DE10236101A1 - Functional tests at test cells, e.g. pharmascreening, catch molecules are immobilized in an array of points to bond with reference particles and test cells for measurement - Google Patents

Abstract

To perform functional tests at test cells, an array is prepared on a carrier plate (10) of separate measurement points (11) where catch molecules (19,21,22) are immobilized to bond with the test cells (23). A mixture is prepared of test cells and reference particles (25), which can bond with the catch molecules and which differ from the test cells. To perform functional tests at test cells, an array is prepared on a carrier plate (10) of separate measurement points (11) where catch molecules (19,21,22) are immobilized to bond with the test cells (23). A mixture is prepared of test cells and reference particles (25), which can bond with the catch molecules and which differ from the test cells. The mixture is applied to the test points, so that the test cells and reference particles can bond with the catch molecules. The ratios are determined at least at some of the test points where interesting test cells have bonded with reference particles. In a further process, at least one measurement point with its catch molecules is divided over a number of measurement surfaces in the array, and is moved after contact with the test cells and reference particles.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie einen Kit zur Durchführung funktioneller Tests an biologischen Zellen, bei dem ein Array von Messpunkten eingesetzt wird, wobei an jedem Messpunkt zumindest ein Fängermolekül oder Bindungspartner für die zu testenden biologischen Zellen immobilisiert ist.The present invention relates to a method and a kit for performing functional tests biological cells where an array of measuring points is used is, at each measuring point at least one capture molecule or binding partner for the testing biological cells is immobilized.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter "funktionellen Test" bspw., aber nicht abschließend oder beschränkend, solche Experimente, Tests oder Messungen verstanden, bei denen bestimmte Eigenschaften oder Merkmale der Zellen oder die Änderung dieser Eigenschaften oder Merkmale in Abhängigkeit von einer Behandlung der Zellen und/oder der Art der Fängermoleküle und/oder der Zugabe von Substanzen erfasst oder bewertet werden.Within the scope of the present invention are under "functional test", for example, but not conclusively or restrictive understood such experiments, tests or measurements in which certain Properties or characteristics of the cells or the change in these properties or characteristics depending treatment of the cells and / or the type of capture molecules and / or the addition of substances can be recorded or evaluated.

Die Behandlung der Zellen ist z.B. eine Bestrahlung mit einer energiereichen Strahlung, wie sie in der Radiotherapie eingesetzt wird. Die Zugabe von Substanzen umfasst z.B. im Rahmen von Pharmascreening die Gabe von pharmazeutischen Präparaten, deren Auswirkung auf die Zellen bspw. im Rahmen einer Dosisfindungsstudie untersucht wird, oder die Zugabe von Antikörpern, die gegen Zelloberflächenrezeptoren gescreent werden. Die Wahl der Art der Fängermoleküle betrifft z.B. Komponenten extrazellulärer Matrixmoleküle zur Simulation der natürlichen Mikroumgebung der Zellen, um in vitro ihre Reaktion auf Bestrahlung, Stimulation durch Liganden und/oder zugegebene Pharmaka unter Bedingungen der natürlichen Mikroumgebung zu testen.The treatment of the cells is e.g. radiation with high-energy radiation, as described in radiotherapy is used. The addition of substances includes e.g. in the context of pharmaceutical screening the administration of pharmaceutical preparations, their effect on the cells, for example, in the context of a dose-finding study is being investigated, or the addition of antibodies against cell surface receptors be screened. The choice of the type of capture molecules affects e.g. components extracellular Matrix molecules for Simulation of natural Microenvironment of the cells to determine their response to radiation in vitro, Stimulation by ligands and / or added drugs under conditions the natural Test microenvironment.

Unter "zu testenden biologischen Zellen" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bspw., aber nicht abschließend oder beschränkend, primäre tierische, insbesondere humane Zellen, pflanzliche oder bakterielle Zellen, Zelllinien, genetisch veränderte Zellen, Zellen aus Biopsiematerial, gesunde unentartete Zellen, insbesondere Tumorzellen, Zellen aus dem peripheren Blut etc. verstanden. Diese Zellen werden im weiteren als Testzellen bezeichnet.Under "biological to be tested In the context of the present invention, cells "are, for example, but not finally or restrictive, primary animal, especially human, plant or bacterial cells Cells, cell lines, genetically modified cells, cells made of biopsy material, healthy degenerate cells, especially tumor cells the peripheral blood, etc. understood. These cells are referred to as Called test cells.

Zu den "Eigenschaften und Merkmalen" der Testzellen zählen bspw., aber nicht abschließend oder beschränkend, ihr Proliferationsvermögen, ihre Viabilität, das Muster ihrer Zelloberflächenmoleküle, ihr Vermögen zum Signalaustausch oder zur Interaktion mit anderen Zellen, ein möglicher pathologischer Zustand, eine genetische Entartung, ihr genetisches Profil, ihr Expressionsprofil, ihr Vermögen, an bestimmte Substanzen zu binden.To the "properties and characteristics" of the test cells count for example, but not conclusively or restrictive, their ability to proliferate, their viability, the pattern of their cell surface molecules, you capital for signal exchange or for interaction with other cells potential pathological condition, a genetic degeneration, its genetic Profile, their expression profile, their assets, to certain substances to tie.

Diese Verfahren werden mit Arrays von Messpunkten durchgeführt, um mit wenigen Zellen parallel unterschiedliche Funktionen von Zellen auslesen zu können. Ein Vorteil derartiger Arrays besteht darin, dass im Gegensatz zu Mikrotiterplatten für alle Messpunkte gleiche Umgebungsbedingungen vorherrschen.These procedures are using arrays carried out by measuring points, to different functions of cells in parallel with just a few cells to be able to read out. An advantage of such arrays is that, in contrast to Microtiter plates for all measuring points have the same ambient conditions.

Trägerplatten mit Arrays, die zur Durchführung solcher Verfahren geeignet sind, sowie Beispiel für solche funktionellen Tests finden sich bspw. in der WO 02/02226 der Anmelderin oder der WO 00/39580.Carrier plates with arrays that to carry out such methods are suitable, as well as examples of such Functional tests can be found, for example, in WO 02/02226 by the applicant or WO 00/39580.

Die Trägerplatten sind i.d.R. Glas- oder Kunststoffplättchen, die eine funktionalisierte, bspw. aldehydaktivierte Oberfläche aufweisen, auf der an voneinander abgegrenzten Messpunkten Fängermoleküle oder Bindungspartner für die Testzellen immobilisiert sind. Zwischen den Messpunkten ist die Oberfläche geblockt, um unspezifische Bindung von Testzellen oder sonstigen Substanzen zu verhindern.The carrier plates are usually Glass- or plastic plates, which have a functionalized, for example aldehyde-activated surface, on the capture molecules or binding partner at different measuring points for the Test cells are immobilized. Between the measuring points is the surface blocked to non-specific binding of test cells or other To prevent substances.

Die Messpunkte haben einen Durchmesser von 200 bis 800 μm und einen Mittenabstand von bspw. 500 μm, so dass sich auf einer Fläche von 1 × 1 cm 100 Messpunkte unterbringen lassen.The measuring points have a diameter from 200 to 800 μm and a center distance of 500 μm, for example, so that an area of 1 × 1 cm 100 measuring points.

Auf den Messpunkten werden bspw. unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert. Auf die Trägerplatte wird dann eine Lösung mit Testzellen gegeben, die dann für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert wird, bevor die nicht an Fängermolekülen immobilisierten Testzellen wieder abgewaschen werden. Die gebundenen Testzellen werden dann optisch ortsaufgelöst erfasst, um zu bestimmen, an welche Fängermoleküle die Testzellen gebunden haben. Die optische Erfassung kann bspw. über Hellfeldmikroskopie oder Fluoreszenzmessungen erfolgen, es sind aber auch andere Messprinzipien einsetzbar, wie sie bspw. in der WO 02/02226 oder der WO 00/39580 beschrieben sind.For example, immobilized different capture molecules. On the carrier plate will then come up with a solution Given test cells which then for is incubated for a certain period of time before those not immobilized on capture molecules Test cells are washed off again. The bound test cells are then optically spatially resolved recorded to determine which capture molecules the test cells bound to to have. The optical detection can be done, for example, using bright field microscopy or Fluorescence measurements are carried out, but there are also other measurement principles can be used, as described, for example, in WO 02/02226 or WO 00/39580 are described.

Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung durchgeführte Messungen mit derartigen Trägerplatten haben nun ergeben, dass die Messsignale zwischen verschiedenen Messpunkten innerhalb einer Trägerplatte und zwischen Messpunkten verschiedener Trägerplatten stark schwanken, obwohl die Fängermoleküle, die Testzellen und der Versuchsansatz identisch waren. Diese Variabilität zwischen den Messpunkten auf einer Trägerplatte und zwischen verschiedenen Trägerplatten führt dazu, dass die Messergebnisse häufig nicht hinreichend zuverlässig miteinander verglichen werden können.From the inventors of the present Registration carried out Measurements with such carrier plates have now shown that the measurement signals between different measurement points within a carrier plate and fluctuate strongly between measuring points of different carrier plates, although the capture molecules that Test cells and the test batch were identical. This variability between the measuring points on a carrier plate and between different carrier plates leads to, that the measurement results are common not sufficiently reliable can be compared with each other.

Diese Problematik ist auch aus der Veröffentlichung Belov et al.: "Immunophenotyping of Leukemias Using a Cluster of Differentiation Antibody Microarray", in Cancer Research (2001) 61, 4483-4489 zu entnehmen.This problem is also from the publication Belov et al .: "Immunophenotyping of Leukemias Using a Cluster of Differentiation Antibody Microarray ", in Cancer Research (2001) 61, 4483-4489.

