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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Herstellung von gegen Nicht-Hüllproteine von Pflanzenviren
gerichtete "single-chain Fv" (scFv)-Fragmente in Pflanzen und deren
Verwendung zur Bekämpfung
von viralen Erkrankungen in Pflanzen. Insbesondere betrifft die
vorliegende Erfindung die Expression eines scFv gegen ein Motiv
der „Palm"
Domäne
einer viralen RNA-abhängigen
RNA Polymerase (RdRp). Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung
die Verwendung der oben genannten scFv-Fragmente gegen durch Pflanzenviren
der Gruppe Tombusvirus (wie z.B. TBSV und CNV = Cucumber Necrosis
Virus = Gurken-Nekrose Virus) und Carmovirus (wie z.B. TCV = Turnip
Crincle Virus = Kohl-Verkrüpplungs
Virus) verursachten Erkrnakungen. In einem letzten Aspekt betrifft
die Erfindung zudem die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten scFv-Fragmente
zur Behandlung von anderen RNA-Viren, insbesondere des Nicht-Pflanzenvirus
HCV (Hepatitis C Virus).
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Trotz der Anwendung von Pestiziden
um die Populationen von Insekten als Überträgern zu verringern und den
herkömmlichen
Züchtungsansätzen, stellen
Viren immer noch eine wichtige Bedrohung der landwirtschaftlichen
Produktion von vielen Anbaupflanzen dar. Rekombinante Ansätze, einschließlich der
Transformation von viralen Sequenzen in die Pflanzengenome kann
ausreichend sein eine Virusresistenz zu übertragen, wird jedoch immer
noch durch die Öffentlichkeit
kontrovers diskutiert. Antikörper
sind als in der Natur omnipräsent
bekannt und stellen keine Bedrohung der menschlichen Gesundheit
nach deren Verzehr dar. Die sogenannte „Plantibody"-übertragene
Virusresistenz kann daher das Verfahren der Wahl im Hinblick auf
sowohl technische und soziale Aspekte sein.
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Die Expression von funktionellen
rekombinanten Antikörpern
in transgenen Pflanzen wurde während der
letzten 10 Jahre entwickelt (zusammengefaßt durch Fiedler, U., 0. Artsaenko,
J. Phillips and U. Conrad. Transgenic plants- a low tost production
system for recombinant antibodies, in Harper, K. and A. Ziegler (eds.):Recombinant
Antibodies-applications in plants science and plant pathology. Taylor
and Francis, London, 1999, pp. 129-144 (1999), Fischer R, Liao YC,
Hoffmann K, Schillberg S, Emans N. Molecular farming of recombinant
antibodies in plants. Biol Chem. 380(7-8):825-39 (1999), De Jaeger,
G., De Wilde C., Eeekhout D., Fiers E., Depieker A. The plantibody
approach: expression of antibody genes in plants to modulate plant
metabolism or to obtain pathogen resistance. Plant Molecular Biology
43: 419-428 (2000)).
Rekombinante Antikörper
wurden auch als in verschiedene Kompartimente von Pflanzenzellen
gerichtet (beschrieben durch Fiedler U, Conrad U High level production
and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds
Bio/Technology 10, 1090-1094 (1995)) sowie als exprimiert in Speicherorganen,
wie Samen (Fiedler und Conrad, 1995) und Kartoffelknollen (Artsaenko
0., Kettig B., Fiedler U., Conrad U., During K. Potato tubers as a
biofactory for recombinant antibodies Mol. Breeding 4: 313-319 (1998))
gezeigt. Rekombinante Antikörper wurden
ebenfalls zur Immunmodulation von Hormonfunktionen verwendet (Artsaenko
0, Peisker M, zur Nieden U, Fiedler U, Weiler EW, Muntz K, Conrad
U. Expression of a single chain Fv antibody against abscisic acid creates
a wildtype phenotype in transgenic tobacco. Plant J 8: 745-750 (1995),
Phillips, J., Artsaenko 0, Fiedler U, Horstmann C, Mock H-P, K.
Muntz K, Conrad U. Seed-specific immunomodulation of abscisic acid
activity induces a developmental switch. EMBO J. 16,4489-4611 (1997)).
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Alle positiv-Strang RNA-Viren kodieren
für eine
RNA-abhängige
RNA Polymerase (RdRp), die als die katalytische Untereinheit bei
der Replikation des viralen Genoms fungiert. Konservierte Motive
wurden innerhalb dieser viralen Proteine identifiziert, die an spezifischen
Funktionen bei der Genomreplikation, wie z.B. Polymerase- Helikase-
und RNA-capping Aktivitäten
beteiligt sind (Koonin, E. V, The phytogeny of RNA-dependent RNA
polymerases of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology
72, 2197-2206 (1991), Rozanov, M.N., Koonin, E.V. and Gorbelenya
A.E. Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark
of the "Sindbis-like" supergroup of positive-strand RNA viruses.
Journal of General Virology.73, 2129-2134 (1992)). Im Augenblick
bestehen 8 konservierte RdRp Motive (Koonin, E. V, The phytogeny
of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses.
Journal of General Virology 72, 2197-2206 (1991), Poch, 0., Sauvageut,
I., Delarue, M. and Tordo, N. Identification of four conserved motifs
among RNAdependent polymerase encoding elements. EMBO Journal 8,
3867-38-74 (1989)). Vier dieser 8 konservierten Motive sind als
in allen Klassen von Polymerasen vorhanden bekannt und führen zu
dem katalytischen Teil der sogenannten "Palm" oder auch "Handflächen"-Domäne" (Hansen,
J.L. Long, A.M. and Schulz, S.C. Structure of RNA-dependent RNA
polymerase of poliovirus. Structure 5, 1109-1122(1997), Ollis, D.L.,
Brick, P., Hamlin, R., Xuong, N.G. and Steitz, T.A. Structure of
large fragments of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with
dTMP. Nature 313, 762-766 (1985)). Diese funktionellen Domänen erscheinen
als ein vielversprechendes Ziel für die antivirale Intervention
und könnten
eine Art von Breitspektrum-Resistenz ermöglichen.
