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Die Herstellung von Ersatzgewebe
in Zellkultur, das sogenannte Tissue Engeneering, die Bereitstellung
von Surrogatzellen für
Zellbasierte Transplantationstherapien und die Identifizierung neuer
Wirkstoffe mit Hilfe Zellbasierter Hochdurchsatzverfahren sind Paradebeispiele
für innovative
Anwendung der Biotechnologie.
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Eine Vorraussetzung für Zellbasierte
Therapien ist neben der Qualität
vor allem die Verfügbarkeit
großer
Zellmengen des benötigten
Zelltyps. Geht man von publizierten Daten aus, wonach der Ventrikel
eines menschlichen Herzens aus etwa 5,6 × 109 Herzmuskelzellen
besteht (Kajstura et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jul 21; 95(15):
8801–5.)
und bei einem Herzinfarkt bis zu 20% aller Herzmuskelzellen irreversibel
verloren gehen, so müssen
einem Patienten etwa 1 × 109 vitale Herzmuskelzellen transplantiert
werden, um den Verlust zu kompensieren.
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Im Gegensatz zu primären Zellen
können
Stammzellen als potentiell unbegrenzte Quelle für die Isolierung differenzierter,
spezifischer Zelltypen dienen (Poulsom R. et al., J Pathol. 2002
Jul; 197(4): 441–56.; Gepstein
L. Circ Res. 2002 Nov 15; 91(10): 866–76.). Unter Stammzellen sind
im Kontext dieser Erfindung Zellen gemeint, die sich zum Einen selbst
erneuern können,
dass heißt
unter Aufrechterhaltung Ihrer Stammzelleigenschaften vermehrt werden
können,
und zum Anderen in einem als Differenzierung bezeichneten Vorgang einen
oder mehrere spezialisierte Zelltypen wie beispielsweise Herzmuskelzellen,
Endothelzellen, Knorpelzellen, Knochenzellen, Fettzellen, neuronale
Zellen, Leberzellen oder Insulin bildende Zellen bilden können (Wobus
AM. Mol Aspects Med. 2001 Jun; 22(3): 149–64).
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Unter Differenzierung ist im Rahmen
dieser Erfindung die Bildung spezialisierter, Zellen bzw. Zelltypen oder
Gewebe aus Stammzellen gemeint (Gilbert S.F., Developmental Biology,
forth edition, 1994. Sinaer Associate's Inc. Sunderland, Massachusetts, USA).
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Beispiele für Stammzellen sind Stammzellen
aus Nabelschnurblut (Sanchez-Ramos JR., J Neurosci Res. 2002 Sep
15; 69(6): 880–93.),
neuronale Stammzellen (Hitoshi S. et al., Genes Dev. 2002 Apr 1;
16(7): 846–58.
Okano H. J Neurosci Res. 2002 Sep 15; 69(6): 698–707.), mesenchymale Stammzellen
aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut (Jiang Y. et al., Exp
Hematol. 2002 Aug; 30(8): 896–904.;
Schwartz et al., J Clin Invest. 2002 May; 109(10): 1291–302.) sowie
Stammzellen aus der Haut (Toma et al., Nat Cell Biol. 2001 Sep;
3(9): 778–84.),
dem Pankreas (Means AL., Pancreatology. 2001; 1(6): 587–96.), der
Leber (Suzuki A., et al., Cell Transplant. 2001; 10(4-5): 393–6.), dem
Darm (Brittan M., J. Pathol. 2002 Jul; 197(4): 492–509.) oder aus
Fettgewebe (Cannon B. et al., Methods Mol Biol. 2001; 155: 213–24.), um
nur einige zu nennen. Weitere wichtige Stammzellen sind die embryonalen
Keimzellen (Schamblott MI., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jan
2; 98(1): 113–8.),
so wie die sogenannten embryonalen Stammzellen (ESC), die aus der
inneren Zellmasse einer Blastozyste isoliert werden können. Embryonale
Stammzellen wurden bereits aus einer Vielzahl von Spezies etabliert,
unter anderem aus der Maus (Evans MJ, Kaufman MH., Nature. 1981
Jul 9; 292(5819): 154–6.)
und dem Menschen (Thomson JA, et al., Science. 1998 Nov 6; 282(5391):
1145–7.).
ESC sind pluripotente Stammzellen, das heißt sie können in eine Vielzahl spezifischer
Zelltypen differenzieren (Wobus AM., Mol Aspects Med. 2001 Jun;
22(3): 149–64.;
Amit M, Itskovitz-Eldor J., J Anat. 2002 Mar; 200(Pt 3): 225–32). Sowohl
für humane
als auch für
murine ESC konnte gezeigt werden, dass sie unter anderem in Herzmuskelzellen
(Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24; Mummary
C. et al., J Anat. 2002 Mar; 200(Pt 3): 233–42.; Xu C. et al., Circ Res.
2002 Sep 20; 91(6): 501–8.),
Insulin produzierende Zellen (Assady et al., Diabetes. 2001 Aug;
50(8): 1691–7.;
Soria B. Differentiation. 2001 Oct; 68(4-5): 205–19.; Lumelsky M. et al,. Science.
2001 May 18; 292(5520): 1389–94.),
neuronale Zellen (Schuldiner M. et al., Brain Res. 2001 Sep 21; 913(2):
201–5.),
Endothelzellen (Levenberg S. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Apr 2;
99(7): 4391–6.)
und blutbildende Zellen (Kaufmann DS., Proc Natl Acad Sci USA. 2001
Sep 11; 98(19): 10716–21.)
differenzieren können,
um nur einige zu nennen.
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Zunächst bestand die Einschränkung bei
der Differenzierung eines bestimmten Zelltyps aus Stammzellen, dass
der jeweilige Zelltyp nur in einem Gemisch einer Vielzahl differenzierter
Zelltypen erhältlich
war. Kürzlich
wurden Arbeiten publiziert, bei der Herzmuskelzellen aus ESC der
Maus mit Hilfe einer Doppelstrategie aus einem Percoll-Gradienten
und der Fluoreszenz-aktivierten Zell Sortierung (FACS) angereichert
wurden (Muller M., FASEB J. 2000 Dec; 14(15): 2540–8.). Hierbei
wurde ein Anteil von bis zu 97 % Herzmuskelzellen am gesamten Zellgemisch
dokumentiert. Neben der unvollständigen
Anreicherung hat die Methode den Nachteil, dass mittels FACS nur
relativ geringe Zellzahlen sortiert werden können und die Zellen bei der
Prozedur mechanisch gestresst und teilweise abgetötet werden.
In einer weiteren Arbeit wurden Herzmuskelzellen aus humanen ESC
mittels Dichtezentrifugation angereichert (Xu C. et al., Circ Res.
2002 Sep 20; 91(6): 501–8.). Hierbei
konnte ein Anteil von 70% der gesuchten Herzmuskelzellen im Zellgemisch
erreicht werden. Neben der begrenzten Aufreinigung können mit
dieser Methode nur geringe Zellzahlen isoliert werden.
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Von Klug und Mitarbeitern (Klug et
al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) wurde eine Methode entwickelt,
bei der ESC genetisch so verändert
werden, dass ein Antibiotika-Resistenzgen
in einem spezifischen Zelltyp, der bei der Differenzierung von ESC
entsteht, exprimiert wird. Durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikums
konnten sehr reine Herzmuskelzellpopulationen mit einem Herzmuskelzellanteil
von 99,6% erhalten werden. Hierbei wurden die Herzmuskelzellen auf
der Oberfläche
von Zellkulturplatten angereichert. Die Methode ist jedoch nur begrenzt
skalierbar und damit nicht für
die Herstellung von Zellen im klinisch oder technisch relevanten
Maßstab
geeignet. Ein weiterer Nachteil der Methode ist, dass die Dichte,
die Verteilung und die Anzahl der angereicherten Herzmuskelzellen
auf der Platte kaum beeinflusst werden kann.
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Zur Selektion von Herzmuskelzellen
aus genetisch modifizierten ESC werden laut einer Methode von Klug
et al. (J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) gebildete EBs zur Differenzierung
auf Zellkulturplatten plattiert. Die Selektion von Herzmuskelzellen
findet dann durch die Zugabe eines geeigneten Antibiotikums zum
verwendeten Kulturmedium statt. Hierbei entstehen auf den Zellkulturplatten
heterogen verteilte Anhäufungen
von Herzmuskelzellen. Um die erhaltenen Herzmuskelzellen für pharmakologische
Hochdurchsatzverfahren verwenden zu können, müssen die Zellen abgelöst, vereinzelt
und auf neuen Plattenformaten replattiert werden, da hierfür eine gleichmäßige Verteilung
der Herzmuskelzellen in einer gewünschten Dichte auf geeigneten,
variierenden Plattenformaten benötigt
wird. Diesbezüglich
wird festgestellt, dass die auf Zellkulturplatten isolierten Herzmuskelzellenhaufen
nur schwer vereinzelt und in Suspension gebracht werden können. Die Zellen
sind zur Beschichtung anderer Platten nicht geeignet da hierbei
weit über
95% aller Herzmuskelzellen verloren gehen.
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Die Differenzierung von ESC wird
in vielen Protokollen dadurch eingeleitet, dass die Zellen zunächst vereinzelt
werden und die entstehende Zellsuspension auf Petrischale ausgesät wird.
Auf der Petrischale wird ein Absetzen der Zellen auf dem Plattenboden
verhindert. Die Zellen bleiben in Suspension und es kommt zur Bildung
von kugelförmigen
Zellaggregaten, die im Rahmen dieses Patents als Sphäroide bezeichnet
werden. In der Literatur werden Sphäroide aus ESC häufig „Embryoid
Bodies" (EBs) genannt.
Die Bildung von EBs unter Verwendung eines geeigneten Mediums ist
die Vorraussetzung für
die Differenzierung von ESC in eine Vielzahl von Zelltypen, unter
anderem in Herzmuskelzellen, Insulin bildende Zellen und Endothelzellen,
um nur einige zu nennen (Guan K, et al, ALTEX. 1999; 16(3): 135–141.; Zandstra
PW, et al, Biotechnol Bioeng. 2000 Sep 20; 69(6): 607–17.). Diese
Beobachtung wurde sowohl bei der Differenzierung muriner ESC als
auch humaner ESC beschrieben (Itskovitz-Eldor J, et al, Mol Med.
2000 Feb; 6(2): 88–95.).
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Die Bildung von Sphäroiden aus
Stammzellen im technischen Maßstab
ist in Petrischalen nur bedingt möglich, da die Methode sehr
Zeit- und Arbeitskraftintensiv ist und nicht beliebig dimensioniert
werden kann. Ein weiterer Nachteil der EB-Bildung in Petrischalen
ist die sehr heterogene Größe der entstehenden
EBs und die Neigung der Sphäroide
miteinander zu großen,
ungleichmäßigen Aggregaten
zu Fusionieren. Das Wachstum und die Differenzierung von ESC wird
durch die Bildung großer
Aggregate stark gehemmt oder komplett inhibiert. Der Differenzierungsprozess
kann bei dieser Methode nicht reproduzierbar durchgeführt werden.
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Neben der Verwendung von bakteriellen
Kulturschalen wurde die Induktion von EBs mittels der sogenannten „Hanging
Drop" Technik sowie
durch Einbetten von ESZ in Nitrozellulose beschrieben (Viswanathan S,
et al., Stem Cells. 2002; 20(2): 119–38.; Dang S., et al., Biotechnol
Bioeng. 2002 May 20; 78(4): 442–53.). Diese
Methoden sollen durch das Separieren einzelner EBs die unkontrollierte
Fusion verhindern und damit die Reproduzierbarkeit der Differenzierungsprozesse
verbessern. Beide Systeme sind jedoch ebenfalls sehr schwer skalierbar
und damit für
die Übertragung
in den technischen Maßstab
nicht geeignet.
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Um diese Probleme zu lösen wurden
alternative Strategien entwickelt, bei denen ESC in Alginat- oder Agarose-Tröpfchen eingekapselt
wurden (Magyar et al., 2001, Ann. NY Acad. Sci., Nov, 944, 135–143). Die Methode
soll die Fusion der entstehenden EBs verhindern. Der Ansatz ist
jedoch technisch aufwendig und stellt ein regulatorisches Problem
dar, da die Zellen mit einer Vielzahl von Substanzen wie Aggarose,
Alginat und Öl
(zum fixieren der gebildeten Mikrokapseln) in Kontakt kommen.
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Alternativ wurde die Bildung von
Sphäroiden
durch Rühren
einer Suspension von ESC in sogenannten Spinnerflaschen publiziert
(Wartenberg M. et al., Lab Invest. 1998 Oct; 78(10): 1301–14. Sen
A. et al., Brain Res Dev Brain Res. 2002 Mar 31; 134(1-2): 103–13.). Es
kommt hierbei häufig
zur Aggregation von ESC zu wenigen, großen Klumpen. Die Zellen in
den Klumpen teilen sich kaum und eine Differenzierung in spezifische Zelltypen
wie zum Beispiel Herzmuskelzellen wird nicht erreicht (Dang SM.
et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Das
System kann nur begrenzt skaliert werden und die maximale Zelldichte
im Spinner ist auf etwa 1 × 106 Zellen pro ml limitiert (Prokop A, Rosenberg
MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.; Lindl T., Zell und Gewebekultur,
4. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, ISBN 3-8274-0803-2
(2000)).
