DE10234901A1 - New nucleic acids encoding Mrp4, useful in the diagnosis of prostatic, bladder and ovarian tumors, also in screening for specific binding agents, and potential therapeutic agents - Google Patents

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ROSENTHAL, ANDRE, PROF., 14482 POTSDAM, DE
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Abstract

New nucleic sequences (I) that encode Mrp4 and/or an Mrp4 protein or peptide (II), especially containing at least 12 nucleotides from an approximately 2.2 kb sequence (fully defined). Independent claims are also included for the following: (1) use of Mrp4 RNA (Ia) or (II) to screen for binding agents (III); (2) use of Mrp4 inhibitors or binding agents (IV) to prepare a composition for treating the specified tumors; (3) methods for diagnosis or treatment of the specified tumors; (4) pharmaceutical composition containing (IV) and an anticancer agent; (5) protein or peptide (II) that contains at least 4 amino acids (aa) from an approximately 1300 aa sequence reproduced, excluding those deposited as Genbank NM-005845, AY-081219 or XM-036453, and sequence (1) of WO0058471; and (6) acid (I) encoding Mrp4 and/or an Mrp4 protein or peptide (II) for detecting (a) tumor of the prostate, bladder and/or ovary or (b) the risk of developing these tumors. Tissue from the specified organs is tested for overtranscription of (I) or overexpression of (II).

Description

Gebiet der ErfindungField of the Invention

Die Erfindung betrifft neue Verwendungen von Mrp4 oder daraus abgeleiteten Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, sowie die Verwendung von an Mrp4 bindenden Substanzen zur Diagnose und/oder Behandlung von Tumor-Erkrankungen.The invention relates to new uses of Mrp4 or sequences derived therefrom for screening thereon binding substances, and the use of binding to Mrp4 Substances for diagnosis and / or treatment of tumor diseases.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technikbackground of the invention and prior art

Mrp4 gehört zu ATP-Bindungskassetten Superfamilie der Transportproteine, welche die Energie der ATP Hydrolyse für ihre Aktivität nutzen. Gemäß der Literaturstelle M.A. Barrand et al., Gen. Pharmacol. 28:639-645 (1997) ist Mrp4 mit Veränderungen der Akkumulation und Verteilung von Wirkstoffen assoziiert. Im Zusammenhang mit dem antiviralen Wirkstoff PMEA, den Antikrebs-Wirkstoffen 6-Mecaptopurin, 6-Thioguanin sowie Estradiol 17-ß-D-glucuronid ist der Transport dieser Wirkstoffe durch Efflux durch die Zellmembran vermittels Mrp4 bekannt (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92:1934-1940 (2000); Z.S. Chen et al., JBC 276(36):33747-33754 (2001)). Mrp4 wurde in Prostata-Normalgewebe sowie in stabil transifizierten NIH3T3 Zellen sowohl im Zytoplasma als auch in der Membran detektiert (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92:1934-1940 (2000)). Mrp4 wird vorwiegend in Prostata-Normalgeweben und in geringerem Maße in verschiedenen anderen Normalgeweben exprimiert. Weiterhin ist Expression in diversen Tumorzelllinien zu beobachten (P. Borst et al., J Natl Cancer Inst 92:1295-1302 (2000)).Mrp4 is part of ATP binding cassettes Superfamily of transport proteins that support the energy of ATP hydrolysis for your activity use. According to the literature reference M.A. Barrand et al., Gen. Pharmacol. 28: 639-645 (1997) is Mrp4 with changes in Accumulation and distribution of active substances associated. In connection with the antiviral agent PMEA, the anti-cancer agents 6-mecaptopurine, 6-thioguanine and estradiol 17-ß-D-glucuronide is the Efflux transports these agents through the cell membrane Mrp4 known (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92: 1934-1940 (2000); Z.S. Chen et al., JBC 276 (36): 33747-33754 (2001)). Mrp4 was in Prostate normal tissue and in stably transcribed NIH3T3 cells detected both in the cytoplasm and in the membrane (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92: 1934-1940 (2000)). Mrp4 is predominant in normal prostate tissues and to a lesser extent expressed in various other normal tissues. Furthermore is Expression in various tumor cell lines can be observed (P. Borst et al., J Natl Cancer Inst 92: 1295-1302 (2000)).

Resistenz gegen Chemotherapeutika ist ein großes und andauerndes Problem in der Behandlung von Krebserkrankungen. Manche bösartigen Tumore reagieren von Anfang an schlecht auf Chemotherapie und sind insofern anscheinend intrisisch resistent. Andere Tumore reagieren anfänglich gut auf eine Chemotherapie, aber entwickeln im Verlauf der Chemotherapie offenbar eine Resistenz, was entweder auf einen Selektionsprozess unter den malignen Zellen oder eine zelluläre Antwort auf den Wirkstoff zurückzuführen sein dürfte. Dieses weit verbreitete Phänomen wird MDR (Multi-Drug Resistance) genannt.Resistance to chemotherapy drugs is a big one and ongoing problem in the treatment of cancer. Some malicious ones From the start, tumors react poorly to chemotherapy and are in this respect apparently intrisically resistant. Other tumors respond initially good on chemotherapy, but develop over the course of chemotherapy apparently a resistance to either a selection process among the malignant cells or a cellular response to the drug likely. This widespread phenomenon is called MDR (Multi-Drug Resistance).

Technisches Problem der Erfindungtechnical Problem of the invention

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Diagnose und/oder zur Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovarkrebs anzugeben sowie Mittel zu deren Identifizierung. Der Erfindung liegt insbesondere das technische Problem zu Grunde, resistente Tumore zu identifizieren und zu behandeln.The invention is technical Underlying problem, pharmaceutical compositions for diagnosis and / or for the treatment of prostate and / or bladder and / or Specify ovarian cancer and means of identification. The invention lies especially the technical problem underlying resistant tumors to identify and treat.

Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.Basics of the invention and preferred Embodiments.

