DE10257102A1 - Verfahren zur Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen im aktiv begasten Bioreaktor und ihre Verwendung in der Medizin, Pharmakologie und Biotechnologie - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung der Stammzellen in einem aktiv begasten Bioreaktor durchgeführt wird.

Description

  • Die Herstellung von Ersatzgewebe in Zellkultur, das sogenannte Tissue Engeneering, die Bereitstellung von Surrogatzellen für Zellbasierte Transplantationstherapien und die Identifizierung neuer Wirkstoffe mit Hilfe Zellbasierter Hochdurchsatzverfahren sind Paradebeispiele für innovative Anwendung der Biotechnologie.
  • Eine Vorraussetzung für Zellbasierte Therapien ist neben der Qualität vor allem die Verfügbarkeit großer Zellmengen des benötigten Zelltyps. Geht man von publizierten Daten aus, wonach der Ventrikel eines menschlichen Herzens aus etwa 5,6 × 109 Herzmuskelzellen besteht (Kajstura et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jul 21; 95(15): 8801–5.) und bei einem Herzinfarkt bis zu 20% aller Herzmuskelzellen irreversibel verloren gehen, so müssen einem Patienten etwa 1 × 109 vitale Herzmuskelzellen transplantiert werden, um den Verlust zu kompensieren.
  • Im Gegensatz zu primären Zellen können Stammzellen als potentiell unbegrenzte Quelle für die Isolierung differenzierter, spezifischer Zelltypen dienen (Poulsom R. et al., J Pathol. 2002 Jul; 197(4): 441–56.; Gepstein L. Circ Res. 2002 Nov 15; 91(10): 866–76.). Unter Stammzellen sind im Kontext dieser Erfindung Zellen gemeint, die sich zum Einen selbst erneuern können, dass heißt unter Aufrechterhaltung Ihrer Stammzelleigenschaften vermehrt werden können, und zum Anderen in einem als Differenzierung bezeichneten Vorgang einen oder mehrere spezialisierte Zelltypen wie beispielsweise Herzmuskelzellen, Endothelzellen, Knorpelzellen, Knochenzellen, Fettzellen, neuronale Zellen, Leberzellen oder Insulin bildende Zellen bilden können (Wobus AM. Mol Aspects Med. 2001 Jun; 22(3): 149–64).
  • Unter Differenzierung ist im Rahmen dieser Erfindung die Bildung spezialisierter, Zellen bzw. Zelltypen oder Gewebe aus Stammzellen gemeint (Gilbert S.F., Developmental Biology, forth edition, 1994. Sinaer Associate's Inc. Sunderland, Massachusetts, USA).
  • Beispiele für Stammzellen sind Stammzellen aus Nabelschnurblut (Sanchez-Ramos JR., J Neurosci Res. 2002 Sep 15; 69(6): 880–93.), neuronale Stammzellen (Hitoshi S. et al., Genes Dev. 2002 Apr 1; 16(7): 846–58. Okano H. J Neurosci Res. 2002 Sep 15; 69(6): 698–707.), mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut (Jiang Y. et al., Exp Hematol. 2002 Aug; 30(8): 896–904.; Schwartz et al., J Clin Invest. 2002 May; 109(10): 1291–302.) sowie Stammzellen aus der Haut (Toma et al., Nat Cell Biol. 2001 Sep; 3(9): 778–84.), dem Pankreas (Means AL., Pancreatology. 2001; 1(6): 587–96.), der Leber (Suzuki A., et al., Cell Transplant. 2001; 10(4-5): 393–6.), dem Darm (Brittan M., J. Pathol. 2002 Jul; 197(4): 492–509.) oder aus Fettgewebe (Cannon B. et al., Methods Mol Biol. 2001; 155: 213–24.), um nur einige zu nennen. Weitere wichtige Stammzellen sind die embryonalen Keimzellen (Schamblott MI., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jan 2; 98(1): 113–8.), so wie die sogenannten embryonalen Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse einer Blastozyste isoliert werden können. Embryonale Stammzellen wurden bereits aus einer Vielzahl von Spezies etabliert, unter anderem aus der Maus (Evans MJ, Kaufman MH., Nature. 1981 Jul 9; 292(5819): 154–6.) und dem Menschen (Thomson JA, et al., Science. 1998 Nov 6; 282(5391): 1145–7.). ESC sind pluripotente Stammzellen, das heißt sie können in eine Vielzahl spezifischer Zelltypen differenzieren (Wobus AM., Mol Aspects Med. 2001 Jun; 22(3): 149–64.; Amit M, Itskovitz-Eldor J., J Anat. 2002 Mar; 200(Pt 3): 225–32). Sowohl für humane als auch für murine ESC konnte gezeigt werden, dass sie unter anderem in Herzmuskelzellen (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24; Mummary C. et al., J Anat. 2002 Mar; 200(Pt 3): 233–42.; Xu C. et al., Circ Res. 2002 Sep 20; 91(6): 501–8.), Insulin produzierende Zellen (Assady et al., Diabetes. 2001 Aug; 50(8): 1691–7.; Soria B. Differentiation. 2001 Oct; 68(4-5): 205–19.; Lumelsky M. et al,. Science. 2001 May 18; 292(5520): 1389–94.), neuronale Zellen (Schuldiner M. et al., Brain Res. 2001 Sep 21; 913(2): 201–5.), Endothelzellen (Levenberg S. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Apr 2; 99(7): 4391–6.) und blutbildende Zellen (Kaufmann DS., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Sep 11; 98(19): 10716–21.) differenzieren können, um nur einige zu nennen.
  • Zunächst bestand die Einschränkung bei der Differenzierung eines bestimmten Zelltyps aus Stammzellen, dass der jeweilige Zelltyp nur in einem Gemisch einer Vielzahl differenzierter Zelltypen erhältlich war. Kürzlich wurden Arbeiten publiziert, bei der Herzmuskelzellen aus ESC der Maus mit Hilfe einer Doppelstrategie aus einem Percoll-Gradienten und der Fluoreszenz-aktivierten Zell Sortierung (FACS) angereichert wurden (Muller M., FASEB J. 2000 Dec; 14(15): 2540–8.). Hierbei wurde ein Anteil von bis zu 97 % Herzmuskelzellen am gesamten Zellgemisch dokumentiert. Neben der unvollständigen Anreicherung hat die Methode den Nachteil, dass mittels FACS nur relativ geringe Zellzahlen sortiert werden können und die Zellen bei der Prozedur mechanisch gestresst und teilweise abgetötet werden. In einer weiteren Arbeit wurden Herzmuskelzellen aus humanen ESC mittels Dichtezentrifugation angereichert (Xu C. et al., Circ Res. 2002 Sep 20; 91(6): 501–8.). Hierbei konnte ein Anteil von 70% der gesuchten Herzmuskelzellen im Zellgemisch erreicht werden. Neben der begrenzten Aufreinigung können mit dieser Methode nur geringe Zellzahlen isoliert werden.
  • Von Klug und Mitarbeitern (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) wurde eine Methode entwickelt, bei der ESC genetisch so verändert werden, dass ein Antibiotika-Resistenzgen in einem spezifischen Zelltyp, der bei der Differenzierung von ESC entsteht, exprimiert wird. Durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikums konnten sehr reine Herzmuskelzellpopulationen mit einem Herzmuskelzellanteil von 99,6% erhalten werden. Hierbei wurden die Herzmuskelzellen auf der Oberfläche von Zellkulturplatten angereichert. Die Methode ist jedoch nur begrenzt skalierbar und damit nicht für die Herstellung von Zellen im klinisch oder technisch relevanten Maßstab geeignet. Ein weiterer Nachteil der Methode ist, dass die Dichte, die Verteilung und die Anzahl der angereicherten Herzmuskelzellen auf der Platte kaum beeinflusst werden kann.
  • Zur Selektion von Herzmuskelzellen aus genetisch modifizierten ESC werden laut einer Methode von Klug et al. (J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) gebildete EBs zur Differenzierung auf Zellkulturplatten plattiert. Die Selektion von Herzmuskelzellen findet dann durch die Zugabe eines geeigneten Antibiotikums zum verwendeten Kulturmedium statt. Hierbei entstehen auf den Zellkulturplatten heterogen verteilte Anhäufungen von Herzmuskelzellen. Um die erhaltenen Herzmuskelzellen für pharmakologische Hochdurchsatzverfahren verwenden zu können, müssen die Zellen abgelöst, vereinzelt und auf neuen Plattenformaten replattiert werden, da hierfür eine gleichmäßige Verteilung der Herzmuskelzellen in einer gewünschten Dichte auf geeigneten, variierenden Plattenformaten benötigt wird. Diesbezüglich wird festgestellt, dass die auf Zellkulturplatten isolierten Herzmuskelzellenhaufen nur schwer vereinzelt und in Suspension gebracht werden können. Die Zellen sind zur Beschichtung anderer Platten nicht geeignet da hierbei weit über 95% aller Herzmuskelzellen verloren gehen.
  • Die Differenzierung von ESC wird in vielen Protokollen dadurch eingeleitet, dass die Zellen zunächst vereinzelt werden und die entstehende Zellsuspension auf Petrischale ausgesät wird. Auf der Petrischale wird ein Absetzen der Zellen auf dem Plattenboden verhindert. Die Zellen bleiben in Suspension und es kommt zur Bildung von kugelförmigen Zellaggregaten, die im Rahmen dieses Patents als Sphäroide bezeichnet werden. In der Literatur werden Sphäroide aus ESC häufig „Embryoid Bodies" (EBs) genannt. Die Bildung von EBs unter Verwendung eines geeigneten Mediums ist die Vorraussetzung für die Differenzierung von ESC in eine Vielzahl von Zelltypen, unter anderem in Herzmuskelzellen, Insulin bildende Zellen und Endothelzellen, um nur einige zu nennen (Guan K, et al, ALTEX. 1999; 16(3): 135–141.; Zandstra PW, et al, Biotechnol Bioeng. 2000 Sep 20; 69(6): 607–17.). Diese Beobachtung wurde sowohl bei der Differenzierung muriner ESC als auch humaner ESC beschrieben (Itskovitz-Eldor J, et al, Mol Med. 2000 Feb; 6(2): 88–95.).
  • Die Bildung von Sphäroiden aus Stammzellen im technischen Maßstab ist in Petrischalen nur bedingt möglich, da die Methode sehr Zeit- und Arbeitskraftintensiv ist und nicht beliebig dimensioniert werden kann. Ein weiterer Nachteil der EB-Bildung in Petrischalen ist die sehr heterogene Größe der entstehenden EBs und die Neigung der Sphäroide miteinander zu großen, ungleichmäßigen Aggregaten zu Fusionieren. Das Wachstum und die Differenzierung von ESC wird durch die Bildung großer Aggregate stark gehemmt oder komplett inhibiert. Der Differenzierungsprozess kann bei dieser Methode nicht reproduzierbar durchgeführt werden.
  • Neben der Verwendung von bakteriellen Kulturschalen wurde die Induktion von EBs mittels der sogenannten „Hanging Drop" Technik sowie durch Einbetten von ESZ in Nitrozellulose beschrieben (Viswanathan S, et al., Stem Cells. 2002; 20(2): 119–38.; Dang S., et al., Biotechnol Bioeng. 2002 May 20; 78(4): 442–53.). Diese Methoden sollen durch das Separieren einzelner EBs die unkontrollierte Fusion verhindern und damit die Reproduzierbarkeit der Differenzierungsprozesse verbessern. Beide Systeme sind jedoch ebenfalls sehr schwer skalierbar und damit für die Übertragung in den technischen Maßstab nicht geeignet.
  • Um diese Probleme zu lösen wurden alternative Strategien entwickelt, bei denen ESC in Alginat- oder Agarose-Tröpfchen eingekapselt wurden (Magyar et al., 2001, Ann. NY Acad. Sci., Nov, 944, 135–143). Die Methode soll die Fusion der entstehenden EBs verhindern. Der Ansatz ist jedoch technisch aufwendig und stellt ein regulatorisches Problem dar, da die Zellen mit einer Vielzahl von Substanzen wie Aggarose, Alginat und Öl (zum fixieren der gebildeten Mikrokapseln) in Kontakt kommen.
  • Alternativ wurde die Bildung von Sphäroiden durch Rühren einer Suspension von ESC in sogenannten Spinnerflaschen publiziert (Wartenberg M. et al., Lab Invest. 1998 Oct; 78(10): 1301–14. Sen A. et al., Brain Res Dev Brain Res. 2002 Mar 31; 134(1-2): 103–13.). Es kommt hierbei häufig zur Aggregation von ESC zu wenigen, großen Klumpen. Die Zellen in den Klumpen teilen sich kaum und eine Differenzierung in spezifische Zelltypen wie zum Beispiel Herzmuskelzellen wird nicht erreicht (Dang SM. et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Das System kann nur begrenzt skaliert werden und die maximale Zelldichte im Spinner ist auf etwa 1 × 106 Zellen pro ml limitiert (Prokop A, Rosenberg MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.; Lindl T., Zell und Gewebekultur, 4. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, ISBN 3-8274-0803-2 (2000)).
