DE10260871A1

DE10260871A1 - Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Veränderung des Serin-Acetyltransferase-Gehalts

Info

Publication number: DE10260871A1
Application number: DE10260871A
Authority: DE
Inventors: Michael Geiger; Susanne Tropf; Klaus Salchert; Ulrich Keetman; Karin Herbers; Rainer Lemke; Rüdiger HELL; Markus Wirtz
Original assignee: SunGene GmbH
Current assignee: SunGene GmbH
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2002-12-23
Publication date: 2004-07-08
Also published as: BR0317624A; AU2003288255A1; WO2004058934A2; EP1576164A2; WO2004058934A3; US20060021085A1; AU2003288255A8; CA2511025A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder Aktivität an Serin-Acetyltransferase (SAT) und/oder einen veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für eine SAT kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt an SAT aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder Aktivität an Serin-Acetyltransferase (SAT) und/oder einen veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für eine SAT kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. RN:DB:aw Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Kultivierung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt an SAT aufweisen.
Als Vitamin E werden üblicherweise die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität bezeichnet, bei denen es sich um Derivate des 6-Chromanols handelt (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Tocopherole (1) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2) eine ungesättigte Seitenkette:
α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
β-Tocopherol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
γ-Tocopherol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
δ-Tocopherol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃
α -Tocotrienol: R¹ = R² = R³ = CH₃ β -Tocotrienol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H γ-Tocotrienol: R¹= H, R² = R³ = CH₃ δ -Tocotrienol: R¹ = R² = H, R³ = CH3
In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle vorstehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin E-Aktivität verstanden.
Diese Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität sind wichtige natürliche fett-lösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen. Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharmazeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.
Von den genannten Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität ist das α-Tocopherol biologisch am wichtigsten. Die Tocopherole und Tocotrienole kommen in vielen Pflanzenölen vor, besonders reich an Tocopherolen und Tocotrienolen sind die Samenöle von Soja, Weizen, Mais, Reis, Baumwolle, Raps, Luzerne und Nüssen. Auch Früchte und Gemüse, wie z.B. Himbeeren, Bohnen, Erbsen, Fenchel, Paprika etc. enthalten die oben genannten Vitamin E-Verbindungen. Soweit bisher bekannt werden Tocopherole und Tocotrienole ausschließlich in Pflanzen bzw. photosynthetisch aktiven Organismen synthetisiert. Einige der wichtigsten Synthesewege der Tocopherole und Tocotrienole sind in 1a und 1b dargestellt.
Tocopherole tragen aufgrund ihres Redoxpotentials dazu bei, die Oxidation ungesättigter Fettsäuren durch Luftsauerstoff zu vermeiden; in Menschen ist α-Tocopherol das wichtigste fettlösliche Antioxidans. Es wird angenommen, dass die Tocopherole durch die Funktion als Antioxidantien zur Stabilisierung biologischer Membranen beitragen, da durch den Schutz der ungesättigten Fettsäuren der Membrane die Membranfluidität aufrechterhalten wird. Jüngeren Erkenntnissen zu Folge kann darüber hinaus mit der regelmäßigen Zufuhr relativ hoher Tocopherol-Dosen der Ausbildung der Arieriosclerose entgegengewirkt werden. Als weitere günstige Eigenschaften der Tocopherole wurden die Verzögerung Diabetes-bedingter Spätschäden, die Verminderung des Risikos der Kataraktbildung, die Verminderung des oxidativen Stresses bei Rauchern, antikarzinogene Effekte, protektive Wirkung gegen Hautschäden wie Erytheme und Hautalterung beschrieben.
Wegen ihrer oxidationshemmenden Eigenschaften werden die Tocopherole und Tocotrienole nicht nur lebensmitteltechnologisch genützt, sondern auch in auf natürlichen Ölen basierenden Anstrichfarben, in Desodorantien und anderen Kosmetika, beispielsweise Sonnenschutzmittel, Hautpflegemittel, Lippenstiften etc. eingesetzt. Dabei sind Tocopherol-Verbindungen wie Tocopherolacetat und -succinat die üblichen Applikationsformen für die Anwendung als Vitamin E in durchblutungsfördernden und Lipid-senkenden Mitteln und veterinärmedizinisch als Futtermittelzusatz.
Wirtschaftliche Verfahren zur Herstellung von Vitamin E-Verbindungen bzw. von Nahrungs- und Futtermitteln mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt sind daher von großer Bedeutung. Besonders vorteilhaft sind dabei biotechnologische Verfahren oder durch genetische Veränderung optimierte Vitamin E-produzierende Organismen wie transgene Pflanzen und Pflanzenzellen.
Bei der Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt bedient man sich dabei im Stand der Technik üblicherweise Enzymen, die in die Biosynthese der Tocopherole und Tocotrienole in höheren Pflanzen involviert sind (siehe auch 1a und 1b).
In höheren Pflanzen wird Tyrosin ausgehend von Chorismat über Prephenat und Arogenat gebildet. Die aromatische Aminosäure Tyrosin wird durch das Enzym Tyrosinaminotransferase in Hydroxyphenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homogentisinsäure überführt wird.
Die Homogentisinsäure wird anschließend an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydrochinol bzw. das 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinol zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zyklisierung γ Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol.
Es sind Versuche bekannt, in transgenen Organismen durch Überexpression einzelner Biosynthesegene eine Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Tocopherol- bzw. Tocotrienolgehaltes zu erreichen.

WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).

WO 99/04622 bzw. DellaPenna et al., (1998) Science 282, 2098-2100 beschreiben Gensequenzen codierend für eine γ-Tocopherolmethyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

WO 99/23231 zeigt, dass die Expression einer Geranylgeranyl-Reductase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherolbiosynthese zur Folge hat.

WO 00/08169 beschreibt Gensequenzen codierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-S-Phosphat-Synthase und eine Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat Oxidoreduktase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

WO 00/68393 und WO 00/63391 beschreiben Gensequenzen codierend eine Phytyl/Prenyl-Transferase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

In WO 00/61771 wird postuliert, dass die Kombination eines Gens aus dem Sterol-Stoffwechsel in Kombination mit einem Gen aus dem Tocopherolstoffwechsel zu einer Erhöhung des Tocopherolgehalts in transgenen Pflanzen führen kann.

Alle diese Methoden liefern zwar genetisch veränderte Organismen, insbesondere Pflanzen, die in der Regel einen modifizierten Gehalt an Vitamin E aufweisen, weisen jedoch den Nachteil auf, dass die Höhe des Gehalts an Vitamin E in den im Stand der Technik bekannten genetisch veränderten Organismen noch nicht zufriedenstellend ist.

Es besteht daher weiterhin ein großer Bedarf an transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit deutlich erhöhten Vitamin E-Gehalten, die zur Gewinnung der Vitamin E-Verbindungen genützt werden können.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, dass die Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt ermöglicht.

Diese und weitere Aufgaben der Erfindung, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, werden durch den Gegenstand des unabhängigen Anspruchs gelöst.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden durch die abhängigen Unteransprüche definiert.

Es ist jetzt überraschend gefunden worden, dass die Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SAT in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eine Steigerung des Gehalts an Vitamin E-Verbindungen wie den genannten Tocopherolen und Tocotrienolen ermöglicht. Dies war insbesondere deswegen überraschend, weil bisher davon ausgegangen wurde, dass Enzyme mit einer SAT-Aktivität eine Funktion lediglich in Biosynthesewegen zur Herstellung von Schwefel-haltigen Verbindungen wie Cystein, Methionin und z.B. Glutathion haben.

Serin-Acetyltransferase (SAT, EC2.3.1.30) ist an dem zweistufigen Prozess beteiligt, durch den in vivo in Mikroorganismen und Pflanzen die Cystein-Biosynthese bewerkstelligt wird.

SAT sorgt für die Bildung des aktivierten Thioesters O-Acetylserin (OAS) aus Serin und Acetyl-CoenzymA. Freies Sulfid wird in O-Acetylserin eingeführt, um Cystein und Acetat mittels enzymatischer Katalyse durch O-Acetylserin (Thiol)-Lyase zu erhalten. Die durch SAT katalysierte Reaktion stellt hierbei den geschwindigkeitslimitierenden Schritt dar, wobei die Aktivität dieses Enzyms ausschließlich in Verbindung mit O-Acetylserin (Thiol)-Lyase (OAS-TL) in dem so genannten Cysteinsynthase-Komplex gefunden wird. OAS-TL ist bedingt durch die Aktivität SAT-freier Homodimere in großem Überschuss vorhanden (Kredich et al., (1969) J. Biol. Chem., 244, 2428-2439; Saito (2000) Curr. Opin. Biol. 3, 188-195).

Mikrobielle, pflanzliche und tierische SATs können nach ihrer allosterischen Regulierbarkeit in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Eine Reihe von SATs wird durch das Endprodukt des durch sie katalysierten Biosynthesewegs, Cystein, inhibiert. Solche SATs werden üblicherweise als Feedback-regulierte SATs bezeichnet (Wirtz et al., (2002), Amino acids, in press; Hell et al., (2002) Amino Acids 22, 245-257; Noji et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 32739-45; moue et al., (1999) Eur. J. Biochem. 266, 220-27; Saito (2000) Curr. Op. Plant Biol. 3, 188-95).

Als Prototypen für Feedback-regulierte SATs gelten die mikrobiellen SATs CysE aus E. coli (Accession Code E12533; Denk und Böck (1987) J. Gen. Microbiol. 133, 515-25) und S. typhimurium (Accession Code A00198; Kredich and Tomkins (1966) J. Biol. Chem. 241, 4955-65), sowie die pflanzlichen SATs SAT-c aus A. thaliana (Accession Code U30298; Noji et al., vide supra), SAT2 aus Citrullus vulgaris (Accession Code D49535; Saito et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-26) und SAT56 aus Spinacia oleracea (Accession Code D88529; Noji et al., (2001) Plant Cell Physiol. 42, 627-34).