In dieser Veröffentlichung ist ein Verfahren beschrieben, bei dem mehr als 50 CD-Antigene auf Leukozyten nachgewiesen werden. Dazu wird ein Array von verschiedenen, an unterschiedlichen Messpunkten immobilisierten Antikörpern gegen die jeweiligen CD-Antigene verwendet, auf das eine Suspension von Testzellen gegeben wird, wobei die Testzellen nur an solche Messpunkte binden, an denen Antikörper immobilisiert sind, für die sie die entsprechenden CD-Antigene exprimieren. Die gebundenen Testzel len werden optisch ortsaufgelöst erfasst. Das sich ergebende Muster von mit Testzellen besetzten Messpunkten repräsentiert den Immunphänotyp des Patienten, aus dem die Testzellen stammen.This publication describes a method in which more than 50 CD antigens are detected on leukocytes. For this purpose, an array of different antibodies against the respective CD antigens immobilized at different measuring points is used, onto which a suspension of test cells is placed, the test cells only binding to those measuring points at which antibodies are immobilized for which they have the corresponding CD -Express antigens. The bound test cells become optical recorded in a spatially resolved manner. The resulting pattern of test points populated with test cells represents the patient's immunophenotype from which the test cells originate.

Das Antikörperarray umfasst auf einer Fläche von 0,72 cm × 0,4 cm insgesamt 60 Messpunkte, auf die jeweils 5nl Antiköperlösung gegeben wurde. Der Durchmesser eines Messpunktes beträgt ca. 400 μm. Auf das Array wurden 100 μl einer Zellsuspension mit einer Konzentration von 10⁷ Testzellen/ml gegeben. Die Autoren berichten, dass bei dieser Konzentration pro Messpunkt etwa 600 Testzellen gebunden wurden, während bei 10⁶ Testzellen/ml ca. 100 Testzellen gebunden werden.The antibody array covers a total of 60 measuring points on an area of 0.72 cm × 0.4 cm, to which 5nl antibody solution was added. The diameter of a measuring point is approx. 400 μm. 100 μl of a cell suspension with a concentration of 10 ⁷ test cells / ml were added to the array. The authors report that around 600 test cells were bound at this concentration per measuring point, while around 100 test cells are bound at 10 ⁶ test cells / ml.

Mit anderen Worten, nur ca. 0,1 bis 1 ‰ der in der Suspension befindlichen Testzellen können auch an die Messpunkte binden. Bei einem so geringen Anteil an tatsächlich bindenden Testzellen besteht nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung jedoch das Problem, dass die Messergebnisse aus statistischen Gründen nicht zuverlässig genug sind, insbesondere wenn die Messergebisse für verschiedene Messpunkte nicht nur qualitativ, wie bei der Typisierung des Immunphänotyps in der genannten Veröffentlichung, sondern auch quantitativ verglichen werden sollen, wie bei den eingangs erwähnten funktionellen Tests. Das Problem wird noch gravierender, wenn wenige Zellen zur Verfügung stehen, also nicht 10⁷ Zellen/ml sondern bspw. nur 10⁵ Zellen/ml, wie dies bei vielen Versuchsansätzen der Fall ist.In other words, only approx. 0.1 to 1 ‰ of the test cells in the suspension can also bind to the measuring points. With such a small proportion of actually binding test cells, however, according to the inventors of the present application, there is the problem that the measurement results are not reliable enough for statistical reasons, in particular if the measurement results for different measurement points are not only qualitative, as in the case of the typing of the immunophenotype in of the publication mentioned, but also to be compared quantitatively, as in the functional tests mentioned at the beginning. The problem becomes even more serious when a few cells are available, for example not 10 ⁷ cells / ml but, for example, only 10 ⁵ cells / ml, as is the case with many experimental approaches.

Auffällig an den in dieser Veröffentlichung gezeigten Fluoreszenzaufnahmen von Versuchsergebnissen ist darüber hinaus, dass die Messpunkte in der Größe stark variieren und z.T. sehr ungleichmäßig mit Testzellen besetzt sind. Nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung führt das in dieser Veröf fentlichung beschriebene Verfahren wegen dieser Schwankungen aber zu einer Verfälschung der Messergebnisse, so dass die eingangs erwähnten funktionalen Tests nicht mit hinreichender Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden können.Noticeable at the in this publication shown fluorescence recordings of test results is also that the measurement points are large in size vary and partly very unevenly filled with test cells are. According to the knowledge of the inventors of the present application, this leads in this publication described method due to these fluctuations but to a falsification of the measurement results, so that the functional tests mentioned at the beginning do not be carried out with sufficient accuracy and reproducibility can.

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art bereitzustellen, bei dem die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zwischen den Messergebnissen von Messpunkten in einem Array und in verschiedenen Arrays so groß ist, dass ein zuverlässiger Vergleich der Messergebnisse und die Erstellung einer zuverlässigen Abstufung der Messergebnisse möglich ist.Against this background, the The present invention has for its object a method of the beginning Provide mentioned type, in which the reliability and reproducibility between the measurement results of measurement points in an array and in different arrays is so large that a reliable comparison of the measurement results and the creation of a reliable gradation of the measurement results is possible.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe einerseits gelöst durch ein Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:

• a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können,
• b) Erstellen einer Mischung aus den Testzellen und aus Referenzpartikeln, die das Vermögen haben, an die Fängermoleküle zu binden, und die von den Testzellen unterscheidbar sind,
• c) Kontaktieren der Mischung aus Schritt b) mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen und Referenzpartikel binden können, und
• d) Bestimmen des Verhältnisses von interessierenden gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln für zumindest einige der Messpunkte.

According to the invention, this object is achieved on the one hand by a method for carrying out functional tests on test cells, with the steps:

• a) providing an array of mutually separate measuring points, at each of which capture molecules are immobilized, to which the test cells can bind,
• b) creating a mixture of the test cells and of reference particles which have the ability to bind to the capture molecules and which are distinguishable from the test cells,
• c) contacting the mixture from step b) with the array so that test cells and reference particles can bind to each measuring point, and
• d) determining the ratio of bound test cells of interest to bound reference particles for at least some of the measurement points.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.The basis of the invention In this way, the task is completely solved.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, dass die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Messergebnisse von der variierenden Größe der Messpunkte sowie der mangelnden Homogenität der immobilisierten Fängermoleküle abhängt, und dass es durch die Verwendung der Referenzpartikel möglich wird, die Einflüsse der unterschiedlichen Größen der Flächen der Messpunkte sowie andere Inhomogenitäten bspw. in der lokalen Konzentration der Fängermoleküle aus den Messergebnissen herauszurechnen. Die Erfinder gehen damit gerade nicht den sich aufgrund der Erkenntnisse der Erfinder eigentlich anbietenden Weg, die Variabilität durch aufwendigere Herstellungsverfahren zu minimieren, die zu einheitlicheren Flächen der Messpunkte sowie gleichmäßiger lokaler Konzentration der Fängermoleküle führen, sondern verwenden Referenzpartikel.The inventors of the present application have namely recognized that the reproducibility and reliability of the measurement results on the varying size of the measuring points and the lack of homogeneity depends on the immobilized capture molecules, and that using the reference particles makes it possible the influences of the different sizes of the surfaces the measuring points and other inhomogeneities, for example in the local concentration of the capture molecules from the To calculate measurement results. The inventors are just going with it not actually based on the knowledge of the inventors offering way, the variability to minimize through more elaborate manufacturing processes, the more uniform surfaces the measuring points as well as more uniform local Concentration of the capture molecules lead, but use Reference particles.

Die Zahl der pro Messpunkt gebundenen Testzellen und damit das jeweilige Messsignal hängt bei den bekannten Verfahren nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung also mit anderen Worten nicht nur von den Bindungseigenschaften zwischen den Testzellen und den Fängermolekülen sondern auch von der Dichte der Fängermoleküle pro Messpunkt, von der Größe der Fläche der Messpunkte und von der Homogenität der Konzentration der Fängermoleküle ab.The number of bound per measurement point Test cells and thus the respective measurement signal depend on the known methods according to the knowledge of the inventors of the present application in other words, not just from the binding properties between the test cells and the capture molecules also on the density of the capture molecules per measuring point, on the size of the area of the Measuring points and of homogeneity the concentration of the capture molecules.

Die vorhandene Variabilität in der Größe der Flächen der Messpunkten und die Inhomogenität der aufgebrachten Fängermoleküle ermöglicht es wegen der Referenzpartikel jetzt dennoch, eine Abstufung in der Bindung der Testzellen an die verschiedenen Fängermoleküle mit hinreichender Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu bestimmen.The existing variability in the Size of the areas of the Measuring points and inhomogeneity of the applied capture molecules makes it possible because of the reference particles now, a gradation in the bond of the test cells to the different capture molecules with sufficient accuracy and reliability to determine.

Der Quotient aus dem Messsignal für die Testzellen und dem Messsignal für die Referenzpartikel an einem bestimmten Messpunkt kann als Maß für die Bindung der Testzellen an die Fängermoleküle dieses Messpunktes genommen werden. Das Messsignal für die Referenzpartikel ist nämlich sozusagen ein Maß für die Anzahl der Fängermoleküle in einem Messpunkt.The quotient from the measurement signal for the test cells and the measurement signal for The reference particle at a particular measurement point can serve as a measure of the bond of the test cells to the capture molecules of this Measurement point are taken. The measurement signal for the reference particles is namely a measure of the number, so to speak of the capture molecules in one Measuring point.

Unter "interessierenden gebundenen Testzellen" werden in diesem Zusammenhang einmal Testzellen verstanden, die sich aus der Suspension auf Messpunkten abgelagert haben und dort adhärieren. Das Verhältnis von gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln dient dann dazu, das Adhäsionsverhalten der Testzellen an unterschiedliche Fängermoleküle miteinander vergleichen zu können.Under "interested bound Test cells "are understood in this context as test cells which have deposited from the suspension on measuring points and adhere there. The relationship from bound test cells to bound reference particles then the adhesion behavior of the test cells on different capture molecules to be able to.

