DE10257771A1 - Inhibition of HIV replication by expression of late domain peptides in target cells - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Membran-verankerbare Konstrukte des "late Domain"-Bereichs von Retroviren, insbesondere HIV, kodieren. Die Konstrukte hemmen die Freisetzung von HIV aus infizierten Zellen und können somit für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden.The invention relates to nucleic acids which code for membrane-anchorable constructs of the "late domain" area of retroviruses, in particular HIV. The constructs inhibit the release of HIV from infected cells and can therefore be used for the treatment of HIV-infected patients.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinfragmente (Peptide) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) mit antiviraler Funktion. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die für membranständige virale ,late domain'-Proteine oder -Peptide kodieren, die durch diese Nukleinsäuren kodierten Peptide, sowie die Verwendung dieser Peptide und Nukleinsäuren zur gezielten Hemmung viraler Infektionen.The present invention relates to Protein fragments (peptides) of the human immunodeficiency virus (HIV) with antiviral function. In particular, the invention relates to nucleic acids which for membrane-bound virals late domain proteins or encode peptides, the peptides encoded by these nucleic acids, and the use of these peptides and nucleic acids for targeted inhibition viral infections.

Das menschliche Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) ist der Erreger der erworbenen Immunschwäche AIDS. Weltweit sind heute ca. 40 Millionen Menschen mit HIV infiziert und drei Millionen Menschen sind 2001 an AIDS verstorben. Obwohl bereits seit einiger Zeit mehrere antivirale Medikamente (Reverse Transkriptase-Inhibitoren und Protease-Inhibitoren) gegen HIV verfügbar sind, wirft die Behandlung von AIDS Patienten auch in entwickelten Ländern sehr große Probleme auf. Aufgrund der sehr raschen Anpassung des Virus durch Mutation treten bei einer Therapie mit einzelnen Wirkstoffen (Monotherapie) schon nach wenigen Wochen resistente Virusvarianten auf. Dieses Problem lässt sich nur sehr begrenzt durch die Kombination mehrerer Medikamente umgehen. Gegenwärtig wird die HIV-Infektion in entwickelten Ländern durch eine intensive medikamentöse Therapie behandelt (highly active antiretroviral therapy, HAART), welche die Einnahme von mindestens drei verschiedenen antiviralen Medikamenten erfordert. Um eine Resistenzentwicklung bei einer HAART zu minimieren, ist die genaue Einhaltung komplizierter Therapieverfahren und eine engmaschige und aufwändige Überwachung des Therapieerfolges erforderlich.The human immunodeficiency virus Type 1 (HIV-1) is the causative agent of acquired immune deficiency AIDS. Around 40 million people worldwide are infected with HIV today and three million people died of AIDS in 2001. Even though several antiviral drugs (reverse Transcriptase inhibitors and protease inhibitors) against HIV are available, raises the treatment of AIDS patients very much even in developed countries size Problems on. Due to the very rapid adaptation of the virus by mutation occur with therapy with individual active ingredients (monotherapy) resistant virus variants appear after just a few weeks. This Problem leaves is very limited by the combination of several drugs bypass. Currently HIV infection in developed countries is intense drug Therapy treated (highly active antiretroviral therapy, HAART), which means taking at least three different antivirals Medication required. To develop resistance in a HAART minimizing is the exact adherence to complicated therapy procedures and close and complex monitoring therapy success is required.

Um die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden, wurde im Zuge der Entwicklung einer effektiven HIV-Vakzine nach HIV-Proteinfragmenten oder -Peptiden gesucht, die in bestimmte Mechanismen der Virusreplikation eingreifen, um gezielt verschiedene Stufen einer HIV-Infektion auszuschalten. Darüber hinaus bietet die Expression antiviral wirksamer Proteine bzw. Peptide in HIV-permissiven Zellen durch gentherapeutische Strategien die Möglichkeit, die Virusreplikation längerfristig zu hemmen und ist damit der Behandlung durch tägliche Einnahme mehrerer Medikamente überlegen. Ein Schritt in der HIV-Replikation, der bisher einer gezielten Hemmung nicht zugänglich war, ist die Freisetzung des Virus von der Plasmamembran.To the disadvantages mentioned above To avoid has been in the course of developing an effective HIV vaccine searched for HIV protein fragments or peptides that are in certain Mechanisms of virus replication intervene to target different ones Eliminate levels of HIV infection. Expression also offers antiviral proteins or peptides in HIV-permissive cells through gene therapy strategies the possibility of virus replication long-term inhibit and is therefore superior to treatment by taking several medications daily. A step in HIV replication that has been targeted inhibition inaccessible was the release of the virus from the plasma membrane.

Das Gag-Protein (Gruppenspezifisches Antigen), das Hauptstrukturprotein von HIV, trägt alle funktionellen Domänen, die zur Partikelbildung und -freisetzung benötigt werden. Das Gag-Pol-Polyprotein birgt zusätzlich funktionelle Domänen für die viralen Enzyme Protease, Reverse Transkriptase und Integrase. Gag und Gag-Pol bilden nach Transport zur Innenseite der Plasmamembran sphärische Partikel. Diese Partikel stülpen sich in einem als ,Knospung' bezeichneten Prozess aus der Membran heraus, bis nur noch ein schmaler Membranschlauch Partikel und Zelle verbindet. Als letzter Schritt der Knospung findet an dieser Stelle eine Membranfusion statt, die das Partikel von der Zelle trennt. Gleichzeitig damit oder kurz darauf werden Gag und Gag-Pol durch die virale Protease in ihre funktionellen Untereinheiten gespalten. Dadurch wird eine morphologische Umlagerung (,Reifung') ausgelöst, die essentiell für die Infektiösität des Virions ist, und die mit den derzeit in der HIV-Therapie verwendeten Protease-Hemmern blockiert werden kann.The gag protein (group specific Antigen), the main structural protein of HIV, carries all the functional domains that for particle formation and release are required. The Gag-Pol polyprotein also harbors functional domains for the viral enzymes protease, reverse transcriptase and integrase. gag and Gag-Pol form after transport to the inside of the plasma membrane spherical Particle. These particles turn upside down in one called 'budding' Process out of the membrane until only a narrow membrane tube is left Connects particles and cells. As the last step the budding takes place at this point a membrane fusion takes place, which separates the particle from separates the cell. At the same time or shortly thereafter, gag and Gag-Pol through the viral protease into its functional subunits split. This triggers a morphological rearrangement ("maturation") that essential for the infectivity of the virion and with the protease inhibitors currently used in HIV therapy can be blocked.

Die HIV-Knospung ist ein aktiver Prozess, der eine bisher wenig bekannte zelluläre Maschinerie involviert. Bei Retroviren (einschließlich HIV), sowie einigen anderen Virusgruppen, z.B. Filoviren (Ebola) und Rhabdoviren (Tollwut, Vesicular stomatitis Virus) wurden sogenannte ,late domain'-Proteine identifiziert. Diese enthalten kleine, hochkonservierte Peptidmotive, die für die Virusfreisetzung notwendig sind. Alle bekannten ,late domains' bei Retroviren liegen innerhalb des Gag-Strukturproteins, im Fall von HIV in der C-terminalen Domäne p6. Das zentrale funktionelle Element der ,late domain' bildet bei HIV die Peptidsequenz P(T/S)AP. ,late domain'-Elemente anderer Retroviren, sowie die anderer Virusfamilien, enthalten die Peptidsequenz PPXY als wichtigstes Element, häufig in Kombination mit einer P(T/S)AP-Sequenz. Das PPXY Motiv fehlt bei HIV. Die P(T/S)AP- bzw. PPXY-Elemente können sich zum Teil gegenseitig ersetzen und unabhängig von ihrer Lokalisation innerhalb des Gesamtmoleküls wirken.HIV budding is an active one Process involving a little-known cellular machinery. For retroviruses (including HIV), as well as some other virus groups, e.g. Filoviruses (Ebola) and rhabdoviruses (rabies, vesicular stomatitis virus) were so-called late domain proteins identified. These contain small, highly preserved peptide motifs, the for the virus release is necessary. All known, late domains are with retroviruses within the Gag structural protein, in the case of HIV in the C-terminal domain p6. The The central functional element of the 'late domain' in HIV is the peptide sequence P (T / S) AP. , late domain 'elements other retroviruses, as well as those of other virus families, contain the Peptide sequence PPXY as the most important element, often in combination with one P (T / S) AP sequence. The PPXY motif is missing in HIV. The P (T / S) AP or PPXY elements can partly replacing each other and regardless of their location within the whole molecule Act.