Die Erfindung lehrt die Verwendung einer für Mrp4 codierenden Nukleinsäure und/oder eines Mrp4 Peptids oder Proteins zur Detektion von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere von Tumoren mit einer erhöhten Resistenz, wobei eine Prostata- oder Blasen- oder Ovar-Gewebeprobe, beispielsweise in vitro, auf Übertranskription von Mrp4 RNA oder auf Überexpression eines Mrp4 Proteins untersucht wird. Eine an für Mrp4 codierende Nukleinsäure oder eine an Mrp4 Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, kann zur Detektion verwendet werden, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ delektiert wird.The invention teaches the use one for Mrp4 coding nucleic acid and / or a Mrp4 peptide or protein for the detection of prostate and / or bubble and / or Ovarian tumors or to detect a risk of prostate disease and / or bladder and / or ovary tumors, in particular tumors with an increased Resistance, with a prostate or bladder or ovary tissue sample, for example in vitro, for over-transcription of Mrp4 RNA or for overexpression of a Mrp4 protein is examined. A nucleic acid coding for Mrp4 or a detector substance binding to Mrp4 protein or peptide, preferably containing a reporter group, can be used for detection, binding said nucleic acid and / or said protein or peptide to the detector substance is detected semi-quantitatively or quantitatively.

Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung einer Mrp4 RNA oder eines Mrp4 Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolutierung, selektiert wird.The invention further teaches Use of a Mrp4 RNA or a Mrp4 protein or peptide for screening for substances that bind to it, especially prospective ones Active substances for inhibiting said RNA or said protein or peptide or prospective detector substances, being a prospective Substance or a mixture of such prospective substances with said RNA or said protein or peptide is contacted, whereby binding events are determined with a binding assay, and where a binding prospective substance, if necessary after deconvolution, is selected.

Die Erfindung lehrt schließlich die Verwendung einer Mrp4 inhibierenden oder daran bindenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere zur Behandlung resistenter Tumore. Die Substanz kann ein Antikörper sein, welcher durch Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Mrp4 Peptid oder Protein, mit hierfür codierender cDNA transfizierte Zellen, mit endogen ein solches Peptid oder Protein exprimierenden Tumorzellen, oder mit rekombinant hergestellten Mrp4 Peptiden oder Proteinen, erhältlich ist, oder ein Phage-Display-Antikörper sein. Die Substanz kann aber auch eine Mimikryverbindung eines Antikörpers gegen ein Mrp4 Peptid oder Protein sein. Die Substanz kann schließlich ein Aptamer, eine antisense RNA, oder ein Ribozym sein. Die Substanz kann zusätzlich, insbesondere im Falle eines bispezifischen Antikörpers oder einer Mimikryverbindung hierzu, eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente tragen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet sein.The invention finally teaches Use of a substance which inhibits or binds to Mrp4 for the manufacture of a pharmaceutical composition for treatment of prostate and / or bladder and / or ovary tumors, in particular for the treatment of resistant tumors. The substance can be an antibody which by immunizing a non-human mammal with a Mrp4 peptide or protein, with cDNA coding for it Cells with endogenously expressing such a peptide or protein Tumor cells, or with recombinantly produced Mrp4 peptides or Proteins, available is, or a phage display antibody. The substance can but also a mimicry compound of an antibody against a Mrp4 peptide or be protein. Finally, the substance can be an aptamer, an antisense RNA, or a ribozyme. The substance can also especially in the case of a bispecific antibody or a mimicry compound a cytotoxic and / or immunostimulating component wear. The pharmaceutical composition can be used for local application be prepared in tissue containing tumor cells.

Die Erfindung läßt sich im Rahmen eines Verfahrens zur Diagnose einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung verwenden, wobei eine Detektorsubstanz in einer Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe, ggf. in vitro nach Gewebeentnahme, appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als, ggf. resistente, Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird, sowie eines Verfahrens zur Behandlung einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung, insbesondere resistenter Tumore, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird, wobei optional gleichzeitig, davor, oder danach ein hiervon verschiedener, üblicher Antikrebs-Wirkstoff in gleicher oder verschiedener Darreichungsform dargereicht wird.The invention can be used in the context of a method for diagnosing a prostate and / or Use bladder and / or ovary tumor disease, an embodiment of a detector substance with a reporter group being applied to the tissue to be examined, possibly in vitro after tissue removal, the tissue to be examined then being subjected to a detection method step which is sensitive to the reporter group, and wherein in the case of the detection of a defined minimum value of the reporter group in the tissue, the tissue is qualified as possibly containing tumor cells, and a method for the treatment of a prostate and / or bladder and / or ovary tumor disease, in particular resistant tumors, wherein one The pharmaceutical composition according to the invention is administered to a patient in a physiologically effective dose, optionally at the same time, before or after, a different, conventional anti-cancer active ingredient is administered in the same or different administration form.

Die Erfindung betrifft schließlich eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend zumindest zwei Komponenten A und B, wobei Komponente A eine Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 8 ist, wobei die Komponente B ein (üblicher) Antikrebs-Wirkstoff ist, wobei die Komponenten A und B alternativ hergerichtet sein können i) als räumlich separate Komponenten eines Mehrkomponentenpräparates, bestimmt zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Darreichung und galenisch hergerichtet als gleiche oder verschiedene Darreichungsformen, oder ii) als Kombinationspräparat in Form einer räumlich verbundenen und einheitlichen Darreichungsform.Finally, the invention relates to a pharmaceutical composition containing at least two components A and B, wherein component A is a substance according to any one of claims 4 to 8, wherein component B is an (ordinary) anti-cancer drug is, components A and B being prepared alternatively can i) as spatial separate components of a multi-component preparation, intended for simultaneous use or successive administration and galenically prepared as the same or different dosage forms, or ii) as a combination preparation in Form a spatial connected and uniform dosage form.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Mrp4 überexprimiert ist in Prostata- und Blasen- und/oder Ovartumoren, i.e. in besagten Tumorgeweben ist die Expression höher, verglichen mit normalen Zellen gleichen Gewebes, und der daraus herleitbaren technische Lehre, daß Mrp4 als Zielmolekül bei der Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen, insbesondere im Falle intrinsischer Resistenzen oder erworbenen oder erwerbbaren Resistenzen, eingesetzt werden kann. Mrp4 kann also als Marker zur Identifizierung von Tumorzellen, insbesondere von resistenten Tumorzellen, in den besagten Tumorgeweben dienen. Auf der anderen Seite bietet die Inhibierung von Mrp4 die Möglichkeit, insbesondere auch in Verbindung mit üblichen Wirkstoffen der Chemotherapie, Resistenzen zu überwinden oder erst gar nicht auftreten zu lassen. Insofern kann die Erfindung auch zur Prävention einer Entwicklung einer Resistenz genutzt werden. Denn durch Verhinderung des Effluxes verabreichter Chemotherapeutika aufgrund der Inhibierung des Mrp4 ist die anhaltende Wirkung dieser Chemotherapeutika in allen Zielzellen sichergestellt.The invention is based on the knowledge that that Mrp4 overexpresses is in prostate and bladder and / or ovary tumors, i.e. in said Tumor tissue expression is higher compared to normal cells same fabric, and the technical teaching that can be derived from it, that Mrp4 as a target in the diagnosis and therapy of these diseases, in particular in the case of intrinsic resistance or acquired or acquired Resistance can be used. So Mrp4 can be used as a marker for identification of tumor cells, especially resistant tumor cells, in the serve said tumor tissues. On the other hand, the inhibition offers from Mrp4 the possibility in particular also in connection with the usual agents of chemotherapy, Overcome resistance or not to appear at all. In this respect, the invention also for prevention development of resistance can be used. Because by preventing the Effluxes given chemotherapy drugs due to inhibition of the Mrp4 is the persistent effect of these chemotherapy drugs in ensured all target cells.

