DE10249171A1 - Polymerase chain reaction method for detecting Salmonella in an animal, environmental or food samples, based on specific amplification of part of the invA gene, also provides indication of virulence - Google Patents

Polymerase chain reaction method for detecting Salmonella in an animal, environmental or food samples, based on specific amplification of part of the invA gene, also provides indication of virulence Download PDF

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Abstract

A PCR method for detecting Salmonella, is new. A PCR method for detecting Salmonella comprises: (a) incubating a sample first in peptone broth and then in Rappaport-Vassiliadis medium; (b) extracting DNA; (c) adding oligonucleotide PCR primers, each having a sequence that is specific for Salmonella but unable to cross-react with other organisms; (d) performing PCR; (e) cleaving the amplicon with a restriction enzyme (RE) that has a recognition sequence present at least once in the amplicon; and (f) detecting cleavage products. Independent claims are also included for: (1) the DNA oligonucleotide primers (S1) and (S2); and (2) kit for the process comprising oligonucleotide primers, as specified; PCR reagents, and RE, as specified. tttacggtctattttgatttg (S1) atatgctccacaaggttaatg (S2)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Salmonella in einer Probe, spezifische DNA-Oligonukleotide als PCR-Primer und ein Kit zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens.The present invention relates to a method for the specific detection of Salmonella in a sample, specific DNA oligonucleotides as PCR primers and a kit for performing the inventive method.

Salmonella-Spezies (Serovare) sind bakterielle Krankheitserreger humaner Gastroenteritiden. Im Jahre 2000 wurden in Deutschland beim Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin 79 535 Fälle einer Salmonellen-Infektion beim Menschen gemeldet. Dabei wird jedoch von einer mindestens 10fach höheren Dunkelziffer nicht gemeldeter Erkrankungen ausgegangen.Salmonella species (Serovare) are bacterial pathogens of human gastroenteritis. In year 2000 were in Germany at the Federal Institute for Consumer Health Protection and veterinary medicine 79,535 cases a Salmonella infection in humans. However, this will of at least 10 times higher Unknown number of diseases not reported.

Eine wichtige Rolle bei der Übertragung von Salmonella-Spezies vom Tier auf den Menschen spielen kontaminierte Lebensmittel von infizierten, landwirtschaftlichen Nutztieren. So stellt das Geflügel, das Rind und das Schlachtschwein ein bedeutendes Reservoir für diese Zoonose-Erreger dar. Besonders vom persistent infizierten Tier (intermittierender Ausscheider des Erregers) geht eine mögliche Gefahr für den Verbraucher aus, da Infektionen mit nicht wirtsadaptierten Salmonellen beim landwirtschaftlichen Nutztier überwiegend symptomlos verlaufen und deshalb weder im Herkunftsbestand noch auf dem Schlachthof bei der Lebendbeschau erkannt werden. Trotz aller Maßnahmen der Tier- und Fleischhygiene, können die Erreger humaner Enteritiden so über Produkte tierischer Herkunft in die Lebensmittelkette gelangen und Erkrankungsfälle beim Verbraucher verursachen. Die Identifizierung von persistent, aber auch der akut infizierten Tiere stellt heute ein zentrales Probleme des Gesundheitlichen Verbraucherschutzes in der tierischen Produktion dar. Um die betroffenen Tiere im Bestand und am Schlachthof eindeutig identifizieren und selektieren zu können, sind schnelle, sensitive und spezifische Nachweismethoden erforderlich. Diese Forderungen werden in besonderem Maße durch die PCR-Methode erfüllt.An important role in the transfer contaminated by Salmonella species from animals to humans Food from infected farm animals. So put the poultry, cattle and slaughter pigs are an important reservoir for them Zoonotic pathogens Especially from persistently infected animals (intermittent Eliminator of the pathogen) is a possible danger to the consumer because infections with non-host-adapted Salmonella in agricultural livestock predominantly are asymptomatic and therefore neither in the stock of origin nor be recognized at the slaughterhouse during the live inspection. Despite all measures animal and meat hygiene, can the pathogens of human enteritis via products of animal origin get into the food chain and cases of illness in Cause consumers. The identification of persistent, however Acute infected animals are also a key problem today of consumer health protection in animal production To the affected animals in the stock and at the slaughterhouse clearly Being able to identify and select is quick, sensitive and specific detection methods required. These demands will be in particular fulfilled by the PCR method.

In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl verschiedener PCR-Methoden zum Nachweis von Salmonellen aus Lebensmitteln, klinischen Materialien und Umweltproben beschrieben. Die Zielsequenzen der Salmonella-PCR-Methoden, insbesondere der in den letzten fünf Jahren publizierten Sequenzen, sind aber auf einige wenige Genabschnitte beschränkt geblieben. Ein in vielen Studien gewählter DNA-Abschnitt ist das invA-Gen von S. Typhimurium. Die Unterschiede in den einzelnen Studien liegen im wesentlichen in der Adaptation der PCR-Methode an die speziellen Anforderungen des sehr heterogenen Probenmaterials, aus dem schließlich der Nachweis von Salmonellen erfolgen soll. Die Anpassung der jeweiligen PCR-Methode erfolgte letztlich durch eine Modifikation der unterschiedlichen Voranreicherungsschritte sowie durch Variation der DNA-Extraktionsmethoden und der PCR-Bedingungen. Die Vielzahl der von verschiedenen Autoren beschriebenen Methoden ist meist sehr speziell an bestimmte Bedingungen bzw. Probenmaterialien adaptiert. Ob sich diese Methoden prinzipiell eignen würden, Salmonella in Umweltproben oder Lebensmitteln wie Schweinefleisch bzw. Schweinefleischprodukte nachzuweisen, ist nur durch eine Überprüfung jeder einzelnen Methode auf falsch positive Signale durch eine Untersuchung, wie sie im Beispielteil angegeben ist, möglich. Dies ist zur Zeit nicht praktikabel. Selbstverständlich geben aber natürlich die unterschiedlichen, oben genannten Autoren an, dass die von ihnen entwickelte Methode grundsätzlich für den Nachweis von Salmonella für das angegebene Probenmaterial geeignet ist.Over the past few years a variety of different PCR methods for the detection of Salmonella from food, clinical materials and environmental samples. The target sequences of the Salmonella PCR methods, especially the in the last five Years published sequences, but are on a few gene segments limited remained. This is a section of DNA chosen in many studies S. Typhimurium invA gene. The differences in the individual studies are essentially in the adaptation of the PCR method to the special requirements of the very heterogeneous sample material from which the Detection of Salmonella should take place. The adjustment of each PCR method was used ultimately through a modification of the different pre-enrichment steps as well as by varying the DNA extraction methods and the PCR conditions. The Variety of methods described by different authors mostly very specific to certain conditions or sample materials adapted. Whether these methods would be suitable in principle, Salmonella in environmental samples or foods such as pork or pork products Evidence can only be provided by checking each individual method for false positive signals through an investigation such as that in Example part is specified, possible. This is currently not practical. Of course, of course they do different authors mentioned above that those of them developed method basically for the Detection of Salmonella for the specified sample material is suitable.

So ist die von Widjojoatmodjo und Mitarbeitern (1991) entwickelte PCR mit einer immunomagnetischen Separation kombiniert, was jedoch den Nachteil einer ungenügenden Sensitivität hervorruft. Die von Rahn und Mitarbeiter (1992) für die Salmonellen-spezifische PCR gewählten Oligonukleotide basieren auf dem invA-Gen (GALAN et al., 1992). Das Detektions-Limit dieser Methode liegt bei 3×102 KBE (Kolonie bildende Einheiten). Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass beim Vorhandensein von bestimmten E. coli Stämmen falsch positive Ergebnisse erzielt werden. Die spezifische Problematik dieser Methode nach Rahn et al. (1992) wird durch ein multiples Alignment des invA-Gens gegen andere bakterielle Gensequenzen deutlich. Es zeigt sich dabei, dass insbesondere im Bereich des 5'-Endes des invA-Gens eine hohe Sequenzidentität mit Teilen des Genoms von E. coli besteht. Es wird zudem eine 90 %ige Sequenzidentität zwischen den Genomen von Salmonella und E. coli beschrieben (SALYERS und WHITT, 1994). Diese Sequenzidentitäten zwischen den beiden Spezies können letztendlich, wie im Fall von invA, zu falsch-positiven Ergebnissen in der PCR-Diagnostik führen. Die entstehenden falsch-positiven Amplifikate können eine identische Baasenpaarlänge wie das spezifische PCR Produkt besitzen, so dass die Spezifität durch eine DNA-Hybridisierung überprüft werden muss (Feder et al., 2001).So is that of Widjojoatmodjo and Coworkers (1991) developed PCR with an immunomagnetic Separation combined, which, however, causes the disadvantage of insufficient sensitivity. That of Rahn and co-workers (1992) for the salmonella-specific PCR chosen Oligonucleotides are based on the invA gene (GALAN et al., 1992). The detection limit of this method is 3 × 102 CFU (colony-forming units). However, recent studies show that in the presence of certain E. coli strains false positive results are achieved. The specific problem this method according to Rahn et al. (1992) is a multiple Alignment of the invA gene with other bacterial gene sequences clearly. It shows that in particular in the region of the 5 'end of the invA gene a high sequence identity with Parts of the genome of E. coli exist. It will also be a 90% sequence identity between the genomes of Salmonella and E. coli (SALYERS and WHITT, 1994). These sequence identities between the two species can ultimately, as in the case of invA, to false positive results in PCR diagnostics to lead. The resulting false-positive amplicons can have an identical Baase pair length as own the specific PCR product so that the specificity by DNA hybridization can be checked must (Feder et al., 2001).

Olsen et al. (1991) konnten durch Sequenz-Analysen von 20 verschiedenen Salmonella-Serovaren einen 2.3 kb großen DNA-Bereich ermitteln, der eine komplette Basenhomologie in allen Serovaren aufwies. Darauf ausbauend entwickelten Aabo und Mitarbeiter (1993) ein Oligonukleotidpaar, das anhand von 146 Salmonellen-Stämmen und 86 Nicht-Salmonellen-Spezies auf seine Spezifität geprüft wurde. Zwar wurden alle Salmonella-Spezies mittels dieser PCR-Methode korrekt erkannt. Auch die nicht Salmonellen-Spezies darunter 21 E. coli-Isolate zeigten keinerlei positive Amplifikate. Der Nachteil dieser Methode ist allerdings, dass sie auf einem Abschnitt des Genoms von Salmonellen basiert, dessen Funktion bis heute noch nicht bekannt ist und daher durch den Nachweis dieses Genes keine Aussage über die Virulenz des Isolates getroffen werden kann.Olsen et al. (1991) were able to carry out sequence analyzes of 20 different Salmonella serovars determine a 2.3 kb DNA region which had a complete base homology in all serovars. Building on this, Aabo and co-workers (1993) developed a pair of oligonucleotides, which is based on 146 Salmonella strains and 86 Non-Salmonella species has been tested for specificity. All Salmonella species were correctly recognized using this PCR method. Even the non-Salmonella species among them 21 E. coli isolates showed no positive amplificates. The disadvantage of this method, however, is that it is based on a section of the Salmonella genome, the function of which is not yet known and therefore no evidence about the virulence of the isolate can be made by detecting this gene can.

Trotz der Vielzahl bereits publizierter PCR-Methoden fehlen diagnostische PCR-Verfahren, die in Proben einen Nachweis von Salmonella mit hoher Sensitivität und Spezifität ermöglichen und somit zu einer Verbesserung der Salmonellen-Diagnostik beitragen.Despite the large number already published PCR methods are lacking diagnostic PCR methods that a sample Enable detection of Salmonella with high sensitivity and specificity and thus contribute to an improvement in salmonella diagnostics.