Daneben gibt es eine Gruppe von SATs, die in wesentlich geringerem Ausmaß durch Cystein bzw. überhaupt nicht durch Cystein inhibiert werden können. Man bezeichnet diese SATs auch als Feedback-unabhängige SATs. Typische Vertreter solcher Feedback-unabhängigen SATs sind bislang nur aus Pflanzen bekannt. Dazu gehören z.B. SAT A aus Arabidopsis thaliana (EMBL Accession code X82888; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol. 109, 1498; Wirtz et al., 2002, vide supra), SAT 4 aus Nicotiana tabacum (Accession Code AJ414052; Wirtz et al., 2002, vide supra) und ASATS aus Allium tuberosum (Urano et al., (2000) Gene 257, 269-277).

Aufgrund ihrer Rolle im Biosyntheseweg für Cystein wurde die Verwendung von SATkodierenden Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nur im Zusammenhang mit Verfahren zur Herstellung von transgenen Organismen mit erhöhten Cystein- bzw. Glutathion-Gehalten diskutiert (Wirtz et al., vide supra). Aus dem Stand der Technik ist keine funktionelle Verbindung zwischen SAT und Biosynthesewegen, die zur Produktion von Vitamin E-Verbindungen wie Tocopherolen und Tocotrienolen führen, bekannt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jetzt überraschend gefunden worden, dass die Änderung des Gehalts oder der Aktivität von funktionellen oder nicht-funktionellen SATs in Pflanzen verwendet werden kann, um transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen herzustellen, die über erhöhte Vitamin E-Gehalte verfügen. Die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SATs in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann dabei z.B. auf die Übertragung und Überexpression von Nukleinsäuren, die für funktionelle oder nichtfunktionelle SATs kodieren, auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen zurückzuführen sein. Die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SAT in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt kann auch auf die Hoch- bzw. Herunterregulierung der Aktivität und/oder der synthetisierten Menge von endogenen SATs zurückzuführen sein.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist jetzt darüber hinaus gefunden worden, dass die Veränderung des Gehalts an Thiol-Verbindungen verwendet werden kann, um transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen herzustellen, die über erhöhte Vitamin E-Gehalte verfügen. Die Änderung des Gehalts an Thiol-Verbindungen kann dabei z.B. auf die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SATs in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zurückzuführen sein und damit z.B. durch die Übertragung und Überexpression von Nukleinsäuren, die für funktionelle oder nicht-funktionelle SATs kodieren, auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erreicht werden. Die Änderung des Gehalts an Thiol-Verbindungen kann dabei aber auch auf die Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von anderen in die Stoffwechselwege von Thiol-Verbindungen involvierten Enzymen zurückzuführen sein und damit z.B. durch die Übertragung und Überexpression von Nukleinsäuren, die für solche Enzyme oder Homologe, Mutanten bzw. Fragmente davon kodieren, auf Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erreicht werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt und einem veränderten Gehalt und/oder Aktivität von SAT im Vergleich zum Wildtyp.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen die Expression von SAT durch Übertragung von Nukleinsäuresequenzen, die für funktionelle oder nicht-funktionelle SATs oder funktionelle Äquivalente davon kodieren, auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen bewirkt wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen die Aktivität oder Menge an endogener SAT hoch- oder herunterreguliert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen Antikörper, die für SATs spezifisch sind und möglicherweise deren Funktion hemmen, in der Zelle exprimiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen der posttranslationale Modifikationsstatus von überexprimierten oder endogenen funktionellen und/oder nicht-funktionellen SATs verändert wird.

Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, bei denen die Expression von einem Teil der endogenen SAT-Gene durch Verfahren wie z.B. Antisense-Verfahren, post-transcriptional gene silencing (PTGS), virus-induced gene silencing (VIGS), RNA interference (RNAi) oder homologe Rekombination gesilenct wurde.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, die über einen im Vergleich zum Wildtyp veränderten Gehalt und/oder Aktivität an SAT verfügen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die Pflanzen einen veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen im Vergleich zum Wildtyp aufweisen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und über im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Vitamin E-Gehalte verfügen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nukleinsäuren, die für funktionelle oder nicht-funktionelle SATs aus verschiedenen Organismen kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt.

Unter Serin-Acetyltransferase-Aktivität wird erfindungsgemäß die Enzymaktivität einer Serin-Acetyltransferase verstanden.

Unter einer Serin-Acetyltransferase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Serin und Acetyl-Coenzym A zum aktivierten Thioester O-Acetylserin (OAS) zu verknüpfen.

Dementsprechend wird unter Serin-Acetyltransferase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Serin-Acetyltransferase umgesetzte Menge Serin bzw. gebildete Menge O-Acetylserin verstanden.

Bei einer gegenüber dem Wildtyp veränderten SAT-Aktivität wird erfindungsgemäß somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein SAT eine andere Menge Serin umgesetzt bzw. eine andere Menge O-Acetylserin gebildet.

Bei einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten SAT-Aktivität wird somit erfindungsgemäß im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein SAT die umgesetzte Menge Serin bzw. die gebildete Menge O-Acetylserin erhöht.

Bei einer gegenüber dem Wildtyp erniedrigten SAT-Aktivität wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein SAT die umgesetzte Menge Serin bzw. die gebildete Menge O-Acetylserin erniedrigt.

Bei einem gegenüber dem Wildtyp veränderten Gehalt an SAT wird somit im Vergleich zum Wildtyp in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle eine andere Menge des Proteins SAT hergestellt.

Bei einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten Gehalt an SAT wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer Pflanze bzw. Pflanzenzelle mehr SAT hergestellt.

Entsprechend wird bei einer gegenüber dem Wildtyp erniedrigten Gehalt an SAT in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle im Vergleich zum Wildtyp weniger SAT hergestellt.

Bei einem gegenüber dem Wildtyp veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen wird somit im Vergleich zum Wildtyp in der Pflanze bzw. Pflanzenzelle eine andere Menge der Thiol-Verbindungen hergestellt. Entsprechendes gilt bei erhöhten bzw. erniedrigten Thiol-Gehalten.

Vorzugsweise beträgt die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bewirkte die Erhöhung des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT in einer transgenen Pflanzenzelle bzw. Pflanze mindestens 5%, bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 100%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 10, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 50, noch bevorzugter mindestens den Faktor 100 und am meisten bevorzugt mindestens den Faktor 1000.

Vorzugsweise beträgt die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren bewirkte Erniedrigung des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT in einer transgenen Pflanzenzelle bzw. Pflanze mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 20%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 40%, ebenfalls besonders bevorzugt mindestens 60% , insbesondere bevorzugter mindestens 80%, ebenfalls insbesondere bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 98%.

Unter einem Wildtyp wird erfindungsgemäß der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden.

Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von SAT gesprochen wird, dann sind erfindungsgemäß damit sowohl Feedback-regulierte als auch Feedback-unabhängige SATs gemeint. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff SAT funktionelle sowie nicht-funktionelle SATs.

Funktionelle SATs fallen dabei unter die Definition wie sie oben für eine SAT gegeben worden ist.

Wenn im Rahmen der Erfindung vom funktionell äquivalenten Teilen von SATs gesprochen wird, dann sind damit Fragmente der Nukleinsäuresequenzen von kompletten SATs gemeint, deren Expression noch zu Proteinen mit der enzymatischen Aktivität eines SAT führen. Diese Proteinfragmente fallen ebenfalls unter den Begriff „funktionell äquivalente Teile von SATs".

Nicht-funktionelle SATs verfügen erfindungsgemäß über die gleiche Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen wie funktionelle SATs bzw. funktionelle äquivalente Teile davon, weisen jedoch an einigen Stellen Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden oder Aminosäuren auf, die bewirken, dass die nicht-funktionellen SATs nicht oder nur sehr begrenzt in der Lage sind, Serin unter Bildung von O-Acetylserin zu acetylieren. Nicht-funktionelle SATs umfassen auch solche SATs, die Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen auf Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzebene tragen und nicht oder trotzdem in der Lage sind, mit physiologischen Bindungspartnern der SAT zu interagieren. Zu solchen physiologischen Bindungspartnern gehören z.B. die O-Acetylserin (Thiol)-Lyase.

Erfindungsgemäß umfasst der Begriff "nicht-funktionelle SAT" nicht solche Proteine, die keine wesentliche Sequenzhomologie auf Aminosäure- bzw. Nukleinsäureebene zu funktionellen SATs aufweisen. Proteine, die nicht in der Lage sind, Acetylgruppen auf Serin zu übertragen, und keine wesentliche Sequenzhomologie mit SATs aufweisen, sind daher definitionsgemäß mit dem erfindungsgemäßen Begriff "nicht-funktionelle SATs" nicht gemeint. Nicht-funktionelle SATs werden im Rahmen der Erfindung auch als inaktivierte oder inaktive SATs bezeichnet.

Somit zeichnen sich erfindungsgemäße nicht-funktionelle SATs, die die oben genannten Punktmutationen, Insertionen und/oder Deletionen tragen, durch eine wesentliche Sequenzhomologie zu den bekannten funktionellen erfindungsgemäßen SATs oder deren funktionell äquivalenten Teilen aus.

Unter wesentlicher Sequenzhomologie wird erfindungsgemäß allgemein verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines DNA-Moleküls bzw. eines Proteins zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen einer bekannten funktionellen SAT oder deren funktionell äquivalenten Teilen identisch sind.

Unter Identität zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al., (1989), Comput. Appl. Bioci., 5(2), 151) berechnet wird.

Homologien können ebenfalls mit Hilfe der Lasergene-Software der Firma DNA Star, Inc., Madison, Wisconsin (USA) unter Anwendung der CLUSTAL-Methode (Higgins et al., (1989), Comput. Appl. Bioci., 5(2), 151) berechnet werden.

Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen von Feedback-regulierten bzw. Feedbackunabhängigen funktionellen SATs sind dem Fachmann bekannt. Sie können z.B. in allgemein bekannten Datenbanken wie der Nukleotidsequenzdatenbank Genbank oder der Proteinsequenzdatenbank des NCBI entnommen werden. Darüber hinaus finden sich zahlreiche Beispiele für die genannten SATs in der Literatur (siehe oben).

