DE10238697A1 - New peptaibol peptide compounds having high alpha-aminoisobutyric acid content, useful for treating neurological diseases such as schizophrenia, obtained by culturing Trichoderma strain - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft neue Peptaibole, die als Sekundärmetabolite von dem Pilz Trichoderma sp. DSM 15117 während der Fermentation synthetisiert werden und sich im Myzel und in der Kulturbrühe anhäufen, ein Herstellungsverfahren für diese Verbindungen und ihre Verwendung als pharmakologischer Wirkstoff, insbesondere als Arzneimittel.The invention relates to new peptaiboles, the as secondary metabolites from the fungus Trichoderma sp. DSM 15117 synthesized during fermentation and accumulate in the mycelium and in the culture broth, a manufacturing process for this Compounds and their use as pharmacologically active substances, especially as a medicine.
Naturstoffe verschiedenster Strukturen werden bekanntermaßen durch Mikroorganismen produziert, wobei Peptidantibiotika eine große Subklasse der bekannten antibakteriellen und antifungalen Wirkstoffe bilden, die aus verschiedenen pro- und eukaryotischen Mikroorganismen isoliert werden können.Natural substances of various structures are known to be produced by microorganisms, peptide antibiotics being a large subclass form the well-known antibacterial and antifungal agents, which is isolated from various pro- and eukaryotic microorganisms can be.
Peptidische Antibiotika und strukturell ähnliche Wirkstoffe, wie z.B. Enzyminhibitoren oder Rezeptorantagonisten, zeichnen sich durch interessante biologische Wirkungen aus (z.B. diverse antimikrobielle Aktivitäten, kanzerostatische, kardiotone, immunmodulatorische Wirkungen, Wachstumsförderung von Nutztieren, Wirkungen als Insektizide usw.; siehe; z.B. Gräfe, U., Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg, 1992; Takeuchi et al., J.Antibiot. 44, 263–272, 1991; Kaneda, M., J. Antibiot. 44, 792– 796, 1991, W. Steglich et al., Römpp, Chemie-Lexikon Naturstoffe, W. Steglich et al., G. Thieme Stuttgart 1997).Peptide antibiotics and structurally similar ones Active substances, e.g. Enzyme inhibitors or receptor antagonists, are characterized by interesting biological effects (e.g. various antimicrobial activities, cancerostatic, cardiotonic, immunomodulatory effects, growth promotion of farm animals, effects as insecticides, etc .; please refer; e.g. Grafe, U., Biochemistry of Antibiotics, Spectrum Heidelberg, 1992; Takeuchi et al., J. Antibiot. 44, 263-272, 1991; Kaneda, M., J. Antibiot. 44, 792-796, 1991, W. Steglich et al., Römpp, Chemical encyclopedia natural products, W. Steglich et al., G. Thieme Stuttgart 1997).
Die Peptaibole bilden eine besondere Untergruppe der Peptidwirkstoffe. Es handelt sich um lineare Peptide mit bis zu 20 Aminosäurebestandteilen, die sich durch einen besonders hohen Gehalt an α-Aminoisobuttersäure (Aib) auszeichnen (Brückner, H. und Przybylski, M., J. Chromatogr. 296, 263–275, 1984; Pandey, R.C. et al., J. Antibiot. 27, 274–282, 1974; Przybylski, M. et al., Biomed. Mass. Spectrom. 11, 569–582, 1984). Für einzelne Vertreter der Peptaibole wurden antimikrobielle Eigenschaften und morphogene Wirkungen auf Pilze berichtet (Argoudelis, A. et al., J. Antibiot. 27, 321–328, 1974; Dornberger, K. et al., J. Antibiot. 48, 977–989, 1995).The peptaiboles form a special one Subset of peptide drugs. They are linear peptides with up to 20 amino acid components, which are characterized by a particularly high content of α-aminoisobutyric acid (Aib) award (Brückner, H. and Przybylski, M., J. Chromatogr. 296, 263-275, 1984; Pandey, R.C. et al., J. Antibiot. 27, 274-282, 1974; Przybylski, M. et al., Biomed. Mass. Spectrom. 11, 569-582, 1984). For individuals Representatives of the peptaibole have antimicrobial properties and morphogenic effects on fungi reported (Argoudelis, A. et al., J. Antibiot. 27, 321-328, 1974; Dornberger, K. et al., J. Antibiot. 48, 977-989, 1995).