Andererseits ist es auch möglich, die Apoptoserate oder die Viabilität von Testzellen zu untersuchen, die nach Adhäsion auf den Fängermolekülen unter Zugabe bestimmter Substanzen oder unter einer Behandlung bspw. durch Bestrahlung inkubiert werden. Nach der Inkubation werden dann die noch vitalen oder die absterbenden bzw. abgestorben Testzellen erfasst und für jeden Messpunkt mittels der Zahl der gebundenen Referenzpartikel normiert, so dass z.B. der Einfluss unterschiedlicher Fängermoleküle auf die Apoptoserate ermittelt werden kann.On the other hand, it is also possible to use the Apoptosis rate or viability of test cells to be examined after adhesion to the capture molecules Adding certain substances or under treatment, for example Irradiation can be incubated. After the incubation, the still vital or the dying or dead test cells recorded and for each measuring point using the number of bound reference particles normalized so that e.g. the influence of different capture molecules on the Apoptosis rate can be determined.

Außer der Adhäsion oder der Apoptoserate können auf diese Weise im Rahmen funktioneller Tests auch andere Eigenschaften der Testzellen oder Veränderungen dieser Eigenschaften untersucht werden. Wichtig ist dabei, dass die Anzahl der "interessierenden" Testzellen auf einem Messpunkt durch die Anzahl der ebenfalls gebundene Referenzzellen sozusagen normiert wird und damit mit der Anzahl der interessierenden Testzellen auf anderen Messpunkten vergleichbar ist. Die interessierenden Testzellen sind bspw. im Rahmen von Adhäsionsuntersuchengen alle gebunde nen Testzellen, im Rahmen anderer funktioneller Tests die Apoptoserate, die Viabilität, das Vermögen, an Antikörper zu binden, Signale auszutauschen etc.Except for the adhesion or the rate of apoptosis can in this way also other properties as part of functional tests of the test cells or changes of these properties are examined. It is important that the number of "interesting" test cells on a measuring point by the number of reference cells also bound, so to speak is standardized and thus with the number of test cells of interest is comparable at other measuring points. The test cells of interest are, for example, within the scope of adhesion studies all bound test cells, as part of other functional tests the rate of apoptosis, the viability, the Fortune, of antibodies bind, exchange signals etc.

Als Referenzpartikel können dabei künstliche Kugeln (beads), bspw. Latexkugeln verwendet werden, die Oberflächenmoleküle tragen, die eine vergleichbare Bindung an die Fängermoleküle ermöglichen wie die Oberflächenmoleküle der Testzellen. Diese Kugeln lassen sich preiswert und einfach herstellen und können für lange Zeit gelagert werden; sie sind aus anderen Anwendungen im Stand der Technik bekannt und haben eine Größe, die der der Testzellen entsprechen kann. Ein weiterer Vorteil der Kugeln besteht darin, dass ihr Bindungsverhalten an die Fängermoleküle nicht durch nachträglich zugegebene Substanzen oder bspw. radioaktive oder UV-Bestrahlung beeinflusst wird, so dass nach dem Mischen und ggf. Immobilisieren von Testzellen und Kugeln der Einfluss dieser Maßnahme auf die Testzellen und bspw. deren Bindung oder Apoptoserate verfolgt werden kann, ohne dass die Bindung der Kugeln dadurch beeinflusst wird, so dass die Referenz erhalten bleibt.You can use it as a reference particle artificial Balls, for example latex balls, are used which carry surface molecules, which enable a similar binding to the capture molecules as the surface molecules of the test cells. These balls are inexpensive and easy to manufacture and can last for a long time Time to be stored; they are in the state from other applications known in the art and have a size that of the test cells can correspond. Another advantage of the balls is that their binding behavior to the capture molecules is not due to the fact that they are subsequently added Influences substances or, for example, radioactive or UV radiation is so that after mixing and possibly immobilizing test cells and balls the influence of this measure on the test cells and For example, their binding or rate of apoptosis can be tracked without that the binding of the balls is influenced so that the Reference is retained.

Andererseits ist es auch möglich, als Referenzpartikel biologische Referenzzellen zu nehmen, die messtechnisch, vorzugsweise optisch von den Testzellen unterscheidbar sind, aber wie die Testzellen an Fängermoleküle binden. Die Referenzzellen können dabei unbehandelte Testzellen sein, die messtechnisch von den zu untersuchenden und vor dem Mischen behandelten Testzellen unterscheidbar sind.On the other hand, it is also possible as To take reference particles biological reference cells, the metrological, are preferably optically distinguishable from the test cells, but how the test cells bind to capture molecules. The reference cells can be untreated test cells that differ from the measurement technology Examining test cells and treated before mixing distinguishable are.

Es ist aber auch vorgesehen, dass sowohl künstliche Kugeln als auch biologische Referenzzellen in den Referenzpartikeln vorhanden sind. Dies ermöglicht es, mehrere Parameter über sozusagen interne Referenzen zu korrigieren.But it is also envisaged that both artificial Balls as well as biological reference cells in the reference particles available. this makes possible it over several parameters to correct internal references, so to speak.

Vorzugsweise werden die Testzellen und die Referenzpartikel im Verhältnis 1:1 miteinander gemischt, so dass sie mit gleicher Wahrscheinlichkeit auf die Fängermoleküle treffen.Preferably the test cells and the reference particles in the ratio Mixed 1: 1 with each other so that they are equally likely hit the catcher molecules.

In einem Ausführungsbeispiel sind die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch messtechnisch, vorzugsweise optisch unterscheidbar, dass die Testzellen mit einem anderen Marker, vorzugsweise einem Fluoreszenzmarker oder einem genetischen Marker markiert sind als die Referenzpartikel.In one embodiment, the test cells are of the reference particles by measurement, preferably optically distinguishable that the test cells with a different marker, preferably a fluorescent marker or a genetic marker than the reference particles.

Hier ist von Vorteil, dass das Array mit zwei verschiedenen Anregungswellen und/oder Emissionsfiltern ausgelesen werden kann, wobei nacheinander oder zeitgleich ortsaufgelöste optische Signale erfasst werden, aus denen das Verhältnis von interessierenden Testzelle zu Referenzpartikel dann berechnet werden kann.The advantage here is that the array read out with two different excitation waves and / or emission filters can be, one after the other or simultaneously spatially resolved optical Signals are captured from which the ratio of those interested Test cell to reference particle can then be calculated.

Es ist auch möglich, die Testzellen mit einem genetischen Marker wie bspw. einem Reportergen wie GFP (green fluorescent protein) zu markieren. Wenn die Referenzpartikel Referenzzellen sind, können auch die Referenzzellen statt der oder unterschiedlich zu den Testzellen genetisch markiert sein.It is also possible to use a test cell genetic markers such as a reporter gene such as GFP (green fluorescent protein). If the reference particle reference cells are, can also the reference cells instead of or different from the test cells be genetically marked.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel sind die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch messtechnisch unterscheidbar, dass die Testzellen mit einem anderen radioaktiven Marker versehen sind als die Referenzpartikel.In another embodiment the test cells of the reference particles are therefore metrological distinguishable that the test cells with another radioactive Markers are provided as the reference particles.

Es ist auch vorgesehen, sowohl radioaktive als auch optische Markierungen zusammen, also Testzellen und Referenzzellen radioaktiv und optisch zu markieren, oder gemischt zu verwenden, also bspw. die Testzellen optisch und die Referenzpartikel radioaktiv zu markieren.It is also intended to be both radioactive as well as optical markings together, i.e. test cells and reference cells radioactive and optical marking, or mixed use, For example, the test cells are optical and the reference particles are radioactive to mark.

Die Referenzzellen sind vorzugsweise genetisch derart von den Testzellen verschieden, dass sie auf Substanzen und/oder Bestrahlungen, deren Wirkung auf die Testzellen untersucht werden soll, nicht oder bekannt anders reagieren.The reference cells are preferred genetically so different from the test cells that they are based on substances and / or irradiations, the effect of which is examined on the test cells should not react or is known to react differently.

Hier ist von Vorteil, dass nach dem Mischen der Test- und Referenzzellen diese Mischung in der angegebenen Weise behandelt werden kann, ohne dass die Bindung an die Fängermoleküle oder sonstigen im Rahmen der funktionellen Tests untersuchte Eigenschaften der Referenzzellen mit beeinträchtigt werden. Mit anderen Worten, während die Bestrahlung bspw. dazu führen kann, dass ein bestimmter Prozentsatz der Testzellen abgetötet wird oder seine Bindungseigenschaften an die Fängermoleküle so verändert, dass er schlechter oder besser an die Fängermoleküle bindet, bleibt die Bindung der Referenzzellen an die Fängermoleküle unverändert und ist damit ein Maß für die Anzahl der Fängermoleküle je Messpunkt.The advantage here is that after the test and reference cells have been mixed, this mixture can be treated in the manner indicated without impairing the binding to the capture molecules or other properties of the reference cells examined in the course of the functional tests. In other words, while radiation can, for example, lead to a certain percentage of the test cells being killed or its binding properties to the catcher molecules being changed such that it binds poorly or better to the catcher molecules, the reference cells remain bound to the catcher molecules unchanged and is therefore a measure of the number of capture molecules per measuring point.

Es ist andererseits auch möglich, eine Mischung aus Testzellen und Referenzzellen auf zwei Arrays aufzuteilen und nur das eine Array nach oder während der Inkubation zu bestrahlen oder mit einer Testsubstanz in Kontakt zu bringen. Das unbehandelte Array dient dann als Referenz für die Wirkung auf Testzellen und auf Referenzzellen.On the other hand, it is also possible to have one Split the mixture of test cells and reference cells into two arrays and only irradiate one array after or during the incubation or in contact with a test substance. The untreated Array then serves as a reference for the effect on test cells and on reference cells.

Dabei ist es auch möglich, die Referenzzellen unbehandelt zu lassen und erst nach der Behandlung der Testzellen mit diesen zu mischen.It is also possible to Leave reference cells untreated and only after treatment of the Mix test cells with these.