Daher liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, Oligonukleotide bereitzustellen, die als PCR-Primer spezifisch für Salmonella sind und eine gleichzeitige Bestimmung der Virulenz zulassen.Therefore, the object of the invention based on providing oligonucleotides that are specific as PCR primers for Salmonella and allow simultaneous determination of virulence.

Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.The task is carried out in the claims defined object solved.

Die nachfolgenden Figuren erläutern die Erfindung.The following figures explain the Invention.

1 zeigt ein Schrittdiagramm für die Probenaufbereitung und DNA-Extraktion aus Gewebeproben nach vorangegangener kultureller Anreicherung. 1 shows a step diagram for the sample preparation and DNA extraction from tissue samples after previous cultural enrichment.

2 zeigt ein Schrittdiagramm für die DNA-Extraktion aus Gewebeproben vom persistent infizierten Schwein nach vorangegangener kultureller Anreicherung. 2 shows a step diagram for the DNA extraction from tissue samples from the persistently infected pig after previous cultural enrichment.

3 zeigt in einem Diagramm die prozentualen Nachweisraten von S. Typhimurium DT104 in Gewebeproben von persistent infizierten Meishan-Schweinen. Die schwarzen Balken stellen die prozentuale Nachweisrate der Kulturverfahren nach ISO 6579 dar. Die grauen Balken zeigen den prozentualen Nachweis mit der invA I-PCR-Methode (RAHN et al., 1992) zum Nachweis von Salmonella nach 24stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon. To, Tonsille; Maly, Mandibularlymphknoten; Lu, Lunge; Le, Leber; Mi, Milz; Je, Jejunum; IL, Ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, Lungenlymphknoten; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, Colonlymphknoten; Mus, Muskulatur. 3 shows the percentage detection rates of S. Typhimurium DT104 in tissue samples from persistently infected Meishan pigs. The black bars represent the percentage detection rate of the culture methods according to ISO 6579. The gray bars show the percentage detection using the invA I-PCR method (RAHN et al., 1992) for the detection of Salmonella after 24 hours of enrichment in peptone broth. To, tonsil; Maly, mandibular lymph node; Lu, lungs; Le, liver; Wed, spleen; Je, Jejunum; IL, ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, pulmonary lymph node; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, colon lymph nodes; Mus, muscles.

4 zeigt in einem Diagramm die prozentualen Nachweisraten von S. Typhimurium DT104 in Gewebeproben von persistent infizierten Hybridschweinen. Die schwarzen Balken stellen die prozentuale Nachweisrate des Kulturverfahrens nach ISO 6579 dar. Die dunkelgrauen Balken zeigen den prozentualen Nachweis mit der invA I-PCR Methode (RAHN et al., 1992) zum Nachweis von Salmonella nach 24stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon. Die hellgrauen Balken zeigen die prozentuale Nachweisrate mit der invA I-PCR-Methode (RAHN et al. 1992) zum Nachweis von Salmonella nach 48stündiger kombinierter Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV-Medium. To, Tonsille; Maly, Mandibularlymphknoten; Lu, Lunge; Le, Leber; Mi, Milz; Je, Jejunum; IL, Ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, Lungenlymphknoten; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, Colonlymphknoten; Mus, Muskulatur. 4 shows in a diagram the percentage detection rates of S. Typhimurium DT104 in tissue samples from persistently infected hybrid pigs. The black bars represent the percentage detection rate of the culture method according to ISO 6579. The dark gray bars show the percentage detection using the invA I-PCR method (RAHN et al., 1992) for the detection of Salmonella after 24 hours of enrichment in peptone broth. The light gray bars show the percentage detection rate using the invA I-PCR method (RAHN et al. 1992) for the detection of Salmonella after 48 hours of combined enrichment in peptone broth and RV medium. To, tonsil; Maly, mandibular lymph node; Lu, lungs; Le, liver; Wed, spleen; Je, Jejunum; IL, ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, pulmonary lymph node; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, colon lymph nodes; Mus, muscles.

5 zeigt das Ergebnis des Nachweises von S. Typhimurium DT 104 in Gewebeproben von einem persistent infizierten Hybridschwein nach einer Agarosegelelektrophorese. 5A zeigt Amplifikate nach invA I-PCR (Rahn et al., 1992), und 5B die Amplifikate nach invA-II-PCR jeweils nach 48 stündiger kombinierter Pepton-Bouillon-RV-Medium-Anreicherung. Jeweils in Spur eins ist der Längenstandard (LS), in Spur zwei die Positiv-Kontrolle (+) und in Spur drei die Negativ-Kontrolle (-) aufgetragen. To, Tonsille; Maly, Mandibular-lymphknoten; Lu, Lunge; Le, Leber; Mi, Milz; Je, Jejunum; IL, Ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, Lungenlymphknoten; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, Colonlymphknoten; Mus, Muskulatur; ♦ kennzeichnet unspezifische Produkte der invA I-PCR-Methode. In 5 sind die Unterschiede hinsichtlich der Spezifität zwischen den beiden PCR-Methoden invA I und invA II dargestellt. Das unspezifische Produkte aus der Probe vom Mandibularlymphknoten, von der Lunge, von der Leber und von der Milz läuft etwas höher im Gel als das spezifische Produkt von 284 bp. 5 shows the result of the detection of S. Typhimurium DT 104 in tissue samples from a persistently infected hybrid pig after agarose gel electrophoresis. 5A shows amplificates according to invA I-PCR (Rahn et al., 1992), and 5B the amplificates after invA-II-PCR each after 48 hours of combined peptone broth RV medium enrichment. The length standard (LS) is plotted in lane one, the positive control (+) in lane two and the negative control (-) in lane three. To, tonsil; Maly, mandibular lymph nodes; Lu, lungs; Le, liver; Wed, spleen; Je, Jejunum; IL, ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, pulmonary lymph node; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, colon lymph nodes; Mus, muscles; ♦ identifies non-specific products of the invA I-PCR method. In 5 the differences in specificity between the two PCR methods invA I and invA II are shown. The non-specific product from the sample from the mandibular lymph node, from the lungs, from the liver and from the spleen runs somewhat higher in the gel than the specific product of 284 bp.

6A und B zeigt das Ergebnis der vergleichenden Spezifitätsprüfung der invA I-PCR Methode (Rahn et al., 1992) und der invA II-PCR-Methode anhand von Gewebeproben eines nicht infizierten Kontrolltieres nach einer Agarosegelelektrophorese. Alle Gewebeproben vom Schwein wurden mittels bakteriologischer Methoden (ISO 6579) Salmonella-negativ getestet. Die A zeigt die Amplifikate nach invA I-PCR (Rahn et al., 1992) und die B die Amplifikate nach invA-II-PCR jeweils nach 48stündiger kombinierter Pepton-Bouillon-RV- Medium-Anreicherung. Jeweils in Spur eins ist der Längenstandard (LS), in Spur zwei die Positiv-Kontrolle (+) und in Spur drei die Negativ-Kontrolle (-) aufgetragen. To, Tonsille; Maly, Mandibularlymphknoten; Lu, Lunge; Le, Leber; Mi, Milz; Je, Jejunum; IL, Ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, Lungenlymphknoten; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, Colonlymphknoten; Mus, Muskulatur; i kennzeichnet unspezifische Produkte der invA I-PCR-Methode. 6A and B shows the result of the comparative specificity test of the invA I-PCR method (Rahn et al., 1992) and the invA II-PCR method using tissue samples from an uninfected control animal after agarose gel electrophoresis. All pig tissue samples were tested negative for Salmonella using bacteriological methods (ISO 6579). The A shows the amplificates according to invA I-PCR (Rahn et al., 1992) and the B the amplificates after invA-II-PCR each after 48 hours of combined peptone broth RV medium enrichment. The length standard (LS) is plotted in lane one, the positive control (+) in lane two and the negative control (-) in lane three. To, tonsil; Maly, mandibular lymph node; Lu, lungs; Le, liver; Wed, spleen; Je, Jejunum; IL, ileum; Co, Colon; Ca, Caecum; Luly, pulmonary lymph node; Icly, lnn. Ileocolici; Jely, Jejunallymphknoten; Coly, colon lymph nodes; Mus, muscles; i identifies non-specific products of the invA I-PCR method.

7. zeigt das Ergebnis der Spezifitätsprüfung der invA I-PCR-Methode (Rahe et al., 1992) anhand von E. coli-Reinkulturen. Jeweils in Spur eins ist der Längenstandard (LS), in Spur zwei die Positiv-Kontrolle (+) und in Spur drei die Negativ-Kontrolle (-) aufgetragen. 1, E. coli ATCC 11229; 2, E. coli DSMZ 682; 3, E. coli DSMZ 787; 4, E. coli DSMZ 1103; 5 bis 9, E. coli Feldisolate vom Schwein, i kennzeichnet unspezifische Produkte der invA I-PCR-Methode 7 , shows the result of the specificity test of the invA I-PCR method (Rahe et al., 1992) using pure E. coli cultures. The length standard (LS) is plotted in lane one, the positive control (+) in lane two and the negative control (-) in lane three. 1, E. coli ATCC 11229; 2, E. coli DSMZ 682; 3, E. coli DSMZ 787; 4, E. coli DSMZ 1103; 5 to 9, E. coli field isolates from pigs, i denotes non-specific products of the invA I-PCR method

8A. und B zeigt das Ergebnis des Sensitivitätsvergleich zwischen der invA I-PCR Methode (Rahn et al., 1992) und der invA II-PCR Methode. Die 8A zeigt die Nachweisgrenze der invA I-PCR-Methode, und die B die der invA II-PCR-Methode. Die noch detektierbare Zellzahl pro Reaktionsansatz ist in der Beschriftung der Figuren hervorgehoben. Jeweils in Spur eins ist der Längenstandard (LS), in Spur zwei die Positiv-Kontrolle (+) und in Spur drei die Negativ-Kontrolle (-) aufgetragen. 8A , and B shows the result of the sensitivity comparison between the invA I-PCR method (Rahn et al., 1992) and the invA II-PCR method. The 8A shows the detection limit of the invA I-PCR method, and the B that of the invA II PCR method. The number of cells that can still be detected per reaction batch is highlighted in the labeling of the figures. The length standard (LS) is plotted in lane one, the positive control (+) in lane two and the negative control (-) in lane three.

9 zeigt in einer schematischen Darstellung den Ansatzpunkt der PCR-Methode auf dem invA-Gen von Salmonella. 9 shows a schematic representation of the starting point of the PCR method on the invA gene by Salmonella.

Amplifikationsbereich der invA PCR-Methode (Oligonukleotide invA-sal-F1 und invA-sal-R1)Amplification range of the invA PCR method (Oligonucleotides invA-sal-F1 and invA-sal-R1)

10 zeigt in einer schematischen Darstellung die unterschiedlichen Ansatzpunkte der invA I und invA II-PCR-Methoden auf dem invA-Gen von S. Typhimurium DT104. 10 shows a schematic representation of the different starting points of the invA I and invA II PCR methods on the invA gene from S. Typhimurium DT104.