Es gibt Hinweise darauf, dass ,late domain'-Peptide intrazelluläre Faktoren binden und zum Ort der Virusfreisetzung rekrutieren (Freed 2002, Perez und Nolan 2002). Mögliche direkte Interaktionspartner von ,late domain' Motiven sind die zellulären Proteine Tsg101 (für PTAP) und die Ubiquitin-Ligase Nedd4 (für PPXY) (VerPlank 2001, Garrus 2001, Kokonyogo 2001). Die Interaktion dieser Faktoren mit dem Virusprotein könnte für die Partikelfreisetzung wichtig sein (Garrus 2001, Kokonyogo 2001), so dass eine gezielte Hemmung dieser Interaktion die Virusproduktion in einem späten Schritt im Replikationszyklus unterbrechen und eventuell in Kombination mit Proteaseinhibitoren die Virusreplikation verhindern würde.There is evidence that, late domain 'peptides intracellular Binding factors and recruiting to the location of the virus release (Freed 2002, Perez and Nolan 2002). Possible The direct interaction partners of 'late domain' motifs are the cellular proteins Tsg101 (for PTAP) and the ubiquitin ligase Nedd4 (for PPXY) (VerPlank 2001, Garrus 2001, Kokonyogo 2001). The interaction of these factors with the viral protein could be for particle release be important (Garrus 2001, Kokonyogo 2001), so that a targeted Inhibiting this interaction in a late step virus production interrupt in the replication cycle and possibly in combination would prevent virus replication with protease inhibitors.

Es wurde nun gefunden, dass die Expression eines Fusionsproteins, welches eine membranständige Version der ,late domain'-Region von HIV-1, p6, enthält, die HIV-Partikelfreisetzung aus der transfizierten Zelle hemmt und nach Transduktion die HIV-Virusreplikation um etwa 90% reduziert. Wahrscheinlich liegt dies daran, dass das erfindungsgemäße Fusionsprotein zur Bindung und Rekrutierung der wirtseigenen Faktoren befähigt sein könnte. Die wirtseigenen Faktoren sollten somit für eine Bindung an ,echte' virale ,late domain'-Peptide nicht mehr zur Verfügung stehen, so dass es nicht zur Partikelbildung bzw. -freisetzung kommt. Die gentherapeutische Blockierung der Virusreplikation zu einem späten Zeitpunkt im Replikationszyklus kann in direkter Verbindung mit bereits zugelassenen antiviralen Medikamenten wirken. Vorteilhaft ist außerdem, dass funktionelle ,late domains' kompakte Peptidmotive sind und sich damit zum Einsatz in gentherapeutischen Vektoren hervorragend eignen. Bei intrazellulärer Expression dieser Peptide ist nur eine geringe Immunogenität zu erwarten. Der unerwartete Effekt wurde unter anderem dadurch erzielt, dass der ,late domain' Anteil des Fusionspeptids mit einem membranverankernden Anteil verknüpft wurde, so dass das Fusionspeptid direkt am Ort der Freisetzung, namentlich an der Plasmamembran, exprimiert wird.It has now been found that expression of a fusion protein containing a membrane-bound version of the late domain region of HIV-1, p6, inhibits HIV particle release from the transfected cell and, after transduction, inhibits HIV virus replication by approximately 90 % reduced. This is probably due to the fact that the fusion protein according to the invention could be capable of binding and recruiting the host's own factors. The host's own factors should therefore no longer be available for binding to true 'viral, late domain' peptides, so that there is no particle formation or release. The gene therapy blocking of the virus replication at a late point in the replication cycle can work in direct connection with already approved antiviral drugs. It is also advantageous that are functional, late domains' compact peptide motifs and are therefore ideally suited for use in gene therapy vectors. When these peptides are expressed intracellularly, only a low immunogenicity is to be expected. The unexpected effect was achieved, inter alia, by linking the 'late domain' portion of the fusion peptide to a portion anchoring to the membrane, so that the fusion peptide is expressed directly at the site of release, specifically at the plasma membrane.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Fusionsprotein der allgemeinen Formel
5'-MTS-(Marker)-,late domain'-3'
wobei
„5' " das 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet,
„ 3' " das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet,
„(Marker)" eine optional vorhandene DNA-Region, die für ein Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet
„MTS" die für ein „membrane targeting signal" kodierende DNA-Region, Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet,
und
„late domain" eine DNA-Region, die für den exprimierten Bereich der „late domain", eines Fragments oder Derivates davon, eines Virus kodiert, bezeichnetThe present invention therefore relates to a nucleic acid sequence coding for a fusion protein of the general formula
5'-MTS- (marker) -, late domain'-3 '
in which
"5 '" denotes the 5' end of the nucleic acid sequence,
"3 '" denotes the 3' end of the nucleic acid sequence,
"(Marker)" denotes an optionally available DNA region which codes for a peptide for the detection of the construct
"MTS" denotes the DNA region coding for a "membrane targeting signal", fragments or derivatives thereof,
and
"Late domain" denotes a DNA region which codes for the expressed region of the "late domain", a fragment or derivative thereof, of a virus

Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuren der allgemeinen Formel:
5'-MTS-,late domain'-(Marker)-3'
und
5'-(Marker)-MTS-,late domain'-3'
sowie Fragmente und Derivate davon.The invention also relates to nucleic acids of the general formula:
5'-MTS, late domain '- (marker) -3'
and
5 '- (marker) -MTS-, late domain'-3'
as well as fragments and derivatives thereof.

Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet "Virus" sämtliche Viren, deren Genom mit einem "late domain"-Bereich ausgestattet ist. Beispiele für Viren, die in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, umfassen Retroviren, darunter Leukoseviren, Sarkomviren, z.B. HTLV-I, und insbesondere Lentiviren wie HIV-1 und HIV-2. Die Erfindung umfasst außerdem Filoviren (z.B. Ebola-Virus), Rhabdoviren (z.B. Tollwut-Virus), sowie andere umhüllte Viren wie Herpesviren, Bunyaviren, Arenaviren, Flaviviren und Togaviren.According to the present invention "Virus" means all Viruses whose genome is equipped with a "late domain" area is. examples for Viruses included in the present invention include Retroviruses, including leukemia viruses, sarcoma viruses, e.g. HTLV-I, and especially lentiviruses such as HIV-1 and HIV-2. The invention includes Moreover Filoviruses (e.g. Ebola virus), rhabdoviruses (e.g. rabies virus), as well as others enveloped Viruses such as herpes viruses, bunya viruses, arena viruses, flaviviruses and togaviruses.

In einer bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus dem Genom von Retroviren, Filoviren und Rhabdoviren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus dem Genom von Retroviren, insbesondere Lentiviren. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der für „late domain" kodierende Bereich aus einem Genomabschnitt von HIV-1, der als p6 bezeichnet wird..In a preferred embodiment originates from the area coding for "late domain" from the genome of retroviruses, filoviruses and rhabdoviruses. In a particularly preferred embodiment originates from the area coding for "late domain" from the genome of retroviruses, especially lentiviruses. In a very particularly preferred embodiment originates from the area coding for "late domain" from a genome section of HIV-1 called p6.

In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf DNA-Sequenzen, die für eine „late domain" kodieren, bei denen mindestens ein Nukleotid der offenbarten Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf „late domain"-DNA-Sequenzen, bei denen die ursprüngliche Nukleotidsequenz entweder am 5'-, am 3'- oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des kodierten „late domain"-Bereichs erhalten bleibt.In connection with the present Invention relates to the above term “fragment and derivative " DNA sequences for a “late encode domain, in which at least one nucleotide of the sequence disclosed at least one nucleotide other than the original one is replaced can be, or on "late domain "DNA sequences where the original Nucleotide sequence either at the 5 ', on the 3 'or on both End and / or within the sequence either extended, shortened or shortened at one end and extended at the other end is provided that the function and biological effects of the encoded “late domain "region preserved.

Darüber hinaus schließt die erfindungsgemäße Definition von „late domain" das Nacheinanderschalten mehrerer „late domains" ein, wobei es unerheblich ist, ob die „late domains" gleich oder verschieden sind, oder ob sie aus dem gleichen oder zwei verschiedenen Viren stammen.In addition, the definition according to the invention closes from “late domain "sequencing several “late domains ", where it is irrelevant whether the “late domains "equal or are different, or whether they are the same or two different Viruses come from.