Besonders bevorzugt für die erfindungsgemäßen Verfahren sind die Nukleinsäuresequenzen für Feedback-regulierte funktionelle SATs aus A. thaliana (SAT-c; U30298; Noji et al., (1998) vide supra), aus Citrullus vulgaris (SAT2; Accession Code D49535; Saito et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321-26) und aus Spinacia oleracea (SAT56; D88529; Noji et al., (2001) Plant Cell Physiol. 42, 627-34) sowie aus Mikroorganismen wie S typhimurium (CysE; Accession Code A00198; Kredich and Tomkins (1966) J. Biol. Chem. 241, 4955-65).

Ebenfalls besonders bevorzugt sind für die erfindungsgemäßen Verfahren die Nukleinsäure-Sequenzen für Feedback-unabhängige funktionelle SATs aus Pflanzen, Mikroorganismen, Pilzen und Tieren. Besonders bevorzugt sind dabei die cDNA-Sequenzen der Nicotiana tabacum SAT-Gene 1, 4 und 7 (EMBO Accession numbers AJ414051, AJ414052 und AJ414053) sowie die Arabidopsis thaliana SAT-Gene SAT 52, SAT 5 und SAT A (EMBL Accession Codes U30298, Z34888 und X82888).

Weitere bevorzugte Nukleinsäuresequenzen für die genannten SATs aus umfassen sowie die A. thaliana Gene SAT-p (Accession Code L42212; Noji et al., (1998) vide supra) und SAT-m (identisch zu SAT A; Accession code X82888; Noji et al., (1998) vide supra; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol., 109, 1498; Wirtz et al., (2002) vide supra).

SATs mit Sequenzen, die zu den Sequenzen der oben genannten Accession numbers im Wesentlichen homolog sind, sind ebenfalls Gegenstand bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung.

Besonders bevorzugt verwendet man für das erfindungsgemäße Verfahren Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, enthaltend die Aminosäuresequenz GKXXGDRHPKIGD (X steht für eine beliebige Aminosäure; Wirtz et al., (2001) Eur. J. Biochem. 268, 686-93) oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 30%, vorzugsweise von mindestens 50%, bevorzugt von mindestens 70%, noch bevorzugter von mindestens 90%, am bevorzugtesten von mindestens 95% auf Aminosäureebene mit der Sequenz mit dem Accession code X82888 (Bogdanova et al., (1995) FEBS L. 358, 43-47; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol. 109, 1498; Wirtz et al., 2002, vide supra) haben und die die enzymatische Eigenschaft einer SAT aufweisen.

Erfindungsgemäße nicht-funktionelle Feedback-regulierte oder nicht-funktionelle Feedbackunabhängige SATs können vom Fachmann in einfacher Weise identifiziert werden. Dem Fachmann stehen eine Reihe von Techniken zur Verfügung, mit denen es möglich ist, Mutationen, Insertionen oder Deletionen in die Nukleinsäuresequenzen, die für funktionelle SATs kodieren, einzufügen (Sambrook (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Nach Einführung der Punktmutation, Insertion und/oder Deletion, die auch allgemein als Mutation bezeichnet werden, kann der Fachmann durch entsprechende Enzymaktivitättests, wie sie in den Beispielen dargestellt oder aus dem Stand der Technik bekannt sind, feststellen, ob die mutagenisierten SATs noch über Enzymaktivität verfügen. Nicht-funktionelle SATs verfügen über eine im Vergleich zur nichtmutagenisierten SAT erniedrigten Aktivität. Erfindungsgemäß verfügt eine nicht-funktionelle SAT über 1 bis 90%, bevorzugt über 1 bis 70%, besonders bevorzugt über 1 bis 50%, ebenfalls besonders bevorzugt über 1 bis 30%, insbesondere bevorzugt über 1 bis 15% und am meisten bevorzugt über 1 bis 10% der Aktivität der entsprechenden funktionellen SAT mit Wildtyp-Sequenz.

Nicht-funktionelle SATs, die nicht mehr (oder trotzdem) in der Lage sind, an physiologische Bindungspartner der SAT wie z.8. (OAS-TL) zu binden, kann der Fachmann durch entsprechende in vitro Bindungstests ebenfalls in Routineexperimenten identifizieren.

Bevorzugt werden als nicht-funktionelle SATs für die erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäuresequenzen verwendet, die für eine nicht-funktionelle SAT mit reduzierter Enzymaktivität kodieren, wobei die SAT mindestens einen Aminosäureaustausch innerhalb des in SAT-Enzymen konservierten Aminosäuremotivs
GKX₁X₂GDRHPKIGD
verfügt. Bei der Aminosäure X handelt es sich generell um eine beliebige Aminosäure, bei X₁ handelt es sich bevorzugt um Q oder A; bei der Aminosäure X₂ handelt es sich bevorzugt um C oder S. Aminosäuren sind im Ein-Buchstaben-Code abgekürzt. Auch die N- bzw. C-Terminal neben diesem genannten Motiv liegenden Aminosäuren sind in SATs stark konserviert. Das Kernmotiv innerhalb der genannten Aminosäuresequenzmotiv ist DRH. Ein Aminosäureaustausch innerhalb dieses Kernmotivs ist besonders bevorzugt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Mutation, die zu der enzymatischen Inaktivierung der SAT führt, um einen Aminosäureaustausch der Aminosäure Histidin innerhalb des genannten Motivs. Dabei ist ein Austausch von Histidin zu Alanin besonders bevorzugt.

Unter dem Begriff "Punktmutation" ist in der Beschreibung der Austausch einer Aminosäure oder eines Nukleotid durch eine andere Aminosäure oder ein anderes Nukleotid zu verstehen. Bezüglich Aminosäuren werden so genannte konservative Austausche bevorzugt durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure ähnliche physiko-chemische Eigenschaften hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise ein Austausch von Glutamat durch Aspartat oder Valin durch Isoleucin. Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure oder eines Nukleotids durch eine direkte Bindung.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren oder Nukleotiden in die Polypeptidkette oder in das Nukleinsäuremolekül, wobei formal eine direkte Bindung durch eine oder mehrere Aminosäuren oder Nukleotide ersetzt wird.

In der beigefügten 2 werden verschiedene SAT-Aminosäuresequenzen im Vergleich dargestellt. Dabei steht SAT1 für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A (SAT-1, database axcession no. U 22964), SATS steht für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform B (SAT-5, database axcession no. Z 34888), SAT52 steht für die Arabidopsis thaliana SAT-Isoform C (SAT-52, database axcession no. U 30298), CysE steht für das SAT-Enzym aus S. typhimurium (CysE, database accession no. A 00198); TDT steht für Tetrahydrodipicolinat-N-Succinyltransferase aus E. coli (TDT; database accession no. P 56220); LpxA steht für UDP-N-Acetylglucosaminacyltransferase aus E. coli (LpxA; database accession no. P 10440). Weitere Sequenzangaben sind zu finden in Murillo et al., (1995) Cell. Mol. Biol. Res. 41, 425 -433; Howarth et al., (1997) Biochim. Biophys. Acta 1350, 123 -127; Saito et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 16321 – 16326, Genbank Accession no. D 88530 (K. Saito). Dem beiliegenden Alignment kann die Position des für die Inaktivierung des SAT-Enzyms geeigneten Motivs entnommen werden . Entsprechend kann durch Alignments die Position des konservierten Aminosäuremotivs in weiteren, dem Stand der Technik zu entnehmenden SAT-Enzymen bestimmt werden. Z.B. befindet sich das Kernmotiv D R H in der Arabidopsis thaliana SAT-Isoform A bei Aminosäure 307-309, wobei sich die Nummerierung immer auf das erste Methionin des längsten offenen Leserahmens bezieht. Die Position des Motivs in den anderen SAT-Isoformen kann problemlos dem als 2 beigefügten Aminosäure-Alignment entnommen werden.

Neben den oben genannten SAT-Genen stehen dem Fachmann weitere im Stand der Technik beschriebene und in den Gendatenbanken erhältliche SAT-Sequenzen zur Verfügung, die sich für die Umsetzung der Erfindung eignen. Darüber hinaus ist der Fachmann mittels Routineverfahren wie PCR oder Screening von Bibliotheken mit geeigneten SAT-Gensonden problemlos in der Lage weitere SAT-Gensequenzen aus einem beliebigen Organismus zu isolieren.

Es ist bereits oben eine Vielzahl von DNA-Sequenzen, die sowohl für funktionelle als auch für nicht-funktionelle, Feedback-regulierte bzw. Feedback-unabhängige SATs aus verschiedenen Organismen kodieren, angegeben worden. Dem Fachmann ist bekannt, wie er entsprechende korrespondierende DNA-Sequenzen von anderen Organismen isolieren kann. Typischerweise wird der Fachmann zunächst durch Homologie-Vergleiche in den etablierten Datenbanken wie z.B. der Genebank-Datenbank am NCBI versuchen, entsprechende homologe Sequenzen zu identifizieren. Solche Datenbanken können auf der NCBI-Homepage beim NIH unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov gefunden werden.

DNA-Sequenzen mit einer hohen Homologie, d.h. einer hohen Ähnlichkeit oder Identität sind bona fade Kandidaten für DNA-Sequenzen, die den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, d.h. SATs entsprechen. Diese Gensequenzen können durch Standardmethoden, wie z.B. PCR und Hybridisierung isoliert werden, und ihre Funktion durch entsprechende Enzymaktivitättests und andere Experimente durch den Fachmann bestimmt werden. Homologievergleiche mit DNA-Sequenzen können erfindungsgemäß auch verwendet werden, um PCR-Primer zu designen, indem zunächst die Regionen identifiziert werden, die zwischen den DNA-Sequenzen von verschiedenen Organismen am meisten konserviert sind. Solche PCR-Primer können dann benutzt werden, um in einem ersten Schritt DNA-Fragmente zu isolieren, die Bestandteile von DNA-Sequenzen sind, die zu den DNA-Sequenzen der Erfindung homolog sind.

Es gibt eine Reihe von Suchmaschinen, die für solche Homologievergleiche bzw. -suchen verwendet werden können. Diese Suchmaschinen umfassen z.B. die CLUSTAL-Programmgruppe des BLAST-Programms, das durch das NCBI zur Verfügung gestellt wird.