Von Interesse ist insbesondere der biologische Wirkmechanismus der Peptaibole, der eine Ionenkanalbildung in biologischen Membranen beinhaltet (siehe z.B. Grigoriev, P. et al., Biochim. Biophys. Acta 1237, 1–5, 1995).Of particular interest is the biological mechanism of action of peptaibole, which is an ion channel formation contained in biological membranes (see e.g. Grigoriev, P. et al., Biochim. Biophys. Acta 1237, 1-5, 1995).
Darüber hinaus wurde für eine Reihe
von Peptidwirkstoffen gezeigt, daß sie mit Rezeptoren von Zellen oder
mit Enzymen zellulärer
Signalketten interagieren und somit antagonistische, agonistische,
inhibitorische und stimulatorische Wirkungen hervorrufen (Miyata,
S. et al., J. Antibiot. 45, 74–82,
1992; Kamiyama et al., J. Antibiot. 45, 424–427, 1992; Weber et al., J.
Antibiot. 44, 164–171,
1991). Ampullosporin wurde kürzlich
als erster und bisher einziger Vertreter der Peptaibole beschrieben,
der eine neuroleptische Wirkung am Versuchstier aufweist (Ritzau
et al., J. Antibiot. 50, 722–728,
1997;
Die für neuroleptische Anwendungen vorgesehenen und eingesetzten Wirkstoffe, wie z.B. Synthetika (Chlorpromazin, Haloperidol), das o.g. genannte Ampullosporin weisen Mängel auf, dadurch gekennzeichnet, daß unbefriedigende Wirkungen vorhanden sind und daß eine zu hohe Toxizität, unerwünschte Nebeneffekte oder eine unvorteilhafte Pharmakokinetik auftreten.The one for neuroleptic applications provided and used active ingredients, e.g. Synthetics (chlorpromazine, Haloperidol), the above Ampullosporin mentioned have defects, characterized in that unsatisfactory Effects are present and that a toxicity too high, undesirable Side effects or unfavorable pharmacokinetics may occur.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, neue Wirkstoffe vom Typ der Peptaibole mit neuroleptischer Wirkung zur Verfügung zu stellen, die potentiell verbesserte Wirkungen und Anwendungseigenschaften besitzen.The object of the invention is therefore new active substances of the peptaibole type with neuroleptic effect to disposal to pose the potentially improved effects and application properties have.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Trichoderma sp. DSM 15117 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie den üblichen anorganischen Salzen fermentiert wird, in dem die neuen neuroleptisch wirksamen Peptaibole, vorzugsweise in der Kulturbrühe angehäuft werden, anschließend aus der Kulturbrühe isoliert, in reiner Form gewonnen und gegebenenfalls in chemische Derivate überführt werden.The object is achieved according to the invention solved, that the Trichoderma sp. DSM 15117 in a nutrient medium with carbon and Nitrogen source as well as the usual inorganic salts are fermented in which the new neuroleptic effective peptaibols, preferably in the culture broth, subsequently from the culture broth isolated, obtained in pure form and optionally converted into chemical derivatives.
Die Erfindung betrifft somit neue
Peptaibole der allgemeinen Formel I,
N-Acetyl-L-Val-L-Gln-X-Y-L-Leu-Aib-L-Pro-L-Leucinol
(I),
worin X für
L-Val-L-Val-L-Val, L-Leu-L-Val-Aib, L-Leu-L-Leu-Aib,
L-Val-Aib-L-Gln-L-Gln
und L-Leu-Aib-L-Gln-L-Gln steht und
Y L-Pro-L-Val, L-Pro-L-Leu
oder L-Leu-L-Leu-L-Pro bedeuten.The invention thus relates to new peptaibols of the general formula I
N-acetyl-L-Val-L-Gln-XYL-Leu-Aib-L-Pro-L-leucinol (I),
where X for L-Val-L-Val-L-Val, L-Leu-L-Val-Aib, L-Leu-L-Leu-Aib,
L-Val-Aib-L-Gln-L-Gln and L-Leu-Aib-L-Gln-L-Gln stands and
Y means L-Pro-L-Val, L-Pro-L-Leu or L-Leu-L-Leu-L-Pro.
