geeigneten Weg verabreicht werden. Zum Beispiel kann das Bindungsmittel in den Patienten eingeführt werden durch einen intravenösen, subkutanen, intraperitonealen, intrathekalen, intravesikalen, intradermalen, intramuskulären oder intralymphatischen Weg. Die Zusammensetzung kann vorliegen in Form von Lösung, Tablette, Aerosol oder Multi-Phasen-Zusammensetzung. Liposome, lange zirkulierende Liposome, Immunoliposome, bioabbaubare Microsphären, Mizellen oder dergleichen können als Träger, Vehikel oder Zufuhrsystem verwendet werden.

Weiterhin kann unter Verwendung von im Fachbereich wohlbekannten ex-vivo-Verfahren Blut oder Serum dem Patienten entnommen werden; optional kann es wünschenswert sein, das Antigen im Blut des Patienten zu reinigen; das Blut oder Serum kann dann gemäß der Erfindung mit einer Zusammensetzung gemischt werden, welche ein Bindungsmittel umfasst, und das behandelte Blut oder Serum wird dem Patienten wieder zugeführt. Der Kliniker kann die anti-idiotypischen und anti-isotypischen Reaktionen, welche mit den verschiedenen Wegen assoziiert sind, vergleichen, um den effektivsten Verabreichungsweg zu bestimmen. Die Erfindung sollte nicht auf ein besonderes Verfahren der Einführung des Bindungsmittels in den Patienten beschränkt sein.

Verabreichung kann einmal erfolgen, mehr als einmal oder über eine längere Zeitspanne. Da die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für Patienten in einem schweren Krankheitsstadium verwendet werden, d.h. lebensbedrohlich oder potentiell lebensbedrohlich, kann, wenn wünschenswert, auch ein Überschuss an Bindungsmittel verabreicht werden. Tatsächliche Verfahren und Protokolle zur Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen, einschließlich Verdünnungstechniken zum Injizieren der vorliegenden Zusammensetzungen, sind wohlbekannt oder werden für den Fachmann offensichtlich sein.

Einige dieser Verfahren und Protokolle sind in "Remington's Pharmaceutical Science", Mack Publishing Co. (1982) beschrieben.

Ein Bindungsmittel kann in Kombination mit anderen Bindungsmitteln verabreicht werden oder kann in Kombination mit anderen Behandlungsprotokollen oder -mitteln, wie z.B. chemotherapeutischen Mitteln, verabreicht werden.

Die Effektivität der Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung kann in vitro oder in vivo beobachtet werden. Humorale Reaktionen können in vitro durch herkömmliche Immunoassays beobachtet werden, wobei die anti-Tumor-Aktivität der Reaktion durch Komplement-vermittelte Cytotoxizitäts-Assays und/oder Antikörper-abhängige, zelluläre Cytotoxizitäts(ADCC)-Assays bestimmt werden kann. Die Assaymethodologien sind wohlbekannt und sind im "Handbook of Experimental Immunology", Vol. 2, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986) beschrieben. Andere Assays können darauf gerichtet werden, den Gehalt an Antigen im Patienten oder im Gewebe zu bestimmen. Zell-vermittelte Immunität kann in vivo beobachtet werden durch die Entwicklung von Hypersensitivitätsreaktionen des verzögerten Typs oder andere in-vivo- oder in-vitro-Mittel, welche den Fachleuten bekannt sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Hauttestreaktionsprotokolle, Lymphocyten-Stimulierungs-Assays, Messen der Toxizität der Lymphocyten eines Subjekts auf Tumorzellen durch Verwendung eines Standard-Cytotoxizitäts-Assays, durch ein Limiting Dilution Assay oder durch Messung von Plasmagehalten von Cytokinen unter Verwendung von Standard-ELISA-Assays.

Bestimmen der Effektivität eines spezifischen Bindungsmittel-Antigen-Paars kann auch durch Beobachtung der Zelltötung erfolgen. Fachleute auf diesem Gebiet werden anerkennen, dass es eine Vielzahl von Mechanismen gibt, die als Nachweis für Zelltötung gelten. Wie in den Beispielen gezeigt, kann Zelltötung gezeigt werden durch Aufzeigen, dass Ab3 ADCC vermittelt, dass Ab1 und HAMA CDC vermitteln, dass natürliche Killer(NK)-Zellen produziert werden, und/oder dass cytotoxische T-Lymphocyten (CTLs) produziert werden.

BEISPIELE

Beispiel 1

Antikörper-vermittelte Immuntherapie

Einfluß von zirkulierendem Antigen bei der Induktion Antigen-spezifischer anti-Tumor-Immunreaktionen

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung Antigen-spezifischer muriner, monoklonaler Antikörper, um eine Immunreaktion gegen ein immunsuppressives, Tumor-assoziiertes Antigen zu induzieren. Injektion eines Antikörpers gegen ein spezifisches Epitop in einem multi-epitopischen Antigen kann zu Immunreaktionen gegen verschiedene, andere Epitope auf diesem Antigen führen.

In einem Versuch, den Handlungsmechanismus von Mab-B43.13 zu verstehen, wurden verschiedene, immunologische Parameter bei Eierstockkrebspatienten untersucht, welchen dieser Antikörper injiziert wurde. Diese Untersuchungen zeigen klar Aktivierung sowohl der humoralen als auch der zellulären anti-Krebs-Immunreaktionen.

Die Erzeugung menschlicher, CA125-bindender Antikörper wurde vor Injektion von MAb-B43.13 gemessen und mit den Gehalten an CA125 vor Injektion wie auch Überlebensdaten korreliert. Tabelle 1 zeigt, dass die Erzeugung von anti-CA125-Antikörpern mit den Gehalten an CA125 vor der Injektion korreliert. Zirkulierendes CA125 beeinflusst die Entwicklung von anti-CA125-Antikörpern nur, wenn Patienten die Mab-B43.13-Injektion erhielten. Wenn anti-CA125-Antikörper vor Injektion von Mab-B43.13 verglichen werden zwischen Patienten mit niedrigen oder hohen CA125-Werten (unter oder über 102 U/mL), wurde kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen gefunden (Tabelle 1). Eine minimale Konzentration von 105 U/mL CA125 wurde als repräsentativ für eine signifikante Menge CA125 ausgewählt.

Tumortötung entweder durch einen anti-CA125-Antikörpervermittelten ADCC-Mechanismus oder durch CA125-spezifische CLTs führt zu erhöhtem Überleben bei Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde. Obwohl angeführt wurde, dass hohe Gehalte an Serum-CA125 ein schlechter, prognostischer Indikator sind, scheinen sie einen nützlichen Effekt in Kombination mit der Injektion von anti-CA125-Antikörper in solche Patienten zu haben. Zum Beispiel erhöhte sich die Immunitätsreaktion gegen CA125 um mehr als 20%, wenn die CA125-Gehalte mehr als 105 Einheiten pro ml waren, was wiederum das mittlere Überleben bei solchen Patienten von 39,1 Monat auf 54,5 Monate erhöhte (Tabelle 1). Daher führt die Injektion eines Bindungsmittels in einen Patienten, welcher erhöhte Gehalte von multi-epitopischem, löslichem Antigen aufweist, zu Antigen-spezifischer, humoraler und zellulärer Reaktion, was wiederum zur Tumortötung, gefolgt von verbessertem Überleben, führt. Ähnliche Resultate wurden für CA125-Gehalte von 5 und 9,5 Einheiten pro ml erhalten. TABELLE 1 Korrelation zwischen Serum-CA125-Gehalten, menschlicher anti-CA125(Ab1')-Reaktion und Überleben bei Patienten, welchen Mab-B43.13 injiziert wurde

TABELLE 2 Korrelation zwischen Serum-CA125-Gehalten und Antikörper-Gehalten bei Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde

Die Korrelation zwischen CA125-Antikörpern und Überleben mit einem CA125-Schwellenwert von 105 U/ml ist in Tabelle 3 gezeigt.

TABELLE 4 Reaktion von Patienten mit detektierbaren oder mittleren Gehalten an CA125

In einem Versuch, den Mechanismus hinter der anti-CA125-Antikörperbildung durch MAb-B43.13-Injektion bei Krebspatienten zu verstehen, haben wir die menschlichen anti-CA125-Antikörper charakterisiert, welche in deren Seren gegenwärtig waren. Zum Beispiel würde, wenn die anti-CA125-Antikörper auf die Art erzeugt würden, wie das idiotypische Netzwerk es suggeriert, MAb-B43.13 anti-MAb-B43.13-Antikörper erzeugen, von denen einige exakt das CA125-Antigen (= Ab2) nachahmen würden. Diese wiederum können anti-CA125-Antikörper (= Ab3) erzeugen. Die Ab3, welche durch diesen Weg erzeugt wurden, wurden an das gleiche Epitop auf CA125 wie das Ab1 (= B43.13) binden und würden daher mit der Bindung von Ab-B43.13 an das Antigen konkurrieren.

Auf der anderen Seite binden Antikörper, welche durch das Antigen selbst erzeugt wurden, an verschiedene Epitope, welche auf dem Antigen zugänglich sind. Wenn die anti-CA125-Antikörper auf eine Art erzeugt wurden, wie es durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagen wird, würde der Weg folgen: Ab1 + lösliches Antigen → Ab1c. Diesem Schema folgend würde MAb-B43.13 (Ab1) das CA125-Serumantigen binden, was wiederum einen anti-CA125-Antikörper (Ab1c) erzeugen würde. Weiterhin würden über diesen Weg erzeugte Ab1c-Antikörper binden und inhibiert werden durch andere anti-CA125-Antikörper, wie etwa B27.1 oder M11, da, wie obig bemerkt, CA125 multi-epitopisch ist und B43.13-, M11- und B27.1-Epitope unterschiedlich (distinct) sind. Auch wird Ab1c nicht an anti-MAb-B43.13-Antikörper binden.

Analyse der Serumproben mit positivem anti-CA125-Titer zeigte, dass deren Bindung an CA125 nicht nur durch MAb-B43.13-Einzelkettenantikörper, sondern auch durch F(ab')-Fragmente von anderen CA125-Antikörpern, B27.1 und M11 inhibiert werden konnten, welche Epitope auf CA125 erkennen, welche unterschiedlich von B43.13 sind (Tabellen 2 und 3). Sera von nur zwei Patienten wurden als anti-CA125-Antikörper enthaltend betrachtet, welche exklusiv über idiotypische Induktion MAb-B43.13 (= Ab3) erzeugt wurden, d.h. anti-CA125-Antikörper, welche nur und vollständig mit MAb-B43.13 inhibiert werden konnten und an polyklonales Hasen-Ab2 gebunden werden konnten.

Wenn also das Serum des Patienten anti-CA125-Antikörper enthielt, welche nur durch MAb-B43.13 inhibierbar waren, wurde es Ab3-enthaltend klassifiziert; solche die durch MAb-B27.1 inhibiert werden konnten, wurden als Ab1c klassifiziert. In anderen Worten führt Injektion eines Bindungsmittels, wie etwa eines Antikörpers, gegen ein einzelnes Epitop auf einem multi-epitopischen Antigen zur Erzeugung einer humoralen und zellulären Reaktion gegen ein anderes Epitop auf dem Antigen.

Die Gegenwart einer multi-epitopischen anti-CA125-Reaktion in Sera von mit MAb-B43.13 behandelten Patienten mit hohen CA125-Gehalten hat uns überzeugt, dass neben anti-idiotypischer Induktion andere Mechanismen existieren, um eine Immunitätsreaktion gegen Tumor-assoziierte Antigene zu induzieren. In diesem Szenario bildet der injizierte Antikörper einen Komplex mit dem zirkulierenden Antigen in vivo. Dieser Prozess kann verschiedene Effekte hervorrufen. Die Komplexierung des Antigens durch Antikörper kann die Aufnahme von CA125 durch professionelle Antigen-präsentierende Zellen (APC) erleichtern und damit das Antigen immunogener machen. Der komplexierende Antikörper – in unserem Fall von einer murinen Quelle – könnte auch als ein Adjuvanz fungieren, Zusatz einer fremden Komponente zu dem Selbst-Antigen CA125, welche Erkennung durch das Immunsystem erleichtern könnte. Epitope des Antigens werden durch den komplexierenden Antikörper blockiert und werden entweder vor einer Bearbeitung geschützt oder an verschiedenen Sequenzen verarbeitet, wodurch neue Peptide für MHC-Bindung erzeugt werden. Es ist auch möglich, dass eine Konformationsänderung in dem Antigen stattfindet, wenn Bindung an den Antikörper erfolgt, wodurch neue Epitope dem Immunsystem ausgesetzt werden, einschließlich subdominanter oder immun-latenter Epitope.