Es können auch zwei oder mehr Arten von Referenzpartikel mit den Testzellen gemischt werden, wobei die verschiedenen Arten von Referenzpartikeln voneinander und von den Testzellen unterscheidbar sind, z.B. durch drei verschiedene "Farben". So ist es möglich, als erste Art von Referenzpartikeln sog. "beads" zu verwenden, die durch die Behandlung nicht beeinflusst werden und als Referenz zwischen verschiedenen Arrays dienen, und als zweite Art von Referenzpartikeln Referenzzellen zu verwenden, die dazu dienen, die Variation innerhalb eines Arrays herauszurechnen.There can also be two or more types of reference particles are mixed with the test cells, the different types of reference particles from each other and from the Test cells are distinguishable, e.g. through three different "colors". So it is possible the first type of reference particles to use so-called "beads" which not be affected by treatment and as a reference between different arrays, and as a second type of reference particle To use reference cells that serve the variation within of an array.

Alternativ oder zusätzlich kann auf jedem Array ein Referenz-Messpunkt vorgesehen sein, an den nur Referenzpartikel binden. Dies kann als Referenz zwischen verschiedenen Arrays verwendet werden, wobei der Referenzmesspunkt von den anderen Messpunkten isoliert ist, so dass auf ihn nur Referenzpartikel aufgetragen werden.Alternatively or additionally a reference measurement point on each array be provided, to which only reference particles bind. This can be as Reference between different arrays can be used, where the Reference measuring point is isolated from the other measuring points, so that only reference particles are applied to it.

Erfindungsgemäß wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe andererseits gelöst durch ein Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten:

• a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, wobei ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind,
• b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können,
• c) ortsaufgelöstes Erfassen von die Anzahl der interessierenden Testzellen an den Messflächen repräsentierenden Messdaten,
• d) Errechnen eines Messwertes für zumindest einen Messpunkt aus den Messdaten der ihm zugeordneten Messflächen.

According to the invention, on the other hand, the object on which the invention is based is achieved by a method for carrying out functional tests on test cells, with the steps:

• a) Providing an array of mutually separate measuring points, at each of which different capture molecules are immobilized, to which the test cells can bind, a measuring point with its associated capture molecules being divided up over several measuring surfaces in the array, which are arranged at different locations in the array,
• b) contacting a suspension of test cells with the array so that test cells can bind at each measuring point,
• c) location-resolved detection of measurement data representing the number of test cells of interest on the measurement surfaces,
• d) Calculation of a measurement value for at least one measurement point from the measurement data of the measurement areas assigned to it.

Auch diese Weise wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe vollkommen löst.This is also how the invention completely solves the underlying task.

Die Erfinder der Vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, dass die ungleichmäßige Ablagerung von Testzellen auf den Messpunkten, wie sie aus der Veröffentlichung von Belov et al., a.a.O., ersichtlich ist, nicht ausschließlich auf die Inhomogenität der Messpunkte sonder auch darauf zurückzuführen ist, dass die Testzellen in der Suspension nicht homogen verteilt sind, sondern sich an bestimmten Stellen auf dem Array bevorzugt ablagern. Dies führt aber dazu, dass die lokale Anzahl der Testzellen auf dem Array nicht überall gleich ist. Mit anderen Worten kann sich also bspw. trotz einer starken Bindung zwischen Testzellen und Fängermolekülen für einen bestimmten Messpunkt ein schwächeres Messsignal ergeben als für einen Messpunkt, an dem die Bindung schwächer ist, weil an dem ersten Messpunkt die lokale Konzentration der Testzellen geringer ist als an dem zweiten Messpunkt.The inventors of the present application have namely recognized that the uneven deposit of test cells on the measuring points as they are from the publication by Belov et al., op. cit., is not exclusively based on the inhomogeneity The measuring points are also due to the fact that the test cells are not distributed homogeneously in the suspension, but rather on certain Preferably store locations on the array. However, this leads to the local Number of test cells on the array is not the same everywhere. With others Words can, for example, despite a strong bond between Test cells and capture molecules for one certain measuring point a weaker one Measurement signal result as for a measuring point where the bond is weaker because of the first Measuring point the local concentration of the test cells is less than at the second measurement point.

Durch die Verteilung eines (logischen) Messpunktes auf mehrere Messflächen an verschiedenen Stellen im Array wird nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung die statistische Wahrscheinlichkeit der Anhaftung für verschiedene Messpunkte, also über die zugeordneten Messflächen Bemittelt, jedoch gleich hoch.By distributing a (logical) Measuring point on several measuring surfaces at various points in the array, according to the inventor's knowledge the present application the statistical probability of Attachment for different measuring points, i.e. over the assigned measuring areas Average, but the same height.

Wenn die einzelnen Messflächen dabei so klein werden, dass nicht mehr im statistischen Sinne ausreichend viele Testzellen binden können, um ein verlässliches Messsignal zu erzeugen, so können auch hier die oben ausführlich diskutierten Referenzpartikel und Maßnahmen eingesetzt werden, was zu einem synergistischen Effekt führt.If the individual measuring surfaces are there become so small that it is no longer sufficient in the statistical sense can bind many test cells, to be a reliable one Generate measurement signal, so here also the above in detail discussed reference particles and measures are used which leads to a synergistic effect.

Im Idealfall werden bezogen auf die Zahl der Testzellen in der Suspension so große Flächen für einen Messpunkt realisiert, dass zumindest mehr als 50%, im Idealfall nahezu 100 der Testzellen aus dem Überstand auf den Messpunkten binden können. Hierzu ist erfindungsgemäß ein bestimmtes Verhältnis zwischen der Fläche (F) eines Messpunktes und der Anzahl (N) der Testzellen in der Suspension erforderlich, das von der Haftfläche (H) der jeweiligen Zellen abhängt und wie folgt gewählt ist: F ≥ a × N × H; a = 0.5, vorzugsweise ca. 1.0 Ideally, based on the number of test cells in the suspension, such large areas are realized for a measuring point that at least more than 50%, ideally almost 100, of the test cells from the supernatant can bind to the measuring points. For this purpose, according to the invention, a specific ratio between the area (F) of a measuring point and the number (N) of test cells in the suspension is required, which depends on the adhesive area (H) of the respective cells and is selected as follows: F ≥ a × N × H; a = 0.5, preferably about 1.0

Unter Haftfläche wird hier die Größe der Fläche verstanden, mit der sich eine Zelle auf das Substrat auflegt. Bei Bakterien sind dies typischer Weise H = 1 μm² und bei tierischen Zellen H > 100 μm². Auf einer Messfläche von F = 800 μm² können sich damit ca. 800 Bakterien oder 8 tierische Zellen ablagern, so dass in diesem Fall (F = 800 μm²) in der auf das Array aufgegebenen Suspension höchstens N = 800 Bakterien oder N = 8 tierische Zellen enthalten sein sollten.Adhesive area is understood here to mean the size of the area with which a cell lies on the substrate. This is typically H = 1 μm ² for bacteria and H> 100 μm ² for animal cells. Approx. 800 bacteria or 8 animal cells can be deposited on a measuring area of F = 800 μm ² , so that in this case (F = 800 μm ² ) in the suspension applied to the array at most N = 800 bacteria or N = 8 animal cells should be included.

Um ein höheres Messsignal zu erhalten, wird erfindungsgemäß entweder die Fläche F eines Messpunktes größer gewählt oder mehrere Messflächen werden zu einem logischen Messpunkt mit einer Gesamtfläche F zusammengefasst.To get a higher measurement signal, according to the invention either the area F of a measuring point selected larger or several measuring surfaces are combined into a logical measuring point with a total area F.

Unter diesen Bedingungen können nahezu alle Testzellen aus dem Überstanden binden ohne sich gegenseitig zu beeinträchtigen. Auch diese Wahl des Verhältnisses zwischen Anzahl und die Haftfläche bestimmender Art der Testzellen und Größe der Fläche eines Messpunktes ist für sich genommen neu und erfinderisch und führt zusammen mit einer oder beiden der oben genannten Maßnahmen, nämlich den Referenzpartikeln und/oder den verteilten Messflächen zu einem synergistischen Effekt. Bei der Verwendung von Referenzpartikeln ist das obige Verhältnis auf die Summe der in der Suspension vorhandenen Testzellen und Referenzpartikel wie folgt anzuwenden: F ≥ a × (NT × HT + NR × HR )
wobei NT und HT die Anzahl und die Haftfläche der Testzellen sowie NR und HR die Anzahl und Haftfläche der Referenzpartikel bezeichnen und a ein Faktor von 0.5, vorzugsweise ca. 1.0 ist.Under these conditions, almost all test cells can bind from the overhang without interfering with each other. This choice of the ratio between the number and type of test cells and the size of the surface of a measuring point, which determines the adhesive surface, is in itself new and inventive and, together with one or both of the above-mentioned measures, namely the reference particles and / or the distributed measuring surfaces, leads to one synergistic effect. When using reference particles, the above ratio should be applied to the sum of the test cells and reference particles present in the suspension as follows: F ≥ a × (NT × HT + NR × HR)
where NT and HT denote the number and the adhesive surface of the test cells and NR and HR the number and adhesive surface of the reference particles and a is a factor of 0.5, preferably approximately 1.0.

Für ein gegebenes Array mit bekannten Flächen der Messpunkte muss also nach Erkenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung die Menge von Testzellen und ggf. Referenzpartikeln in der auf das Array zu gebenden Suspension/Mischung so gewählt werden, dass das obige Verhältnis eingehalten wird, um zu einer Situation zu gelangen, bei der nahezu alle Testzellen/Referenzpartikel an einen Messpunkt binden können, so dass eine Kompetition zwischen den Messpunkten um die Zellen besteht. Dadurch sind quantitative Auswertungen möglich, die bei höherer Anzahl von Testzellen verfälscht würden.For a given array with known areas of the measuring points must therefore according to the knowledge of the inventors of the present application, the amount of test cells and possibly reference particles in the towards the array giving suspension / mixture are chosen so that the above relationship is observed in order to arrive at a situation in which almost all test cells / reference particles can bind to a measuring point, so that there is competition between the measurement points for the cells. This enables quantitative evaluations to be carried out with a higher number adulterated by test cells would.