Im Rahmen der Erfindung kann es sich empfehlen, im Vorfeld einer Behandlung mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Probe aus einem Gewebe, welches als Tumorgewebe mit anderen Methoden identifiziert ist, zu entnehmen und die Gewebeprobe auf Expression bzw. Überexpression von Mrp4 zu untersuchen. In diesem Zusammenhang ist von besonderer Bedeutung, daß Mrp4 Substratspezifität aufweist, beispielsweise zu zyklischen Nukleotiden, Purinanalogen und nukleosidbasierten antivirale Wirkstoffen; der Erhalt des Expressionsmusters zu Mrp4 kann also die Auswahl potentiell geeigneter Wirkstoffe bzw. den Ausschluss potentiell ungeeigneter Wirkstoffe bzw. Chemotherapeutika erleichtern. Alternativ kann mit einer erfindungsgemäßen Detektorsubstanz zur Diagnose in vivo auf Mrp4 Phänotyp getestet werden. Wird eine Überexpression von Mrp4 gegenüber Normalgewebe gleichen Typs festgestellt, so ist die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung indiziert.In the context of the invention it can recommend in advance of treatment with a pharmaceutical according to the invention Composition a sample from a tissue, which is called tumor tissue identified with other methods, and take the tissue sample for expression or overexpression to investigate by Mrp4. In this context is special Meaning that Mrp4 substrate specificity has, for example to cyclic nucleotides, purine analogs and nucleoside-based antiviral agents; the maintenance of the expression pattern for Mrp4, the selection of potentially suitable active ingredients or the exclusion of potentially unsuitable active substances or chemotherapeutic agents facilitate. Alternatively, with a detector substance according to the invention for diagnosis in vivo on Mrp4 phenotype getting tested. Becomes an overexpression from Mrp4 opposite Normal tissue of the same type is found, so is the use of the pharmaceutical according to the invention Composition indexed.

Von eigenständiger Bedeutung im Rahmen der Erfindung ist, daß die Erfindung besonders vorteilhaft im Falle androgensensitiver Tumore bzw. Tumorzellen einsetzbar ist.Of independent importance in the context of Invention is that Invention particularly advantageous in the case of androgen sensitive tumors or tumor cells can be used.

Im Falle bispezifischer an Mrp4 bindender Substanzen ist es bevorzugt, wenn die an Mrp4 bindende Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt. Dies führt dann letztendlich dazu, dass praktisch ausschließlich Tumorzellen getötet werden, sei es durch die Zytotoxizität, sei es durch Angriff durch das stimulierte Immunsystem, während Normalzellen in dem Gewebe praktisch vollständig erhalten bleiben. Im Falle des Einsatzes einer zytotoxischen Komponente wird es sich besonders empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist, beispielsweise zur Injektion.In the case of bispecific substances that bind to Mrp4 it is preferred if the substance binding to Mrp4 additionally has a cytotoxic and / or immunostimulating component. This then leads ultimately that practically only tumor cells are killed, be it through cytotoxicity, be it through attack by the stimulated immune system during normal cells in the tissue practically completely remain. In case of using a cytotoxic component It is particularly recommended if the pharmaceutical composition is prepared for local application in tissue containing tumor cells, for example for injection.

Die Erfindung betrifft des weiteren ein Mrp4 Protein oder Peptid enthaltend eine Teilsequenz von zumindest 4 Aminosäuren aus Seq.-ID 10, insbesondere aus Seq.-ID 11, oder enthaltend Seq.-ID 10, insbesondere Seq.-ID 11, oder bestehend aus einer solchen Sequenz, nicht jedoch ein Protein oder Peptid gemäß oder codiert durch Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 und XM_036453. Die Erfindung betrifft schließlich eine für ein solches Protein oder Peptid codierende Nukleinsäure, insbesondere eine Sequenz gemäß Seq.-ID 9 oder eine Teilsequenz hieraus. Ein erfindungsgemäßes Protein bzw. Peptid bzw. eine hierfür codierende Nukleinsäure läßt sich in allen vorstehend und folgend beschriebenen Zusammenhängen einsetzen.The invention further relates to a Mrp4 protein or peptide containing a partial sequence of at least 4 amino acids from SEQ ID 10, in particular SEQ ID 11, or containing SEQ ID 10, in particular SEQ ID 11, or consisting of such a sequence, but not a protein or peptide according to or encoded by Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 and XM_036453. The invention relates finally one for such a protein or peptide encoding nucleic acid, especially one Sequence according to SEQ ID 9 or a partial sequence from it. A protein according to the invention or peptide or one therefor coding nucleic acid can use in all contexts described above and below.

Definitionen.Definitions.

Für Mrp4 sind die folgenden Sequenzen bekannt: Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 und XM_036453.For The following sequences are known to Mrp4: Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 and XM_036453.