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In der Pharmaindustrie werden zur
Identifizierung und Testung neuer Wirkstoffe Hochdurchsatzverfahren
eingesetzt, bei denen Zellen, die auf Zellkulturplatten verschiedener
Formate aufgebracht sind, mit einer Vielzahl von Substanzen behandelt
werden. Bisher werden bei diesen Verfahren in der Regel etablierte
Zelllinien wie CHO Zellen aus dem Hamster oder Tumorziellinien wie
COS-Zellen verwendet (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc
Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.).
In Zukunft wäre
es jedoch wünschenswert
Hochdurchsatzverfahren mit spezifischen Zelltypen wie Herzmuskelzellen,
Insulin produzierenden Zellen, Gefäßendothelzellen, Neuronale
Zellen oder Leberzellen durchzuführen,
um nur einige zu nennen (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc
Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.).
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist die Bereitstellung bestimmter, differenzierter Zelltypen wie beispielsweise
Herzmuskelzellen, Insulin produzierende Zellen, neuronale Zellen,
Leberzellen oder Endothelzellen aus Stammzellen in einer klinisch
und industriell relevanten Menge, um dringend benötigte Zelltypen
für klinische
Therapien, sowie für
pharmazeutische und biotechnologische Testverfahren bereitzustellen.
Diesbezüglich
erkannten die Erfinder, das ein Herstellungsverfahren skalierbar,
robust, reproduzierbar und einfach sein soll, um die gewünschten
Zelltypen kostengünstig
sowohl in hoher Reinheit als auch mit hohen Ausbeuten bereitstellen
zu können.
Weiter wurde erkannt, dass Zellmengen in einer Größenordnung
von 108–109 Zellen pro Patient für Transplantationstherapien
nach dem derzeitigen Stand der Technik nur mittels Fermentation
in einem geregelten, aktiv begasten, Bioreaktor erhalten werden
können.
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Zur Lösung der Aufgabe erfolgt die
Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen über eine
Differenzierung der Stammzellen und vorzugsweise die Selektion eines
bestimmten Zelltyps in einem geregelten, aktiv begasten Bioreaktor.
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Mit Stammzellen sind im Kontext dieser
Erfindung alle Zellen gemeint, die sich unter Aufrechterhaltung Ihrer
Stammzelleigenschaften selbst erneuern können und in einem als Differenzierung
bezeichneten Vorgang einen oder mehrere spezifische Zelltypen wie
beispielsweise Herzmuskelzellen, neuronale Vorläuferzellen oder Insulin bildende
Zellen bilden können
(Wobus AM. Mol Aspects Med. 2001 Jun; 22(3): 149–64).
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Zu den Stammzelleigenschaften zählt die
Expression bestimmter Stammzellmarker, die je nach Stammtyp verschieden
sein können
(beispielsweise sind SSEA-1, E-Cadherin und Oct-4 Stammzellmarker
für ESC
der Maus; Zandstra PW., et al. Biotechnol Bioeng. 2000 Sep 20; 69(6):
607–17.),
während
SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 und TRA-1-81 Marker für ESC des Menschen sind (Odorico
et al., Stem Cells. 2001; 19(3): 193–204.), sowie die Fähigkeit
zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit
zur Differenzierung.
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Unter der Differenzierung von Stammzellen
ist im Rahmen dieser Erfindung die Bildung spezifischer, spezialisierter
Zellen bzw. Zelltypen oder Gewebe aus Stammzellen gemeint (Gilbert
S.F., Developmental Biology, forth edition, 1994. Sinaer Associate's Inc. Sunderland,
Massachusetts, USA).
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Unter hochreinen Zelltypen sind im
Rahmen dieser Erfindung aus Stammzellen abgeleitete, spezifische
Zelltypen gemeint, die einen Anteil von mindestens 80% einer Lebendzellpopulation
ausmachen.
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Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung klinisch bzw. industriell relevanter Zellmengen
kann während
des Verfahrens eine Zelldichte von mindestens 2 × 106 Zellen
pro Milliliter Kulturmedium, bevorzugt von mindestens 5 × 106 Zellen, besonders bevorzugt von mindestens
1 × 107 Zellen pro Milliliter Kulturmedium erreicht
werden.
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Unter einem Bioreaktor ist in dieser
Erfindung ein Behältnis
gemeint, dass zur Kultivierung eukaryontischer Zellen, vorzugsweise
tierischer Zellen, besonders bevorzugt zur Kultivierung von Säugerzellen
geeignet ist.
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Unter der Vorraussetzung, dass alle
anderen Faktoren wie beispielsweise Nährstoffe nicht limitiert sind,
ist die maximale erreichbare Zelldichte in einem Zellkultursystem
vom Sauerstoffeintrag abhängig
(Prokop A, Rosenberg MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.). In
einem handelsüblichen
Spinnersystem, in dem die Begasung allein über den Kopfraum erfolgt (keine
submerse Begasung wie beispielsweise bei Superspinnern (Braun Biotech)),
ist der maximale Gaseintrag durch die Gasaustauschoberfläche gegeben. In
solchen Spinnersystemen ist die Gasaustauschoberfläche im Verhältnis zum
Kulturvolumen gering. Daher können
in diesem Systemen nur vergleichsweise geringe Zelldichten von etwa
1–2 × 106 Zellen erreicht werden (Prokop A, Rosenberg
MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.).
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Unter submerser Begasung ist im Rahmen
dieser Erfindung eine Begasung über
Geräte
oder technische Vorrichtungen gemeint, die in das Kulturmedium eintauchen.
Hierzu zählen
beispielsweise Sparger oder Microsparger, die zum Einleiten von
Gasen in Bioreaktoren verwendet werden (siehe 3. und 4.).
Weitere Geräte
und technische Vorrichtungen, die zur submersen Begasung geeignet
sind, sind beispielsweise unter Chmiel H. (Chmiel H., Bioprozesstechnik
1&2. Gustav Fischer,
Nr. 1597 & 1634,
ISBN 3825215970 (1991)), Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering
Fundamentals, second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher
Education, (1986)) oder Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik
in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993)). dargestellt.
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Unter aktiver Begasung wird im Rahmen
dieser Erfindung jeder Gaseintrag verstanden, der über eine reine
Kopfraumbegasung unter Normalbedingungen (37°C, 5–10% CO2,
Atmosphärendruck)
hinausgeht. Zur aktiven Begasung von Bioreaktoren eignen sich das
Kulturmedium durchströmende
Gasströme,
der Gaseintrag über
Membranen, chemisch oder elektrochemisch erzeugter Sauerstoffeintrag
oder kontinuierlicher Austausch von an Sauerstoff verarmten Medium
gegen mit Sauerstoff angereichten Medium. Methoden und geeignete
technische Ausrüstungen
zum aktiven Gaseintrag in einen Bioreaktor sind unter Prokop A.
und Rosenberg MZ. (Prokop A, Rosenberg MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol.
1989; 39: 29–71.)
Chmiel H. (Chmiel H., Bioprozesstechnik 1&2. Gustav Fischer, Nr. 1597 & 1634, ISBN 3825215970
(1991)), Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering Fundamentals,
second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986))
oder Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie,
Springer, ISBN 3540561900 (1993)) beschrieben.
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Unter einem geregelten Bioreaktor
sind Bioreaktor-Systeme gemeint, bei denen mindestens der Sauerstoffpartialdruck
im Kulturmedium mit geeigneten Geräten gemessen und geregelt werden
wird. Geeignete Geräte
zur Messung des Sauerstoffpartialdrucks sind beispielsweise Sauerstoffelektroden.
Der Sauerstoffpartialdruck kann beispielsweise über die Menge und die Zusammensetzung
des verwendeten Gasgemischs (z.B. Luft oder ein Gemisch aus Luft
und/oder Sauerstoff und/oder Stickstoff und/oder Kohlendioxyd) geregelt
werden. Geeignete Geräte
zur Messung und Regelung des Sauerstoffpartialdrucks sind unter
Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering Fundamentals,
second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) oder
Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie,
Springer, ISBN 3540561900 (1993)) beschrieben.
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In einer bevorzugten Ausführung verfügt ein geregelter
Bioreaktor über
Geräte
zur Messung und Regelung des pH-Werts. Beispielsweise kann der pH-Wert
mit einer pH-Elektrode gemessen werden. Die Regelung des pH-Werts
kann z.B. durch den Anteil an Kohlendioxyd am zur Begasung verwendeten
Gasgemisch oder durch Zugabe von Säuren oder Laugen zum Kulturmedium
geregelt werden. Geeignete Geräte
zur Messung und Regelung des pH-Werts sind unter Bailey, JE. (Bailey,
JE., Biochemical Engeneering Fundamentals, second edition, MCGraw-Hill,
Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) oder Jackson AT.
(Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer,
ISBN 3540561900 (1993)) beschrieben.
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Ein besonderer Vorteil eines geregelten
Bioreaktors ist, dass ein bestimmter Sauerstoffpartialdruck und/oder
ein bestimmter pH-Wert während
einer Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen konstant gehalten
werden kann. Beide Parameter können
einen Einfluss auf die Differenzierung von Stammzellen haben und
beispielsweise die Bildung eines bestimmten Zelltyps während der
Differenzierung fördern
oder hemmen. Durch Konstanthalten beider Parameter wird daher die
Reproduzierbarkeit von Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen
verbessert.
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In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren
in einem Rührkessel-Bioreaktor durchgeführt und
der aktive Gaseintrag erfolgt vorzugsweise mit Hilfe eines Spargers,
besonders bevorzugt mit einem Mikrosparger. Für die aktive Begasung eignet
sich reiner Sauerstoff, Luft oder ein zusammengesetztes Gasgemisch,
das neben Sauerstoff eine Beimischung von Stickstoff und/oder Kohlendioxid
und/oder anderer Gasen enthalten kann. Besonders geeignet ist ein
Verfahren bei dem der Sauerstoffpartialdruck in der Suspension mit
einer Elektrode gemessen wird. Anhand dieser Messung wird mittels
einer Regeleinheit der Gaseintrag in den Bioreaktor und damit der
Sauerstoffpartialdruck im Medium gesteuert.
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Besonders bevorzugt wird der pH-Wert
im Kulturmedium mit einer geeigneten Elektrode gemessen und über eine
entsprechende Regeleinheit durch Zusatz geeigneter Substanzen wie
beispielsweise Kohlendioxid, Säuren
oder Laugen geregelt.
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Die Bildung kleiner Körper, die
bevorzugt eine Zellzahl von 1–1.000
Zellen pro Körper
aufweisen, und ein Anwachsen der Körper zu einer Größe von 20.000–30.000
Zellen pro EB für
die Differenzierung von ESC in eine Vielzahl von Zelltypen, unter
anderem in Herzmuskelzellen, ist vorteilhaft. Wenn die ESC hingegen durch
die Fusion von EBs und/oder das Verklumpen von Einzelzellen aufgrund
ungeeigneter Verfahren zu großen
Klumpen fusionieren, wird die Differenzierung zu Herzmuskelzellen
und anderen Zelltypen gehemmt (Dang SM. et al., Biotechnol Bioeng
2002 May 20; 78(4): 442–53).
Das erfindungsgemäße Verfahren
wird bevorzugt so durchgeführt,
dass, ausgehend von einer Zellsuspension aus Stammzellen innerhalb
von 1–3
Tagen Körper
mit einer Größe von etwa
1-1.000 Zellen gebildet werden. Weiterhin werden die Bedingungen
so gewählt,
dass die Körper
innerhalb von 3–9
Tagen zu einer Größe von 5.000–30.000
Zellen pro Körper
anwachsen können.
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Während
der Kultivierung erfolgt ein Anwachsen der Zellen im aktiv begasten
und geregelten Bioreaktor auf eine Zelldichte von über 2×106 Zellen/ml, weiter bevorzugt auf wenigstens
5×106 Zellen/ml und am Bevorzugtesten auf wenigstens
1×107 Zellen/ml. Damit ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
erstmals möglich
bei der Differenzierung von Stammzellen eine Zelldichte zu erreichen,
die bisher nur von der Hochzelldichte-Fermentation herkömmlicher Zelllinien bekannt
ist.
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Erstmals konnte mit Hilfe der Rührgeschwindigkeit
im aktiv begasten, geregelten Bioreaktor die Sphäroid-Bildung und damit die
Differenzierung von ESC gezielt gesteuert werden, was in den Beispielen
3 und 4 durch die reproduzierbare Entstehung kontrahierender Herzmuskelzellen
in hoher Zellzahl nachgewiesen wurde. Bei der Selektion eines spezifischen
Zelltyps ist die Reinheit des selektierten Zelltyps so einstellbar,
daß 3 der
Anteil anderer Zelltypen weniger als 20%, besser unter 10%, bevorzugt
unter 5%, weiter bevorzugt höchstens
2%, insbesondere unter 1% und am bevorzugtesten höchstens
0,3% beträgt.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
lassen sich in einem aktiv begasten und geregelten Bioreaktor höchstkonzentrierte
Zellsuspensionen von mindestens 2×106 Zellen/ml
bereitstellen, vorzugsweise mit 5×106 Zellen/ml
und am Bevorzugtesten mit wenigstens 1×107 Zellen/ml,
bestehend aus einem Medium und darin enthaltenen aus Stammzellen
abgeleiteten Sphäroiden.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind Zellsuspensionen bestehend aus einem Medium und darin enthaltenen
Sphäroiden
eines hochreinen, aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps erhältlich.