Analog zu dem vorgenannten bezieht sich „Fragmente und Derivate" auf DNA-Sequenzen kodierend für eine MTS, bei denen mindestens ein Nukleotid der ursprünglichen Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf MTS-DNA-Sequenzen, bei denen die ursprüngliche Nukleotidsequenz entweder am 5'-, am 3'- oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des kodierten MTS-Bereichs erhalten bleibt.Analogous to the aforementioned "Fragments and derivatives " DNA sequences coding for an MTS in which at least one nucleotide of the original Sequence through at least one nucleotide that is different from the original is different, can be replaced, or on MTS DNA sequences, where the original Nucleotide sequence either at the 5 ', on the 3 'or on both End and / or within the sequence either extended, shortened or shortened at one end and extended at the other end is provided that the function and biological effects of the encoded MTS area is retained.

Die Erfindung schließt verschiedene Möglichkeiten zum Transport und zur Verankerung des von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten Peptids an der Membran ein. Geeignet sind hierfür alle Peptide, die als intrazelluläres Membran-Targetingsignal fungieren können. „MTS" kann daher für ein Peptid kodieren, das ein Motiv zur intrazellulären Anhängung eines Membranankers birgt, z.B. Palmitoyl, Myristoyl-, bzw. Prenyl oder CaaX-Motiv. Für die vorliegende Erfindung kann es auch zweckmäßig sein, wenn „MTS" für einen Transmembrananker eines Typ I – Transmembranproteins kodiert. Unter einem Typ I – Transmembranprotein versteht der Fachmann ein Transmembranprotein mit extrazellulärem Amino- und intrazellulärem Carboxyterminus.The invention includes several possibilities for transporting and anchoring the encoded by the nucleic acid of the invention Peptide on the membrane. Suitable for this are all peptides that act as intracellular membrane targeting signals can act. "MTS" can therefore refer to a peptide encode a motif for intracellular attachment of a membrane anchor, e.g. Palmitoyl, myristoyl, or prenyl or CaaX motif. For the present Invention it may also be appropriate if "MTS" for one Transmembrane anchor of a type I transmembrane protein coded. Under a type I transmembrane protein the person skilled in the art understands a transmembrane protein with extracellular amino and intracellular Carboxy terminus.

Geeignet für die Erfindung sind demnach MTS aller dem Fachmann zugänglichen Typ I-Transmembranproteine. Bevorzugt sind MTS von Typ I-Transmembranproteinen, die ausgewählt sind aus der nicht abschließenden Liste von Beispielen wie Ribophorin I und Π, MHC-Klasse I, HIV-1-Vpu, Synaptotagmin II, Maus-CMV-gp48, Mensch-CMV-US11, Calnexin, PERK, UDP-Glucuronosyltransferase, low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR) oder CD34.Accordingly, MTS of all type I transmembrane proteins accessible to the person skilled in the art are suitable for the invention. Preferred are MTS of type I transmembrane proteins which are selected from the non-exhaustive list of examples such as ribophorin I and Π, MHC class I, HIV-1-Vpu, Synaptotagmin II, Mouse-CMV-gp48, human-CMV-US11, calnexin, PERK, UDP-glucuronosyltransferase, low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR) or CD34.

Als „Marker" zum Nachweis der durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierten Peptide kommen verschiedene Peptide bzw. dafür kodierende DNA-Sequenzen in Betracht. Generell schließt die Erfindung alle Peptide bzw. Proteine ein, die sich für einen Nachweis, beispielsweise für einen immunologischen Nachweis, eignen. Für die vorliegende Erfindung eignen sich besonders sogenannte Reportergene oder andere Gene, die für Proteine bzw. Peptide kodieren, deren Anwesenheit leicht zu bestimmen ist. Marker, die sich zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eignen, können ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend sogenannte „epitope-tags" (c-Myc, Hämagglutinin, FLAG), Biotin, Digoxygenin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Green Fluorescent Protein (GFP) und Derivate davon mit veränderter Fluoreszenz (EGFP, EYFP, EFCP), β-Galactosidase, Luciferasen, β-Glucuronidase und β-Lactamase. Verfahren zum Nachweis der vorstehenden Marker sind dem Fachmann bekannt.As a "marker" for detecting the encoded by the nucleic acid of the invention Peptides come with different peptides or DNA sequences coding for them into consideration. Generally closes the invention includes all peptides or proteins that are suitable for a Proof, for example for an immunological proof. For the present invention so-called reporter genes or other genes are particularly suitable for proteins or encode peptides whose presence is easy to determine. Markers that are going to run suitable for the present invention can be selected from the group comprising so-called "epitope tags" (c-Myc, hemagglutinin, FLAG), biotin, digoxygenin, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, Green fluorescent protein (GFP) and derivatives thereof with modified Fluorescence (EGFP, EYFP, EFCP), β-galactosidase, Luciferases, β-glucuronidase and β-lactamase. Methods for detecting the above markers are known to the person skilled in the art known.

Der Marker kann auch für ein beliebiges Peptid kodieren, dessen Nachweis mittels dem Fachmann bekannter Methoden unter Verwendung von spezifischen Antikörpern erfolgt, z.B. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), Western Blot, Immunpräzipitation, Enzyme-linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) oder Radioactive Immunoadsorbent Assay (RIA). Vorteilhaft ist es, wenn der zum Nachweis verwendete Antikörper mit einem Molekül gekoppelt ist, das den Nachweis ermöglicht oder dazu beiträgt. Geeignet hierfür sind beispielsweise Biotin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase, Fluoreszein-Isothiocynat (FITC), Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC), Diamidinophenylindol (DAPI) und Phycoerythrin.The marker can also be used for any Encode peptide, the detection of which is known by the person skilled in the art Methods using specific antibodies, e.g. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), Western Blot, Immunoprecipitation, Enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) or radioactive immunoadsorbent Assay (RIA). It is advantageous if the one used for the detection antibody with one molecule coupled that enables or contributes to the proof. Suitable therefor Examples are biotin, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, Fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), diamidinophenylindole (DAPI) and phycoerythrin.

Für die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure keinen für einen Marker kodierenden Bereich enthält. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Nukleinsäure für (gen-)therapeutische Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn die Nukleinsäure für ein möglichst kleines Peptid kodiert und das besagte Peptid möglichst frei von zusätzlichen, für die Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise ungünstig auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.For the present invention may also be desirable if the Nucleic acid according to the invention none for one Contains marker coding area. This is particularly advantageous if the nucleic acid is for (gene) therapeutic Purposes. Then it is important if the nucleic acid is for one if possible encodes the small peptide and said peptide is as free as possible of additional, for the Impact of contingent minority interests is possible unfavorable affect the physiological state of the target cell.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz, sowie Fragmente und Derivate gemäß obiger Definition davon, auf.In a preferred embodiment the nucleic acid according to the invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 1, as well as fragments and derivatives according to the above Definition of that on.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz, sowie Fragmente und Derivate gemäß obiger Definition davon, auf.In a further preferred embodiment the nucleic acid according to the invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, as well as fragments and derivatives according to the above Definition of that on.

Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Expression des von ihr kodierten Peptids in Zellen, insbesondere HIV-infizierten Zellen, eingesetzt.The nucleic acid according to the invention is preferably used Expression of the peptide encoded by it in cells, in particular HIV-infected cells.

Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Wirts- bzw. Zielzelle (Transfektion bzw. Transformation) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide, Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen.To introduce the nucleic acid of the invention in the Host or target cell (transfection or transformation) numerous methods are available to the person skilled in the art, depending on the host cell selected. The easiest method for gene transfer is the injection of "naked" nucleic acids into a target tissue / target cells. A more efficient method is to manipulate a single one Cell by the so-called microinjection of the nucleic acid in the Nucleus. Very cheap is the use of reagents and methods that calcium chloride, Rubidium chloride, lithium chloride, calcium phosphate, DEAE dextran, cationic lipids, Liposomes, biolistic particle bombardment ("gene gun" method), heat shock transformation and electroporation, as well as any combination thereof.