Dieses Verhältnis ist z.B. vorteilhaft, wenn wenige Zellen zur Verfügung stehen, wie bei Tumorbiopsien, oder wenn das "homing" von Stammzellen untersucht werden soll. Nur in den erfindungsgemäß verwendeten niedrigen Anzahlen der Testzellen lässt sich eine Präferenz der Testzellen für bestimmte Fängermoleküle quantitativ ermitteln. Dies gilt auch, wenn bei gemischten Zellpopulationen eine Subpopulation getrennt untersucht werden soll.This relationship is e.g. advantageous, if few cells are available stand, as with tumor biopsies, or when the "homing" of stem cells to be examined. Only in the low numbers used according to the invention of the test cells yourself a preference of test cells for certain catcher molecules quantitative determine. This also applies when mixed cell populations a subpopulation is to be examined separately.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass bei größeren Mengen von Testzellen diese auch auf Substrate binden, für die sie keine ausgewiesene Präferenz haben.The inventors of the present application could show in this context that with larger quantities of test cells also bind them to substrates for which they no proven preference to have.

Allgemein ist es noch bevorzugt, wenn das Array nach dem Kontaktieren mit der Suspension/Mischung, also während der Inkubation mit den Testzellen und ggf. den Referenzpartikeln bewegt wird, bspw. auf einem Rüttler oder einer Wiege oder mittels einer Pumpe bspw. über mikrofluidischen Durchfluß, um die lokalen Konzentrationsunterschiede bei den Testzellen und ggf. Referenzpartikeln zu verringern. Durch das Bewegen werden ferner immer wieder neue Testzellen oder Referenzpartikel zu den Messpunkten geführt, so dass eine größere Anzahl von ihnen die Chance erhält, an Fängermoleküle zu binden. Im Gegensatz zu Proteinarrays, wo das Massenwirkungsgesetz gilt und dieses Rütteln nur begrenzt Vorteile bringen würde, erhöht das Rütteln die Zahl der gebundenen Testzellen und ggf. Referenzpartikel erstaunlicher Weise erheblich, wie die Erfinder der vorliegenden Anmeldung zeigen konnten.In general, it is still preferred if the array after contacting the suspension / mixture, so while incubation with the test cells and possibly the reference particles is moved, for example on a vibrator or a cradle or by means of a pump, for example, via microfluidic flow to the local concentration differences in the test cells and possibly reference particles to reduce. By moving, there are always new ones Test cells or reference particles led to the measuring points, see above that a larger number given them a chance bind to capture molecules. In contrast to protein arrays, where the law of mass action applies and this shaking would bring limited benefits elevated the shaking the number of bound test cells and possibly reference particles more astonishing Significantly, as the inventors of the present application show could.

Vor diesem Hintergrund ist bei einem eingangs genannten Verfahren auch diese Maßnahme für sich genommen neu und erfinderisch, sie wird jedoch bevorzugt zusammen mit einer oder mehreren der oben genannten Maßnahmen angewendet.With this in mind is one the method mentioned at the outset, this measure taken on its own, new and inventive, however, it is preferred together with one or more of the above measures mentioned applied.

Insgesamt ist es möglich, dass das Array entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht ist, wie es in den eingangs erwähnten WO 00/39580 und WO 02/02226 der Fall ist, oder dass es ein logisches Array aus einzelnen Kugeln ist, die mit Fängermolekülen beladen sind und in der üblichen Weise z.B. durch Farbmarkierungen voneinander unterschieden werden können. Ein Messpunkt entspricht dann entweder einer Kugel oder mehreren Kugeln, die jeweils im obigen Sinne eine Messfläche darstellen.Overall, it is possible that the array either on a carrier plate is applied, as described in WO 00/39580 and WO 02/02226 is the case or that there is a logical array of individual balls is loaded with catcher molecules are and in the usual Way e.g. be distinguished from one another by color markings can. A measuring point then corresponds to either a sphere or several Balls, each representing a measuring surface in the above sense.

Wenn Kugeln (beads) als Array verwendet werden, werden sie im einfachsten Fall in die Lösung/Mischung gegeben und unter leichter Agitation bspw. auf einem Rüttler inkubiert.When balls are used as an array in the simplest case, they are added to the solution / mixture and under light agitation, for example, incubated on a vibrator.

Die Testzellen werden in bestimmten Anwendungen vor oder nach dem Kontaktieren mit dem Array einer Behandlung unterzogen werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe: Bestrahlen mit energiereicher Strahlung, bspw. W-Licht oder radioaktive Strahlung, Kontaktieren mit Testsubstanzen wie bspw. pharmazeutischen Wirkstoffen, anderen Zellen, Chemotherapeutika, Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Antikörper, Lektine und andere Biopolymere.The test cells are in specific Applications before or after contacting the array of a treatment be subjected to the selected is from the group: Irradiation with high-energy radiation, e.g. UV light or radioactive radiation, contact with test substances such as active pharmaceutical ingredients, other cells, chemotherapy drugs, Components extracellular Matrix proteins, antibodies, lectins and other biopolymers.

An den Messpunkten sind unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene.At the measuring points are different Immobilized capture molecules, which are preferably selected are from the group: protein such as components of extracellular matrix proteins, Receptors. Ligands, poly-lysine, peptides from laminin sequences, Control peptides, peptidomimetics, antibodies, lectins, antigens, allergens.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit mit einem Array aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen Fängermoleküle immobilisiert sind, an die Testzellen binden können, und mit Referenzpartikeln, die an die Fängermoleküle binden.The invention further relates to a kit with an array of mutually separate measuring points, at which capture molecules are immobilized, to which test cells can bind, and with reference particles which bind the capture molecules.

Die Referenzpartikel sind dabei vorzugsweise die oben näher beschriebenen Referenzpartikel, wobei weiter vorzugsweise an den Messpunkten unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene, Nukleinsäuren, Nukleotide.The reference particles are preferred the above closer described reference particles, further preferably at the Measuring points immobilized different capture molecules are preferably selected are from the group: protein such as components of extracellular matrix proteins, Receptors. Ligands, poly-lysine, peptides from laminin sequences, Control peptides, peptidomimetics, antibodies, lectins, antigens, allergens, nucleic acids, Nucleotides.

Das Array ist dabei entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht oder es ist ein logisches Array aus einzelnen Kugeln, die mit Fängermolekülen beladen sind, wobei weiter vorzugsweise zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind.The array is either on a carrier plate applied or it's a logical array of individual balls, which are loaded with catcher molecules are, with further preferably at least one measuring point with its assigned capture molecules to several measuring surfaces in the array is split at different places in the array are arranged.

Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung sowie aus den beigefügten Figuren.Further advantages and features result itself from the description below and from the accompanying figures.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegeben Kombination sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the above not only mentioned features and to be explained below in the specified combination but also in other combinations or can be used alone, without the scope of the present Leaving invention.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:Embodiments of the invention are shown in the figures and are described in the description below explained in more detail. It demonstrate:

1 ein schematisches Beispiel für ein auf einer Trägerplatte angeordnetes Array aus Messpunkten, wobei die Messpunkte auf verschiedene Messflächen verteilt sind; 1 a schematic example of an array of measuring points arranged on a carrier plate, the measuring points being distributed over different measuring surfaces;

2 eine schematische Seitenansicht der Trägerplatte aus 1; 2 a schematic side view of the support plate 1 ;

3 Aufnahmen von an einen Messpunkt des Arrays aus 1 gebundenen Testzellen und Referenzzellen, wobei A) die Hellfeldaufnahme für Testzellen und Referenzzellen, B) eine Fluoreszenzaufnahme für die Testzellen und die Referenzzellen, C) eine Fluoreszenzaufnahme für die Testzellen und D) eine Fluoreszenzaufnahme für die Referenzzellen ist; 3 Recordings from to a measuring point of the array 1 bound test cells and reference cells, wherein A) is the bright field image for test cells and reference cells, B) a fluorescence image for the test cells and the reference cells, C) a fluorescence image for the test cells and D) a fluorescence image for the reference cells;

4 verschiedene Fluoreszenzaufnahmen, die die Bindung von Testzellen an verschiedene Messpunkte zeigt, die bei der Inkubation nicht bewegt (A, C und E) und bewegt (B, D und F) wurden; 4 different fluorescence images showing the binding of test cells to different measuring points that were not moved (A, C and E) and moved (B, D and F) during the incubation;

5 ein Diagramm, das die Bindung von Testzellen an verschiedene Fängermoleküle in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl in der aufgebrachten Suspension zeigt; und 5 a diagram showing the binding of test cells to different capture molecules depending on the number of cells used in the applied suspension; and

6 ein Diagramm, das die Besiedlung einer Messfläche in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl in der aufgebrachten Suspension mit und ohne Bewegung zeigt. 6 a diagram showing the settlement of a measuring surface depending on the number of cells used in the applied suspension with and without movement.

Beispiel I: Trägerplatte mit einem Array aus MesspunktenExample I: carrier plate with an array of measurement points

In 1 ist mit 10 eine rechteckige Trägerplatte aus Glas oder Kunststoff bezeichnet, auf der hier beispielhaft einige Messflächen 11 in einem Array angeordnet sind, an denen in 1 nicht dargestellte biologische Zellen – im folgenden: Testzellen – oder Referenzpartikel binden können. Zwischen den Messflächen 11 sind Bereiche 12 der Trägerplatte 10 vorgesehen, an die Testzellen und Referenzpartikel nicht binden können.In 1 10 is a rectangular support plate made of glass or plastic, on the example of some measuring surfaces 11 are arranged in an array on which in 1 biological cells, not shown - hereinafter: test cells - or reference particles can bind. Between the measuring surfaces 11 are areas 12 the carrier plate 10 provided to which test cells and reference particles cannot bind.

Die Messflächen haben einen Durchmesser von 500 μm und einen Randabstand von 250 μm, so dass sich ein Mittenabstand von 750 μm ergibt. Ruf diese Weise sind auf einer Trägerplatte 10 mit einer Kantenlänge von 6 mm × 9 mm 96 Messflächen 11 unterzubringen.The measuring surfaces have a diameter of 500 μm and an edge distance of 250 μm, so that there is a center distance of 750 μm. Call this way are on a carrier plate 10 with an edge length of 6 mm × 9 mm 96 measuring surfaces 11 accommodate.