Nach Selektion lassen sich derartige hochreine Zellsuspensionen
in einem aktiv begasten und geregelten Bioreaktor mit einer Zellkonzentration
von mindestens 1×105 Zellen/ml bereitstellen, vorzugsweise mit
mindestens 2×105 Zellen/ml, weiter bevorzugt mit 5×105 Zellen/ml und am Bevorzugtesten mit wenigstens
6×105 Zellen/ml.
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Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen können folgende
Schritte umfassen:
- 1. Herstellung und Kultivierung
genetisch modifizierter Stammzellen.
- 2. Herstellung einer Zellsuspension aus Stammzellen gemäß Punkt
1.
- 3. Expansion von Stammzellen gemäß Punkt 2. in einem aktiv begasten,
geregelten Biorektor unter Verwendung eines Expansionsmediums, dass
die Differenzierung der Stammzellen verhindert.
- 4. Differenzierung von Stammzellen unter Verwendung der Zellsuspension
aus Punk 2. oder 3., bestehend aus Einzelzellen und/oder Sphäroiden,
in einem aktiv begasten, geregelten Biorektor unter Verwendung eines
Mediums in der Weise, dass die Differenzierung in den/die gewünschten
Zelltyp(en) ermöglicht
wird.
- 5. Selektion hochreiner Zelltypen aus differenzierenden Stammzellen
nach Punkt 4. unter Verwendung geeigneter, genetisch modifizierter
Stammzellen nach Punkt 1. in der Weise, dass durch Zugabe eines
entsprechenden Antibiotikums nur der/die gewünschte(n) Zelltyp(en) in einem
aktiv begasten Bioreaktor angereichert wird/werden.
- 6. Herstellung einer homogenen Suspension hochreiner Zelltypen.
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Methoden zur Herstellung von genetisch
modifizierten Stammzellen insbesondere embryonaler Stammzellen (ESC),
sowie Methoden zur Selektion eines bestimmten Zelltyps aus Stammzellen
sind von Klug et al. (J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) und
Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2): 157–62) beschrieben. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird hierzu ein Nukleinsäure-Fragment,
das spezifisch die Expression eines Gens in dem gewünschten
Zelltyp steuert, mit einem Reporter-Gen unter Bildung eines Reporter-Gen-Konstrukts gekoppelt.
Das Reporter-Gen-Konstrukt wird in mindestens eine Stammzelle unter
Bildung genetisch modifizierter Stammzelle(n) eingeführt. Die
genetisch modifizierten Stammzellen werden expandiert und differenziert.
Das eingeführte
Reporter-Gen-Konstrukt ermöglicht
die Selektion eines bestimmten Zelltyps aus den differenzierenden
Stammzellen.
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Als Nukleinsäure-Fragment, das spezifisch
die Expression eines Reporter-Gens in dem gewünschten Zelltyp steuert, eignet
sich im Prinzip jeder Zelltyp-spezifische Promoter. Beispielsweise
wurden für
die Selektion von Herzmuskelzellen der alpha-MHC Promoter (Klug
et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) oder der MLC-2v Promoter
(Muller M. et al. FASEB J. 2000 Dec; 14(15): 2540–8.) verwendet,
die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
besonderst bevorzugt sind. Für
die Selektion von Insulin produzierenden Zellen ist beispielsweise
der Insulin-Gen Promoter geeignet (Soria et al. Diabetes. 2000 Feb.;
49 (2): 157–62),
während
die Selektion von Endothelzellen bevorzugt unter Verwendung des
E-Cadherin-, des
Endomuzin-, oder des Flk1-Promoters durchgeführt werden kann.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das zur Selektion verwendete Reporter-Gen ein Antibiotikum-Resistenz-Gen
und die Selektion eines bestimmten Zelltyps erfolgt durch Zugabe
eines geeigneten Antibiotikums im aktiv begasten, geregelten Bioreaktor.
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Eine Zellsuspension zur Sphäroid-Bildung
nach dem erfindungsgemäßen Verfahrens
kann mittels enzymatischem Verdau oder durch andere bekannte oder
geeignete Methoden aus geeigneten Stammzellen hergestellt werden.
Die gewünschte
Zelldichte wird durch Verwendung eines geeigneten Zellkulturmediums
eingestellt.
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Die Expansion und Differenzierung
von Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, ebenso wie die
Selektion eines bestimmten Zelltyps kann in einem durchgehenden
Bioprozess im selben Bioreaktor durchgeführt werden. Vorzugsweise wird
das erfindungsgemäße Verfahren
in Suspension durchgeführt.
In einer einfachen Ausführung
wird die Suspension zusätzlich
gerührt.
Hierzu eignet sich beispielsweise ein Rührkessel-Bioreaktor.
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Vor Beginn der Differenzierung kann
eine Expansion der Stammzellen erfolgen. Hierzu wird vorzugsweise
ein Medium verwendet, dass die Differenzierung der Stammzellen verhindert.
Bei der Verwendung von ESC der Maus kann dem Medium das Cytokin
Leukemia Inhibitory Factor (LIF) hinzugefügt werden, um die Differenzierung
zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführung wird die Expansion von
Stammzellen in Suspension auf Microcarriern durchgeführt. Geeignete
Microcarrier, die für
die Expansion von ESC bevorzugt verwendet werden, sind: Gelatine-,
Fibronectin, Laminin- oder Matrigel-beschichtete Cytodex 1 oder
Microhex Microcarrier (siehe Beispiel 2). Microcarrier, die für die Expansion
anderer Stammzellen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. In
einer weiter bevorzugten Ausführung
werden Stammzellen in Suspension in Sphäroiden expandiert.
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Zur Differenzierung werden die Stammzellen
vorzugsweise in einem Medium kultiviert, dass für die Differenzierung geeignet
ist. Hierbei kann vorzugsweise eine weitere Expansion der Zellen
erfolgen. Um die Differenzierung in einen bestimmten Zelltyp zu
steuern, können
dem Medium Substanzen zugegeben werden. Eine Differenzierung zu
Herzmuskelzellen kann Vorzugsweise durch die Zugabe von DMSO und
besonders bevorzugt durch Zugabe von Retinsäure zum Kulturmedium bewirkt
werden (Beispiel 4). Eine Differenzierung zu Insulin-produzierenden Zellen
erfolgt vorzugsweise durch die Zugabe von Nikotinamid.
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Die Expansion und Differenzierung
von Stammzellen sowie die Selektion eines bestimmten Zelltyps wird
der Einheit halber in einem Rührkesselbioreaktor
durchgeführt,
ist jedoch auch auf andere Reaktortypen übertragbar. Beispielsweise
kann das Verfahren in einer Blasensäule, einem Airlifter oder einem
Fließbettreaktor
mit und ohne Wirbelschicht durchgeführt werden (siehe Schema der
Bioreaktoren in 3).
In einer bevorzugten Ausführung
hat der verwendete Bioreaktor ein Reaktorvolumen von mindestens
0,25 Litern, weiter bevorzugt wird ein Reaktorvolumen von mindestens
0,5 Litern, insbesondere ein Volumen von mindestens 1 Liter und
am meisten bevorzugt ein Volumen von mindestens 2 Litern. Das maximale
Reaktorvolumen, das zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignet ist, ist im Prinzip nur durch die technische und physikalische
Machbarkeit begrenzt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in den größten, technisch
realisierbaren Bioreaktoren von derzeit etwa 10.000 Litern durchgeführt werden.
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In einer bevorzugten Ausführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Differenzierung von Stammzellen durch die Bildung von Sphäroiden durchgeführt. Bei
der bevorzugten Verwendung von ESC werden diese Sphäroide als
Embryoid Bodies (EBs) bezeichnet. Erstmals konnte mit Hilfe des
erfindungsgemäßen Verfahrens
die Bildung von EBs in einem geregelten Rührkessel-Bioreaktor direkt
aus einer Stammzellsuspension heraus durchgeführt werden. Im Verlauf der
Differenzierung wachsen die entstandenen Sphäroide bezüglich des Durchmessers und
der Zellzahl an, wobei die Anzahl der Zellen pro EB mit Hilfe der
Rührerdrehzahl
gezielt geregelt werden kann. Vorzugsweise werden die Bedingungen
so gewählt,
dass ein Sphäroidwachstum
auf durchschnittlich unter 30.000 Zellen je Sphäroid begrenzt ist. Das bedeutet,
dass die durchschnittliche Zellzahl je Sphäroid begrenzt sein soll, während ein
Teil der Sphäroide
auch mehr Zellen enthalten kann.
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Die Bildung von Sphäroiden im
aktiv begasten Rührkessel-Bioreaktor
wird unter anderem von folgenden Faktoren beeinflusst: die Viskosität des verwendeten
Kulturmediums, die Art des verwendeten Rührers (Größe und Geometrie), die Art
der Begasung, die Art des verwendeten Bioreaktors (Größe und Geometrie) und
die Rührgeschwindigkeit.
Weiterhin haben die Zelldichte sowie der verwendete Stammzelltyp
selbst einen Einfluss auf die Sphäroid-Bildung und die Sphäroid-Größe. Analog
den Beispielen in dieser Erfindung können die Sphäroid-Größe (Zellzahl
pro Sphäroid)
und die Anzahl der gebildeten Sphäroide im Rührkessel-Bioreaktor durch Einstellen
der Rührgeschwindigkeit
kontrolliert werden, sofern andere Faktoren konstant gehalten werden.
Naturgemäß verändert sich
die Sphäroid-Größe und die
Anzahl der Sphäroide über den
Prozessverlauf aufgrund des Zellwachstums und der voranschreitenden
Zelldifferenzierung. Analog zu den dargestellten Beispielen kann
die Rührgeschwindigkeit
so eingestellt werden, dass Sphäroide
einer Größe erhalten
werden, die zu einer optimalen Stammzelldifferenzierung in den gewünschten,
differenzierten Zelltyp führt.
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In einer Ausführungsform wird der erfindungsgemäße Bioprozess
mit ESC durchgeführt
beispielsweise mit ESC der Maus. Die ESC werden expandiert und differenziert,
um beliebige, hochreine Zelltypen aus Stammzellen oder in einer
bevorzugten Ausführungsform
hochreine Herzmuskelzellen zu erhalten.
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In einer bevorzugten Ausführung wird
die Expansion und die Differenzierung von Stammzellen durch die
Bildung von Sphäroiden
in Suspension durchgeführt.
Bei gegebener, konstanter Reaktorgeometrie kann die Sphäroidgröße in einer
Blasensäule
oder einem Airlifter beispielsweise mit Hilfe der Strömungsgeschwindigkeit
des Mediums bzw. der Menge an durchströmendem Gas gesteuert werden.
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In einem Fließbettreaktor mit Wirbelschicht
kann die Bildung von Sphäroiden
durch die im Fleißbett verwendeten
Partikel kontrolliert werden. Unter Partikeln ist jede Art von Partikeln
gemeint, die zur Verwendung in einem Fließbettreaktor geeignet sind,
unabhängig
davon ob sie aus Glas, Kunststoff, Metall, Porzellan oder anderen
Materialien bestehen und welche Größe diese haben. Es ist offensichtlich,
dass die der Zellsuspension hinzugefügten Partikel einen Einfluss
auf die Bildung von Sphäroiden
und die Sphäroid-Größe haben. Werden
die zugegebenen Partikel – Art
und Konzentration – konstant
gehalten, kann die Sphäroid-Bildung und die Sphäroid-Größe im Laufe
des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit Hilfe der Strömungsgeschwindigkeit kontrolliert
werden.
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In einem Fließbettreaktor ohne Wirbelschicht,
lässt sich
die Sphäroidbildung
mit Hilfe der Strömungsgeschwindigkeit
des Mediums kontrollieren.
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Die vorliegende Erfindung stellt
erstmals Verfahren bereit mit dem Zellsuspensionen erhalten werden können, bestehend
aus einem Medium und darin enthaltenen Zellen eines hochreinen,
aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps wobei die Zellen aus Körpern von
weniger als 1000 Zellen, vorzugsweise maximal 100 Zellen weiter
bevorzugt maximal 10 Zellen und am bevorzugtesten aus einer Zelle
bestehen. Bevorzugt wird eine Zellsuspension des gewünschten
Zelltyps bereitgestellt, die fast ausschließlich aus Einzelzellen besteht
und die Zellen gemessen in einem Trypanblau Assay zu mindestens
90% aus lebenden Zellen bestehen, vorzugsweise zu 95% lebenden Zellen
und am meisten bevorzugt zu 97% aus lebenden Zellen.