Darüber hinaus sind dem Fachmann eine Reihe von experimentellen Methoden bekannt, mit denen DNA-Sequenzen aus verschiedensten Organismen isoliert werden können, die zu den erfindungsgemäßen SATs homolog sind. Dazu gehört z.B. das Anfertigen und Screenen von cDNA-Bibliotheken mit entsprechend degenerierten Sonden (siehe auch Sambrook et al., vide supra).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem erhöhten Vitamin E-Gehalt, wobei die Pflanzen einen veränderten Gehalt an Thiol-Verbindungen im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigen diese trangenen Pflanzen erhöhte Gehalte an Thiol-Verbindungen im Vergleich zum Wildtyp. Die Erhöhung an Erhöhung an Thiol-Verbindungen kann dabei mindestens den Faktor 2, bevorzugt mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt mindestens den Faktor 10, insbesondere bevorzugt mindestens den Faktor 20 und am meisten bevorzugt mindestens den Faktor 100 betragen. Die Erhöhung an Vitamin E entspricht in der Regel den weiter unten genannten Werten.

Unter Thiol-Verbindungen werden dabei erfindungsgemäß natürlicherweise in Pflanzen vorkommende Verbindungen mit Thiol-Gruppen verstanden. Insbesondere zählen zu den Thiol-Verbindungen Glutathion, S-Adenosylmethionin, Methionin und Cystein.

Erfindungsgemäß können trangene Pflanzen mit verändertem Gehalt an Thiol-Verbindungen z.B. durch Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT hergestellt werden, wie sie im Folgenden im Detail diskutiert wird. Solche transgenen Pflanzen können aber auch durch Veränderung des Gehalts und/oder der Aktivität von anderen Enzymen, die in die Herstellung von Thiol-Verbindungen involviert sind, hergestellt werden.

Die Erhöhung der SAT-Aktivität und des SAT-Gehalts kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Transkriptions-, Translations- und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend für eine SAT gegenüber dem Wildtyp, beispielsweise durch Induzierung des SAT-Gens oder durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend für eine SAT.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der SAT-Aktivität bzw. des SAT-Gehalts gegenüber dem Wildtyp durch eine Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend einer SAT. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eine SAT durch Einbringen von Nukleinsäuren kodierend eine SAT in den Organismus, bevorzugt in eine Pflanze.

Dazu kann prinzipiell jedes SAT-Gen verschiedenster Organismen, also jede Nukleinsäure, die eine SAT kodiert, verwendet werden. Bei genomischen SAT-Nukleinsäuresequenzen aus eukaryontischen Quellen, die Introns enthalten, sind für den Fall, dass der Wirtsorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden SATs zu spleißen, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden. Alle in der Beschreibung erwähnten Nukleinsäuren können z.B. eine RNA-, DNA- oder cDNA-Sequenz sein.

In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt wird eine Nukleinsäuresequenz, die für eine der oben definierten funktionellen oder nicht-funktionellen, Feedback-regulierten oder Feedback-unabhängigen SATs kodiert, auf eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle übertragen. Diese Übertragung führt zu einer Erhöhung der Expression der funktionellen bzw. nichtfunktionellen SAT und entsprechend zu einer Erhöhung des Vitamin E-Gehalts in den transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen.

Ein solches Verfahren umfasst erfindungsgemäß typischerweise die folgenden Schritte:

a) Herstellung eines Vektors umfassend die folgenden Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt DNA-Sequenzen, in 5'-3'-Orientierung: – eine in Pflanzen funktionelle Promotorsequenz – operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für eine SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodiert – eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz
b) Übertragung des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und ggf. Integration in das pflanzliche Genom.

Ein solches Verfahren kann benutzt werden, um die Expression von DNA-Sequenzen, die für funktionelle oder nicht-funktionelle, Feedback-regulierte oder Feedback-unabhängige SATs oder deren funktionell äquivalente Teile kodieren, zu erhöhen und damit den Vitamin E-Gehalt in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen ebenfalls zu erhöhen. Die Verwendung solcher Vektoren, die regulatorische Sequenzen, wie es Promotor und Terminationssequenzen sind, umfassen, ist dem Fachmann bekannt. Darüber hinaus weiß der Fachmann, wie ein Vektor aus Schritt a) auf Pflanzenzellen übertragen werden kann und welche Merkmale ein Vektor besitzen muss, um ins pflanzliche Genom integriert werden zu können.

Durch Überexpression aktiver SAT kann die Gesamtaktivität von SAT auf diese Weise in Blättern von transgenem Tabak bis um den Faktor 100 erhöht werden (Wirtz et al. (2002) vide supra). Die messbare SAT-Gesamtaktivität erhöht sich nach Überexpression nichtfunktioneller SAT entsprechend nicht, wohl aber die Menge an nicht-funktioneller SAT. Dennoch muss sich in diesen transgenen Linien die Bildungsrate von O-Acetylserin und Cystein erhöht haben, da die Gehalte dieser Verbindungen stark ansteigen (WO 02/060939). Ohne an eine wissenschaftliche Hypothese gebunden sein zu wollen, wird vermutet, dass diese Erhöhung sehr wahrscheinlich durch Kompensation der jeweils nicht betroffenen Zellkompartimente, die über eigene Cysteinsynthese-Enzyme verfügen, erreicht wird, um die durch die inaktivierte SAT verursachte Deregulierung in Plastiden bzw. dem Cytosol auszugleichen (WO 02/060939). Gleichzeitig wird in den Pflanzen eine signifikante Erhöhung des Vitamin E-Gehalts erreicht.

Generell kann durch das dargestellte Verfahren eine Erhöhung des Vitamin E-Gehalts um mindestens 20%, bevorzugt um mindestens 50%, ebenfalls bevorzugt um mindestens 75 %, besonders bevorzugt um mindestens 100%, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 5, ebenfalls insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und am meisten bevorzugt um mindestens den Faktor 100 im Vergleich zum Wildtyp erreicht werden.

Wenn der SAT-Gehalt in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Übertragen einer Nukleinsäure erhöht wird, die für eine SAT aus einem anderen Organismus wie z.B. E. coli kodiert, dann ist es empfehlenswert, die durch die Nukleinsäuresequenz z.B. aus E. coli kodierte Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code in eine Nukleinsäuresequenz zu überführen, die vor allem solche Codons umfasst, die aufgrund der Organismus-spezifischen Codon-Usage häufiger verwendet werden. Die Codon-Usage lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der betreffenden Organismen leicht ermitteln.

Unter Erhöhung der Genexpression bzw. der Aktivität einer Nukleinsäure kodierend eine SAT wird erfindungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Organismus-, insbesondere pflanzeneigenen endogenen SATs verstanden. Dies kann beispielsweise durch Veränderung der Promotor-DNA-Sequenz für SAT kodierende Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine veränderte, vorzugsweise erhöhte Expressionsrate mindestens eines endogenen SAT-Gens zur Folge hat, kann durch Deletion oder Insertion von DNA-Sequenzen erfolgen.

Eine Veränderung der Promotor-Sequenz von endogenen SAT-Genen führt in der Regel zu einer Veränderung der exprimierten Menge des SAT-Gens und damit auch zu einer Änderung der in der Zelle bzw. der Pflanzen nachweisbaren SAT-Aktivität.

Des Weiteren kann eine veränderte bzw. erhöhte Expression mindestens eines endogenen SAT-Gens dadurch erzielt werden, dass ein im nicht transformierten Organismus nicht vorkommendes Regulatorprotein mit dem Promotor dieser Gene in Wechselwirkung tritt. Solch ein Regulator kann ein chimäres Protein darstellen, welches aus einer DNA-Bindedomäne und einer Transkriptionsaktivator-Domäne besteht, wie beispielsweise in WO 96/06166 beschrieben.

Eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Aktivität und des Gehalts von endogenen SATs besteht darin, Transkriptionsfaktoren, die in die Transkription der endogenen SAT-Gene involviert sind, z.B. durch Überexpression hochzuregulieren. Die Maßnahmen zur Überexpression von Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt und werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung für SATs offenbart.

Darüber hinaus kann eine Veränderung der Aktivität von endogenen SATs durch gezielte Mutagenese der endogenen Genkopien erreicht werden.

Eine Veränderung der endogenen SATs kann ebenfalls durch Beeinflussung der posttranslationalen Modifikationen von SATs erreicht werden. Dies kann z.B. dadurch geschehen, dass die Aktivität von Enzymen wie Kinasen oder Phosphatasen, die in die post-translationale Modifikation von SATs involviert sind, durch entsprechende Maßnahmen wie Überexpression oder "gene silencing" reguliert wird.

Die Expression von endogenen SATs kann auch über die Expression von Aptameren, die spezifisch an die Promotorsequenzen von SAT binden, reguliert werden. Je nachdem, ob die Aptamere an stimulierende oder reprimierende Promotorbereiche binden, wird die Menge und in diesem Fall damit die Aktivität an endogener SAT erhöht oder erniedrigt.

Aptamere können auch so entworfen werden, dass sie spezifisch an die SAT-Proteine binden und durch z.B. Bindung an das katalytische Zentrum der SATs die Aktivität der SATs reduzieren. Die Expression von Aptameren erfolgt üblicherweise durch Vektor-basierte Überexpression und ist dem Fachmann ebenso wie der Entwurf und die Selektion von Aptameren wohl bekannt (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36).

Darüber hinaus kann eine Verminderung der Menge und Aktivität von endogenen SATs durch verschiedene, dem Fachmann wohl bekannte experimentelle Maßnahmen erreicht werden. Diese Maßnahmen werden üblicherweise unter dem Begriff des "gene silencing" zusammengefasst. Zum Beispiel kann durch Übertragen eines oben genannten Vektors auf Pflanzen, der eine für SAT-kodierende DNA-Sequenz oder Teile davon in Antisense-Orientierung aufweist, die Expression eines endogenen SAT-Gens gesilenct werden. Dies beruht darauf, dass die Transkription eines solchen Vektors in der Zelle zu einer RNA führt, die mit der vom endogenen SAT-Gen transkribierten mRNA hybridisieren kann und somit deren Translation verhindert.

Prinzipiell können die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die, gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Dies kann die Effizienz einer antisense Strategie erhöhen.