Wie in der prinzipiellen Seitenansicht der 2 zu sehen ist, kann die Trägerplatte als Bodenplatte eines Zellkulturgefäßes ausgebildet sein. Die Trägerplatte 10 trägt auf dem Abschnitt 17 eine funktionalisierte Oberfläche 18, an der in den Messpunkten 11 Fängermoleküle 19, 21 ,22 immobilisiert sind.As in the principle side view of the 2 can be seen, the carrier plate can be designed as a base plate of a cell culture vessel. The carrier plate 10 bears on the section 17 a functionalized surface 18 , at the in the measuring points 11 capture molecules 19 . 21 . 22 are immobilized.

Die Fängermoleküle 19, 21, 22 unterscheiden sich in der Regel von Messfläche 11 zu Messfläche 11, wobei verschiedene Messflächen 11 zu einem logischen Messpunkt zusammengefasst werden können. Die Messflächen 11 eines logischen Messpunktes tragen identische Fängermoleküle 19, 21 oder 22 und sind statistisch über die Trägerplatte 10 verteilt.The catcher molecules 19 . 21 . 22 usually differ from the measuring surface 11 to measuring area 11 , with different measuring surfaces 11 can be combined into a logical measuring point. The measuring surfaces 11 of a logical measuring point carry identical catcher molecules 19 . 21 or 22 and are statistically over the carrier plate 10 distributed.

An die Fängermoleküle 19, 21 und 22 können Testzellen 23 binden, deren Bindungsverhalten an die Fängermoleküle 19, 21, 22 oder deren Reaktion auf eine Co-Stimulierung durch Fängermoleküle 19 und Testsubstanzen bzw. auf eine Behandlung wie bspw. eine Bestrahlung untersucht werden soll.To the capture molecules 19 . 21 and 22 can test cells 23 bind their binding behavior to the capture molecules 19 . 21 . 22 or their response to co-stimulation by capture molecules 19 and test substances or for treatment such as radiation.

In den Bereichen 12 zwischen den Messflächen 11 ist die funktionalisierte Oberfläche 18 durch Moleküle 24 geblockt, so dass die Testzellen 23 nur im Bereich der Messflächen 11 gebunden werden können.In the fields of 12 between the measuring surfaces 11 is the functionalized surface 18 through molecules 24 blocked so the test cells 23 only in the area of the measuring surfaces 11 can be bound.

In 2 ist bei 25 ein Referenzpartikel angedeutet, der an die Fängermoleküle 22 bindet. Als Referenzpartikel 25 kommen Biologische Zellen oder aber Kunststoff-Kugeln in Betracht, die auf ihrer Oberfläche Moleküle tragen, mit denen sie an die Fängermoleküle 19, 21, 22 binden. Die Referenzpartikel 25 sind als interne Referenz vorgesehen, um Schwankungen in der Größe der Messflächen 11 oder der Anzahl der Fängermoleküle in der Messfläche sowohl innerhalb eines Array als auch zwischen verschiedenen Arrays herausrechnen zu können.In 2 a reference particle is indicated at 25, attached to the capture molecules 22 binds. As a reference particle 25 Biological cells or plastic spheres come into consideration which have molecules on their surface with which they attach to the capture molecules 19 . 21 . 22 tie. The reference particles 25 are provided as an internal reference to avoid fluctuations in the size of the measurement areas 11 or to be able to calculate the number of capture molecules in the measurement area both within an array and between different arrays.

Wie eine derartige Trägerplatte 10 mit Messflächen 11 hergestellt werden kann, ist im Beispiel 1 der oben genannten WO 02/02226 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.Like such a carrier plate 10 with measuring surfaces 11 can be produced is in the example 1 of the above-mentioned WO 02/02226, the disclosure of which is hereby expressly incorporated by reference becomes.

Beispiel II: Inkubieren einer Mischung aus Testzellen und Referenzzellen auf einem Array mit Messpunkten, die auf verschiedene Messflächen verteilt sindExample II: Incubate a mixture of test cells and reference cells on an array with measuring points that are distributed over different measuring surfaces

Test- und Referenzzellen werden für diesen Versuch mit verschiedene Membranfarbstoffen markiert.Test and reference cells are made for this Experiment marked with different membrane dyes.

Als Testzellen dienen hu AO SMC bzw. GLZ, die mit dem Vibrant Dil Red Fluorescent Cell Linker Kit (V22885Y MoBiTec) nach den Vorschriften des Herstellers markiert werden.Hu AO SMC or GLZ using the Vibrant Dil Red Fluorescent Cell Linker Kit (V22885Y MoBiTec) must be marked according to the manufacturer's instructions.

Als Referenzzellen dienen PC12, die mit dem Vibrant DiO Green Fluorescent Cell Linker Kit (V22886Y MoBiTec) nach den Vorschriften des Herstellers markiert werden.PC12 serve as reference cells with the Vibrant DiO Green Fluorescent Cell Linker Kit (V22886Y MoBiTec) marked according to the manufacturer's instructions.

Zur Darstellung von Test- und Referenzzellen in einer Aufnahme wurden beide Zellarten mit der Vibrant Cell Labeling Solution DAPI blau gefärbt.To display test and reference cells Both types of cells were recorded with Vibrant Cell Labeling Solution DAPI colored blue.

In den Messflächen wurden als Fängermoleküle verschiedene Matrixproteine immobilisiert.Various capture molecules were found in the measurement areas Immobilized matrix proteins.

Die Test- und Referenzzellen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, die Mischung auf die Trägerplatte mit dem Array gegeben, und die Trägerplatte dann für 4 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert.The test and reference cells were in relation to Mixed 1: 1, put the mixture on the carrier plate with the array, and the carrier plate then for 4 h in the incubator at 37 ° C incubated.

In 3 ist beispielhaft für einen Messpunkt mit Laminin aus der humanen Plazenta als Fängermolekül gezeigt, dass sich sowohl Testzellen (GLZ) als auch Referenzzellen (PC 12) an den Messpunkt binden, die Referenzzellen jedoch in deutlich geringerer Anzahl als die Testzellen. Es ist zu erkennen, dass der Messpunkt gleichmäßig mit Fängermolekülen besetzt ist.In 3 As an example of a measuring point with laminin from the human placenta as a capture molecule, it is shown that both test cells (GLZ) and reference cells (PC 12) bind to the measuring point, but the reference cells in a significantly smaller number than the test cells. It can be seen that the measuring point is evenly populated with capture molecules.

3A zeigt eine Hellfeldaufnahme für beide Zellart, 3B eine Fluoreszenzaufnahme des Messpunktes mit einem Blaufilter für Test- und Referenzzellen nach DAPI-Färbung , 3C eine Fluoreszenzaufnahme mit einem für die Emission der Testzellen durchlässigen Rotfilter, und 3D eine entsprechende Aufnahme mit einem für die Emission der Referenzzellen durchlässigen Grünfilter. 3A shows a bright field image for both cell types, 3B a fluorescence image of the measuring point with a blue filter for test and reference cells after DAPI staining, 3C a fluorescence image with a red filter permeable to the emission of the test cells, and 3D a corresponding image with a green filter permeable to the emission of the reference cells.

In der nachstehenden Tabelle ist beispielhaft für einige Messpunkte jeweils mit Laminin (human placenta) als Fängermolekül für eine Mischsuspension von Test- und Referenzzellen die Gesamtzahl und der Prozentsatz der jeweils gebundenen Zellen angegeben, wobei für PC12 mit GLZ jeweils 100 000 Zellen von jeder Art auf ein Array gegeben wurden und für PC12 mit hu AO SMC jeweils von jedem Typ 35 000 Zellen.In the table below is exemplary of some measuring points each with laminin (human placenta) as a capture molecule for a mixed suspension of test and reference cells the total number and percentage of the cells bound in each case, 100 for PC12 with GLZ 000 cells of each type were placed on an array and used for PC12 hu AO SMC of each type 35,000 cells.

Besiedelung von Laminin Meßflächen durch Testzellen (Gliomzelllinie GLZ) und Referenzzellen (neuronale Zelllinie PC12)

Colonization of laminin measuring areas by test cells (glioma cell line GLZ) and reference cells (neuronal cell line PC12)

Besiedelung von Laminin Meßflächen durch Testzellen (Glatte Muskelzellen huAO SMC) und Referenzzellen (neuronale Zelllinie PC12)

Tabelle: Adhäsion von Test – und Referenzzellen; angegeben ist die Anzahl der pro Meßpunkt gebundenen Zellen sowie der jeweilige relative Anteil an der besiedelten FlächeColonization of laminin measuring surfaces by test cells (smooth muscle cells huAO SMC) and reference cells (neuronal cell line PC12)

Table: Adhesion of test and reference cells; the number of cells bound per measuring point and the respective relative proportion of the populated area are indicated

Obwohl zwischen einzelnen Messpunkten extreme Abweichungen in der Anzahl der gebundenen Zellen besteht, ist der Prozentsatz der gebundenen Testzellen im Rahmen der für biologische Messungen üblichen Schwankungsbreite etwa konstant. Während bspw. am Messpunkt 1 nur 53 und am Messpunkt 4 sogar 569 Zellen insgesamt gebundene haben, waren jeweils 64% bzw. 75% der gebundenen Zellen Testzellen (GLZ). Auch für die Messpunkte 2 und 3 lag das Verhältnis mit 70% bzw. 75% in diesem Bereich.Although there are extreme deviations in the number of bound cells between individual measuring points len exists, the percentage of bound test cells is approximately constant within the range of fluctuation common for biological measurements. For example, at the measuring point 1 only 53 and at the measuring point 4 even 569 cells bound in total, 64% and 75% of the bound cells were test cells (GLZ), respectively. Also for the measuring points 2 and 3 the ratio was 70% and 75% in this range.