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Um aus Sphäroiden oder Zellaggregaten
eines hochreinen Zelltyps, Suspensionen zu erhalten, die fast ausschließlich aus
vitalen Einzelzellen bestehen, wird beispielsweise ein Verfahren gewählt, bei
dem die Zellaggregate zunächst
in einem geeigneten Puffer inkubiert werden. Bevorzugte Puffer sind
PBS oder HEPES und besonders bevorzugt sind Puffer, die einen geringen
Gehalt an Kalzium-Ionen aufweisen. Die Sphäroide oder Zellaggregate werden
mindestens 5 Minuten, bevorzugt mindestens 15 Minuten insbesondere
mindestens 30 min bei einer bevorzugten Temperatur von beispielsweise
36–38°C und der
Einfachheit halber unter mechanischer Behandlung inkubiert. Als
mechanische Behandlung kommt jede Methode in Frage, bei der die Zellen
gerührt,
geschüttelt
oder auf eine andere Weise bewegt werden, ohne die Zellen hierbei
zu schädigen. Besonderst
bevorzugt sind mechanische Behandlungen, die im technischen Maßstab beispielsweise
in einem geeigneten Bioreaktor erfolgen können. Hierzu zählt beispielsweise
das Rühren
mit einem geeigneten Rührer in
einem Rührkessel-Bioreaktor. Der Inkubation
in einem Puffer kann eine enzymatische Behandlung beispielsweise
mit Proteasen folgen. Geeignete Enzyme oder Enzym-Gemische zum Vereinzeln
von Zellen sind Accutase, Collagenase, Dispase oder Trypsin, wobei
Trypsin besonderst bevorzugt wird.
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In einem bevorzugten Verfahren werden
die Sphäroide
oder Zellaggregate mindestens 5 Minuten, bevorzugt mindestens 15
Minuten am meisten bevorzugt mindestens 30 min bei einer Temperatur
von ungefähr 37°C und bevorzugter
Weise unter mechanischer Behandlung mit dem Enzym oder Enzym-Gemisch
inkubiert. Bevorzugt sind mechanische Behandlungen, die im technischen
Maßstab
in einem geeigneten Bioreaktor erfolgen können. Die enzymatische Behandlung
wird bevorzugt in der Weise durchgeführt, dass eine Suspension,
die vorzugsweise fast ausschließlich
aus Einzelzellen besteht, erhalten wird. Die Enzymatische Behandlung
kann beispielsweise durch die Zugabe von Serum oder geeigneten Puffern,
die die Wirkung des Enzyms hemmen, gestoppt werden. Auf diese Weise
lassen sich hochreine Zellsuspensionen herstellen, die mehr als 50%
Einzelzellen, bevorzugt mindestens 80% Einzelzellen und insbesondere über 90%
Einzelzellen aufweisen.
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Die Vitalität der Zellen kann beispielsweise
mit einem Trypanblau Assay bestimmt werden. Der Grad der Zellvereinzelung
kann beispielsweise durch eine lichtmikroskopische Analyse im Phasenkontrast
bestimmt werden. Eine weitere Möglichkeit
zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Sphäroiden ist
die Behandlung mit Ultraschall. Die vereinzelten Zellen eines bestimmten,
hochreinen Zelltyps können
in einer geeigneten Konzentration in jedem geeigneten Puffer oder
Medium suspendiert werden, um erfindungsgemäße Suspensionen für die Transplantation,
für das
Tissue Engineering oder für
die Beschichtung von Platten für
die Pharmaforschung oder die Medizin- und Biotechnologie zu erhalten,
um nur einige Anwendungsmöglichkeiten
zu nennen.
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Es wird vermutet, das die erfindungsgemäßen Suspensionen,
die weitgehend aus Einzelzellen bestehen, bei der Transplantation
gegenüber
größeren Sphäroiden oder
Zellaggregaten verbesserte Chancen für ein Anwachsen im Organ haben.
In der Regel werden die Zellen bei der Transplantation durch dünne Kanülen einer
Spritze oder eines Katheders gedrückt wobei Einzelzellen gegenüber größeren Körpern zerstörenden Scherkräften weit
weniger ausgesetzt scheinen. Weiterhin werden Einzelzellen oder
kleine Zellaggregate beim Anlagern und Anwachsen an vorhandene Blutgefäße größere Überlebenschancen
haben, da eine schnelle Versorgung jeder einzelnen Zelle mit Nährstoffen
und Sauerstoff eher gewährleistet
ist. Das könnte
für erfindungsgemäße Suspensionen
aus hochreinen Herzmuskelzellen besonders vorteilhaft sein, da Herzmuskelzellen
gegenüber
einer Sauerstoffunterversorgung besonderst empfindlich sind. Das
bessere Anwachsverhalten implantierter Zellen erfindungsgemäßer Suspensionen
ermöglicht
verbesserte Therapien durch weniger benötigte Transplantatzellen einerseits
und weniger absterbende Implantatzellen andererseits. Somit wird
die Belastung während
einer Therapie durch tote Zellen und überflüssiges Suspensionsvolumen verringert
und Therapiekosten werden bei verbesserter Genesung und erniedrigten
Zellzahlen gesenkt. Ein weiterer Vorteil erfindungsgemäßer Einzelzellsuspensionen
ist ein gleichmäßiges Verteilen
des jeweiligen Zelltyps im Zielgewebe.
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Die Bereitstellung homogenerer Einzellzellsuspensionen
eines bestimmten Zelltyps ist jedoch nicht nur zur Behandlung von
Herzerkrankungen wie dem Herzinfarkt oder beim Zellverlust durch
Entzündungen
am Herzen entscheidend. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens,
wird es erstmals möglich,
hochreine erfindungsgemäße Zellsuspensionen
in ausreichender Menge und Qualität zur Verfügung zu stellen, um zellbasierte
Therapien wie das Verabreichen von Dopamin-produzierenden Zellen
bei Parkinson Patienten, die Injektion von Nervenzellen in das Rückenmark
zur Heilung Querschnittsgelähmter,
die Transplantation von Leberzellen bei Leberschäden oder die Bereitstellung
von Insulin produzierenden Zellen bei Patienten mit Diabetes durchführen zu
können.
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Zusammenfassend kann gesagt werden,
dass die erfindungsgemäßen Suspensionen
hochreiner Zelltypen, insbesondere Einzelzellsuspensionen, für ein gleichmäßiges Verteilen
des jeweiligen Zelltyps im Zielgewebe und ein effizientes Anlagern
an vorhandene Blutgefäße besonders
geeignet sind. Daher sind sie zur Verwendung in zellbasierten Therapien
prädestiniert.
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In der Pharma Industrie werden Hochdurchsatzverfahren
eingesetzt, bei denen Zellen, die auf Zellkulturplatten verschiedener
Formate aufgebracht sind, mit einer Vielzahl von Substanzen behandelt
werden. Ziel ist die Identifizierung und Testung neuer Wirkstoffe.
Bisher werden bei diesen Verfahren in der Regel etablierte Zelllinien
wie HEK-293 Zellen, CHO-K1 Zellen aus dem Hamster oder Tumorziellinien
wie COS-7 Zellen verwendet (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc
Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.).
Erfindungsgemäß wird es
nun ermöglicht,
Hochdurchsatzverfahren mit spezifischen Zelltypen wie Herzmuskelzellen,
Insulin produzierenden Zellen, Gefäßendothelzellen, Neuronalen
Zellen oder Leberzellen durchzuführen,
um nur einige zu nennen. Gegenüber
Fibroblasten- oder Tumorzelllinien haben differenzierte Zellen eines
bestimmten Typs den Vorteil, dass sie alle Gene exprimieren und
damit alle Proteine enthalten, die für den jeweiligen Zelltyp typisch sind,
inklusive pharmakologisch wichtiger Proteine wie Rezeptoren, Kinasen,
Ionenkanäle
und Faktoren, die an Signaltransduktionskaskaden beteiligt sind,
um nur einige zu nennen. Mit Hilfe spezifischer Zelltypen ist es daher
möglich
Wirksubstanzen zu identifizieren und zu testen, die eine multiple
Wirkung auf zahlreiche Makromoleküle in der Zelle haben (Numann
R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.). Erfindungsgemäß ist die
Anwendung spezifischer Zelltypen als die Vorraussetzung zur Etablierung
innovativer Verfahren zur Identifizierung neuer Zielgene („Target
Identification"),
zur Validierung und Charakterisierung bereits identifizierter Zielgene
(„Target
Validation") und
zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirksubstanzen geschaffen,
um nur einige Verfahren zu nennen. Im Prinzip können für solche Verfahren primäre Zellen verwendet
werden, die aus Organen oder Geweben von Tieren isoliert werden.
Ein entscheidender Nachteil ist, dass die Qualität von Primärzellen aufgrund von Alters-
und/oder anderen, individuellen Unterschieden von Tier zu Tier schwankt.
Organe und Gewebe bestehen in der Regel aus einer Vielzahl unterschiedlicher
Zelltypen und Methoden zur Isolation eines gewünschten Zelltyps aus dem komplexen
Gewebe bestehen oft nicht. Darüber
hinaus ist es für
viele Hochdurchsatzverfahren entscheidend, dass die verwendeten
Zellen genetisch verändert
werden können,
um ein auswertbares Signal in einem entsprechenden Verfahren zu
erzeugen. Die genetische Modifikation primärer Zellen ist jedoch in der
Regel technisch aufwendig. Die Verwendung von Primärzellen
ist aus ethischen Gründen
ausgeschlossen, sobald es sich um Zellen aus dem Menschen handelt wie
dessen Herzmuskelzellen, pankreatische Beta Zellen oder Leberzellen.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es erstmals möglich,
reproduzierbar, hochreine Zellen eines bestimmten Typs in einer
Menge bereitzustellen, die für
Pharmakologische-, Medizinische- und Biotechnologische-Verfahren
geeignet sind. Ein weiterer, wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Zellsuspensionen
und Einzelzellen ist die Möglichkeit,
die Zellen auf der Ebene der Stammzelle genetisch zu modifizieren.
Damit können
interessante Ziel-Gene nach Bedarf aktiviert oder inaktiviert werden.
Eine weitere Möglichkeit
ist die Einführung
von Reporter-Genen und/oder Reporter-Gen-Konstrukten in Stammzellen.
Diese Konstrukte können so
gewählt
werden, dass in den erfindungsgemäßen Zellen ein Signal erzeugt
wird, welches in Pharmakologischen-, Medizinischen- oder Biotechnologischen-Verfahren auswertbar
ist.
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Für
Pharmakologische-, Medizinische- und Biotechnologische-Verfahren
ist es entscheidend, dass Formate, bevorzugt Plattenformate, vorliegen,
die einen hochreinen Zelltyp in einer reproduzierbaren Zellzahl und
Zellverteilung enthalten. Als Plattenformate sind beispielsweise
Multiwell-Platten geeignet, die üblicherweise
6 Wells, 24 Wells, 96 Wells, 384 Wells oder 1536 Wells enthalten.
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Die vorliegende Erfindung stellt
erstmals Formate zur Verfügung,
die Formateinheiten aufweist die wiederum Bereiche aufweisen in
denen ein Zelltyp homogen verteilt vorliegt. In einer bevorzugten
Ausführung ist
der Zelltyp eine Herzmuskelzelle. In einer weiter bevorzugten Ausführung werden
die Zellen auf den Formaten in einer Dichte und einer Verteilung
eingesetzt, in der sich die meisten, vorzugsweise alle Zellen berühren. Weiter
bevorzugt ist eine Ausführung,
bei der die Zellen in den Formaten in mindestens einer Dimension nahezu
einschichtig vorliegen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden
hochreine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
aus ESC selektierte Herzmuskelzellen verwendet, die homogen und
einschichtig auf Platten aufgetragen werden und sich weitestgehend
berühren,
so das ein funktionelles Synzytium entsteht. In einer am meisten
bevorzugten Ausführung
enthalten die verwendeten Herzmuskelzellen mindestens ein, bevorzugt
zwei Reporter-Gen-Konstrukte, die zur Verwendung in Reportergen-Assays
geeignet sind.
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Unter Formaten im Sinne der Endung
versteht man Anordnungen, Träger
und Matrizes mit Beschichtungen oder ineinandergreifende Strukturen.
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Die Erfindung bezieht sich weiterhin
auf ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gewebes oder Organs
enthaltend mindestens eine Zelle, hergestellt nach dem weiter oben
beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren
zur Selektion bestimmter Zelltypen aus Stammzellen. Zur Erzeugung
des Organs oder Gewebes kann ein oder mehrere erfindungsgemäßer) Zelltypen)
miteinander, mit anderen geeigneten Zelltypen oder mit geeigneten
Trägern
kombiniert werden. Unter anderen „geeigneten Zelltypen" im Sinne der Erfindung
wird eine nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Zelle
verstanden, die für
die Bildung des künstlichen
Organs oder Gewebes erforderlich ist oder die Teil des künstlichen
Gewebes oder Organs ist.