Für die Expression und für das Einbringen der Nukleinsäure in die Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem sogenannten Expressionsvektor inseriert ist.For the expression and for the introduction of the nucleic acid In the target cell, it is advantageous if the nucleic acid of the invention in a so-called expression vector is inserted.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante DNA und einen Expressionsvektor, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.The present invention relates to hence a recombinant DNA and an expression vector, which contain the nucleic acid of the invention.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen, insbesondere menschlichen, bakteriellen oder einen retroviralen Vektor, Plasmid, Bakteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren, die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet sind. Falls gewünscht oder erforderlich, kann die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten, operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber auch Introns oder ähnliche Elemente sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors, die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen oder dazu beitragen.In a preferred embodiment is the expression vector a eukaryotic, especially human, bacterial or a retroviral Vector, plasmid, bacteriophage or other vectors common in genetic engineering, which are suitable for the expression of proteins or peptides. If required or required, the nucleic acid sequence in the vector according to the invention with regulatory elements, the transcription and synthesis of a ensure translatable mRNA in pro- and / or eukaryotic cells, be operationally connected. Such regulatory elements are Promoters, enhancers or transcription termination signals, however, can also introns or similar Be elements, like elements that represent the stability and multiplication of the vector, enable selection and / or integration into the host genome or contribute to it.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen retroviralen Vektor inseriert. Retroviren sind sogenannte RNA-Viren, deren Genom nach Infektion einer Zelle revers in DNA transkribiert und in das Wirtszell-Genom integriert wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt hierbei über rezeptorgesteuerte Endozytose. Bei manchen retroviralen Vektoren wird die Expression des Vektors nach Aufnahme des Virus ausgeschaltet, so dass die Zelle nur einmal infiziert wird. Die Integration der viralen DNA in das Genom wird durch ein viralkodiertes Protein, Integrase, bewirkt, wobei der Integrationsort unspezifisch ist. Vektoren auf retroviraler Basis sind aufgrund der vorstehend genannten Eigenschaften insbesondere für die Gentherapie geeignet, denn sie werden durch die rezeptorgesteuerte Endozytose effizienter aufgenommen, und effizienter integriert, da der Prozess enzymatisch erfolgt. Der Fachmann kennt diesen Vorgang auch unter der Bezeichnung „retrovirale Transduktion".In a particularly preferred embodiment, the nucleic acid according to the invention is inserted into a retroviral vector. Retroviruses are so-called RNA viruses, the genome of which is reverse-transcribed into DNA after infection of a cell and integrated into the host cell genome. The uptake into the cell takes place via receptor-controlled endocytosis. With some retroviral vectors, the expression of the vector is switched off after the virus has been taken up, so that the cell is infected only once. The integration of the viral DNA into the genome is effected by a virally encoded protein, integrase, the location of integration being non-specific. Because of the properties mentioned above, retroviral-based vectors are particularly suitable for gene therapy, because they are absorbed more efficiently by receptor-controlled endocytosis men, and integrated more efficiently because the process is enzymatic. The person skilled in the art knows this process also under the name “retroviral transduction”.

Dem Fachmann ist bekannt, wie solche Vektoren mittels sogenannter „Packaging Cells", die sogenannte Helferviren im Genom tragen, in die Zielzelle eingeschleust werden. Die Erfindung umfasst alle retroviralen Vektoren, die sich beispielsweise von Onko-, Lenti- oder Spumaviren ableiten. Beispielhaft handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen retroviralen Vektor um M159.The person skilled in the art knows how such Vectors using so-called “packaging Cells ", the so-called Helper viruses carry in the genome, are introduced into the target cell. The invention includes all retroviral vectors, for example from Onko, Lenti or Derive spumaviruses. The retroviral according to the invention is an example Vector around M159.

Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, eines Fragments oder Derivats davon, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in eine geeignete Wirtszelle mittels geeigneter Methoden, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle und (c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.The invention also includes a Process for the production of a recombinant protein, a fragment or derivative thereof which encodes the nucleic acid of the invention becomes. The process includes the following steps: (a) Insertion a vector according to the invention, which contains the nucleic acid according to the invention in a suitable host cell using suitable methods, the host cell can be pro- or eukaryotic, (b) cultivation of the transfected Host cell and (c) isolation of the recombinant protein from the Host cell or from the culture medium.

Falls gewünscht oder erforderlich können die gemäß Schritt (c) isolierten Proteine für andere Zwecke weiter aufgereinigt werden. Der Fachmann kennt hierfür zahlreiche Methoden, z.B. Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie, Ionenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affinitätschromatografie und ähnliches.If desired or necessary, the according to step (c) isolated proteins for other purposes are further purified. The expert knows numerous for this Methods, e.g. Salt fractionation, size exclusion chromatography, Ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography and similar.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiertes Fusionspeptid der allgemeinen Formel
NH2-MTS-(Marker)-,late domain'-COOH
wobei
„NH2" das aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„COOH" das carboxyterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„(Marker)" ein optional vorhandenes Peptid zum Nachweis des Konstrukts bezeichnet,
„MTS" ein „membrane targeting signal", Fragment oder Derivat davon, bezeichnet,
und
„late domain" die „late domain"-Region, ein Fragment oder Derivat davon, eines Virus bezeichnet.The present invention furthermore relates to a fusion peptide of the general formula encoded by the nucleic acid according to the invention
NH 2 -MTS- (marker) - late domain'-COOH
in which
"NH 2 " denotes the amino terminal end of the fusion peptide,
"COOH" denotes the carboxy terminal end of the fusion peptide,
“(Marker)” denotes an optionally present peptide for the detection of the construct,
“MTS” denotes a “membrane targeting signal”, fragment or derivative thereof,
and
"Late domain" denotes the "late domain" region, a fragment or derivative thereof, of a virus.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Fusionspeptid der allgemeinen Formeln
NH2-MTS-,late domain'-(Marker)-COOH
und
NH2-(Marker)-MTS-,late domain'-COOH
sowie Fragmente und Derivate davon.The invention also relates to a fusion peptide of the general formulas
NH 2 -MTS-, late domain '- (marker) -COOH
and
NH 2 - (marker) -MTS-, late domain'-COOH
as well as fragments and derivatives thereof.

Für die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn das erfindungsgemäße Fusionspeptid keinen Marker enthält. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Fusionspeptid für therapeutische Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn das Fusionspeptid möglichst klein und möglichst frei von zusätzlichen, für die Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise ungünstig auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.For the present invention may also be desirable if that fusion peptide according to the invention does not contain a marker. This is particularly advantageous when the fusion peptide is therapeutic Purposes. Then it is important if the fusion peptide preferably small and possible free of additional, for the Impact of contingent minority interests is possible unfavorable affect the physiological state of the target cell.

In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf Aminosäuresequenzen von „late domain", bei denen mindestens eine Aminosäure durch mindestens eine Aminosäure, die von der ursprünglichen verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf „late domain"-Aminosäuresequenzen, bei denen die ursprüngliche Aminosäuresequenz entweder am amino-, am carboxyterminalen oder an beiden Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder an einem Ende verkürzt und am anderen Ende verlängert ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des „late domain"-Bereiches erhalten bleibt.In connection with the present Invention relates to the above term “fragment and derivative " amino acid sequences from “late domain "where at least one amino acid by at least one amino acid, that of the original is different, can be replaced, or on "late domain" amino acid sequences in which the original amino acid sequence either at the amino or carboxy terminal or at both ends and / or either lengthened, shortened or shortened at one end within the sequence and extended at the other end is provided that the function and biological effect of the "late domain" area are preserved remains.

Erfindungsgemäß können auch mehrere „late domains" nacheinander geschaltet sein, wobei es unerheblich ist ob die „late domains" gleich oder verschieden sind, oder ob sie aus gleichen oder verschiedenen Viren stammen.According to the invention, several “late domains” can also be switched in succession be, it is irrelevant whether the "late domains" the same or different or whether they come from the same or different viruses.