Es ist interessant, zu bemerken, dass die Komplexbildung zwischen CA125 und MAb-B43.13 auch während pharmakokinetischer Studien beobachtet wurde, wie durch Abfall an zirkulierenden-CA125-Gehalten nach Injektion von MAb-B43.13 bestimmt. Wenn Patienten mehr als eine Injektion erhielten und Patienten hohe Gehalte an menschlichen anti-Maus-Antikörpern (HAMA) entwickelten, zeigte der Antikörper ein schnelles Ausscheiden zu Leber und Milz, wie in immunoscintographischen Studien gezeigt wurde. Antigen-Antikörper-Komplexe, welche in lymphoiden Zentren, wie der Milz, angereichert wurden, sind bekannt dafür, dass sie sehr effektiv T-Zellen durch antigen-präsentierende Zellen präsentiert werden können, wie etwa B-Zellen, Makrophagen oder dendritische Zellen.

Erhöhung von Antigenbearbeitung und Präsentation durch Immunkomplexierung ist in verschiedenen Systemen gezeigt worden. Abzielung auf Tetanustoxoid auf Fc_R durch Komplexierung mit anti-Tetanustoxoid IgG führt zu einem 10- bis 1000-fachen Zuwachs bei Bearbeitung und Präsentation dieses Antigens, wie durch T_H-Zellaktivierung gemessen. Eine ähnliche Steigerung an Immunogenität wurde bei Hepatitis-B-Antigen beobachtet, welches mit seinem entsprechenden Antikörper komplexiert war. Auch die natürliche Gegenwart von Antikörpern gegen β-Galactosyl-Epitope ist verwendet worden, um Tumorimpfimmunogenität bei β-Galactosyl-modifizierten, Tumor-assoziierten Antigenen zu steigern.

Es wurde beobachtet, dass MAb-B43.13 einen schützenden Effekt auf sein CA125-Epitop während Antigenbearbeitung durch das Immunsystem hat. Das MAb-B43.13-Epitop wurde von fast allen anti-CA125-Antikörperproben von Patienten erkannt (Inhibierung in 78% der Proben, Tabelle 2).

Das Gegenteil scheint auch zuzutreffen, das heißt, CA125 hat konservierende Eigenschaften auf das Idiotyp von MAb-B43.13 während des Antigenbearbeitungsvorgangs. Die verstärkte Bildung von Ab2 bei Mäusen, welche mit dem CA125-MAb-B43.13-Komplex immunisiert wurden, verglichen mit Mäusen, welche mit MAb-B43.13-KLH (3) immunisiert wurden, und die verstärkte Ab2-Produktion in Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde, mit CA125-Titern über 105 Einheiten pro ml bestätigen diese Beobachtung. Es wird auf Tabelle 5 und 6 für eine Zusammenfassung verwiesen und auf Tabelle 6 für die Details dieser Ergebnisse. Sera von diesen Patienten wurden auf die Gegenwart von menschlichen anti-CA125-Antikörpern analysiert, durch deren Fähigkeit, an CA125 zu binden [R. Madiyalakan et al., Hybridoma, 14: 199–203, 1995) und Schultes et al., "Cancer Immunology and Immunotherapy", 46: 201–212 (1998)]. Aus gepoolten Patientensera aufbereiteter Antikörper zeigte, dass er B43.13 in ähnlichen Assays inhibiert, jedoch nicht B27.1. Die Erklärung für diese Anomalie muss noch gefunden werden. Es wurde jedoch unter Verwendung von M11-Antikörpern bestätigt, dass B43.13 an ein charakteristisches Epitop bindet und dass bei Bindung mit B43.13 CA125 tatsächlich durch das Immunsystem erkannt wird. TABELLE 5

¹: Um als signifikant betrachtet zu werden, muss die Inhibierung mindestens 15% betragen
²: Einzelketten MAb-B43.13, F(ab') MAb-B27.1 und F(ab') M11 wurden in den Inhibierungsversuchen verwendet, um nicht-spezifische Inhibierung aufgrund des Fc-Teils des Antikörpers und Kreuzreaktivität aufgrund von HAMA zu vermeiden
³: Dieses Experiment produzierte ein anomales Ergebnis, wie durch die negative Zahl augenscheinlich wird, aus bisher unbekannten Gründen
|: anti-MAb-B43.13 (Ab2) wurde aus Hasen gereinigt, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde
ND =: nicht bestimmt
NA =: nicht zutreffend

Daher kann Komplexbildung zu erhöhter anti-CA125 als auch anti-idiotypischer Antikörperbildung führen. Manca et al., "J. Immunol.", 140: 2893 (1988) und Ling et al., "Immunology", 627 (1987) haben gezeigt, dass Antikörper die Sequenz ihres Epitops während Antigenverarbeitung erhalten können, und es wurden Antikörper verwendet, um Immunitätsreaktionen auf weniger immunogene Epitope eines Antigens hervorzurufen.

Erhöhte Antigen-Präsentation von Antigen-Antikörper-Komplexen wurde erleichterter Antigenaufnahme durch den Fc_-Rezeptor (Makrophagen, dendritische Zellen) oder Membran-gebundenem Ig (B-Zellen) auf professionellen, Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zugerechnet. Der menschliche Fc_RI- und RIII-Rezeptor auf Makrophagen und dendritischen Zellen bindet nicht-murines IgG₁, aber das menschliche Fc_RII, welches Phagocytose und Pinozytose von kleinen Immunkomplexen vermittelt, hat eine starke Affinität zu diesem murinen IgG-Isotyp. Dementsprechend können verschiedene, professionelle APCs bei der vorzugsweisen Präsentation des CA125-MAb-B43.13-Komplexes involviert sein. Wir haben B-Zellen mit zwei verschiedenen Spezifitäten sowie Makrophagen als APC:CA125-spezifische B-Zellen (aus Mäusen, welche mit CA125 immunisiert wurden) und anti-MAb-B43.13-spezifische B-Zellen (aus Mäusen, welche mit MAb-B43.13 immunisiert wurden) getestet. Normale B-Zellen dienten als Kontrolle. Wenn die Proliferation von CA125-spezifischen T-Zellen beobachtet wurde anhand von [Methyl-³H]-Thymidinaufnahme, wurde optimale Stimulierung bei MAb-B43.13-spezifischen B-Zellen beobachtet, welche mit dem CA125-MAb-B43.13-Komplex (3) stimuliert wurden, gefolgt von Präsentation von CA125 durch CA125-spezifische B-Zellen. Erhöhte Präsentation von Immunkomplexen durch Makrophagen und dendritische Zellen wird vermittelt durch vorzugsweise Aufnahme durch das Fc_R. 4 bestätigt, dass CA125 effektiver durch Makrophagen präsentiert wird, wenn es mit einem Antigen-spezifischen Antikörper komplexiert ist.

Die Fähigkeit von MAb-B43.13, die Immunogenität von CA125 zu erhöhen, wurde in einem Mausmodell durch Immunisierung einer Maus mit dem CA125-MAb-43.13-Komplex studiert und mit CA125 oder MAb-B43.13 allein als dem Immunogen verglichen. Wenn das Mäuseserum auf anti-CA125-Antikörpergehalte untersucht wurde, hatten die Mäuse, welchen der Antigen-Antikörper-Komplex injiziert worden war, die höchsten Titer (siehe 5). Dies stützt die Beobachtung, dass Interaktion des Antigens mit einem spezifischen Antikörper zu einer höheren Antigen-spezifischen, humoralen Immunitätsreaktion führt, verglichen mit dem Antigen oder Antikörper allein.

Diese Ergebnisse zeigen klar, dass, wenn ein Antikörper gegen ein einzelnes Epitop (B43.13) einem Patienten injiziert wurde, eine Antikörperreaktion gegen das ganze Antigen hervorgerufen wird, welche verschiedene Epitope, welche in dem Antigen gegenwärtig sind, erkennt. In anderen Worten erzeugt Injektion eines Bindungsmittels, wie etwa einem monoklonalen Antikörper, zu einem löslichen, multiepitopischen Antigen in einem Patienten mit einem funktionierenden Immunsystem einen Antikörper auf das Antigen, wobei der erzeugte Antikörper durch Antikörper auf unterschiedliche Epitope inhibiert wird.

Beispiel 2

Ähnlich führt Injektion des Bindungsmittels bei Krebspatienten mit zirkulierendem CA125 zu Antigen-spezifischen CTLs. Mononukleare Zellen in peripherem Blut (PBMC) von acht Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde, wurden auf Cytotoxizität gegen CA125-positive oder CA125-negative Eierstocktumorzellen in einem Chrom-Freisetzungs-Assay getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Spezifizität der Auflösung (Lysis) wurde durch die Fähigkeit von MAb-B43.13, eine solche Auflösung zu inhibieren, bestätigt, sowie die Unfähigkeit, CA125-negative Tumorzellen zu töten. Von den acht Patienten, welche MAb-B43.13 erhielten, wurden bei mindestens vier Patienten (Nr. 5 bis Nr. 8) CA125-spezifische, cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) in ihrem Blut bestimmt. Die Erzeugung von CA125-spezifischen CTLs tötet wahrscheinlich Eierstockkrebszellen bei den Patienten. TABELLE 7 Cytotoxicität bei Patienten, welchen eine MAb-B43.13 enthaltende Impfung injiziert wurde

Beispiel 3

Immuntherapie von menschlichen Eierstockkarzinomen in einem Tiermodell

Um die therapeutische Effektivität zu untersuchen, wurde MAb-B43.13 in einem menschlichen-PBL-SCID/BG-Mausmodell getestet. Mäuse wurden mit menschlichem PBL (normale Donoren) durch i.p.-Injektion von 2 bis 3 × 10⁷ PBL pro Maus rekonstituiert. MAb-B43.13 wurde in einer Menge von 100 μg pro Maus in PBS verabreicht, in verschiedenen, experimentellen Ansätzen. Ein Kontrollantikörper mit passendem Isotyp (MOPC21 oder MAb-170) und PBS-Injektion diente als Kontrollen. Die Eierstockkrebszellen NIH:OVCAR-Nu3 wurden i.p. bei 1 × 10⁶ Zellen pro Maus oder s.c. bei 4 × 10⁶ Zellen pro Maus injiziert. Hu-PBL-SCID/BG-Mäusen wurden entweder vor Injektion von Tumorzellen immunisiert, oder nachdem kleine Tumore etabliert waren (zwei Wochen nach Transplantation). In einem anderen Experiment wurde Tumor-aufweisenden Mäusen MAb-B43.13 zwei Wochen nach Tumor-Transplantation, zusammen mit PBL, injiziert (s.c.).

Antikörper-Injektionen wurden zweimal in zwei-Wochen-Intervallen wiederholt. Funktionelle und zelluläre Charakterisierung von Serum und PBL von diesen Mäusen zeigte die erfolgreiche Transplantation eines menschlichen Immunsystems in diese Mäuse.

Alle drei Experimente zeigten, dass MAb-B43.13-Behandlung fähig war:
a) die Entwicklung von Tumoren zu verzögern oder zu verhindern;
b) die Größe von kleinen, etablierten Tumoren (s.c. Tumor-Injektion) zu reduzieren oder Bauchwasserproduktionen zu unterdrücken;
c) Tumorwachstum zu verzögern, wenn vor Tumorimplantation injiziert und
d) das Überleben von Mäusen (i.p. Tumor-Injektion) zu verlängern.

Menschliche Tumore infiltrierende Lymphocyten (TIL) wurden in Mäusen unter Verwendung von Flußzytomerie identifiziert, welche zu der in-vivo-anti-Tumor-Aktivität von MAb-B43.13 beitragen könnte.