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Unter einem Träger im Sinne der Erfindung
versteht man eine Substanz, Molekül, Material oder Matrix, die
(das) als chemische, physiologische oder mechanische Unterstützung für das herzustellende
Gewebe oder Organ dient. Geeignete Träger sind beispielsweise Zellkulturplatten
verschiedener Formate.
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand
von Beispielen mit Bezug auf Figuren veranschaulicht. Die generelle
Gültigkeit
der Erfindung wie oben beschrieben wird durch die Beispiele nicht
eingeschränkt.
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Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
71 ESC, die 48 Stunden auf Microcarriern kultiviert werden (Lichtmikroskopische
Aufnahme im Phasenkontrast). (A) Gelatine-beschichtete Microhex Microcarrier (Durchmesser:
125μm);
(B) Fibronektin-beschichtete
Cytodex 1 Microcarrier (Durchmesser: 180μm). Beide Carrier sind geeignet,
um ein Anheften und kultivieren von ESC zu ermöglichen.
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2 zeigt
die durchschnittlichen Wachstumsraten u (siehe Gleichung 1) von
zwei ESC Monolayerkulturen (gemittelt über jeweils 7 Passagen), und
die durchschnittlichen Wachstumsraten von vier ESC Microcarrierkulturen
kultiviert auf Fibronectin beschichteten Cytodex 1 Microcarriern
in Spinnern (gemittelt über
jeweils 3 Passagen). Die Wachstumsraten der ESC sind in beiden Kultursystemen
(Monolayerkultur bzw. Suspensionskultur auf Microcarriern) gewissen
Schwankungen unterworfen. Die mittleren Wachstumsraten haben über die
gemessene Passagenzahl die gleiche Größenordnung.
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3 zeigt
schematisch den Aufbau verschiedener Spinnersysteme (1.A-D) und
aktiv begaste Bioreaktorsysteme. Die offenen, weiß gefüllten Kreise
bezeichnen Gasblasen, gefüllte
Kreise bezeichnen Mikropartikel (unter 2.-4.). Die großen, schwarzen
Pfeile bezeichnen den Gaseintrag in das jeweilige System. Die feinen
Pfeile in 1.A-D bezeichnen die Strömungs- und die Umdrehungsrichtung
des Rührers.
Schwach angedeutete Punkte (1.A-D) bezeichnen Zellen, Microcarrier
oder Sphäroide.
Unter 1.A-D sind verschiedene Spinnersysteme gezeigt, die sich im
wesentlichen im verwendeten Rührer
unterscheiden. Der Gaseintrag erfolgt bei diesen Systemen allein überden Kopfraum.
Unter 2. ist der schematische Aufbau eines Rührkesselbioreaktors gezeigt,
bei dem lediglich das aktive Begasungssystem in Form von A eines
Microspargers und B in Form eines Begasungsrings hervorgehoben ist.
In schwarz ist ein Blattrührer
angedeutet. Unter 3. ist der schematische Aufbau verschiedener Typen
von Airlifter Bioreaktoren gezeigt. A Blasensäule, B Airlifter Bioreaktor
mit internem Loop und C Airlift Bioreaktor mit externem Loop. Unter
4. sind Bioreaktoren mit blasenfreier Begasung gezeigt. A Rührkesselbioreaktor
mit Begasungskorb, B Fließbettreaktor
mit und C ohne Wirbelschicht. Potentiell sind alle dargestellten
aktiv begasten Reaktortypen geeignet, um die Kultivierung und Differenzierung
von Stammzellen in hoher Dichte durchzuführen, um damit spezifische
Zelltypen aus differenzierten Stammzellen im technischen Maßstab bereitstellen
zu können.
Die Bildung von Sphäroiden,
die für
die Differenzierung mancher Stammzellen entscheidend ist, kann je
nach Reaktortyp durch die Rührgeschwindigkeit, die
Fließgeschwindigkeit
des Kulturmediums, die Art der erzeugten Strömung oder durch die Art des
verwendeten Fließbetts
beeinflusst und gesteuert werden.
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4A beschreibt
den schematischen Aufbau eines geregelten, aktiv begasten Rührkessel-Bioreaktors
mit eingezeichneter Meß-
und Regeleinheit für
Gase, Temperatur und pH. Zusätzlich
sind Systeme zur Medienversorgung, Probentnahme und Ernte gekennzeichnet.
B und C zeigt schematisch auftretende Strömungen in einem Medium bzw.
einer Zellsuspension bei Verwendung von B, eines Blattrührers mit
schräggestellten Blättern und
C, eines Paddelrührers
(Rushton turbine). Im Prinzip sollten beide Rührertypen zur Erzeugung geeigneter
Sphäroide
aus Stammzellen in einem Bioreaktor geeignet sein, In dieser Erfindung
wird die kontrollierte Bildung von Sphäroiden beispielhaft mit einem
unter B gezeigten Blattrührer
durchgeführt
(siehe Beispiel 4).
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5 Zur
Optimierung der EB-Bildung, Stammzellexpansion und Differenzierung
wurden ESC über
9 Tage bei Rührerdrehzahlen
von 35, 65, 80 und 120 Upm im Bioreaktor kultiviert. In Diagramm
A sind die Zellzahlen der entsprechenden Bioreaktorläufe dargestellt.
Diagramm B zeigt die Vervielfachung der Anfangszelldichte (Anfangszelldichte
pro Endzelldichte) nach 9 Tagen Kultivierung im Bioreaktor bei Rührerdrehzahlen von
35, 60, 80 und 120 Upm. Wie aus den Diagrammen hervorgeht wird die
höchste
Zelldichte (1,29×107 Zellen/ml) und folglich die größte Vervielfachung
der Anfangszellzahl (129fach) in dem verwendeten System bei einer
Rührergeschwindigkeit
von 65 Upm erreicht. Bei dieser Rührergeschwindigkeit wird gleichzeitig
ein gleichmäßiges Anwachsen
der EBs erhalten. Die erfolgreiche Differenzierung wird durch die
Bildung von Herzmuskelzellen nachgewiesen
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6 zeigt
die Bildung von EBs im Rührkessel-Bioreaktor
bei 65 Upm (siehe Beispiel 3). Zu Beginn der Kultivierung liegen
die ESC als Einzelzellen in Suspension vor (Start). Im weiteren
Verlauf (Tag1) bilden sich Sphäroide,
bestehend aus wenigen (~10–100)
Zellen. Die Bilder (Lichtmikroskopische Aufnahmen im Phasenkontrast)
zeigen deutlich die Zunahme der EB-Größe während der weiteren Kultivierung über 9 Tage. Zum
Größenvergleich
ist ein schwarzer Balken mit einer Länge von 100μm dargestellt. Die EBs zeichnen
sich durch eine relativ gleichmäßige Form
und Größe aus.
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7A zeigt
ein Diagramm, in dem die EB-Dichte (EB/ml Kulturmedium) in Abhängigkeit
der Rührerdrehzahl über die
Kultivierungsdauer dargestellt ist. Ausgenommen bei einer Rührerdrehzahl
von 35Upm, bei der die ESC offensichtlich sehr früh zu wenigen,
großen
Sphäroiden
fusionieren, wird bei allen Umdrehungsgeschwindigkeiten zunächst (Tag
2) eine hohe EB-Dichte (3.000–8.000
EBs/ml) erhalten. Nach einer Verringerung der EB-Dichte, die laut
Literatur durch EB-Fusionen erfolgt, stabilisiert sich die EB-Zahl
noch etwa 4 Tagen und bleibt weitgehend unverändert.
B zeigt
die durchschnittliche EB-Größe (Anzahl
der Zellen/EB) nach 2, 3, 4, 7 und 9 Tagen EB-Bildung im Bioreaktor
bei Rührerdrehzahlen
von 35, 60, 80 und 125Upm. Die größten EBs mit durchschnittlich
fast 50.000 Zellen/EB werden bei einer Rührergeschwindigkeit von 35Upm
erhalten. Hierbei kommt es häufig
zur Fusion von EBs, da gleichzeitig nur ein geringes Anwachsen der
Zellen erfolgt (siehe 5A und B). Während
bei 65Upm EB-Größen erreicht
werden, die auch in anderen Systemen zur EB-Bildung beobachtet wurden (20.000–30.000
Zellen/EB) ist die maximale EB-Größe bei 80 bzw. bei 125Upm offensichtlich
limitiert.
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8A zeigt
ein Diagramm zur Differenzierung genetisch veränderter ESC und die Selektion
reiner Herzmuskelzellen aus diesen Stammzellen im gerührten, geregelten
Bioreaktor bei einer Rührergeschwindigkeit
von 65Upm (siehe Beispiel 4). Dargestellt ist die Zelldichte (Zellen/ml) über die
Zeit. Nach 9 Tagen Differenzierung durch die Bildung von EBs, wird
ein Antibiotikum hinzugefügt,
um die Herzmuskelzellen selektiv anzureichern. Bei diesem Bioprozess
wird am Ende der Selektion eine Zelldichte von 6,38×105 Herzmuskelzellen/ml und damit eine Gesamtzellzahl
von 1,28×109 Herzmuskelzellen im 2 L Bioreaktor erhalten.
B zeigt den mittels Durchflusszytometrie
(FACS) gemessenen Anteil der SSEA-1- und E-Cadherin positiven Zellen über den
Verlauf der in Beispiel 4 beschriebenen Bioreaktorkultivierung.
Die FACS-Analyse zeigt eine Reduktion der SSEA-1 positiven Zellen
von 75% auf 2% innerhalb von 9 Tagen Kultivierung und EB-Bildung im
Bioreaktor. Nach weiteren 5 Tagen Kultivierung mit einem Antibiotikum
können
keine SSEA-1 positiven Zellen mehr nachgewiesen werden. Die E-Cadherin
Expression der Zellen verringert sich ebenfalls im Verlauf der EB-Bildung
(9 Tage) von 93% auf 12%. Während
der Selektion erfolgt eine weitere Verringerung der E-Cadherin Expression,
so dass nach insgesamt 14 Tagen Kultivierung im Bioreaktor keine
E-Cadherin positiven Zellen mehr nachweisbar sind. Die deutliche
Abnahme der Expression der Stammzell-spezifischen Marker SSEA-1
und E-Cadherin während
der EB-Bildung im Bioreaktor zeigt die Differenzierung der genetisch
modifizierten ESC. Nach 9 Tagen EB-Bildung ist noch ein geringer
Anteil an SSEA-1 und E-Cadherin positiven Zellen vorhanden. Diese
undifferenzierten Zellen werden offensichtlich durch die Antibiotika-Behandlung
im weiteren Verlauf der Kultivierung eliminiert. Durch die Selektion
werden hochreine Herzmuskelzellen erhalten, die in Form von Sphäroiden (Cardiac
Bodies) in Suspension vorliegen (siehe 9).
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9A zeigt
Gefrierschnitte durch EBs am Tag 9 der Kultivierung und B Gefrierschnitte
durch CBs am Tag 18 der Kultivierung, die in dem in Beispiel 4 beschriebenen
Bioprozess erhalten werden. Die Schnitte wurden mit dem MF20 Antikörper zum
Nachweis gebildeter Herzmuskelzellen immunhistochemisch gefärbt. Während die
unter A dargestellten EBs vor Zugabe des Antibiotikums einige Bereiche
mit dunkel gefärbten
Herzmuskelzellen aufweisen, bestehen die Sphäroide (Cardiac Bodies) offensichtlich
durchgehend aus positiv gefärbten
(dunkle Färbung)
Herzmuskelzellen. Der schwarze Balken zeigt die Größenverhältnisse.
C zeigt die immunhistochemische Anfärbung (MF20
Antikörper
und Kernfärbung
mit Hämalaun)
plattierter Zellen, die durch die Vereinzelung der in B gezeigten
CBs erhalten wurden (auf Gelatine beschichteten Zellkulturplatten
48 Stunden nach dem Plattieren). Die Zellen wurden in einer Dichte
von 4,7×104 Zellen/cm2 ausgesät. Die schwarzen
Pfeilspitzen verdeutlichen beispielhalt die Zellkerne.
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Beispiele
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Standard 1: Kultivierung
muriner embryonaler Stammzellen (ESC) als Monolayerkultur
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Zur Kultivierung undifferenzierter
J1 ESC (Lee et al., Cell 1992 Jun 12; 69(6): 915–26) wird ESC-Kulturmedium
verwendet (D-MEM, Kat.Nr. 32430-027 (Gibco), 10 % FCS (PAA); 1%
nichtessentielle Aminosäuren
(MEM NEAA, Sigma); 0,1mM Mercapthoethanol, 1000U/ml LIF/Esgro (Chemicon)).
Die Zellen werden auf 100mm Gelatine beschichteten (Gelatine, Sigma)
Zellkulturschalen ausplattiert und alle 48 Stunden durch Trypsin-Behandlung
wie folgt vereinzelt. Die Zellen werden mit PBS (Gibco) gewaschen,
mit Trypsin-EDTA (Gibco) überschichtet
und 5 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die vollständige
Vereinzelung der Zellen erfolgt durch mechanisches Scheren mit einer
Pasteurpipette. Die Trypsin-Behandlung wird durch Zugabe von ESC-Kulturmedium
zur Zellsuspension beendet. Nachfolgend wird die Zellsuspension
zentrifugiert, der Trypsin-haltige Überstand wird verworfen und
die Zellen werden in frischem ESC-Kulturmedium resuspendiert. Testzellen
werden mit 0,4% Trypanblau-Lösung
(Sigma) gefärbt.