Hinsichtlich der Definitionen von „Marker", „Virus" und „MTS" gelten die vorstehend für die erfindungsgemäße Nukleinsäure gemachten Angaben, die hier auf Proteinebene bezogen sind.With regard to the definitions of "marker", "virus" and "MTS", the above apply for the made nucleic acid according to the invention Information related to the protein level here.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Fusionspeptid die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz auf. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Fusionspeptid die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz auf.In a preferred embodiment shows the fusion peptide according to the invention the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In another preferred embodiment shows the fusion peptide according to the invention the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

In einem weiteren Aspekt führt die Insertion der Nukleinsäuresequenz in erfindungsgemäße, gentherapeutisch anzuwendende Vektoren und das Einbringen der erfindungsgemäßen Vektoren in HIV-infizierte Zellen zur Expression eines Fusionspeptides, wodurch eine starke Hemmung der HIV-Replikation verursacht wird. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten.In another aspect, the Insertion of the nucleic acid sequence in gene therapy according to the invention Vectors to be used and the introduction of the vectors according to the invention in HIV-infected cells for expression of a fusion peptide, whereby a strong inhibition of HIV replication is caused. The invention therefore also relates to the use of the vector according to the invention for the Treatment of HIV-infected patients.

In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Freisetzung von infizierten Zellen, wobei dieses das Inkontaktbringen und die Transfektion der HIV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Günstig zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anwesenheit der vorgenannten Reagenzien bzw. der Einsatz der vorstehend genannten Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und die eine Aufnahme der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Zelle ermöglichen bzw. dazu beitragen.In this context, the invention relates to a method for inhibiting the release of HIV from infected cells, this comprising contacting and transfecting the HIV-infectable cell with the vector according to the invention. The presence of the aforementioned reagents or the use of the aforementioned methods, which the Are known to those skilled in the art and which enable or contribute to the absorption of the nucleic acid according to the invention into the cell.

Als mögliche Zielzellen für eine Transfektion/retrovirale Transduktion mit einem erfindungsgemäßen Vektor sind alle Zellarten denkbar. Besonders bevorzugt für das vorstehend genannte Verfahren sind T-Lymphozyten und/oder hämatopoetische Stammzellen. Ganz besonders bevorzugt sind T-Lymphozyten.As possible target cells for transfection / retroviral Transduction with a vector according to the invention are all cell types conceivable. Particularly preferred for the above method are T lymphocytes and / or hematopoietic Stem cells. T lymphocytes are very particularly preferred.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Freisetzung, wobei dieses das Inkontaktbringen der HIV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Fusionspeptid oder eines Fragments oder Derivats davon umfasst. Das Verfahren kann in vitro in einer wässrigen Lösung, in vivo in einem geeigneten Zellkultur-Assay, oder in einem Lebewesen mittels geeigneter Verabreichungsformen durchgeführt werden.The invention further relates to a method of inhibiting HIV release, this the Bringing the HIV-infectable cell into contact with the fusion peptide according to the invention or a fragment or derivative thereof. The procedure can be in vitro in an aqueous Solution, in vivo in a suitable cell culture assay, or in a living being be carried out by means of suitable administration forms.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid können im Sinne der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel, optional in Kombination mit einem geeigneten Trägerstoff, verwendet werden.The nucleic acid according to the invention and / or the vector according to the invention and / or the fusion peptide according to the invention can in the sense of the present invention as a pharmaceutical, optionally in Combination with a suitable carrier can be used.

Dabei ist es unerheblich, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen verabreicht werden. Die Verabreichung der aktiven Substanzen kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Dosis und/oder die Einwirkzeit des Arzneimittels ist variabel und hängt vom physiologischen Zustand der zu behandelnden Person ab. Dabei können Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten eine Rolle spielen. Außerdem kann es von Bedeutung sein, ob die Krankheit akut, chronisch oder prophylaktisch behandelt werden muss.It is irrelevant whether the nucleic acid according to the invention and / or the vector according to the invention and / or the fusion peptide according to the invention administered alone or in combination with other active substances become. The active substances can be administered simultaneously or one after the other. The dose and / or the exposure time of the The drug is variable and depends depends on the physiological condition of the person to be treated. there can Age, weight and gender of the patient play a role. Moreover it may be important whether the disease is acute, chronic or must be treated prophylactically.

In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid zur Herstellung eines Arzneimittels, optional in Verbindung mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff, für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten verwendet.In another embodiment the nucleic acid according to the invention and / or the vector according to the invention and / or the fusion peptide according to the invention for the manufacture of a drug, optionally in conjunction with a pharmaceutically acceptable carrier for the treatment of HIV-infected patients used.

Die Herstellung solcher Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Für die Stabilität und Wirksamkeit des Arzneimittels ist gegebenenfalls die Anwesenheit von Stabilisatoren und Trägersubstanzen wie Stärke, Laktose, Stearinsäure, Fette, Wachse, Alkohole oder physiologische Kochsalzlösungen oder anderer Additiva wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe erforderlich. Arzneimittel in flüssiger Form lassen sich, falls erforderlich, lyophilisieren.The manufacture of such drugs are known to the person skilled in the art. For the stability and effectiveness of the drug may be the presence of stabilizers and carriers like starch, lactose, stearic acid, Fats, waxes, alcohols or physiological saline solutions or other additives such as preservatives, colors, flavors required. Medicines in liquid If necessary, the mold can be lyophilized.

Die vorliegende Erfindung betrifft demnach auch ein Arzneimittel, das, optional in Kombination mit weiteren, pharmazeutisch verträglichen Substanzen und Trägerstoffen, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid enthält, und das für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten geeignet ist.The present invention relates to therefore also a drug that, optionally in combination with further, pharmaceutically acceptable Substances and carriers, a nucleic acid according to the invention and / or a vector according to the invention and / or a fusion peptide according to the invention contains and that for the treatment of HIV-infected people Is suitable for patients.

Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral erfolgen, z.B. in Form von beschichteten oder unbeschichteten Tabletten, Granulaten, harten und weichen Gelatinekapseln, oder sie kann rektal in Form von Zäpfchen erfolgen. Das Arzneimittel kann auch parenteral – unter Umgehung des Verdauungsapparates – z.B. subkutan, intramuskulär oder intravenös in Form von Lösungen für Infusionen oder Injektionen verabreicht werden. Andere geeignete Darreichungsformen betreffen direkte Applizierungen (z.B. auf die Haut) in Form von Salben, Tinkturen, Sprays oder transdermalen therapeutischen Mitteln, oder zu inhalierende Mittel in Form von Nasensprays, Aerosolen, oder in Form von Mikrokapseln, Implantaten oder Stäbchen. Die geeignete Darreichungsform hängt von der Art und der Schwere der Krankheit ab.The administration of the drug can be oral, e.g. in the form of coated or uncoated Tablets, granules, hard and soft gelatin capsules, or it can be rectal in the form of suppositories respectively. The drug can also be administered parenterally - bypassing the digestive system - e.g. subcutaneous, intramuscularly or intravenously in the form of solutions for infusions or injections. Other suitable dosage forms concern direct applications (e.g. on the skin) in the form of ointments, Tinctures, sprays or transdermal therapeutic agents, or agents to be inhaled in the form of nasal sprays, aerosols, or in the form of microcapsules, implants or rods. The appropriate dosage form depends on the type and severity of the disease.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, das zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden kann, wobei das Kit mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid umfasst.Finally, the present concerns Invention a kit that can be used to treat HIV-infected patients can, wherein the kit at least one nucleic acid according to the invention and / or a vector according to the invention and / or a fusion peptide according to the invention includes.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:The invention will be more apparent from the following Examples closer explains:

Beispiel 1: Klonierung der prototypischen Expressionsplasmide bhd-1a und bhd-1:Example 1: Cloning of the prototypical expression plasmids bhd-1a and bhd-1:

Ausgangsvektor für die Konstruktion des Plasmids bhd-1a war der Vektor pEFplink (LIT), der eingesetzte offene Leseraster in eukaryontischen Zellen unter Kontrolle des zellulären EF1-alpha-Promoters exprimiert. In dieses Plasmid wurde eine ,in frame' Fusion aus den kodierenden Sequenzen für srcNLS (PCR-amplifiziert aus pHHR-srcNLS-GFP; R. Welker, unpubliziert) und dem vollständigen p6 Protein von HIV-1 (PCR-amplifiziert aus pNL4-3) kloniert. Zwischen diese beiden Fusionsanteile wurde die ebenfalls mittels PCR amplifizierte kodierende Sequenz für EGFP (aus pEGFP-c1, Clontech) gesetzt. Daraus resultierte Plasmid bhd-1a. Durch Klonierung der gesamten Expressionskassette aus bhd-1a in das Plasmid M159 (zur Verfügung gestellt von Dr. M. von Laer, Georg-Speyer-Haus Frankfurt) entstand der lentivirale Vektor bhd-1. Dieses Plasmid exprimiert das therapeutische Gen unter der Kontrolle des ,long terminal repeat' des Myeloproliferative Sarkom Virus. Durch die ebenfalls im Vektor vorhandene leader-Sequenz 71 des Murinen embryonic stem cell Virus und das beta-Posttranskriptionelle Regulationselement des Waldmurmeltier-Hepatitis B-Virus wird die Expressionseffizienz gesteigert (Schambach 2000).Starting vector for the construction of the plasmid bhd-1a was the vector pEFplink (LIT), the open reading frame used in eukaryotic cells under the control of the cellular EF1-alpha promoter expressed. In this plasmid, an in frame fusion from the coding Sequences for srcNLS (PCR-amplified from pHHR-srcNLS-GFP; R. Welker, unpublished) and the full p6 protein of HIV-1 (PCR amplified from pNL4-3) cloned. Between these two fusion components were also amplified by means of PCR coding sequence for EGFP (from pEGFP-c1, Clontech) set. This resulted in plasmid bhd-1a. By cloning the entire expression cassette from bhd-1a into the plasmid M159 (provided from Dr. M. von Laer, Georg-Speyer-Haus Frankfurt) was the lentiviral Vector BHD-1. This plasmid under-expresses the therapeutic gene control of the 'long terminal repeat' of the myeloproliferative sarcoma virus. Through the leader sequence 71 of the murine, which is also present in the vector embryonic stem cell virus and the beta post-transcriptional regulatory element of the woodchuck hepatitis B virus is the expression efficiency increased (Schambach 2000).

Beispiel 2: Kultivierung der Zellen und VirenExample 2: Cultivation of cells and viruses

293T-, COS-7 und Phoenix-ampho-Zellen wurden in Dulbecco's Medium (Invitrogen), komplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS; Sigma), kultiviert. PM-1 und Jurkat-Zellen wurden in RPMI-Medium mit 10% FCS kultiviert.293T, COS-7 and Phoenix ampho cells were in Dulbecco's Medium (Invitrogen) complemented with 10% fetal calf serum (FCS; Sigma), cultured. PM-1 and Jurkat cells were cultured in RPMI medium with 10% FCS.

Replikationskompetente Viren wurden nach Transfektion von 293T Zellen mit dem proviralen Klon pNL4-3 und anschliessender Passage auf PM-1 Zellen gewonnen.Replication-competent viruses were after transfection of 293T cells with the proviral clone pNL4-3 and then passage through PM-1 cells.

Zur stabilen Transfektion von PM-1 Zellen wurde ein retroviraler Vektor, der für das prototypische Fusionsprotein kodiert (bhd-1) mittels der Verpackungszellinie Phoenixampho (Grigani et al., 1998) verpackt.For stable transfection of PM-1 Cells became a retroviral vector that was used for the prototypical fusion protein encodes (bhd-1) using the Phoenixampho packaging cell line (Grigani et al., 1998).

Beispiel 3: Expression des prototypischen Fusionsproteins in transfizierten ZellenExample 3: Expression of the prototypical fusion protein in transfected cells

Um die Expression und Stabilität des Fusionsproteins zu testen, wurde das entsprechende Expressionskonstrukt zunächst alleine in verschiedene Zellinien (HeLa, 293T, COS-7) transfiziert . In Zellextrakten konnte ein Protein mit dem erwarteten apparenten Molekulargewicht (ca. 35 kDa) nachgewiesen werden, das mit Antiseren gegen EGFP sowie gegen p6 reagiert (Zeichnung 1B). Das Fusionsprotein ist demnach in Zellen stabil, die exprimierte Menge entspricht in etwa der des gut exprimierten Markerproteins EGFP alleine (Blot mit anti-GFP, vgl. Spuren 1 und 3). Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von transfizierten COS-7 (Zeichnung 1C) und HeLa-Zellen (nicht gezeigt) zeigte ein starkes GFP-Signal an der Plasmamembran. Das synthetische Membranlokalisationssignal ist demnach in dem hier verwendeten Kontext funktionell und das Fusionsprotein wird an den beabsichtigten Wirkungsort innerhalb der Zelle transportiert.To the expression and stability of the fusion protein to test, the corresponding expression construct was initially alone transfected into different cell lines (HeLa, 293T, COS-7). In Cell extracts could produce a protein with the expected apparent molecular weight (approx. 35 kDa) can be detected using antisera against EGFP and reacted to p6 (drawing 1B). The fusion protein is accordingly stable in cells, the amount expressed corresponds approximately to that of well expressed marker protein EGFP alone (blot with anti-GFP, see. Lanes 1 and 3). The fluorescence microscopic examination of transfected COS-7 (drawing 1C) and HeLa cells (not shown) showed a strong GFP signal on the plasma membrane. The synthetic Membrane localization signal is therefore in the context used here functional and the fusion protein is delivered to the intended site of action transported within the cell.

Beispiel 4: Ko-Transfektionsexperiment zum Nachweis der inhibitorischen Wirkung des neuen FusionsproteinsExample 4: Co-transfection experiment to demonstrate the inhibitory effect of the new fusion protein

Durch Ko-Transfektion des prototypischen Vektors mit dem Plasmid pKHIV wurde auf einfache Weise die inhibitorische Wirkung des Fusionsproteins auf die Partikelfreisetzung untersucht (Zeichnung 2). pKHIV (LIT) ist ein nicht-infektiöses subvirales Derivat des proviralen Klons pNL4-3, das die kodierenden Regionen von HIV-1 (mit Ausnahme von nef) unter Kontrolle des CMV major late-Promotors enthält. Die viralen Hauptstrukturproteine Gag und Gag-Pol werden exprimiert und bilden virusähnliche Partikel, die normal in den Zellkulturüberstand freigesetzt werden (da in pKHIV die ,long terminal repeats' und die Primerbindungsstelle fehlen, sind die entstehenden Partikel nicht infektiös). Bei Anwesenheit eines inhibitorisch wirksamen Fusionsproteins in der gleichen Zelle sollte entsprechend weniger Virusprotein ins Medium freigesetzt werden. Dieses Plasmid wurde zusammen mit dem Vektor bhd-1a (bzw. zur Negativkontrolle mit dem Leervektor pEFplink oder dem EGFP-Expressionsplasmid pEGFP-c1) in 293T-Zellen transfiziert. Bei den Kotransfektionen wurden jeweils equimolare Mengen der beiden Plasmide eingesetzt. Die Immunoblot-Analyse des Zellextraktes mit anti-GFP-Antiserum zeigte, dass das Fusionsprotein in vergleichbarer Menge zum Kontrollprotein EGFP exprimiert wurde (Zeichnung 2, oben). 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellkulturüberstände geerntet, durch 0,45 μm Filter filtriert und in Ultrazentrifugenröhrchen auf ein Saccharosekissen (20% w/w in phosphatgepufferter NaCl-Lösung) geschichtet. Durch Zentrifugation (90 min; 39000 rpm, SW-41 Rotor) wurden die Viruspartikel aus dem Überstand pelletiert und anschliessend vollständig auf ein SDS-Gel aufgetragen. Durch Immunoblot mit Antiserum gegen HIV-1 Capsid wurden die pelletierten Viruspartikel nachgewiesen. Wie Zeichnung 2 zeigt, werden bei gleicher Menge an intrazellulär exprimiertem Gag-Protein (Zeichnung 2, Mitte) in Anwesenheit des Fusionsproteins deutlich weniger Viruspartikel freigesetzt (unten) als in den Kontrollansätzen.By co-transfecting the prototypical Vector with the plasmid pKHIV was the inhibitory in a simple manner Effect of the fusion protein on particle release examined (Drawing 2). pKHIV (LIT) is a non-infectious subviral derivative of the proviral clones pNL4-3 that encode the coding regions of HIV-1 (with the exception of nef) under the control of the CMV major late promoter contains. The main viral structural proteins Gag and Gag-Pol are expressed and form virus-like Particles that are normally released into the cell culture supernatant (since the 'long terminal repeats' and the primer binding site are missing in pKHIV, the resulting particles are not infectious). In the presence of an inhibitory effective fusion protein in the same cell should be corresponding fewer virus proteins are released into the medium. This plasmid was used together with the vector bhd-1a (or for negative control with the empty vector pEFplink or the EGFP expression plasmid pEGFP-c1) transfected in 293T cells. In the case of co-transfections, respectively equimolar amounts of the two plasmids were used. Immunoblot analysis of the cell extract with anti-GFP antiserum showed that the fusion protein was expressed in a comparable amount to the control protein EGFP (Drawing 2, above). The cell culture supernatants were harvested 48 hours after transfection 0.45 μm Filters are filtered and placed in ultracentrifuge tubes on a sucrose cushion (20% w / w in phosphate buffered NaCl solution) layered. By centrifugation (90 min; 39000 rpm, SW-41 rotor) the virus particles were removed from the supernatant pelleted and then completely applied to an SDS gel. The pelleted were by immunoblot with antiserum against HIV-1 capsid Virus particles detected. As drawing 2 shows, the same Amount of intracellular expressed gag protein (drawing 2, middle) in the presence of the Fusion protein releases significantly fewer virus particles (below) than in the control approaches.