Bei den Endpunkten der Therapiestudie wurden überlebende Mäuse aus verschiedenen Behandlungsgruppen euthanisiert. Blut, Milz, Tumor und peritoneale Waschwässer wurden von der Messung von menschlichem Immunoglobulin als auch flußcytometrischer Analyse von menschlichem PBL in Mausgeweben erhalten. Tumore wurden auch durch Immunohistochemie analysiert.

Beispiel 5

Induktion von idiotypischem Netzwerk auf anti-MUC-1-Antikörper bei Brustkrebs

MUC-1-Proteine (polymorphisches Epithel-Muzin), welche auf bösartigem Epithel exprimiert wurden, sind unterglycosyliert, was zu Exponierung von neuen T- und B-Zellen-Epitopen führt. Ein anti-MUC-1-muriner Klon, Alt-1, wurde erzeugt durch Immunisierung von Mäusen mit CA15.3-Antigen, einem Glycoprotein, welches aus einem MUC-1-Protein und Kohlehydrat besteht, und bezüglich seiner Bindungsspezifität auf CA15.3 durch ELISA und auf MUC-1-Transfektom durch FACS-Analyse charakterisiert. Injektion von MAb-Alt-1 (AB1), konjugiert an KLH, in Mäuse mit MUC-1-Transfektom führte zur Produktion von anti-idiotypischem Antikörper (Ab2) (7) und anti-anti-idiotypischem Antikörper (Ab3) (8). Ein Minimum von vier Injektionen bei einer Dosis von 50 μg pro Maus führte zu einer messbaren, humoralen Reaktion. Die Ab2- und Ab3-Gehalte erreichten ihr Maximum nach sechs Injektionen. Der anti-idiotypische Antikörper (Ab2) konkurrierte mit dem nativen Antigen CA15.3. T-Zellen-Proliferationsstudien zeigten spezifische Reaktion auf den injizierten Antikörper und CA15.3, was die Gegenwart von Idiotyp-spezifischen T- Zellen (T2) und anti-Idiotyp-spezifischen T-Zellen (T3) anzeigt.

Zusätzlich wurde ein Brusttumormodell unter Verwendung eines mit dem humanen MUC-1-Gen transfektierten Maus-Brust-Karzinoms 413BCR entwickelt. Gruppen von Mäusen wurden mit A1t-1-KLH oder menschlichem Immunoglobulinkonjugat behandelt und mit geeigneten, positiven Kontrollen (liposomalem MUC-1) und negativen Kontrollen (murinem Immunoglobulin) verglichen. Immunisierungen wurden zweimal vor und nach Tumorimplantation in wöchentlichen Intervallen ausgeführt. Die Tumorvolumina wurden wöchentlich gemessen und die Wachstumsraten ermittelt.

Eine signifikante Tumorreduktion wurde bei Mäusen beobachtet, welche mit Alt-1-IgG-Konjugat, verglichen mit anderen Gruppen, behandelt wurden.

Beispiel 6

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung gegen CA19.9 (Sle^a) wurde produziert, einem exzellenten Marker für Bauchspeicheldrüsenkrebs (87%), Magenkrebs (68%) und colorektalem Krebs (50%). Es ist dokumentiert worden, dass der Kohlehydratligand (Sle^a) die Kohlehydratgruppen der menschlichen, carcinoembriogenen Antigenfamilie [Anostario et al.; 1994)], von menschlichem, pankreatischem MUC-1 [Ho, et al.; (1995)] und CA19.9 [Hamanaka, et al.; Pancreas, 13:160–165 (1996)] bildet. Sle^a ist auch in menschlichen Melanomen [Ravindranath et al., Cancer, 79:1686 (1997)] und colorektalem Krebs [Yamada, et al., (1997)] identifiziert worden. Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen, dass eine Zusammensetzung, welche ein für Sle^a (oder ein oder mehrere andere Adhäsionsmoleküle) spezifisches Bindungsmittel enthält, wobei eine solche Zusammensetzung, welche ein oder mehrere andere Bindungsmittel, welche für andere Antigene oder Moleküle spezifisch sind, optional enthalten kann, bei der Behandlung von vielen anderen Krebsarten nützlich ist, da SLe^a in großen Mengen auf der Oberfläche von vielen anderen Tumoren exprimiert wird [Srinivas, et al.; (1996)].

Das Bindungsmittel in der Zusammensetzung war Alt-3, ein IgG3-monoklonaler Antikörper, welcher stark an CA19.9 bindet und von dem gezeigt wurde, dass er Tumortötung durch CDC in vitro vermittelt.

Etwa 10⁴ mit Chrom-Markierung versehene SW 1116 (2200 CPM) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Alt-3, Alt-2, NS 1116, Alt-4, und unspezifischem mIgG3 (20 μg/ml bis 0,0025 μg/ml) inkubiert. Die Antikörper wurden 45 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Bei den Behandlungsgruppen, welche mit HAMA inkubiert wurden, wurden die Antikörper zweimal mit Medium gewaschen und mit 1 μg/ml HAMA 45 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Alle Platten wurden gewaschen und Effektorzellen (frische gesammelte, menschliche PBLs) oder frisches, menschliches Serum (20% in Medium) zugegeben und für vier Stunden inkubiert. Der cytotoxische Index (C.I.) wurde dann berechnet. Gepaarter T-Test wurde verwendet, um jede Konzentration zu analysieren.

Dieses Experiment zeigt, dass Alt-3 und Alt-2 extrem effektiv in Komplement-vermittelter Cytotoxizität sind (9). Eine solche Cytotoxizität wird in der Gegenwart von HAMA verstärkt. Der anti-Tumoreffekt von Alt-3 wurde auch in SCID/BG-Mäusen analysiert, welche mit menschlichem PBL rekonstituiert wurden. Dieses Experiment zeigt eine Verringerung an Tumorvolumen als eine Folge des Bindungsmittels und des Bindungsmittel/Antigen-Komplexes. (10).

Beispiel 7

PSA-gerichtete Immuntherapie von Prostatakrebs

(Produktion von AR47.47)

Prostata-spezifisches Antigen (PSA) stellt ein attraktives Ziel für die Immuntherapie von Prostatakrebs dar. Dieses Glycoprotein wird fast exklusiv durch die Prostatadrüse synthetisiert und wird derzeit für die Diagnose und die Beobachtung von Prostatakrebspatienten verwendet. Da jedoch PSA als ein Selbst-Antigen anerkannt ist, ist es essentiell für effektive Immuntherapie, innovative Strategien zu entwickeln, welche fähig sind, das Immunsystem zu triggern und eine Schutzimmunität gegen PSA-exprimierende Zellen zu induzieren. Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines Antikörpers, um eine anti-idiotypische Kaskade, welche mit einer Antigen-spezifischen anti-Tumor-Immunitätsreaktion assoziiert ist, auszulösen. Eine lange Liste von anti-PSA-monoklonalen Antikörpern ist in unserem Labor hergestellt worden, und diese Antikörper wurden auf ihre potentielle, therapeutische Wirksamkeit gegen Prostatakrebs evaluiert. Wir haben gezeigt, dass die Immunisierung von Mäusen mit einem ausgewählten anti-PSA-Antikörper eine spezifische Immunität gegen PSA selbst induzieren kann. Diese Ergebnisse heben daher die potentielle Verwendung von anti-PSA-Antikörpern für die Immuntherapie von Prostatakrebs hervor.

anti-PSA-Antikörper-sekretierende Hybridomklone wurden durch Fusion von murinen Myelomzellen Sp2/O mit den Splenocyten einer Balb/c-Maus, welche mit menschlichem PSA immunisiert war, hergestellt. Ein beispielhafter Klon AR47.47 bindet an ein Epitop von PSA, welches Aminosäuresequenzen 139–163 des PSA-Moleküls entspricht.

Das erste Auswahlkriterium, welches verwendet wird, um den anti-PSA-Antikörper zu identifizieren, war die Fähigkeit dieses Antikörpers, mit zirkulierendem PSA zu interagieren.

Zirkulierendes PSA wird entweder in freier Form oder mit Antiproteasen, wie etwa α-anti-Chymotrypsin und β2-Macroglobulin, komplexiert gefunden. Um auf Klone zu screenen, haben wir drei verschiedene Formen von PSA verwendet: Freies PSA; mit α-anti-Chymotrypsin komplexiertes PSA (PSA-ACT), und freies PSA, welches nicht mit α-anti-Chymotrypsin komplexiert (PSA-nc). Freies PSA entspricht direkt aus menschlichem Samenfluid gereinigtem PSA. Co-inkubieren von freiem PSA mit gereinigtem ACT führt zur Bildung von PSA-ACT und PSA-nc. PSA-nc kann durch Gelfiltrationschromatographie abgetrennt werden. Es wird geglaubt, dass PSA-nc die freie Form von PSA, welche im Kreislauf gegenwärtig ist, repräsentieren kann. Komplexierung von PSA mit β2-Macroglobulin führt zu einer totalen Einkapselung von PSA. Als eine Folge davon ist diese Form von PSA nicht länger durch monoklonale anti-PSA-Antikörper detektierbar. Wir haben daher diese Form von zirkulierendem PSA für das Screening nicht verwendet.

PSA gehört zu der Kallikreinfamilie, und es liegt ein hoher Grad von struktureller Homologie zwischen PSA und den Kallikreinen HK1 und HK2 vor. Die Abwesenheit von Kreuzreaktivität des anti-PSA-Antikörpers mit Kallikrein, welches aus menschlichem Plasma isoliert wurde, wurde als ein zweites Kriterium für die Auswahl verwendet.

Der Hybridomklon AR47.47 reagierte auf die oben beschriebenen Kriterien, und eine starke Immunreaktivität wurde mit den drei Formen von PSA beobachtet, welche für das Screening verwendet wurde, während keine Kreuzreaktivität mit menschlichem, plasmatischem Kallikrein beobachtet wurde. Der Hybridomklon AR47.47 wurde zweimal durch limitierende Verdünnung geklont, und der Klon AR47.47R6R6 der zweiten Generation wurde für weitere Studien ausgewählt. Klon AR47.47R6R6 wurde an Standardmedium (RPMI 10% FBS) adaptiert, und eine Zellenbank wurde ausgebildet. Die Abwesenheit von Mycoplasma-Kontamination wurde unter Verwendung des Boehringer-Mannheim-Mycoplasma-Tests verifiziert. Klon AR47.47R6R6 wurde in der amerikanischen Typkultursammlung abgelegt und hat Accession Nr. H-B 12526 erhalten.

Immunisierung von DBA-Mäusen mit einer Bindungszusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung (AR47.47) wurde auf die Induzierung einer spezifischen PSA-Immunität über das idiotypische Netzwerk (d.h. Induzierung von Ab3-Antikörpern) untersucht. Anti-PSA-Antikörper (Ab3) konnten in dem Serum von Tieren, welche mit AR47.47 immunisiert waren, detektiert werden; ein Minimum von zwei Injektionen von AR47.47 war für Ab3-Herstellungen notwendig. Keine Reaktivität gegenüber PSA wurde für die Kontrollgruppen (Mäusen, welche mit einem Kontrollantikörper mit passendem Isotyp, welcher nicht mit PSA verwandt ist, immunisiert wurden und Mäusen, welche PBS-Injektionen erhielten) detektiert.

AR47.47 ist auf ein PSA-Epitop gerichtet, welches zwischen der Sequenz 139–163 des PSA-Moleküls enthalten ist. Die anti-PSA-Antikörper, welche durch AR47.47-immunisierte Mäuse hergestellt wurden, können spezifisch mit dem PSA-Peptid 139–163 interagieren, was zeigt, dass wenigstens ein Teil des produzierten Ab3 bezüglich Spezifität auf AR47.47 identisch ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung mit AR47.47 eine spezifische anti-PSA-Immunität im Wirt induzieren kann.

Beispiel 8

Anti-idiotypische Induzierung von PSA-Immunität in Mäusen

Mäuse wurden verwendet, um zu bestimmen, ob Immunisierung mit anti-PSA-Antikörpern eine spezifische Immunität gegen PSA über Aktivierung des idiotypischen Netzwerks induzieren kann. Das Ziel dieses Experiments war es, zu zeigen, dass die Immunisierung von Mäusen mit anti-PSA-Antikörpern (Ab1) das Immunsystem stimulieren kann, anti-idiotypische Antikörper (Ab2 = Ersatzantigen) und anti-anti-idiotypische Antikörper (Ab3) zu erzeugen, welche fähig sind mit dem ursprünglichen Antigen zu reagieren.