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Der Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV;
Tomatenzwergbusch-Virus), ein Mitglied der Gruppe der Tombusviren,
ist ein kleiner kugelförmiger
Pflanzenvirus, der ein einzelnes positiv-Sinnstrang-RNA-Genom von 4775 Nukleotiden
enthält,
das für
5 Gene kodiert. Der erste offene Leserahmen kodiert für ein 33-kDa
Protein, das als an der viralen RNA-Replikation beteiligt nachgewiesen
wurde, jedoch erhält
seine Aminosäuresequenz keine
bekannten Motive, die es als ein solches Protein definieren würden. Das
Lesen über
das Amber Stopcodon des p33 offenen Leserahmens führt zu der
Translation eines 92 kDa Fusionsproteins, dessen durchgelesener
Teil hochkonservierte Motive enthält, die in den katalytischen
Untereinheiten von RdRp's gefunden werden. Die Produkte der offenen
Leserahmen 3 (Hüllenprotein)
und Leserahmen 5 („nested
p19/p22 movement" Proteine) werden jeweils von 2 subgenomischen
(sg) m-RNA's translatiert. Das TBSV-92kDa Protein enthält Motive,
die von allen RdRp's geteilt werden und besitzt die klassischen
Finger, Handflächen
("palm") und Daumen("thumb) untereinheiten.
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Als Wirtsspektren der hier näher betrachteten
RNA-Viren befallen Tombus-, Carmo- und Dianthoviren nur dicotyledone
Wirtspflanzen, bei TBSV wurde in mehr als 120 Spezies aus mehr als
20 Familien gefunden, so z.B. Tomate, Artischocke, Geranie, Petunie,
Kirsche, Pfeffer, Nelke und Wein. CNV wird nur in Gurke (Cucumis
sativus), Cowpea (Vigna sinensis) und Zinnie (Zinnia elegans) systemisch,
führt aber
bei verschiedenen Spezies von Amaranthacaen, Chenopodiacaen, Compositen,
Cucubitacaen, Leguminosen und Solanacaen zu Lokalinfektionen. TNC
führt zu
Infektionen in Kohl und Brassica-Arten. Flaviviren infizieren Vertebraten
(einschließlich
Mensch) und Pestiviren Säugetiere
(einschließlich
Mensch).
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Tavladoraki et al. (Tavladoraki P,
et al. Nature 1993 Dec 2;366(6454):469-72) beschreiben transgene Pflanzen,
die einen funktionellen single-chain Fv Antikörper exprimieren und dadurch
gegen einen spezifischen Virusangriff geschützt sind, in diesem Fall gegen
den icosahedralen Artischocke "mottled crinkle" Tombusvirus. Zudem
wird durch die Expression lediglich eine Verringerung der Infektionshäufigkeit
und eine Verzögerung
dr Symptome erreicht.
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McCormick et al. (Proc Natl Acad
Sci U S A 1999 Jan 19;96(2):703-8) beschreiben die Herstellung von spezifischen
Lymphoma-Impfstoffen durch Expression des Tumor-abgeleiteten single-chain
Fv Epitops in Tabakpflanzen.
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Franconi et al. (Franconi R, et al.
Immunotechnology 1999 Mar;4(3-4):189-201) beschreiben die funktionelle
Expression eines scFv Antikörperfragments
gegen Tospoviren, insbesondere den Tomaten "spotted wilt" Tospovirus
(TSWV), in Bakterien und Pflanzen. Das scFv Antikörperfragment
stammte von einem Antikörper
gegen ein Epitop des Glycoproteins G1, eines "envelope" spezifischen
Virusproteins. Lediglich die Produktion von sekretierten Fragmenten
war erfolgreich. Zudem wird das PVX Virus-Vektorkonstrukt verwendet,
das kein infektiöser
Klon des homologen Virus ist, gegen das der scFV Antikörper gerichtet
ist. Ähnlich
beschreiben Hendy et al (Hendy S, et al. J Immunol Methods 1999
Dec 10;231(1-2):137-46) die Produktion eines Hüllprotein spezifischen scFv
Antikörperfragments
in Pflanzen auf Basis des Kartoffelvirus X (PVX) episomalen Vektors.
Hierbei soll die Pflanze nicht gegen virale Infektion geschützt werden.
Fecker et al. (Fecker LF, et al. Plant Mol Biol 1996 Dec;32(5):979-86) beschreiben die
Expression eines scFv Antikörperfragments
gegen Rüben "necrotic
yel-low vein" Virushüllenprotein
in Nicotiana benthamiana.
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WO 96/27612 beschreibt die Produktion
von stabilen Antikörperfragmenten
in Hefezellen.
US 5,316,931 beschreibt
Pflanzen virale Vektoren, die heterologe subgenomische Promotoren
aufweisen, zur systemischen Expression von fremden Gene.
US 5,811,653 beschreibt
die virale Amplifikation von rekombinanter messenger RNA in transgenen
Pflanzen.
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Die Brauchbarkeit des immunmodulierenden
Ansatzes wurde erfolgreich für
menschliche Viren angewendet (Marasco, W.A. Intracellular antibodies
(intrabodies) as research reagents and therapeutic molecules for
gene therapy. Immunotechnology 1, 1-19 (1995)), jedoch ist deren
Anwendung in der Pflanzenvirologie unterrepräsentiert. Bis heute wurden
lediglich die Expressionen von rekombinanten Antikörpern gegen
Hüllproteindomänen (CP)
von Pflanzenviren berichtet. Bei der Expression von Anti-TMV-CP-Antikörpern konnten Voss
et al. (Voss A, Niersbach M, Hain R, Hirseh HJ, Liao YC, Kreuzaler
F, Fischer R. Reduced virus infectivity in N. tabaccum secreting
aTMV-specific full-size antibody. Mol. Breed. 1: 39-50 (1995)) eine
verringerte Empfindlichkeit gegenüber TMV in Tabakpflanzen zeigen.
Auch ergab die intrazelluläre
Expression von scFv gegen die CP von TMV eine verbesserte Virusresistenz
gegen TMV (Zimmermann S, Sehillberg S, Liao Y-C, Fischer R. Intracellular
ex pression of TMV-specific single chain Fv fragments leads to improved
virus resistance in Nicotiana tabacum. Mol. Breed. 4:369-379 (1998)).
Die Expression von Anti-CP rekombinanten Antikörpern führte jedoch nicht zu einer
bemerkenswerten Verbesserung der Resistenzstrategien gegen Pflanzenviren.
Da Hüllenproteine
von Pflanzenviren eine hohe Variabilität zeigen, können in Pflanzen Breitspektrum-Resistenzen nicht
erwartet werden. Darüber
hinaus akkumulieren sich Hüllproteine
in großen
Mengen in Pflanzenzellen, was es. schwierig macht, einen ausreichend
hohen scFv-Titer in den Pflanzenzellen zu erreichen, um eine voll-ständige Neutralisierung
des Antigens zu erhalten.