Insbesondere betrifft die Erfindung
die folgenden Peptaibole:
Peptaibol 1 der Formel I, worin X
L-Leu-L-Val-Aib und Y L-Pro-L-Leu
Peptaibol 2 der Formel I,
worin X L-Leu-L-Leu-Aib und Y L-Pro-L-Leu
Peptaibol 3 der Formel
I, worin X L-Val-Aib-L-Gln-L-Gln und Y L-Leu-L-Leu-L-Pro
Peptaibol
4 der Formel I, worin X L-Leu-Aib-L-GIn-L-Gln und Y L-Leu-L-Leu-L-Pro
Peptaibol
5 der Formel I, worin X L-Val-L-Val-L-Val und Y L-Pro-L-ValIn particular, the invention relates to the following peptaiboles:
Peptaibol 1 of formula I, wherein X L-Leu-L-Val-Aib and Y L-Pro-L-Leu
Peptaibol 2 of formula I, wherein X L-Leu-L-Leu-Aib and Y L-Pro-L-Leu
Peptaibol 3 of formula I, wherein X L-Val-Aib-L-Gln-L-Gln and Y L-Leu-L-Leu-L-Pro
Peptaibol 4 of formula I, wherein X L-Leu-Aib-L-GIn-L-Gln and Y L-Leu-L-Leu-L-Pro
Peptaibol 5 of formula I, wherein X L-Val-L-Val-L-Val and Y L-Pro-L-Val
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Peptaibole der Formel I, insbesondere der Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Trichoderma sp. DSM 15117 in einem Nährmedium kultiviert, bis sich diese Verbindungen in der Kulturbrühe anhäufen und man sie nachfolgend daraus isoliert.The invention further relates to a process for the preparation of the peptaibols of the formula I, in particular Peptaibole 1, 2, 3, 4 and 5, which is characterized in that he Trichoderma sp. DSM 15117 cultured in a nutrient medium until under these compounds accumulate in the culture broth and subsequently isolated from it.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der Peptaibole der Formel I als pharmakologisch wirksame Stoffe, insbesondere als neuroleptische, antipsychotische und anderweitig neurologisch wirksame Arzneimittel.Another object of the invention relates to the use of the peptaibols of the formula I as pharmacological effective substances, especially as neuroleptic, antipsychotic and other neurologically active drugs.
Ferner betrifft die Erfindung Arzneimittel, die eine oder mehrere Peptaibole der Formel I enthalten, und die unter Verwendung der üblichen Träger- und Hilfsstoffe hergestellt werden.The invention further relates to pharmaceuticals, which contain one or more peptaibols of the formula I, and using the usual Carrier- and auxiliaries are produced.
Definitionendefinitions
- – Unter neuen Peptaibolen der allgemeinen Formel I sind die Verbindungen 1–5 zu verstehen.- Under The compounds are new peptaiboles of the general formula I. 1-5 to understand.
- – Die erfindungsgemäßen Peptaibole (1–5) besitzen gemäß Formel I Molmassen von 1175 Da bis 1458 Da.- The Peptaibole according to the invention (1-5) possess according to formula I Molar masses from 1175 Da to 1458 Da.
- – Als Kulturbrühe wird das Nährmedium, welches das darin gewachsene Pilzmyzel enthält, bezeichnet.- As broth becomes the nutrient medium, which contains the mushroom mycelium grown therein.
Der Mikroorganismenstamm HKI 0276 wurde aus einer Bodenprobe in Westthüringen (Deutschland) gewonnen, und bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig (DSMZ) am 26.7.2002 unter der Hinterlegungsnummer DSM 15117 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.The microorganism strain HKI 0276 was obtained from a soil sample in West Thuringia (Germany), and at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH in Braunschweig (DSMZ) on July 26, 2002 under the deposit number DSM 15117 according to the conditions of the Budapest Treaty.
Die erfindungsgemäßen Peptaibole werden durch den Stamm Trichoderma sp. DSM 15117 produziert.The peptaiboles according to the invention are by the Trichoderma sp. DSM 15117 produces.