Amplifikationsbereich der invA I-PCR-Methode (Oligonukleotide ST 139 und ST 141), Bereich höchster Sequenzidentität mit Teilen des E. coli-Genoms, Amplifikationsbereich der invA II-PCR-Methode (Oligonukleotide invA-sal-F1 und invA-sal-R1)Amplification range of the invA I-PCR method (Oligonucleotides ST 139 and ST 141), area of highest sequence identity with parts of the E. coli genome, amplification range of the invA II PCR method (Oligonucleotides invA-sal-F1 and invA-sal-R1)

Der Begriff "Salmonella" wie hier verwendet bedeutet, dass er alle Isolate, Stämme und Subspezies, die das invA-Gen tragen.The term "Salmonella" as used here means that it all isolates, strains and subspecies that carry the invA gene.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Salmonella, umfassend die aufeinander folgenden Schritte:The present invention relates to a method for the detection of Salmonella comprising the successive following steps:

  • a) Inkubieren einer Probe in Pepton-Bouillon und anschließend in Rappaport-Vassiliadis-Medium,a) Incubate a sample in peptone broth and subsequently in Rappaport-Vassiliadis medium,
  • b) Extrahieren der DNA aus der Probe,b) extracting the DNA from the sample,
  • c) Zugabe von DNA-Oligonukleotiden als Primer für eine PCR, wobei die DNA-Oligonukleotide jeweils eine Sequenz aufweisen, die spezifisch für Salmonella ist und nicht mit Sequenzen anderer Organismen kreuzreagieren können,c) adding DNA oligonucleotides as primers for a PCR, being the DNA oligonucleotides each have a sequence that is specific for Salmonella and not can cross-react with sequences from other organisms,
  • d) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR),d) Perform a polymerase chain reaction (PCR),
  • e) Durchführen einer DNA-Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens einmal in dem durch Schritt d) erzeugten DNA-Amplifikat vorkommt, und Nachweisen der durch die DNA-Spaltung erhaltenen DNA-Fragmente.e) Perform DNA cleavage with a restriction enzyme that contains a recognition sequence having at least once in that generated by step d) DNA amplificate occurs, and detection of the DNA cleavage DNA fragments obtained.

Eine wesentliche Vorraussetzung, um pathogene Mikroorganismen aus unterschiedlichen Untersuchungsproben mit hoher Sensitivität nachzuweisen, ist die effiziente Aufarbeitung des Probenmaterials (Inkubation). Im ersten Schritt muss somit gewährleistet werden, dass die potentiell im Probenmaterial vorhandenen Salmonellen optimal angereichert werden, um im nächsten Schritt, der Gewinnung der Nukleinsäuren, ausreichende Konzentrationen an Nukleinsäure zu gewährleisten. Da diese beiden Schritte im Vergleich zur eigentlichen PCR sehr zeitaufwendig sind, ist eine Automatisierung der Anreicherung, sowie der Extraktion der Nukleinsäuren bevorzugt. Eine weitgehende Automatisierung der PCR kann durch die Etablierung einer Real-Time PCR, optimiert für die erfindungsgemäßen DNA-Oligonukleotidprimer, erreicht werden. Eine Automatisierung aller drei Prozessstufen, der Anreicherung, der Nukleinsäureextraktion und der PCR, ermöglicht ein effizientes und hoch standardisiertes Verfahren zum Nachweis von Salmonella.An essential requirement for pathogenic microorganisms from different test samples with high sensitivity the efficient processing of the sample material must be proven (Incubation). The first step is to ensure that the Salmonella potentially present in the sample material is optimally enriched to be in the next Step, obtaining the nucleic acids, sufficient concentrations of nucleic acid to ensure. Because these two steps are very compared to the actual PCR are time consuming is an automation of enrichment, as well the extraction of the nucleic acids prefers. Extensive automation of the PCR can be achieved through the Establishment of a real-time PCR, optimized for the DNA oligonucleotide primers according to the invention, can be achieved. Automation of all three process stages, enrichment, nucleic acid extraction and PCR an efficient and highly standardized method of detection by Salmonella.

Die Inkubation kann mit unterschiedlichen Proben, wie Gewebeproben, Umweltproben und Lebensmittelproben erfolgen. Die verwendete Probe ist vorzugsweise Gewebe von Schlachttieren, z.B. Geflügel aller An, Rinder, Schweinen, Schafe, oder Fleischsaft oder Blut dieser Tiere, oder verschiedenste Lebensmittel und Produkte tierischer Herkunft, z.B. Wurst, Hackfleisch. Vorzugsweise wird die Probe für die Inkubation zerkleinert. Als Nährmedium für die Vorinkubation wird Pepton-Bouillon verwendet. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise bei 37°C für 24 Stunden unter aeroben Bedingungen. Anschließend wird in einem zweiten Medium, nämlich Rappaport-Vassiliadis (RV)-Medium, die Probe selektiv angereichert. Dazu können Aligouts der Probe aus dem ersten Medium, z.B. 100 μl, überführt und dann im zweiten Medium inkubiert werden, vorzugsweise für 24 Stunden bei 42 °C. Anschließend erfolgt eine übliche DNA-Extraktion.The incubation can be done with different Samples such as tissue samples, environmental samples and food samples are taken. The sample used is preferably tissue from slaughter animals, e.g. poultry all kind, cattle, pigs, sheep, or meat juice or blood of these animals, or various foods and products of animal Origin, e.g. Sausage, minced meat. Preferably the sample is for incubation crushed. As a nutrient medium for the Peptone broth is used prior to incubation. The incubation takes place preferably at 37 ° C for 24 Hours under aerobic conditions. Then in a second Medium, namely Rappaport-Vassiliadis (RV) medium, the sample enriched selectively. You can do this Aligouts of the sample from the first medium, e.g. 100 μl, transferred and then incubated in the second medium, preferably for 24 hours at 42 ° C. Subsequently there is a usual one DNA extraction.

Die Sequenzen der Oligonukleotidprimer sind für das erfinderische Verfahren wesentlich. Daher ist insbesondere darauf zu achten, dass die Sequenzen nicht bei den zu untersuchenden Schlachttieren oder den Tieren, aus denen die zu untersuchenden Lebensmittel hergestellt wurden, vorkommen. Ferner ist darauf zu achten, dass die Sequenzen nicht mit Sequenzen aus anderen, nicht Salmonella-artigen Mikroorganismen stammen. Nur so kann eine zuverlässige, hoch spezifische PCR-Diagnostik gewährleistet werden. Durch die z.B. 90%ige DNA-Sequenzhomologie zwischen Salmonella spp. und E. coli, muss insbesondere die Spezifität hinsichtlich verschiedener E. coli-Isolate beachtet werden. Da E. coli zur normalen Fäkalflora bei Mensch und Tier gehört, wäre eine Kreuzreaktivität der Oligonukleotidprimer von erheblichem Nachteil. Vorzugsweise stammen die Sequenzen für die erfindungsgemäßen Oligonukleotidprimer von der Sequenz des Salmonella invA-Gens (M90846, European Bioinformatics Institut, http://srs6.ebi.ac.uk/srs6bin/cgi-bin/wgetz) ab. Besonders bevorzugt stammen die Oligonukleotidprimer vom 3'-Ende des invA-Gens, da es Überschneidungen mit dem Genom von E. coli im besonderen Maße im Bereich des 5'-Endes des invA-Gens gibt. Insbesondere bevorzugt weisen die Oligonukleotidprimer eine Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 (invA-sal-F1) und SEQ ID NO:2 (invA-sal-R1) oder deren Derivate auf.The sequences of the oligonucleotide primers are for the inventive method essential. Therefore, it is particularly important to ensure that the sequences are not in the animals to be examined or the animals from which the food to be examined is made have occurred. It is also important to ensure that the sequences not with sequences from other, non-Salmonella-like microorganisms. This is the only way a reliable, highly specific PCR diagnostics can be guaranteed. By e.g. 90% DNA sequence homology between Salmonella spp. and E. coli, in particular, the specificity regarding different E. coli isolates are observed. Since E. coli is normal faecal flora heard in humans and animals, would be a Cross-reactivity the oligonucleotide primer of considerable disadvantage. Preferably come from the sequences for the oligonucleotide primers according to the invention from the sequence of the Salmonella invA gene (M90846, European Bioinformatics Institute, http://srs6.ebi.ac.uk/srs6bin/cgi-bin/wgetz). Especially the oligonucleotide primers preferably originate from the 3 'end of the invA gene, since they overlap with the genome of E. coli in the region of the 5 'end of the invA gene gives. The oligonucleotide primers particularly preferably have one Sequence according to SEQ ID NO: 1 (invA-sal-F1) and SEQ ID NO: 2 (invA-sal-R1) or their derivatives on.

Das erfindungsgemäße spezifische Oligonukleotidprimerpaar (invA-sal-F1 und invA-sal-R1) amplifiziert ein 443 bpgroßes Produkt im Bereich des 3'Endes des invA-Gens. Das Amplifikat enthält eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease Nde I, um die Spezifität des Amplifikates mit Hilfe eines Restriktionsverdaus kontrollieren zu können. Die Restriktionsendonuklease Nde I spaltet das spezifische Amplifikat in zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von jeweils 247 bp sowie 196 bp.The specific oligonucleotide primer pair according to the invention (invA-sal-F1 and invA-sal-R1) amplifies a 443 bp product in the area of the 3 'end of the invA gene. The amplificate contains a recognition site for the restriction endonuclease Nde I to the specificity check the amplicon using a restriction digest to be able to. The restriction endonuclease Nde I cleaves the specific amplificate in two DNA fragments, each with a size of 247 bp as well 196 bp.

Die erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Salmonella in verschiedensten Gewebeproben von Schlachttieren mit hoher Spezifität und Sensitivität nachzuweisen. Diese neue, auf dem 3'-Ende des invA-Gens basierende Nachweismethode, ist insbesondere auch im Hinblick auf die neue Salmonellose-Verordnung (Polten, 2002) von besonderem Interesse, wenn es darum geht, serologisch positive Salmonellose-Befunde bei Schlachtschweinen abzusichern. Insbesondere die Ergebnisse von Fleischsaft-ELISA-Systemen, die oft auf sehr unterschiedlichen Antigenen basieren und daher nur eine geringe Korrelation untereinander aufweisen (Van der Heijden, 2001), lassen sich mit dieser Methode verifizieren.The method according to the invention makes it possible to sample Salmonella in various tissue samples Detect slaughter animals with high specificity and sensitivity. This new detection method, which is based on the 3 'end of the invA gene, is of particular interest with regard to the new Salmonellosis Ordinance (Polten, 2002) when it comes to confirming serologically positive salmonellosis findings in slaughter pigs. In particular, the results of meat juice ELISA systems, which are often based on very different antigens and therefore have only a low correlation with each other (Van der Heijden, 2001), can be verified with this method.