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Es ist daher Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die Therapie von pflanzenviralen Erkrankungen dadurch
entscheidend zu verbessern, daß in
den Pflanzen effektive scFv-Fragmente exprimiert werden, die sich gegen
ein breites Spektrum von RNA-Pflanzenviren einsetzen lassen. Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die in den
Pflanzen produzierten scFv-Fragmente zur Therapie von RNA Viruserkrankungen
zu verwenden.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten scFv-Fragments
in einer Pflanze gelöst,
das ein zur Verfügung
stellen einer DNA, die für
ein nicht gegen virale Hüllproteine
gerichtetes scFv-Fragment kodiert, die Klonierung der DNA in einen
geeigneten Expressionsvektor, die Transformation oder Infektion
einer Pflanze mit dem Vektor, und die Expression des nicht gegen virale
Hüllproteine
gerichteten scFv-Fragments in der Pflanze umfaßt.
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Bis heute wurden lediglich die Expressionen
von rekombinanten Antikörpern
gegen Hüllproteindomänen (CP)
von Pflanzenviren berichtet. Die Expression von Anti-CP rekombinanten
Antikörpern
führte
jedoch nicht zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Resistenzstrategien
gegen Pflanzenviren. Darüber
hinaus akkumulieren sich Hüllproteine
in großen
Mengen in Pflanzenzellen, was es schwierig machte, einen ausreichend
hohen scFv-Titer in den Pflanzenzellen zu erreichen. Daher weicht
die vorliegende Erfindung vom Konzept der Hüllproteine ab, in dem nicht-Hüllproteine
verwendet werden, die die oben genannten Nachteile nicht aufweisen.
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Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist.
Diese RdRp hat sich überraschenderweise
als ideales Target für
die Herstellung von scFv-Fragmenten erwiesen. Besonders bevorzugt
ist ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist,
die aus der Supergruppe 2 von positiv Strang viralen RdRps, und
insbesondere von einem Virus der (i) Tombus-, Carmo-, und Dianthoviren,
insbesondere CNV, TCV oder TBSV, (ii) Pestiviren, (iii) Flaviviren,
insbesondere HCV oder (iv) ssRNA Bakteriophagen, abstammt.
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Innerhalb der oben genannten RdRps
kann das erfindungsgemäße Verfahren
gegen konservierte Bereiche der RdRp gerichtete scFv-Fragmente zur
Verfügung
stellen, wobei besonders die scFv-Fragmente, die gegen die Handflächen ("palm")
Domäne
einer viralen RdRp gerichtet sind, bevorzugt sind.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft die erfindungsgemäß hergestellten scFv-Fragmente,
insbesondere die VH und/oder VL-Ketten
eines scFv-Fragments, insbesondere die VH-Ketten
der scFv H2C6 (Seq ID No. 1), H1E11 (Seq ID No. 2), P55H9 (Seq ID
No. 3) oder 28H3 (Seq ID No. 4), deren entsprechende scFv-Fragmente
sich alle als besonders wirksam erwiesen haben, sowie deren funktionell
identische Derivate, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, die
die Funktion nicht verändern,
oder die Marker oder sogenannte "Tags" enthalten. Die Peptide können auch
in Form von Fusionsproteinen vorliegen, die das scFv-Fragment oder
Ketten-Bestandteile davon als funktionellen Teil enthalten.. Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Polynucleotide, die für erfindungsgemäße scFv-Fragmente
kodieren, insbesondere die für
die VH-Ketten der scFv-Fragmente H2C6 (Seq.
ID. No 5), H1E11 (Seq. ID. No 6), P55H9 (Seq. ID. No 7) oder 28H3 (Seq.
ID. 8) kodierenden Polynukleotide und deren z.B. durch stumme Mutationen
veränderten
homologe Sequenzen. Bevorzugt sind erfindungsgemäße Polynucleotide, die in Form
einer DNA, PNA oder RNA, insbesondere einer plus-Sinnstrang-RNA,
vorliegen.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynucleotid
enthält,
insbesondere ein Vektor in For eines pET 23a+ pET 26b+- Derivats.
Besonders bevorzugt ist ein rekombinanter Vektor in Form eines infektiösen Klons
des Virus, in den das gegen die virale RdRp gerichtete scFv-Fragments
integriert vorliegt, insbesondere TBSV-BS3-FC811. Dieser Vektor erlaubt
als Testsystem die Entwicklung und Überprüfung der effektiv auf das zu
bekämpfende
Virus (in diesem Falle z.B. TBSV) abgestimmte Therapie von viralen
Erkrankungen und kann somit eine Basis für diese Therapie bilden. Die
Erfindung stellt somit das Konzept zur Verfügung, daß eine effektivere Behandlung
durch die Abstimmung des Konstrukts zusammen mit dem scFv-Fragment
gegen das nicht-CP erreicht werden kann. Dieser Ansatz ist den bisherigen
Ansätzen
in jeder Hinsicht überlegen.
So betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren
zur Behandlung von oder der Prophylaxe vor viralen Pflanzenerkrankungen, umfassend
die Expression von rekombinanten scFv-Fragmenten in der Pflanze,
die nicht gegen virale Hüllproteine
gerichtet sind. Der Prophylaxe-Aspekt ist in diesem Fall ebenfalls
eine erhebliche Verbesserung gegenüber en bisherigen Verfahren.
Bevorzugt ist eine Behandlung, bei der das scFv-Fragment gegen eine
virale RdRp gerichtet ist, die insbesondere eine Pflanzen-virale
RdRp ist, die aus der Supergruppe 2 von positiv Strang Pflanzen-viralen
RdRps, und insbesondere von einem Virus der Tombus-, Carmo-, und
Dianthoviren, insbesondere CNV, TCV oder TBSV stammt. Bevorzugt
ist dabei ein erfindungsgemäßes Verfahren,
bei dem das scFv-Fragment
gegen die Handflächen
("palm") Domäne
der viralen RdRp gerichtet ist.
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Die zu behandelnden Pflanze können aus
einer Vielzahl von dicotyledonen Kultur- und Anbaupflanzen, wie
zum Beispiel Gurke, Tomate, Rübe,
Raps, Wein, Kartoffel und/oder Tabak, insbesondere ausgewählt aus
den Solanaceae sein. Als Wirtsspektren der hier näher betrachteten
RNA-Viren befallen Tombus-, Carmo- und Dianthoviren Wirtspflanzen
in mehr als 120 Spezies aus mehr als 20 Familien gefunden, so z.B.
Tomate, Artischocke, Geranie, Petunie, Kirsche, Pfeffer, Nelke und
Wein. CNV wird nur in Gurke (Cucumis sativus), Cowpea (Vigna sinensis)
und Zinnie (Zinnia elegans) systemisch, führt aber bei verschiedenen
Spezies von Amaranthacaen, Chenopodiacaen, Compositen, Cucubitacaen,
Leguminosen und Solanacaen zu Lokalinfektionen. TNC führt zu Infektionen
in Kohl und Brassica-Arten. Die vorliegende Erfindung liefert somit
die Basis für
die Behandlung einer Vielzahl von viralen Erkrankungen in den oben
genannten Pflanzen.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft schließlich
die Verwendung eines oben genannten erfindungsgemäßen scFv-Polypeptids
oder eines wie oben genannten erfindungsgemäßen Polynucleotids zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung von all-gemein durch Viren verursachten Erkrankungen.