Im Rahmen dieser Beschreibung wird die Bezeichnung Mrp4 für alle humanen Isoformen, bekannt oder neu, auf Nukleinsäuren- oder Aminosäurenbasis, verwendet. Mit diesen Begriffen mit umfaßt sind auch die im Rahmen dieser Beschreibung offenbarten kurzen Sequenzen, welche aus den Isoformen stammen, beispielsweise Immunisierungssequenzen. Weiterhin mit umfaßt sind auch Homologe, wobei die Homologie zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%, beträgt. Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder allelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der explizit offenbarten Sequenzen, beispielsweise ein Exon oder mehrere Exons, oder komplementärer Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 30 bis 50 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an einProtein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfaßt, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i.e. eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen umfaßt. Schließlich sind RNA sowie damit korrelierende DNA und umgekehrt umfaßt, ebenso wie genomische DNA als auch korrelierte cDNA und umgekehrt und RNAi.Within the scope of this description, the designation Mrp4 for all human isoforms, known or new, on nucleic acid or amino acid ren basis, used. These terms also include the short sequences disclosed in the context of this description, which originate from the isoforms, for example immunization sequences. Also included are homologs, the homology being at least 80%, preferably more than 90%, most preferably more than 95%. In the case of nucleic acid sequences, complementary or allelic variants are also included. Furthermore, sequences are included which only represent partial sequences of the explicitly disclosed sequences, for example one or more exons, or complementary sequences thereto, with the proviso that, in the case of nucleic acids, these partial sequences have a length sufficient for hybridization with a nucleic acid according to the invention, at least 30 up to 50 bases, and in the case of the proteins or peptides bind to a protein or peptide-specific target molecule with at least the same affinity. Furthermore, all nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are included, namely those which are under stringent conditions (5 ° C. to 25 ° C. below the melting temperature; see additionally JM Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and EM Southern, J Mol Biol, 98: 503ff (1975)) hybridize. It goes without saying that the invention also includes expression cassettes, ie one or more of the nucleic acid sequences according to the invention with at least one control or regulatory sequence. Such an expression cassette can also comprise a sequence for a known protein, a fusion protein being formed in the course of the translation from a known protein and a protein or peptide according to the invention. Antisense sequences to the above nucleic acid sequences are also included. Finally, RNA and correlating DNA and vice versa are included, as are genomic DNA and correlated cDNA and vice versa and RNAi.

Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Mrp4 Nukleinsäuren oder Protein bzw. Peptide neben den Volllängen der angesprochenen Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen hieraus, und zwar mit einer Mindestlänge von 12 bis 30 Nukleotiden, beispielsweise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nukleinsäuren und einer Mindestlänge von 4 bis 10 Aminosäuren, beispielsweise 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Peptide oder Proteine.In connection with uses according to the invention include the terms of Mrp4 nucleic acids or protein or peptides next to the full lengths the sequences mentioned (see also the previous paragraph) Partial sequences from this, with a minimum length of 12 to 30 nucleotides, for example 30 to 90 nucleotides, in the case of nucleic acids and a minimum length from 4 to 10 amino acids, for example 10 to 30 amino acids, in the case of peptides or proteins.

Der Begriff der Behandlung umfaßt auch die Prophylaxe.The concept of treatment also includes prophylaxis.

Als Inhibitor ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung von Mrp4 inhibiert oder gebildetes Mrp4 in der Aktivität reduziert, bezogen auf die Mrp4 Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors. Insofern kann ein Inhibitor einerseits eine Substanz sein, welche in der Entstehungskaskade von Mrp4 inhibierend eingreift. Auf der anderen Seite kann ein Inhibitor eine Substanz sein, welche mit gebildetem Mrp4 eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen zumindest reduziert sind.A compound is an inhibitor or substance that either inhibits the formation of Mrp4 or formed Mrp4 reduced in activity based on that Mrp4 activity in the absence of the inhibitor. In this respect, on the one hand, an inhibitor be a substance that inhibits the formation cascade of Mrp4 intervenes. On the other hand, an inhibitor can be a substance be, which forms a bond with formed Mrp4, namely such that further physiological interactions with endogenous Substances are at least reduced.

Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich eines Antikörpers, nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden, wie der zu Grunde liegende Antikörper.Mimicry molecules are compounds that the emulate a variable region, in particular the binding region of an antibody and bind in the same place as a target molecule lying antibodies.

Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, antiidiotypische Antikörper sowie Phage-Display-Antikörper, aber auch chimäre Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden. Weiterhin umfaßt der Begriff der Antikörper bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper kombinieren eine definierte Immunzellaktivität mit einer spezifischen Tumorzellerkennung, wodurch Tumorzellen getötet werden. Ein bispezifischer Antikörper bindet einerseits an ein Auslösemolekül der Immun-Effektorzelle (z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an Antigene der Tumorzielzelle.The term antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal Antibody, non-human, human and humanized antibodies, anti-idiotypic antibodies as well Phage display antibodies, however also chimeric antibody as well as specific fragments of the light and / or heavy chain of the variable range of the underlying antibodies of the above type Production or production of such antibodies with given immunogens is well known to the average specialist and need not be explained in more detail become. Also includes the concept of antibodies bispecific antibodies. Bispecific antibodies combine a defined immune cell activity with a specific tumor cell recognition, thereby killing tumor cells become. A bispecific antibody binds to a trigger molecule of the immune effector cell (e.g. CD3, CD16, CD64) and on the other hand to antigens of the tumor target cell.

Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen, und zwar sowohl zur systemischen als auch zur lokalen Verabreichung. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium infrage. Geeigente feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i.v., i.p., i.m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Mrp4 Inhibitor in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.The pharmaceutical preparation of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in a customary manner, both for systemic and for local administration. Counter ions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium. Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions (iv, ip, im) as well as preparations with a protracted active ingredient release , in the production of customary auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers. Auxiliaries include magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, cellulose and its derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycols and solvents such as sterile water and mono- or polyhydric alcohols, for example glycerol. A pharmaceutical composition according to the invention can be produced by mixing at least one Mrp4 inhibitor according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, other suitable active ingredients, additives or auxiliaries with a defined inhibitor dose and to give the desired Dar form of preparation is prepared.

Tumorzellen überexprimieren Mrp4 spezifisch bzw. differenziell, wenn Mrp4 im Vergleich zu Normalzellen des gleichen Gewebes in zumindest 10% höherer Menge exprimiert wird.Tumor cells specifically overexpress Mrp4 or differential if Mrp4 compared to normal cells of the same Tissue in at least 10% higher Amount is expressed.