Das erfindungsgemäße Verfahren konnte im Vergleich zur Bakteriologie nach ISO 6579 und im Vergleich zur PCR-Methode nach DIN 10135 an Organen von experimentell infizierten Schlachtschweinen etabliert werden. Es ist demnach besonders geeignet, Schlachtschweine am Schlachthof zu erfassen, die mit Salmonellen kontaminiert sind. Da das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu Deutschen und Internationalen Standards etabliert wurde, kann es auch als Referenzmethode für etwaige neu zu etablierende Testsysteme verwendet werden. So eignet sich das Verfahren als Referenzverfahren besonders, wenn es darum geht verschiedene neue serologische Testssysteme zu etablieren bzw. mit ihnen zu vergleichen. So kann das erfindungsgemäße Verfahren im Hinblick auf die neue Salmonellose-Verordnung als Referenzmethode eingesetzt werden, wenn eindeutig und auch auf genomischer Ebene festgestellt werden soll, ob Schlachtkörper als Salmonella-positiv zu bewerten sind oder nicht.The method according to the invention was able to compare bacteriology according to ISO 6579 and compared to the PCR method according to DIN 10135 on organs of experimentally infected slaughter pigs to be established. It is therefore particularly suitable for slaughter pigs to be recorded at the slaughterhouse that are contaminated with Salmonella. Since the inventive method established in comparison to German and international standards it can also be used as a reference method for any newly established ones Test systems are used. The method is therefore suitable as a reference method especially when it comes to various new serological test systems to establish or compare with them. The method according to the invention can thus with regard to the new salmonellosis regulation as a reference method be used if clearly and also at the genomic level To determine whether carcasses are Salmonella positive are to be assessed or not.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass die Funktion des invA-Gens, das die Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt, als wichtiger Virulenzfaktor für die Invasivität von Salmonella bewiesen ist. Daher lässt der Nachweis dieses Gens gleichzeitig auch Rückschlüsse auf die Invasivität und damit die Virulenz des Isolates zu.Another major advantage of the method according to the invention is that the function of the invA gene is the basis of the method according to the invention represents, as an important virulence factor for the invasiveness of Salmonella is proven. Therefore leaves the detection of this gene also draws conclusions about the invasiveness and thus the virulence of the isolate.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als einschränkend aufzufassen. Sofern nicht anders angegeben, wurden molekularbiologische Standardmethoden verwendet, wie z.B. von Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben.The following examples illustrate the Invention and are not to be construed as limiting. Unless otherwise stated, standard molecular biological methods were used, such as. by Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Beispiel 1:Example 1:

Die Infektionsversuche fanden im voll klimatisierten Versuchstierstall des Institutes für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen an der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig statt. Schweine wurden im Alter von sieben Wochen über eine Magensonde (Fa. Rüsch, Kernen) mit S. Typhimurium DT104 (Stammsammlung des Instituts für Mikrobiologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig, MARG et al., 2001) infiziert. Für den Infektionsversuch mit S. Typhimurium DT104 wurde die Übernachtkultur in LB-Bouillon auf 1×101 1 Kolonie bildende Einheiten (KBE) pro Infektionsdosis eingestellt. Die jeweilige Keimzahl wurde den Probanden in einem Gesamtvolumen von 20 ml PBS verabreicht.The infection tests took place in the fully air-conditioned laboratory animal stable of the Institute for Animal Hygiene and Public Veterinary Science at the Faculty of Veterinary Medicine at the University of Leipzig. At the age of seven weeks, pigs were infected with S. Typhimurium DT104 (trunk collection of the Institute for Microbiology of the Faculty of Veterinary Medicine at the University of Leipzig, MARG et al., 2001) using a gastric tube (Rüsch, Kernen). For the infection test with S. Typhimurium DT104, the overnight culture in LB broth was set to 1 × 10 1 1 colony-forming units (CFU) per infection dose. The respective number of bacteria was administered to the test subjects in a total volume of 20 ml PBS.

Beispiel 2: Probenmaterial aus Infektionsversuchen mit S. Typhimurium DT 104Example 2: Sample material from infection experiments with S. Typhimurium DT 104

Zur kulturellen Untersuchung und zur Evaluierung der für Salmonellen spezifischen PCR-Nachweismethoden standen Gewebeproben aus zwei Infektionsversuchen und aus einer Negativ-Kontrollgruppe zur Verfügung. In einem ersten Versuch wurden 84 Gewebeproben von sechs experimentell mit S. Typhimurium DT104 infizierten chinesischen Meishan-Schweinen (Tierexperimentellen Station „Unterer Lindenhof", Universität Hohenheim, REINER et al. 2002) entnommen. Alle Tiere entwickelten innerhalb von zwei Tagen nach experimenteller Infektion mit S. Typhimurium DT104 klinische Symptome einer akuten Salmonellose mit profusem gelblichen Durchfall, Fieber und Inappetenz. Kulturell waren sämtliche Schweine nach der Infektion in den Faeces-Proben Salmonella positiv, über den Versuchszeitraum schied jedes Tier auch Salmonellen aus. Zwei der sechs Tiere verstarben vor dem festgesetzten Schlachttermin, die Abgänge erfolgten drei und fünf Tage nach der Infektion unter den Symptomen einer akuten Salmonellose. Die restlichen vier Tiere wurden wie geplant 14 Tage nach experimenteller Infektion geschlachtet. Zum Zeitpunkt der Schlachtung zeigten die vier Tiere keine klinischen Symptome einer Erkrankung mehr, schieden aber noch vereinzelt Salmonellen aus. Damit waren sie zu diesem Zeitpunkt persistent infiziert.For cultural investigation and to evaluate the for Salmonella specific PCR detection methods were tissue samples from two infection trials and one Negative control group to disposal. In a first trial, 84 tissue samples from six were experimental Chinese Meishan pigs infected with S. Typhimurium DT104 (Animal experimental station “Unterer Lindenhof ", University of Hohenheim, REINER et al. 2002). All animals developed within two days after experimental infection with S. Typhimurium DT104 clinical symptoms of acute salmonellosis with profuse yellowish diarrhea, fever and anorexia. Everyone was cultural Pigs positive after infection in the Salmonella faeces specimens Each animal also excreted Salmonella in the test period. Two of the six animals died before the scheduled slaughter date, the Disposals followed three and five Days after infection under the symptoms of acute salmonellosis. The remaining four animals became experimental 14 days after planned Infection slaughtered. At the time of slaughter they showed four animals no longer had clinical symptoms of a disease, but still isolated from Salmonella. With that they were to this Time persistently infected.

Für die zweite Versuchsreihe standen 336 Gewebeproben von 24 experimentell mit S. Typhimurium DT104 infizierten Hybridschweinen (Landschwein × Edelschwein) (Hybridzucht des Bundeshybridzuchtprogramms (BHZP), Züchtungszentrale Lüneburg, REINER et al. 2002) zur Verfügung. Alle Tiere zeigten bis etwa sieben Tage nach experimenteller Infektion mit S. Typhimurium D7104 klinische Symptome einer akuten Salmonellen-Infektion mit erhöhter Körpertemperatur, Durchfall und vermindertem Allgemeinbefinden. Keines der Tiere verstarb im Verlaufe des Versuches, obgleich alle Schweine über den Versuchszeitraum bakteriologisch positiv gewesen waren. Klinische Symptome waren am Tag der Schlachtung nicht mehr feststellbar. Die Tiere waren demnach persistent infiziert.For the second series of tests were 336 tissue samples from 24 experimental Hybrid pigs infected with S. Typhimurium DT104 (country pig × noble pig) (Hybrid breeding of the Federal Hybrid Breeding Program (BHZP), breeding center Lueneburg, REINER et al. 2002) are available. All animals showed up to about seven days after experimental infection with S. Typhimurium D7104 clinical symptoms of an acute Salmonella infection with increased Body temperature, Diarrhea and reduced general condition. None of the animals died in the course of the trial, although all pigs over the Experimental period had been bacteriologically positive. clinical Symptoms were no longer evident on the day of slaughter. The Animals were therefore persistently infected.

Als Negativ-Kontrollen dienten 98 Gewebeproben von sieben nicht infizierten Hybridschweinen aus dem gleichen Salmonella-freien Herkunftsbestand, aus dem die Tiere der zweiten Infektionsgruppe stammten. Von sämtlichen Tieren der drei Versuchsgruppen wurden zum Zeitpunkt der Schlachtung jeweils die in Tabelle 2 aufgeführten Gewebeproben entnommen. Eine Übersicht der durchgeführten Infektionsversuche, aus denen Gewebeproben für die Untersuchungen dieser Arbeit entnommen werden konnten, zeigt Tabelle 1. Tabelle 1. Infektionsversuche

Figure 00100001
Tabelle 2. Gewebeproben zur S. Typhimurium DT104- Diagnostik von persistent infizierten Schlachtschweinen
Figure 00100002
98 tissue samples from seven uninfected hybrid pigs from the same Salmonella-free herd of origin from which the animals of the second infection group originated served as negative controls. The tissue samples listed in Table 2 were taken from all animals in the three test groups at the time of slaughter. An overview of the infection tests carried out, from which tissue samples could be taken for the investigations of this work, is shown in Table 1. Table 1. Infection attempts
Figure 00100001
Table 2. Tissue samples for S. Typhimurium DT104 diagnosis of persistently infected slaughter pigs
Figure 00100002

Beispiel 3: Oligonukleotide zum Nachweis von SalmonellenExample 3: Oligonucleotides for the detection of salmonella

Für die Salmonella-PCR-Diagnostik wurden zwei verschiedene Oligonukleotidpaare, die auf dem invA-Gen basieren, verwendet. Die Oligonukleotide sind in Tabelle 3 aufgeführt. Um beide PCR-Methoden im weiteren Verlauf der Untersuchung unterscheiden zu können, wurde die auf dem Bereich des 5'Endes des invA-Gens basierende Methode nach RAHN et al. (1992) als invA I-PCR (Oligonukleotide ST 139 und ST 141) bezeichnet und die erfindungsgwemäßen Oligonukleotide, die auf dem Bereich des 3'Endes des invA-Genes basieren, als invA II-PCR (Oligonukleotide invA-sal-F1 und invA-sal-R1). Tabelle 3. Ausgewählte Oligonukleotidsequenzen für die Salmonella-Diagnostik in Gewebeproben vom persistent infizierten Schlachtschwein

Figure 00110001
Two different pairs of oligonucleotides based on the invA gene were used for Salmonella PCR diagnostics. The oligonucleotides are listed in Table 3. In order to be able to differentiate between the two PCR methods in the further course of the investigation, the method based on the region of the 5 ′ end of the invA gene according to RAHN et al. (1992) referred to as invA I-PCR (oligonucleotides ST 139 and ST 141) and the oligonucleotides according to the invention, which are based on the region of the 3 ′ end of the invA gene, as invA II-PCR (oligonucleotides invA-sal-F1 and invA -sal-R1). Table 3. Selected oligonucleotide sequences for Salmonella diagnosis in tissue samples from persistently infected slaughter pigs
Figure 00110001

Beispiel 4: Diagnostik von SalmonellaExample 4: Diagnostics by Salmonella

1. Kulturelle Diagnostik1. Cultural diagnostics

Die bakteriologische Untersuchung der Gewebeproben erfolgte nach der ISO 6579 mit den nachfolgend aufgeführten Änderungen. Dazu wurde das Organmaterial (Tabelle 2) steril entnommen, in Spiritus getaucht, im Labor über einem Bunsenbrenner abgeflammt und jeweils 5 g in 25 ml Pepton-Bouillon (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) eingewogen. Anschließend wurde das Material bei höchster Stufe für 2 Min im Stomacher 400 (Fa. Seward, London, UK) in einem Stomacherbeutel (Fa. Seward, London, UK) homogenisiert und dann bei 37 °C für 24 Stunden im Beutel aerob bebrütet. Danach wurden aus der Pepton-Bouillon-Voranreicherung zweimal 100 μl entnommen und in jeweils ein neues Reagenzröhrchen mit 9,9 ml Rappaport-Vassiliadis (RV)-Medium (Fa. Merck, Darmstadt) überführt und für 24 Stunden bei 42 °C inkubiert. Beide Ansätze im RV-Medium wurden nach dem Bebrüten jeweils auf XLD- und BPLS-Agarmedium (Fa. Merck, Darmstadt) mittels Glasstab ausgestrichen und bei 37 °C für 24 Stunden inkubiert. Nach 24 Stunden wurden potentiell positive Kolonien mittels Objektträgerschnellagglutination bestätigt (Agglutinationsseren von der Firma Sifin, Berlin).The bacteriological examination the tissue samples were taken according to ISO 6579 with the following changes listed. For this purpose, the organ material (Table 2) was removed sterile, in alcohol submerged in the laboratory burned in a Bunsen burner and each 5 g in 25 ml peptone broth (From Merck, Darmstadt, Germany). Then was the material at the highest Level for 2 min in a Stomacher 400 (Seward, London, UK) in a stomacher bag (Seward, London, UK) homogenized and then at 37 ° C for 24 hours incubated aerobically in the bag. Then 100 μl were withdrawn twice from the peptone broth pre-enrichment and in a new test tube with 9.9 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium (Merck, Darmstadt) transferred and for 24 Hours at 42 ° C incubated. Both approaches in RV medium were incubated after incubation each on XLD and BPLS agar medium (Merck, Darmstadt) by means of Streak the glass rod and incubate at 37 ° C for 24 hours. To 24 hours were potentially positive colonies using slide agglutination approved (Agglutination sera from Sifin, Berlin).