Dabei können
auch die funktionell identischen Derivate, bei denen Aminosäuren ausgetauscht
sind, die die Funktion nicht verändern,
oder die Marker oder sogenannte "Tags" enthalten zur Herstellung
verwendet werden. Die Peptide können
auch in Form von Fusionsproteinen vorliegen, die das scFv-Fragment
als funktionellen Teil enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch die Polynucleotide, die für
erfindungsgemäße scFv-Fragmente
kodieren und deren z.B. durch stumme Mutationen veränderten
homologe Sequenzen. Bevorzugt sind erfindungsgemäße Polynucleotide, die in Form
einer DNA, PNA oder RNA, insbesondere einer plus-Sinnstrang-RNA,
vorliegen.
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Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung
eines gegen die RdRp eines Flavivirus, insbesondere HCV, oder Pestivirus
gerichteten erfindungsgemäßen scFv-Fragments
oder des dafür
kodierenden Polynucleotids. Flaviviren infizieren Vertebraten (einschließlich Mensch)
und Pestiviren Säugetiere
(einschließlich
Mensch).
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Die Erfinder haben das Konzept des
Schutzes von Pflanzen gegen Virusinfektionen, basierend auf der Expression
von single-chain Fv (scFv) Fragmenten gegen ein Motiv der Handflächendomäne der RNA-abhängigen RNA
Polymerase (RdRp) des BS3 Isolats von Tomaten "Bushy Stunt Virus"
(TBSV-BS3) verwendet. Verschiedene E. coli exprimierte Fragmente
der RdRp wurden verwendet, um scFv's aus einer Phagenbibliothek auszuwählen. Die
inhibitorischen Aktivitäten
dieser scFv's wurden in in vitro und in vivo Experimenten untersucht.
Eine Epitopkartierung zeigte, daß die vier scFv's mit dem höchsten Potential
an Inhibierung auf dem Motiv E die Handflächendomäne der RdRp kartierten. Motiv
E wird als eine große
Rolle bei der Templatbindung spielend betrachtet und ist daher für die RdRp
Aktivität
essentiell. Die ausgewählten
scFv's inhibierten nicht nur die Aktivität der TBSV RdRp, sondern auch
die RdRp von CNV und TCV. CNV gehört zu derselben Gruppe von
Viren wie TBSV (Tombusvirus), wohingegen TCV zu der eng verwandten
Gruppe von Carmoviren zählt. Darüber hinaus
konnte gezeigt werden, daß einige
unserer scFv's an die RdRp des nur entfernt verwandten Hepatitis
Virus C (HCV) binden, möglicherweise
aufgrund einiger Sequenzhomologien in dem Motiv E der RdRp's. Dies
ist der erste Bericht, daß scFv's
gegen RdRp's von Pflanzenviren die virale Replikation in vivo inhibieren
können.
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Es konnte außerdem gezeigt werden, daß scFv's
gegen konservierte Domänen
hoch effizient bei der Inhibierung von nicht nur Replikationen von
homologen, sondern auch heterologen Viren sind und daher die beste
Wahl für
einen Plantibody-basierten Ansatz sind, um Virusresistenz zu erreichen.
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Die Erfindung soll nun durch die
folgenden Beispiele näher
verdeutlicht werden, wobei Bezug genommen wird auf die beigefügten Zeichnungen
und das Sequenzprotokoll, in denen
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1 zeigt:
die scFv vermittelte Inhibierung von CNV RdRp, in vitro Test. Verschiedene
Mengen von scFvs wurden mit CNV RdRp für 30 Min. inkubiert, bevor
die RdRp Reaktion durch die Zugabe von dem Templat (Di-72 (–)) gestartet
wurde. Die verbleibende Replikaseaktivität wird in Prozent der nicht-inhibierten
Replikaseaktivität
ohne die Zugabe von scFvs gezählt.
Wie in 1 gezeigt, wurde
die RNA-Synthese durch die ausgewählten scFv's in verschiedenem
Ausmaß blockiert,
sogar wenn die Menge von scFv zu niedrig wie 98 ng war.
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2 zeigt:
die scFv vermittelte Inhibierung von E. coli exprimierter TCV RdRp,
in vitro Test. Repräsentative
denaturierende Gelanalysen von radiomarkierten RNA Produkten, synthetisiert
durch in vitro Transkription mit E. coli exprimiertem TCV in der
Abwesenheit (Spur 1) und Anwesenheit (Spur 2) von scFv P55. Das
Fehlen von Replikationsprodukten in Spur 2 zeigt klar die Inhibierung
der TCV Replikase durch scFv P55.
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3 zeigt:
die scFv vermittelte Inhibierung der Replikation des TBSV-BS3 Wild-typ
Virus, in vivo Test. Eine Suspension von Agrobacterium, die verschiedene
scFv Konstrukte einhielt, wurde in N. benthamiana Blätter infiltriert.
4 Tage nach Infiltration, wurden infiltrierte Blätter mechanisch mit 1 μg von TBSV-BS3
Viruspartikeln beimpft und Die Etablierung der systemischen Infektion
wurde überwacht.
Sieben Tage nach der Inokulation, wurde die systemische Infektion
in allen Planzen außer
denjenigen, die scFv H2C6 und P55 exprimierten, nachgewiesen. A,
B Symptome in Pflanzen, die scFv Grud Und P55 exprimieren, sowie
in wt Kontrollpflanzen 7 Tage nach Virusinokulation. Apikale Blätter von
wt und scFv Grud exprimierenden Pflanzen zeigen typische Mißbildungen
und Mosaiksymptome, wo hingegen scFv P55 exprimierende Pflanzen
Symptom-frei nach Virusinokulation bleiben. C, D Western blot, die
die Expression von scFvs nach Agro-Infiltration zeigen. Infiltrierte
Blätter
wurden 4 Tni und 7 Tni (D) geerntet. Tni = Tage nach Infiltration
(dpi – day
post infiltration). M = Marker (Pflanze, die scFv exprimierte)
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4 zeigt:
Symptom-Expression (7 Tage nach Inokulation) in wt N. benthamiana
Pflanzen, die mit einem infektiösen
TBSV-BS3 Klon inokuliert wurden, der verschiedene scFv Gene trägt. A Symptom-Expression
in Pflanzen, die alle verschiedene scFvs exprimieren. Wt Kontrollpflanzen
und Pflanzen, die scFv Grud, 28H3 und H1E11 exprimieren, zeigen
alle systemische Infektion, einschließlich verkrüppeltem Wachstum und Mißbildungen
von apikalen Blättern,
wo hingegen Pflanzen, die scFv H2C6 und P55 exprimierten, Symptom-frei
blieben. B Vergleich zwischen N. benthamiana Pflanzen, die scFv
Grud (negative Kontrolle) und scFv P55 (am meisten effizienter scFv)
exprimieren.