Beispiel 5: Infektion von stabil transduzierten PM-1 und Jurkat-Zellen zum Nachweis der inhibitorischen Wirkung auf die Virusreplikation.Example 5: Infection of stably transduced PM-1 and Jurkat cells for the detection of inhibitory effect on virus replication.

Mit Hilfe von Verpackungszellinien wurden stabil mit bhd-1 transduzierte PM-1 und Jurkat-Zellen hergestellt. Durch hohe Transduktion oder durch FACS-Sortierung wurde ein Anteil von ca. 80% EGFP positiver Zellen erreicht. Im Vergleich zu untransduzierten, bzw. mit einem nur EGFP-exprimierenden Kontrollvektor (M56) transduzierten Zellinien sollten diese Zellen eine verminderte Virusreplikation erlauben. Dies wurde durch Infektion mit den HIV-1 Isolaten NL4-3, bzw. dem besonders aggressiven Isolat D117II getestet. Die Virusreplikation über bis zu 3 Wochen wurde durch Bestimmung des Capsidproteins p24 im Medium verfolgt. Wie Zeichnung 3 zeigt, war in diesen Experimenten die Freisetzung von p24 in bhd-1 transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen um etwa 90% inhibiert. Durch Expression des Prototyp-Fusionsproteins kann also die HIV-1 Replikation effizient gehemmt werden.With the help of packaging cell lines were stably produced with bhd-1 transduced PM-1 and Jurkat cells. A portion was obtained through high transduction or through FACS sorting reached by approximately 80% EGFP positive cells. Compared to untransduced, or with a control vector (M56) expressing only EGFP Cell lines, these cells should have reduced virus replication allow. This was caused by infection with the HIV-1 isolates NL4-3, or the particularly aggressive isolate D117II. Virus replication over to 3 weeks was determined by determining the capsid protein p24 in the medium tracked. As shown in drawing 3, the was in these experiments Release of p24 in bhd-1 transduced cells compared inhibited by about 90% to the controls. By expression of the prototype fusion protein HIV-1 replication can be inhibited efficiently.

Beschreibung der Zeichnungen:Description of the drawings:

Zeichnung 1:Drawing 1:

  • (A) Schematischer Aufbau des getesteten prototypischen Inhibitorproteins. SrcNLS: von den Erfindern entwickeltes synthetisches Membranlokalisationssignal (R.Welker, unpubliziert); EGFP: grün fluoreszierendes Protein; p6: komplette kodierende Sequenz des p6 Proteins von HIV-1 NL4-3.(A) Schematic structure of the prototypical inhibitor protein tested. SrcNLS: Synthetic membrane localization signal developed by the inventors (R.Welker, unpublished); EGFP: green fluorescent protein; p6: complete coding sequence of the p6 protein of HIV-1 NL4-3.
  • (B) Ein eukaryotischer Expressionsvektor, der für das in (A) skizzierte Fusionsprotein kodiert, wurde transient in 293T-Zellen transfiziert. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und der Gesamtextrakt mittels Immunoblot auf das Vorhandensein des Fusionsproteins untersucht (Spur 3). Als Kontrolle wurden parallel mit Leervektor transfizierte Zellen (Spur 2), sowie mit dem Plasmid pEGFP-c1 (Clontech) transfizierte Zellen (Spur 1) verwendet. Das Bild zeigt Immunoblots entwickelt mit den angegebenen Antiseren; auf der linken Seite sind die Positionen der Molekulargewichts-Standards (MW in Kilodalton) aufgetragen. In den mit Inhibitorkonstrukt transfizierten Zellen wird ein Protein der erwarteten Grösse (ca. 35 kDa) detektiert, das sowohl mit Antiserum gegen p6, als auch mit Antiserum gegen GFP reagiert.(B) A eukaryotic expression vector suitable for the in (A) Outlined fusion protein was transient in 293T cells transfected. 48 hours after transfection, the cells were lysed, and the total extract by means of immunoblot for the presence of the Fusion protein examined (lane 3). As a control, were parallel cells transfected with empty vector (lane 2) and with the plasmid pEGFP-c1 (Clontech) transfected cells (lane 1) were used. The Image shows immunoblots developed with the specified antisera; on the left are the positions of the molecular weight standards (MW in kilodaltons). In the with inhibitor construct transfected cells becomes a protein of the expected size (approx. 35 kDa) detected, both with antiserum against p6, as well reacted with antiserum against GFP.
  • (C) COS-7 Zellen wurden mit dem Inhibitorkonstrukt bhd-1a transfiziert und 48 h nach Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die intrazelluläre Lokalisation des srcNLS-EGFP-p6-Fusionsproteins zu bestimmen. Man erkennt ein starkes Fluoreszenzsignal an der Plasmamembran.(C) COS-7 cells were transfected with the inhibitor construct bhd-1a and examined 48 h after transfection using fluorescence microscopy, around the intracellular Determine the localization of the srcNLS-EGFP-p6 fusion protein. you detects a strong fluorescence signal on the plasma membrane.

Zeichnung 2:Drawing 2:

293T-Zellen wurden mit gleichem Mengen eines nicht-infektiösen HIV-1 Derivats (pKHIV) und dem Inhibitorkonstrukt kotransfiziert. Als Negativkontrolle wurde anstelle des Inhibitorkonstruktes der Expressionsvektor ohne kodierende Sequenz bzw. das EGFP-exprimierende Plasmid pEGFP-c1 (Clontech) eingesetzt. 48 h nach Transfektion wurden die Zellen lysiert, und gleiche Mengen des Zellextrakts mittels Immunoblot auf Expression des inhibitorischen Proteins (oben) und dem von pKHIV kodierten HIV Hauptstrukturprotein Gag (Mitte) getestet. Aus dem Zellkulturüberstand wurden die freigesetzten subviralen Partikel mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen gereinigt, vollständig auf ein SDS-Gel aufgetragen und durch Immunoblot nachgewiesen (unten).293T cells were of equal amounts one non-infectious HIV-1 derivative (pKHIV) and the inhibitor construct co-transfected. As a negative control instead of the inhibitor construct, the Expression vector without coding sequence or the EGFP-expressing plasmid pEGFP-c1 (Clontech) used. 48 hours after transfection, the Cells lysed, and equal amounts of cell extract by immunoblot on expression of the inhibitory protein (top) and that of pKHIV encoded HIV main structural protein Gag (center) tested. From the Cell culture supernatant the released subviral particles by means of ultracentrifugation cleaned by a sucrose cushion, completely applied to an SDS gel and detected by immunoblot (below).

In allen Ansätzen werden vergleichbare Mengen an Gag-Protein exprimiert (Mitte), die Freisetzung von Gag-Partikeln ist jedoch in Anwesenheit des inhibitorischen Proteins im Vergleich zu den beiden Kontrollen deutlich reduziert (unten).Comparable amounts are used in all approaches expressed on Gag protein (center), the release of Gag particles however, is compared in the presence of the inhibitory protein significantly reduced to the two controls (below).