In diesen Experimenten wurde ein kommerziell erhältlicher Antikörper als ein Modell-anti-PSA-Antikörper verwendet (RLSD09; ATCC HB-8525). Der gereinigte Antikörper wurde an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) konjugiert, um seine Immogenität zu vergrößern. Die an KLH konjugierten anti-PSA-Antikörper waren immer noch fähig, PSA zu binden, was anzeigt, dass der Idiotyp der Antikörper nicht durch die Konjugationsprozedur maskiert wurde. B43.13-Antikörper, ein Maus-monoklonaler Antikörper des gleichen Idiotyps wie der PSA-Antikörper (IgG1) wurde als Kontrolle verwendet. B43.13-Antikörper ist spezifisch gegen das CA125-Eierstocktumor-Antigen gerichtet und zeigt keine Kreuzreaktion mit PSA. Zusätzlich wurde durch FACS-Analyse verifiziert, dass der B43.13-Antikörper nicht an die Zelloberfläche von Line-1-PSA oder P815-PSA bindet.

Mäuse wurden in drei Gruppen von jeweils fünf Mäusen unterteilt. Die erste Gruppe von Mäusen wurde mit an KLH-konjugiertem anti-PSA-Antikörper immunisiert. Die zweite, Gruppe von Mäusen wurde mit an KLH konjugiertem Kontroll-B43.13-Antikörper immunisiert. Die dritte Gruppe von Mäusen erhielt PBS-Injektionen. Injektionen wurden i.p. in 10-Tage-Intervallen mit vollständigem Freund'schem Adjuvans für die erste Reaktion und unvollständigem Freund'schem Adjuvans für die zweite Injektion ausgeführt.

Ab2 ist ein Ersatzantigen, welches fähig ist, das PSA-Epitop, welches durch den injizierten anti-PSA-Antikörper erkannt wird, zu imitieren. Ein kompetitives Inhibitions- Assay wurde eingesetzt, um den Serumgehalt an Ab2 zu messen. Dieses Assay wurde fünf Tage nach der zweiten Injektion durchgeführt. Eine Inhibierung wurde nach Inkubation in Gegenwart von Mäuseserum von Mäusen beobachtet, welche mit anti-PSA-Antikörpern immunisiert waren, nicht aber, wenn Serum von Mäusen, welche mit Kontrollantikörpern oder PBS immunisiert waren, verwendet wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung von Balb/c-Mäusen und DBA-Mäusen mit dem anti-PSA-Antikörper die Bildung von anti-idiotypischem Antikörper (Ab2) induzieren können, welcher fähig ist, PSA nachzuahmen.

Beispiel 9

Effekt von anti-PSA-Immunisierung auf Tumorentwicklung

Balb/c-Mäuse wurden verwendet, um zu bestimmen, ob Immunisierung mit anti-PSA-Antikörpern die Tiere gegen einen nachfolgenden Tumorbefall schützen kann. Balb/c-Mäuse wurden in drei Gruppen von jeweils fünf Mäusen aufgeteilt. Die erste Gruppe wurde mit an KLH konjugiertem anti-PSA-Antikörper RLSD09 immunisiert; die zweite Gruppe wurde mit an KLH konjugiertem Kontrollantikörper B43 immunisiert, und die dritte Gruppe erhielt PBS-Injektionen. Insgesamt vier Injektionen wurden jeder Gruppe bei Verwendung von 50 μg Antikörpern für jede Injektion gegeben. Die Tumorzellen Line-1-PSA wurden intravenös zwischen der dritten und vierten Injektion injiziert. 19 Tage nach Tumorimpfung wurden die Mäuse geopfert, und die Zahl der Tumorherde in den Lungen und Ab3-Gehalte im Serum bestimmt.

Die Tumorbelastung in der Gruppe von Mäusen, welche mit anti-PSA-MAb immunisiert waren, war wesentlich niedriger als die der Gruppe von Mäusen, welche mit Kontrollantikörpern immunisiert waren. Von besonderem Interesse ist die Demonstrierung einer negativen Korrelation zwischen Ab3-Gehalten und der Anzahl von Tumorherden in den Lungen, in der Gruppe von Mäusen, welche mit anti-PSA-MAb immunisiert wurden.

Beispiel 10

Anti-inflammatorische Zusammensetzung

Um die Effektivität einer Bindungsmittel enthaltenden Zusammensetzung bei der Behandlung von Entzündungen zu testen, wurde ein Doppelblindversuch an 18 Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht etwa 450 g), welche in drei Gruppen aufgeteilt wurden (8 Ratten in jeder Gruppe), ausgeführt.

Die erste Gruppe wurde mit KLH-konjugiertem IgM-Antikörper, welcher für einen Kohlehydratliganden auf Leukocyten spezifisch ist, geimpft (250 μg/Ratte, i.p.). Die zweite Gruppe wurde geimpft mit KLH-konjugiertem IgM-Antikörper ohne Bindung an den gleichen Liganden (250 μg/Ratte, I.P.). Die dritte Gruppe war eine Kontrollgruppe und erhielt keine Impfung.

Eine Entzündung wurde hervorgerufen durch Injektion von 1-%igem Carrageenan in 0,9%-igem NaCl (Typ IV) in die rechte Hinterpfote der Ratte (0,5 ml/Ratte). Beobachtung von Pfotenödemen durch Wasserverdrängungsmessung und Tastzirkelmessung.

Der inhibitorische Effekt von Alt-4-Antikörper auf Entzündung war klinisch unterschiedlich von der Kontrollgruppe und Kontroll-IgM-Antikörpergruppe (11).

Beispiel 11

Photoaktivierung erhöht Immunogenität

Normale, gesunde Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet. Die Tiere wurden zufällig gruppiert (4 pro Gruppe) und erhielten vier verschiedene Dosen (5 μg, 10 μg, 25 μg und 50 μg) von MAb 43.13. Vor der Injektion wurden Blutproben, vor Initiierung der geplanten Injektionen, genommen. Jede Ratte erhielt die passende Dosis von MAb, welche in steriler, 0,01-molarer, phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt war, intravenös. Eine zweite Studiengruppe erhielt 20 μg von jeder MAb-Zubereitung mit oder ohne unvollständigen Freund'schen Adjuvans (IFA). Blutproben wurden unmittelbar vor der Dosisinjektion bei 0, 21, 42, 63 und 77 Tagen genommen.

MAb-B43.13 ist ein murines IgG, reaktiv mit CA125. Antikörperzubereitungen bestanden aus MAb-B43.13 in der nativen Form oder in einer UV-exponierten Form (z.B. photoaktiviert). Natives MAb wurde von einer Stammkonzentration von 5 mg/ml mit 0,01-molarer, phosphatgepufferter Salzlösung auf Dosen von 5, 10, 25 und 50 μg/100 μl verdünnt. UV-exponiertes MAb wurde aus der lyophilisierten Form mit 0,01-molarer, phosphatgepufferter Salzlösung (2,2 mg/0,47 ml) rekonstituiert und verdünnt, um die gleichen Dosen wie für das native MAb zu erhalten.

Ein Assay wurde entwickelt, um die Ratten-anti-Maus-Reaktion im Serum der injizierten Tiere zu messen. Antiisotypische Ratten-anti-Maus-Antikörper wurden gemessen unter Verwendung einer ELISA-Platte, welche mit einem Kontrollantikörper mit passendem Isotyp MOPC 21 beschichtet war. Proben wurden 1 : 100 verdünnt, mit dem beschichteten Antikörper reagieren gelassen, gewaschen und gebundener Antikörper unter Verwendung von Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Ratten-IgG (H + L) mit ABTS-Substrat detektiert.

Unbekannte wurden von einer Standardkurve abgelesen, welche unter Verwendung von kommerziellem Ratten-anti-Maus-Antikörper erstellt wurde.

Die Ergebnisse der Ratten-anti-Maus(RTAMA)-Analyse von Seren der verschiedenen Gruppen von Ratten, welchen natives und UV-exponiertes MAb-B43.13 injiziert wurde, sind in Tabellen 8 und 9 dargestellt. Die immunologische Reaktion auf die Zusammensetzungen ist in Form der Zahl von Ansprechenden in jeder Gruppe ausgedrückt, wobei der numerische Grenzwert in den Tabellen definiert ist. Dieser Wert (Mittel aller Proben (Blanks) vor Injektion plus 3 SD) stellt sicher, dass eine wahre, positive Reaktion gemessen wird und es unwahrscheinlich ist, dass die Ergebnisse auf einer Assay-Schwankung beruhen. Die Tabulierung der Ansprechenden hat wahrscheinlich mehr Bedeutung unter dem Gesichtspunkt, dass die Fluktuation der Größe der Reaktionen sehr grob sein kann und daher Interpretation behindert.

TABELLE 8 Tierreaktion* auf intravenöse Injektion von nativen und UV-exponierten MAb-B43.13-Zusammensetzungen

Die Daten bestätigen tendenziell, dass die Reaktion auf das UV-exponierte MAb-B43.13 früher stattfindet (nach nur einer Injektion), wie durch die größere Zahl von Ansprechenden bei allen Dosishöhen in den Tag-2l-Gruppen gezeigt.

Außerdem ist bei allen anderen Zeitspannen (und nach mehrfachen Injektionen) die proportionale Reaktion jeder Gruppe, welcher intravenös UV-exponiertes MAb-B43.13 gegeben wurde, größer. Es könnte vorgeschlagen werden, dass die Reaktion für UV-exponiertes MAb-B43.13 länger aufrecht erhalten wird, da das native MAb-B43.13 eine verringerte Reaktionsrate von Tag 23 bis Tag 77 zu zeigen scheint.

Tatsächliche Werte von erhöhter Reaktion an Tag 77 sind in Tabelle 8 dargestellt.

TABELLE 9 Gesamte und Ab2-Induktion in Ratten, welchen natives oder UV-exponiertes MAB-B43.13 injiziert wurde

Beispiel 12

Proteinmodifikation als ein Ergebnis von UV-Exponierung

Die letztlichen, chemischen Spezies, welche nach Photoaktivierung gegenwärtig sind, sind spezifisch für einen gegebenen Satz von Exponierungsbedingungen und die Zusammensetzung der Matrixlösung (wie obig beschrieben). Für einfache Polypeptide, welche eine jegliche der drei primären, UV-absorbierenden (UV-B-) Aminosäuren (Cystin, Tryptophan, Tyrosin) enthalten, können die Konsequenzen von UV-Exponierung zu Amidbindungsaufbrechung, Disulfidbindungsaufbrechung, Änderung der absorbierenden Aminosäuren und Änderung von nebeneinander oder nahe beieinander liegenden Aminosäuren führen. Diese Veränderungen werden durch direkte Photoionisation oder Photoanregung und indirekt durch Radikalbildung aus anderen Bestandteilen verursacht. Die Natur und das Ausmaß dieser Modifikationen hängt stark von den chemischen Reaktivitäten der erzeugten Spezies und reaktiven Tendenzen oder Stabilisierungs-/Quenching-Fähigkeiten anderer Bestandteile ab. Für diese Größe von Molekülen resultiert jegliche Veränderung im Allgemeinen in dramatischen Änderungen der biologischen Funktion.

Die gleichen Reaktionen können bei größeren Proteinen stattfinden; jedoch stellen sekundäre und tertiäre, strukturelle Elemente für UV-Exponierung trotz ähnlicher Aminosäuresequenzen unterschiedliche Substrate dar. Daher ändert die hydrophobe/hydrophile Natur und einander nahe Aminosäuren von beabstandeten Kettensequenzen als Resultat der Faltung die Mikro-Umgebung und beeinflusst daher das Ausmaß und die Natur der Modifikation, zusätzlich zu anderen Bestandteilaspekten, wie obig festgestellt. In Anbetracht der Dominanz des Tryptophan-Absorptionsprofils in dieser UV-Bandbreite wird es als die primäre Stelle des anfänglichen Photoaktivierungsprozesses angenommen, aber eine direkte Wirkung auf Cystein und Tyrosin ist auch tragbar.