In einem Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und den üblichen Mineralsalzen produziert Trichoderma sp. DSM 15117 die erfindungsgemäßen Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5. Anstelle des Stammes Trichoderma sp. DSM 15117 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden. Als Mutanten und Varianten gelten alle jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Verbindungen zu synthetisieren.In a medium with a carbon source, a nitrogen source and the usual Mineral salts are produced by Trichoderma sp. DSM 15117 the peptaiboles according to the invention 1, 2, 3, 4 and 5. Instead of the Trichoderma sp. DSM 15117 can its mutants and variants are also used. As mutants and variants apply to all those microorganisms of the species that are able to synthesize the compounds of the invention.
Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene erzeugt werden.Such mutants can be in a manner known per se by physical means, e.g. irradiation with ultraviolet or x-rays or chemical mutagens are generated.
Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in der Kulturbrühe angehäuften Wirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibiotischen Wirkung auf bekannte Testkeime anhand der dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden.Screening for mutants and variants, the compounds of the invention can be synthesized by determining the biological activity of the in the culture broth accumulated Active ingredients, for example by testing the antibiotic effect for known test germs using the methods known to the person skilled in the art carried out become.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie z.B. Glucose, Lactose, Glycerol, Mannitol oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt.As preferred carbon sources for the Aerobic fermentation are suitable for assimilable carbohydrates and Sugar alcohols, e.g. Glucose, lactose, glycerol, mannitol or their mixtures and natural products containing carbohydrates, such as malt extract.
Als Stickstoffquelle eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.Are suitable as a nitrogen source Amino acids, Peptides and proteins and their breakdown products, such as tryptones or Peptones, also meat extracts, ground seeds, for example of corn, wheat, beans, soybeans or the cotton plant, distillation residues of Alcohol production, fish meal or yeast extracts, but also ammonium salts and nitrates.
Die Bildung der Peptaibole entsprechend der allgemeinen Strukturformel I erfolgt gut in Nährmedien, die 0,2–6 % Malzextrakt, bevorzugt 2–4 % Malzextrakt, 1 % Glucose, 0,01–1 % Hefeextrakt, bevorzugt 0,1–0,6 % Hefeextrakt, enthalten.The formation of the peptaiboles accordingly The general structural formula I takes place well in nutrient media that 0.2-6 % Malt extract, preferably 2-4 % Malt extract, 1% glucose, 0.01-1% yeast extract, preferred 0.1-0.6% Yeast extract.
Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder unter Verwendung von Standkulturen in Glasflaschen. Die Fermentation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen, Erlenmeyer- oder Rundkolben verschiedener Volumina erfolgen. Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen 15–37 °C, besonders bevorzugt zwischen 20–30 °C, durchgeführt. Der pH-Wert liegt zwischen 4 und 7, bevorzugt zwischen 4,5 und 6,5. Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 5–28 Tage, bevorzugt 7–18 Tage, kultiviert. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwischen 100 ml und 250 ml), aber auch im Produktionsmaßstab (Volumina bis mehrere m3) durchgeführt werden.The cultivation is carried out aerobically, for example submerged with shaking or stirring in shake flasks or using stand cultures in glass bottles. The fermentation can take place, for example, in steep breast bottles, Erlenmeyer or round-bottom flasks of different volumes. It is carried out in a temperature range between 15-37 ° C, particularly preferably between 20-30 ° C. The pH is between 4 and 7, preferably between 4.5 and 6.5. The microorganism is cultivated under these conditions for 5-28 days, preferably 7-18 days. The fermentation can be carried out on a laboratory scale (culture volumes between 100 ml and 250 ml), but also on a production scale (volumes up to several m 3 ).
Vorteilhafterweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. zunächst werden eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1:5 bis 1:20, überimpft werden.One cultivates advantageously in several stages, i.e. first one or more precultures are prepared in a liquid nutrient medium, which then into the actual production medium, the main culture, for example in relation to 1: 5 to 1:20, vaccinated become.
Die Vorkultur erhält man, indem man ein versportes Myzel von z.B. Malzagar-Nährböden in eine Nährlösung überführt, beispielsweise durch Einimpfen von Myzelbewachsenen Agarstücken, und diese 7–28 Tage, vorzugsweise 7 Tage, inkubiert.The pre-culture can be obtained by using a spore Mycelium from e.g. Malt agar media in one Transferred nutrient solution, for example by inoculating mycelium-grown agar pieces, and this 7-28 days, preferably 7 days, incubated.