Zytotoxische Komponenten bzw. Gruppen sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten bzw. zu Nekrose führen oder zumindest wachstumshemmend wirken. Diese können außer an eine erfindungsgemäße Substanz gekoppelt auch als Komponente B eingesetzt werden. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131 J, 177Lu) insbesondere Zytostatika sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylantien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe, Carmustin, Lomustin, Semustin, Triazene, Dacarbazin), Antimetaboliten (z.B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin, Cytarabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin), Mitosehemmer (z.B. Vincaalkaloide, Voncristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel), Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid), Antibiotika (z.B.Are cytotoxic components or groups Compounds that directly or indirectly induce apoptosis or lead to necrosis or at least act to inhibit growth. These can be in addition to a substance according to the invention coupled can also be used as component B. Such groups or Connections can in addition to radioisotopes (e.g. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131 J, 177Lu) especially cytostatics, which are used in tumor therapy become. Examples of this are: alkylating agents (e.g. mechlorethamine, ifosfamide, chlorambucil, Cyclophosphamide, melphalan, alkyl sulfonates, busulphan, nitrosoureas, Carmustine, lomustine, semustine, triazenes, dacarbazine), antimetabolites (e.g. folic acid antagonists, Methotrexate, pyrimidine analogues, fluorouracil, fluorodeoxyuridine, Cytarabine, gemcitabine, purine analogs, mercaptopurine), mitotic inhibitors (e.g. vinca alkaloids, Voncristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel), epipodophyllotoxins (e.g. etoposide, teniposide), antibiotics (E.g.

Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-Asparaginase), Platinkomplexverbindungen (z.B. Cisplatin), Hormone und verwandte Verbindungen (z.B. Nebennierenrindensteroide, Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, Androgene, Antiöstrogene, Tamoxifen, Steriodanaloga, Flutamid). Bei Bindung einer solchen Verbindung mit einer an Mrp4 bindenden Substanz erfolgt die Kopplung dergestalt, daß die Affinität zu Mrp4 um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Substanz ohne zytostatische Gruppe, reduziert ist und die zytostatische Wirkung der Gruppe um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Verbindung ohne Substanz, reduziert ist.Dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, Anthracyclines, bleomycin, L-asparaginase), platinum complex compounds (e.g. cisplatin), hormones and related compounds (e.g. adrenal cortex steroids, Aminogluthetimide, progestogens, estrogens, Androgens, anti-estrogens, Tamoxifen, steroid analogs, flutamide). When binding such Coupling takes place with a substance that binds to Mrp4 in such a way that the affinity to Mrp4 by no more than 90%, preferably 50%, based on the substance without cytostatic group, is reduced and the cytostatic effect the group by no more than 90%, preferably 50%, based on the connection without substance is reduced.

Eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha, -beta, -gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Chemokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8. Diese Komponente kann auch als eine Komponente B eingesetzt werden.An immunostimulating component is usually a protein or an effective component thereof, which Immune system cells stimulated. Examples for this are: Cytokines, such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF, interferons, such as IFN-alpha, -beta, -gamma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8), human LIF, chemokines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8. This component can also be used as a component B.

Eine Reportergruppe ist ein Atom, Molekül oder eine Verbindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung mittels Phosphoimager. Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzählung.A reporter group is an atom, Molecule or a connection which in connection with one placed thereon Assay the detection of the reporter group and thus with the reporter group connected compound or substance. Examples of reporter groups and associated detection methods are: 32P labeling and intensity measurement using phosphoimager. Many other examples are known to those of ordinary skill in the art and need not the detailed list.

Eine an Mrp4 bindende Substanz kann eine Substanz sein, welche ein Mrp4 Protein oder eine Mrp4 RNR bindet.A substance that binds to Mrp4 can be a substance that binds a Mrp4 protein or a Mrp4 RNR.

Resistenz bezeichnet die Widerstandsfähigkeit von malignen Zellen gegenüber Chemotherapeutika. Eine Zelle ist im Falle einer erwerbbaren Resistenz resistent, wenn die Zeit bis zum Zelltod verlängert ist gegenüber einer Referenzzelle gleichen Zelltyps bzw. gleicher Zellline und gleicher Dosierung oder wenn die Proliferationsrate der resistenten Zelle unter gleichen Bedingungen erhöht ist gegenüber jener der Referenzzelle. Eine Zelle ist im Falle einer initialen Resistenz resistent, wenn die Zeit bis zum Zelltod verlängert oder die Proliferationsrate erhöht ist gegenüber einer nichtresistenten Referenzzelle verschiedenen Zelltyps und gleicher Dosierung.Resistance means resilience of malignant cells opposite Chemotherapeutics. A cell is in the case of acquired resistance resistant if the time to cell death is extended to one Reference cell of the same cell type or cell line and same Dosage or if the proliferation rate of the resistant cell is below same conditions increased is opposite that of the reference cell. A cell is in the case of an initial one Resistance resistant if the time to cell death is prolonged or the proliferation rate increases is opposite a non-resistant reference cell of different cell types and same dosage.

Im Rahmen der vorstehenden Definition gegenüber dem engen Wortsinn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch die bestimmten Begriffe im engen Wortsinn.As part of the above definition across from The narrow sense of the word also includes expanded definitions the certain terms in the narrow sense of the word.

Beispiele.Examples.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich bevorzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen:The invention is described below of preferred embodiments only illustrative examples and figures explained. Show it:

1: Chipanalyse zur differenziellen Expression von Mrp4 in Protatatumorgeweben aus Patienten, 1 : Chip analysis for the differential expression of Mrp4 in protate tumor tissues from patients,

2: Cancer Profiling Array zur differenziellen Expression von Mrp4 in Protata- und Ovartumorgeweben aus Patienten, 2 : Cancer Profiling Array for the differential expression of Mrp4 in protata and ovarian tumor tissues from patients,

3: Mrp4 TagMan in Prostatatumor- und Protatanormalgeweben aus gleichen Patienten, 3 : Mrp4 TagMan in prostate tumor and protate abnormal tissues from the same patient,

4: Mrp4 TagMan in verschiedenen humanen Tumorzelllinien, 4 : Mrp4 TagMan in different human tumor cell lines,

5: verschiedene Hammerhead Ribozyme, welche Mrp4 mRNA schneiden, 5 : various hammerhead ribozymes that cut Mrp4 mRNA,

6: Immunisierungspeptide, 6 : Immunization peptides,

7: eine Mrp4 codierende Nukleinsäure (Seq.-ID 9), und 7 : a nucleic acid encoding Mrp4 (SEQ ID 9), and

8: ein Mrp4 Protein bzw. Peptid (Seq.-ID 10), wobei die markierte Teilsequenz (Seq.-ID 11) von selbstständiger Bedeutung ist. 8th : a Mrp4 protein or peptide (SEQ ID 10), the labeled partial sequence (SEQ ID 11) being of independent importance.