Weitere Methoden zur Reduzierung der SAT-Expression insbesondere in Pflanzen als Organismen umfassen die zur Kosuppression führende Überexpression homologer SAT- Nukleinsäuresequenzen (Jorgensen et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31 (5), 957-973) oder die Induktion des spezifischen RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell et al., (1999) Plant J. 20 (3), 357-362). Diese Methoden werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet.

Weitere Methoden sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in das endogene Gen mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18 (5), 555-558) oder die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z.B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20 (5) 963-976) oder homologer Rekombination (Hohn et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8321-8323.).

Ferner ist eine Genrepression (aber auch die Genüberexpression) auch mit spezifischen DNAbindenden Faktoren z.B. Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Ferner können Faktoren in eine Zelle eingebracht werden, die das Zielprotein selber inhibieren. Die Protein-bindenden Faktoren können z.B. Aptamere sein (Famulok et al., (1999) Curr Top Microbiol Immunol. 243, 123-36).

Als weitere Protein-bindende Faktoren, deren Expression in Pflanzen eine Reduktion des Gehalts und/oder der Aktivität an SAT bewirkt, kommen SAT-spezifische Antikörper in Frage. Die Herstellung von monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten SATspezifischen Antikörpern folgt Standard-Protokollen (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymol. 182, pp. 663-679 (1990), M. P. Deutscher, ed.). Die Expression von Antikörpern ist ebenfalls aus der Literatur bekannt (Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205-216; Maynard and Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).

Weitere Techniken, die verwendet werden können, um die Expression von endogenen SAT-Genen zu unterdrücken, zu minimieren oder zu verhindern, umfassen VIGS, RNAi oder "gene knockouts" z.B. durch homologe Rekombination. Die entsprechenden Verfahren sind dem Fachmann bekannt oder können in einfacher Weise in der Literatur recherchiert werden. Eine weitere übliche Methode zum "gene silencing" ist die Co-Suppression (siehe z.B. Waterhouse et al., (2001), Nature 411, 834-842; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol. 20, 446-448 und weitere Publikationen in dieser Ausgabe, Paddison et al., (2002), Genes Dev. 16, in press, Brummelkamp et al., (2002), Science 296, 550-553).

Die genannten Techniken sind dem Fachmann wohl bekannt. Er weiß daher auch über welche Größen die für z.B. Antisense-Verfahren oder das RNAi-Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte verfügen müssen, und über welche Komplementarität, Homologie bzw. Identität die jeweiligen Nukleinsäuresequenzen verfügen müssen.

Die Begriffe Komplementarität, Homologie und Identität sind dem Fachmann bekannt.

Unter Sequenzhomologie bzw. Homologie wird dabei erfindungsgemäß allgemein verstanden, dass die Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz eines DNA-Moleküls bzw. eines Proteins zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98% zu den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen eines bekannten DNA- oder RNA-Moleküls bzw. Proteins identisch sind.

Mit dem Begriff Komplementarität wird die Fähigkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zu hybridisieren. Der Fachmann weiß, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine 100-prozentige Komplementarität verfügen müssen, um miteinander hybridisieren zu müssen. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer anderen Nukleinsäuresequenz hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, zu mindestens 50%, zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98 bzw. 100% komplementär.

Nukleinsäuremoleküle sind identisch, wenn sie gleiche Nukleotide in gleicher 5'-3'-Reihenfolge aufweisen.

Die Hybridisierung einer Antisense-Sequenz mit einer endogenen mRNA-Sequenz findet typischerweise in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro statt. Erfindungsgemäß wird eine Hybridisierung in vivo oder in vitro unter Bedingungen ausgeführt, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten.

Stringente in vitro Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (siehe z.B. Sambrook et al., vide supra). Der Begriff "spezifische Hybridisierung" bezieht sich auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz bindet, wenn diese Nukleinsäuresequenz Teil einer komplexen Mischung von z.B. DNA- oder RNA-Molekülen ist.

Der Begriff "stringente Bedingungen" bezieht sich damit auf Bedingungen, unter denen eine Nukleinsäuresequenz präferentiell an eine Zielsequenz bindet, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen.

Stringente Bedingungen sind von den Umständen abhängig. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Hybridisierungstemperatur circa 5°C unter dem Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und einem definierten pH-Wert liegt. Tm ist die Temperatur (bei einem definierten pH-Wert, einer definierten ionischen Stärke und einer definierten Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der Moleküle, die zu einer Zielsequenz komplementär sind, mit dieser Zielsequenz hybridisieren. Typischerweise umfassen stringente Bedingungen Salzkonzentrationen zwischen 0,01 und 1,0 M Natriumionen (oder eines anderen Salzes) und einen pH zwischen 7,0 und 8,3. Die Temperatur ist mindestens 30°C für kurze Moleküle (z.B. für solche, die zwischen 10 bis 50 Nukleotiden umfassen). Zusätzlich können stringente Bedingungen die Zugabe von destabilisierenden Agenzien wie z.B. Formamid umfassen. Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben folgende Zusammensetzung.

Prähybridisierungslösung:

0,5 % SDS
5x SSC
50 mM NaPO₄, pH 6,8
0,1 % Na-Pyrophosphat
5x Denhardt's Lösung
100 μg/ml Lachssperm

Hybridisierungslösung:

Prähybridisierungslsg.
1×10⁶ cpm/ml Sonde (5-10 min 95°C)

20x SSC.

3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat
ad pH 7 mit HCl

50x Denhardt's Reagenz:

5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrrolidon
5 g Bovine Serum Albumine
ad 500 ml A. dest.

Eine typische Verfahrensweise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus:
Optional: Blot 30 min in 1x SSC/ 0,1% SDS bei 65°C waschen
Prähybridisierung: mindestens 2 h bei 50-55°C
Hybridisierung: über Nacht bei 55-60°C

Die Begriffe "Sense" und "Antisense" sowie "Antisense-Orientierung" sind dem Fachmann bekannt. Der Fachmann weiß darüber hinaus, wie lang Nukleinsäuremoleküle, die für Antisense-Verfahren verwendet werden sollen, sein müssen und welche Homologie oder Komplementarität sie hinsichtlich ihrer Zielsequenzen haben müssen.

Entsprechend weiß der Fachmann auch, wie lang Nukleinsäuremoleküle, die für andere "gene silencing"-Verfahren verwendet werden, sein müssen. Zum Beispiel weiß der Fachmann, dass bei einem RNAi-Verfahren Nukleinsäuremoleküle in die Zelle eingebracht werden müssen, bei denen es sich entweder um doppelsträngige RNA, von denen ein Strang homolog bzw. identisch zu einer endogenen RNA-Sequenz ist, handelt, oder um DNA-Moleküle, deren Transkription in der Zelle entsprechende doppelsträngige RNA-Moleküle ergeben, wobei die die RNA-interference induzierenden doppelsträngigen RNA-Moleküle üblicherweise 20-25 Nukleotide umfassen (siehe auch Tuschl et al., vide supra). Eine ausführliche Beschreibung dieser Methode ist ebenfalls in WO 99/32619 offenbart.

Auch eine kombinierte Anwendung der vorstehend beschriebenen Methoden ist denkbar.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung des Vitamin E-Gehalts in transgenen Pflanzen, bei dem zusätzlich zu der Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SAT solche Enzyme, die eine erhöhte Bildung von Homogentisat oder Phytylpyrophosphat, einen verminderten Abbau von Homogentisat oder Phytylpyrophosphat oder eine verstärkte Umsetzung innerhalb der letzten Schritte der Tocopherolbiosynthese bewirken (z.B. Tocopherolmethyltransferase, Tocopherolcyclase, γ-Tocopherolmethyltransferase), hinsichtlich ihres Gehalts oder ihrer Aktivität in den transgenen Pflanzen verändert sind.

Beispiele für solche Enzyme finden sich in der WO 02/072848, die hier diesbezüglich ausdrücklich als Offenbarung eingeführt wird.

Da es sich bei diesen Enzymen um Enzyme handelt, die in die Regulation der Vitamin E-Synthese in vivo involviert sind, bringt die Hochregulierung des Gehalts bzw. der Aktivität der vorgenannten Enzyme im Zusammenhang mit der Änderung des Gehalts und/oder der Aktivität von SATs weitere Vorteile bei der Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt. Die Hoch- oder Runterregulation der Aktivität bzw. des Gehalts der genannte Enzyme kann dabei durch eine und/oder eine Kombination der vorgenannten Methoden erfolgen.

Wenn erfindungsgemäß DNA-Sequenzen verwendet werden, die in 5'-3'-Orientierung operativ mit einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist, verknüpft sind, können allgemein Vektoren konstruiert werden, die nach der Übertragung auf Pflanzenzellen die Überexpression der kodierenden Sequenz in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen ermöglichen bzw. die Suppression von endogenen Nukleinsäuresequenzen bewirken.

Vektoren, die erfindungsgemäß zur Überexpression und zur Repression von DNA-Sequenzen, die für die verschiedenen SATs oder funktionell äquivalente Teile davon kodieren, verwendet werden können, können zusätzlich zu den zu übertragenden Nukleinsäuresequenzen regulatorische Sequenzen umfassen. Welche spezifischen regulatorischen Elemente bzw. Sequenzen in diesen Vektoren enthalten sind, hängt dabei von dem Ziel der Anwendung ab. Vektoren, die zur Überexpression von kodierenden Sequenzen in Pflanzen verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann sind ebenso Methoden zur Übertragung der Sequenzen sowie zur Herstellung von transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einer erhöhten bzw. reduzierten Expression von Proteinen bekannt.

Typischerweise gewährleisten die regulatorischen Elemente, die in Vektoren enthalten sind, die Transkription und, wenn erwünscht, die Translation der Nukleinsäuresequenz, die auf die Pflanzen übertragen wird.

Diese Nukleinsäurekonstrukte, in denen die kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Regulationssignalen operativ verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten, werden als Vektoren oder auch Expressionskassetten genannt.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere als Expressionskassette fungierende Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend eine SAT oder funktionell äquivalente Teile davon, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft ist, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.

Vorzugsweise enthalten die Regulationssignale einen oder mehrere Promotoren, die die Transkription und Translation in Organismen, insbesondere in Pflanzen gewährleisten.