1. Nachweis mittels PCR-Methode1. Detection using the PCR method

Für den spezifischen Salmonella Nachweis in Gewebeproben von Schlachtschweinen wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Oligonukleotide als Primer verwendet. Das Kontroll-Oligonukleotidpaar (inv-A I-PCR) basiert auf einem Bereich nahe des 5'-Endes des invA-Gens von S. Typhimurium. Die Amplifikation liefert ein 284 bp großes Produkt. Ein wesentlicher Nachteil des Nachweises mit den Kontroll-Oligonukleotiden besteht darin, dass der Bereich am 5'-Ende des invA-Gens von S. Typhimurium hohe Übereinstimmungen mit bestimmten Bereichen des Genoms von E. coli besitzt.For the specific Salmonella detection in tissue samples from slaughter pigs were those listed in Table 3 Oligonucleotides used as primers. The control oligonucleotide pair (inv-A I-PCR) is based on an area near the 5 'end of the invA gene by S. Typhimurium. The amplification provides a 284 bp product. A major disadvantage of detection with the control oligonucleotides is that the region at the 5 'end of the S. Typhimurium invA gene high correspondence with certain regions of the E. coli genome.

Das erfindungsgemäße Oligonukleotidpaar (invA-sal-F1 und invA-sal-R1, Tabelle 3) amplifiziert ein 443 bp großes Produkt im Bereich des 3'Endes des invA-Gens. Die Lokalisation des Amplifikationsbereiches der beiden PCR-Methoden innerhalb der invA-kodierenden Region ist schematisiert in 10 dargestellt. Bei der Konstruktion erfindungsgemäßen Oligonukleotide für die invA II-PCR-Methode wurde insbesondere auf Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen geachtet, um die Spezifität des späteren Amplifikates mit Hilfe eines Restriktionsverdaus auch kontrollieren zu können. Zur Überprüfung der Spezifität des 443 bp großen Produktes wurde deshalb die Restriktionsendonuklease Nde I ausgewählt. Sie spaltet das spezifische Produkt in zwei Amplifikate mit einer Größe von 247 bp sowie 196 bp.The oligonucleotide pair according to the invention (invA-sal-F1 and invA-sal-R1, Table 3) amplifies a 443 bp product in the region of the 3 ′ end of the invA gene. The location of the amplification area of the two PCR methods within the invA coding region is schematized in 10 shown. When constructing oligonucleotides according to the invention for the invA II-PCR method, particular attention was paid to interfaces for restriction endonucleases in order to be able to also control the specificity of the later amplificate with the aid of a restriction digest. The restriction endonuclease Nde I was therefore selected to check the specificity of the 443 bp product. It splits the specific product into two amplicons with a size of 247 bp and 196 bp.

2. Spezifitätsprüfungen und Sensitivitätsprüfungen der PCR-Methoden2. Specificity tests and Sensitivity tests of the PCR methods

Die Spezifitätsprüfung der beiden zum Salmonella-Nachweis eingesetzten PCR-Verfahren erfolgte anhand von Bakterien-Reinkulturen. Für die Spezifitätsprüfung wurden ausgewählte Referenzstämme und Feldisolate eingesetzt (Tabelle 5). Jeweils eine Kolonie wurde mit einer Öse von der Agarmedium-Platte abgehebert und in 500 μl Aqua bidest. in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf, Köln) zu einer homogenen Suspension vermischt. Die Suspension wurde dann bei 94 °C für 10 Min im Wasserbad erhitzt, anschließend bei 13.000 x g für 5 min abzentrifugiert und bei 4 °C gelagert. Jeweils 3 μl des Überstandes wurden als Template für jeden 50 μl PCR-Ansatz eingesetzt. Insgesamt wurden 12 Salmonella-Stämme getestet sowie 36 Nicht-Salmonella-Spezies, welche durch ihr Vorkommen beim Schwein tierartspezifisch von diagnostischer Relevanz sind.The specificity check of the two PCR methods used for Salmonella detection was carried out using pure bacterial cultures. Selected reference strains and field isolates were used for the specificity test (Table 5). One colony at a time was lifted off the agar medium plate with an eyelet and bidistilled in 500 μl aqua. mixed in a 1.5 ml Eppendorf reaction vessel (Eppendorf, Cologne) to form a homogeneous suspension. The suspension was then heated in a water bath at 94 ° C. for 10 minutes, then centrifuged at 13,000 × g for 5 minutes and stored at 4 ° C. 3 μl of the supernatant were in each case used as a template for every 50 μl PCR mix. A total of 12 strains of Salmonella were tested and 36 non-Salmonella species, which are of diagnostic relevance due to their presence in pigs.

Zum Vergleich der Sensititvität der invA I-PCR- und der invA II-PCR-Methode wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe von 107 absteigend auf 100 GKZ/ml einpipettiert. Dafür wurde der als Infektionsstamm ausgewählte vom Schwein isolierte S. Typhimurium DT104- Stamm verwendet. Von jeder Verdünnungsstufe wurde jeweils 1 ml in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überpipettiert und bei 13.000 x g für 5 Min abzentrifugiert, der Überstand dann vorsichtig abpipettiert und verworfen. Das Pellet wurde anschließend in 1 ml Lysis-Puffer, der sich aus 0,2 mg/ml Proteinase K (Fa. AppliChem, Darmstadt) und 0,025 % Tween 20 (Fa. Fluka Chemie, Steinheim) in Aqua bidest. zusammensetzt, bei 56 °C für 1 Stunde im Thermoblock (Fa. Uniequip, München) inkubiert. Zur Inaktivierung der Proteinase K wurden die Eppendorf-Reaktionsgefäße anschließend direkt nach der Inkubation im Wasserbad für 10 min auf 94 °C erhitzt und bei 13.000 x g für 5 min abzentrifugiert. Jeweils 3 μl des Überstandes wurden pro 50 μl PCR-Ansatz (3 μl Template-DNA und 47 μl Mastermix) zugesetzt.To compare the sensitivity of the invA I-PCR and the invA II-PCR method became a logarithmic dilution series Pipetted from 107 descending to 100 GKZ / ml. For that was the one selected as an infection strain porcine S. Typhimurium DT104 strain used. From each level of dilution pipetted 1 ml each into a 1.5 ml Eppendorf tube and at 13,000 x g for Centrifuged for 5 minutes, the supernatant then pipetted off carefully and discarded. The pellet was then in 1 ml lysis buffer, which consists of 0.2 mg / ml Proteinase K (from AppliChem, Darmstadt) and 0.025% Tween 20 (from Fluka Chemie, Steinheim) in Aqua bidest. composed, at 56 ° C for 1 hour in a thermoblock (Fa. Uniequip, Munich) incubated. The Eppendorf tubes were then used directly to inactivate Proteinase K. heated to 94 ° C for 10 min after incubation in a water bath and at 13,000 x g for Centrifuged for 5 min. 3 μl each of the supernatant were per 50 ul PCR approach (3 μl Template DNA and 47 ul Master mix) added.

3. PCR-Bedingungen und Agarose-Gelelektrophorese3. PCR conditions and Agarose gel electrophoresis

Bei dem für die PCR verwendeten Thermocycler handelte es sich um das Modell GeneAmp 2400 PCR-System (Fa. Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim). Alle Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 μl pro PCR-Ansatz in 200 μl PCR-Reaktionsgefäßen (Fa. Peglab Biotechnologie GmbH, Erlangen) durchgeführt. Jeder PCP-Ansatz setzte sich aus je 5 μl 10 x PCR-Reaktionspuffer (Fa. Roche, Mannheim), 5 μl 2 mM dNTP-Mix (Fa. Hybaid, Franklin), 10 pmol von jedem Primer (Fa. VBC-Genomics, Wien, Österreich) sowie 3 μl bzw. 10 μl Template und dementsprechend 34,8 μl bzw. 27,8 μl Aqua bidest. zusammen. Bei jedem Reaktionsansatz wurde eine Positiv- sowie eine Negativ-Kontrolle mitgeführt. In der Positiv-Kontrolle wurde als Template reine DNA des Infektionsstammes S. Typhimurium DT104 eingesetzt. Als Negativ-Kontrolle diente ein PCR-Ansatz wie oben beschrieben nur ohne Template.With the thermal cycler used for the PCR it was the GeneAmp 2400 PCR system (Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim). All reactions were carried out in a volume of 50 μl per PCR mixture in 200 μl PCR reaction vessels (Fa. Peglab Biotechnologie GmbH, Erlangen). Every PCP approach continued consist of 5 μl each 10 x PCR reaction buffer (Roche, Mannheim), 5 ul 2 mM dNTP mix (company Hybaid, Franklin), 10 pmol from each primer (VBC-Genomics, Vienna, Austria) as well as 3 μl or 10 μl Template and accordingly 34.8 μl or 27.8 μl Aqua bidest. together. at Each reaction batch was a positive and a negative control carried. In the positive control, pure DNA from the infection strain was used as the template S. Typhimurium DT104 used. A PCR approach such as served as a negative control described above only without template.

Die von RAHN et al. (1992) für ihre PCR-Methode angegebenen Zyklusbedingungen mit einem vorangestellten Inkubations-Schritt von 72 °C für 7 min, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 1 min Denaturierung bei 94 °C, 2 min Annealing bei 53 °C und 3 min Extension bei 72 °C, sowie abschließendem Inkubationsschritt für 7 min bei 72 °C wurden anhand von 17 Bakterien-Reinkulturen (9x Salmonella-Spezies., Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis, 3 x Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis) optimiert. Die in Tabelle 5 aufgeführten PCR-Bedingungen begannen jeweils mit einem Denaturierungsschritt von 5 min und endeten in einem finalen Extensionschritt von 7 min. Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte wurde in einem 2 %igen (v/v) Agarose-Gel durchgeführt. Dazu wurden 4 g Agarose (Fa. Life Technologies, Paisley, Schottland) mit 200 ml TBE-Puffer gemischt, im Mikrowellenherd verflüssigt und davon 30 ml in die Gelkammer (Fa. Biorad, München) gegossen. Für die Elektrophorese wurde die Gelkammer mit jeweils 350 ml TBE-Puffer befüllt. Tabelle 4. Zyklusbedingungen der zum Nachweis von Salmonellen eingesetzten PCR-Methoden invA I und invA II.