  • In der Pharmaindustrie werden zur Identifizierung und Testung neuer Wirkstoffe Hochdurchsatzverfahren eingesetzt, bei denen Zellen, die auf Zellkulturplatten verschiedener Formate aufgebracht sind, mit einer Vielzahl von Substanzen behandelt werden. Bisher werden bei diesen Verfahren in der Regel etablierte Zelllinien wie CHO Zellen aus dem Hamster oder Tumorziellinien wie COS-Zellen verwendet (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.). In Zukunft wäre es jedoch wünschenswert Hochdurchsatzverfahren mit spezifischen Zelltypen wie Herzmuskelzellen, Insulin produzierenden Zellen, Gefäßendothelzellen, Neuronale Zellen oder Leberzellen durchzuführen, um nur einige zu nennen (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.).
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung bestimmter, differenzierter Zelltypen wie beispielsweise Herzmuskelzellen, Insulin produzierende Zellen, neuronale Zellen, Leberzellen oder Endothelzellen aus Stammzellen in einer klinisch und industriell relevanten Menge, um dringend benötigte Zelltypen für klinische Therapien, sowie für pharmazeutische und biotechnologische Testverfahren bereitzustellen. Diesbezüglich erkannten die Erfinder, das ein Herstellungsverfahren skalierbar, robust, reproduzierbar und einfach sein soll, um die gewünschten Zelltypen kostengünstig sowohl in hoher Reinheit als auch mit hohen Ausbeuten bereitstellen zu können. Weiter wurde erkannt, dass Zellmengen in einer Größenordnung von 108–109 Zellen pro Patient für Transplantationstherapien nach dem derzeitigen Stand der Technik nur mittels Fermentation in einem geregelten, aktiv begasten, Bioreaktor erhalten werden können.
  • Zur Lösung der Aufgabe erfolgt die Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen über eine Differenzierung der Stammzellen und vorzugsweise die Selektion eines bestimmten Zelltyps in einem geregelten, aktiv begasten Bioreaktor.
  • Mit Stammzellen sind im Kontext dieser Erfindung alle Zellen gemeint, die sich unter Aufrechterhaltung Ihrer Stammzelleigenschaften selbst erneuern können und in einem als Differenzierung bezeichneten Vorgang einen oder mehrere spezifische Zelltypen wie beispielsweise Herzmuskelzellen, neuronale Vorläuferzellen oder Insulin bildende Zellen bilden können (Wobus AM. Mol Aspects Med. 2001 Jun; 22(3): 149–64).
  • Zu den Stammzelleigenschaften zählt die Expression bestimmter Stammzellmarker, die je nach Stammtyp verschieden sein können (beispielsweise sind SSEA-1, E-Cadherin und Oct-4 Stammzellmarker für ESC der Maus; Zandstra PW., et al. Biotechnol Bioeng. 2000 Sep 20; 69(6): 607–17.), während SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 und TRA-1-81 Marker für ESC des Menschen sind (Odorico et al., Stem Cells. 2001; 19(3): 193–204.), sowie die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit zur Differenzierung.
  • Unter der Differenzierung von Stammzellen ist im Rahmen dieser Erfindung die Bildung spezifischer, spezialisierter Zellen bzw. Zelltypen oder Gewebe aus Stammzellen gemeint (Gilbert S.F., Developmental Biology, forth edition, 1994. Sinaer Associate's Inc. Sunderland, Massachusetts, USA).
  • Unter hochreinen Zelltypen sind im Rahmen dieser Erfindung aus Stammzellen abgeleitete, spezifische Zelltypen gemeint, die einen Anteil von mindestens 80% einer Lebendzellpopulation ausmachen.
  • Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung klinisch bzw. industriell relevanter Zellmengen kann während des Verfahrens eine Zelldichte von mindestens 2 × 106 Zellen pro Milliliter Kulturmedium, bevorzugt von mindestens 5 × 106 Zellen, besonders bevorzugt von mindestens 1 × 107 Zellen pro Milliliter Kulturmedium erreicht werden.
  • Unter einem Bioreaktor ist in dieser Erfindung ein Behältnis gemeint, dass zur Kultivierung eukaryontischer Zellen, vorzugsweise tierischer Zellen, besonders bevorzugt zur Kultivierung von Säugerzellen geeignet ist.
  • Unter der Vorraussetzung, dass alle anderen Faktoren wie beispielsweise Nährstoffe nicht limitiert sind, ist die maximale erreichbare Zelldichte in einem Zellkultursystem vom Sauerstoffeintrag abhängig (Prokop A, Rosenberg MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.). In einem handelsüblichen Spinnersystem, in dem die Begasung allein über den Kopfraum erfolgt (keine submerse Begasung wie beispielsweise bei Superspinnern (Braun Biotech)), ist der maximale Gaseintrag durch die Gasaustauschoberfläche gegeben. In solchen Spinnersystemen ist die Gasaustauschoberfläche im Verhältnis zum Kulturvolumen gering. Daher können in diesem Systemen nur vergleichsweise geringe Zelldichten von etwa 1–2 × 106 Zellen erreicht werden (Prokop A, Rosenberg MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.).
  • Unter submerser Begasung ist im Rahmen dieser Erfindung eine Begasung über Geräte oder technische Vorrichtungen gemeint, die in das Kulturmedium eintauchen. Hierzu zählen beispielsweise Sparger oder Microsparger, die zum Einleiten von Gasen in Bioreaktoren verwendet werden (siehe 3. und 4.). Weitere Geräte und technische Vorrichtungen, die zur submersen Begasung geeignet sind, sind beispielsweise unter Chmiel H. (Chmiel H., Bioprozesstechnik 1&2. Gustav Fischer, Nr. 1597 & 1634, ISBN 3825215970 (1991)), Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering Fundamentals, second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) oder Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993)). dargestellt.
  • Unter aktiver Begasung wird im Rahmen dieser Erfindung jeder Gaseintrag verstanden, der über eine reine Kopfraumbegasung unter Normalbedingungen (37°C, 5–10% CO2, Atmosphärendruck) hinausgeht. Zur aktiven Begasung von Bioreaktoren eignen sich das Kulturmedium durchströmende Gasströme, der Gaseintrag über Membranen, chemisch oder elektrochemisch erzeugter Sauerstoffeintrag oder kontinuierlicher Austausch von an Sauerstoff verarmten Medium gegen mit Sauerstoff angereichten Medium. Methoden und geeignete technische Ausrüstungen zum aktiven Gaseintrag in einen Bioreaktor sind unter Prokop A. und Rosenberg MZ. (Prokop A, Rosenberg MZ. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1989; 39: 29–71.) Chmiel H. (Chmiel H., Bioprozesstechnik 1&2. Gustav Fischer, Nr. 1597 & 1634, ISBN 3825215970 (1991)), Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering Fundamentals, second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) oder Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993)) beschrieben.
  • Unter einem geregelten Bioreaktor sind Bioreaktor-Systeme gemeint, bei denen mindestens der Sauerstoffpartialdruck im Kulturmedium mit geeigneten Geräten gemessen und geregelt werden wird. Geeignete Geräte zur Messung des Sauerstoffpartialdrucks sind beispielsweise Sauerstoffelektroden. Der Sauerstoffpartialdruck kann beispielsweise über die Menge und die Zusammensetzung des verwendeten Gasgemischs (z.B. Luft oder ein Gemisch aus Luft und/oder Sauerstoff und/oder Stickstoff und/oder Kohlendioxyd) geregelt werden. Geeignete Geräte zur Messung und Regelung des Sauerstoffpartialdrucks sind unter Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering Fundamentals, second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) oder Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993)) beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführung verfügt ein geregelter Bioreaktor über Geräte zur Messung und Regelung des pH-Werts. Beispielsweise kann der pH-Wert mit einer pH-Elektrode gemessen werden. Die Regelung des pH-Werts kann z.B. durch den Anteil an Kohlendioxyd am zur Begasung verwendeten Gasgemisch oder durch Zugabe von Säuren oder Laugen zum Kulturmedium geregelt werden. Geeignete Geräte zur Messung und Regelung des pH-Werts sind unter Bailey, JE. (Bailey, JE., Biochemical Engeneering Fundamentals, second edition, MCGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986)) oder Jackson AT. (Jackson AT., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993)) beschrieben.
  • Ein besonderer Vorteil eines geregelten Bioreaktors ist, dass ein bestimmter Sauerstoffpartialdruck und/oder ein bestimmter pH-Wert während einer Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen konstant gehalten werden kann. Beide Parameter können einen Einfluss auf die Differenzierung von Stammzellen haben und beispielsweise die Bildung eines bestimmten Zelltyps während der Differenzierung fördern oder hemmen. Durch Konstanthalten beider Parameter wird daher die Reproduzierbarkeit von Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen verbessert.
  • In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem Rührkessel-Bioreaktor durchgeführt und der aktive Gaseintrag erfolgt vorzugsweise mit Hilfe eines Spargers, besonders bevorzugt mit einem Mikrosparger. Für die aktive Begasung eignet sich reiner Sauerstoff, Luft oder ein zusammengesetztes Gasgemisch, das neben Sauerstoff eine Beimischung von Stickstoff und/oder Kohlendioxid und/oder anderer Gasen enthalten kann. Besonders geeignet ist ein Verfahren bei dem der Sauerstoffpartialdruck in der Suspension mit einer Elektrode gemessen wird. Anhand dieser Messung wird mittels einer Regeleinheit der Gaseintrag in den Bioreaktor und damit der Sauerstoffpartialdruck im Medium gesteuert.
  • Besonders bevorzugt wird der pH-Wert im Kulturmedium mit einer geeigneten Elektrode gemessen und über eine entsprechende Regeleinheit durch Zusatz geeigneter Substanzen wie beispielsweise Kohlendioxid, Säuren oder Laugen geregelt.
  • Die Bildung kleiner Körper, die bevorzugt eine Zellzahl von 1–1.000 Zellen pro Körper aufweisen, und ein Anwachsen der Körper zu einer Größe von 20.000–30.000 Zellen pro EB für die Differenzierung von ESC in eine Vielzahl von Zelltypen, unter anderem in Herzmuskelzellen, ist vorteilhaft. Wenn die ESC hingegen durch die Fusion von EBs und/oder das Verklumpen von Einzelzellen aufgrund ungeeigneter Verfahren zu großen Klumpen fusionieren, wird die Differenzierung zu Herzmuskelzellen und anderen Zelltypen gehemmt (Dang SM. et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt so durchgeführt, dass, ausgehend von einer Zellsuspension aus Stammzellen innerhalb von 1–3 Tagen Körper mit einer Größe von etwa 1-1.000 Zellen gebildet werden. Weiterhin werden die Bedingungen so gewählt, dass die Körper innerhalb von 3–9 Tagen zu einer Größe von 5.000–30.000 Zellen pro Körper anwachsen können.
  • Während der Kultivierung erfolgt ein Anwachsen der Zellen im aktiv begasten und geregelten Bioreaktor auf eine Zelldichte von über 2×106 Zellen/ml, weiter bevorzugt auf wenigstens 5×106 Zellen/ml und am Bevorzugtesten auf wenigstens 1×107 Zellen/ml. Damit ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals möglich bei der Differenzierung von Stammzellen eine Zelldichte zu erreichen, die bisher nur von der Hochzelldichte-Fermentation herkömmlicher Zelllinien bekannt ist.
  • Erstmals konnte mit Hilfe der Rührgeschwindigkeit im aktiv begasten, geregelten Bioreaktor die Sphäroid-Bildung und damit die Differenzierung von ESC gezielt gesteuert werden, was in den Beispielen 3 und 4 durch die reproduzierbare Entstehung kontrahierender Herzmuskelzellen in hoher Zellzahl nachgewiesen wurde. Bei der Selektion eines spezifischen Zelltyps ist die Reinheit des selektierten Zelltyps so einstellbar, daß 3 der Anteil anderer Zelltypen weniger als 20%, besser unter 10%, bevorzugt unter 5%, weiter bevorzugt höchstens 2%, insbesondere unter 1% und am bevorzugtesten höchstens 0,3% beträgt.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich in einem aktiv begasten und geregelten Bioreaktor höchstkonzentrierte Zellsuspensionen von mindestens 2×106 Zellen/ml bereitstellen, vorzugsweise mit 5×106 Zellen/ml und am Bevorzugtesten mit wenigstens 1×107 Zellen/ml, bestehend aus einem Medium und darin enthaltenen aus Stammzellen abgeleiteten Sphäroiden.
  • Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Zellsuspensionen bestehend aus einem Medium und darin enthaltenen Sphäroiden eines hochreinen, aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps erhältlich. Nach Selektion lassen sich derartige hochreine Zellsuspensionen in einem aktiv begasten und geregelten Bioreaktor mit einer Zellkonzentration von mindestens 1×105 Zellen/ml bereitstellen, vorzugsweise mit mindestens 2×105 Zellen/ml, weiter bevorzugt mit 5×105 Zellen/ml und am Bevorzugtesten mit wenigstens 6×105 Zellen/ml.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen können folgende Schritte umfassen:
    • 1. Herstellung und Kultivierung genetisch modifizierter Stammzellen.
    • 2. Herstellung einer Zellsuspension aus Stammzellen gemäß Punkt 1.
    • 3. Expansion von Stammzellen gemäß Punkt 2. in einem aktiv begasten, geregelten Biorektor unter Verwendung eines Expansionsmediums, dass die Differenzierung der Stammzellen verhindert.
    • 4. Differenzierung von Stammzellen unter Verwendung der Zellsuspension aus Punk 2. oder 3., bestehend aus Einzelzellen und/oder Sphäroiden, in einem aktiv begasten, geregelten Biorektor unter Verwendung eines Mediums in der Weise, dass die Differenzierung in den/die gewünschten Zelltyp(en) ermöglicht wird.
    • 5. Selektion hochreiner Zelltypen aus differenzierenden Stammzellen nach Punkt 4. unter Verwendung geeigneter, genetisch modifizierter Stammzellen nach Punkt 1. in der Weise, dass durch Zugabe eines entsprechenden Antibiotikums nur der/die gewünschte(n) Zelltyp(en) in einem aktiv begasten Bioreaktor angereichert wird/werden.
    • 6. Herstellung einer homogenen Suspension hochreiner Zelltypen.
  • Methoden zur Herstellung von genetisch modifizierten Stammzellen insbesondere embryonaler Stammzellen (ESC), sowie Methoden zur Selektion eines bestimmten Zelltyps aus Stammzellen sind von Klug et al. (J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) und Soria et al. (Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2): 157–62) beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird hierzu ein Nukleinsäure-Fragment, das spezifisch die Expression eines Gens in dem gewünschten Zelltyp steuert, mit einem Reporter-Gen unter Bildung eines Reporter-Gen-Konstrukts gekoppelt. Das Reporter-Gen-Konstrukt wird in mindestens eine Stammzelle unter Bildung genetisch modifizierter Stammzelle(n) eingeführt. Die genetisch modifizierten Stammzellen werden expandiert und differenziert. Das eingeführte Reporter-Gen-Konstrukt ermöglicht die Selektion eines bestimmten Zelltyps aus den differenzierenden Stammzellen.
  • Als Nukleinsäure-Fragment, das spezifisch die Expression eines Reporter-Gens in dem gewünschten Zelltyp steuert, eignet sich im Prinzip jeder Zelltyp-spezifische Promoter. Beispielsweise wurden für die Selektion von Herzmuskelzellen der alpha-MHC Promoter (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) oder der MLC-2v Promoter (Muller M. et al. FASEB J. 2000 Dec; 14(15): 2540–8.) verwendet, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonderst bevorzugt sind. Für die Selektion von Insulin produzierenden Zellen ist beispielsweise der Insulin-Gen Promoter geeignet (Soria et al. Diabetes. 2000 Feb.; 49 (2): 157–62), während die Selektion von Endothelzellen bevorzugt unter Verwendung des E-Cadherin-, des Endomuzin-, oder des Flk1-Promoters durchgeführt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zur Selektion verwendete Reporter-Gen ein Antibiotikum-Resistenz-Gen und die Selektion eines bestimmten Zelltyps erfolgt durch Zugabe eines geeigneten Antibiotikums im aktiv begasten, geregelten Bioreaktor.
  • Eine Zellsuspension zur Sphäroid-Bildung nach dem erfindungsgemäßen Verfahrens kann mittels enzymatischem Verdau oder durch andere bekannte oder geeignete Methoden aus geeigneten Stammzellen hergestellt werden. Die gewünschte Zelldichte wird durch Verwendung eines geeigneten Zellkulturmediums eingestellt.
  • Die Expansion und Differenzierung von Stammzellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, ebenso wie die Selektion eines bestimmten Zelltyps kann in einem durchgehenden Bioprozess im selben Bioreaktor durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in Suspension durchgeführt. In einer einfachen Ausführung wird die Suspension zusätzlich gerührt. Hierzu eignet sich beispielsweise ein Rührkessel-Bioreaktor.
  • Vor Beginn der Differenzierung kann eine Expansion der Stammzellen erfolgen. Hierzu wird vorzugsweise ein Medium verwendet, dass die Differenzierung der Stammzellen verhindert. Bei der Verwendung von ESC der Maus kann dem Medium das Cytokin Leukemia Inhibitory Factor (LIF) hinzugefügt werden, um die Differenzierung zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführung wird die Expansion von Stammzellen in Suspension auf Microcarriern durchgeführt. Geeignete Microcarrier, die für die Expansion von ESC bevorzugt verwendet werden, sind: Gelatine-, Fibronectin, Laminin- oder Matrigel-beschichtete Cytodex 1 oder Microhex Microcarrier (siehe Beispiel 2). Microcarrier, die für die Expansion anderer Stammzellen geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt. In einer weiter bevorzugten Ausführung werden Stammzellen in Suspension in Sphäroiden expandiert.
  • Zur Differenzierung werden die Stammzellen vorzugsweise in einem Medium kultiviert, dass für die Differenzierung geeignet ist. Hierbei kann vorzugsweise eine weitere Expansion der Zellen erfolgen. Um die Differenzierung in einen bestimmten Zelltyp zu steuern, können dem Medium Substanzen zugegeben werden. Eine Differenzierung zu Herzmuskelzellen kann Vorzugsweise durch die Zugabe von DMSO und besonders bevorzugt durch Zugabe von Retinsäure zum Kulturmedium bewirkt werden (Beispiel 4). Eine Differenzierung zu Insulin-produzierenden Zellen erfolgt vorzugsweise durch die Zugabe von Nikotinamid.
  • Die Expansion und Differenzierung von Stammzellen sowie die Selektion eines bestimmten Zelltyps wird der Einheit halber in einem Rührkesselbioreaktor durchgeführt, ist jedoch auch auf andere Reaktortypen übertragbar. Beispielsweise kann das Verfahren in einer Blasensäule, einem Airlifter oder einem Fließbettreaktor mit und ohne Wirbelschicht durchgeführt werden (siehe Schema der Bioreaktoren in 3). In einer bevorzugten Ausführung hat der verwendete Bioreaktor ein Reaktorvolumen von mindestens 0,25 Litern, weiter bevorzugt wird ein Reaktorvolumen von mindestens 0,5 Litern, insbesondere ein Volumen von mindestens 1 Liter und am meisten bevorzugt ein Volumen von mindestens 2 Litern. Das maximale Reaktorvolumen, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, ist im Prinzip nur durch die technische und physikalische Machbarkeit begrenzt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in den größten, technisch realisierbaren Bioreaktoren von derzeit etwa 10.000 Litern durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Differenzierung von Stammzellen durch die Bildung von Sphäroiden durchgeführt. Bei der bevorzugten Verwendung von ESC werden diese Sphäroide als Embryoid Bodies (EBs) bezeichnet. Erstmals konnte mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Bildung von EBs in einem geregelten Rührkessel-Bioreaktor direkt aus einer Stammzellsuspension heraus durchgeführt werden. Im Verlauf der Differenzierung wachsen die entstandenen Sphäroide bezüglich des Durchmessers und der Zellzahl an, wobei die Anzahl der Zellen pro EB mit Hilfe der Rührerdrehzahl gezielt geregelt werden kann. Vorzugsweise werden die Bedingungen so gewählt, dass ein Sphäroidwachstum auf durchschnittlich unter 30.000 Zellen je Sphäroid begrenzt ist. Das bedeutet, dass die durchschnittliche Zellzahl je Sphäroid begrenzt sein soll, während ein Teil der Sphäroide auch mehr Zellen enthalten kann.
  • Die Bildung von Sphäroiden im aktiv begasten Rührkessel-Bioreaktor wird unter anderem von folgenden Faktoren beeinflusst: die Viskosität des verwendeten Kulturmediums, die Art des verwendeten Rührers (Größe und Geometrie), die Art der Begasung, die Art des verwendeten Bioreaktors (Größe und Geometrie) und die Rührgeschwindigkeit. Weiterhin haben die Zelldichte sowie der verwendete Stammzelltyp selbst einen Einfluss auf die Sphäroid-Bildung und die Sphäroid-Größe. Analog den Beispielen in dieser Erfindung können die Sphäroid-Größe (Zellzahl pro Sphäroid) und die Anzahl der gebildeten Sphäroide im Rührkessel-Bioreaktor durch Einstellen der Rührgeschwindigkeit kontrolliert werden, sofern andere Faktoren konstant gehalten werden. Naturgemäß verändert sich die Sphäroid-Größe und die Anzahl der Sphäroide über den Prozessverlauf aufgrund des Zellwachstums und der voranschreitenden Zelldifferenzierung. Analog zu den dargestellten Beispielen kann die Rührgeschwindigkeit so eingestellt werden, dass Sphäroide einer Größe erhalten werden, die zu einer optimalen Stammzelldifferenzierung in den gewünschten, differenzierten Zelltyp führt.
  • In einer Ausführungsform wird der erfindungsgemäße Bioprozess mit ESC durchgeführt beispielsweise mit ESC der Maus. Die ESC werden expandiert und differenziert, um beliebige, hochreine Zelltypen aus Stammzellen oder in einer bevorzugten Ausführungsform hochreine Herzmuskelzellen zu erhalten.
  • In einer bevorzugten Ausführung wird die Expansion und die Differenzierung von Stammzellen durch die Bildung von Sphäroiden in Suspension durchgeführt. Bei gegebener, konstanter Reaktorgeometrie kann die Sphäroidgröße in einer Blasensäule oder einem Airlifter beispielsweise mit Hilfe der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums bzw. der Menge an durchströmendem Gas gesteuert werden.
  • In einem Fließbettreaktor mit Wirbelschicht kann die Bildung von Sphäroiden durch die im Fleißbett verwendeten Partikel kontrolliert werden. Unter Partikeln ist jede Art von Partikeln gemeint, die zur Verwendung in einem Fließbettreaktor geeignet sind, unabhängig davon ob sie aus Glas, Kunststoff, Metall, Porzellan oder anderen Materialien bestehen und welche Größe diese haben. Es ist offensichtlich, dass die der Zellsuspension hinzugefügten Partikel einen Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden und die Sphäroid-Größe haben. Werden die zugegebenen Partikel – Art und Konzentration – konstant gehalten, kann die Sphäroid-Bildung und die Sphäroid-Größe im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hilfe der Strömungsgeschwindigkeit kontrolliert werden.
  • In einem Fließbettreaktor ohne Wirbelschicht, lässt sich die Sphäroidbildung mit Hilfe der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums kontrollieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt erstmals Verfahren bereit mit dem Zellsuspensionen erhalten werden können, bestehend aus einem Medium und darin enthaltenen Zellen eines hochreinen, aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps wobei die Zellen aus Körpern von weniger als 1000 Zellen, vorzugsweise maximal 100 Zellen weiter bevorzugt maximal 10 Zellen und am bevorzugtesten aus einer Zelle bestehen. Bevorzugt wird eine Zellsuspension des gewünschten Zelltyps bereitgestellt, die fast ausschließlich aus Einzelzellen besteht und die Zellen gemessen in einem Trypanblau Assay zu mindestens 90% aus lebenden Zellen bestehen, vorzugsweise zu 95% lebenden Zellen und am meisten bevorzugt zu 97% aus lebenden Zellen.
  • Um aus Sphäroiden oder Zellaggregaten eines hochreinen Zelltyps, Suspensionen zu erhalten, die fast ausschließlich aus vitalen Einzelzellen bestehen, wird beispielsweise ein Verfahren gewählt, bei dem die Zellaggregate zunächst in einem geeigneten Puffer inkubiert werden. Bevorzugte Puffer sind PBS oder HEPES und besonders bevorzugt sind Puffer, die einen geringen Gehalt an Kalzium-Ionen aufweisen. Die Sphäroide oder Zellaggregate werden mindestens 5 Minuten, bevorzugt mindestens 15 Minuten insbesondere mindestens 30 min bei einer bevorzugten Temperatur von beispielsweise 36–38°C und der Einfachheit halber unter mechanischer Behandlung inkubiert. Als mechanische Behandlung kommt jede Methode in Frage, bei der die Zellen gerührt, geschüttelt oder auf eine andere Weise bewegt werden, ohne die Zellen hierbei zu schädigen. Besonderst bevorzugt sind mechanische Behandlungen, die im technischen Maßstab beispielsweise in einem geeigneten Bioreaktor erfolgen können. Hierzu zählt beispielsweise das Rühren mit einem geeigneten Rührer in einem Rührkessel-Bioreaktor. Der Inkubation in einem Puffer kann eine enzymatische Behandlung beispielsweise mit Proteasen folgen. Geeignete Enzyme oder Enzym-Gemische zum Vereinzeln von Zellen sind Accutase, Collagenase, Dispase oder Trypsin, wobei Trypsin besonderst bevorzugt wird.