Der Mechanismus für indirekte Aminosäuremodifikationen wurde als lokale, hydrierte Elektronenerzeugung oder direkter Energietransfer von der primären Absorptionsstelle vorgeschlagen. Die primären, beobachteten Änderungen für große Proteine legen das Augenmerk auf messbare, chemische/biochemische Veränderungen, wie etwa Absorptions- und Fluoreszenzbestimmungen von aromatischen Aminosäuren, welche mit globalen Modifikationen in Verbindung stehen. Individuelle Aminosäureänderungen können in dieser Gruppe von Proteinen detektiert werden, wo Sulfhydrilgehalt bestimmt werden kann als Anzeichen für Cysteindisulfidaufbrechung und/oder dort, wo eine kritische Aminosäure für Funktion involviert ist. Für kleinere Proteine kann Aminosäurehydrolyse und vollständige Quantifizierung ausgeführt werden. Die primäre Bedeutung für funktionelle, große Proteine, wie etwa Enzyme, Rezeptoren oder Antikörper ist daher nicht-spezifische Aminosäuremodifikation, sondern die Konsequenzen jeglicher Änderung ihrer biologischen Funktion und ist stets als Funktion von Enzymfunktion, Rezeptorerkennung oder Antigenbindung beschrieben worden.

Beispiel 13

UV-exponiertes B43-13/CA125 Antikörper/Antigenkomplex erzeugt bessere CA125-spezifische, zelluläre Immunreaktion und bessere, humorale Reaktion

Eine bessere, zelluläre Immunreaktion wurde beobachtet, wenn der UV-exponierte Antikörper in Zusammenhang mit dem Antigen den T-Zellen präsentiert wurde. Damit wurden aus Peritonealräumen von Mäusen isolierte Makrophagen mit nativem B43.13 oder UV-exponiertem B43.13 zusammen mit CA125 stimuliert und CA125-spezifischen, aus Mäusen, denen CA125 injiziert wurden, isolierten Mäuse-T-Zellen präsentiert. Kontrollexperimente umfassten Stimulierung von Makrophagen ohne das Antigen. Wenn die Poliferation von T-Zellen, wie anhand der [³H]-Thymidinaufnahme beobachtet, verfolgt wurde, wurde ein optimaler Stimulationsindex bei Makrophagen beobachtet, welche mit UV-exponiertem B43.13-CA125-Komplex stimuliert waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten zusammengefasst. TABELLE 10

Beispiel 14

UV-Exponierungsbedingungen für erhöhte Immunogenitätsstudien

Ein typischer, experimenteller Aufbau besteht aus einer Photoreaktoreinheit mit acht Lampen (typischerweise 200 – 400-nm-Spektren, 90% bei 300 +/– 20 nm; 3 – 9 Watt/Lampe), welche konzentrisch um einen Zylinder mit einem Durchmesser von etwa 15 Zentimeter angeordnet ist, mit geeigneter, zugehöriger Elektronik, Abschirmung etc. In dieser Photoreaktoreinheit (RMR-600, Southern New England, Ultraviolet Company) werden zu exponierende Proben in verschiedenen Konfigurationen angeordnet: 1. als individuelle 1,5 ml(Borosilikatglas oder Quarz)-Glasfläschchen/-röhrchen, welche in einem acht Einheiten umfassenden Karussell (etwa 5 cm Durchmesser) angeordnet sind, welches in der Kammer bei 1 – 5 U/min während 0 – 180 Minuten (typischerweise 30 Minuten) rotiert wird; 2. als 2 einzelne Glasflächen/-röhrchen (wie oben), welche in der Mitte der Exponierungsquelle plaziert werden und innerhalb ähnlicher Zeitrahmen exponiert werden, oder 3. als eine helikale Glas-(wie oben)spule (etwa 3 mm externer Durchmesser), welche es ermöglicht, dass Ziellösung durch die Photoreaktoreinheit über verschiedene Zeitrahmen von etwa 0 – 180 Minuten fließt, aber typischerweise 10 – 20 Minuten. Dieser letztere Aufbau ermöglicht, dass beachtliche Volumina von Ziellösung auf kontinuierlicher Basis für groß angelegte Herstellungszwecke exponiert werden.

Unter jeglichen von diesen Exponierungsbedingungen können Protein-Ziellösungen bei 0,5 – 10 mg/ml (typischerweise 5 mg/ml) in einer Vielfalt von erwarteten milden, niedrigmolaren Pufferlösungen (typischerweise Phosphat, Pyrophosphat oder Tartrat; pH 5 – 10) exponiert werden, um deren Effekte auf Ziel-Protein-Immunogenität zu bestimmen.

Beispiel 15

Drei Derivate von scFv mit zusätzlichen, C-terminalen Erweiterungen, welche Maus- und menschliches Tuftsin (pDL-6 und pDL-11) oder eine Kontrollsequenz (pDL-10) enthalten, wurden entworfen. Um Plasmide pDL-6, pDL-10 und pDL-11 zu konstruieren, wurden DNA-Oligodeoxyribonucleotide

welche für die Aminosäuresequenzen N-SerGlyGlyGlyThrGlnProArg-C; N-SerAlaGlyGlyGlyGlyCysAla-C, und N-SerGlyGlyGlyThrLysProArg-C kodieren, durch Insertion von Fragmenten in EcoRI- und EagI-Stellen von pPIC-B43 verwendet. Die Plasmid-DNAs wurden in kompetente GS115-Zellen durch Elektroporation transformiert und die resultierenden Transformanten auf Histidin-armem Medium ausgewählt. Alle erhaltenen, positiven Klone wurden isoliert, im Induktionsmedium kultiviert und auf Proteinexpression in SDS-PAGE, gefolgt von Commassie-Färbung, analysiert. Die scFv-Tuftsin-Proteine wurden in minimalem Medium produziert, um einige der späteren Proteinreinigungsprozesse zu vereinfachen. Um die anti-idiotypische Reaktion zu evaluieren, wurden 6 bis 8 Wochen alte BALB/c-Mäuse mit 50 μg scFv-Tuftsin subkutan immunisiert (Tag 0). Zwei Wochen später erhielten die Mäuse 25 μg scFv-Tuftsin intraperitoneal. Das Serum der Mäuse wurde an Tagen 7, 14 und 27 entnommen.

Die anti-idiotypische Antikörperproduktion wurde durch Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) detektiert. In Kürze; chimäres B43.13 wurde auf einer festen Oberfläche beschichtet und dann mit 3%-igem BSA/PBS blockiert. Das chimäre B43.13 wurde mit Serumproben 1 Stunde lang inkubiert und dann mit Ziegen-anti-Maus-H+L-HRPO für eine weitere Stunde inkubiert, gefolgt von drei Spülungen mit Tween 20/PBS. Eine Farbreaktion wurde entwickelt durch Zusatz von 50 μl Substratlösung. Absorption wurde bei 405 nm abgelesen. Das gleiche Verfahren wurde angewendet auf die Detektion von anti-anti-idiotypischer Antikörper(Ab3)-Produktion, außer dass CA125 zu Anfang auf die ELISA-Platte aufgebracht wurde.

Die Daten zeigen, dass es möglich ist, sowohl Ab2 als auch Ab3 in den Serumproben zu detektieren, und dies zeigt an, dass scFv-Tuftsin die idiotypische Immunogenität behielt, welche humorale Immunreaktion in Mäusen hervorrufen könnte. Wir haben herausgefunden, dass die Mäuse, welche mit ScFv-Tuftsin immunisiert wurden, anfingen, starke Produktion von anti-idiotypischem Antikörper (Ab2) 20 Tage nach der ersten Immunisierung zu zeigen. Die Anti-anti-idiotypische Antikörper(Ab3)-Produktion trat jedoch früher auf, mit einem Maximum etwa bei Tag 15. Dies zeigt an, dass die Induktion einer idiotypischen Netzwerkreaktion ein wichtiger Teil des Effektormechanismus bei MAb-basierender Therapie sein könnte.

Beispiel 16

Aufbau und Charakterisierung von Einzelketten-Antikörper

Die MAb-B43.13-variablen-Teilsequenzen wurden unter Verwendung von sequenzspezifischen Primern PCR-amplifiziert und in einen Klonvektor mit scFv-Orientierung von V1-Linker-Vh entwickelt. Die DNA-Fragmentkodierung für das scFv wurde dann in P.-pastoris-Vektor subgeklont, pPIC-9 mit aF-Sekretionssignalen, resultierend in rekombinantem Plasmid pPIC-B43.13. Ein Derivat von pPIC-B43.13 mit zusätzlichen, C-terminalen Erweiterungen, welche ein Cystein enthielten (pDL10) wurde ausgebildet, um eine Disulfidgruppe auszubilden. Daher kann die Antigenbindungsaktivität durch Erhöhung der Avidität gesteigert werden. Um Plasmide pDL10 zu konstruieren, wurden DNA-Oligodeoxyribonukleotide (5'-GAATTCAGCTGGAGGTGGTGGATGTGC-3') verwendet, welche für die Aminosäuresequenzen N-SerAlaGlyGlyGlyGlyCysAla-C kodieren, durch Insertion von Fragmenten in EcoRI- und EagI-Stellen von pPIC-B43.13.

Die Plasmid-DNAs wurden durch Elektroporation transformiert in kompetente GS115-Zellen, und die erhaltenen Transformanten wurden auf Histidin-armem Medium ausgewählt. Nach Screening auf Integration an den korrekten Stellen (d.h. Kolonien, können auf einer –his/+Glycerolplatte wachsen, aber wachsen langsam auf einer –his/+Methanolplatte) wurden alle erhaltenen, positiven Klone isoliert, im Induktionsmedium kultiviert und auf Proteinexpression in SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Färbung, analysiert, wie wir es zuvor beschrieben (Luo et al., 1997). Die Proteinproben wurden gegen PBS dialysiert und unter Verwendung von Centricon^®-10-Filter (Amicon, Danvers, MA) konzentriert.

Reinheit von scFv-pDL10 wurde unter Verwendung von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. CA125-Bindungsspezifität wurde bestimmt unter Verwendung eines ELISA, in welchem Mulden einer Mikrotiterplatte mit CA125, CA15.3 (einem menschlichen Brustkrebsantigen) oder CA19.9 (einem menschlichen Darmkrebsantigen) beschichtet wurden. Der gebundene, einzelkettige Antikörper wurde mit Hilfe von Peroxidase-markiertem Ziegen-anti-Maus-H und L (Southern Bio. Associ.) detektiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen wurde 50 μl ABTS-Substratlösung zugegeben. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.

Einzelkettiges Fv, welches Poly(Milch-co-glykolsäure)-Mikrosphären enthielt, wurde durch eine Doppelemulsionstechnik mit einigen Modifikationen (Uchida et al., 1994) hergestellt. Na¹²⁵I-markiertes scFv-pDL10 wurde als ein Tracer verwendet, um die Beladungseffizienz zu bestimmen. Kurz, scFv-pDL10 (1,5 mg) und Na¹²⁵I-scFv-pDL10 (0,4 μg) in PBS wurden mit 500 μl Chloroform, welches 100 mg PLGA 50/50 (Lactel) enthielt, gemischt. Die Mischung wurde 15 s lang ultraschallbehandelt unter Verwendung einer Ultraschallhomogenisierungsvorrichtung (Heat Systems, New York). Die resultierende Emulsion wurde 2ml 9%-igem Poly(vinylalkohol) (PVA, Aldrich, USA) zugefügt. Emulgieren wurde unter Ultraschallbehandlung 1 min. lang weitergeführt. Die Emulsion wurde zu 8ml 9%-igem PVA transferiert und 2 Stunden lang zum Abdampfen des Chloroforms gerührt. Die Mikrosphären wurden durch Zentrifugierung (15 min., 15000 U/min) wiedergewonnen und mit destilliertem Wasser gewaschen und zumindest 24 Stunden gefriergetrocknet.