Figure 00140001
The by RAHN et al. (1992) for their PCR method specified cycle conditions with a preceding incubation step of 72 ° C for 7 min, followed by 35 cycles with 1 min denaturation at 94 ° C, 2 min annealing at 53 ° C and 3 min extension 72 ° C, as well as the final incubation step for 7 min at 72 ° C were determined using 17 pure bacterial cultures (9x Salmonella species, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis, 3 x Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis) optimized. The PCR conditions listed in Table 5 each started with a denaturation step of 5 min and ended in a final extension step of 7 min. The electrophoretic separation of the PCR products was carried out in a 2% (v / v) agarose gel. For this purpose, 4 g of agarose (from Life Technologies, Paisley, Scotland) were mixed with 200 ml of TBE buffer, liquefied in a microwave oven and 30 ml thereof poured into the gel chamber (from Biorad, Munich). For the electrophoresis, the gel chamber was filled with 350 ml TBE buffer each. Table 4. Cycle conditions of the PCR methods invA I and invA II used for the detection of Salmonella.
Figure 00140001

Beispiel 5:Example 5:

1. Untersuchung von Gewebeproben auf Salmonella mittels PCR1. Examination of tissue samples on Salmonella using PCR

Die Untersuchung der Gewebeproben auf Salmonella mit der PCR erfolgte nach DIN 10135 mit den nachfolgend beschriebenen Abänderungen. Wie vorstehend beschrieben, standen 84 Gewebeproben für einen ersten Versuch zur Verfügung. Bei diesen Proben wurde nach 24 stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon 1 ml in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß abpipettiert, und wie beschrieben, aufbereitet. Die Entnahme der Probe für die PCR-Diagnostik erfolgte immer aus dem Anreicherungsmedium für den Kulturversuch. Jeweils 10 μl des Überstandes nach der DNA-Extraktion aus der Voranreicherung wurden als Template im 50 μl PCR-Ansatz eingesetzt. Der PCR-Ansatz setzte sich wie vorstehend beschrieben zusammen. In der ersten Untersuchung von 84 Gewebeproben nach Pepton-Anreicherung wurde nur die invA I-PCR-Methode eingesetzt.Examination of tissue samples on Salmonella with the PCR was carried out according to DIN 10135 with the following described changes. As described above, 84 tissue samples were for one first try available. These samples were in peptone broth after 24 hours of enrichment Pipette 1 ml into a 1.5 ml Eppendorf tube, and as described, edited. The sample was taken for PCR diagnostics always from the enrichment medium for the culture experiment. Each 10 μl of the supernatant After the DNA extraction from the pre-enrichment were used as a template in a 50 μl PCR mix used. The PCR approach continued as described above together. In the first study of 84 tissue samples after peptone enrichment only the invA I-PCR method was used.

Der Untersuchungsgang bei den 336 Gewebeproben aus dem zweiten Infektionsversuch unterschied sich von dem in der ersten Versuchsreihe, da Erkenntnisse aus dem ersten Infektionsversuch genutzt wurden, um eine der beiden PCR-Verfahren (invA I und invA II) zum Nachweis von S. Typhimurium hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zu optimieren. Es konnte im Vorversuch gezeigt werden, dass nach alleiniger Anreicherung in Pepton-Bouillon nur in einigen Organen die gleiche Sensitivität wie mit dem Kulturversuch erreicht werden konnte. Aus diesem Grund wurden die Organe nicht nur nach 24 stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon mittels PCR untersucht, sondern auch nach kombinierter Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV-Medium für weitere 48 Stunden, um dadurch die Sensitivität des Verfahrens zu erhöhen.The examination course at the 336 Tissue samples from the second infection attempt differed from that in the first series of experiments, since knowledge from the first Infection attempts were used to perform either of the two PCR procedures (invA I and invA II) for the detection of S. Typhimurium with regard to sensitivity and specificity to optimize. It could be shown in the preliminary experiment that after sole accumulation in peptone broth only in some organs the same sensitivity how could be achieved with the cultural experiment. For this reason the organs were not only after 24 hours of enrichment in peptone broth examined by PCR, but also after combined enrichment in peptone broth and RV medium for an additional 48 hours to thereby the sensitivity to increase the procedure.

Von den Gewebeproben des zweiten Versuches wurde deshalb 1 ml aus der Pepton-Anreicherung in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Zusätzlich wurden aus den parallelen Ansätzen des RV-Mediums für den Kulturversuch jeweils 500 μl abgenommen und die Aliquots in einem sterilen 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß zusammengeführt. Die Entnahme der Probe für die PCR-Diagnostik erfolgte aus den Anreicherungen für die Bakteriologie. Die Aufbereitung der Probe nach Pepton-Anreicherung erfolgte wie in 2 beschrieben. Bei der Probe aus der RV-Anreicherung wurde allerdings der erste Zentrifugationsschritt weggelassen. Dieser Zentrifugationsschritt erwies sich nur für diejenigen Fälle erforderlich, bei denen grobe Schwebstoffe aus der Anreicherung zu entfernen sind. Da dies aber in der RV-Anreicherung nicht der Fall war, konnte auf diesen Zentrifugationsschritt verzichtet werden.For this reason, 1 ml of the tissue samples from the second experiment was transferred from the peptone enrichment into a sterile 1.5 ml Eppendorf reaction vessel. In addition, 500 μl were removed from the parallel batches of the RV medium for the culture experiment and the aliquots were combined in a sterile 1.5 ml Eppendorf reaction vessel. The sample for PCR diagnostics was taken from the enrichments for bacteriology. The sample was prepared after peptone enrichment as in 2 described. However, the first centrifugation step was omitted for the sample from the RV enrichment. This centrifugation step was only necessary for those cases in which coarse suspended matter has to be removed from the enrichment. However, since this was not the case in the RV enrichment, this centrifugation step could be dispensed with.

Da die invA I-PCR national (DIN 10135) und auch international (EU-Projekt :"FOOD-PCR" unter folgender Internet-Adresse: http://www.pcr.dk) als eine Standardmethode anerkannt ist, wurden die Gewebeproben zuerst mittels dieser PCR-Methode nach 24stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon und nach 48stündiger kombinierter Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV-Medium untersucht. Es wurden also insgesamt 672 PCRs mit der invA I-PCR durchgeführt. Die Untersuchung der Proben nach Pepton-Anreicherung wurde mit dem Oligonukleotidpaar invA I durchgeführt. Bei bestimmten Proben nach kombinierter Pepton-RV-Anreicherung wurde zusätzlich mit der invA II-PCR-Methode untersucht, da vermeintlich falsch-positive Produkte bei der invA I-PCR amplifiziert wurden. Der Nachweis des jeweiligen Amplifikates erfolgte durch Elektrophorese in einem 2 %igen (v/v) Agarose-Gel und anschließender Färbung im Ethidiumbromid-Bad.Since the invA I-PCR national (DIN 10135) and also internationally (EU project: "FOOD-PCR" at the following Internet address: http://www.pcr.dk) The tissue samples were recognized as a standard method first by means of this PCR method after 24 hours of enrichment in peptone broth and after 48 hours Combined enrichment in peptone broth and RV medium examined. A total of 672 PCRs were carried out with the invA I-PCR. The Examination of the samples after peptone enrichment was carried out with the oligonucleotide pair invA I performed. For certain samples after combined peptone-RV enrichment additionally investigated with the invA II-PCR method, as supposedly false positive products were amplified in the invA I-PCR. Evidence of each Amplificates were obtained by electrophoresis in a 2% (v / v) Agarose gel and subsequent coloring in the ethidium bromide bath.

Ein regelmäßig in der invA I-PCR-Methode auftretendes unspezifisches PCR-Produkt wurde mittels PCR-Purification-Kit® (Fa. Qiagen, Hilden) gereinigt, um daraufhin dessen DNA-Sequenz zu bestimmen. Die Ermittlung der Nukleotid-Sequenz erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode und wurde mit einem LI-COR DNA-Sequenzierer, Model 4000® im Auftrag durchgeführt (Fa. VBC-Genomics, Wien, Österreich). Die Sequenz wurde schließlich mit der Computersoftware Wisconsin (Version 8.1, UNIX®) analysiert. Die Amplifikate der invA II-PCR-Methode wurden mit der Restrtktionsendonuklease Nde I hinsichtlich ihrer Spezifität überprüft. Der 20 μl-Ansatz für den Restriktionsverdau setzte sich jeweils aus 3,5 μl Puffer R+ (Fa. Fermentas, St. Leon Rot), 1,7 u1 Enzym Nde I (10 units/u1), 3,5 u1 PCR-Produkt und 11,3 Aqua bidest. zusammen. Der Ansatz wurde bei 37 °C für 1,5 Stunden in einem 200 μl PCR-Reaktionsgefäß im Thermocycler inkubiert. Nach der Elektrophorese im 2 %igen (v/v) Agarose-Gel und anschließender Färbung im Ethidiumbromidbad, konnten die Fragmente ebenfalls in ihrer Größe mit dem Längenstandard verglichen werden.A non-specific PCR product that regularly occurs in the invA I-PCR method was purified using the PCR Purification Kit® (from Qiagen, Hilden) in order to then determine its DNA sequence. The determination of the nucleotide sequence by the dideoxy chain termination method, and was with a LI-COR performed DNA sequencer, Model 4000 ® on behalf of (Fa. VBC Genomics, Vienna, Austria). The sequence was finally analyzed using the Wisconsin computer software (version 8.1, UNIX ® ). The amplificates of the invA II-PCR method were checked with the restriction endonuclease Nde I with regard to their specificity. The 20 μl batch for restriction digestion consisted of 3.5 μl buffer R + (from Fermentas, St. Leon Rot), 1.7 μl enzyme Nde I (10 units / μl), 3.5 μl PCR product and 11.3 Aqua bidest. together. The mixture was incubated at 37 ° C. for 1.5 hours in a 200 μl PCR reaction tube in a thermal cycler. After electrophoresis in 2% (v / v) agarose gel and subsequent staining in the ethidium bromide bath, the size of the fragments could also be compared with the length standard.

ErgebnisseResults

Diagnostik von S. Typhimurium DT104 in infizierten Meishan-SchweinenDiagnostics of S. Typhimurium DT104 in infected Meishan pigs

In einem ersten Versuch wurden 84 Gewebeproben von sechs infizierten Meishan-Schweinen gewonnen. Die Gewebeproben wurden zum Zeitpunkt der Schlachtung steril entnommen und mittels bakteriologischer Methode nach ISO 6579 und vergleichend mittels invA I-PCR-Methode nach 24stündiger Pepton-Anreicherung untersucht. Die bakteriologische Untersuchung der Proben ergab, dass es Gewebe gibt, in denen bei sämtlichen Tieren S. Typhimurium nachgewiesen werden konnte. Bei diesen Organen handelte es sich um Mandibularlymphknoten, Ileum, Colon, Caecum, Lnn. ileocolici und Colonlymphknoten. Bei denjenigen Schweinen, die mit dem klinischen Bild einer akuten Salmonellose verstarben, konnte S. Typhimurium DT104 sogar in sämtlichen entnommenen Organen kulturell nachgewiesen werden. Dies galt insbesondere auch für die Gewebe, bei denen in den persistent infizierten Tieren kein Nachweis möglich war, dazu gehörten Lunge, Lungenlymphknoten, Leber, Milz und Muskulatur. Die Nachweisraten der beiden Methoden unterschieden sich in den verschiedenen Organen, wie 3 zeigt, erheblich.In a first experiment, 84 tissue samples from six infected Meishan pigs were obtained. The tissue samples were taken sterile at the time of slaughter and examined using the bacteriological method according to ISO 6579 and comparative using the invA I-PCR method after 24-hour peptone enrichment. The bacteriological examination of the samples showed that there are tissues in which S. Typhimurium could be detected in all animals. These organs were Mandibular lymph nodes, ileum, colon, caecum, lnn. ileocolici and colon lymph nodes. In those pigs that died of the clinical picture of acute salmonellosis, S. Typhimurium DT104 could even be culturally detected in all removed organs. This was particularly true for the tissues in which no evidence was possible in the persistently infected animals, including the lungs, pulmonary lymph nodes, liver, spleen and muscles. The detection rates of the two methods differed in the different organs, such as 3 shows, significantly.