Dazu werden 50μl
Zellsuspension mit 50μl
Trypanblau-Lösung gemischt
und 2min inkubiert. Der Farbstoff dringt dabei in Zellen mit defekter
Membran ein, die dadurch blau angefärbt werden. Die Anzahl der
lebenden, ungefärbten
und der toten, blau gefärbten
Zellen wird durch Auszählen
in einer Neubauerzählkammer
bestimmt. Zum Animpfen von 100mm Schalen werden jeweils 2×106 Zellen in 10ml Medium verwendet. Das Medium
wird alle 24 Stunden gewechselt. Die Kultivierung auf der Oberfläche von
Zellkulturschalen wird als Monolayerkultur bezeichnet.
-
Die Differenzierung von ESC Zellen
wird durch Zusatz von Differenzierungsmedium eingeleitet, bestehend
aus ESC-Kulturmedium ohne Zusatz von LIF.
-
Standard 2: Durchflusszytometrie
(FACS) zum Nachweis von SSEA-1 und E-Cadherin
-
Als Marker für undifferenzierte ESC werden
Antikörper
zum Nachweis von SSEA-1 (Stage Specific Embryonic Antigen) und E-Cadherin
verwendet. Bei SSEA-1 handelt es sich um eine glykosyslierte Membranstruktur,
die auf undifferenzierten ESC exprimiert wird (Solter und Knowles,
Proc Natl Acad Sci USA 1978 Nov; 75(11): 5565–9; Solter und Knowles, Curr
Top Dev Biol 1979; 13 Pt 1: 139–65).
E-Cadherin ist ein membrangebundenes Zell-Adhäsionsmolekül, dessen
Expression im Zuge der Differenzierung von ESC herunterreguliert
wird (Butz und Larue, Cell Adhes Commun 1995 Nov; 3(4): 337–52, Sefton
et al., Development 1992 May; 115(1): 313–8).
-
Zur FACS-Analyse werden 4×106 ESC vereinzelt und in 100μl FACS-Puffer
(PBS, 0,1% Natriumazid, 2% BSA (Sigma)) aufgenommen. Unspezifische
Bindestellen werden durch 15min Inkubation auf Eis mit FC-Block
(mCD16/CD32 FcγIII/II
receptor, 1μg/106 Zellen) und durch Zugabe von bovine-IgM
(Sigma, 1 : 100) in FACS-Puffer geblockt. Danach werden 3×25μl der Zellsuspension
in Reaktionsgefäße gegeben,
abzentrifugiert und der Überstand
verworfen. Die drei Ansätze
werden wie folgt verwendet. Im 1. Ansatz dienen ungefärbte Zellen
als negativ Kontrolle. Dazu werden die Zellen in 500μl FACS-Puffer
resuspendiert. Für
den 2. Ansatz werden als Isotypenkontrolle mouse IgM, κ Isotype
Standard (BD PharMingen, 1 : 100 in FACS-Puffer) und rat IgG1, κ Isotype
Standard (BD PharMingen, 1 : 100 in FACS-Puffer) eingesetzt. Die
Zellen werden mit 100μl
einer Mischung beider Antikörper
resuspendiert, auf Eis inkubiert, gewaschen und mit Anti-mouse PE-konjugiertem
IgM Antikörper
(Immunotech, 1 : 100) gefärbt.
Die zweite Färbung
wird mit 100μl
anti-mouse FITC konjugiertem IgG (Sigma, 1 : 100) in FACS-Puffer
durchgeführt.
Zur Analyse werden die Zellen in 500μl Puffer resuspendiert. Im 3.
Ansatz erfolgt die spezifische SSEA-1 und E-Cadherin Färbung. Die Zellen werden mit
100μl einer
Mischung aus anti-SSEA-1 Antikörper
(MC480 Hybridoma-Überstand
(DSHB), 1 : 10 in FACS-Puffer) und anti-E-Cadherin Antikörper (U3254,
Sigma, 1 : 100 in FACS-Puffer) auf Eis inkubiert, gewaschen, mit
dem 2. Antikörper
gefärbt
und in 500μl
FACS-Puffer resuspendiert. Die drei Ansätze werden im FACSCalibur Durchflusszytometer
(Beckman Coulter) analysiert.
-
Standard 3: Herstellung
genetisch modifizierter ESC
-
Die Herstellung genetisch modifizierter
ESC-Klone erfolgt nach einer von Klug et al., beschriebenen Methode
(Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24). Hierzu
werden ESC durch Trypsin-Behandlung vereinzelt und das gewünschte Reporter-Gen-Konstrukt
wird mit Hilfe der Elektroporation in ESC eingeführt. Durch Zugabe eines geeigneten
Antibiotikums lassen sich ESC-Klone isolieren, die das Reporter-Gen-Konstrukt
enthalten. Geeignete, genetisch modifizierte Klone werden wie herkömmliche
ES-Zellen kultiviert und expandiert. Zur Isolierung hochreiner Herzmuskelzellen
aus ESC werden genetisch modifizierte ESC-Klone hergestellt, die
das folgende Reporter-Gen-Konstrukt enthalten. Der Maus alpha-MHC-Promoter
steuert die Herzmuskelzell-spezifische Expression des Gentamycin-Resistenzgens
(aph, verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum Gentamycin oder
G418). Das Konstrukt, das als MHC-neo/pGK-hygro bezeichnet wird,
ist im Detail bei Klug et al. beschrieben (Klug et al. J. Clin.
Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24).
-
Beispiel 1: Expansion
von ESC in Suspension auf Petrischalen
-
Die Expansion von ESC in Suspension
wird auf Microcarriern durchgeführt.
Hierfür
werden Microhex (Nunc) und Cytodex 1 (Amersham Pharmacia Biotech)
Microcarrier verwendet. Microhex Microcarrier sind sechseckige Plättchen aus
Polystyrol, einem Kunststoff, der auch für herkömmliche Zellkulturschalen verwendet
wird. Diese Microcarrier können
mit Proteinen beschichtet werden. Bei der Präparation Gelantine beschichteter
Microhex Carrier werden die Plättchen
nach dem Abwiegen 30min unter Schwenken mit 1 % Gelatine in Reinstwasser
inkubiert, mit ESC-Kultivierungsmedium gewaschen und in einer Konzentration
von 13mg/ml Medium zur Kultivierung eingesetzt. Bei Cytodex 1 handelt
es sich um einen quellbaren, kugelförmigen Microcarrier auf Dextran
Basis, dessen Oberfläche
mit geladenen N,N-Diaminoethyl (DEAE)-Gruppen quervernetzt ist.
Dieser Microcarrier kann ebenfalls zusätzlich mit Proteinen beschichtet
werden. Fibronektin gebundene Cytodex 1 Microcarrier werden folgendermaßen präpariert.
Die Microcarrier werden in PBS über
Nacht gequollen. Der Überstand
wird dekantiert und die Microcarrier werden mit frischem PBS gewaschen.
Die Sterilisation der Microcarrier erfolgt durch Autoklavieren.
Zur Beschichtung werden die sterilisierten Microcarrier absedimentiert
und der Überstand
verworfen. Die Carrier werden mit Fibronektin (Stammlösung: 1mg/ml
in Reinstwasser, Boehringer) für
30min bei Raumtemperatur inkubiert, mit ESC-Kultivierungsmedium
gewaschen, in frischem Medium erneut für 30min inkubiert und in einer
Konzentration von 3mg Cytodex 1 Trockengewicht pro ml Medium zur
Kultivierung eingesetzt.
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Das Wachstum von ESC auf beschichteten
Microcarriern in Suspension wird in Petrischalen untersucht. Dazu
werden 100mm Petrischalen mit je 10ml ESC-Kultivierungsmedium, der
entsprechenden Menge an Microcarriern und je 2×106 ESC
aus Monolayerkultur beimpft und bei 37°C und 5% CO2 im
Brutschrank kultiviert. Der Medienwechsel erfolgt alle 48 Stunden.
Eine Lichtmikroskopische Auswertung der Kulturen im Phasenkontrast
erfolgt täglich.
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In 1 sind
J1 ESC auf Gelatine beschichteten Microhex und auf Fibronektin beschichteten
Cytodex 1 Microcarrier gezeigt. Die Versuche zeigen, dass eine gute
Anheftung der ESC-Zellen
sowohl an Gelatine-beschichtete Microhex als auch an Fibronektin-beschichtete
Cytodex 1 Microcarrier stattfindet. Demnach eigenen sich beide Microcarrier
zur Expansion von ESC in Suspension. Damit konnte das erste mal
gezeigt werden, dass eine Kultivierung pluripotenter Stammzellen
auf Microcarriern in Suspension möglich ist, eine wichtige Vorraussetzung
für die
Anzucht von Stammzellen in skalierbaren Systemen im industriellen
Maßstab.
-
Beispiel 2: Kultivierung
von ESC in Suspension in Spinnerflaschen
-
Zur Microcarrierkultivierung von
ESC in einem gerührten
System werden Spinnerflaschen mit Paddelrührern (Bellco) verwendet. Die
Flaschen werden mit 50ml Kulturvolumen (2×105 Zellen/ml
in ESC-Kulturmedium) beimpft und auf einer Rührstation (Variomag Biosystem,
H+P Labortechnik) bei 37°C
und 5% CO2 kultiviert. Nach einer Initialphase
von 4 bis 6 Stunden in Ruhe wird eine Rührergeschwindigkeit von 30Upm
eingestellt. Das Medium wird alle 48 Stunden vollständig gewechselt.
Nach jeweils 72 Stunden (1. Passage) werden die Zellen von den Microcarriern
durch Trypsin-Behandlung abgelöst,
vereinzelt und erneut auf frischen Microcarriern ausgesät. Die Zellzahl
wird in einer Neubauerzählkammer
bestimmt, dabei wird die Anzahl der lebenden Zellen durch Trypanblaufärbung ermittelt.
-
Die Zellen werden über 3 Passagen
auf Microcarriern kultiviert. Die Zellzahl in den Spinnern nimmt
pro Passage (72 Stunden) von ca. 2×105 auf
ca. 1×106 Zellen/ml zu. Damit können die Zellen in der Spinnerkultur je
Passage durchschnittlich um das 5fache expandiert werden.
-
In
2 sind
die mittleren Wachstumsraten [μ]
(siehe Gleichung 1), der Zellen in Spinnern im Vergleich zu Monolayerkulturen
dargestellt. Die mittleren Wachstumsraten der Monolayerkulturen
entsprechen den Werten der Spinnerkultivierungen.
μ = Wachstumsrate
x
0 = Anfangszellzahl
x = Zellzahl
t
= Zeit
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Nach 3 Passagen werden je 2×106 Zellen aus den Spinnerflaschen in 10ml
ESC-Kulturmedium
auf 100mm Zellkulturschalen plattiert, um die Zellmorphologie mit
Zellen, die durchgehend als Monolayerkulturen kultiviert wurden,
zu vergleichen. Der Vergleich der Zellmorphologie plattierter Zellen
aus Microcarrierkulturen zeigt keinen Unterschied gegenüber Zellen,
die durchgehend als Monolayerkulturen expandiert wurden.
-
ESC sind pluripotent, d.h. sie können durch
Differenzierung verschiedene Zelltypen, unter anderem Herzmuskelzellen
bilden (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24; Wobus
et al., Differentiation 1991 Dec; 48(3): 173–82). Um das Differenzierungspotential
von ESC nach der Microcarrierkultivierung zu untersuchen wird getestet,
ob bei der Differenzierung Herzmuskelzellen entstehen. Dazu werden
jeweils 2×106 Zellen in 10ml Differenzierungsmedium in
100mm Petrischalen eingesät.
Das Medium wird alle 48 Stunden gewechselt. Nach 3 Tagen Differenzierung,
eingeleitet durch die Bildung von Ebs, werden die Zellen durch Trypsinbehandlung
vereinzelt und in Differenzierungsmedium auf 100mm Zellkulturschalen
ausplattiert.
-
Wie für herkömmlich kultivierte ESC beschrieben,
kann auch für
ESC aus Microcarrierkulturen die Bildung von Herzmuskelzellen durch
den Nachweis kontrahierender Bereiche auf den Platten und anschließende positive
MF20-Färbung
der Zellen nachgewiesen werden. Bei der Bildung von Herzmuskelzellen
durch Differenzierung wird kein Unterschied zwischen ESC aus Monolayerkulturen
und Zellen, die in Suspension auf Carriern kultiviert wurden, festgestellt.