Das Pilzmyzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 7–28 Tage, bevorzugt 7 Tage, bei 23–28 °C auf einem Nährboden, wie z.B. Malz-Agar oder Kartoffel-Glucose-Agar, wachsen läßt.The fungal mycelium, for example can be obtained by keeping the strain for about 7-28 days, preferably 7 days, at 23-28 ° C on one Fertile soil, such as. Malt agar or potato-glucose agar.
Die erfindungsgemäßen Peptaibole sind in wechselnden Anteilen in der Kulturbrühe, vorzugsweise im Myzel, enthalten.The peptaibols according to the invention are in changing Proportions in the culture broth, preferably contained in the mycelium.
Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstufen können die üblichen dem Fachmann vertrauten Methoden der biologischen Aktivitätsbestimmung, z.B. der Agardiffusions-Lochplattentest oder die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, beispielsweise an Kieselgel RP18 mit Acetonitril/Wasser/Triethylamin-Mischungen als Laufmittel verwendet werden. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann durch Iod-Dampf oder durch Färbeagentien, z.B. Vanillin/H2SO4 (konz.), erfolgen.To test the active substance concentration in the culture medium or in the individual isolation stages, the customary methods of biological activity determination familiar to the person skilled in the art, for example the agar diffusion perforated plate test or high-performance liquid chromatography, for example on silica gel RP 18 with acetonitrile / water / triethylamine mixtures, can be used as the mobile phase. Detection in thin-layer chromatographic separation can be carried out by iodine vapor or by coloring agents, for example vanillin / H 2 SO 4 (conc.).
Die Isolierung der Peptaibole aus der Kulturbrühe erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Zur Isolierung der Peptaibole wird am Ende der emersen Fermentation im Labormaßstab wasserunlösliches organisches Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäureethylester, zur Kulturlösung zugesetzt und damit die Kulturbrühe vollständig extrahiert. Zur Isolierung der neuen Peptaibole aus submersen Kulturansätzen wird am Ende der Fermentation Kulturmedium und Myzel getrennt und das Myzel mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol oder Aceton, vorzugsweise Methanol, extrahiert.The peptaibols are isolated from the culture broth by known methods under consideration Certification of the chemical, physical and biological properties of the products. To isolate the peptaibols, water-insoluble organic solvent, such as, for example, ethyl acetate, is added to the culture solution at the end of the emersed fermentation on a laboratory scale and the culture broth is thus completely extracted. To isolate the new peptaibols from submerged culture batches, the culture medium and mycelium are separated at the end of the fermentation and the mycelium is extracted with organic solvents such as methanol or acetone, preferably methanol.
Weitere Mengen an Peptaibolen werden durch Extraktion der vom Myzel abgetrennten Kulturlösung mit wasserunlöslichen organischen Lösemitteln, wie z.B. Essigsäureethylester, gewonnen.Additional amounts of peptaiboles will be by extracting the culture solution separated from the mycelium with water organic solvents, such as. ethyl acetate, won.
Nach Einengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des Methanolextraktes des Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Essigsäureethylester oder Dichlormethan, erfolgt die Isolierung der Peptaibole unter Einsatz üblicher chromatographischer Adsorbentien bzw. Trägermaterialien, wie z.B. Kieselgel oder organophile Dextrangele.After concentrating the extracts and if necessary Re-extraction of the methanol extract of the mycelium with water-insoluble organic solvents, such as. ethyl acetate or dichloromethane, the peptaibols are isolated under Use more common chromatographic adsorbents or carrier materials, such as e.g. silica gel or organophilic dextran gels.
Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatographie an Kieselgel, der Gelpermeations-Chromatographie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol, der Mitteldruckchromatographie an Kieselgel RP18 unter Verwendung von Acetonitril/Wasser-Gemischen sowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Methanol/Wasser- und Acetonitril/Wasser-Gemischen, ferner Umkristallieren aus Acetonitril oder Hexan/Chloroform-Gemischen werden schließlich die reinen Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5 erhalten.By sequential application of column chromatography on silica gel, gel permeation chromatography on organophilic dextran gel using polar organic solvents such as methanol, medium pressure chromatography on silica gel RP 18 using acetonitrile / water mixtures as well as high performance liquid chromatography using methanol / water and acetonitrile / water mixtures, further recrystallization from acetonitrile or hexane / chloroform mixtures, the pure peptaibols 1, 2, 3, 4 and 5 are finally obtained.