  • In einem bevorzugten Verfahren werden die Sphäroide oder Zellaggregate mindestens 5 Minuten, bevorzugt mindestens 15 Minuten am meisten bevorzugt mindestens 30 min bei einer Temperatur von ungefähr 37°C und bevorzugter Weise unter mechanischer Behandlung mit dem Enzym oder Enzym-Gemisch inkubiert. Bevorzugt sind mechanische Behandlungen, die im technischen Maßstab in einem geeigneten Bioreaktor erfolgen können. Die enzymatische Behandlung wird bevorzugt in der Weise durchgeführt, dass eine Suspension, die vorzugsweise fast ausschließlich aus Einzelzellen besteht, erhalten wird. Die Enzymatische Behandlung kann beispielsweise durch die Zugabe von Serum oder geeigneten Puffern, die die Wirkung des Enzyms hemmen, gestoppt werden. Auf diese Weise lassen sich hochreine Zellsuspensionen herstellen, die mehr als 50% Einzelzellen, bevorzugt mindestens 80% Einzelzellen und insbesondere über 90% Einzelzellen aufweisen.
  • Die Vitalität der Zellen kann beispielsweise mit einem Trypanblau Assay bestimmt werden. Der Grad der Zellvereinzelung kann beispielsweise durch eine lichtmikroskopische Analyse im Phasenkontrast bestimmt werden. Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Sphäroiden ist die Behandlung mit Ultraschall. Die vereinzelten Zellen eines bestimmten, hochreinen Zelltyps können in einer geeigneten Konzentration in jedem geeigneten Puffer oder Medium suspendiert werden, um erfindungsgemäße Suspensionen für die Transplantation, für das Tissue Engineering oder für die Beschichtung von Platten für die Pharmaforschung oder die Medizin- und Biotechnologie zu erhalten, um nur einige Anwendungsmöglichkeiten zu nennen.
  • Es wird vermutet, das die erfindungsgemäßen Suspensionen, die weitgehend aus Einzelzellen bestehen, bei der Transplantation gegenüber größeren Sphäroiden oder Zellaggregaten verbesserte Chancen für ein Anwachsen im Organ haben. In der Regel werden die Zellen bei der Transplantation durch dünne Kanülen einer Spritze oder eines Katheders gedrückt wobei Einzelzellen gegenüber größeren Körpern zerstörenden Scherkräften weit weniger ausgesetzt scheinen. Weiterhin werden Einzelzellen oder kleine Zellaggregate beim Anlagern und Anwachsen an vorhandene Blutgefäße größere Überlebenschancen haben, da eine schnelle Versorgung jeder einzelnen Zelle mit Nährstoffen und Sauerstoff eher gewährleistet ist. Das könnte für erfindungsgemäße Suspensionen aus hochreinen Herzmuskelzellen besonders vorteilhaft sein, da Herzmuskelzellen gegenüber einer Sauerstoffunterversorgung besonderst empfindlich sind. Das bessere Anwachsverhalten implantierter Zellen erfindungsgemäßer Suspensionen ermöglicht verbesserte Therapien durch weniger benötigte Transplantatzellen einerseits und weniger absterbende Implantatzellen andererseits. Somit wird die Belastung während einer Therapie durch tote Zellen und überflüssiges Suspensionsvolumen verringert und Therapiekosten werden bei verbesserter Genesung und erniedrigten Zellzahlen gesenkt. Ein weiterer Vorteil erfindungsgemäßer Einzelzellsuspensionen ist ein gleichmäßiges Verteilen des jeweiligen Zelltyps im Zielgewebe.
  • Die Bereitstellung homogenerer Einzellzellsuspensionen eines bestimmten Zelltyps ist jedoch nicht nur zur Behandlung von Herzerkrankungen wie dem Herzinfarkt oder beim Zellverlust durch Entzündungen am Herzen entscheidend. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird es erstmals möglich, hochreine erfindungsgemäße Zellsuspensionen in ausreichender Menge und Qualität zur Verfügung zu stellen, um zellbasierte Therapien wie das Verabreichen von Dopamin-produzierenden Zellen bei Parkinson Patienten, die Injektion von Nervenzellen in das Rückenmark zur Heilung Querschnittsgelähmter, die Transplantation von Leberzellen bei Leberschäden oder die Bereitstellung von Insulin produzierenden Zellen bei Patienten mit Diabetes durchführen zu können.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die erfindungsgemäßen Suspensionen hochreiner Zelltypen, insbesondere Einzelzellsuspensionen, für ein gleichmäßiges Verteilen des jeweiligen Zelltyps im Zielgewebe und ein effizientes Anlagern an vorhandene Blutgefäße besonders geeignet sind. Daher sind sie zur Verwendung in zellbasierten Therapien prädestiniert.
  • In der Pharma Industrie werden Hochdurchsatzverfahren eingesetzt, bei denen Zellen, die auf Zellkulturplatten verschiedener Formate aufgebracht sind, mit einer Vielzahl von Substanzen behandelt werden. Ziel ist die Identifizierung und Testung neuer Wirkstoffe. Bisher werden bei diesen Verfahren in der Regel etablierte Zelllinien wie HEK-293 Zellen, CHO-K1 Zellen aus dem Hamster oder Tumorziellinien wie COS-7 Zellen verwendet (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.). Erfindungsgemäß wird es nun ermöglicht, Hochdurchsatzverfahren mit spezifischen Zelltypen wie Herzmuskelzellen, Insulin produzierenden Zellen, Gefäßendothelzellen, Neuronalen Zellen oder Leberzellen durchzuführen, um nur einige zu nennen. Gegenüber Fibroblasten- oder Tumorzelllinien haben differenzierte Zellen eines bestimmten Typs den Vorteil, dass sie alle Gene exprimieren und damit alle Proteine enthalten, die für den jeweiligen Zelltyp typisch sind, inklusive pharmakologisch wichtiger Proteine wie Rezeptoren, Kinasen, Ionenkanäle und Faktoren, die an Signaltransduktionskaskaden beteiligt sind, um nur einige zu nennen. Mit Hilfe spezifischer Zelltypen ist es daher möglich Wirksubstanzen zu identifizieren und zu testen, die eine multiple Wirkung auf zahlreiche Makromoleküle in der Zelle haben (Numann R, Negulescu PA. Trends Cardiovasc Med. 2001 Feb; 11(2): 54–9.). Erfindungsgemäß ist die Anwendung spezifischer Zelltypen als die Vorraussetzung zur Etablierung innovativer Verfahren zur Identifizierung neuer Zielgene („Target Identification"), zur Validierung und Charakterisierung bereits identifizierter Zielgene („Target Validation") und zur Identifizierung neuer pharmakologischer Wirksubstanzen geschaffen, um nur einige Verfahren zu nennen. Im Prinzip können für solche Verfahren primäre Zellen verwendet werden, die aus Organen oder Geweben von Tieren isoliert werden. Ein entscheidender Nachteil ist, dass die Qualität von Primärzellen aufgrund von Alters- und/oder anderen, individuellen Unterschieden von Tier zu Tier schwankt. Organe und Gewebe bestehen in der Regel aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen und Methoden zur Isolation eines gewünschten Zelltyps aus dem komplexen Gewebe bestehen oft nicht. Darüber hinaus ist es für viele Hochdurchsatzverfahren entscheidend, dass die verwendeten Zellen genetisch verändert werden können, um ein auswertbares Signal in einem entsprechenden Verfahren zu erzeugen. Die genetische Modifikation primärer Zellen ist jedoch in der Regel technisch aufwendig. Die Verwendung von Primärzellen ist aus ethischen Gründen ausgeschlossen, sobald es sich um Zellen aus dem Menschen handelt wie dessen Herzmuskelzellen, pankreatische Beta Zellen oder Leberzellen.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es erstmals möglich, reproduzierbar, hochreine Zellen eines bestimmten Typs in einer Menge bereitzustellen, die für Pharmakologische-, Medizinische- und Biotechnologische-Verfahren geeignet sind. Ein weiterer, wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Zellsuspensionen und Einzelzellen ist die Möglichkeit, die Zellen auf der Ebene der Stammzelle genetisch zu modifizieren. Damit können interessante Ziel-Gene nach Bedarf aktiviert oder inaktiviert werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Einführung von Reporter-Genen und/oder Reporter-Gen-Konstrukten in Stammzellen. Diese Konstrukte können so gewählt werden, dass in den erfindungsgemäßen Zellen ein Signal erzeugt wird, welches in Pharmakologischen-, Medizinischen- oder Biotechnologischen-Verfahren auswertbar ist.
  • Für Pharmakologische-, Medizinische- und Biotechnologische-Verfahren ist es entscheidend, dass Formate, bevorzugt Plattenformate, vorliegen, die einen hochreinen Zelltyp in einer reproduzierbaren Zellzahl und Zellverteilung enthalten. Als Plattenformate sind beispielsweise Multiwell-Platten geeignet, die üblicherweise 6 Wells, 24 Wells, 96 Wells, 384 Wells oder 1536 Wells enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt erstmals Formate zur Verfügung, die Formateinheiten aufweist die wiederum Bereiche aufweisen in denen ein Zelltyp homogen verteilt vorliegt. In einer bevorzugten Ausführung ist der Zelltyp eine Herzmuskelzelle. In einer weiter bevorzugten Ausführung werden die Zellen auf den Formaten in einer Dichte und einer Verteilung eingesetzt, in der sich die meisten, vorzugsweise alle Zellen berühren. Weiter bevorzugt ist eine Ausführung, bei der die Zellen in den Formaten in mindestens einer Dimension nahezu einschichtig vorliegen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden hochreine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus ESC selektierte Herzmuskelzellen verwendet, die homogen und einschichtig auf Platten aufgetragen werden und sich weitestgehend berühren, so das ein funktionelles Synzytium entsteht. In einer am meisten bevorzugten Ausführung enthalten die verwendeten Herzmuskelzellen mindestens ein, bevorzugt zwei Reporter-Gen-Konstrukte, die zur Verwendung in Reportergen-Assays geeignet sind.
  • Unter Formaten im Sinne der Endung versteht man Anordnungen, Träger und Matrizes mit Beschichtungen oder ineinandergreifende Strukturen.
  • Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung eines künstlichen Gewebes oder Organs enthaltend mindestens eine Zelle, hergestellt nach dem weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Selektion bestimmter Zelltypen aus Stammzellen. Zur Erzeugung des Organs oder Gewebes kann ein oder mehrere erfindungsgemäßer) Zelltypen) miteinander, mit anderen geeigneten Zelltypen oder mit geeigneten Trägern kombiniert werden. Unter anderen „geeigneten Zelltypen" im Sinne der Erfindung wird eine nicht nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Zelle verstanden, die für die Bildung des künstlichen Organs oder Gewebes erforderlich ist oder die Teil des künstlichen Gewebes oder Organs ist.
  • Unter einem Träger im Sinne der Erfindung versteht man eine Substanz, Molekül, Material oder Matrix, die (das) als chemische, physiologische oder mechanische Unterstützung für das herzustellende Gewebe oder Organ dient. Geeignete Träger sind beispielsweise Zellkulturplatten verschiedener Formate.
  • Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen mit Bezug auf Figuren veranschaulicht. Die generelle Gültigkeit der Erfindung wie oben beschrieben wird durch die Beispiele nicht eingeschränkt.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt 71 ESC, die 48 Stunden auf Microcarriern kultiviert werden (Lichtmikroskopische Aufnahme im Phasenkontrast). (A) Gelatine-beschichtete Microhex Microcarrier (Durchmesser: 125μm); (B) Fibronektin-beschichtete Cytodex 1 Microcarrier (Durchmesser: 180μm). Beide Carrier sind geeignet, um ein Anheften und kultivieren von ESC zu ermöglichen.
  • 2 zeigt die durchschnittlichen Wachstumsraten u (siehe Gleichung 1) von zwei ESC Monolayerkulturen (gemittelt über jeweils 7 Passagen), und die durchschnittlichen Wachstumsraten von vier ESC Microcarrierkulturen kultiviert auf Fibronectin beschichteten Cytodex 1 Microcarriern in Spinnern (gemittelt über jeweils 3 Passagen). Die Wachstumsraten der ESC sind in beiden Kultursystemen (Monolayerkultur bzw. Suspensionskultur auf Microcarriern) gewissen Schwankungen unterworfen. Die mittleren Wachstumsraten haben über die gemessene Passagenzahl die gleiche Größenordnung.