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5 zeigt:
die Bindung von scFvs an NSB5 HCV in vitro. Immobilisierter NSSB
wurde mit scFvs in Microtiterplatten inkubiert. Gebundene scFv Proteine
wurden nach Inkubation mit anti-Myc, gefolgt von alkalischer Phosphatase-konjugiertem
anti-Maus IgG und Konversion des Phosphatasesubstrats p-Nitrophenylphosphat
durch Messen der Absorption bei 405 nm nachgewiesen. Die Werte sind
Mittelwerte von dreifachen Bestimmungen, wobei die Standardabweichungen
durch die Fehlerbalken angegeben sind.
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Seq ID Nos 1 bis 4 zeigen die Aminosäuresequenzen
der VH-Ketten der scFv-Fragmente H2C6 (Seq. ID.
No 1), H1E11 (Seq. ID. No 2), P55H9 (Seq. ID. No 3) und 28H3 (Seq.
ID. No 4),
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Seq ID Nos 5 bis 8 zeigen die Nukleinsäuresequenzen
der VH-Ketten der scFv-Fragmente H2C6 (Seq. ID.
No 5), H1E11 (Seq. ID. No 6), P55H9 (Seq. ID. No 7) und 28H3 (Seq.
ID. No 8).
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Beispiele
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Drei verschiedene Fragmente des offenen
Leserahmens 1, das mit dem Amber Codon des Vollängenklons von TBSV-BS3 beginnt
(Galetzka, D., Russo, M., Lubino, L and Krczal, G. Molecular characterisation
of a Tombusvirus associated with a disease of statice [Goniolimon
Tataricum (L.) Boiss]. Journal of plant pathology 82 (2), 151-155
(2000)) wurden in die BamHI/Sal I Stelle von pET 23a+ und 26a+ zur
Expression als His-tag Fusionsproteine in BL21 (DE3) kloniert. Die
Zielproteine wurden durch induzierte Expressionen der Klone mit
IPTG exprimiert. Die Proteine wurden mit 8 M Harnstoff, pH 8 gelöst, gereinigt
durch Metallaffinitätsharz
(Ni-NTA) und mit 8 M Harnstoff pH 4,5 eluiert.
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Phage-Display
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Die Untersuchung eines Gemischs von
zwei Phagenbibliotheken (A und B) (Durch das MRC, Cambridge, England
zur Verfügung
gestellt) wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt (Nunc Maxisorb, 96 Napf),
die bei 4°C über Nacht
mit 1 μg/Napf
von gereinigtem denaturiertem Protein beschichtet waren (6 Napf/Antigen). Für die erste
Runde an Selektionen wurden 0,5 ml (2,54 x 1013 t.u)
der Phagenbibliothek A und 0,25 ml (3,97 x 1014 t.u)
der Phagenbibliothek B verwendet. Drei Runden Screening wurden gegen
die 3 RdRp-Domänen durchgeführt, die
in den Mikrotiterplatten immobilisiert waren. Elutierte Phagen wurden
dazu verwendet, um TG1-Zellen zu infizieren und mit M13Ko7 Helferphagen
gerettet. Der Kulturüberstand,
der die polyklonalen Phagen aus jeder Runde enthielt, wurde dazu
verwendet, um die Bindung an Zielproteine durch ELISA zu untersuchen.
Um die Bindung von monoklonalen Phagen-scFv zu untersuchen, wurden
einzelne Kolonien von Titrationsplatten der 3. Runde kultiviert
und durch ELISA getestet. Die Klone, die die höchsten Signale ergaben, wurden
dazu ausgewählt,
um HB2151-Zellen zu infizieren, um dann lösliche scFv's zu exprimieren.
Die infizierten HB2151-Zellen wurden durch IPTG induziert und der Überstand,
der lösliche
scFv's enthielt, wurde durch ELISA und Western-blot untersucht.
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Reinigung von scFv's
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E. coli HB2105, infiziert mit ausgewählten monoklonalen
Phagen wurde in einem LB-Medium
angezogen, das mit 1 % Glucose ergänzt war, bis zu einer Dichte
von OD600 = 0,8 und dann über Nacht
mit 1 mM IPTG bei 30°C
induziert. Die induzierten Zellen wurden geerntet und die scFv's
wurden aus dem Überstand
mit einer Protein-L Säule
gemäß den Anweisungen
des Herstellers gereinigt. Die scFv's wurden mit 0,1 M Glycin pH
2,0 eluiert. Jede Fraktion wurde durch Western-blot getestet, und
unter der Verwendung eines Anti-myc Antikörpers. Die Fraktionen, die
scFv's enthielten wurden vereinigt und gegen PBS-Puffer dialysiert.
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Herstellung von RNA-Templaten
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DI-72(–) wurde als RdRp-Templat hergestellt
und für
die in vitro Tests verwendet. Nach T7 RNA-Transkription und Phenol/Chloroform
Extraktion wurden nicht inkorporierte Nukleotide durch wiederholte
Ammoniumacetat/Isopropanolfällung
entfernt. Nach Ethanolfällung
wurden die RNA-Transkripte in sterilem Wasser gelöst und ihre
Menge und Größe durch
ein UV-Spektrophotometer gemessen und auf einem 5% Polyacrylamid/8
M Harnstoffgel (denaturierende PAGE) analysiert.
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ScFv-vermittelte Inhibierung
von RdRp, in vitro-Test.
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Ein CNV Replikase-Komplex wurde wie
beschrieben durch Nagy & Pogany
(Nagy PD, Pogany J. Partial purification and characterisation of
Cucumber necrosis virus and Tomato bushy stunt virus RNA-dependent RNA
polymerases similarities and differences in template usage between
tombusvirus and cannovirus RNA-dependent RNA polymerases. Virology.25;276(2):279-88.(2000))
hergestellt. Die teilweise gereinigte CNV RdRp (10 μl) und verschiedene
Mengen von scFv von 0,1 μg
bis 0,3 μg
wurden jeweils gemischt und bei 0°C
für 30
min inkubiert. Dann wurde die RdRp-Reaktion wie vorher beschrieben
durchgeführt,
mit der Ausnahme, daß die
Reaktion bei 25°C
für 2 Stunden
inkubiert wurde. Jede RdRp-Reaktion
enthielt 3 μg
Templat-RNA. Nach Phenol/Chloroform Extraktion und Ammoniumacetat/Isopropanolfällung wurden
die RdRp-Trankriptionsprodukte auf 20- oder 30-cm-langen denaturierenden
5%PAGE/8 M Harnstoffgelen analysiert, gefolgt von Analyse mit einem
Phosphorimager, wie im Stand der Technik beschrieben.