Die chemische Identität der Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5 entsprechend der in der allgemeinen Formel I gezeigten chemischen Konstitution wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Massenspektrometrie (FAB-MS, Quadrupol-Electro-spray- CID-MS/MS) bewiesen.The chemical identity of the peptaibole 1, 2, 3, 4 and 5 according to that shown in general formula I. chemical constitution is determined by the results of high-resolution mass spectrometry (FAB-MS, Quadrupole-Electro-spray- CID-MS / MS) proven.
Die antibakteriellen Wirkungen der Peptaibole können durch die dem Fachmann bekannten Methoden, wie beispielsweise die Bestimmung der minimalen Hemmzonenkonzentration (MHK) im Agarplattendiffusionstest (Europäisches Arzneibuch 1997, 3. Ausgabe, Amtliche Österreichische Auflage, Verlag Österreich, S. 113–118) aufgezeigt werden.The antibacterial effects of Peptaibole can by methods known to those skilled in the art, such as, for example Determination of the minimum inhibitory zone concentration (MIC) in the agar plate diffusion test (European Pharmacopoeia 1997, 3rd edition, Official Austrian edition, Verlag Österreich, p. 113-118) be shown.
Die neuen Peptaibole 1–5 sind gegen Bakterien, vorzugsweise gegen grampositive Organismen, wie z.B. Bacillus subtilis ATCC 6633 wirksam.The new peptaiboles 1–5 are against bacteria, preferably against gram-positive organisms, e.g. Bacillus subtilis ATCC 6633 effective.
Die erfindungsgemäßen Peptaibole sind stark neuroleptisch am Versuchstier Maus wirksam. Sie senken langanhaltend die Körpertemperatur ebenso ab, wie das bekannte Neurotherapeutikum Chlorpromazin. Sie sind daher für die therapeutische Anwendung als Neuroleptika und Anxyolytika in der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie z.B. Schizophrenie, sehr gut geeignet.The peptaibols according to the invention are highly neuroleptic effective on experimental mouse. They keep the body temperature down for a long time as well as the well-known neurotherapeutic agent chlorpromazine. she are therefore for therapeutic use as neuroleptics and anxiety drugs in the treatment of neurodegenerative diseases, e.g. Schizophrenia, very suitable.
Die erfindungsgemäßen Peltaibole können als solche in Substanz (Einzelsubstanz) oder in Mischung mit geeigneten, aus dem Stand der Technik bekannten Hilfsstoffen oder Trägermaterialien verabreicht werden.The peltaiboles according to the invention can be used as those in substance (individual substance) or in a mixture with suitable, auxiliaries or carrier materials known from the prior art be administered.
Die so hergestellten erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral appliziert, aber auch eine rektale Anwendung ist möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees.The pharmaceuticals according to the invention thus produced are generally administered orally or parenterally, but also rectal application is possible. Suitable solid or liquid galenical forms of preparation are, for example, granules, powders, Tablets, dragees.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.The invention is illustrated by the following embodiments explained in more detail.
AusführunsgbeispieleAusführunsgbeispiele
1a. Herstellung von Vorkulturen des Stammes Trichoderma sp. DSM 15117:1a. Production of pre-cultures of the Trichoderma sp. DSM 15117:
Zur Gewinnung eines versporten Myzels wird der Stamm Trichoderma sp. 15 Tage bei 25 °C auf einem Nährboden folgender Zusammensetzung (g/l) kultiviert: Malzextrakt 40, Hefeextrakt 4, Agar 15, destilliertes Wasser pH 6,0 (Sterilisation 25 min bei 110 °C).To obtain a spun mycelium the Trichoderma sp. 15 days at 25 ° C on a culture medium of the following composition (g / l) cultivated: malt extract 40, yeast extract 4, agar 15, distilled water pH 6.0 (sterilization at 25 min 110 ° C).