  • 3 zeigt schematisch den Aufbau verschiedener Spinnersysteme (1.A-D) und aktiv begaste Bioreaktorsysteme. Die offenen, weiß gefüllten Kreise bezeichnen Gasblasen, gefüllte Kreise bezeichnen Mikropartikel (unter 2.-4.). Die großen, schwarzen Pfeile bezeichnen den Gaseintrag in das jeweilige System. Die feinen Pfeile in 1.A-D bezeichnen die Strömungs- und die Umdrehungsrichtung des Rührers. Schwach angedeutete Punkte (1.A-D) bezeichnen Zellen, Microcarrier oder Sphäroide. Unter 1.A-D sind verschiedene Spinnersysteme gezeigt, die sich im wesentlichen im verwendeten Rührer unterscheiden. Der Gaseintrag erfolgt bei diesen Systemen allein überden Kopfraum. Unter 2. ist der schematische Aufbau eines Rührkesselbioreaktors gezeigt, bei dem lediglich das aktive Begasungssystem in Form von A eines Microspargers und B in Form eines Begasungsrings hervorgehoben ist. In schwarz ist ein Blattrührer angedeutet. Unter 3. ist der schematische Aufbau verschiedener Typen von Airlifter Bioreaktoren gezeigt. A Blasensäule, B Airlifter Bioreaktor mit internem Loop und C Airlift Bioreaktor mit externem Loop. Unter 4. sind Bioreaktoren mit blasenfreier Begasung gezeigt. A Rührkesselbioreaktor mit Begasungskorb, B Fließbettreaktor mit und C ohne Wirbelschicht. Potentiell sind alle dargestellten aktiv begasten Reaktortypen geeignet, um die Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen in hoher Dichte durchzuführen, um damit spezifische Zelltypen aus differenzierten Stammzellen im technischen Maßstab bereitstellen zu können. Die Bildung von Sphäroiden, die für die Differenzierung mancher Stammzellen entscheidend ist, kann je nach Reaktortyp durch die Rührgeschwindigkeit, die Fließgeschwindigkeit des Kulturmediums, die Art der erzeugten Strömung oder durch die Art des verwendeten Fließbetts beeinflusst und gesteuert werden.
  • 4A beschreibt den schematischen Aufbau eines geregelten, aktiv begasten Rührkessel-Bioreaktors mit eingezeichneter Meß- und Regeleinheit für Gase, Temperatur und pH. Zusätzlich sind Systeme zur Medienversorgung, Probentnahme und Ernte gekennzeichnet. B und C zeigt schematisch auftretende Strömungen in einem Medium bzw. einer Zellsuspension bei Verwendung von B, eines Blattrührers mit schräggestellten Blättern und C, eines Paddelrührers (Rushton turbine). Im Prinzip sollten beide Rührertypen zur Erzeugung geeigneter Sphäroide aus Stammzellen in einem Bioreaktor geeignet sein, In dieser Erfindung wird die kontrollierte Bildung von Sphäroiden beispielhaft mit einem unter B gezeigten Blattrührer durchgeführt (siehe Beispiel 4).
  • 5 Zur Optimierung der EB-Bildung, Stammzellexpansion und Differenzierung wurden ESC über 9 Tage bei Rührerdrehzahlen von 35, 65, 80 und 120 Upm im Bioreaktor kultiviert. In Diagramm A sind die Zellzahlen der entsprechenden Bioreaktorläufe dargestellt. Diagramm B zeigt die Vervielfachung der Anfangszelldichte (Anfangszelldichte pro Endzelldichte) nach 9 Tagen Kultivierung im Bioreaktor bei Rührerdrehzahlen von 35, 60, 80 und 120 Upm. Wie aus den Diagrammen hervorgeht wird die höchste Zelldichte (1,29×107 Zellen/ml) und folglich die größte Vervielfachung der Anfangszellzahl (129fach) in dem verwendeten System bei einer Rührergeschwindigkeit von 65 Upm erreicht. Bei dieser Rührergeschwindigkeit wird gleichzeitig ein gleichmäßiges Anwachsen der EBs erhalten. Die erfolgreiche Differenzierung wird durch die Bildung von Herzmuskelzellen nachgewiesen
  • 6 zeigt die Bildung von EBs im Rührkessel-Bioreaktor bei 65 Upm (siehe Beispiel 3). Zu Beginn der Kultivierung liegen die ESC als Einzelzellen in Suspension vor (Start). Im weiteren Verlauf (Tag1) bilden sich Sphäroide, bestehend aus wenigen (~10–100) Zellen. Die Bilder (Lichtmikroskopische Aufnahmen im Phasenkontrast) zeigen deutlich die Zunahme der EB-Größe während der weiteren Kultivierung über 9 Tage. Zum Größenvergleich ist ein schwarzer Balken mit einer Länge von 100μm dargestellt. Die EBs zeichnen sich durch eine relativ gleichmäßige Form und Größe aus.
  • 7A zeigt ein Diagramm, in dem die EB-Dichte (EB/ml Kulturmedium) in Abhängigkeit der Rührerdrehzahl über die Kultivierungsdauer dargestellt ist. Ausgenommen bei einer Rührerdrehzahl von 35Upm, bei der die ESC offensichtlich sehr früh zu wenigen, großen Sphäroiden fusionieren, wird bei allen Umdrehungsgeschwindigkeiten zunächst (Tag 2) eine hohe EB-Dichte (3.000–8.000 EBs/ml) erhalten. Nach einer Verringerung der EB-Dichte, die laut Literatur durch EB-Fusionen erfolgt, stabilisiert sich die EB-Zahl noch etwa 4 Tagen und bleibt weitgehend unverändert.
    B zeigt die durchschnittliche EB-Größe (Anzahl der Zellen/EB) nach 2, 3, 4, 7 und 9 Tagen EB-Bildung im Bioreaktor bei Rührerdrehzahlen von 35, 60, 80 und 125Upm. Die größten EBs mit durchschnittlich fast 50.000 Zellen/EB werden bei einer Rührergeschwindigkeit von 35Upm erhalten. Hierbei kommt es häufig zur Fusion von EBs, da gleichzeitig nur ein geringes Anwachsen der Zellen erfolgt (siehe 5A und B). Während bei 65Upm EB-Größen erreicht werden, die auch in anderen Systemen zur EB-Bildung beobachtet wurden (20.000–30.000 Zellen/EB) ist die maximale EB-Größe bei 80 bzw. bei 125Upm offensichtlich limitiert.
  • 8A zeigt ein Diagramm zur Differenzierung genetisch veränderter ESC und die Selektion reiner Herzmuskelzellen aus diesen Stammzellen im gerührten, geregelten Bioreaktor bei einer Rührergeschwindigkeit von 65Upm (siehe Beispiel 4). Dargestellt ist die Zelldichte (Zellen/ml) über die Zeit. Nach 9 Tagen Differenzierung durch die Bildung von EBs, wird ein Antibiotikum hinzugefügt, um die Herzmuskelzellen selektiv anzureichern. Bei diesem Bioprozess wird am Ende der Selektion eine Zelldichte von 6,38×105 Herzmuskelzellen/ml und damit eine Gesamtzellzahl von 1,28×109 Herzmuskelzellen im 2 L Bioreaktor erhalten.
    B zeigt den mittels Durchflusszytometrie (FACS) gemessenen Anteil der SSEA-1- und E-Cadherin positiven Zellen über den Verlauf der in Beispiel 4 beschriebenen Bioreaktorkultivierung. Die FACS-Analyse zeigt eine Reduktion der SSEA-1 positiven Zellen von 75% auf 2% innerhalb von 9 Tagen Kultivierung und EB-Bildung im Bioreaktor. Nach weiteren 5 Tagen Kultivierung mit einem Antibiotikum können keine SSEA-1 positiven Zellen mehr nachgewiesen werden. Die E-Cadherin Expression der Zellen verringert sich ebenfalls im Verlauf der EB-Bildung (9 Tage) von 93% auf 12%. Während der Selektion erfolgt eine weitere Verringerung der E-Cadherin Expression, so dass nach insgesamt 14 Tagen Kultivierung im Bioreaktor keine E-Cadherin positiven Zellen mehr nachweisbar sind. Die deutliche Abnahme der Expression der Stammzell-spezifischen Marker SSEA-1 und E-Cadherin während der EB-Bildung im Bioreaktor zeigt die Differenzierung der genetisch modifizierten ESC. Nach 9 Tagen EB-Bildung ist noch ein geringer Anteil an SSEA-1 und E-Cadherin positiven Zellen vorhanden. Diese undifferenzierten Zellen werden offensichtlich durch die Antibiotika-Behandlung im weiteren Verlauf der Kultivierung eliminiert. Durch die Selektion werden hochreine Herzmuskelzellen erhalten, die in Form von Sphäroiden (Cardiac Bodies) in Suspension vorliegen (siehe 9).
  • 9A zeigt Gefrierschnitte durch EBs am Tag 9 der Kultivierung und B Gefrierschnitte durch CBs am Tag 18 der Kultivierung, die in dem in Beispiel 4 beschriebenen Bioprozess erhalten werden. Die Schnitte wurden mit dem MF20 Antikörper zum Nachweis gebildeter Herzmuskelzellen immunhistochemisch gefärbt. Während die unter A dargestellten EBs vor Zugabe des Antibiotikums einige Bereiche mit dunkel gefärbten Herzmuskelzellen aufweisen, bestehen die Sphäroide (Cardiac Bodies) offensichtlich durchgehend aus positiv gefärbten (dunkle Färbung) Herzmuskelzellen. Der schwarze Balken zeigt die Größenverhältnisse.
    C zeigt die immunhistochemische Anfärbung (MF20 Antikörper und Kernfärbung mit Hämalaun) plattierter Zellen, die durch die Vereinzelung der in B gezeigten CBs erhalten wurden (auf Gelatine beschichteten Zellkulturplatten 48 Stunden nach dem Plattieren). Die Zellen wurden in einer Dichte von 4,7×104 Zellen/cm2 ausgesät. Die schwarzen Pfeilspitzen verdeutlichen beispielhalt die Zellkerne.
  • Beispiele
  • Standard 1: Kultivierung muriner embryonaler Stammzellen (ESC) als Monolayerkultur
  • Zur Kultivierung undifferenzierter J1 ESC (Lee et al., Cell 1992 Jun 12; 69(6): 915–26) wird ESC-Kulturmedium verwendet (D-MEM, Kat.Nr. 32430-027 (Gibco), 10 % FCS (PAA); 1% nichtessentielle Aminosäuren (MEM NEAA, Sigma); 0,1mM Mercapthoethanol, 1000U/ml LIF/Esgro (Chemicon)). Die Zellen werden auf 100mm Gelatine beschichteten (Gelatine, Sigma) Zellkulturschalen ausplattiert und alle 48 Stunden durch Trypsin-Behandlung wie folgt vereinzelt. Die Zellen werden mit PBS (Gibco) gewaschen, mit Trypsin-EDTA (Gibco) überschichtet und 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Die vollständige Vereinzelung der Zellen erfolgt durch mechanisches Scheren mit einer Pasteurpipette. Die Trypsin-Behandlung wird durch Zugabe von ESC-Kulturmedium zur Zellsuspension beendet. Nachfolgend wird die Zellsuspension zentrifugiert, der Trypsin-haltige Überstand wird verworfen und die Zellen werden in frischem ESC-Kulturmedium resuspendiert. Testzellen werden mit 0,4% Trypanblau-Lösung (Sigma) gefärbt. Dazu werden 50μl Zellsuspension mit 50μl Trypanblau-Lösung gemischt und 2min inkubiert. Der Farbstoff dringt dabei in Zellen mit defekter Membran ein, die dadurch blau angefärbt werden. Die Anzahl der lebenden, ungefärbten und der toten, blau gefärbten Zellen wird durch Auszählen in einer Neubauerzählkammer bestimmt. Zum Animpfen von 100mm Schalen werden jeweils 2×106 Zellen in 10ml Medium verwendet. Das Medium wird alle 24 Stunden gewechselt. Die Kultivierung auf der Oberfläche von Zellkulturschalen wird als Monolayerkultur bezeichnet.
  • Die Differenzierung von ESC Zellen wird durch Zusatz von Differenzierungsmedium eingeleitet, bestehend aus ESC-Kulturmedium ohne Zusatz von LIF.
  • Standard 2: Durchflusszytometrie (FACS) zum Nachweis von SSEA-1 und E-Cadherin
  • Als Marker für undifferenzierte ESC werden Antikörper zum Nachweis von SSEA-1 (Stage Specific Embryonic Antigen) und E-Cadherin verwendet. Bei SSEA-1 handelt es sich um eine glykosyslierte Membranstruktur, die auf undifferenzierten ESC exprimiert wird (Solter und Knowles, Proc Natl Acad Sci USA 1978 Nov; 75(11): 5565–9; Solter und Knowles, Curr Top Dev Biol 1979; 13 Pt 1: 139–65). E-Cadherin ist ein membrangebundenes Zell-Adhäsionsmolekül, dessen Expression im Zuge der Differenzierung von ESC herunterreguliert wird (Butz und Larue, Cell Adhes Commun 1995 Nov; 3(4): 337–52, Sefton et al., Development 1992 May; 115(1): 313–8).