Beispiel 1:Example 1:

Es wurden electronic Northern gemäß der Literaturstelle DE 198 11 194 A1 angefertigt, wobei die in den Sequenzprotokollen angegebene assemblierte Sequenz aus ESTs bzw. Contigs eingesetzt wurde (ok_582). Eine Überexpression in Tumorgewebe mit einer Signifikanz von > 0,90 wurde für Prostata- und Blasengewebe gefunden.There were electronic Northern according to the reference DE 198 11 194 A1 prepared, using the assembled sequence from ESTs or Contigs specified in the sequence listing (ok_582). Overexpression in tumor tissue with a significance of> 0.90 was found for prostate and bladder tissue.

Beispiel 2: Überexpression in ProstatatumorExample 2: Overexpression in prostate tumor

Gepaartes Prostatatumor- und Normalgewebe wurde im Wege der Lasermikrodissektion von 54 Patienten entnommen. Die daraus präparierte RNA wurde amplifiziert, mit Digoxygenin gelabelt und auf einen DNA Chip mit Hilfe der Affymetrix Technologie hybridisiert. Die Ergebnisse der Analyse des Chips sind in der 1 dargestellt. Man erkennt, daß in 55% der Prostatatumoren (28 aus 54 Patienten) die Expression um zumindest den Faktor 2 erhöht ist.Paired prostate tumor and normal tissues were removed by laser microdissection from 54 patients. The RNA prepared from it was amplified, labeled with digoxygenin and hybridized on a DNA chip using Affymetrix technology. The results of the analysis of the chip are in the 1 shown. It can be seen that in 55% of the prostate tumors (28 out of 54 patients) the expression is increased by at least a factor of 2.

Beispiel 3: Überexpression in Prostata- und Ovartumor.Example 3: Overexpression in prostate and ovarian tumors.

2 zeigt Ergebnisse der Expression von Mrp4 auf Prostata- und Blasentumoren und den dazugehörenden Normalgeweben, erhalten wie oben angegeben, aus einem Cancer Profiling Array. Hierfür wurde die Mrp4 Sequenz mit 32P-dCTP gelabelt mittels random hexamer priming und an das Cancer Profiling Array hybridisiert. Dieses enthält. 225 cDNA Paare, wobei jedes Paar Tumor- und Normalgewebe von einem Patienten repräsentiert. Man erkennt, daß in mehreren Prostata- und Ovartumoren Mrp4 überexprimiert wird. 2 shows results of the expression of Mrp4 on prostate and bladder tumors and the associated normal tissues, obtained as stated above, from a cancer profiling array. For this purpose, the Mrp4 sequence was labeled with 32P-dCTP using random hexamer priming and hybridized to the cancer profiling array. This contains. 225 cDNA pairs, each pair representing tumor and normal tissue from one patient. It can be seen that Mrp4 is overexpressed in several prostate and ovarian tumors.

Beispiel 4: Überexpression in Prostatatumor.Example 4: Overexpression in prostate tumor.

Mrp4-spezifische Oligonukleotidprimer wurden generiert und für eine quantitative PCR (TagMan) verwendet, wobei die erster Strang cDNA aus verschiedenen Geweben und Zelllinien, wie in der 3 angegeben, stammte. Mann erkennt zunächst, daß eine signifikante Überexpression von Mrp4 (4-9-fach) in 5 von 15 Prostatgewebepaaren erfolgt.Mrp4-specific oligonucleotide primers were generated and used for quantitative PCR (TagMan), the first strand of cDNA from different tissues and cell lines as shown in the 3 specified, came. Mann first recognizes that there is significant overexpression of Mrp4 (4-9-fold) in 5 out of 15 prostate tissue pairs.

In anderen Normalgeweben der 3 erfolgt keine Expression. Gleiches gilt für die untersuchten Zelllinien, mit Ausnahme der Androgen-sensitiven Tumorzelllinie LNCaP.In other normal tissues 3 there is no expression. The same applies to the cell lines examined, with the exception of the androgen-sensitive tumor cell line LNCaP.

Eine detaillierte Darstellung der Untersuchungen an Zelllinien ist in der 4 gegeben, wobei zunächst die starke Expression in der Prostata-Tumorzelllinie LNCaP deutlicher hervortritt. Es ist aber auch erkennbar, daß eine Expression in nicht Androgen-sensitiven Zelllinien, wie beispielsweise PC-3 und DU-145 vergleichsweise niedrig ist.A detailed description of the investigations on cell lines is in the 4 given, first of all the strong expression in the prostate tumor cell line LNCaP stands out more clearly. However, it can also be seen that expression in non-androgen-sensitive cell lines, such as, for example, PC-3 and DU-145, is comparatively low.