BALB/c-weibliche Mäuse im Alter von 6 – 8 Wochen wurden in allen in-vivo-Experimenten verwendet. Die Immunisierungsgruppen umfassten fünf Gruppen: 1. immunisiert mit PLGA-Mikrosphären; 2. immunisiert mit scFv- pDL10; 3. immunisiert mit scFv-pDL10, welches in PLGA-Mikrosphären zubereitet ist, und die anderen zwei Gruppen immunisiert mit der Mischung von zubereitetem scFv-pDL10 und GM-CSF oder TNF-α. Nach Entnahme der Präimmunisierungs-Serumproben erhielten Gruppen von 4 Mäusen zwei subkutane Immunisierungen an Tag 1 und Tag 14, gefolgt von zwei intraperitonealen Immunisierungen an Tag 21 und Tag 28. Die Immunisierungsdosis war 10 mg der Mikrosphären für s.c; 5 mg für i.p. Für die anderen Gruppen, welche keine Mikrosphären erhielten, war die Dosis an scFv-pDL10 abgestimmt auf die zubereitete Menge. Die Cytokine wurden von R & D Systems (USA) gekauft und den Mäusen in einer Dosis von 0,1 μg pro Tag gegeben. Blutproben aus der Vene des Schwanzes wurden periodisch in "Microtainer"-Röhrchen (Becton Dickinson, USA) entnommen und bei –80°C bis zum Assay eingefroren.

Beispiel 17

Dosis

Fachleute auf diesem Gebiet werden anerkennen, dass die verabreichte Dosis weit variieren kann, basierend auf einem breiten Satz von verschiedenen Umständen. Im Folgenden werden vorläufige Dosierungsrichtlinien gegeben.

Retrospektive Analyse von mehr als 100 Patienten, welchen bis zu zehnmal eine 2-mg-Dosis MAb-B43.13 injiziert wurde zeigte an, dass einige dieser Patienten erfuhren:

a) einen ungewöhnlichen Krankheitsverlauf, charakterisiert durch unerwartet lange Überlebenszeiten, und
b) keine signifikante, ungünstige Reaktion oder Toxizität.

Immunologische Studien wurden durchgeführt, um den in-vivo-Mechanismus des Verhaltens von MAb-B43.13 zu verstehen und zu evaluieren. Diese Studien zeigten an, dass das Ausmaß von anti-idiotypischer Injektion bei Patienten, welchen eine 2-mg-Dosis MAb-B43.13 injiziert wurde, keine Relation zur Anzahl von Injektionen oder dem klinischen Stadium ihrer Krankheit zeigten. Jedoch ist anti-idiotypische Injektion abhängig von den Gehalten des zirkulierenden CA125, welches in dem Serum des Patienten vorhanden ist. Zusätzliche Experimente zeigten, dass die Induktion von MAb-B43.13 bei Patienten mit messbarem Serum-CA125 zur Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen führte, was in Antigen-Epitop-Präsentation und Antigen-spezifischer, humoraler und zellulärer Reaktion auf den Tumor führte.

Diese Studien zeigen, dass eine effektive Dosis lediglich genug Antikörper erfordert, um optimal alles mögliche zirkulierende CA125-Antigen dem Immunsystem zuzuführen und zu präsentieren. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass 1 ng MAb-B43.13 10 Einheiten CA125 binden kann. Unter der Annahme von 40 ml Plasma pro kg Körpergewicht kann die Injektion von 2 mg MAb-B43.13 in einen 60 kg schweren Patienten etwa 8333 E/ml CA125 in Serum binden. Da alle bis zum heutigen Tag getesteten Eierstockkrebspatienten wesentlich weniger als 8333 E/ml CA125 in ihrem Serum hatten, ist eine Injektion von 2 mg MAb-B43.13 mehr als ausreichend, um die benötigte Immunreaktion zu induzieren. CR125-Gehalte wurden als signifikant erhöht betrachtet, wenn die CA125-Konzentration mehr als dreimal den Schwellenwert betrug (z.B. 3 × 35 E/ml oder 105 E/ml). Zusätzlich waren bei Patienten, welche radio-markiertes MAb-B43.13 zur immunoscintografischen Bestätigung der Krankheit erhielten, die Ergebnisse der Bildaufnahme exzellent trotz hohem Serum-CA125, was nahe legt, dass überschüssiges MAb-B43.13 für spezifische Tumoraufnahme vorliegt.

Weiterhin scheinen mehrere Injektionen in ausgewählten Intervallen optimalen Nutzen für den Patienten zu bringen, da CA125 über den gesamten Verlauf der Krankheit erzeugt wird.

Schließlich zeigte die retrospektive Analyse, dass die 2-mg-Dosis therapeutische Effizienz zu haben scheint; keiner der Patienten (> 100) hat irgendwelche ernsthaften Nebenwirkungen oder ungünstige Reaktionen entwickelt. Wenn die gesamte HAMA-Reaktion eine Indikation von anti-idiotypischer Induktion ist, erzeugt eine 2-mg-Dosis signifikante Gehalte von anti-idiotypischen Antikörpern, um den gewünschten, therapeutischen Nutzen zu erzeugen. Mehrere Injektionen von 2 mg MAb-B43.13 in ausgewählten Intervallen scheint die anti-idiotypischen Antikörper in einem gewünschten, therapeutischen Gehalt zu erhalten, ohne irgend eine isotypische, HAMA-induzierte Toxizität zu verursachen.

Ein Bereich effektiver Dosen oder eine therapeutisch akzeptable Menge MAb-B43.13 umfasst daher, ist jedoch nicht beschränkt auf eine Gesamtdosis von etwa 2 mg oder weniger.

Beispiel 18

Immunophotodynamische Therapie

Ein immunkompetentes Mausmodell ist für das MUC-1-System erhältlich. Die MUC-1-Transfektante 413 BCR bildet in BALB/c- oder CB6F1-Mäusen Tumore aus (subkutan oder intravenös). Das BALB/c-Tiermodell wurde verwendet, um HBBA-R2-SL, HBBA-R2-SIL mit Alt-1 und einem Kontrollantikörper (HBBA-R2 ist ein Hypocrellin B-Derivat, beschrieben in PCT/US98/00235, durch Bezugnahme hierin aufgenommen; SL = stealth liposome; SIL = stealth immunoliposome) zu testen. Das Modell hat den Vorteil, dass der Bystander-Effekt des Immunsystems analysiert werden kann. Es ist berichtet worden, dass Hilfe vom Immunsystem, insbesondere von Makrophagen, das Immunsystem für das PDT-Ergebnis steigert und, wie notwendig, zum Erhalt vollständiger Reaktionsraten. BALB/c-Mäusen wurden 2 – 2,5 × 10⁶ 413BCR-Zellen in die rechte Flanke (s.c.) injiziert.

Tumore traten nach 7 bis 10 Tagen auf. Wenn die Tumore einen Durchmesser von etwa 5 mm erreichten, wurden Hypocrellinzusammensetzungen in Höhe von 1 mg/kg i.v. injiziert. Zwei Stunden nach der Injektion von HBBA-R2 wurde eine Lichtbehandlung bei 40 J/cm² (> 600 nm) ausgeführt. Die Mäuse wurden im Folgenden mit Messungen der Tumorgröße beobachtet. Wenn die Tumorgröße das 4-fache des Volumens vor der Behandlung erreichte, wurden die Mäuse getötet. Tumore wurden zwei Monate lang verfolgt und die Überlebenskurven berechnet, aufgetragen und mit der nur mit Licht behandelten Gruppe verglichen.

Für "Stealth-Immunoliposome"-Zusammensetzungen wurde der Antikörper Alt-1, welcher an 413BCR-Zellen bindet, verwendet. Tumore wurden jeden zweiten Tag in drei Dimensionen gemessen. Wenn die Tumore das Vierfache des Volumens vor Behandlung erreichten, wurden die Mäuse getötet. Mäuse, welche nur mit Licht oder nur mit Medikamenten behandelt wurden, wurden als Kontrolle verwendet.

Immunoliposome mit Alt-1 zeigten in Gegenwart von Licht vollständige Heilung. Das HBBA-R2-SIL [Alt-1] zeigte auch verbessertes Überleben im Dunkeln, verglichen mit Mäusen, welche nur mit Licht behandelt wurden. Diese Ergebnisse legen einen therapeutischen Effekt von Alt-1 in diesem Modell dar und unterstreichen die Wichtigkeit von kombinierter Therapie unter Verwendung von PDT und Antikörperimpfung.

Von allen getesteten Zusammensetzungen zeigten für den Tumor spezifische Immunoliposome den besten therapeutischen Effekt. Dies spiegelte sich auch wieder, wenn Tumorvolumina zum Vergleich verwendet wurden. Der Grund für die enormen Unterschiede zwischen SL und SIL ist noch nicht vollständig verstanden. Die Daten legen nahe, dass Immunoliposome eine Immunreaktion in BALB/c-Mäusen verursachen könnten, welche helfen kann, den Tumor zu töten. Aus den Bioverteilungsdaten wissen wir, dass eine Aufnahme von HBBA-R2 beim Tumor etwas höher bei SIL im Vergleich zu SL ist.

Beispiel 19

Der murine, monoklonale Antikörper Alt-4 ist ein Kandidat für die Entwicklung einer anti-gastrointestinalen Krebskomponente. MAb-Alt-4 bindet an das Tumorantigen CA19.9 ein Sialyl-Lewis^a-Antigen, welches gegenwärtig allgemein als einer der am wichtigsten Tumormarker für gastrointestinalen Krebs anerkannt ist. Ein Ansatz zur Chimärisation von Antikörper besteht darin, Maus-humanen Antikörper zu konstruieren, welcher aus einem Maus-variablen Bereich und einem menschlichen, konstanten Bereich besteht, unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie. Die meisten Berichte zeigen, dass der chimäre Antikörper fähig ist, die gleiche spezifische Bindungsaktivität an das Antigen wie in seinem Eltern-Maus-Antikörper zu behalten, jedoch die menschliche anti-Maus-Antikörper(HAMA)-Reaktion bei in-vivo-Anwendungen zu vermeiden.

Experimentelle Strategien

cDNA-Isolierung von V-Genen

RT-PCR-Experimente wurden ausgeführt, um Antikörper-variable Gene unter Verwendung spezifischer Primer zu isolieren. Die cDNAs wurden dann in Klonvektor pBluscript für DNA-Sequenzierung geklont.

Konstruktion von chimären Antikörpern

Chimäre Klone von PAH-18.4H8PCRII#8 und PAG-18.4L20PCRII#19 wurden erhalten durch Ligation von PAG4622-18.4LPCRII und PAH46.6-18.4HPCRII als Expressionsvektoren, und Inserts wurden erhalten von PBKS-18.4L20PCRI1#14 und PBKS-18.4HPCRII#19. Chimäre Klone wurden für Transfektion von SP2/0-Zellen verwendet. Um die effizienteste Methode für die Co-Transfektion dieser Zellen zu erhalten, wurde Kontrollplasmid psV-β gal DNA als ein positives Kontrollplasmid verwendet, um die optimalen Bedingungen für Transfektion in Zellen zu erhalten.

Transfektion

Beide Verfahren zur Transfektion zeigten erfolgreiche Transfektionseffizienz. Lipofectamin verursacht ein gewisses Maß an Zelltod; jedoch die meisten Zellen (80%) der überlebenden Zellen sind transfektiert. Bei Elektroporationsverfahren war die Zelltransfektionseffizienz hoch, und Zellen, welche transfektiert wurden, wurden in Kolonien gezüchtet, welche das neue Kontrollplasmid enthielten. Nach Einstellung optimaler Bedingungen für Transfektion von SP2/0-Zellen wurde Cotransfektion von SP2/0-Zellen mit PAH-18.4 und PAG-18.4 ausgeführt.

Lipofectaminverfahren

2 μg von jedem DNA-Plasmid wurden verwendet. Es wurde dem gleichen Protokoll gefolgt, wie oben beschrieben. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen von 6-Mulden-Platten geerntet, und Zellen wurden in 96-Muldenplatten mit Zelldichte von 1,0 × 10⁴ Zellen/Mulde gepflanzt.

Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurde Selektionsmedium zu jeder Mulde in einem 1 : 1-Verhältnis zugefügt. Selektionsmedium umfasst 1 μg/μl Mycophenolsäure und 5 mM Histodinal, pH 7,5, welcher unter Verwendung von NaOH eingestellt wurde. Selektionsmedium wurde alle 3 Tage gewechselt, und die Zellen befanden sich 12 Tage lang im Selektionsmedium.