Dieses konstante Verhältnis wird zwar dadurch verändert, dass PC 12 im Vergleich mit GLZ schlechter an die Fängermoleküle bindet als im Vergleich mit hu AO SMC, es bleibt jedoch auch hier mit 9% bis 17% hinreichend konstant.This constant ratio will changed by that PC 12 binds poorly to the capture molecules compared to GLZ than in comparison with hu AO SMC, but it remains with 9% sufficiently constant up to 17%.

Mit anderen Worten, das Verhältnis zwischen den beiden jeweiligen Zelltypen ist bei Einhaltung des Verhältnisses F ≥ N × H unabhängig von der Zellzahl pro Messfläche und unabhängig davon, ob die beiden Zellarten um ein Fängermolekül konkurrieren, etwa konstant. Damit ist es möglich, durch Verwendung von Referenzzellen die Variation zwischen Messpunkten herauszurechnen.In other words, the relationship between the two respective cell types is in compliance with the ratio F ≥ N × H regardless of the number of cells per measuring surface and independent of whether the two cell types compete for a catcher molecule, about constant. It is possible by using reference cells the variation between measuring points herauszurechnen.

Der Prozentsatz oder auch das Verhältnis zwischen gebundenen Test- und Referenzzellen ist damit ein verlässlicheres Maß für die Bindung der Testzellen an den einzelnen Messpunkten als die absolute Zahl der gebundenen Testzellen.The percentage or the ratio between bound test and reference cells is therefore a more reliable one Measure of the bond of the test cells at the individual measuring points as the absolute number of bound test cells.

Beispiel III: Inkubation mit und ohne RüttelnExample III: Incubation with and without shaking

Testzellen (PC 12) wurden in einer Konzentration von 0,5 bis 50 × 10⁵ Zellen/ml auf Messflächen der Fläche 280 000 μm² mit verschiedenen Fängermolekülen, nämlich Collagen I, Collagen II und Collagen III, für jeweils 4 h inkubiert, wobei die Trägerplatten während der Inkubation in einem Fall gerüttelt und im anderen Fall in Ruhe stehen gelassen wurden. Zum Rütteln wurde die Trägerplatte in Intervallen von 10 min zur Durchmischung der Zellsuspension über den Arrays manuell bewegt.Test cells (PC 12) were incubated in a concentration of 0.5 to 50 × 10 ⁵ cells / ml on measuring surfaces of the area 280,000 μm ² with different capture molecules, namely collagen I, collagen II and collagen III, for 4 h each, whereby the carrier plates were shaken in one case during the incubation and left to rest in the other case. For shaking, the carrier plate was moved manually at intervals of 10 min to mix the cell suspension over the arrays.

In 4 zeigt die obere Zeile die Bindung an Collagen I, die mittlere die Bindung an Collagen II und die untere die Bindung an Collagen III. Links ist bei A, C, und E jeweils die Inkubation ohne und rechts bei B, D und E die Inkubation mit Rütteln gezeigt.In 4 the upper line shows the binding to collagen I, the middle the binding to collagen II and the lower one the binding to collagen III. Incubation without shaking is shown on the left for A, C and E, and incubation with shaking is shown on the right for B, D and E.

Aus den Aufnahmen ist zu erkennen, dass das Rütteln zu einer deutlich erhöhten und auch deutlich gleichmäßigeren Bindung der Testzellen an die Fängermoleküle führt.From the recordings it can be seen that shaking to a significantly increased and also much more uniform Binding of the test cells to the capture molecules leads.

5 zeigt die Zellzahl pro Messfläche in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl und die Bindung der Testzellen an die drei in der 5 genannten Fängermoleküle. 5 shows the number of cells per measurement area depending on the number of cells used and the binding of the test cells to the three in the 5 mentioned capture molecules.

6 zeigt die Zellzahl pro Messfläche in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl und die Bindung an das Substrat Laminin sowie den Einfluss der Substratbewegung. 6 shows the number of cells per measuring surface depending on the number of cells used and the binding to the substrate laminin and the influence of substrate movement.

Es ist zu erkennen, dass durch das Rütteln dafür gesorgt wird, dass eine Messfläche maximal mit Zellen besiedelt wird. Eine "Sättigung" der Messflächen tritt schon bei einer Konzentration von 20 × 10⁵ Zellen/ml ein, was daran zu erkennen ist, dass ab dieser Konzentration die Zahl der gebundenen Zellen quasi nicht weiter zunimmt.It can be seen that the shaking ensures that a measuring area is populated with cells at most. A "saturation" of the measuring surfaces occurs even at a concentration of 20 × 10 ⁵ cells / ml, which can be seen from the fact that the number of bound cells does not increase any further from this concentration.

Weiter ist in den linken Ästen der Kurven zu erkennen, dass bei niedrigen Konzentrationen, also bei geringerer Anzahl von Zellen pro Messpunkt quasi keine Bindung an Thrombospondin erfolgt, sondern dass nahezu alle Zellen an Laminin oder Kollagen I binden. Dies ist so auch zu erwarten, denn PC12 bindet erheblich schwächer an Thrombospondin als an die anderen Fängermoleküle. Erst durch eine hohe Anzahl von Zellen im Überstand wird die Wirkung der Kompetition abgeschwächt und die Zellen binden auch an Thrombospondin.In the left branches is the Curves can be seen that at low concentrations, i.e. at lower ones Number of cells per measuring point virtually no binding to thrombospondin takes place, but that almost all cells on laminin or collagen I tie. This is to be expected, because PC12 binds considerably weaker on thrombospondin than on the other capture molecules. Only through a large number of cells in the supernatant the effect of the competition is weakened and the cells also bind to thrombospondin.

Beispiel IV: Bestimmung der Sensitivität von Zellen in ihrer natürlichen MikroumgebungExample IV: Determination of sensitivity of cells in their natural microenvironment

Ein Beispiel dafür, wie das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden kann, ist die Untersuchung, wie Tumor- und Normalgewebe in Abhängigkeit von ihrer natürlichen Mikroumgebung auf Bestrahlung oder die Zugabe von toxischen Substanzen reagieren. Es ist bekannt, dass Zellen, deren Strahlensensitivität in einer Zellkultur ohne Zugabe von extrazellulären Matrixkomponenten (ECM) getestet wird, strahlensensitiver sind als Parallelkulturen, die auf ECM kultiviert wurden. Dies bedeutet, dass der Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix für die zellspezifische Reaktivität sowohl von Tumor- als auch von Normalgewebe eine entscheidende Bedeutung zukommt. Ferner lässt sich weiter die Kombinationswirkung von Strahlen- und Chemotherapie in der natürlichen Mikroumgebung optimieren.An example of how the inventive method can be used is the examination of how tumor and normal tissue dependent on from their natural Microenvironment on radiation or the addition of toxic substances react. It is known that cells whose radiation sensitivity is in a Cell culture without adding extracellular matrix components (ECM) is more radiation-sensitive than parallel cultures that were cultivated on ECM. This means that the composition the extracellular matrix for the cell-specific reactivity of both tumor and normal tissue are of crucial importance due. Furthermore lets the combination effect of radiation and chemotherapy continues in the natural Optimize micro environment.

Diese Versuche werden durchgeführt, indem die ECM als Fängermoleküle eingesetzt werden. Die Testzellen werden in Mischsuspension mit Referenzzellen auf ein Array aus verschiedenen Fängermolekülen gegeben und die Anzahl der gebundene Testzellen sowie der gebundenen Referenzzellen bestimmt und daraus die normierte Anzahl der Testzellen pro Messpunkt berechnet. Die Testzellen werden dann mit Staurospondin behandelt und inkubiert. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird die Anzahl der abgestorbenen Testzellen pro Messpunkt bestimmt und aus dieser Anzahl sowie der vor der Inkubation bestimmten normierten Anzahl die Apoptoserate ermittelt.These experiments are carried out by the ECM used as capture molecules become. The test cells are in mixed suspension with reference cells given to an array of different capture molecules and the number the bound test cells and the bound reference cells are determined and from this the standardized number of test cells per measuring point is calculated. The test cells are then treated with staurospondin and incubated. After a certain incubation period, the number of dead test cells determined per measurement point and from this number as well as before the incubation determined apoptosis rate determined specific number.

Versuche mit Staurosporin-induzierter Apoptose bei PC12-Zellen zeigten, dass diese Zellen durch Kollagen IV und Laminin, also ihre natürlichen Substrate, deutlich besser vor den schädigenden Wirkungen des Staurosporin geschützt werden als durch PLL (Poly L Lysin), das wahrscheinlich keine schützende Wirkung besitzt. Die Apoptoserate von Testzellen auf Lamin war nach Staurospondin-Behandlung um einen Faktor 4 erhöht während Testzellen, die auf PLL wuchsen, eine Erhöhung um einen Faktor 15 aufwiesen. Dieser Unterschied war nur durch die Verwendung der Referenzzellen zu bestimmen.Experiments with staurosporin-induced apoptosis in PC12 cells showed that these cells were affected by col IV and laminin, i.e. their natural substrates, were protected significantly better from the damaging effects of staurosporine than by PLL (poly L lysine), which probably has no protective effect. The apoptosis rate of test cells on lamin was increased by a factor of 4 after staurospondin treatment, while test cells that grew on PLL showed a factor of 15 increase. This difference could only be determined by using the reference cells.