Die Expressionskassetten beinhalten Regulationssignale, also regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für mindestens eines der vorstehend beschriebenen Gene operativ verknüpft sind.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte und Expressionskassetten zusätzlich eine Nukleinsäure, die für ein Peptid kodiert, das die Lokalisation der exprimierten SAT in der Zelle reguliert. Bevorzugt kodieren solche Nukleinsäure für plastidäre Transitpeptide, die die Lokalisation in Plastiden, insbesondere bevorzugt in Chloroplasten gewährleistet, oder für Signalpeptide, die die Lokalisation im Cytoplasma, Mitochondrien oder im Endoplasmatischen Reticulum bewirken.

Im Folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäurekonstrukte, Expressionskassetten und Vektoren für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, sowie die transgenen Pflanzen selbst beschrieben.

Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., (1987) Nucl. Acids Res. 15, 8693 -8711).

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., (1980) Cell21, 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., (1989) EMBO J. 8 2195-2202). Ein weiterer möglicher Promotor ist der Nitrilase-Promotor.

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des Ziel-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRP1-Promotor (Ward et al., (1993) Plant. Mol. Biol. 22 361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid-induzierbarer ( EP 388 186 ), ein durch Tetrazyklininduzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer ( EP 335 528 ) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können beispielsweise verwendet werden.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., (1989) EMBO J. 8 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67 % des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler et al., (1995) Bio/Technology 10 1090-1094). Besonders bevorzugt ist daher die Expression der SATs im Samen von Pflanzen unter Verwendung Samen-spezifischer Promotoren wie z.B. des Phaseolin- ( US 5504200 ), des USP- (Baumlein et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 225 (3), 459-467), des LEB4-, des Vicilinund des Legumin B4-Promotors.

Der Biosyntheseort von Vitamin E ist in Pflanzen unter anderem das Blattgewebe, so dass eine blattspezifische Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierend eine SAT sinnvoll ist. Dies ist jedoch nicht einschränkend, da die Expression auch in allen übrigen Teilen der Pflanze – besonders in fetthaltigen Samen – gewebespezifisch erfolgen kann.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft deshalb eine samenspezifische Expression der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren.

Darüber hinaus ist eine konstitutive Expression der SAT von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten SAT kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression der SAT und deren Auswirkung auf die Vitamin E-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet vorzugsweise in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine kodierende Nukleinsäuresequenz und eventuell eine Region für homologe oder heterologe die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im Wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3 835 f oder funktionelle Äquivalente davon.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt vorzugsweise durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer vorstehend beschriebenen Nukleinsäure wie einer für SAT kodierenden Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Nukleinsäuresequenz inserierten Target-Nukleinsäure, die z.B. für ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., (vide supra) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Insbesondere bevorzugt sind insertierte Target-Nukleinsäuren, die ein Targeting in den Plastiden gewährleisten.

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäuresequenz für ein Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des Ziel-Proteins in die Chloroplasten vom Ziel-Protein-Teil enzymatisch abgespalten werden.

Ebenfalls bevorzugt sind in Expressionskassetten Sequenzen enthalten, die für ein Fusionsprotein mit einem Zytoplasma-Peptid kodieren. Die Lokalisation im Zytoplasma kann dabei u.U. auch durch Weglassen der Sequenz für das plastidäre Transitpeptid sichergestellt werden.

Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transitpeptid (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco (rbcs) oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen Nukleinsäure-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.

Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotidsequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotidsequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im Allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.

Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für 'bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Die Erfindung betrifft somit Vektoren enthaltend die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskassetten.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom eines Organismus, insbesondere einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet.

Dazu können insbesondere bei Pflanzen an sich bekannte Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden.

Geeignete Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone – die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 128-143 sowie in Potrykus et al., (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205-225) beschrieben.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie beispielsweise pUC-Derivate verwendet werden. Typischerweise können Vektoren verwendet werden, die über zur Propagation und Selektion in E.coli nötige Sequenzen verfügen. Dazu gehören auch Vektoren der pBR322-, M13mp-Serien und pACYCl84. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einem binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T- DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).

Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich kann T-DNA vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzelle ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeignetem Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten ebenfalls in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein Derivat des Transformationsvektors pSUN2 mit Vicilin-Promotor (WO 02/00900) eingebaut werden.

Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen der Transformation mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (siehe u.a. Chan et al., (1993), Plant Mol. Biol. 22, 491-506).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan et al., (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al., (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: H.J. Rehm et al., Band 2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland).

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich eines erhöhten Vitamin E-Gehalts untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.

Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.

Die Expressionskassette kann über die Pflanzen hinaus auch zur Transformation von Bakterien, insbesondere Cyanobakterien, Moosen, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft daher ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren und der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere der Expressionskassetten zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen, insbesondere zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen oder zur Transformation von Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen.

Vorzugsweise weisen diese transgenen Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Vitamin E auf.

Daher betrifft die Erfindung ferner die Verwendung von SATs oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte zur Erhöhung des Gehalts an Vitamin E in Organismen, die als Wildtyp in der Lage sind, Vitamin E zu produzieren.

Es ist bekannt, dass Pflanzen mit einem hohen Vitamin E-Gehalt eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Stress aufweisen. Unter abiotischem Stress wird beispielsweise Kälte, Frost, Trockenheit, Hitze und Salz verstanden.

Daher betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Herstellung transgener Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Stress aufweisen.

Die vorstehend beschriebenen Proteine und Nukleinsäuren können zur Herstellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen, vorzugsweise zur Herstellung von Vitamin E in transgenen Pflanzen verwendet werden.

Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes der Pflanze oder Pflanzenteile an Vitamin E.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen, indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt oder eine vorstehend beschriebene Kombination von Nukleinsäurekonstrukten in das Genom des Ausgangsorganismus einführt.

Die Erfindung betrifft ferner die vorstehend beschriebenen genetisch veränderten Organismen selbst.

Wie vorstehend erwähnt, weisen die genetisch veränderte Organismen, insbesondere Pflanzen einen erhöhten Gehalt an Vitamin E auf.

Zur Herstellung von Organismen mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin E im Vergleich zum Wildtyp werden in einer bevorzugten Ausführungsform, wie vorstehend erwähnt, photosynthetisch aktive Organismen wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, besonders bevorzugt Pflanzen als Ausgangsorganismen und dementsprechend.

Bei den für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören.

Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US-Patent US 6,137,030 entnommen werden.

Bevorzugte Pflanzen sind Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuss- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Sonnenblume, Canola, Kartoffel oder Soja.

Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Erfindung betrifft somit ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und einen erhöhten Vitamin E-Gehalt aufweisen. Bei den Ernteprodukten und dem Vermehrungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Blüten, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc. Es kann sich auch um Teile dieser Pflanzen wie Pflanzenzellen, Protoplasten und Kalli handeln.

Die genetisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen, können wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Vitamin E verwendet werden.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitamin E können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futtermittel oder als Futter- und Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Pflanzen können ferner zur Herstellung von Vitamin E-haltigen Extrakten verwendet werden.

Erhöhung des Gehaltes an Vitamin E bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze, vorzugsweise für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird in der Regel ein erhöhter Gehalt an Gesamt-Tocopherol verstanden. Unter einem erhöhten Gehalt an Vitamin E wird aber auch insbesondere ein veränderter Gehalt der vorstehend beschriebenen 8 Verbindungen mit Tocopherolaktivität verstanden.

Die Bestimmung des Vitamin E-Gehalts erfolgt nach im Stand der Technik üblichen Methoden. Diese sind insbesondere ausführlich in WO 02/072848 offenbart, dessen Inhalt hier ausdrücklich als Offenbarung für Nachweisverfahren des Vitamin E Gehalts in Pflanzen angeführt wird.

Der Vitamin E-Gehalt kann z.B. in Blättern und Samen von für SATs transgenen Pflanzen bestimmt werden. Dazu werden insbesondere trockene Samen oder gefrorenes Blattmaterial verwendet.

Das Blattmaterial der Pflanzen wird direkt nach der Probennahme in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Der sich daran anschließende Aufschluss der Zellen (Blätter oder Samen) erfolgt mittels einer Rührapparatur durch dreimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm (Umdrehungen pro Minute) in 100% Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt werden. Weitere Inkubations- und Extraktionsschritte ergeben in der Regel keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.

Um Oxidation zu vermeiden, werden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer HPLC-Anlage (Waters Allience 2690) analysiert. Tocopherole und Tocotrienole werden über eine übliche „Reverse Phase"-Säule (ProntoSil200-3-C30 TM , Fa. Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Fa. Merck) identifiziert. Als Detektionssystem dient die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emission 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszenzdetektors FP 920 nachgewiesen werden kann.

Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen, die nur der Veranschaulichung der Erfindung dienen und in keiner Weise als Einschränkung zu verstehen sind, erläutert.

Allgemeine Klonierungsverfahren:

Klonierungsverfahren, wie z.B. Restriktionsspaltung, DNA-Isolierung, Agarose, Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose und Nylon-Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli-Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenz-Analyse von rekombinanter DNA, wurden nach Sambrook et al., vide supra, durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen et al., ((1988) Nucl. Acids Res. 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfolgte in YEB-Medium (Vervliet et al., (1975) J. Gen. Virol. 26, 33).

Bakterienstämme und Plasmide

E. coli (XL 1 Blue) Bakterien wurden von der Firma Stratagene, La Jolla, USA bezogen. Der zur Pflanzentransformation eingesetzte Agrobakterienstamm (GV3101; Bade und Damm in Gene Transfer to Plants; Protrykus, I. and Spangenberg, G., eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30 – 38) war mit dem Vektor pSUN2 transformiert. Zur Klonierung wurde der Vektor pSUN2 verwendet.

Herstellung von transgenen Raps-Pflanzen (Brassica napus)

sTransgene Ölsamen-Rapspflanzen wurden gemäß einem Standardprotokoll hergestellt (Bade und Damm in Gene Transfer to Plants; Protrykus, I. and Spangenberg, G., eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30 – 38). Die genannte Referenz offenbart ebenfalls die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer.