  • Zur FACS-Analyse werden 4×106 ESC vereinzelt und in 100μl FACS-Puffer (PBS, 0,1% Natriumazid, 2% BSA (Sigma)) aufgenommen. Unspezifische Bindestellen werden durch 15min Inkubation auf Eis mit FC-Block (mCD16/CD32 FcγIII/II receptor, 1μg/106 Zellen) und durch Zugabe von bovine-IgM (Sigma, 1 : 100) in FACS-Puffer geblockt. Danach werden 3×25μl der Zellsuspension in Reaktionsgefäße gegeben, abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die drei Ansätze werden wie folgt verwendet. Im 1. Ansatz dienen ungefärbte Zellen als negativ Kontrolle. Dazu werden die Zellen in 500μl FACS-Puffer resuspendiert. Für den 2. Ansatz werden als Isotypenkontrolle mouse IgM, κ Isotype Standard (BD PharMingen, 1 : 100 in FACS-Puffer) und rat IgG1, κ Isotype Standard (BD PharMingen, 1 : 100 in FACS-Puffer) eingesetzt. Die Zellen werden mit 100μl einer Mischung beider Antikörper resuspendiert, auf Eis inkubiert, gewaschen und mit Anti-mouse PE-konjugiertem IgM Antikörper (Immunotech, 1 : 100) gefärbt. Die zweite Färbung wird mit 100μl anti-mouse FITC konjugiertem IgG (Sigma, 1 : 100) in FACS-Puffer durchgeführt. Zur Analyse werden die Zellen in 500μl Puffer resuspendiert. Im 3. Ansatz erfolgt die spezifische SSEA-1 und E-Cadherin Färbung. Die Zellen werden mit 100μl einer Mischung aus anti-SSEA-1 Antikörper (MC480 Hybridoma-Überstand (DSHB), 1 : 10 in FACS-Puffer) und anti-E-Cadherin Antikörper (U3254, Sigma, 1 : 100 in FACS-Puffer) auf Eis inkubiert, gewaschen, mit dem 2. Antikörper gefärbt und in 500μl FACS-Puffer resuspendiert. Die drei Ansätze werden im FACSCalibur Durchflusszytometer (Beckman Coulter) analysiert.
  • Standard 3: Herstellung genetisch modifizierter ESC
  • Die Herstellung genetisch modifizierter ESC-Klone erfolgt nach einer von Klug et al., beschriebenen Methode (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24). Hierzu werden ESC durch Trypsin-Behandlung vereinzelt und das gewünschte Reporter-Gen-Konstrukt wird mit Hilfe der Elektroporation in ESC eingeführt. Durch Zugabe eines geeigneten Antibiotikums lassen sich ESC-Klone isolieren, die das Reporter-Gen-Konstrukt enthalten. Geeignete, genetisch modifizierte Klone werden wie herkömmliche ES-Zellen kultiviert und expandiert. Zur Isolierung hochreiner Herzmuskelzellen aus ESC werden genetisch modifizierte ESC-Klone hergestellt, die das folgende Reporter-Gen-Konstrukt enthalten. Der Maus alpha-MHC-Promoter steuert die Herzmuskelzell-spezifische Expression des Gentamycin-Resistenzgens (aph, verleiht Resistenz gegen das Antibiotikum Gentamycin oder G418). Das Konstrukt, das als MHC-neo/pGK-hygro bezeichnet wird, ist im Detail bei Klug et al. beschrieben (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24).
  • Beispiel 1: Expansion von ESC in Suspension auf Petrischalen
  • Die Expansion von ESC in Suspension wird auf Microcarriern durchgeführt. Hierfür werden Microhex (Nunc) und Cytodex 1 (Amersham Pharmacia Biotech) Microcarrier verwendet. Microhex Microcarrier sind sechseckige Plättchen aus Polystyrol, einem Kunststoff, der auch für herkömmliche Zellkulturschalen verwendet wird. Diese Microcarrier können mit Proteinen beschichtet werden. Bei der Präparation Gelantine beschichteter Microhex Carrier werden die Plättchen nach dem Abwiegen 30min unter Schwenken mit 1 % Gelatine in Reinstwasser inkubiert, mit ESC-Kultivierungsmedium gewaschen und in einer Konzentration von 13mg/ml Medium zur Kultivierung eingesetzt. Bei Cytodex 1 handelt es sich um einen quellbaren, kugelförmigen Microcarrier auf Dextran Basis, dessen Oberfläche mit geladenen N,N-Diaminoethyl (DEAE)-Gruppen quervernetzt ist. Dieser Microcarrier kann ebenfalls zusätzlich mit Proteinen beschichtet werden. Fibronektin gebundene Cytodex 1 Microcarrier werden folgendermaßen präpariert. Die Microcarrier werden in PBS über Nacht gequollen. Der Überstand wird dekantiert und die Microcarrier werden mit frischem PBS gewaschen. Die Sterilisation der Microcarrier erfolgt durch Autoklavieren. Zur Beschichtung werden die sterilisierten Microcarrier absedimentiert und der Überstand verworfen. Die Carrier werden mit Fibronektin (Stammlösung: 1mg/ml in Reinstwasser, Boehringer) für 30min bei Raumtemperatur inkubiert, mit ESC-Kultivierungsmedium gewaschen, in frischem Medium erneut für 30min inkubiert und in einer Konzentration von 3mg Cytodex 1 Trockengewicht pro ml Medium zur Kultivierung eingesetzt.
  • Das Wachstum von ESC auf beschichteten Microcarriern in Suspension wird in Petrischalen untersucht. Dazu werden 100mm Petrischalen mit je 10ml ESC-Kultivierungsmedium, der entsprechenden Menge an Microcarriern und je 2×106 ESC aus Monolayerkultur beimpft und bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank kultiviert. Der Medienwechsel erfolgt alle 48 Stunden. Eine Lichtmikroskopische Auswertung der Kulturen im Phasenkontrast erfolgt täglich.
  • In 1 sind J1 ESC auf Gelatine beschichteten Microhex und auf Fibronektin beschichteten Cytodex 1 Microcarrier gezeigt. Die Versuche zeigen, dass eine gute Anheftung der ESC-Zellen sowohl an Gelatine-beschichtete Microhex als auch an Fibronektin-beschichtete Cytodex 1 Microcarrier stattfindet. Demnach eigenen sich beide Microcarrier zur Expansion von ESC in Suspension. Damit konnte das erste mal gezeigt werden, dass eine Kultivierung pluripotenter Stammzellen auf Microcarriern in Suspension möglich ist, eine wichtige Vorraussetzung für die Anzucht von Stammzellen in skalierbaren Systemen im industriellen Maßstab.
  • Beispiel 2: Kultivierung von ESC in Suspension in Spinnerflaschen
  • Zur Microcarrierkultivierung von ESC in einem gerührten System werden Spinnerflaschen mit Paddelrührern (Bellco) verwendet. Die Flaschen werden mit 50ml Kulturvolumen (2×105 Zellen/ml in ESC-Kulturmedium) beimpft und auf einer Rührstation (Variomag Biosystem, H+P Labortechnik) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Nach einer Initialphase von 4 bis 6 Stunden in Ruhe wird eine Rührergeschwindigkeit von 30Upm eingestellt. Das Medium wird alle 48 Stunden vollständig gewechselt. Nach jeweils 72 Stunden (1. Passage) werden die Zellen von den Microcarriern durch Trypsin-Behandlung abgelöst, vereinzelt und erneut auf frischen Microcarriern ausgesät. Die Zellzahl wird in einer Neubauerzählkammer bestimmt, dabei wird die Anzahl der lebenden Zellen durch Trypanblaufärbung ermittelt.
  • Die Zellen werden über 3 Passagen auf Microcarriern kultiviert. Die Zellzahl in den Spinnern nimmt pro Passage (72 Stunden) von ca. 2×105 auf ca. 1×106 Zellen/ml zu. Damit können die Zellen in der Spinnerkultur je Passage durchschnittlich um das 5fache expandiert werden.
  • In 2 sind die mittleren Wachstumsraten [μ] (siehe Gleichung 1), der Zellen in Spinnern im Vergleich zu Monolayerkulturen dargestellt. Die mittleren Wachstumsraten der Monolayerkulturen entsprechen den Werten der Spinnerkultivierungen.
    Figure 00270001
    μ = Wachstumsrate
    x0 = Anfangszellzahl
    x = Zellzahl
    t = Zeit
  • Nach 3 Passagen werden je 2×106 Zellen aus den Spinnerflaschen in 10ml ESC-Kulturmedium auf 100mm Zellkulturschalen plattiert, um die Zellmorphologie mit Zellen, die durchgehend als Monolayerkulturen kultiviert wurden, zu vergleichen. Der Vergleich der Zellmorphologie plattierter Zellen aus Microcarrierkulturen zeigt keinen Unterschied gegenüber Zellen, die durchgehend als Monolayerkulturen expandiert wurden.
  • ESC sind pluripotent, d.h. sie können durch Differenzierung verschiedene Zelltypen, unter anderem Herzmuskelzellen bilden (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24; Wobus et al., Differentiation 1991 Dec; 48(3): 173–82). Um das Differenzierungspotential von ESC nach der Microcarrierkultivierung zu untersuchen wird getestet, ob bei der Differenzierung Herzmuskelzellen entstehen. Dazu werden jeweils 2×106 Zellen in 10ml Differenzierungsmedium in 100mm Petrischalen eingesät. Das Medium wird alle 48 Stunden gewechselt. Nach 3 Tagen Differenzierung, eingeleitet durch die Bildung von Ebs, werden die Zellen durch Trypsinbehandlung vereinzelt und in Differenzierungsmedium auf 100mm Zellkulturschalen ausplattiert.
  • Wie für herkömmlich kultivierte ESC beschrieben, kann auch für ESC aus Microcarrierkulturen die Bildung von Herzmuskelzellen durch den Nachweis kontrahierender Bereiche auf den Platten und anschließende positive MF20-Färbung der Zellen nachgewiesen werden. Bei der Bildung von Herzmuskelzellen durch Differenzierung wird kein Unterschied zwischen ESC aus Monolayerkulturen und Zellen, die in Suspension auf Carriern kultiviert wurden, festgestellt.
  • Zur weiteren Analyse wird mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS) die Expression von Stammzellmarkern auf Zellen aus Monolayerkulturen versus Zellen aus Suspensionskultur verglichen. Die FACS-Analysen ergeben Schwankungen jedoch keine Abnahme der SSEA-1- und der E-Cadherin-Expression der in Suspension auf Microcarriern kultivierten ESC-Zellen in Spinnern. SSEA-1 und E-Cadherin werden über die gesamte Kulturdauer stabil exprimiert. In Tab.1 sind die FACS-Daten für in Spinnern kultivierte ESC aufgeführt.
  • Tabelle 1: E-Cadherin und SSEA-1 FACS Analyse einer Spinnerkultivierung über 3 Passagen mit J1 ESC auf Microcarriern. Angegeben ist der prozentuale Anteil der Zellen, deren Färbintensität oberhalb von 99% der Isotypenkontrolle liegt. Gezeigt sind die Mittelwerte aus 2 Kultivierungen.
    Figure 00290001
  • Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine Kultivierung pluripotenter ESC auf Microcarriern in Suspension möglich ist, ohne dass die Zellen ihre Wachstums- und Stammzelleigenschaften, wie die Expression von Stammzellmarkern und die Differenzierung in spezifische Zelltypen wie Herzmuskelzellen verlieren. Damit wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals die Expansion von ESC in Suspension ermöglicht.
  • Beispiel 3: EB-Bildung im geregelten, aktiv begasten Bioreaktor
  • Im Folgenden ist ein Verfahren dargestellt, in dem die Bildung von Sphäroiden aus einer ESC Stammzellsuspension direkt in einem skalierbaren System in Form eines geregelten, aktiv begasten Rührkesselbioreaktors erfolgt. Um Sphäroide zu erhalten, die zu einer bestmöglichen Expansion und Differenzierung der verwendeten ESC führen, wird eine Optimierung der Rührerdrehzahl im Bioreaktor durchgeführt, während andere Parameter, die die Sphäroid-Bildung beeinflussen, konstant gehalten werden.
  • Gentechnisch veränderte ESC, die das Konstrukt MHC-neo/pGK-hygro enthalten, werden durch Trypsinbehandlung, vereinzelt und in einer Zelldichte von 2×105 Zellen/ml in Differenzierungsmedium in den Bioreaktor eingebracht. Als Bioreaktor wird ein 2 Liter Rührkesselbioreaktor (Biostat MD, Braun Biotech) mit einem Blattrührer, der eine axiale Strömung erzeugt, verwendet. Der schematische Aufbau des Reaktors ist in 4a dargestellt. Die aktive Begasung, die nach Bedarf mit Druckluft, Kohlendioxid (CO2) oder Sauerstoff (O2) durchgeführt werden kann, wird über eine „digital control unit" (DCU, Braun Biotech) geregelt. Nach Eichung der Sauerstoffelektrode zur Messung des Sauerstoffpartialdrucks (pO2) wird ein Sollwert von 40% Luftsättigung eingestellt, der mit Hilfe der Meß- und Regeltechnik über die gesamte Kulturdauer konstant gehalten wird. Der pH-Wert im Kulturmedium wird mit einer pH-Elektrode gemessen und über die CO2-Zufuhr geregelt.