Die Nachweisraten der beiden Verfahren waren in Lunge, Jejunum, Ileum, Colon und Caecum nicht gleich. Es konnte bei dieser Untersuchung gezeigt werden, dass sich insbesondere die lymphatischen Organe wie Mandibularlymphknoten, Lnn. ileocolici und Colonlymphknoten (3) zum Nachweis einer S. Typhimurium-Infektion beim Meishan-Schwein eignen, wenn man die invA I-PCR-Methode nach 24stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon anwendet. In diesen Geweben war mittels der PCR-Methode und auch dem Kulturversuch ein Nachweis von S. Typhimurium bei allen Tieren möglich. Hier berechnet sich für die PCR-Methode nach 24stündiger Pepton-Anreicherung für die 36 untersuchten lymphatischen Organe (Tonsille, Mandibularlymphknoten, Lungenlymphknoten, Lnn. ileocolici, Jejunallymphknoten und Colonlymphknoten) eine 100 %ige Sensitivität, bei 100 %iger Spezifität.The detection rates of the two methods were not the same in the lungs, jejunum, ileum, colon and caecum. It could be shown in this investigation that the lymphatic organs such as the mandibular lymph nodes, Lnn. ileocolici and colon lymph nodes ( 3 ) for detection of S. Typhimurium infection in Meishan pigs, if the invA I-PCR method is used after 24 hours of enrichment in peptone broth. In these tissues, detection of S. Typhimurium was possible in all animals using the PCR method and also the culture experiment. After the 24-hour peptone enrichment for the 36 examined lymphatic organs (tonsil, mandibular lymph nodes, lung lymph nodes, lnn. Ileocolici, jejunally lymph nodes and colon lymph nodes), a 100% sensitivity, with 100% specificity, is calculated for the PCR method.

Bei den jeweiligen Schweinen, die unter den Symptomen einer akuten Salmonellose verstorben waren, gelang der Nachweis mittels invA I-PCR-Methode in allen Gewebeproben. So konnten die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchung durch die invA I-PCR-Methode bestätigt werden. Der Nachweis von S. Typhimurium in anderen Geweben war allerdings über eine 24stündige Anreicherung in Pepton-Bouillon und anschließender invA I-PCR-Methode nicht mit befriedigender Sensitivität möglich. Dies betrifft insbesondere den Nachweis in Lunge, Jejunum, Ileum, Colon und Caecum (3). In diesen Geweben war die kulturelle Diagnostik der invA I-PCR-Methode hinsichtlich ihrer Sensitivität überlegen, da die PCR-Methode bei 24 untersuchten Proben lediglich eine Sensitivität von 36 % bei 100 % Spezifität aufwies. Bei einigen Gewebeproben waren auch unspezifische PCR-Produkte erkennbar, die aber nicht zu einer Verwechslung mit dem spezifischen PCR-Produkt von 284 bp führten, da sie deutlich größer waren als das erwartete PCR-Produkt. Die invA I-PCR-Methode nach 24stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon erbrachte bei 84 untersuchten Proben eine Sensitivität von 79 % bei einer Spezifität von 100 % für den Nachweis von S. Typhimurium in den Geweben vom Meishan-Schwein. Das bedeutet, dass der Kulturversuch der PCR-Methode nach Anreicherung in Pepton-Bouillon hinsichtlich der Sensitivität überlegen ist, wenn man alle Gewebe der persistent infizierten Schweine in eine Bewertung einbezieht.In the respective pigs that had died from the symptoms of acute salmonellosis, the detection using the invA I-PCR method was successful in all tissue samples. The results of the bacteriological examination could be confirmed by the invA I-PCR method. However, the detection of S. Typhimurium in other tissues was not possible with satisfactory sensitivity via a 24-hour enrichment in peptone broth and subsequent invA I-PCR method. This applies in particular to detection in the lungs, jejunum, ileum, colon and caecum ( 3 ). In these tissues, the cultural diagnosis of the invA I-PCR method was superior in terms of its sensitivity, since the PCR method only showed a sensitivity of 36% with 100% specificity in 24 examined samples. Some tissue samples also showed non-specific PCR products, but they did not lead to confusion with the specific PCR product of 284 bp, as they were significantly larger than the expected PCR product. The invA I-PCR method after 24 hours of enrichment in peptone broth yielded a sensitivity of 79% with a specificity of 100% for the detection of S. Typhimurium in the tissues of the Meishan pig in 84 samples examined. This means that the culture test of the PCR method after enrichment in peptone broth is superior in terms of sensitivity if all tissues of the persistently infected pigs are included in an evaluation.

Diagnostik von S. Typhimurium DT104 in persistent infizierten Schweinen Für die Untersuchung der 336 Gewebeproben von 24 experimentell infizierten Hybridschweinen wurden neben der bakteriologische Methode (ISO 6579) auch die PCR-Verfahren invA I und invA II vergleichend geprüft. Der Vergleich der Ergebnisse der PCR-Methode nach 24stündiger Anreicherung in Pepton-Bouillon, sowie nach 48stündiger kombinierter Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV-Medium mit der kulturellen Untersuchungsmethode zeigte, dass nach Anreicherung in Pepton-Bouillon in keinem Gewebe die Sensitivität der bakteriologischen Verfahrensweise erreicht werden konnte. Erst nach kombinierter Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV-Medium für 48 Stunden kann die Sensitivität des Kulturversuches erreicht und in Ileum und Jejunum sogar übertroffen werden (4). Für die PCR-Analyse nach Anreicherung in Pepton-Bouillon errechnete sich eine Sensitivität von 58 % bei 100 %iger Spezifität, bei insgesamt 336 untersuchten Proben. Entnimmt man dagegen die Proben für die PCR nach kombinierter Pepton Bouillon-RV-Medium-Anreicherung, errechnete sich für dieses Verfahren eine 100 %ige Sensitivität für die PCR und eine Spezifität von 96 %.Diagnostics of S. Typhimurium DT104 in persistently infected pigs In addition to the bacteriological method (ISO 6579), the PCR methods invA I and invA II were also compared to examine the 336 tissue samples from 24 experimentally infected hybrid pigs. The comparison of the results of the PCR method after 24 hours of enrichment in peptone broth and after 48 hours of combined enrichment in peptone broth and RV medium with the cultural investigation method showed that after enrichment in peptone broth in no tissue the sensitivity of the bacteriological procedure could be achieved. Only after combined enrichment in peptone broth and RV medium for 48 hours can the sensitivity of the culture experiment be achieved and even exceeded in the ileum and jejunum ( 4 ). For the PCR analysis after enrichment in peptone broth, a sensitivity of 58% with 100% specificity was calculated for a total of 336 samples examined. If, on the other hand, the samples for the PCR are taken after combined peptone broth RV medium enrichment, a 100% sensitivity for the PCR and a specificity of 96% was calculated for this method.

Die in der PCR-Diagnostik positiven, aber in der Bakteriologie negativen Proben wurden zur Abklärung auch mit der invA II-PCR-Methode untersucht. Auch mit dieser Methode konnte das für das verwendete Oligonukleotidprimerpaar spezifische Produkt von 443 bp amplifiziert werden. Die 443 bp großen Amplifikate aus Ileum und Jejunum-Proben wurden zusätzlich erfolgreich mit der Restriktionsendonuklease Nde I geschnitten. So konnte das Testergebnis nochmals verifiziert werden. Die Auswertung der bakteriologischen Diagnostik und der PCR-Ergebnisse im Hinblick auf einen Erregertropismus ergab zwei Gewebeproben, bei denen 96 % (23 von 24 Tiere) der Tiere als Salmonella-positiv identifiziert werden konnten. So erwies sich das Caecum und die Lnn. ileocolici als geeignete Probenahmelokalisation für die S. Typhimurium DT104-Diagnostik im persistent infizierten Tier. Berücksichtigte man nur die PCR-Diagnostik-Ergebnisse aus einer 48stündigen kombinierten Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV -Medium, dann eignete sich auch eine Kombination aus Caecum und Ileum, um 96 % aller Tiere als Salmonella-positiv zu identifizieren. Das eine Schwein, welches nicht durch eine der genannten Organkombinationen erfasst werden konnte, war kulturell und mittels PCR-Methode lediglich im Jejunallymphknoten Salmonella-positiv.The positive ones in PCR diagnostics, but in bacteriology negative samples were also used for clarification examined with the invA II-PCR method. Even with this method could do that for the oligonucleotide primer pair specific product of 443 bp can be amplified. The 443 bp amplicons from Ileum and Jejunum samples were added successfully cut with restriction endonuclease Nde I. So the test result could be verified again. The evaluation bacteriological diagnostics and PCR results with regard to pathogen tropism revealed two tissue samples in which 96% (23 of 24 animals) of the animals could be identified as Salmonella positive. So it turned out the caecum and the lnn. ileocolici as a suitable sampling location for the S. Typhimurium DT104 diagnostics in persistently infected animals. considered only the PCR diagnostic results from a 48-hour combined enrichment in peptone broth and RV medium, then a combination of caecum was also suitable and ileum to identify 96% of all animals as Salmonella positive. The one pig, which is not through one of the organ combinations mentioned was culturally and using the PCR method only in Jejunallymph node Salmonella positive.

Bei acht der insgesamt 24 untersuchten Tiere wurden nach 48 Stunden kombinierter Anreicherung in Pepton-Boillon und RV-Medium in den unterschiedlichsten Gewebeproben auch unspezifische Produkte amplifiziert. Diese acht Tiere sowie vier weitere Schweine, die eindeutig positiv in der invA I-PCR waren, wurden zur Abklärung und zum Vergleich der Spezifität der beiden Oligonukleotidpaare mit dem invA II-Oligonukleotidprimerpaar nach kombinierter Pepton-Bouillon-RV-Medium-Anreicherung untersucht. Bei allen Geweben der acht untersuchten Tiere, die ein unspezifisches aber vermeintlich positives Produkt aufwiesen, konnte mit der invA II-PCR-Methode kein positives und auch kein unspezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Ein Beispiel für die unspezifischen Amplifikate und den Vergleich der Spezifität zwischen der invA I- und invA II-PCR-Methode aus den Geweben eines experimentell mit S. Typhimurium DT104 infizierten Tieres zeigt 5. Die Spezifität des 448 bp großen Produktes der invA II-PCR wurde mit der Restriktionsendonuklease Nde I überprüft.After 48 hours of combined enrichment in peptone boil and RV medium, eight of the 24 animals examined also amplified non-specific products in a wide variety of tissue samples. These eight animals and four further pigs, which were clearly positive in the invA I-PCR, were examined for clarification and to compare the specificity of the two oligonucleotide pairs with the invA II oligonucleotide primer pair after combined peptone-broth RV medium enrichment. With all fabrics Of the eight animals examined, which had an unspecific but supposedly positive product, no positive and no unspecific amplificate could be detected with the invA II-PCR method. An example of the non-specific amplificates and the comparison of the specificity between the invA I and invA II PCR methods from the tissues of an animal experimentally infected with S. Typhimurium DT104 is shown 5 , The specificity of the 448 bp invA II-PCR product was checked with the restriction endonuclease Nde I.