Beispiel 5: Nachweis von Mrp4 mittels AntikörpernExample 5: Detection of Mrp4 using antibodies

In diesem Beispiel wird die Markierung eines Tumors bzw. seiner Metastasen durch einen anti-Mrp4-Antikörper in vivo (Mausmodell) beschrieben. Ein anti-Mrp4-Antikörper wird mit einem Markermolekül (z. B. Radioisotop) markiert. In NMRI-Nacktmäuse werden 3 × 106 Mrp4-transfizierte humane Zellen oder Tumorzellen mit hoher endogener Mrp4 Expression, beispielsweise LNCaP Zellen, transplantiert. Nach einem Zeitraum, der ausreicht, um Metastasen an einer sekundären Stelle des Körpers zu entwickeln, beispielsweise 30 Tage nach der Transplantation, wird den Mäusen markierter Antikörper infiziert. Die Kontrolltiere werden mit einem nicht relevanten Antikörper behandelt. Wenige Stunden nach der Antikörperapplikation werden die Tiere getötet und aus allen Organen Gewebeschnitte angefertigt. Diese Schnitte werden auf die Gegenwart von markiertem anti-Mrp4 Antikörper untersucht.In this example, the labeling of a tumor or its metastases by an anti-Mrp4 antibody in vivo (mouse model) is described. An anti-Mrp4 antibody is labeled with a marker molecule (e.g. radioisotope). 3 × 10 6 Mrp4-transfected human cells or tumor cells with high endogenous Mrp4 expression, for example LNCaP cells, are transplanted into NMRI nude mice. After a period of time sufficient to develop metastases to a secondary site in the body, for example 30 days after the transplant, the mice become infected with labeled antibodies. The control animals are treated with an irrelevant antibody. A few hours after the antibody application, the animals are sacrificed and tissue sections are made from all organs. These sections are examined for the presence of labeled anti-Mrp4 antibody.

Bei den anti-Mrp4 Antikörpern handelt es sich um polyklonale Antikörper gegen humanes Mrp4 Protein, konjugiert mit einem Trägerprotein, in Kaninchen gezogen und mit den spezifischen immobilisierten Peptiden affinitätsgereinigt.The anti-Mrp4 antibodies act polyclonal antibodies against human Mrp4 protein conjugated to a carrier protein, raised in rabbits and with the specific immobilized peptides affinity purified.

Beispiele für Immunisierungspeptide sind in 6 (Seq.-ID 1 bis 4) angegeben. Als Immunogene können ebenso mit cDNA von Mrp4, oder Teilsequenzen hiervon transfizierte Zellen, wie beispielsweise COS-Zellen oder NIH3T3-Zellen, eingesetzt werden. Ebenso sind Tumorzellen, die endogen Mrp4 exprimieren, geeignet. Weiterhin kann auch rekombinant hergestelltes Mrp4 bzw. Teilsequenzen hieraus, die in Producerzellen, wie E. coli oder Insektenzellen exprimiert werden, zur Immunisierung eingesetzt werden.Examples of immunization peptides are in 6 (SEQ ID 1 to 4). Cells which are transfected with Mrp4 cDNA or partial sequences thereof, such as, for example, COS cells or NIH3T3 cells, can also be used as immunogens. Tumor cells expressing Mrp4 endogenously are also suitable. Furthermore, recombinantly produced Mrp4 or partial sequences thereof, which are expressed in producer cells such as E. coli or insect cells, can also be used for the immunization.

Beispiel 6: Immunhistochemischer Nachweis von Tumorzellen.Example 6: Immunohistochemical Detection of tumor cells.

Primäre Tumoren werden aus den Patienten mit Prostata-, Blasen- und/oder Ovartumoren isoliert und als Paraffin bzw. Gefrierschnitte präpariert. Diese Schnitte werden mit einem anti-Mrp4-Antikörper auf die Überexpression von Mrp4 in Tumorzellen untersucht. Die immunhistologische Untersuchung mit dem Mrp4-Antikörper zeigt höhere Expression von Mrp4 in den Tumorzellen im Vergleich zu umliegenden Normalgewebe. Die Untersuchung erfolgt im Einzelnen durch Inkubation mit dem anti-Mrp4 Antikörper als primärem Antikörper, einem biotinyliertem sekundären anti-Kaninchen Antikörper und einer Streptavidin-gekoppelten Meerrettichperoxidase. Die Färbung erfolgt mit DAB als chromogenen Substrat (braune Färbung). Die Gegenfärbung erfolgt mit Hemalaun-Lösung (blaue Färbung). Es sind maligne und nichtmaligne Zellen unterscheidbar, wobei die malignen Zellen eine starke Färbung, i.e. hohen Mrp4 Gehalt, aufweisen, während die nichtmalignen Zellen nur moderat gefärbt sind.Primary tumors are made from the patient Prostate, bladder and / or ovary tumors isolated and as paraffin or frozen sections prepared. These sections are over-expressed with an anti-Mrp4 antibody of Mrp4 examined in tumor cells. The immunohistological examination with the Mrp4 antibody shows higher Expression of Mrp4 in the tumor cells compared to the surrounding ones Normal tissue. The examination is carried out in detail by incubation with the anti-Mrp4 antibody as the primary Antibody, a biotinylated secondary anti-rabbit antibody and a streptavidin-coupled horseradish peroxidase. The coloring is done with DAB as a chromogenic substrate (brown color). The counterstaining takes place with hemalaun solution (blue color). Malignant and non-malignant cells can be distinguished, the malignant ones Cells a strong staining, i.e. have high Mrp4 content, while the non-malignant cells only moderately colored are.

Beispiel 7: RNA-InhibitorenExample 7: RNA inhibitors

In der 5 (Seq.-ID 5 und 6) sind verschiedene Hammerhead Ribozyme dargestellt, die Mrp4 an den dargestellten Stellen schneiden und so die Aktivität eventueller Translationsprodukte inhibieren oder zumindest: reduzieren. Geeignete antisense RNA Sequenzen sind beispielsweise 5"-UCACCUCCUGGUACACGGGCAG-3" (Seq.-ID 7) und 5"-GCAGAUGUUCGCGUCCUGCAGC-3" (Seq.-ID 8). Es ist auch möglich durch Konstruktion von Primern, mittels welcher RNAi Sonden generiert werden, Mrp4 zu inhibieren im Wege des Gen Silencing (RNA Wechselwirkung).In the 5 (Seq. ID 5 and 6) various hammerhead ribozymes are shown which cut Mrp4 at the points shown and thus inhibit or at least: reduce the activity of any translation products. Suitable antisense RNA sequences are, for example, 5 "-UCACCUCCUGGUACACGGGCAG-3" (SEQ ID 7) and 5 "-GCAGAUGUUCGCGUCCUGCAGC-3" (SEQ ID 8). It is also possible to inhibit Mrp4 by gene silencing (RNA interaction) by constructing primers by means of which RNAi probes are generated.