Elektroporationsverfahren

20 μg von jedem DNA-Plasmid wurden verwendet. Für Transfektion wurde die gleiche Methode wie oben beschrieben verwendet. Nach Elektroporation wurden Zellen in 96-Muldenplatten aufgebracht, bei 1 × 10⁴ Zellen/Mulde-Dichte. 24 Stunden nach Transfektion wurde Selektionsmedium zu den Zellen zugefügt. Zellen wurden 12 Tage lang unter Selektionsmedium gehalten, und die Medien wurden alle 3 Tage gewechselt.

Um zu bestimmen, ob Transfektion stattgefunden hat, wurde Überstand von transfektierten Zellen für ELISA verwendet, um die Produktion des erwünschten, chimären Proteins per Assay zu ermitteln. CA19.9 wurde verwendet, um die Platten zu beschichten und wurden mit 3%-igem BSA blockiert. Für primäre Antikörpergewebskulturen wurde Überstand verwendet, und für sekundären Antikörper wurde Hasen-anti-humanes (Fab'2)IgG(H+L) verwendet. Ein Assay von ELISA ergab positive Ergebnisse für die Produktion des erwünschten Produkts.

Beispiel 20

Experimentelle Verifizierung der Erzeugung von Antikörperreaktion gegen mehrere Epitope, welche in einem Antigen vorliegen, durch Injektion eines Antikörpers gegen ein einzelnes Epitop

Krebsantigen CA125, welches auf mehr als 80% von Epithel-Eierstock-Krebsen exprimiert wird, wird als ein Beispiel verwendet, um die vorliegende Erfindung zu demonstrieren.

CA125 hat mehrere Epitope, welche durch verschiedene Antikörper, wie etwa OC125, M11, B43.13, B27.1, unter anderem, erkannt werden. In der vorliegenden Erfindung wurde MAb-B43.13 verwendet, um eine CA125-spezifische Immunreaktion zu erzeugen, welche Erkennen des B27.1-Epitops einschloss.

Verfahren

86 Eierstockkrebspatienten mit aktiver Krankheit wurden auf die Gegenwart von Antikörpern gegen CA125 getestet. Keine der Patienten hatte Antikörper gegen CA125 vor Injektion von MAb-B43.13. Den Patienten wurde 2 mg MAb-B43.13 bei variierenden Zeitintervallen (siehe z.B. Tabelle 5 für einige der Patienten) injiziert. Seren von diesen Patienten wurden auf die Gegenwart von menschlichen anti-CA125-Antikörper anhand deren Fähigkeit, an C125 zu binden, analysiert [R. Madiyalakan et al., Hybridoma, 14: 199–203 1995]. Solche anti-CA125-Antikörper wurden weiter klassifiziert, gegen das B43.13-Epitop oder B27.1-Epitop zu sein, durch deren Fähigkeit, die korrespondierenden Antikörper zu inhibieren. Das Grundprinzip für die Klassifizierung stammt aus der Tatsache, dass anti-CA125-Antikörper in diesen Patienten durch einen der folgenden zwei Wege erzeugt worden wäre:

1. Wenn die anti-CA125-Antikörper in der Art erzeugt worden wären, welche durch die oben angegebene Netzwerktheorie vorgeschlagen wird, würde der Weg Ab1 → Ab2 → Ab3 folgen. Diesem Schema folgend würde MAb-B43.13 (Ab1) einen anti-Idiotyp gegen MAb-B43.13 (Ab2) erzeugen, welcher wiederum einen anti-anti-Idiotyp gegen MAb-B43.13 (Ab3, oder anti-CA125-Antikörper) erzeugen würde. Weiterhin würden die AB3-Antikörper, welche auf diesem Weg erzeugt wurden, nur an MAb-B43.13 binden, und nur durch dieses inhibiert werden, da das B43.13-Epitop das einzige, gegenwärtige Epitop ist.
2. Wenn die anti-CA125-Antikörper auf eine Art erzeugt würden, wie es durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagen wird, würde der Weg Ab1 + lösliches Antigen → Ab3' folgen. Diesem Schema folgend würde MAb-B43.13 (Ab1) das CA125-Serumantigen binden, welches wiederum einen anti-CA125-Antikörper (Ab3') erzeugen würde. Weiterhin würden die Ab3'-Antikörper, welche auf diesem Weg erzeugt wurden, an B27.1-Antikörper binden und durch diese inhibiert werden, da, wie zuvor angemerkt, CA125 multi-epitopisch ist und B43.13 und B27.1-Epitope unterschiedlich sind. Auch wird Ab3' nicht an anti-MAb-B43.13-Antikörper binden.

Daher würde Patientenserum als Ab3 enthaltend klassifiziert, wenn es anti-CA125-Antikörper enthielt, welche nur durch MAb-B43.13 inhibierbar waren; solche die durch MAb-B27.1 inhibierbar waren, wurden als Ab3' klassifiziert.

Ergebnisse

Vierzehn Patienten entwickelten anti-CA125-Antikörper in ihren Seren (Tabelle 1) in Reaktion auf MAb-B43.13-Injektion. 10 von diesen 14 Patienten hatten Ab3', während nur zwei Patienten Ab3-Antikörper in ihren Seren hatten. Zwei Patienten hatten auch beide Antikörper. Die Gegenwart von Ab3 in ihren Seren wurde auch durch die Fähigkeit dieser Antikörper bestätigt, an den gereinigten Hasen-anti-MAb-B43.13-Antikörper zu binden. Es gab zwei Patienten (#2 und #7), welche anti-CA125-Antikörper aufwiesen, welche jedoch nicht durch MAb-B43.13 oder MAb-B27.1 inhibierbar waren, was demnach nahe liegt, dass sie Antikörper gegen CA125 haben könnten, welche andere Epitope als B43.13 oder B27.1 erkennen.

Diese Ergebnisse zeigen klar, dass, wenn ein Antikörper gegen ein einzelnes Epitop (B43.13) einem Patienten injiziert wurde, eine Antikörperreaktion gegen das ganze Antigen erzeugt wird, welche verschiedene Epitope, welche im Antigen gegenwärtig sind, erkennt. Die Gegenwart von Ab3 in einigen Patienten könnte durch die wahrscheinliche Gegenwart von überschüssigem B43.13-Epitop in CA125 erklärt werden, infolge von unzureichender Bindung des Antikörpers an das Epitop oder Idiotyp-Induktion durch Weg I. Nichts desto trotz scheint der vorwiegende Mechanismus der Reaktion der von Weg II zu sein. In anderen Worten, erzeugt Injektion eines monoklonalen Antikörpers zu einem löslichen, multi-epitopischen Antigen in einem Patienten mit einem funktionierenden Immunsystem einen Antikörper auf das Antigen, wobei der erzeugte Antikörper von Antikörpern auf verschiedene Epitope inhibiert wird.

Beispiel 21

In pharmazeutischen Studien wurden Blutproben auf CR125-Gehalte vor und nach vorbestimmten Zeitintervallen nach MAb-B43.13-Injektion analysiert. Bei Patienten mit erhöhten CA125-Gehalten vor Injektion konnte ein signifikanter Abfall von zirkulierenden CA125-Gehalten unmittelbar nach MAb-B43.13-Injektion erkannt werden (Tabelle 11). Dies zeigt klar, dass das Bindungsmittel bei Einführung in den Körper mit dem zirkulierenden CA125 interagiert und dieses entfernt.

TABELLE 11 CA125-Abgabe nach MAb-B43.13-Injektion Patient#(CA125-Angaben in E/ml)

Weiterhin wird das mit Antikörper komplexierte Antigen dem Immunsystem effizient präsentiert und erzeugt bessere Antigen-spezifische, humorale und zelluläre Reaktion. Dies wurde durch die folgenden Experimente gezeigt, welche in Beispielen 22 und 23 gezeigt sind.

Beispiel 22

Balb/c-Mäuse wurden immunisiert entweder mit 10 μg MAb-B43.13 in PBS, i.v.; 10.000 Einheiten CA125 in PBS, i.v.; oder 10 μg MAb-B43.13 und 10.000 Einheiten CA125 in PBS, i.v., alle drei Wochen für insgesamt 3 Injektionen. Das Verhältnis in der B43.13/CA125-Injektion war ähnlich dem, welches bei Patienten mit erhöhten CA125-Gehalten beobachtet wurde, wie, basierend auf den pharmakokinetischen Daten, welche in Tabelle 10 dargestellt sind, bestimmt wurde. Wenn die Mäuseseren auf anti-CA125-Antikörpergehalte analysiert wurden, hatten die Mäuse, welchen der Antigenantikörperkomplex injiziert wurde, den höchsten Titer. Dies stützt die Beobachtung, dass Bindungsmittel-Antigeninteraktion zu einer besseren Antigen-spezifischen, humoralen Immunreaktion führt, verglichen mit Bindungsmittel oder Antigen alleine.

Beispiel 23

Ähnlich wurde eine bessere, zelluläre Immunreaktion beobachtet, wenn das Bindungsmittel in Verbindung mit dem Antigen den T-Zellen präsentiert wurde. Damit würden aus Mäuse-Peritonealraum isolierte Makrophagen stimuliert mit MAb-B43.13 allein; CA125 allein, einem MAb-B43.13-CA125-Komplex oder Kontroll-MAb-CA125 und CA125-spezifischen Maus-T-Zellen (isoliert aus Mäusen, welchen CA125 injiziert wurde) präsentiert. Wenn die Proliferation der T-Zellen, wie anhand der [³H]-Thymidinaufnahme beobachtet, verfolgt wurde, wurde ein optimaler Stimulierungsindex bei Makrophagen beobachtet, welche mit dem Antikörperantigenkomplex stimuliert wurden (2).

Beispiel 24

Die Rolle von Serumantigen bei der Induktion einer multi-epitopischen Antikörperreaktion als Konsequenz einer Antikörper-Iinjektion wurde weiter in Hasenstudien bestätigt. Hasen, welche keinerlei Serum-CA125 enthalten, wenn ihnen MAb-B43.13 injiziert wurde, erzeugten anti-CA125-Antikörper, welche nicht durch B27.1 inhibierbar waren. Im Gegensatz dazu erzeugen Eierstockkrebspatienten mit hohen Serum-Antigen-CA125-Gehalten anti-CA125-Antikörper, welche durch B27.1 in Reaktion auf MAb-B43.13-Injektion inhibierbar sind.

Beispiel 25

Experimentelle Verifizierung der Induktion von Antigen-spezifischer anti-Tumorreaktion durch Antikörper-Injektion

Menschlicher anti-C125-Antikörper verursacht Tumorzell-Lysis durch Antikörper-abhängige, zelluläre Cytotoxizität ("ADCC"). Obwohl das injizierte MAb-B43.13 nicht selbst eine ADCC und/oder Komplement-abhängige Cytolyse("CDC")-vermittelte Lysis von Eierstocktumorzellen verursacht, führt die Erzeugung von anti-CR125-Antikörpern der Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde, zu Tumorzellen-Lysis (siehe 3). Dies wurde in einem ⁵¹Chrom-Freisetzungs-Assay untersucht durch Inkubation der markierten Eierstocktumorzellen mit Effektorzellen und Seren von sechs Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde. Dies stützt den Schluss, dass die Injektion eines Bindungsmittels zu seiner Interaktion mit dem Antigen führt, wobei eine spezifische, humorale Reaktion zu anti-CA125-Antikörpern führt, welche Tumorcell-Lysis durch ADCC verursachen. Diese Ergebnisse zeigten deutlich die Erzeugung von Antigen-spezifischer anti-Tumorreaktion nach Injektion des Antikörpers.