-
Zur weiteren Analyse wird mit Hilfe
der Durchflusszytometrie (FACS) die Expression von Stammzellmarkern
auf Zellen aus Monolayerkulturen versus Zellen aus Suspensionskultur
verglichen. Die FACS-Analysen ergeben Schwankungen jedoch keine
Abnahme der SSEA-1- und
der E-Cadherin-Expression der in Suspension auf Microcarriern kultivierten
ESC-Zellen in Spinnern. SSEA-1 und E-Cadherin werden über die
gesamte Kulturdauer stabil exprimiert. In Tab.1 sind die FACS-Daten
für in
Spinnern kultivierte ESC aufgeführt.
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Tabelle
1: E-Cadherin und SSEA-1 FACS Analyse einer Spinnerkultivierung über 3 Passagen
mit J1 ESC auf Microcarriern. Angegeben ist der prozentuale Anteil
der Zellen, deren Färbintensität oberhalb
von 99% der Isotypenkontrolle liegt. Gezeigt sind die Mittelwerte
aus 2 Kultivierungen.
-
Zusammenfassend konnte gezeigt werden,
dass eine Kultivierung pluripotenter ESC auf Microcarriern in Suspension
möglich
ist, ohne dass die Zellen ihre Wachstums- und Stammzelleigenschaften,
wie die Expression von Stammzellmarkern und die Differenzierung
in spezifische Zelltypen wie Herzmuskelzellen verlieren. Damit wird
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erstmals die Expansion von ESC in Suspension ermöglicht.
-
Beispiel 3: EB-Bildung
im geregelten, aktiv begasten Bioreaktor
-
Im Folgenden ist ein Verfahren dargestellt,
in dem die Bildung von Sphäroiden
aus einer ESC Stammzellsuspension direkt in einem skalierbaren System
in Form eines geregelten, aktiv begasten Rührkesselbioreaktors erfolgt.
Um Sphäroide
zu erhalten, die zu einer bestmöglichen
Expansion und Differenzierung der verwendeten ESC führen, wird
eine Optimierung der Rührerdrehzahl
im Bioreaktor durchgeführt,
während
andere Parameter, die die Sphäroid-Bildung
beeinflussen, konstant gehalten werden.
-
Gentechnisch veränderte ESC, die das Konstrukt
MHC-neo/pGK-hygro enthalten, werden durch Trypsinbehandlung, vereinzelt
und in einer Zelldichte von 2×105 Zellen/ml in Differenzierungsmedium in
den Bioreaktor eingebracht. Als Bioreaktor wird ein 2 Liter Rührkesselbioreaktor
(Biostat MD, Braun Biotech) mit einem Blattrührer, der eine axiale Strömung erzeugt,
verwendet. Der schematische Aufbau des Reaktors ist in 4a dargestellt. Die aktive
Begasung, die nach Bedarf mit Druckluft, Kohlendioxid (CO2) oder Sauerstoff (O2)
durchgeführt
werden kann, wird über
eine „digital
control unit" (DCU,
Braun Biotech) geregelt. Nach Eichung der Sauerstoffelektrode zur
Messung des Sauerstoffpartialdrucks (pO2)
wird ein Sollwert von 40% Luftsättigung eingestellt,
der mit Hilfe der Meß-
und Regeltechnik über
die gesamte Kulturdauer konstant gehalten wird. Der pH-Wert im Kulturmedium
wird mit einer pH-Elektrode gemessen und über die CO2-Zufuhr
geregelt.
-
Alternativ kann die Regelung auch
durch Zugabe von Säuren
oder Laugen erfolgen. Der Sollwert beträgt pH 7,2. Dieser Sollwert
wird mit Hilfe der verwendeten Meß- und Regeltechnik im Rahmen
einer Abweichung von ±0,3
pH-Einheiten konstant gehalten. Die Bildung von EBs, ausgehend von
einer ESC-Suspension, wird über
9 Tage bei folgenden Rührerdrehzahlen
durchgeführt:
35, 65, 80 und 120Upm. Der Reaktor wird jeweils mit 1 Liter Kulturvolumen
gestartet und nach 48 Stunden Kultivierung auf 2 Liter aufgefüllt. Die
Begasung erfolgt bis zum Auffüllen
auf das Endvolumen (48h) über
den Kopfraum. Danach wird die Gasversorgung mittels Blasenbegasung über einen
Microsparger durchgeführt.
Bei Bedarf wird zur Vermeidung von Schaumbildung bis zu 0,025 %
Antifoam C (Sigma) zugesetzt. Täglich
wird 50% des Mediums erneuert. Täglich
wird ca. 5ml Probe entnommen und folgende Parameter werden bestimmt:
die EB-Dichte, die Zelldichte und die Lebend- und Totzellzahl. Die
EB-Dichte wird durch Auszählung
im Phasenkontrast ermittelt. Die Zellzählung erfolgt nach der Vereinzelung
der Zellen durch Trypsinverdau. Der Anteil an lebenden Zellen wird
nach Trypanblaufärbung
in einer Neubauer-Zählkammer
ermittelt. Die Anzahl der Zellen/EB ergibt sich aus dem Quozienten
der Lebendzellzahl (Zellen/ml) und der ermittelten EB-Dichte (EBs/ml).
In 5A ist die Zelldichte
im Bioreaktor im Verlauf der Kultivierung in den einzelnen Bioreaktorläufen über 9 Tage
dargestellt.
-
Die durchschnittliche Zellzahl pro
EB in Abhängigkeit
der Rührergeschwindigkeit
im Bioreaktor ist in Tab.2 und in 7 gezeigt.
Bereits nach 48 Stunden ist der Einfluss der Rührergeschwingigkeit auf die EB-Größe deutlich
nachweisbar. Bei 35Upm beträgt
die durchschnittliche Zellzahl/EB 1.953 Zellen, während bei
einer Drehzahl von 125Upm Stunden ein EB nach 48 Stunden durchschnittlich
aus 181 Zellen besteht. Im weiteren Verlauf der Kultivierung nimmt
die Zellzahl pro EB naturgemäß zu. Beispielsweise
wird bei einer Rührergeschwindigkeit
von 65Upm nach 48 Stunden eine EB-Größe von 278 Zellen/EB erreicht
und die Sphäroide wachsen über die
Dauer von 9 Tagen zu einer durchschnittlichen Größe von 22.571 Zellen/EB heran
(siehe Tab. 2, 7B).
Dieser Verlauf des EB-Wachstums stimmt gut mit publizierten Daten
zur EB-Bildung in anderen Systemen überein (Dang et al., Biotechnol
Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53).
Demgegenüber
werden bei einer Rührergeschwindigkeit
von 35Upm bereits nach 3 Tagen Kultivierung EBs mit einer durchschnittlichen
Zellzahl von mehr als 11.000 Zellen/EB erhalten, die am Tag 9 der
Kultivierung auf mehr als 48.000 Zellen/EB ansteigt. Laut Dang et
al. (Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53) kann
diese EB-Größe nur durch
die Fusion von EBs entstehen, nicht jedoch durch gleichmäßiges Anwachsen
aufgrund von Zellteilungen in den EBs. Die Fusion von EBs und die
damit einhergehende Bildung nur weniger EBs (siehe 7A) resultiert in einer verhältnismäßig geringen
Expansion der Zellen (Vervielfachung nur um den Faktor 18,9 bei
35Upm, siehe Tab.3). Dass die Bildung großer EBs durch EB-Fusion auch die Differenzierung
negativ beeinflussen kann wurde berichtet (Dang et al., Biotechnol
Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53).
Im Gegensatz dazu wird in dem hier verwendeten System eine durchschnittliche
Zellzahl von 10.000 Zellen/EB bei Rührergeschwindigkeiten von 80
bzw. 125Upm nicht erreicht. EBs, die zu einer Zellzahl von 20.000–30.000 Zellen/EB
anwachsen, wären
jedoch wünschenswert,
da diese EB-Größe unter
Verwendung von murinen ESC auch mit anderen Systemen erreicht wird
und für
eine optimale Differenzierung der ESC wichtig zu sein scheint (Dang
et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Darüber hinaus
wird bei einer Rührerdrehzahl von
80 bzw. 125Upm auch eine vergleichsweise geringe Proliferation der
differenzierenden ESC beobachtet, die bei 80Upm am Tag 9 zu einer
Vervielfachung der eingesetzten Zellen um den Faktor 39,3 und bei
125Upm nur um den Faktor 26,9 führt.
-
Tabelle
2: Zellanzahl pro EB nach 2, 3, 4, 7 und 9 Tagen EB-Bildung im Bioreaktor
bei Rührergeschwindigkeiten
von 35, 65, 80 und 125Upm.
-
Die bei den einzelnen Rührergeschwindigkeiten
ermittelten Zelldichten und die maximal erreichte Expansion der
Zellen am Tag 9 ist in Tab.3 wiedergegeben. Die erreichte Lebend-Zelldichte ist in
Abhängigkeit der
Rührerdrehzahl
sehr verschieden. Die höchste
Zelldichte wird mit 1,28×107 Zellen/ml bei einer Rührerdrehzahl von 65Upm erreicht.
Ausgehend von 2×105 Zellen/ml zu Beginn der Kultivierung wird
damit eine 128fache Vervielfachung der Anfangszelldichte erhalten.
Gleichzeitig wachsen die EBs bei dieser Umdrehungszahl gleichmäßig an (siehe
Tab.3 und 6 und 7A) und eine Differenzierung
zu Herzmuskelzellen wird beobachtet. Die Bildung von Herzmuskelzellen
ist durch das Entstehen kontrahierender EBs gekennzeichnet. Zusätzlich lassen
sich auf Schnitten von EBs Herzmuskelzellen mit Hilfe der MF20-Färbung nachweisen
(siehe 9A) Damit ist
gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren
zur Bildung von Sphäroiden
direkt aus einer Stammzellsuspension geeignet ist. Eine Expansion
und Differenzierung der verwendeten Stammzellen wird erreicht. Die
EB-Bildung, gekennzeichnet durch die Anzahl der gebildeten EBs sowie
die sich über
den Prozessverlauf verändernde
EB-Größe (Zellen/EB),
lässt sich
gezielt mit Hilfe der Rührerdrehzahl
steuern. Es ist offensichtlich, dass Parameter, die einen Einfluss
auf die EB-Bildung haben, wie beispielsweise die Rührerdrehzahl
bei Rührkesselbioreaktoren
oder die Strömungsgeschwindigkeit
bei Airlifter-, Fließbett-,
Wirbelschichtreaktoren und Blasensäulen, bzw. andere geeignete
Parameter bei anderen Reaktormodellen, angepasst werden müssen, um
eine geeignete Sphäroidbildung
zu erreichen. Die Parameter, welche die Bildung bzw. das Anwachsen
der Sphäroide
beeinflussen, müssen
hierbei dem verwendeten Stammzelltyp ebenso angepasst werden, wie
dem spezifischen Zelltyp, der durch Differenzierung der Stammzellen
erhalten werden soll.
-
Gegenüber Spinnerflaschen oder anderen
nicht geregelten Systemen hat die Verwendung eines geregelten Bioreaktors
besondere Vorteile, die für
die reproduzierbare Differenzierung von Stammzellen in einen gewünschten
Zelltyp entscheidend sind. Alle wichtigen Parameter wie der Sauerstoffpartialdruck
(pO2) und der pH-Wert im Kulturmedium können über die
Kulturdauer konstant gehalten werden. Das Erzielen hoher Zelldichten,
der entscheidende Faktor für
die Bereitstellung von klinisch relevanten Zellmengen, kann nur
durch die aktive Begasung der Kulturen im geregelten Bioreaktor
erreicht werden.
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Tabelle
3: Dargestellt ist die Anfangs- sowie die Lebendzelldichte am Tag
9 der jeweiligen Bioreaktorprozesse in Abhängigkeit der Rührerdrehzahl.
Der resultierende Multiplikationsfaktor ist ebenfalls angegeben.
-
Beispiel 4: Bildung hochreiner
Herzmuskelzellen im Bioreaktor
-
Das in Beispiel 3 dargestellte Verfahren
zur EB-Bildung im geregelten Bioreaktor wird im Folgenden Beispiel
zur Bildung von Herzmuskelzellen aus gentechnisch modifizierten
ESC (beinhalten das Konstrukt MHC-neo/pGK-hygro, siehe Standard
3) verwendet. Hierzu wird die EB-Bildung im Rührkesselbioreaktor nach Beispiel
3 bei einer Rührergeschwindigkeit
von 65Upm durchgeführt.
Dazu werden Stammzellen aus Monolayerkulturen mit ESC-Kultivierungsmedium
expandiert und mittels Trypsin-Behandlung vereinzelt. Unter Verwendung
von Differenzierungsmedium wird der Bioreaktor mit einem Liter der
Zellsuspension (Zelldichte von 2×105 Zellen/ml)
angeimpft und die Differenzierung wird über 9 Tage, wie in Beispiel
3 beschrieben, durchgeführt.
Im Anschluß an
die EB-Bildungs- und Differenzierungsphase wird die Selektion von
Herzmuskelzellen durch Zugabe von Retinsäure (RA, Konzentration: 10nM
im Differenzierungsmedium, Sigma) und Geniticin (G418, Konzentration:
400μg/ml
Differenzierungsmedium, Gibco) im aktiv begasten Bioreaktor eingeleitet.