1b. Die Herstellung einer emersen Standkultur bzw. einer Vorkultur des Stammes1b. The making of a stand culture or a pre-culture of the tribe
Trichoderma sp. erfolgt in 1 l Erlenmeyerkolben mit 250 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung (g/l): D-Glucose 10; Malzextrakt 20; Hefeextrakt 2; (NH4)2PO4 0,5. Die Beimpfung erfolgt mit 2 cm2-Aeralen von Oberflächenkulturen des Stammes Trichoderma sp., die auf Agarmedium entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden.Trichoderma sp. takes place in 1 l Erlenmeyer flask with 250 ml nutrient medium of the following composition (g / l): D-glucose 10; Malt extract 20; Yeast extract 2; (NH 4 ) 2 PO 4 0.5. The inoculation is carried out with 2 cm 2 -als of surface cultures from the Trichoderma sp. Strain, which were grown on agar medium in accordance with Example 1a.
1c. Herstellung von Schüttelkulturen des Stammes Trichoderma sp.:1c. Production of shake cultures of the Trichoderma sp .:
Es werden 1 l Erlemneyerkolben mit eingebauten Schikanen mit jeweils 250 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung (g/l) verwendet: Glycerin 5; Glucose 3; Pepton 8; 2-Methylallanin 1 sowie 0,1 % Malzagar. Die Beimpfung erfolgt wie unter 1a und 1b beschrieben. Es kann als Vorkulturmedium auch Kartoffel-Glucose-Agar (Difco) verwendet werden.There are 1 l Erlemney flask with built-in baffles, each with 250 ml nutrient medium of the following composition (g / l) used: glycerin 5; Glucose 3; Peptone 8; 2-Methylallanin 1 and 0.1% malt agar. The inoculation is carried out as in 1a and 1b described. Potato-glucose agar (Difco) can also be used as a pre-culture medium. be used.
2. Gewinnung der Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5 aus der Kulturbrühe:2. Obtaining the Peptaibole 1, 2, 3, 4 and 5 from the culture broth:
Die gesamte Kultur wird im Verhältnis 2:1 (Kulturbrühe/Lösungsmittel) mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wird nach Trocknen über Natriumsulfat bis zum Rückstand im Vakuum eingeengt.The whole culture becomes 2: 1 (Broth / solvent) extracted with ethyl acetate, and the extract is dried over sodium sulfate to the residue concentrated in vacuo.
3. Chromatographische Auftrennung der Peptaibole 1–53. Chromatographic separation of peptaiboles 1-5
Die Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5 werden
aus dem eingeengten Ethylacetatextrakt von 20 l Fermentatiansbrühe durch
die nachfolgenden chromatographischen Aufarbeitungsschritl:e erhalten:
Zunächst wird
der Rückstand
des eingeengten Extraktes auf eine Chromatographiesäule, gefüllt mit
Dextrangelen, wie z.B. Sephadex LH-20, in Methanol gegeben. Mit
dem gleichen Lösungsmittel
werden zunächst ölige Begleitkomponenten
eluiert, danach eluiert man die Hauptmenge an Peptaibolen sowie
nachfolgend niedermolekulare Verunreinigungen. Ausbeute: 1,8 g.
In einer zweiten säulenchromatographischen
Reinigungsstufe erfolgt die Chromatographie an Kieselgel 60 unter
Verwendung von Chloroformn/Methanol/Triethylamin (9:1; 0,1; v/v)
als Eluent. Ausbeute: 1,1 g. Eine weitere Anreicherung der Peptaibole
kann durch nochmalige Säulenchromatographie
an organophilen Dextrangelen, wie Sephadex LH-20, in Methanol erfolgen.
Das auf diese Weise erhaltene Gemisch der Peptaibole 1–5 kann
durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
unter Verwendung von Rcversphasen-Kieselgelen (z.B. RP18)
und eines binären
Gradienten Wasser-Acetonitril (95:5 zu 5:95, 30 min) aufgetrennt
werden. Die reinen Peptaibole können
aus Acetonitril oder Chloroform-Hexan-Mischungen umkristallisiert
werden.Peptaibols 1, 2, 3, 4 and 5 are obtained from the concentrated ethyl acetate extract from 20 l of fermentation broth by the following chromatographic workup steps:
First, the residue of the concentrated extract is placed on a chromatography column filled with dextran gel such as Sephadex LH-20 in methanol. With the same solvent, oily accompanying components are first eluted, then the main amount of peptaibols and subsequently low-molecular impurities are eluted. Yield: 1.8 g. In a second column chromatography purification stage, chromatography on silica gel 60 is carried out using chloroform / methanol / triethylamine (9: 1; 0.1; v / v) as the eluent. Yield: 1.1 g. The peptaibols can be further enriched by repeated column chromatography on organophilic dextran gels, such as Sephadex LH-20, in methanol. The mixture of peptaibols 1-5 obtained in this way can be separated by high-performance liquid chromatography using reverse phase silica gels (for example RP 18 ) and a binary gradient of water-acetonitrile (95: 5 to 5:95, 30 min). The pure peptaibols can be recrystallized from acetonitrile or chloroform-hexane mixtures.