Zeichnung 3:Drawing 3:

Zwei verschiedene T-Zell-Linien (Jurkat und PM-1) wurden stabil mit dem Inhibitorkonstrukt transduziert und anschliessend mit den HIV-1 Isolaten NL4-3 und D117II infiziert. Als Mass für die Virusfreisetzung wurde zu mehreren Zeitpunkten nach Infektion HIV-1 Capsidprotein (p24) im Zellkulturüberstand mittels ELISA quantifiziert. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte aus zwei Ansätzen. In Zellen, die mit dem Inhibitorkonstrukt bhd-1 transduziert wurden, ist die Virusreplikation im Vergleich zur Kontrolle um etwa 90% reduziert.Two different T cell lines (Jurkat and PM-1) were stably transduced with the inhibitor construct and then infected with the HIV-1 isolates NL4-3 and D117II. As a measure of The virus release was at several times after infection HIV-1 capsid protein (p24) in the cell culture supernatant quantified by ELISA. The mean values from two approaches are shown. In Cells transduced with the inhibitor construct bhd-1 the virus replication is about 90% compared to the control reduced.

Diese Daten wurden von Frau PD Dr. D. v. Laer, Georg-Speyer-Haus Frankftut/M., zur Verfügung gestellt SEQUENCE LISTING

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This data was provided by Ms. PD Dr. D. v. Laer, Georg-Speyer-Haus Frankftut / M SEQUENCE LISTING
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Claims (27)

Nukleinsäure der allgemeinen Formel 5'-MTS-(Marker)-,late domain'-3' wobei „5'" das 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet, „3'" das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet, „(Marker)" eine optional vorhandene DNA-Region, die für ein Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet. „MTS" die für ein „membrane targeting signal" kodierende DNA-Region, Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet, und „late domain" eine DNA-Region, die für den exprimierten Bereich der „late domain", eines Fragments oder Derivates davon, eines Virus kodiert, bezeichnet, ein Fragment oder Derivat davon.nucleic acid the general formula 5'-MTS (markers) -, late domain '3' in which "5 '" denotes the 5' end of the nucleic acid sequence, "3 '" denotes the 3' end of the nucleic acid sequence, "(Marker)" an optionally available DNA region needed for encodes a peptide to detect the construct. "MTS" for a "membrane targeting signal "coding DNA region, fragments or derivatives thereof, and "Late domain" a DNA region, the for the expressed area of the “late domain ", a fragment or derivatives thereof, encoded by a virus, on Fragment or derivative thereof. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Filoviren, Rhabdoviren und Retroviren.Nucleic acid, a fragment or derivative thereof, according to claim 1, characterized in that that the said virus is selected is from the group consisting of filoviruses, rhabdoviruses and retroviruses. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein Retrovirus ist.Nucleic acid, a fragment or derivative thereof, according to claims 1 and 2, characterized in that that the virus is a retrovirus. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Retrovirus ein Lentivirus ist.Nucleic acid, a fragment or derivative thereof, according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the retrovirus is a lentivirus. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Lentivirus HIV-1 ist.Nucleic acid, a fragment or derivative thereof, according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the lentivirus is HIV-1. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass „MTS" die Nukleotide 1 bis 63 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz umfasst.Nucleic acid, a fragment or derivative thereof, according to any one of claims 1 to 5 characterized in that "MTS" nucleotides 1 to 63 of the SEQ ID NO: 1 sequence shown. Nukleinsäure, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass sie keine für einen „Macker" kodierende DNA-Region enthält.Nucleic acid, a fragment or derivative thereof, according to any one of claims 1 to 6 characterized in that it does not contain a DNA region coding for a “maker”. Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.nucleic acid with the sequence shown in SEQ ID NO: 1, a fragment or Derivative thereof. Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.nucleic acid with the sequence shown in SEQ ID NO: 3, a fragment or Derivative thereof. Rekombinante DNA, die eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 enthält.Recombinant DNA that contains a nucleic acid according to a of claims Contains 1 to 9. Expressionsvektor, der eine rekombinante DNA gemäß Anspruch 10 enthält.Expression vector comprising a recombinant DNA according to claim 10 contains. Expressionsvektor gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass er ein retroviraler Vektor ist.Expression vector according to claim 11, characterized in that it's a retroviral vector. Expressionsvektor gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der retrovirale Vektor M159, ein Fragment oder Derivat davon, ist.Expression vector according to claim 12, characterized in that the retroviral vector M159, a fragment or derivative thereof, is. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Peptids, das von der Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 kodiert wird, umfassend die folgenden Schritte: (a) Einbringen eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 in eine Wirtszelle, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle, und (c) Isolierung des Peptids aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.A method for producing a recombinant peptide which is encoded by the nucleic acid according to one of claims 1 to 9, comprising the following steps: (a) introducing a vector according to one of claims 11 to 13 into a host cell, the host cell being pro- or eukaryotic (b) culturing the transfected host cell, and (c) Isolation of the peptide from the host cell or from the culture medium. Fusionspeptid der allgemeinen Formel NH2-MTS-,late domain'-(Marker)-COOH wobei „NH2" das aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet, „COOH" das carboxyterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet, „(Marker)" ein optional vorhandenes Peptid zum Nachweis des Konstrukts bezeichnet, „MTS" ein „membrane targeting signal", Fragment oder Derivat davon, bezeichnet, und „late domain" den „late domain", Fragment oder Derivat davon, eines Virus bezeichnet, ein Fragment oder Derivat davon.Fusion peptide of the general formula NH 2 -MTS-, late domain '- (marker) -COOH where "NH 2 " denotes the amino-terminal end of the fusion peptide, "COOH" denotes the carboxy-terminal end of the fusion peptide, "(marker)" an optionally present peptide to detect the construct, "MTS" denotes a "membrane targeting signal", fragment or derivative thereof, and "late domain" denotes the "late domain", fragment or derivative thereof, of a virus, a fragment or derivative thereof. Fusionspeptid, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass „MTS" die Aminosäuren 1 bis 21 der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz umfasst.Fusion peptide, a fragment or derivative thereof, according to claim 15, characterized in that "MTS" amino acids 1 to 21 of the in SEQ ID NO: 2 sequence included. Fusionspeptid, ein Fragment oder Derivat davon, gemäß den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass es keinen Marker enthält.Fusion peptide, a fragment or derivative thereof, according to claims 15 and 16, characterized in that it contains no marker. Fusionspeptid mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.Fusion peptide with that shown in SEQ ID NO: 2 Sequence, fragment or derivative thereof. Fusionspeptid mit der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Sequenz, ein Fragment oder Derivat davon.Fusion peptide with that shown in SEQ ID NO: 4 Sequence, fragment or derivative thereof. Verwendung eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 zur Behandlung von HIV-Infektionen.Use of a vector according to any one of claims 11 to 13 for the treatment of HIV infections. Verwendung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass HIV-infizierte Zellen mit dem Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 transfiziert werden.Use according to claim 20, characterized in that HIV-infected cells with the vector according to a of claims 11 to 13 can be transfected. Verwendung gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die HIV-infizierten Zellen T-Lymphozyten sind.Use according to claim 21, characterized in that the HIV-infected cells are T lymphocytes. Verfahren zur Hemmung einer HIV-Freisetzung, umfassend das Inkontaktbringen einer HIV-infizierten Zelle mit dem Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19.A method of inhibiting HIV release, comprising contacting an HIV-infected cell with the fusion peptide according to one of claims 15 to 19. Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder eines Fusionspeptids gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19 zur Verwendung als Arzneimittel.nucleic acid according to one of claims 1 to 9 and / or a vector according to any one of claims 11 to 13 and / or a fusion peptide according to any one of claims 15 to 19 for use as a medicine. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9, eines Vektors gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und eines Fusionspeptids gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten.Use of a nucleic acid according to one of claims 1 to 9, a vector according to one of claims 11 to 13 and a fusion peptide according to any one of claims 15 to 19 for the manufacture of a medicament for the treatment of HIV-infected patients. Arzneimittel zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder einen Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder ein Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19, optional in Kombination mit weiteren pharmazeutisch verträglichen Substanzen und/oder Trägerstoffen.Medicines used to treat HIV-infected people Patients containing a nucleic acid according to any one of claims 1 to 9 and / or a vector according to one of claims 11 to 13 and / or a fusion peptide according to any one of claims 15 to 19, optionally in combination with other pharmaceutically acceptable ones Substances and / or carriers. Kit, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9 und/oder ein Vektor gemäß einer der Ansprüche 11 bis 13 und/oder ein Fusionspeptid gemäß einer der Ansprüche 15 bis 19.Kit containing a nucleic acid according to any one of claims 1 to 9 and / or a vector according to one of the Expectations 11 to 13 and / or a fusion peptide according to any one of claims 15 to 19th
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