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ScFv-vermittelte Inhibierung
von RdRp, in vivo-Test (Agrobakterium-Infiltration)
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Die cDNA-Fragmente, die für die ausgewählten scFv's
kodierten, wurden durch PCR mit 5'spezifischen Primern amplifiziert,
die eine NcoI-Stelle einführten
und 3'spezifischen Primern, die eine NotI-Stelle einführten. Diese
Restriktionsstellen wurden für
Subklonierung in pRTI eingeführt,
welcher den 35S Promotor und den Blumenkohl-Mosaikvirus-Terminator
enthält.
Die Expressionskassetten wurden in die HindIII-Stelle des pGJ-Pflanzen-Expressionsvektors
kloniert. Agrobacterium tumefaciens Stamm ATHV wurde mir jedem der
Expressionsplasmide durch Elektroporation transformiert. Die Agrobakterien
wurden in die Blätter
von fünf
N. benthamiana-Wildtyp-Pflanzen wie beschrieben infiltriert (Y.
Yang, R. Li and M. Qi. In vivo analysis of plant promoters and transcription
factors by agroinfiltration of tobacco leaves. The Plant Journal.
22(6):543-551(2000)). 4 Tage nach der Infiltration wurden die infiltrierten
Blätter
mechanisch mit 1 μg
TBSV-BS3-Viruspartikeln beimpft und die lokalen und systemischen
Symptome wurden nach 7, 14 und 25 Tagen nach der Beimpfung untersucht.
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ScFv's-vermittelte Inhibierung
von RdRp (Expression von scFv's über
einen infektiösen
Klon des homologen Virus)
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Ein infektiöser Vektor (FC811) wurde durch
Entfernung des Großteils
des Hüllenproteingens
in Leserahmen 3 des Vollängen
TBSV-BS3-Klons entfernt, indem eine multiple cloning Site in diese
Region eingeführt wurde.
Die cDNA-Fragmente, die für
die ausgewählten
scFv's kodierten, wurden durch PCR mit 5'spezifischen Primern, die
eine SphI-Stelle einführten
und 3'spezifischen Primern, die eine KpnI-Stelle einführten amplifiziert, um
in den infektiösen
Klon FC811 subkloniert zu werden. Das mit SmaI linearisierte Plasmid
wurde als Templat für
die in vitro-Transkription verwendet und zur mechanischen Beimpfung
auf N. benthamiana-Wildtyppflanzen (vier
Pflanzen pro scFv). Die Virusinfektion wurde durch Nachweis von
lokalen und systemischen Symptomen nach der Beimpfung verfolgt.
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Epitopkartierung
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Verschiedene Fragmente der TBSV-Replikase,
die verschiedene Motive darstellen wurden kloniert, expremiert und
gereinigt gemäß dem bei
der Reinigung der scFv's beschriebenen Verfahren. 96/Napf Mikotiterplatten
(Nunc Maxisorb) wurden mit 1 μg
der verschiedenen Antigene beschichtet. Die Bindung von scFv's an
die verschiedenen Replikasefragmente wurde durch ELISA mit Anti-myc
und alkalischer Phosphatase(AP)-konjugiertem und Anti-Maus Antikörpern nachgewiesen,
gefolgt von Inkubation in Substratpuffer. Die Absorption wurde bei
405 nm in einem Spektrophotometer gemessen.
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Proteinexpression und Phage-Display
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Trotz Versuche mit verschiedenen
Kombinationen von Plasmiden und Wirtsstämmen, sowie mit verschiedenen
Bedingungen von Temperatur, pH und IPTG Konzentrationen konnten
Fragmente der RdRp in löslicher
Form in E. coli nicht exprimiert werden. Wir verwendeten daher die
denaturierten gereinigten Proteine als Antigene zur Selektion von
scFv's aus der Phagenbibliothek. Die Anreicherung von positiven
Gebundenen in jeder Runde der Phage-Display-Selektion konnte durch erhöhten Phagentiter
nachgewiesen werden. Die monoklonalen Phagen ergaben positive Signale
sowohl in ELISA und Western-blots, was vermuten läßt, daß die Bindungsstellen
dieser scFv's lineare Epitope sind. Die scFv's, die die höchsten Signale
in sowohl ELISA und Western-blot ergaben, wurden mit Protein-L gereinigt
und für
weitere Experimente verwendet. In der vorliegenden Erfindung wurden
somit das erste Mal unseres Wissens nach denaturierte Proteine zur
erfolgreichen Selektion von scFv's in Phage-Display verwendet.
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In vitro-Test
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Um das Potential von ausgewählten scFv's
zu untersuchen die virale Replikase zu inhibieren, ist der Nachweis
von de novo-Produkten, die von der zu untersuchenden RdRp transkribiert
wurden, das bevorzugte Verfahren. CNV und TBSV gehören zu derselben
Gruppe von Viren (Tombusvirus) und ihre RdRp's sind relativ homolog.
Der Vergleich des Templat-Gebrauchs der TBSV und CNV-RdRp's ergab
keine signifikanten Unterschiede zwischen den zwei Replikasen (Nagy,
2000). Die Ergebnisse zeigen, daß die vier ausgewählten scFv's die
CNV RdRp inhibieren. Wie in 1 gezeigt,
wurde die RNA-Synthese durch die ausgewählten scFv's in verschiedenem
Ausmaß blockiert,
sogar wenn die Menge von scFv zu niedrig wie 98 ng war. Kontrollreaktionen
zeigten, daß der
inhibitorische Effekt dieser scFv's nicht aufgrund von Abbau des
RNA-Templats durch eine mögliche
Kontamination mit Nuklease in den scFv -Präparationen war. Da gezeigt
werden konnte, daß scFvp55
zu der größten Inhibierung
der RdRp führte,
wurde dieser scFv für
weitere Untersuchungen verwendet.
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Rüben
"Crinkle" Virus (TCV) ist ein Carmovirus, der ebenfalls zur Familie
von Tombusviridae zählt
und seine RdRp ist aus derselben Linie, wie diejenige von TBSV und
CNV. Kürzlich
wurde gezeigt, daß TCV
RdRp, exprimiert in E. coli, eine RdRp-Aktivität in vitro zeigt. Um weiterhin
zu untersuchen, ob unsere scFv's ebenfalls die RdRp von TCV inhibieren
können,
wurde ein Inhibierungstest mit scFvp55 durchgeführt (1). Das Ergebnis zeigt klar, daß scFvp55
ebenfalls die Aktivität
von TCV RdRp in vitro stark inhibiert (2).