Claims (14)

Verwendung einer für Mrp4 codierenden Nukleinsäure und/oder eines Mrp4 Peptids oder Proteins zur Detektion von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere von Tumoren mit einer erhöhten Resistenz, wobei eine Prostata- oder Blasen- oder Ovar-Gewebeprobe auf Übertranskription von Mrp4 RNA oder auf Überexpression eines Mrp4 Proteins untersucht wird.Use one for Nucleic acid encoding Mrp4 and / or a Mrp4 peptide or protein for the detection of prostate and / or bladder and / or ovary tumors, or for the detection of a Risk of disease of prostate and / or bladder and / or ovary tumors, especially of tumors with increased resistance, one Prostate or bladder or ovary tissue sample for over-transcription of Mrp4 RNA or for overexpression of a Mrp4 protein is examined. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine an für Mrp4 codierende Nukleinsäure oder eine an Mrp4 Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet wird, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.Use according to claim 1, wherein a nucleic acid coding for Mrp4 or a detector substance binding to Mrp4 protein or peptide, preferably containing a reporter group is used, binding said Nucleic acid and / or said protein or peptide semi-quantitative to the detector substance or is detected quantitatively. Verwendung einer Mrp4 RNA oder eines Mrp4 Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolutierung, selektiert wird.Use of a Mrp4 RNA or a Mrp4 protein or peptide for screening for substances that bind to it, especially prospective active substances to inhibit said RNA or said protein or peptide or prospective detector substances, where a prospective substance or a mixture of such prospective substances with said RNA or said protein or peptide is contacted with a binding assay Binding events are detected, and being a binding prospective substance, if necessary after deconvolution, is selected. Verwendung einer Mrp4 inhibierenden oder daran bindenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere zur Behandlung resistenter Tumoren.Use of a substance which inhibits or binds to Mrp4 for the manufacture of a pharmaceutical composition for treatment of prostate and / or bladder and / or ovary tumors, in particular for the treatment of resistant tumors. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz ein Antikörper ist, welcher durch Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugetiers mit einem Mrp4 Peptid oder Protein, oder einer hierfür codierenden cDNA, erhältlich ist, oder ein Phage-Display Antikörper ist.Use according to claim 4, wherein the substance is an antibody, which by immunization of a non-human mammal with a Mrp4 peptide or protein, or a coding for this cDNA, available or a phage display is antibody. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz eine Mimikriverbindung eines Antikörpers gegen ein Mrp4 Peptid oder Protein ist.Use according to claim 4, wherein the substance is a facial expression compound of an antibody against a Mrp4 peptide or protein. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz, ein Aptamer, eine antisense RNA, oder ein Ribozym ist.Use according to claim 4, wherein the substance, an aptamer, is an antisense RNA, or a ribozyme. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt.Use according to one of claims 4 to 7, wherein the substance additionally carries a cytotoxic and / or immunostimulating component. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist.Use according to one of claims 4 to 8, wherein the pharmaceutical Composition for local application in tissue containing tumor cells is prepared. Verfahren zur Diagnose einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung, insbesondere zur Diagnose resistenter Tumoren, wobei eine Detektorsubstanz in einer Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als, ggf. resistente, Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird.Method for diagnosing a prostate and / or bladder and / or Ovarian tumor disease, especially for the diagnosis of resistant tumors, wherein a detector substance in one embodiment with a reporter group is applied to the tissue to be examined, the tissue to be examined is then subjected to a detection method step which is sensitive for the Is reporter group, and being in the case of detection of a defined minimum value the reporter group in the tissue the tissue as, possibly resistant, tumor cells containing qualified. Verfahren zur Behandlung einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung, insbesondere resistenter Tumoren, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 9 in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird, wobei optional gleichzeitig, davor, oder danach ein hiervon verschiedener Antikrebs-Wirkstoff in gleicher oder verschiedener Darreichungsform dargereicht wird.Process for the treatment of a prostate and / or bladder and / or Ovarian tumor disease, especially resistant tumors, one Pharmaceutical composition according to one of claims 4 to 9 presented to a patient in a physiologically effective dose , optionally at the same time, before, or after one of them various anti-cancer drug is presented in the same or different dosage forms. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend zumindest zwei Komponenten A und B, wobei Komponente A eine Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 8 ist, wobei die Komponente B eine Antikrebs-Wirkstoff ist, wobei die Komponenten A und B alternativ hergerichtet sein können i) als räumlich separate Komponenten eines Mehrkomponentenpräparates, bestimmt zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Darreichung und galenisch hergerichtet als gleiche oder verschiedene Darreichungsformen, oder ii) als Kombinationspräparat in Form einer räumlich verbundenen und einheitlichen Darreichungsform.Pharmaceutical composition containing at least two components A and B, wherein component A is a substance according to any one of claims 4 to 8, wherein component B is an anti-cancer drug, wherein components A and B can alternatively be prepared i) as spatial separate components of a multi-component preparation, intended for simultaneous use or successive administration and galenically prepared as the same or different dosage forms, or ii) as a combination preparation in Form a spatial connected and uniform dosage form. Ein Mrp4 Protein oder Peptid enthaltend eine Teilsequenz von zumindest 4 Aminosäuren aus Seq.-ID 10, insbesondere aus Seq.-ID 11, oder enthaltend Seq.-ID 10, insbesondere Seq.-ID 11, oder bestehend aus einer solchen Sequenz, nicht jedoch ein Protein oder Peptid gemäß oder codiert durch Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 und XM_036453 und nicht Seq.-ID 1 gemäß WO0058471.A Mrp4 protein or peptide containing a partial sequence of at least 4 amino acids from SEQ ID 10, in particular from SEQ ID 11, or containing SEQ ID 10, in particular SEQ ID 11, or consisting of such a sequence, but not a protein or peptide according to or encoded by Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 and XM_036453 and not SEQ ID 1 according to WO0058471. Eine für ein Protein oder Peptid nach Anspruch 13 codierende Mrp4 Nukleinsäure, insbesondere enthaltend eine Teilsequenz von zumindest 12 Nukleotiden aus Seq.-ID 9.One for Mrp4 nucleic acid encoding a protein or peptide according to claim 13, in particular containing a partial sequence of at least 12 nucleotides from SEQ ID 9th
DE2002134901 2002-07-26 2002-07-26 New nucleic acids encoding Mrp4, useful in the diagnosis of prostatic, bladder and ovarian tumors, also in screening for specific binding agents, and potential therapeutic agents Ceased DE10234901A1 (en)

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