Die Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) oberflächensterilisiert, in Wasser bei 55°C für 10 min gewaschen und in einer 1%igen Hypochlorite-Lösung (25% (v/v) Teepol, 0,1% (v/v) Tween20) für 20 min inkubiert. Danach wurde jeder Samen sechsmal mit sterilem Wasser für 20 min gewaschen. Die Samen wurden für drei Tage auf Filterpapier getrocknet. 10 bis 15 Samen wurden dann in einem Glasbehälter, der 15 ml Keimungs-Medium enthielt, ausgekeimt. Die Wurzeln und Apices wurden von verschiedenen Setzlingen (Größe ca. 10 cm) entfernt und die verbleibenden Stämmchen (engl.: hypocotyls) in Stückchen von ca. 6 mm Länge geschnitten. Die auf diese Weise erhaltenen ca.

600 Explantate wurden in 50 ml „Basal"-Medium für 30 min gewaschen und dann in ein einen 300 ml Behälter überführt. Nach der Zugabe von 100 ml Kallusinduktions-Medium wurden die Kulturen unter Schütteln bei 100 rpm (engl.: revolutions per minute) für 24 h inkubiert.

Zur Transformation wurde eine Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens in „Luria Broth"-Medium, das mit Kanamycin (20 mg/1) versetzt war, bei 29°C angezogen und 2 ml dieser Kultur in 50 ml Antibiotika-freiem „Luria Broth"-Medium bei 29°C für 4 Stunden inkubiert, bis eine OD₆₀₀ von 0,4 bis 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde dann bei 2000 rpm für 25 min. zentrifugiert und das Zellpellet in 25 ml „Basal"-Medium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde auf eine OD₆₀₀ von 0,3 durch entsprechende Zugabe von Medium eingestellt.

Das Kallusinduktions-Medium wurde von den Ölsamen-Rapsexplantaten mit Hilfe von sterilen Pipetten entfernt und 50 ml der Bakteriensuspension zu den Explantaten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Bakteriensuspension wurde dann entfernt und die Ölsamen-Rapsexplantate anschließend mit 50 ml des Kallusinduktions-Mediums für 1 min gewaschen. Anschließend wurden 100 ml des Kallusinduktions-Mediums zugegeben. Die Co-Kultivierung wurde unter Schütteln bei 100 rpm für 24 h durchgeführt und durch Entfernen des Kallusinduktions-Mediums gestoppt. Die Explantate wurden dann jeweils zweimal mit 25 ml Wasch-Medium für 1 min und zweimal mit 100 ml Wasch-Medium für 60 min unter Schütteln bei 100 rpm gewaschen. Das Wasch-Medium wurde dann mit den Explantaten in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit Hilfe von sterilen Pipetten entfernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20 bis 30 Explantate in 90 mm Petrischalen, die 25 ml "Shoot induction"-Medium mit Kanamycin enthielten, überführt. Die Petrischalen wurden mit zwei Schichten Leukopor^® abgedichtet und bei 25°C und 2000 Lux einem Photozyklus von 16 h Licht und 16 h Dunkelheit unterworfen. Jeweils nach 12 Tagen wurden die sich entwickelnden Kalli in frische Petrischalen, die ebenfalls "Shoot induction"-Medium enthielten, überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration vollständiger Pflanzen wurden wie in der oben angegebenen Referenz (Bade und Damm, vide supra) durchgeführt.

Herstellung einer enzymatisch inaktiven Serin-Acetyltransferase (SAT), die noch zur Interaktion mit OAS-TL befähigt ist.

Die im Stand der Technik hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz sowie der zugrundeliegenden DNA-Sequenz beschriebene SAT-A aus Arabidopsis thaliana (EMBL Accession code X82888; Bogdanova und Hell (1995) Plant Physiol. 109, 1498; Wirtz et al., 2002, vide supra) wurde durch gerichtete Mutagenese der Aminosäure Histidin 309 zu Alanin inaktiviert (die Nummerierung bezieht sich auf das erste Methionin des offenen Leserahmens). Die gerichtete Mutagenese der zugehörigen cDNA im Plasmid pBlueScript (Stratagene) erfolgte durch Basenpaaraustausch nach einem kommerziell verfügbaren Verfahren der Firma Promega (Heidelberg, Deutschland).

Die ortgerichtete Mutagenese der SAT-A cDNA wurde mit pBS/ΔSAT1-6 durchgeführt (Bogdanova et al., (1995) FEBS Lett. 358, 43-47). Das eingesetzte Promega GeneEditor in vitro Site Directed Mutagenesis System erzielte im Durchschnitt 80% positive Klone. Die Punktmutationen wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert und die resultierenden Aminosäureaustausche wurden in Bezug auf das Startkodon des längsten möglichen offenen Leserahmens einer mitochondrialen SAT-A cDNA nummeriert (cDNA SAT-1 (Roberts et al., (1996) Plant Mol. Biol. 30, 1041-1049)).

Die Inaktivierung der SAT-Mutante durch den Aminosäureaustausch in Position 309 (Histidin → Alanin) wurde durch fehlende heterologe Komplementation einer SAT-freien E. coli-Mutante und durch Enzymbestimmung in vitro (maximal 1 % Restaktivität) belegt. Die Interaktionsfähigkeit mit O-Acetylserin (Thiol) Lyase (OAL-TL) wurde durch heterologe Expression in dem Hefe "two-hybrid"-System und Coexpression in E. coli mit nachfolgender biochemischer Reinigung bewiesen.

Die Inaktivierung des cysE-Gens von E. coli zwecks Erzeugung einer SAT-freien E. coli Mutante wurde nach der von Hamilton et a1., beschriebenen Methode durchgeführt (Hamilton (1989) J. Bacteriol. 171, 4617 – 4622). Hierdurch sollte ein Bakterienstamm bereitgestellt werden, der bezüglich seiner SAT-Defizient stabiler ist als die im Stand der Technik gegenwärtig erhältlichen. Hierzu wurde das Wildtyp cysE-Gen mittels PCR kloniert und durch Insertion einer Gentamycin-Resistenz-Kassette in eine ClaI-Restriktionsschnittstelle bei Position 522, bezogen auf das Startcodon des cysE-Gens, inaktiviert. Nach Klonierung dieser Cassette in das Plasmid pMAK705, welches einen Temperatur-sensitiven Replikationsursprung trägt, wurde das inaktivierte cysE-Gen in das Genom von E. coli C600 via homologe Rekombination integriert, um den Stamm MW1 zu ergeben (thr, leu, thi, lac, λ-P1 + F', cysE, Gm^r). Komplementationstests unter Einsatz der E. coli-Stämme EC 1801 (E. coli Genetik Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA) oder MW 1 wurden auf M9-Minimalmedium-Agarplatten mit oder ohne Cystein unter Zugabe von Induktionsmittel und selektiven Antibiotika durchgeführt.

Die Konstrukte für die Expression der mitochondrialen SAT-A aus Arabidopsis thaliana umfassten pBS/ΔSAT1-6 (X82888; Bogdanova et al., (1985) vide supra), pET/ΔSAT1-6 sowie mutierte Formen der SAT-A. Um das zuletzt genannte Plasmid zu erhalten, wurde die kodierende Region der SAT-A mittels PCR von Basenpaar 28 – 939 ohne mitochondriales Transitpeptid unter Einsatz spezifischer Primer, flankiert von EcoRI- und XhoI-Schnittstellen, amplifiziert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCAP (Roche, Mannheim, Deutschland) kloniert, die Sequenz mittels Sequenzierung beider Stränge verifiziert und in die entsprechenden Schnittstellen von pET29a (Novagen, Madison, USA) eingefügt, was in einem Fusionsprotein mit den 35 Aminosäuren des S-Tag an seinem N-Terminus für Affinitätsreinigung an S-Agarose resultierte. Mitochondriale OAS-TL aus A. thaliana wurde in ähnlicher Weise durch Klonierung eines PCR-Produkts, welches das reife Protein ohne das mitochondriale Transitpeptid von Basenpaar 172 – 1162 (AJ271727 (Hesse et al., (1999) Amino Acids 16, 113-131) umfasste, in die NcoI-BamHI-Schnittstellen von pET3d, was pET/OAS-C ergab, exprimiert.

Die Expression, Kultivierung und Affinitätsreinigung von SAT und OAS-TL unter Einsatz des S-tag-Systems (Novagen) wurden im Wesentlichen wie von Droux et al., (1998, Eur. J. Biochem. 255,235-245) beschrieben, durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen. Nach dem letzten Waschschritt wurde der S-tag nicht durch proteolytische Spaltung an der Affinitätssäule entfernt, da diese Behandlung in Fraktionen mit labiler SAT-Aktivität resultierte. Statt dessen wurde SAT mit 3 M MgCl₂ eluiert, welches anschließend durch Gelfiltration an PD10-Säulen (Amerschan, Freiburg, Deutschland) entfernt wurde. In vitro Interaktion von SAT und OAS-TL an der Säule wurde in einem Standardwasch- und Elutionsprotokoll mit oder ohne 1 mM OAS (O-Acetylserin) bestimmt, wie beschrieben von Droux et al., (1998, vide supra).

Die Bestimmung der Proteinkonzentration und die Auftrennung von Proteinen wurden nach Standardprotokollen (z.B. Sambrook et al., vide supra) durchgeführt.

Die SAT-Enzymaktivität mit und ohne OAS-TL wurde in einem Standard-Assay auf der Grundlage der Methode von Kredich und Becker (1971, In Methods in Enzymology (Tabor and Tabor, eds), Seiten 459-469, Academic Press, New York, USA) bestimmt. Roh- oder gereinigtes rekombinantes SAT-Protein wurde in einem Volumen von 250 μl (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 0,2 mM Acetyl-CoA, 2mM Dithiothreitol, 5mM Serin) bei 25°C inkubiert und A₂₃₂ wurde für bis zu 3 Min. aufgenommen.

Die OAS-TL-Aktivität wurde unter gesättigten Bedingungen wie zuvor beschrieben untersucht (Nakamura et al., (1987) Plant Cell Physiol.28, 885-891). Kinetische Analysen wurden mit der SigmaPlot-Software durchgeführt, welche hyperbolische Anpassungen auf der Grundlage der Michaelis-Menten-Gleichung erlaubte: ν = V_max × ([S]/(K_m + [S]).