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Um den Effekt von verschiedenen Templaten
und Temperaturbedingungen auf die RdRp-Inhibierung zu untersuchen, wurde zunächst die
Inhibierung von beiden Minus- und Plussträngen durch Verbindung von teilweise
gereinigter CNV RdRp untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß verschiedene
Template das Ausmaß der
Inhibierung der RdRp nicht beeinflussen. Wenn scFv's und RdRp bei
25°C inkubiert
wurden, war die Inhibierung der RNA-Syntese jedoch effizienter blockiert,
als bei 4°C.
Interessanterweise konnte die RNA-Synthese nicht inhibiert werden,
wenn scFv's nur nach dem Beginn der Transkription des Templats durch
die RdRp hinzugegeben wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten,
daß die
Bindungsstelle von scFv's die Konformation verändert, wenn die Aktivität der RdRp
beginnt. Dies führt
dazu, daß die
scFv's keinen Zugang mehr zur Bindungsstelle auf der RdRp haben.
Es bestätigt
ebenfalls die Schlußfolgerung,
daß der
abnehmende Titer von transkribiertem Templat an der Inhibierung
der RdRp-Aktivität
durch die scFv's begründet
war, und nicht aufgrund von irgendeiner Kontamination in den scFv-Präparationen.
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In vivo-Test
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Die scFv-vermittelte Inhibierung
von viraler RdRp wurde ebenfalls in vivo untersucht, um zu bestätigen, daß die Aktivität der RdRp
auch in Pflanzenzellen durch ausgewählte scFv's inhibiert werden
kann. Zwei Verfahren wurden entwickelt, um die Inhibierungsaktivität zu untersuchen.
Zunächst
wurden intakte Blätter vom
Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen mit einer Agrobakterium-Suspension
infiltriert, die zu der cytoplasmatischen Expression der verschiedenen
scFv's führte.
Ein scFv, der die RdRp nicht betraf (scFv Grud), wurde im Test eingeschlossen,
um den Effekt der Expression von heterogenen Proteinen nach der
viralen Infektion auszuschließen.
Drei Tage nach der Agro-Infiltration wurden TBSV-Viruspartikel mechanisch
auf infiltrierte Blätter beimpft.
Dies simuliert die Situation in einer transgenen Pflanze, in der
Viren Blätter
infizieren, die das entsprechende scFv konstitutiv exprimieren.
Um zu Bestätigen,
daß die
transiente Expression funktionell war, wurde ein Blatt von jeder
Charge von infiltrierten (nicht-Virus-beimpften) Pflanzen vier Tage
nach der Infiltration geerntet und die Proteinexpression (scFv)
wurde durch Western-blot gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß scFv's in
infiltrierten Blättern
leicht exprimiert werden können
(3c). 7 Tage nach der Virusbeimpfung
entwickelten die Pflanzen, die scFv Grud, 28H3 und H1E11 exprimierten
eine systemische Infektion (1A). Die
Pflanzen, die scFvH2C6 und P55 exprimierten zeigten jedoch zur selben
Zeit keinerlei Symptome von systemischer Infektion. Am Tag 15 begann
der Virus jedoch auch in den scFvH2C6 und P55 exprimierenden Pflanzen
zu akkumulieren. Diese Verzögerung
der systemischen Infektion in diesen Pflanzen kann durch die abnehmende Expression
von scFv's in Pflanzen nach Agro-Infiltration verursacht sein. Dies
wird durch die Western-blot-Analyse gestützt, die zeigt, daß die scFv's
nach 15 Tagen nach Infiltration nicht mehr nachgewiesen werden konnten
(3D).
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Die verringerte Empfindlichkeit gegenüber viralen
Infektionen liegt nicht an dem durch die Agro-Infiltration verursachten
Streß auf
die Pflanzen, wie durch die mit scFv Grud infiltrierten Pflanzen
gezeigt wird. Diese Pflanzen zeigten dieselbe Empfindlichkeit gegenüber viraler
Infektion als Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen.
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In einem zweiten Experiment wurden
die scFv-Gene in einem infektiösen
Klon von TBSV kloniert, der durch die Erfinder hergestellt wurde,
wobei der größte Teil
des offenen Leserahmens 3, der für
das Hüllenprotein
von TBSV kodiert, durch die entsprechende cDNA ersetzt ist. Gemäß Scholthoff
et al (Scholthof HB, Scholthof KB, Kikkert M, Jackson AO. Tomato
bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function
in eell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology.10;213(2):425-38
(1999)) ist das Hüllenprotein
nicht für
die systemische TBSV-Infektion in Wirtspflanzen erforderlich und
ist daher für
unsere Experimente vernachlässigbar.
Während
der infektiöse
Klon repliziert, wird das heterogene Gen von der subgenomischen
RNA1 (sgRNA1) ähnlich
dem Hüllenproteingen
im Wildtypvirus exprimiert. Daher wurde in vitro transkribierte
RNA, die die verschiedenen scFv-Gene enthielt, dazu verwendet, um
Wildtyp N. Benthamiana-Pflanzen mechanisch zu beimpfen, um die inhibierende
Aktivität
der verschiedenen scFv's auf die virale Replikase zu untersuchen.
7 Tage nach der Beimpfung, wurde eine systemische Infektion in beimpften
Pflanzen beobachtet, die scFv Grud und 28H3 exprimierten, jedoch
nicht Pflanzen, die die anderen scFv's exprimierten. Nur ein paar
lokale Symptome konnten in inokulierten Blättern von H2C6, H1E11 und P33
gefunden werden. Qiu et al (2000)verfolgten die Anreicherung von
genomischer RNA (der exprimierte Leserahmen für die virale Replikase), sgRNA1
(der exprimierende Leserahmen für
das Hüllenprotein)
und sgRNA2 (der exprimierte Leserahmen für das Movement-Protein) von
TBSV in infizierten Protoplasten. Die Autoren beobachteten, daß sgRNA2
normalerweise mit gRNA gemeinsam auftritt und das sgRNA1 nur ein
paar Stunden später erscheint.
Es ist bekannt, daß die
Replikase, die von gRNA translatiert wird, die Regulation von sgRNA1
und 2 reguliert. Da die scFv's in den offenen Leserahmen 3 kloniert
waren, der über
sgRNA1 exprimiert wird, der in Pflanzenzellen nach gRNA erscheint
kann die Inhibierung der Replikase durch scFv nicht in der sehr
frühen Phase
der Replikation/Infektion auftreten und daher nicht zu einer vollständigen RdRp-Inhibierung
führen.