Claims (23)

Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten: a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, b) Erstellen einer Mischung aus den Testzellen und aus Referenzpartikeln, die das Vermögen haben, an die Fängermoleküle zu binden, und die von den Testzellen unterscheidbar sind, c) Kontaktieren der Mischung aus Schritt b) mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen und Referenzpartikel binden können, und d) Bestimmen des Verhältnisses von interessierenden gebundenen Testzellen zu gebundenen Referenzpartikeln für zumindest einige der Messpunkte.Procedure for implementation functional tests on test cells, with the steps: a) Provide an array of separate measuring points, at each of which Immobilized capture molecules to which the test cells can bind, b) Create one Mix of the test cells and reference particles that have the ability to bind to the capture molecules and which are distinguishable from the test cells, c) Contact the mixture from step b) with the array so that at each measurement point Can bind test cells and reference particles, and d) Determine of the relationship from bound test cells of interest to bound reference particles for at least some of the measurement points. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt b) Testzellen und Referenzpartikel im Verhältnis 1:1 gemischt werden.A method according to claim 1, characterized in that in the step b) test cells and reference particles are mixed in a ratio of 1: 1. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzpartikel künstliche Kugeln (beads), bspw. Latexkugeln umfassen, die Oberflächenmoleküle tragen, die eine vergleichbare Bindung an die Fängermoleküle ermöglichen wie die Oberflächenmoleküle der Testzellen.A method according to claim 1 or 2, characterized in that the reference particles are artificial Comprise balls, for example latex balls, which carry surface molecules, which enable a similar binding to the capture molecules as the surface molecules of the test cells. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzpartikel biologische Referenzzellen umfassen, die messtechnisch, vorzugsweise optisch von den Testzellen unterscheidbar sind, aber wie die Testzellen an Fängermoleküle binden.Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that that the reference particles comprise biological reference cells that metrologically, preferably optically distinguishable from the test cells are, but how the test cells bind to capture molecules. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzzellen vorzugsweise genetisch derart von den Testzellen verschieden sind, dass sie auf Substanzen und/oder Bestrahlungen, deren Wirkung auf die Testzellen untersucht werden soll, nicht oder bekannt anders reagieren als die Testzellen.A method according to claim 4, characterized in that the Reference cells preferably genetically from the test cells are different in that they are based on substances and / or radiation, whose effect on the test cells is to be examined, not or known to react differently than the test cells. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch optisch unterscheidbar sind, dass die Testzellen mit einem anderen Marker, vorzugsweise einem Fluoreszenzmarker oder einem genetischen Marker markiert sind als die Referenzpartikel.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that that the test cells can be optically distinguished from the reference particles are that the test cells with a different marker, preferably a fluorescent marker or a genetic marker than the reference particles. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen von den Referenzpartikeln dadurch messtechnisch unterscheidbar sind, dass die Testzellen mit einem anderen radioaktiven Marker versehen sind als die Referenzpartikel.Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that that the test cells of the reference particles are measured are distinguishable that the test cells with another radioactive Markers are provided as the reference particles. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that that at least one measuring point with its associated capture molecules several measuring surfaces in the array is split at different places in the array are arranged. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für den zumindest einen Messpunkt jeweils ein Messwert für die Testzellen und die Referenzpartikel aus Messwerten berechnet wird, die für die zugeordneten Messflächen bestimmt werden.A method according to claim 8, characterized in that for the at least one measurement point each a measurement value for the test cells and the reference particles is calculated from measured values, which is determined for the assigned measurement areas become. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Fläche F eines Messpunktes und der Anzahl NT der Testzellen und der Anzahl NR Referenzpartikel in der Mischung ein Verhältnis besteht, das von der Haftfläche HT der Testzellen und der Haftfläche HR der Referenzpartikel abhängt und wie folgt gewählt ist: F ≥ a × (NT × HT + NR × HR), a = 0.5, vorzugsweise ca. 1.0 Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that there is a ratio between the area F of a measuring point and the number NT of the test cells and the number of NR reference particles in the mixture, that of the adhesive area HT of the test cells and the adhesive area HR of the reference particles depends and is selected as follows: F ≥ a × (NT × HT + NR × HR), a = 0.5, preferably about 1.0 Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten: a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, wobei zumindest ein Messpunkt mit seinen zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind, b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können, c) ortsaufgelöstes Erfassen von die Anzahl der interessierenden Testzellen an den Messflächen repräsentierenden Messdaten, d) Errechnen eines Messwertes für zumindest einen Messpunkt aus den Messdaten der ihm zugeordneten Messflächen.Method for carrying out functional tests on test cells, with the steps: a) providing an array of separate measuring points, at each of which different capture molecules are immobilized, to which the test cells can bind, at least one measuring point with its assigned capture molecules on several measuring surfaces in the Array is divided, which to various which points are arranged in the array, b) contacting a suspension of test cells with the array so that test cells can bind to each measuring point, c) spatially resolved detection of measurement data representing the number of test cells of interest on the measurement surfaces, d) calculating a measurement value for at least a measurement point from the measurement data of the measurement areas assigned to it. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen F, der Summe der Messflächen eines Messpunkte und N, der Anzahl der Testzellen in der Suspension ein Verhältnis besteht, das von der Haftfläche H der Testzellen abhängt und wie folgt gewählt ist: F ≥ a × N × H, a = 0.5, vorzugsweise ca. 1.0. A method according to claim 11, characterized in that between F, the sum of the measurement areas of a measurement point and N, the number of test cells in the suspension, there is a ratio which depends on the adhesive area H of the test cells and is selected as follows: F ≥ a × N × H, a = 0.5, preferably about 1.0. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten: a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können., und b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können, wobei zwischen der Fläche F eines Messpunktes und der Anzahl N der Testzellen in der Suspension ein Verhältnis besteht, das von der Haftfläche H der Testzellen abhängt und wie folgt gewählt ist: F ≥ a × N × H, a = 0.5, vorzugsweise ca. 1.0. Method for carrying out functional tests on test cells, comprising the steps of: a) providing an array of separate measuring points, at each of which capture molecules are immobilized, to which the test cells can bind, and b) contacting a suspension of test cells with the array, see above that test cells can bind to each measuring point, whereby there is a ratio between the area F of a measuring point and the number N of test cells in the suspension, which depends on the adhesive area H of the test cells and is selected as follows: F ≥ a × N × H, a = 0.5, preferably about 1.0. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Array nach dem Kontaktieren mit den Testzellen und ggf. den Referenzpartikeln bewegt wird, bspw. auf einem Rüttler oder einer Wiege. Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that that the array after contacting the test cells and possibly the reference particles are moved, for example on a vibrator or a cradle. Verfahren zur Durchführung funktioneller Tests an Testzellen, mit den Schritten: a) Bereitstellen eines Arrays aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen jeweils Fängermoleküle immobilisiert sind, an die die Testzellen binden können, und b) Kontaktieren einer Suspension von Testzellen mit dem Array, so dass an jedem Messpunkt Testzellen binden können, und c) Inkubieren des Arrays mit der Suspension, wobei das Array bewegt wird, vorzugsweise auf einem Rüttler oder auf einer Wiege.Procedure for implementation functional tests on test cells, with the steps: a) Provide an array of separate measuring points, at each of which Immobilized capture molecules are to which the test cells can bind, and b) Contact a suspension of test cells with the array so that at each Measuring point can bind test cells, and c) incubating the array with the suspension, the Array is moved, preferably on a vibrator or on a cradle. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Array entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht ist, oder dass es ein logisches Array aus einzelnen Kugeln ist, die mit Fängermolekülen beladen sind.Method according to one of claims 1 to 15, characterized in that that the array is either mounted on a carrier plate, or that it's a logical array of individual spheres that start with Load catcher molecules are. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen vor oder nach dem Kontaktieren mit dem Array einer Behandlung unterzogen werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe: Bestrahlen mit energiereicher Strahlung, bspw. W-Licht oder radioaktive Strahlung, Kontaktieren mit Testsubstanzen wie bspw. pharmazeutischen Wirkstoffen, anderen Zellen, Chemotherapeutika, Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Antikörper, Lektine oder andere Biopolymere.Method according to one of claims 1 to 16, characterized in that that the test cells before or after contacting the array undergo a treatment selected from the group: irradiation with high-energy radiation, e.g. UV light or radioactive radiation, Contact with test substances such as pharmaceutical agents, other cells, chemotherapy drugs, components of extracellular matrix proteins, Antibody, Lectins or other biopolymers. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass an den Messpunkten unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulä rer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene.Method according to one of claims 1 to 17, characterized in that that different capture molecules are immobilized at the measuring points preferably selected are from the group: protein such as components of extracellular matrix proteins, Receptors. Ligands, poly-lysine, peptides from laminin sequences, Control peptides, peptidomimetics, antibodies, lectins, antigens, allergens. Kit mit einem Array aus voneinander getrennten Messpunkten, an denen Fängermoleküle immobilisiert sind, an die Testzellen binden können, und mit Referenzpartikeln, die an die Fängermoleküle binden.Kit with an array of separate measuring points, on which capture molecules are immobilized, can bind to the test cells, and with reference particles that bind to the capture molecules. Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzpartikel die Referenzpartikel aus einem der Ansprüche 3 bis 7 sind.Kit according to claim 19, characterized in that the reference particles the reference particles from one of claims 3 to 7. Kit nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass an den Messpunkten unterschiedliche Fängermoleküle immobilisiert sind, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe: Protein wie bspw. Komponenten extrazellulärer Matrixproteine, Rezeptoren. Liganden, Poly-Lysin, Peptide aus Lamininsequenzen, Kontrollpeptide, Peptidomimetika, Antikörper, Lektine, Antigene, Allergene.Kit according to claim 19 or 20, characterized in that different capture molecules are immobilized at the measuring points preferably selected are from the group: protein such as components of extracellular matrix proteins, Receptors. Ligands, poly-lysine, peptides from laminin sequences, control peptides, Peptidomimetics, antibodies, Lectins, antigens, allergens. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Array entweder auf einer Trägerplatte aufgebracht ist, oder dass es ein logisches Array aus einzelnen Kugeln ist, die mit Fängermolekülen beladen sind.Kit according to one of the claims 19 to 21, characterized in that the array either on a carrier plate is applied, or that there is a logical array of individual Is balls that are loaded with catcher molecules are. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Messpunkt mit seinen, zugeordneten Fängermolekülen auf mehrere Messflächen in dem Array aufgeteilt ist, die an verschiedenen Stellen im Array angeordnet sind.Kit according to one of the claims 19 to 22, characterized in that at least one measuring point with its assigned capture molecules several measuring surfaces in the array is split at different places in the array are arranged.