Für die Interaktionsanalysen unter Einsatz des Hefe "two-hybrid"-Systems wurden die Transformation der Hefestämme HF7c und PCY2, die Selektion auf Minimalmedium und (3-Galaktosidase-Assays durchgeführt wie bereits beschrieben (Bogdanova and Hell (1997) Plant J. 11, 251-262). PCR mit spezifischen Primerpaaren, flankiert von SaII- bzw. SpeI-Schnittstellen, wurde für sämtliche Konstrukte eingesetzt, um die kodierenden Regionen in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen von pPC86 (GAL4-Aktivierungsdomäne) und pPC97 (GAL4-DNA-Bindungsdomäne) einzufügen (Chevray and Nathans (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793). EST 181H17T7 (GenBank Accession Number AJ2711727) wurde als Template eingesetzt, um OAS-TL C ohne mitochondriales Transitpeptid von Basenpaar 172 – 1162 zu erzeugen. Im Unterschied zu den bisher eingesetzten full length-Konstukt (Bogdanova et al., (1997) vide supra) wurden die pPC-Vektoren mit mitochondrialer SAT-A ohne mitochondriales Transitpeptid durch Amplifizierung von Basenpaar 28 – 939 konstruiert (X82888 (Bogdanova et al., (1995) vide supra).

Expression der aktiven SAT-A und der nicht funktionellen SAT-A-Mutante (H309A) in Pflanzen Die cDNAs der aktiven SAT-A (SAT) und der inaktivierten Mutante SAT-A H309A (SATH309A) wurden in einen binären Transformationsvektor (pSUN2, WO 02/00900) kloniert. SAT und SATH309A wurden in gleicher Weise durch PCR amplifiziert und mit dem Leserahmen des rbcs Transitpeptides fusioniert. Die Lokalisierung beider SATs im Cytosol erfolgte mit pSUN2 unter Weglassung des Abschnitts für das Importpeptid. Als Promotoren wurden entweder der Nitrilase-Promotor für eine konstitutive Expression oder der Vicilin-Promotor für eine samenspezifische Expression verwendet.

Die Klonierungen erfolgten jeweils in die vorgegebenen XhoI- bzw. SmaI-Restriktionsschnittstellen des genannten Vektors pSUN2.

Die cDNA der aktiven SAT und der SAT-Mutante SATH309A wurde jeweils mit den Oligonukleotid-Primern SAT269 und SAT270, die über 5'-gelegene zusätzliche XhoI- und EcoRI-Restriktionsschnittstellen verfügten, durch Standard PCR amplifiziert. Nach Verdau mit EcoRI wurden die SAT-Fragmente durch Ligation mit dem ebenfalls mit EcoRI verdauten Transitpeptid rbcs fusioniert. Das Transitpeptid wurde mittels der Oligonukleotid-Primer Tra201 und Tra202, die über 5'-gelegene zusätzliche EcoRI- und SmaI-Restriktionsschnittstellen verfügten, ebenfalls durch Standard-PCR amplifiziert. Anschließend erfolgte die Ligation der fusionierten Fragmente in die XhoI- und SmaI- Restriktionsschnittstellen des Vektors.

Beispiel für Standard PCR: Reaktionsvolumen 50 μl mit 20 pmol jedes Primers, 1-10 ng Plasmid, Puffer des Herstellers, 1 U Taq-Polymerase (Promega). Abfolge: 5 Min. bei 94°C, dann 30 Zyklen zu 30 Sek. bei 94°C, 60 Sek. bei 55°C, 30 Sek. bei 72°, gefolgt von 10 Min. bei 72°C.

Extraktion und Aktivitätsbestimmung der SATs aus transgenen Rapspflanzen

Die SATs wurden aus dem transgenen Pflanzenmaterial extrahiert und ihre Aktivität bestimmt. Dazu wurde das Protokoll von Nakamura et al., ((1987) Plant Cell Physiol., 28, 885-891) verwendet. Es wurden jeweils die Blätter (Nitrilase-Promotor) oder die Samen (Vicilin-Promotor) von drei unabhängigen transgenen Linien untersucht. Es zeigte sich, dass transgene Pflanzen, die die SATH309A exprimieren, über eine unveränderte SAT-Aktivität im Vergleich zu nicht-transgenen Pflanzen verfügen, während transgene Pflanzen, die die aktive SAT überexprimieren, über eine deutlich erhöhte Gesamt-SAT Aktivität verfügen.

Bestimmung des Vitamin E-Gehalts der transgenen Pflanzen

Die Extraktion von Vitamin E und dessen Nachweis erfolgte wie oben beschrieben. Für die Analyse wurde gefrorenes Blattmaterial (Nitrilase-Promotor) oder trockene Samen (Vicilin-Promotor) eingesetzt. Das Blattmaterial der Pflanzen wurde entsprechend direkt nach der Probennahme in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Der sich daran anschließende Aufschluss der Zellen (Blätter oder Samen) erfolgte mittels einer Rührapparatur durch dreimalige Inkubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm (Umdrehungen pro Minute) in 100% Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere Inkubations- und Extraktionsschritte ergaben in der Regel keine weitere Freisetzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.

Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer HPLC-Anlage (Waters Allience 2690) analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine übliche „Reverse Phase"-Säule (ProntoSil200-3-C30 TM , Fa. Bischoff) mit einer mobilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Fa. Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluoreszenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emission 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszenzdetektors FP 920 nachgewiesen wurde.

Sowohl in transgenem Pflanzenmaterial mit aktiver SAT oder inaktiver SATH304A konnte unabhängig davon, ob eine konstitutive oder samenspezifische Expression durchgeführt wurde, eine Erhöhung des Vitamin E Gehalts im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden.

Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten eindeutig, dass die Arabidopsis thaliana SAT-Mutante mit einem Aminosäureaustausch in Position 309 keine enzymatische SAT-Aktivität mehr aufweist, dennoch aber zur Komplexbildung, also zur Interaktion mit OAS-TL in der Lage ist. Die Expression dieser Mutante führte ebenso wie die Expression einer aktiven SAT zu einer überraschenden Erhöhung des Gehalts an Vitamin E.

Abbildungen

1 zeigt typische Vitamin E Biosynthesewege.

2 zeigt ein Aminosäure-Alignment verschiedener Serinacetyltransferasen.

3 zeigt eine Vektorkarte des pSUN2 mit dem rbcs-SATH309A-Konstrukt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität von Serin-Acetyl-Transferase (SAT) in den Pflanzen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der SAT-Gehalt durch Übertragung einer Nukleinsäure, die für eine SAT oder einen funktionell äquivalenten Teil davon kodiert, auf die Pflanze bzw. Pflanzenzelle erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine feedback-regulierte und/oder feedbackunabhängige SAT handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine SAT aus Mikroorganismen, bevorzugt aus E. coli, Corynebacterium glutamicum, aus Pilzen, bevorzugt aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, oder aus Pflanzen, bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Allium tuberosum, Brassica oleracea oder Hybriden wie Glycine max, Zea mays, Triticum aestivum handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die SATs mit den Genbank Accession Numbers (in Klammern: Genannotationen der Arabidopsis Genomsequenzierung) L42212(At1g55920), AF112303(At2g17640), X82888(At3g13110), U30298(At5g56760), At4g35640, AJ414051, AJ414052, AJ414053 oder um SATs mit Sequenzen, die zu den Sequenzen der genannten Accession numbers im wesentlichen homolog sind, handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um nicht-funktionelle SATs handelt, die Punktmutation(en), Deletionen und/oder Insertionen aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine nicht-funktionelle SAT handelt, die Punktmutationen, Deletionen und/oder Insertionen aufweist, die die Bindung an physiologische Bindungspartner, bevorzugt an Acetyl-Coenzym A und/oder OAS-TL verhindern.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine nicht-funktionelle SAT handelt, die aufgrund einer Mutation innerhalb des Aminosäuresequenzmotivs G K X X G D R H P K I G D (X steht für eine beliebige Aminosäure) enzymatisch inaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation das Kernmotiv D R H betrifft.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation das Histidin innerhalb des Motivs betrifft.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellung eines Vektors umfassend die folgenden Nukleinsäuresequenzen in 5'-3'- Orientierung: – eine in Pflanzen funktionelle Promotersequenz – operativ damit verknüpft eine DNA-Sequenz, die für eine SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodiert – eine in Pflanzen funktionelle Terminationssequenz b) Übertragung des Vektors aus Schritt a) auf eine Pflanzenzelle und gegebenenfalls Integration in das pflanzliche Genom.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zusätzlich über Nukleinsäuresequenzen verfügt, die eine kompartimentspezifische Expression der SAT in der transgenen Pflanze und/oder Pflanzenzelle, bevorzugt in Mitochondrien, Plastiden, Chloroplasten und/oder im Cytosol bewirken.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs im Vergleich zum Wildtyp geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs durch Beeinflussung der Transkription und/oder Translation erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs durch Regulation der posttranslationalen Modifikationen erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt und/oder die Aktivität der endogenen SATs durch gene silencing erniedrigt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das gene silencing durch ein antisense-Verfahren, durch PTGS, durch VIGS, durch RNAi oder durch homologe Rekombination erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität der SAT durch Expression von Antikörpern, die für SAT spezifisch sind, in der Pflanzenzelle verringert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus nach dem Kultivieren geerntet wird und Vitamin E anschließend aus dem Organismus isoliert wird.
Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Thiol-Verbindungen in den Pflanzen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Glutathion, S-Adenosylmethionin, Methionin und Cystein in den Pflanzen gegenüber dem Wildtyp verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 durchgeführt wird.
Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Pflanzenzellen mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin E.
Verwendung von Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren für eine funktionelle oder nicht funktionelle, feedback-regulierte oder feedback-unabhängige SAT oder funktionell äquivalente Teile davon kodieren.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 23 oder 24 in einem der Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 19.
Transgene Pflanze und/oder Pflanzenzelle mit erhöhtem Vitamin E Gehalt, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 erhältlich ist.
Transgene Pflanze und/oder Pflanzenzelle nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine monokotyledone oder dikotyledone Pflanze handelt.
Transgene Pflanze und/oder Pflanzenzelle nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Pflanze um Baumwolle, Leguminosen, Soja, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Tabak, Sisal und Getreide, bevorzugt um Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse handelt.