Beispiel 26

Tumortötung entweder durch einen anti-CA125-Antikörper vermittelten ADCC-Mechanismus oder durch CA125-spezifische CLTs führen zu erhöhtem Überleben bei Patienten, welchen MAb-B43.13 injiziert wurde. Obwohl behauptet wurde, dass hohe Serumgehalte an CA125 schlechte prognostische Indikatoren sind, scheinen sie einen nützlichen Effekt in Kombination mit der Injektion von anti-CA125-Antikörper in solchen Patienten zu haben. Zum Beispiel erhöhte sich die Immunreaktion gegen CA125 um mehr als 20%, wenn die CA125-Gehalte mehr als 100 Einheiten/ml betrugen, was wiederum das mittlere Überleben bei solchen Patienten von 39,1 Monaten auf 54,5 Monate erhöhte (Tabelle 12). Damit führt die Injektion eines Bindungsmittels in einen Patienten, welcher erhöhte Gehalte an multi-epitopischem, löslichem Antigen aufweist, zu Antigen-spezifischer, humoraler und zellulärer Reaktion, was wiederum zur Tumortötung, gefolgt von verbessertem Überleben, führt. TABELLE 12 Korrelation zwischen Serum-CA125-Gehalten menschlicher anti-CA125(Ab₁')-Reaktion und Überleben bei Patienten, denen MAb-B43.13 injiziert wurde

Beispiel 27

Ein Bauchspeicheldrüsenkrebspatient, bei welchem metastatische Krankheit diagnostiziert wurde, wurde wiederholt eine Zusammensetzung, welche einen anti-CA19.9-Antikörper enthielt, injiziert. Der Patient erhielt keine andere Behandlung und überlebte 22 Monate lang nach der ursprünglichen Diagnose (19 Monate nach Operation und der Injektion). Dies wird verglichen mit der gegenwärtigen, geschätzten Überlebensspanne von 6 Monaten Überleben nach der ursprünglichen Diagnose.

Während die vorliegende Erfindung in einigen Details mit Hilfe von Illustrationen und Beispielen beschrieben wurde, sollte verstanden werden, dass die Erfindung verschiedene Modifikationen und alternative Formen umfassen kann und nicht auf die spezifischen Ausführungsformen beschränkt ist. Es sollte verstanden werden, dass diese spezifischen Ausführungsformen die Erfindung nicht beschränken sollen und dass die Erfindung alle Modifikationen, Äquivalente und Alternativen umfassen soll, welche in den Umfang der Erfindung fallen.

Beispiel 28

Management von "watchfull waiting", folgend auf primäre Behandlung

Die Effekte von OvaRex^® bei der Verlängerung der Zeit bis zum Wiederausbruch der Krankheit und Überleben während der Zeitspanne des "watchfull waiting" nach der anfänglichen Behandlung mit Operation und/oder Chemotherapie werden ebenfalls betrachtet. Das Wiederauftreten von Eierstockkrebs nach erfolgreicher Primärbehandlung wird innerhalb von etwa 12 Monaten erwartet (mittlere Zeit). Das OvaRex^®-klinische Entwicklungsprogramm zum Bestimmen der Behandlung von Patienten, welche bei Vervollständigung von primärer, Platin-basierender Chemotherapie startet, schließt 2 noch laufende, randomisierte Studien ein, welche eine geplante Zahl von 444 Patienten einschließt.

Die erste Studie, ein Doppelblind-, Placebo-kontrollierter Versuch zur Evaluierung von Krankheitsrückfall, Sicherheit, Überleben und gesundheitsbezogener Lebensqualität, folgend auf zuvorige, erfolgreiche Behandlung für Stadium III/IV-Krankheit ist vollkommen ausgefüllt mit 345 Patienten, von denen alle CA125-Gehalte von weniger als 35 Einheiten/ml aufweisen. Eine zwischenzeitliche Analyse der Daten von 252 Patienten, welche OvaRex^® erhalten haben, zeigt, dass mehr als 50% der Patienten auf die Behandlung ansprechen und bestätigt frühere Daten, welche das günstige Sicherheitsprofil des Medikaments zeigen. Interessanterweise sind CA125-Gehalte von mehr als 5 Einheiten/ml mit einem signifikanten Risiko eines frühen Rückfalls verbunden. Basierend auf einer unabhängigen Einschätzung der vorläufigen Daten scheint aktive Behandlung mit OvaRex^® dieses Risiko zu verringern, was mit einem Verständnis des Behandlungsmechanismus konsistent ist. Die stärkste, klinische Reaktion auf OvaRex^® wurde bei Patienten beobachtet, welche für das Medikament spezifische Immunreaktionen aufweisen. Zum Beispiel betrug in einem zwischenzeitlichen Datensatz die mittlere Zeit bis zum Rückfall 18,9 Monate bei Patienten mit Ab2-Gehalten von mindestens 100 Einheiten, verglichen mit 7,4 Monaten bei Patienten mit Ab2-Gehalten von weniger als 100 Einheiten. Es ist von Interesse, anzumerken, dass klinisch nützliche Immunreaktionen induziert werden, angesichts reduziertem, zirkulierendem Tumorantigen bei Beendigung der primären Chemotherapie in diesem Programm, aber dass das Muster von Immunreaktionen konsistent mit dem ist, welches in Studien fortgeschrittener Krankheit beobachtet wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CA125 nicht in besonders hohen Gehalten zu zirkulieren braucht, damit OvaRex^® eine klinisch nützliche Immunreaktion hervorruft, dass jedoch Gehalte von mindestens 5 Einheiten/ml bei anfänglicher Dosierung bevorzugt sein können.

Um das Verhältnis zwischen der Anzahl der Dosen, dem Dosierungszeitplan und induzierter Immunreaktion zu bewerten, werden bei einer 102 Patienten umfassenden, randomisierten Studie Patienten mit CA125-Gehalten von < 35 Einheiten/ml, folgend auf erfolgreiche Primärbehandlung für Stadium III/IV-Krankheit eingetragen. Das Protokoll wird bestimmen, wie die Anzahl der Dosen Immunreaktionsparameter beeinflusst und wird sowohl Anzahl der Dosen und Immunreaktionsparameter einschließlich HAMA, Ab2, anti-CA125 und T-Zellen-Immunität mit klinischem Ergebnis korrelieren.

Die bis zum heutigen Tage zusammengestellten Daten bezüglich Effekten von OvaRex^®, welches bei wiederauftretendem Eierstockkrebs verabreicht wurde oder während des "watchfull waiting"-Stadiums der Krankheit nach Operation und/oder Chemotherapie zeigen, dass OvaRex^® Überleben verlängert und die Zeit bis zum Rückfall bei Patienten mit Eierstockkrebs erhöht. Diese klinischen Nutzen sind reduzierbar mit der Induktion von tumorspezifischen T-Zellen-Reaktionen verbunden – deutlich gezeigt bei den potentiell wiederkehrenden Krankheitsstudien – und mit der Produktion von Standard-humoralen Markern, wie etwa HAMA und Ab2 (Noujaim et al., im Druck). Mehr als 500 Patienten wurden bisher mit OvaRex^® behandelt, was zeigte, dass OvaRex^® ein günstiges Sicherheitsprofil aufweist – besonders im Kontext von gegenwärtig verwendeten Chemotherapien.

CA125, der Eierstockkrebsmarker, an welchen OvaRex^® bindet, liegt bei 97% von Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs vor, wird jedoch auch bei Patienten mit anderen Krebstypen gefunden. CA125 kann daher medizinisch relevant für viele Tumortypen sein.

Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen, welche die Immunogenität des Wirts verändern.

Claims

Verfahren zum Verlängern des Überlebens eines Krebspatienten, umfassend: Identifizieren eines Patienten, welcher CA125-Gehalte von etwa 35 Einheiten/ml oder weniger aufweist, und dem Patienten einen xenogenen, für CA125-Antigen spezifischen Antikörper verabreichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Patient ein Eierstockkrebspatient ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 9,5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein muriner Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper muriner, monoklonaler Antikörper B43.13 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper in einer geringen Dosis verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Dosis von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Patienten ist.
Verfahren zum Verlängern einer Zeit bis zu einem Krankheitsrückfall bei einem Krebspatienten, folgend auf anfängliche Behandlung mit Chemotherapie und/oder operativen Eingriff, wobei das Verfahren umfasst: Identifizieren eines Patienten, welcher anfänglicher Behandlung unterzogen wurde und CA125-Gehalte von etwa 35 Einheiten/ml oder weniger aufweist, und dem Patienten einen xenogenen, für CA125-Antigen spezifischen Antikörper verabreichen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Patient ein Eierstockkrebspatient ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 9,5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein muriner Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper muriner, monoklonaler Antikörper B43.13 ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper in einer geringen Dosis verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Dosis von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Patienten ist.
Verfahren zum Verlängern des Überlebens eines Krebspatienten, folgend auf anfängliche Behandlung mit Chemotherapie und/oder operativen Eingriff, wobei das Verfahren umfasst: Identifizieren eines Patienten, welcher anfänglicher Behandlung unterzogen wurde und CA125-Gehalte von etwa 35 Einheiten/ml oder weniger aufweist, und dem Patienten einen xenogenen, für CA125-Antigen spezifischen Antikörper verabreichen.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Patient ein Eierstockkrebspatient ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Gehalt an CA125-Antigen von etwa 9,5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Antikörper ein muriner Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Antikörper muriner, monoklonaler Antikörper B43.13 ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Antikörper in einer geringen Dosis verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Dosis von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Patienten ist.
Verfahren zum Induzieren einer Wirtsimmunreaktion gegen ein multi-epitopisches in-vivo-CA125-Antigen, welches in einem Gehalt von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 30 Einheiten/ml vorliegt, welcher keine effektive Wirtsimmunreaktion hervorruft, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen des Antigens mit einer Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches spezifisch an ein erstes Epitop auf dem Antigen bindet, und das Bindungsmittel ein Bindungsmittel/Antigen-Paar ausbilden lassen, wobei eine Wirtsimmunreaktion gegen ein zweites Epitop auf dem Antigen hervorgerufen wird.
Verfahren zum Ändern einer Wirtsimmunreaktion gegen ein CA125-Antigen, welches in einem Gehalt von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 30 Einheiten/ml vorliegt, wobei das Verfahren umfasst: dem Wirt eine Zusammensetzung verabreichen, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches spezifisch an das Antigen bindet und die Immunreaktion gegen das Antigen ändert, wobei das in der Zusammensetzung vorliegende Bindungsmittel nicht mit Radiomarkierung versehen ist, und in einer Menge von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Wirts vorliegt.
Verfahren zum Induzieren einer Wirtsimmunreaktion gegen ein multi-epitopisches in-vivo-CA125-Antigen, welches in einem Gehalt von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 30 Einheiten/ml vorliegt, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen des multi-epitopischen Antigens mit einer Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel, mit Ausnahme von B43.13, umfasst, welches spezifisch an ein erstes Epitop auf dem Antigen bindet, und das Bindungsmittel ein Bindungsmittel/Antigen-Paar ausbilden lassen, wobei eine Wirtsimmunreaktion gegen ein zweites Epitop auf dem Antigen hervorgerufen wird.
Verfahren zum Ändern einer Wirtsimmunreaktion gegen ein CA125-Antigen, welches in einem Gehalt von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 30 Einheiten/ml vorliegt, wobei das Verfahren umfasst: dem Wirt eine Zusammensetzung verabreichen, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches spezifisch an das Antigen bindet und die Immunreaktion gegen das Antigen ändert, wobei das Bindungsmittel in einer Menge von etwa 0,1 μg bis etwa 2 mg pro kg Körpergewicht des Wirts vorliegt.
Verfahren zum Induzieren einer Wirtsimmunreaktion gegen ein multi-epitopisches CA125-Antigen, welches in einem Gehalt von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 35 Einheiten/ml in einem Wirtsserum vorliegt, wobei das Antigen keine effektive Wirtsimmunreaktion hervorruft, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen des Antigens mit einer Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches spezifisch an das Antigen bindet, und das Bindungsmittel ein Bindungsmittel/Antigen-Paar ausbilden lassen, wobei eine günstige Wirtsimmunreaktion gegen das Antigen hervorgerufen wird.
Verfahren zum Induzieren einer Wirtsimmunreaktion gegen ein multi-epitopisches in-vivo-CA125-Antigen, welches in einem Gehalt von etwa 5 Einheiten/ml bis etwa 9,5 Einheiten/ml vorliegt, welcher keine effektive Wirtsimmunreaktion hervorruft, wobei das Verfahren umfasst: In-Kontakt-Bringen des Antigens mit einer Zusammensetzung, welche ein Bindungsmittel umfasst, welches spezifisch an ein erstes Epitop auf dem Antigen bindet, und das Bindungsmittel ein Bindungsmittel/Antigen-Paar ausbilden lassen, wobei eine Wirtsimmunreaktion gegen ein zweites Epitop auf dem Antigen hervorgerufen wird.