4. Strukturaufklärung:4. Structure elucidation:
Die Struktur der neuen Peptaibole entsprechend allgemeiner Formel I wird durch die massenspektrometrischen Untersuchungen bestätigt.The structure of the new peptaibole according to general formula I is by mass spectrometric Investigations confirmed.
Tabelle 1 zeigt die physikochemischen Eigenschaften. Das Molekulargewicht, die chemische Formel und die Sequenz der Aminosäuren in den neuen Peptaibolen wurde durch hochauflösende Electrospray-Massenspek-trometrie und Tandem-Massenspektrometrie (CID-MS/MS, MS") bestimmt. Die Chiralitätsanalyse wurde durch seine Hydrolyse, Derivatisierung der erhaltenen Aminosäuren mit Marfey's Reagenz und HPLC-Analyse unter Vergleich mit chiralen Aminosäurederivaten durchgeführt.Table 1 shows the physicochemical Characteristics. The molecular weight, the chemical formula and the Sequence of the amino acids in the new peptaiboles was done by high-resolution electrospray mass spectrometry and tandem mass spectrometry (CID-MS / MS, MS "). Chirality analysis was performed by his Hydrolysis, derivatization of the amino acids obtained with Marfey's reagent and HPLC analysis compared with chiral amino acid derivatives.
Tabelle
1: Physikochemische Eigenschaften der Peptaibole 1, 2, 3, 4 und
5 
5. Biologische Wirksamkeit:5. Biological effectiveness:
Die Peptaibole 1, 2, 3, 4 und 5 zeigen in einer Dosis von 1–100 mg/kg Körpergewicht an der Maus eine dosisabhängige Abnahme der Körpertemperatur bis zur Raumtemperatur in der gleichen Größenordnung wie das bekannte Neuroleptikum Chlorpromazin (Thompson, E.B. Drug Bioscreening, Drug Evaluation Techniques in Phamacology, Chapter 3: Antipsychotic activity; VCH New York, Weinheim, Basel, Cambridge, S. 25–22, 1990).The peptaiboles 1, 2, 3, 4 and 5 show in a dose of 1-100 mg / kg body weight dose-dependent on the mouse Decrease in body temperature up to room temperature in the same order of magnitude as the known one Neuroleptic chlorpromazine (Thompson, E.B. Drug Bioscreening, Drug Evaluation Techniques in Phamacology, Chapter 3: Antipsychotic activity; VCH New York, Weinheim, Basel, Cambridge, pp. 25-22, 1990).
Ferner induzieren sie die Pigmentbildung durch den Pilzstamm Phoma destructiva und wirken antibakteriell und fungizid gegen grampositive Bakterien und phytopathogene Pilze.They also induce pigment formation through the fungus strain Phoma destructiva and have an antibacterial effect and fungicidal against gram-positive bacteria and phytopathogenic fungi.
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|---|---|
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-
2002
- 2002-08-23 DE DE2002138697 patent/DE10238697A1/en not_active Withdrawn
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| 8181 | Inventor (new situation) |
Inventor name: BERG, ALBRECHT, DR., 07929 SAALBURG-EBERSDORF, DE Inventor name: DIECKMANN, RALF, DR., 10707 BERLIN, DE Inventor name: ERHARD, MARCEL, DR., 14476 GOLM, DE Inventor name: HäRTL, ALBERT, DR., 07749 JENA, DE Inventor name: KALLOW, WIBKE, DR., 12307 BERLIN, DE Inventor name: KUBICEK, CHRISTIAN, PROF. DR., WIEN, AT Inventor name: NEUHOF, TORSTEN, DR., 14197 BERLIN, DE Inventor name: SCHLEGEL, BRIGITTE, 07743 JENA, DE |
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