Prüfung der Kontrollgruppe auf SalmonellaCheck the control group for Salmonella

Die 98 Gewebeproben der Negativ-Kontrollgruppe wurden mittels kultureller Methoden (ISO 6579) und durch die invA-I- und invA-II-PCR-Methode nach kombinierter Anreicherung in Pepton-Bouillon und RV-Medium vergleichend untersucht. Sämtliche 98 untersuchten Gewebeproben wurden in der kulturellen Untersuchung Salmonella-negativ getestet. Die Untersuchung der Gewebe der Salmonella-negativ getesteten Tiere mit den PCR-Verfahren konnte die bereits für die Gewebeproben von experimentell infizierten Tieren gezeigte ungenügende Spezifität der invA-I-PCR-Methode bestätigen. Bei allen kulturell-negativ getesteten Tieren gab es einige Gewebestrukturen, bei denen wieder ein unspezifisches PCR-Produkt amplifiziert wurde. Dies war nur geringfügig größer als das spezifische Amplifikat von 284 bp. Untersuchte man die Gewebeproben dieser Tiere jedoch mit der invA-II-PCR-Methode wurde weder ein spezifisches Amplifikat noch ein unspezifisches Produkt amplifiziert. Ein Beispiel für die PCR-Ergebnisse aus den Gewebeproben eines Salmonella-negativen Schweines zeigt 6.The 98 tissue samples from the negative control group were compared by means of cultural methods (ISO 6579) and by the invA-I and invA-II-PCR method after combined enrichment in peptone broth and RV medium. All 98 Tissue samples examined were tested negative for Salmonella in the cultural study. The examination of the tissues of the Salmonella-negative animals with the PCR method was able to confirm the insufficient specificity of the invA-I-PCR method already shown for the tissue samples of experimentally infected animals. In all culturally negative animals there were some tissue structures in which an unspecific PCR product was amplified again. This was only slightly larger than the specific amplicon of 284 bp. However, if the tissue samples of these animals were examined using the invA-II-PCR method, neither a specific amplificate nor an unspecific product was amplified. An example of the PCR results from the tissue samples of a Salmonella-negative pig shows 6 ,

Um sicher zu gehen, dass es sich bei den in 6 (Mit einer Raute gekennzeichnete Amplifikate) markierten Amplifikaten wirklich um unspezifische Produkte handelte, wurde das vermeintlich unspezifische PCR-Produkt aus dem Mandibularlymphknoten gereinigt und im Auftrag bei der Firma Genomics in Wien ansequenziert. Das Resultat der Sequenzierung wurde mit der Gendatenbank des EMBL (European Bioinformatics Institute) verglichen. Als Ergebnis war eine 91 %ige Übereinstimmung mit dem membrangebundenen Transglycosylase-Gen von Escherichia coli mit der Accession-Nummer EC18785 feststellbar. Zur Verifizierung der Ergebnisse der Sequenzierung, die mit nur 91 % keine optimale Übereinstimmung mit dem Transglykosylase-Gen erbrachte, wurde DNA von neun verschiedenen E. coli-Stämmen als Template in einem 50 μl PCR-Ansatz mit den Oligonukleotiden der invA I-PCR-Methode eingesetzt. Bei der Untersuchung der E. coli- Reinkulturen traten die unspezifischen Amplifikate des für Salmonellen spezifischen invA I-Oligonukleotidpaares wieder auf, allerdings nicht bei allen E. coli-Stämmen (7).To make sure that the in 6 (Amplicons marked with a rhombus) marked amplicons really were unspecific products, the supposedly unspecific PCR product was cleaned from the mandibular lymph node and sequenced on behalf of the Genomics company in Vienna. The result of the sequencing was compared with the gene database of the EMBL (European Bioinformatics Institute). The result was a 91% match with the membrane-bound transglycosylase gene from Escherichia coli with the accession number EC18785. To verify the results of the sequencing, which did not match optimally with the transglycosylase gene with only 91%, DNA from nine different E. coli strains was used as a template in a 50 μl PCR approach with the oligonucleotides of the invA I-PCR Method used. When examining the pure E. coli cultures, the non-specific amplificates of the salmonella-specific invA I oligonucleotide pair reappeared, but not in all E. coli strains ( 7 ).

Spezifitätsprüfung der invA II-PCR-MethodeSpecificity check of the invA II-PCR method

Die Spezifitätsprüfung der in dieser Arbeit neu entwickelten invA II PCR-Methode erfolgte anhand von Bakterien-Reinkulturen. Die invA I- PCR nach Rahn et al. (1992) wurde von dieser Arbeitsgruppe an einer Vielzahl von Reinkulturen getestet, die sowohl Salmonella als auch diverse andere Enterobacteriaceae beinhalteten. Aus diesem Grund wurde dieses Oligonukleotidpaar in dieser Arbeit nicht erneut auf seine Spezifität hin überprüft. Lediglich eine Optimierung der PCR-Bedingungen an 17 Reinkulturen war erforderlich, da bei Anwendung der PCR-Bedingungen nach RAHM et al. (1992) bei 9 Salmonella-Spezies das spezifische PCR-Produkt von 284 bp optimal amplifiziert wurde, jedoch bei Y. pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis und E. coli ATCC 11229 auch unspezifische Produkte amplifiziert worden waren. Durch Optimierung der PCR-Bedingungen gelang es, die Amplifikation unspezifischer Produkte bei Y. pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis und E. coli (ATCC 11229) zu verhindern und die Spezifität für Salmonella zu erhalten. Daraufhin wurden die optimierten PCR-Bedingungen von 35 Zyklen zu 30 sec Denaturierung bei 94 °C, 30 sec Annealing bei 64 °C und 30 sec Extension bei 72 °C eingesetzt.The specificity check of the new in this work developed invA II PCR method was based on pure bacterial cultures. The invA I-PCR according to Rahn et al. (1992) was created by this working group tested on a variety of pure cultures, both Salmonella as well as various other Enterobacteriaceae included. For this This pair of oligonucleotides was not repeated in this work on its specificity checked. Only optimization of the PCR conditions on 17 pure cultures was necessary, since using the PCR conditions according to RAHM et al. (1992) at 9 Salmonella species optimally amplified the specific PCR product of 284 bp , but with Y. pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis and E. coli ATCC 11229 also amplified non-specific products were. By optimizing the PCR conditions, the amplification was successful non-specific products in Y. pseudotuberculosis, Enterococcus to prevent faecalis and E. coli (ATCC 11229) and specificity for Salmonella to obtain. The optimized PCR conditions of 35 cycles of 30 sec denaturation at 94 ° C, 30 sec annealing at 64 ° C and 30 sec extension at 72 ° C used.

Die Spezifitätsprüfung der invA II-PCR-Methode wurde anhand von 48 verschiedenen Isolaten (überwiegend Referenzstämme) durchgeführt. In Tabelle 6 sind alle geprüften Stämme aufgeführt. Bei allen 12 getesteten Salmonella-Serovaren konnte das spezifische Amplifikat von 443 bp amplifiziert werden. Unspezifische Produkte traten bei den neun getesteten E. coli-Stämmen nicht auf. Nur bei Y. intermedia und Y. aldovae waren PCR-Produkte erkennbar. Bei Y. intermedia waren es zwei unspezifische Produkte mit einer Größe von ungefähr 500 bp und 100 bp und bei Y. aldovae ein Produkt mit einer Größe von etwa 300 bp. Diese unspezifischen Produkte unterschieden sich im Agarose-Gel deutlich von dem spezifischen Amplifikat von 443 bp. Tabelle 6. Spezifitätsprüfung der invA II-PCR-Methode anhand von Bakterien-Reinkulturen. Ein Amplifikation des spezifischen 443 bp großen Produktes der invA II-PCR ist als + gekennzeichnet, keine Amplifikation als – und die Amplifikation unspezifischer Produkte als (-)

Figure 00210001
The specificity test of the invA II-PCR method was carried out using 48 different isolates (mostly reference strains). Table 6 lists all the strains tested. The specific amplificate of 443 bp could be amplified in all 12 Salmonella serovars tested. Non-specific products were not found in the nine E. coli strains tested. Only in Y. intermedia and Y. aldovae were PCR products recognizable. For Y. intermedia there were two non-specific products with a size of approximately 500 bp and 100 bp and for Y. aldovae a product with a size of approximately 300 bp. These non-specific products differed significantly in the agarose gel from the specific amplificate of 443 bp. Table 6. Specificity testing of the invA II-PCR method using pure bacteria cultures. An amplification of the specific 443 bp product of the invA II-PCR is marked as +, no amplification as - and the amplification of unspecific products as (-)
Figure 00210001

Sensitivität der PCR-Methoden zur Salmonellen-Diagnostik Die Überprüfung und insbesondere der Vergleich der Sensitivität der PCR-Verfahren invA I und invA II erfolgte anhand einer logarithmisch absteigenden Verdünnungsreihe von S. Typhimurium DT 104. Für beide Oligonukleotidpaare konnte die gleiche Nachweisgrenze bei einer Keimzahl von 103 Zellen pro Reaktionsansatz festgestellt werden.Sensitivity of PCR methods for salmonella diagnosis The review and especially the comparison of the sensitivity of the PCR method invA I and invA II was performed using a logarithmic descending dilution series by S. Typhimurium DT 104. For both oligonucleotide pairs were able to achieve the same detection limit a bacterial count of 103 cells per reaction batch.

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Sequenzprotokoll

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sequence Listing
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Figure 00240001
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Claims (6)

Verfahren zum Nachweis von Salmonella, umfassend die aufeinander folgenden Schritte: a) Inkubieren einer Probe in Pepton-Bouillon und anschließend in Rappaport-Vassiliadis-Medium, b) Extrahieren der DNA aus der Probe, c) Zugabe von DNA-Oligonukleotiden als Primer für eine PCR, wobei die DNA-Oligonukleotide jeweils eine Sequenz aufweisen, die spezifisch für Salmonella ist und nicht mit Sequenzen anderer Organismen kreuzreagieren können, d) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), e) Durchführen einer DNA-Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens einmal in dem durch Schritt d) erzeugten DNA-Amplifikat vorkommt, und f) Nachweisen der durch die DNA-Spaltung erhaltenen DNA-Fragmente.A method for the detection of Salmonella comprising the successive steps: a) Incubate a sample in peptone broth and then in Rappaport-Vassiliadis medium, b) Extracting the DNA from the sample, c) addition of DNA oligonucleotides as a primer for a PCR, the DNA oligonucleotides each have a sequence that is specific for Salmonella and not can cross-react with sequences from other organisms, d) Carry out a polymerase chain reaction (PCR), e) performing one DNA cleavage with a restriction enzyme that contains a recognition sequence having at least once in that generated by step d) DNA amplificate occurs, and f) Evidence of DNA cleavage DNA fragments obtained. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Oligonukleotide Sequenzen des 3'-Endes des invA-Gens von Salmonella aufweisen.The method of claim 1, wherein the DNA oligonucleotides Sequences of the 3 'end of the Salmonella invA gene. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA-Oligonukleotide Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und 2 aufweisen.Method according to one of the preceding claims, wherein the DNA oligonucleotides have sequences according to SEQ ID NO: 1 and 2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Restriktionsenzym NdeI ist.Method according to one of the preceding claims, wherein the restriction enzyme is NdeI. DNA-Oligonukleotide mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder 2.DNA oligonucleotides with a sequence according to SEQ ID NO: 1 or 2. Kit zum Durchführen des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend DNA-Oligonukleotide als Primer für eine PCR, wobei die DNA-Oligonukleotide jeweils eine Sequenz aufweisen, die spezifisch für Salmonella ist und nicht mit Sequenzen anderer Organismen kreuzreagieren können, Reagenzien zur Durchführung einer PCR, ein Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens einmal in dem durch die PCR erzeugten DNA-Amplifikat vorkommt.Kit to carry out of the method according to one of the preceding claims, comprising DNA oligonucleotides as primers for a PCR, the DNA oligonucleotides each having a sequence, the specific for Salmonella is and does not cross-react with sequences from other organisms can, Reagents for implementation a PCR, a restriction enzyme that has a recognition sequence, the at least once in the DNA amplificate generated by the PCR occurs.
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