  • Alternativ kann die Regelung auch durch Zugabe von Säuren oder Laugen erfolgen. Der Sollwert beträgt pH 7,2. Dieser Sollwert wird mit Hilfe der verwendeten Meß- und Regeltechnik im Rahmen einer Abweichung von ±0,3 pH-Einheiten konstant gehalten. Die Bildung von EBs, ausgehend von einer ESC-Suspension, wird über 9 Tage bei folgenden Rührerdrehzahlen durchgeführt: 35, 65, 80 und 120Upm. Der Reaktor wird jeweils mit 1 Liter Kulturvolumen gestartet und nach 48 Stunden Kultivierung auf 2 Liter aufgefüllt. Die Begasung erfolgt bis zum Auffüllen auf das Endvolumen (48h) über den Kopfraum. Danach wird die Gasversorgung mittels Blasenbegasung über einen Microsparger durchgeführt. Bei Bedarf wird zur Vermeidung von Schaumbildung bis zu 0,025 % Antifoam C (Sigma) zugesetzt. Täglich wird 50% des Mediums erneuert. Täglich wird ca. 5ml Probe entnommen und folgende Parameter werden bestimmt: die EB-Dichte, die Zelldichte und die Lebend- und Totzellzahl. Die EB-Dichte wird durch Auszählung im Phasenkontrast ermittelt. Die Zellzählung erfolgt nach der Vereinzelung der Zellen durch Trypsinverdau. Der Anteil an lebenden Zellen wird nach Trypanblaufärbung in einer Neubauer-Zählkammer ermittelt. Die Anzahl der Zellen/EB ergibt sich aus dem Quozienten der Lebendzellzahl (Zellen/ml) und der ermittelten EB-Dichte (EBs/ml). In 5A ist die Zelldichte im Bioreaktor im Verlauf der Kultivierung in den einzelnen Bioreaktorläufen über 9 Tage dargestellt.
  • Die durchschnittliche Zellzahl pro EB in Abhängigkeit der Rührergeschwindigkeit im Bioreaktor ist in Tab.2 und in 7 gezeigt. Bereits nach 48 Stunden ist der Einfluss der Rührergeschwingigkeit auf die EB-Größe deutlich nachweisbar. Bei 35Upm beträgt die durchschnittliche Zellzahl/EB 1.953 Zellen, während bei einer Drehzahl von 125Upm Stunden ein EB nach 48 Stunden durchschnittlich aus 181 Zellen besteht. Im weiteren Verlauf der Kultivierung nimmt die Zellzahl pro EB naturgemäß zu. Beispielsweise wird bei einer Rührergeschwindigkeit von 65Upm nach 48 Stunden eine EB-Größe von 278 Zellen/EB erreicht und die Sphäroide wachsen über die Dauer von 9 Tagen zu einer durchschnittlichen Größe von 22.571 Zellen/EB heran (siehe Tab. 2, 7B). Dieser Verlauf des EB-Wachstums stimmt gut mit publizierten Daten zur EB-Bildung in anderen Systemen überein (Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Demgegenüber werden bei einer Rührergeschwindigkeit von 35Upm bereits nach 3 Tagen Kultivierung EBs mit einer durchschnittlichen Zellzahl von mehr als 11.000 Zellen/EB erhalten, die am Tag 9 der Kultivierung auf mehr als 48.000 Zellen/EB ansteigt. Laut Dang et al. (Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53) kann diese EB-Größe nur durch die Fusion von EBs entstehen, nicht jedoch durch gleichmäßiges Anwachsen aufgrund von Zellteilungen in den EBs. Die Fusion von EBs und die damit einhergehende Bildung nur weniger EBs (siehe 7A) resultiert in einer verhältnismäßig geringen Expansion der Zellen (Vervielfachung nur um den Faktor 18,9 bei 35Upm, siehe Tab.3). Dass die Bildung großer EBs durch EB-Fusion auch die Differenzierung negativ beeinflussen kann wurde berichtet (Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Im Gegensatz dazu wird in dem hier verwendeten System eine durchschnittliche Zellzahl von 10.000 Zellen/EB bei Rührergeschwindigkeiten von 80 bzw. 125Upm nicht erreicht. EBs, die zu einer Zellzahl von 20.000–30.000 Zellen/EB anwachsen, wären jedoch wünschenswert, da diese EB-Größe unter Verwendung von murinen ESC auch mit anderen Systemen erreicht wird und für eine optimale Differenzierung der ESC wichtig zu sein scheint (Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53). Darüber hinaus wird bei einer Rührerdrehzahl von 80 bzw. 125Upm auch eine vergleichsweise geringe Proliferation der differenzierenden ESC beobachtet, die bei 80Upm am Tag 9 zu einer Vervielfachung der eingesetzten Zellen um den Faktor 39,3 und bei 125Upm nur um den Faktor 26,9 führt.
  • Tabelle 2: Zellanzahl pro EB nach 2, 3, 4, 7 und 9 Tagen EB-Bildung im Bioreaktor bei Rührergeschwindigkeiten von 35, 65, 80 und 125Upm.
    Figure 00310001
  • Die bei den einzelnen Rührergeschwindigkeiten ermittelten Zelldichten und die maximal erreichte Expansion der Zellen am Tag 9 ist in Tab.3 wiedergegeben. Die erreichte Lebend-Zelldichte ist in Abhängigkeit der Rührerdrehzahl sehr verschieden. Die höchste Zelldichte wird mit 1,28×107 Zellen/ml bei einer Rührerdrehzahl von 65Upm erreicht. Ausgehend von 2×105 Zellen/ml zu Beginn der Kultivierung wird damit eine 128fache Vervielfachung der Anfangszelldichte erhalten. Gleichzeitig wachsen die EBs bei dieser Umdrehungszahl gleichmäßig an (siehe Tab.3 und 6 und 7A) und eine Differenzierung zu Herzmuskelzellen wird beobachtet. Die Bildung von Herzmuskelzellen ist durch das Entstehen kontrahierender EBs gekennzeichnet. Zusätzlich lassen sich auf Schnitten von EBs Herzmuskelzellen mit Hilfe der MF20-Färbung nachweisen (siehe 9A) Damit ist gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Bildung von Sphäroiden direkt aus einer Stammzellsuspension geeignet ist. Eine Expansion und Differenzierung der verwendeten Stammzellen wird erreicht. Die EB-Bildung, gekennzeichnet durch die Anzahl der gebildeten EBs sowie die sich über den Prozessverlauf verändernde EB-Größe (Zellen/EB), lässt sich gezielt mit Hilfe der Rührerdrehzahl steuern. Es ist offensichtlich, dass Parameter, die einen Einfluss auf die EB-Bildung haben, wie beispielsweise die Rührerdrehzahl bei Rührkesselbioreaktoren oder die Strömungsgeschwindigkeit bei Airlifter-, Fließbett-, Wirbelschichtreaktoren und Blasensäulen, bzw. andere geeignete Parameter bei anderen Reaktormodellen, angepasst werden müssen, um eine geeignete Sphäroidbildung zu erreichen. Die Parameter, welche die Bildung bzw. das Anwachsen der Sphäroide beeinflussen, müssen hierbei dem verwendeten Stammzelltyp ebenso angepasst werden, wie dem spezifischen Zelltyp, der durch Differenzierung der Stammzellen erhalten werden soll.
  • Gegenüber Spinnerflaschen oder anderen nicht geregelten Systemen hat die Verwendung eines geregelten Bioreaktors besondere Vorteile, die für die reproduzierbare Differenzierung von Stammzellen in einen gewünschten Zelltyp entscheidend sind. Alle wichtigen Parameter wie der Sauerstoffpartialdruck (pO2) und der pH-Wert im Kulturmedium können über die Kulturdauer konstant gehalten werden. Das Erzielen hoher Zelldichten, der entscheidende Faktor für die Bereitstellung von klinisch relevanten Zellmengen, kann nur durch die aktive Begasung der Kulturen im geregelten Bioreaktor erreicht werden.
  • Tabelle 3: Dargestellt ist die Anfangs- sowie die Lebendzelldichte am Tag 9 der jeweiligen Bioreaktorprozesse in Abhängigkeit der Rührerdrehzahl. Der resultierende Multiplikationsfaktor ist ebenfalls angegeben.
    Figure 00320001
  • Beispiel 4: Bildung hochreiner Herzmuskelzellen im Bioreaktor
  • Das in Beispiel 3 dargestellte Verfahren zur EB-Bildung im geregelten Bioreaktor wird im Folgenden Beispiel zur Bildung von Herzmuskelzellen aus gentechnisch modifizierten ESC (beinhalten das Konstrukt MHC-neo/pGK-hygro, siehe Standard 3) verwendet. Hierzu wird die EB-Bildung im Rührkesselbioreaktor nach Beispiel 3 bei einer Rührergeschwindigkeit von 65Upm durchgeführt. Dazu werden Stammzellen aus Monolayerkulturen mit ESC-Kultivierungsmedium expandiert und mittels Trypsin-Behandlung vereinzelt. Unter Verwendung von Differenzierungsmedium wird der Bioreaktor mit einem Liter der Zellsuspension (Zelldichte von 2×105 Zellen/ml) angeimpft und die Differenzierung wird über 9 Tage, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. Im Anschluß an die EB-Bildungs- und Differenzierungsphase wird die Selektion von Herzmuskelzellen durch Zugabe von Retinsäure (RA, Konzentration: 10nM im Differenzierungsmedium, Sigma) und Geniticin (G418, Konzentration: 400μg/ml Differenzierungsmedium, Gibco) im aktiv begasten Bioreaktor eingeleitet. Die Kultivierung wird hierbei für weitere 9 Tage fortgesetzt. Dabei wird täglich 50% des Mediums erneuert. Die Ausbeute an generierten Herzmuskelzellen wird durch Trypanblaufärbung bestimmt. Die Lebendzellzahl wird durch Vereinzelung der Zellen nach der in Beispiel 5 beschriebenen Methode und nachfolgende Trypanblaufärbung ermittelt. In 8A sind die Lebendzellzahlen über den Kulturverlauf gezeigt.
  • Um die Reinheit der erhaltenen Herzmuskelzellen zu überprüfen, werden die in Suspension erhaltenen Cardiac Bodies (CB) nach der unter Beispiel 5 beschriebenen Methode vereinzelt. Hierbei werden Einzelzellsuspensionen erhalten, die laut Trypanblaufärbung mindestens zu 90% aus vitalen Herzmuskelzellen bestehen. Die Einzelzellsuspensionen werden auf Gelatine-beschichteten Zellkulturschalen plattiert und nach 48 Stunden mit dem MF20 Antikörper zum Nachweis der schweren Kette Sarkomeren-Myosins (MF20, Klug et al., J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) gefärbt. Gleichzeitig wird eine Kernfärbung mit Hämalaun durchgeführt. Wie in Beispiel 6 beschrieben und in 9C gezeigt ist, bestehen die plattierten Zellen zu über 99% aus MF20 positiven Herzmuskelzellen. Auch die erhaltenen CBs, die am Ende der Selektion zum Nachweis von Herzmuskelzellen gefriergeschnitten und mit MF20 Antikörper gefärbt werden, bestehen offensichtlich ausnahmslos aus positiv gefärbten Herzmuskelzellen (siehe 9B). Wie in der Graphik in 8B dargestellt ist, wird während des gesamten Bioprozesses mit Hilfe der FACS-Analyse (siehe Standard 2) der Anteil der Zellen in der Kultur bestimmt, die für die Stammzellmarker SSEA-1 und E-Cadherin positiv sind (Nachweis undifferenzierter ESC). Während des Kulturverlaufs nimmt der Anteil der positiven Zellen deutlich ab und nach Tag 14 sind keine positiven Zellen mehr nachweisbar. Diese Analyse ist ein weiterer Nachweis dafür, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hochreine Zelltypen aus Stammzellen isoliert werden können, wobei am Ende des Verfahrens keine Stammzellen mehr in der Kultur nachweisbar sind.