Die Kultivierung wird hierbei für
weitere 9 Tage fortgesetzt. Dabei wird täglich 50% des Mediums erneuert.
Die Ausbeute an generierten Herzmuskelzellen wird durch Trypanblaufärbung bestimmt.
Die Lebendzellzahl wird durch Vereinzelung der Zellen nach der in
Beispiel 5 beschriebenen Methode und nachfolgende Trypanblaufärbung ermittelt.
In 8A sind die Lebendzellzahlen über den
Kulturverlauf gezeigt.
-
Um die Reinheit der erhaltenen Herzmuskelzellen
zu überprüfen, werden
die in Suspension erhaltenen Cardiac Bodies (CB) nach der unter
Beispiel 5 beschriebenen Methode vereinzelt. Hierbei werden Einzelzellsuspensionen
erhalten, die laut Trypanblaufärbung
mindestens zu 90% aus vitalen Herzmuskelzellen bestehen. Die Einzelzellsuspensionen
werden auf Gelatine-beschichteten Zellkulturschalen plattiert und
nach 48 Stunden mit dem MF20 Antikörper zum Nachweis der schweren
Kette Sarkomeren-Myosins (MF20, Klug et al., J. Clin. Invest. 1996
Jul.; 98 (1): 216–24)
gefärbt.
Gleichzeitig wird eine Kernfärbung
mit Hämalaun
durchgeführt.
Wie in Beispiel 6 beschrieben und in 9C gezeigt
ist, bestehen die plattierten Zellen zu über 99% aus MF20 positiven
Herzmuskelzellen. Auch die erhaltenen CBs, die am Ende der Selektion
zum Nachweis von Herzmuskelzellen gefriergeschnitten und mit MF20
Antikörper
gefärbt
werden, bestehen offensichtlich ausnahmslos aus positiv gefärbten Herzmuskelzellen
(siehe 9B). Wie in der
Graphik in 8B dargestellt ist,
wird während
des gesamten Bioprozesses mit Hilfe der FACS-Analyse (siehe Standard
2) der Anteil der Zellen in der Kultur bestimmt, die für die Stammzellmarker
SSEA-1 und E-Cadherin
positiv sind (Nachweis undifferenzierter ESC). Während des Kulturverlaufs nimmt
der Anteil der positiven Zellen deutlich ab und nach Tag 14 sind
keine positiven Zellen mehr nachweisbar. Diese Analyse ist ein weiterer
Nachweis dafür,
dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
hochreine Zelltypen aus Stammzellen isoliert werden können, wobei
am Ende des Verfahrens keine Stammzellen mehr in der Kultur nachweisbar
sind.
-
Beispiel 5: Verfahren
zur Herstellung vitaler Einzellzellsuspensionen aus Embryoid Bodies
(EBs) oder Cardiac Bodies (CBs)
-
Bei der Differenzierung von ESC in
Suspension entstehen die als EBs bezeichneten Sphäroide. Mit Hilfe
von Verfahren zur Selektion hochreiner Herzmuskelzellen in Suspension
(siehe Beispiel 4) werden nicht-Herzmuskelzellen in den EBs durch
Zusatz eines Antibiotikums abgetötet,
so dass Sphäroide
aus reinen Herzmuskelzellen erhalten werden, die im Rahmen dieser
Erfindung als Cardiac Bodies (CBs) bezeichnet werden. Bei EBs und
CBs handelt es sich um hochdichte Zell-Sphäroide, die aus bis zu 50.000
Zellen bestehen können
(Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53; siehe
Tab.2). Die Vielschichtigkeit der EBs, sowie die von einigen Zelltypen
während
der Differenzierung gebildete extrazelluläre Matrix, erfordert ein geeignetes
Verfahren, mit dem aus den Sphäroiden
vitale Zellsuspensionen herstellt werden können, die weitestgehend aus
Einzelzellen bestehen und daher besondere Vorteile für den Einsatz
bei Zelltherapien sowie zur Beschichtung von Matrices aufweisen.
-
Zur Herstellung von Einzellzellsuspensionen
werden EBs oder CBs durch Sedimentation vom Kulturmedium getrennt
und für
mindestens 15min bei 37°C
mit einem Low-Calcium-Puffer nach Maltsev et al. (Maltsev, Circ
Res. 1994 Aug; 75(2): 233–44.)
oder mit Hepes- bzw. PBS-Puffer
behandelt. Für
eine 100mm Petrischale mit etwa 1×106–5×107 Zellen wird hierbei 10ml Waschpuffer verwendet.
Die Schalen werden während
der Inkubation auf einem Rotations-Schüttler
bewegt. Der Puffer wird nach Sedimentation der Sphäroide entfernt
und durch 3ml Trypsinlösung
je 100mm Schale ersetzt. Die Schalen werden für weitere 15min bei 37°C auf einem
Rotations-Schüttler
bewegt. Zum Vereinzeln werden die Sphäroide mit einer weitporigen
Zellkulturpipette einige Male auf und ab pipettiert. Die Vereinzelung
der Sphäroide
wird lichtmikroskopisch im Phasenkontrast überprüft. Zum Abstoppen des Trypsin-Verdaus
wird die Zellsuspension mit 2 Volumen Serum-haltigem Kulturmedium
versetzt. Mit diesem Verfahren lassen sich Zellsuspensionen erhalten,
die fast ausschließlich
aus Einzelzellen bestehen. Die Vitalität der Zellen wird durch Trypanblaufärbung überprüft.
-
Die mechanische Bewegung der Zellen
bzw. Sphäroide
während
der Zugabe des Waschpuffers (Schritt 1), des Trypsins (Schritt 2)
und der anschließenden
Zellvereinzelung (Schritt 3) kann modifiziert werden um zum gleichen
Ergebnis zu gelangen. Beispielsweise können alle Schritte auch direkt
in einem Rührkesselbioreaktor
oder anderen geeigneten Systemen durchgeführt werden. Hierbei muss die
mechanische Bewegung der Zellen bzw. der Sphäroide so vorsichtig durchgeführt werden,
dass eine Schädigung
der Zellen vermieden wird. Die Vitalität der Zellen wird mit einer
Trypanblaufärbung überprüft. Die
Zellen weisen bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vitalität von mindesten
90% auf. In der Regel wird jedoch eine Vitalität von 95–97% erzielt.
-
Beispiel 6: Verfahren
zur Herstellung Herzmuskelzell-beschichteter Platten
-
Die nach der Selektion im Bioreaktor
erhaltenen Cardiac Bodies (CBs) aus Beispiel 4 können mit Hilfe des Verfahrens
zur Herstellung vitaler Einzelzellsuspensionen vereinzelt (siehe
Beispiel 5) und auf Zellkulturplatten verschiedener Formate z.B.
1536Well-, 384Well-, 96Well-, 24Well-, 6Well-Platten ausgesät werden. Hierzu
werden die Platten zuvor mit Gelatine oder Fibronectin beschichtet.
Beim Ausplattieren einer Zelldichte von 7×104 Zellen/cm2 Plattenoberfläche, kann beispielsweise eine
einheitliche, dichte Einzelzellschicht aus kontrahierenden Herzmuskelzellen
erhalten werden (9C).
Die erhaltenen Zellen kontrahieren rhythmisch. Es wird beobachtet,
dass sich Kontraktionen gleichmäßig über alle
Zellen innerhalb einer Platte ausbreiten können. Offensichtlich sind die
Zellen in der erhaltenen Zellschicht aus hochreinen Herzmuskelzellen
funktionell miteinander gekoppelt, so dass eine Reizweiterleitung
gefolgt von einer Kontraktion über
alle Zellen ermöglicht
wird. Die Zellen bilden offensichtlich ein funktionelles Synzytium.
Erhaltene Platten werden zum Nachweis von Herzmuskelzellen immunhistochemisch
mit dem MF20 Antikörper-
und einer Hämalaun
Kernfärbung wie
folgt angefärbt.
Der monoklonale MF20 Antikörper
dient zum Nachweis sarkomeren Myosins in quergestreiften Muskelzellen.
Laut Klug et al. (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1):
216–24)
ist der Antikörper geeignet,
um während
der Phase der ESC Differenzierung (8 Tage Differenzierung) Herzmuskelzellen
spezifisch nachzuweisen. Die plattierten Zellen werden mit PBS gewaschen
und mit Methanol fixiert. Nach einem Waschschritt mit PBS/0,1% Triton
X-100 werden unspezifische Bindungsstellen durch Inkubation mit
Blockierungsreagenz (PBS, 3% Goatserum (Vektor), 1% BSA (Sigma),
0,1% Triton X-100) geblockt. Anschließend werden die Zellen zum
Nachweis der schweren Kette von sarkomerem Myosin mit dem MF20 Antikörper (MF20
Hybridomaüberstand
(Developmental Studies Hybridoma Bank) 1 : 10) inkubiert und mit
PBS/Triton sowie PBS/Goatserum/BSA gewaschen. Nach der Inkubation
mit dem Zweitantikörper
(Goat antimouse Biotin conjugierter IgG HL (Dianova) 1 : 1000) erfolgt
der Nachweis der Peroxidiase-Reaktion
mittels ABC-Reagenz (ABC Kit Vectastain; Vektor) und DAB-Färbelösung (DAB
Kit; Vektor). Zur Kernfärbung
werden die Zellen mit Mayers Hämalaun
Lösung
inkubiert und unter fließendem
Wasser gebläut.
Nachfolgend werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Kaisers-Glycerin-Gelatine überschichtet.
Zum Fotografieren wird eine Digitalkamera (Nikon, Coolpix 990) verwendet.
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Zum Nachweis von Herzmuskelzellen
in EBs oder CBs werden die Sphäroide
in 30% Saccharose über Nacht
inkubiert, in TissueTec (Jung/Leica) eingebettet und in einem Cryostat
(Leica) in einer Schichtdicke von 10μm geschnitten. Die Schnitte
werden mit Methanol fixiert und wie oben beschrieben mit dem monoklonalen MF20
Antikörper
gefärbt
(Peroxidase-gekoppelter
Zweitantikörper).
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In 9 ist
die MF20-Färbung
auf einer erhaltenen Zellkulturschale dargestellt. Zur detaillierten
Analyse werden nach einem Zufallsprinzip Bereiche auf den gefärbten, mit
Zellen beschichteten Schalen ausgewählt und im Mikroskop unter
Hellfeldbeleuchtung bei 200facher Vergrößerung gezählt (MIKROSKOP XY Axiovert
Leica, 20× Objektiv,
10× Okular).
Nach dem Auszählen
von etwa 1.000 Zellen konnte keine Zelle identifiziert werden, die
einen Hämalaun
gefärbten
Kern, jedoch kein MF20 positives Cytoplasma aufweist. Offensichtlich
handelt es sich bei allen analysierien Zellen ausnahmslos um Herzmuskelzellen.
Aufgrund dieser Analyse kann davon ausgegangen werden, dass mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
bis zu 100% reine Herzmuskelzellpopulationen erhalten werden können. Mit
einer vergleichbaren Methode haben Klug et al., (Klug et al. J.
Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) Herzmuskelzellen analysiert,
die durch genetische Selektion auf der Oberfläche von Zellkulturplatten erhalten
wurden. Hierbei wurden 3 MF20 negative Zellen bei einer Gesamtzahl
von 791 gezählten
Zellen beobachtet. Das entspricht einer Reinheit von 99,6%, die
mit dem hier beschriebenen Verfahren noch übertroffen wird. Ein anderer
Vorteil, der erstmals mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
erreicht wird, ist die Bereitstellung von Matrices beliebiger Formate,
beschichtet mit einer beliebigen, geeigneten Zelldichte des jeweiligen,
aus Stammzellen isolierten, Zelltyps. Auf diese Weise wird die Möglichkeit
geschaffen, Formate mit geringer Standardabweichung bereitzustellen, so
dass die Zellzahl oder Zelldichte pro Format oder Formateinheit
in hoher Reproduzierbarkeit erfolgen kann. Die Reproduzierbarkeit
der Zellzahl, der Zelldichte oder der Zellverteilung je Format oder
Einheit ist ein entscheidender Vorteil für die Verwendung solcher Zelltypen
bei Hochdurchsatz-Verfahren in der Pharmaindustrie, für toxikologische Screens
und zur Validierung von Kandidatengenen in der Biotechnologie.
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Im Verlauf des Verfahrens wird innerhalb
von 18 Tagen eine Zelldichte von 6,38×105 Herzmuskelzellen/ml
Kultursuspension erhalten. Damit konnte in einem 2 Liter Bioreaktor
eine Gesamtzellzahl von 1,28×109 hochreinen Herzmuskelzellen erzielt werden.
Die durchschnittliche Größe der gebildeten
CBs betrug am Tag 18 der Kultivierung 2979 Herzmuskelzellen/CB.
Das dargestellte, erfindungsgemäße Verfahren
ist einfach durchführbar,
robust und sollte auf größere Reaktorvolumen übertragen
sein. Damit ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals gelungen
einen hochreinen, spezifischen Zelltyp aus Stammzellen in einem
klinisch und industriell relevanten Maßstab herzustellen.