  • Beispiel 5: Verfahren zur Herstellung vitaler Einzellzellsuspensionen aus Embryoid Bodies (EBs) oder Cardiac Bodies (CBs)
  • Bei der Differenzierung von ESC in Suspension entstehen die als EBs bezeichneten Sphäroide. Mit Hilfe von Verfahren zur Selektion hochreiner Herzmuskelzellen in Suspension (siehe Beispiel 4) werden nicht-Herzmuskelzellen in den EBs durch Zusatz eines Antibiotikums abgetötet, so dass Sphäroide aus reinen Herzmuskelzellen erhalten werden, die im Rahmen dieser Erfindung als Cardiac Bodies (CBs) bezeichnet werden. Bei EBs und CBs handelt es sich um hochdichte Zell-Sphäroide, die aus bis zu 50.000 Zellen bestehen können (Dang et al., Biotechnol Bioeng 2002 May 20; 78(4): 442–53; siehe Tab.2). Die Vielschichtigkeit der EBs, sowie die von einigen Zelltypen während der Differenzierung gebildete extrazelluläre Matrix, erfordert ein geeignetes Verfahren, mit dem aus den Sphäroiden vitale Zellsuspensionen herstellt werden können, die weitestgehend aus Einzelzellen bestehen und daher besondere Vorteile für den Einsatz bei Zelltherapien sowie zur Beschichtung von Matrices aufweisen.
  • Zur Herstellung von Einzellzellsuspensionen werden EBs oder CBs durch Sedimentation vom Kulturmedium getrennt und für mindestens 15min bei 37°C mit einem Low-Calcium-Puffer nach Maltsev et al. (Maltsev, Circ Res. 1994 Aug; 75(2): 233–44.) oder mit Hepes- bzw. PBS-Puffer behandelt. Für eine 100mm Petrischale mit etwa 1×106–5×107 Zellen wird hierbei 10ml Waschpuffer verwendet. Die Schalen werden während der Inkubation auf einem Rotations-Schüttler bewegt. Der Puffer wird nach Sedimentation der Sphäroide entfernt und durch 3ml Trypsinlösung je 100mm Schale ersetzt. Die Schalen werden für weitere 15min bei 37°C auf einem Rotations-Schüttler bewegt. Zum Vereinzeln werden die Sphäroide mit einer weitporigen Zellkulturpipette einige Male auf und ab pipettiert. Die Vereinzelung der Sphäroide wird lichtmikroskopisch im Phasenkontrast überprüft. Zum Abstoppen des Trypsin-Verdaus wird die Zellsuspension mit 2 Volumen Serum-haltigem Kulturmedium versetzt. Mit diesem Verfahren lassen sich Zellsuspensionen erhalten, die fast ausschließlich aus Einzelzellen bestehen. Die Vitalität der Zellen wird durch Trypanblaufärbung überprüft.
  • Die mechanische Bewegung der Zellen bzw. Sphäroide während der Zugabe des Waschpuffers (Schritt 1), des Trypsins (Schritt 2) und der anschließenden Zellvereinzelung (Schritt 3) kann modifiziert werden um zum gleichen Ergebnis zu gelangen. Beispielsweise können alle Schritte auch direkt in einem Rührkesselbioreaktor oder anderen geeigneten Systemen durchgeführt werden. Hierbei muss die mechanische Bewegung der Zellen bzw. der Sphäroide so vorsichtig durchgeführt werden, dass eine Schädigung der Zellen vermieden wird. Die Vitalität der Zellen wird mit einer Trypanblaufärbung überprüft. Die Zellen weisen bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vitalität von mindesten 90% auf. In der Regel wird jedoch eine Vitalität von 95–97% erzielt.
  • Beispiel 6: Verfahren zur Herstellung Herzmuskelzell-beschichteter Platten
  • Die nach der Selektion im Bioreaktor erhaltenen Cardiac Bodies (CBs) aus Beispiel 4 können mit Hilfe des Verfahrens zur Herstellung vitaler Einzelzellsuspensionen vereinzelt (siehe Beispiel 5) und auf Zellkulturplatten verschiedener Formate z.B. 1536Well-, 384Well-, 96Well-, 24Well-, 6Well-Platten ausgesät werden. Hierzu werden die Platten zuvor mit Gelatine oder Fibronectin beschichtet. Beim Ausplattieren einer Zelldichte von 7×104 Zellen/cm2 Plattenoberfläche, kann beispielsweise eine einheitliche, dichte Einzelzellschicht aus kontrahierenden Herzmuskelzellen erhalten werden (9C). Die erhaltenen Zellen kontrahieren rhythmisch. Es wird beobachtet, dass sich Kontraktionen gleichmäßig über alle Zellen innerhalb einer Platte ausbreiten können. Offensichtlich sind die Zellen in der erhaltenen Zellschicht aus hochreinen Herzmuskelzellen funktionell miteinander gekoppelt, so dass eine Reizweiterleitung gefolgt von einer Kontraktion über alle Zellen ermöglicht wird. Die Zellen bilden offensichtlich ein funktionelles Synzytium. Erhaltene Platten werden zum Nachweis von Herzmuskelzellen immunhistochemisch mit dem MF20 Antikörper- und einer Hämalaun Kernfärbung wie folgt angefärbt. Der monoklonale MF20 Antikörper dient zum Nachweis sarkomeren Myosins in quergestreiften Muskelzellen. Laut Klug et al. (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) ist der Antikörper geeignet, um während der Phase der ESC Differenzierung (8 Tage Differenzierung) Herzmuskelzellen spezifisch nachzuweisen. Die plattierten Zellen werden mit PBS gewaschen und mit Methanol fixiert. Nach einem Waschschritt mit PBS/0,1% Triton X-100 werden unspezifische Bindungsstellen durch Inkubation mit Blockierungsreagenz (PBS, 3% Goatserum (Vektor), 1% BSA (Sigma), 0,1% Triton X-100) geblockt. Anschließend werden die Zellen zum Nachweis der schweren Kette von sarkomerem Myosin mit dem MF20 Antikörper (MF20 Hybridomaüberstand (Developmental Studies Hybridoma Bank) 1 : 10) inkubiert und mit PBS/Triton sowie PBS/Goatserum/BSA gewaschen. Nach der Inkubation mit dem Zweitantikörper (Goat antimouse Biotin conjugierter IgG HL (Dianova) 1 : 1000) erfolgt der Nachweis der Peroxidiase-Reaktion mittels ABC-Reagenz (ABC Kit Vectastain; Vektor) und DAB-Färbelösung (DAB Kit; Vektor). Zur Kernfärbung werden die Zellen mit Mayers Hämalaun Lösung inkubiert und unter fließendem Wasser gebläut. Nachfolgend werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Kaisers-Glycerin-Gelatine überschichtet. Zum Fotografieren wird eine Digitalkamera (Nikon, Coolpix 990) verwendet.
  • Zum Nachweis von Herzmuskelzellen in EBs oder CBs werden die Sphäroide in 30% Saccharose über Nacht inkubiert, in TissueTec (Jung/Leica) eingebettet und in einem Cryostat (Leica) in einer Schichtdicke von 10μm geschnitten. Die Schnitte werden mit Methanol fixiert und wie oben beschrieben mit dem monoklonalen MF20 Antikörper gefärbt (Peroxidase-gekoppelter Zweitantikörper).
  • In 9 ist die MF20-Färbung auf einer erhaltenen Zellkulturschale dargestellt. Zur detaillierten Analyse werden nach einem Zufallsprinzip Bereiche auf den gefärbten, mit Zellen beschichteten Schalen ausgewählt und im Mikroskop unter Hellfeldbeleuchtung bei 200facher Vergrößerung gezählt (MIKROSKOP XY Axiovert Leica, 20× Objektiv, 10× Okular). Nach dem Auszählen von etwa 1.000 Zellen konnte keine Zelle identifiziert werden, die einen Hämalaun gefärbten Kern, jedoch kein MF20 positives Cytoplasma aufweist. Offensichtlich handelt es sich bei allen analysierien Zellen ausnahmslos um Herzmuskelzellen. Aufgrund dieser Analyse kann davon ausgegangen werden, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bis zu 100% reine Herzmuskelzellpopulationen erhalten werden können. Mit einer vergleichbaren Methode haben Klug et al., (Klug et al. J. Clin. Invest. 1996 Jul.; 98 (1): 216–24) Herzmuskelzellen analysiert, die durch genetische Selektion auf der Oberfläche von Zellkulturplatten erhalten wurden. Hierbei wurden 3 MF20 negative Zellen bei einer Gesamtzahl von 791 gezählten Zellen beobachtet. Das entspricht einer Reinheit von 99,6%, die mit dem hier beschriebenen Verfahren noch übertroffen wird. Ein anderer Vorteil, der erstmals mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erreicht wird, ist die Bereitstellung von Matrices beliebiger Formate, beschichtet mit einer beliebigen, geeigneten Zelldichte des jeweiligen, aus Stammzellen isolierten, Zelltyps. Auf diese Weise wird die Möglichkeit geschaffen, Formate mit geringer Standardabweichung bereitzustellen, so dass die Zellzahl oder Zelldichte pro Format oder Formateinheit in hoher Reproduzierbarkeit erfolgen kann. Die Reproduzierbarkeit der Zellzahl, der Zelldichte oder der Zellverteilung je Format oder Einheit ist ein entscheidender Vorteil für die Verwendung solcher Zelltypen bei Hochdurchsatz-Verfahren in der Pharmaindustrie, für toxikologische Screens und zur Validierung von Kandidatengenen in der Biotechnologie.
  • Im Verlauf des Verfahrens wird innerhalb von 18 Tagen eine Zelldichte von 6,38×105 Herzmuskelzellen/ml Kultursuspension erhalten. Damit konnte in einem 2 Liter Bioreaktor eine Gesamtzellzahl von 1,28×109 hochreinen Herzmuskelzellen erzielt werden. Die durchschnittliche Größe der gebildeten CBs betrug am Tag 18 der Kultivierung 2979 Herzmuskelzellen/CB. Das dargestellte, erfindungsgemäße Verfahren ist einfach durchführbar, robust und sollte auf größere Reaktorvolumen übertragen sein. Damit ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals gelungen einen hochreinen, spezifischen Zelltyp aus Stammzellen in einem klinisch und industriell relevanten Maßstab herzustellen.

Claims (23)

  1. Verfahren zur Herstellung hochreiner Zelltypen aus Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung der Stammzellen in einem aktiv begasten Bioreaktor durchgeführt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anteil eines Zelltyps mindestens 90% aller Zellen beträgt, insbesondere mindestens 99%.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, das die Differenzierung der Stammzellen in Suspension erfolgt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen genetisch modifiziert sind.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion mit einem Antibiotikum durchgeführt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor ein Rührkesselbioreaktor ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor ein geregelter Bioreaktor ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass während des Verfahrens eine Zelldichte im Bioreaktor von mehr als 2 × 106 Zellen/ml erreicht wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Selektion ein hochreiner Zelltyp in Kultur in einer Zellkonzentration von mindestens 2 × 105 Zellen/ml, insbesondere 5 × 105 Zellen/ml erhalten wird.
  10. Verfahren zur Herstellung von Sphäroiden, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Sphäroide in einem aktiv begasten Medium hergestellt werden.
  11. Zellsuspension aus einem Medium und einem hochreinen, aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen zu mindestens 50% als Einzelzellen vorliegen.
  12. Zellsuspension bestehend aus einem Medium und darin dispergierten Einzelzellen oder Sphäroiden eines hochreinen, aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps, dadurch gekennzeichnet, dass ein Anteil anderer Zelltypen höchstens 5%, insbesondere höchstens 0,3% beträgt.
  13. Zellsuspension nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die darin dispergierten Körper maximal aus 2,5 × 103 Zellen pro Sphäroid, bevorzugt aus maximal 1 × 102 Zellen pro Sphäroid, bevorzugt aus 10 Zellen pro Sphäroid, am meisten bevorzugt aus Einzelzellen bestehen.
  14. Zellsuspension nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem hochreinen Zelltyp um Herzmuskelzellen handelt.
  15. Format, dadurch gekennzeichnet, dass das Format eine vordefinierte Zellzahl oder Zelldichte eines hochreinen, aus Stammzellen abgeleiteten Zelltyps aufweist.
  16. Format, das Einheiten aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass Einheiten mit reproduzierter Zellzahl oder Zelldichte eines hochreinen Zelltyps vorliegen.
  17. Format nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass es Formateinheiten aufweist, die Bereiche aufweisen, in denen der Zelltyp homogen verteilt vorliegt.
  18. Format nach einem der Ansprüche 15 oder 17 dadurch gekennzeichnet, dass das Format eine Anordnung von Trägern ist, die mit dem hochreinen Zelltyp beschichtet sind.
  19. Anordnung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, das die Trägereinheiten mit einer Einzelzelllage beschichtet sind.
  20. Therapeutisch wirksame Menge einer Zellsuspension gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.
  21. Künstliches Gewebe oder Organ, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe oder Organ mindestens eine Zelle aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder aus einer Suspension nach einem der Ansprüche 11 bis 14 enthält.
  22. Verfahren zum Testen der pharmakologischen Aktivität einer Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Zelle aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer Zellsuspension nach einem der Ansprüche 11 bis 14 einer Substanz ausgesetzt wird und die pharmakologische Aktivität der Substanz bestimmt wird.
  23. Verfahren zur Kultivierung von Stammzellen insbesondere embrionale Stammzellen dadurch gekennzeichnet, dass Stammzellen in Suspension auf Mikrocarriern kultiviert werden.
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