Dies läßt vermuten,
daß bei
Beginn der Infektion, bevor die scFv-Herstellung stattfindet, einiges
virales Material sich in ausreichenden Mengen ansammelt, um lokale
Symptome in beimpften Blättern
zu verursachen und Zelle- zu Zellebewegung einiger gRNA, was die
Entwicklung von lokalen Symptomen in Pflanzen erklärt, die
mit dem infektiösen
TBSV-Klon infiziert wurden, der die Gene für scFv H2C6, H1E11 und P55
trägt.
Um den Virus-Titer in beimpften Pflanzen zu verfolgen, wurden Sub-Beimpfungsexperimente
mit Pflanzensaft von apikalen Blättern,
mit jeder der Pflanzen durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, daß drei
Tage nach der Infektion nur Pflanzen, die mit Inokulat von Pflanzen,
die scFv Grud und 28H3 beimpft wurden, lokale Symptome in beimpften Blättern zeigten
und Pflanzen, die nur scFv Grud exprimierten, zeigten systemische
Infektionen vier Tage nach Beimpfung. Diese Ergebnisse zeigen eine
fast vollständige
Reduktion des viralen Titers in Pflanzen, die scFvH2C6, H1E11 und
P55H9 exprimierten. Diese Ergebnisse zeigen, daß scFv28H3 weniger aktiv bei
der Inhibierung der RdRp-Aktivität
ist, was als Konsequenz zu einiger Akkumulation und Translation
von gRNA und sgRNA1 in den infizierten Pflanzen führt. Dies
führt auch
zu lokaler Infektion und sub-inokulierten Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen.
Die Menge von in den Sub-Inokulationsexperimenten
transferierter viraler RNA und die weitere Herunterregulierung durch
den scFv, der von dem viralen Genom expremiert wurde verhinderte
jedoch sie Etablierung von systemischer Infektion in den Wildtyp
N. benthamiana-Pflanzen, sogar im Fall von scFv28H3.
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Darüber hinaus wurden 21 Tage nach
Infektion inokulierte Blätter
von jeder Charge der scFvexprimierenden Pflanzen geerntet und die
Anreicherung der scFv's wurde durch Western-blot untersucht. Die
Ergebnisse zeigten, daß nur
der scFv Grud 21 Tage nach Inokulation nachge wiesen werden kann
und sich im Vergleich zu Tag 4 und Tag 7 nach der Beimpfung anzureichern
scheint.
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Dieses Ergebnis unterstützt die
Schlußfolgerung,
daß die
virale Resistenz an der Inhibierung der viralen RdRp durch die scFv's
liegt. Da scFv Grud die virale RdRp nicht beeinflußt, wird
die Expression diese scFv die RdRp-Aktivität im Transkriptionsprozeß nicht
inhibieren und konsequenterweise sich im Replikationsprozeß anreichern.
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Die vorliegende Erfindung zeigt zum
ersten Mal, daß Antikörper direkt
aus dem viralen Genom exprimiert werden können, dessen Replikation sie
herunter regulieren sollen. Dieser Test ist daher besonders brauchbar,
da die virale RNA und das inhibierende Mittel in einem 1-Schritt-Verfahren
gleichzeitig der Pflanze zugeführt
werden können
und daher die Wirkung der Antikörper
optimiert wird. Die Ergebnisse der RdRp-Inhibierungstests in vitro
und in vivo zeigen klar, daß scFv's
P55 und H2C6 eine hohe RdRp-Inhibierungsaktivität aufweisen, wohingegen scFv's
28H3 und H1E11 die RdRp-Aktivität
nur zu einem bestimmten Ausmaß inhibieren.
Zusammenfassend sind die scFv's P55 und H2C6 die besten Kandidaten
für eine
RdRp-Inhibierung und die Produktion von Virus-resistenten transgenen
Pflanzen.
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Epitopkartierung
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Um die Bindungsdomäne der verschiedenen
scFv's exakt zu definieren, wurde eine Epitopkartierung durchgeführt. Verschiedene
Fragmente der TBSV RdRp wurden in Expressionsvektoren kloniert und
in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Die überexprimierten Zielproteine
wurden wie beschrieben gereinigt. Die Bindungsaktivität jeder
der scFv's an die verschiedenen Antigene wurde durch ELISA wie beschrieben
nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß alle der vier scFv's. in
der Motiv E-Region binden. Das Motiv E von TBSV "RDRP" wird als
eine ?-Helix Konformation aufweisend vermutet, es ist jedoch unbekannt,
ob sie auch als eine "Daumenklammer" fungieren kann. Unsere Ergebnisse
zeigen, daß die
Bindung von unseren scFv's an diese Region die Aktivität von RdRp
verschwinden läßt. Jedoch
können
die scFv's nach Beginn der Trankription nicht binden und die RdRp-Aktivität inhibieren
(gefunden in den in vitro-Ergebnissen). Zusammengefaßt stützen die
Daten die Hypothese, daß das
Motiv E der getesteten RdRp als eine Daumenklammer während der
Bindung des Templats fungiert und daher für die RdRp-Aktivität besonders
wichtig ist. Die Vergleichsergebnisse des Motiv E der RdRp's von
TBSV, CNV (Tombusvirus) und TCV (Carmovirus) zeigen hohe Homologie,
was die Ergebnisse erklärt
und unterstützt,
daß unsere
scFv's in der Lage sind, die RdRp von verschiedenen Gruppen von Viren
zu inhibieren. Koonin (Koonin, E. V, The phytogeny of RNA-dependent
RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. Journal of General
Virology 72, 2197-2206 (1991)) zeigte, daß die TBSV RdRp zur Supergruppe
2 von positiv-Strang
viralen RdRp's gehört,
die vier verschiedene Gruppen von viralen Polymerasen umfaßt. Diese
werden in (i) Tombus-, Carmo- und Dianthovirus, (ii) Pestivirus,
(iii) Flavivirus und (iv) ssRNA Bakteriophagen klassifiziert. Der
Cystein-Rest im Motiv E ist in allen RdRp's dieser Supergruppe 2
enthalten. Die E, V, E/P, F, C, Q/S Reste in Motiv E sind in allen
Gruppen konserviert, mit Ausnahme der Gruppe (iv). Diese Daten lassen
vermuten, daß die
vorliegenden scFv's auch die RdRp's von anderen (Pflanzen) Viren
in dieser Supergruppe inhibieren können, die nicht zu Gruppe I
gehören.
Transgene Pflanzen, die die funktionellen scFv's exprimieren, werden
ein attraktives Werkzeug sein, um die scFv-vermittelte Inhibierung
von viralen RdRp's von verschiedenen Virusfamilien zu untersuchen,
da sie leicht mit den zu untersuchenden Viren beimpft werden können, gefolgt
von einer sorgfältigen Überwachung
einer möglichen
Virusinfektion.
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Bindungsaktivität von scFv's
an HCV RdRp
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Da auch die RdRp's von menschlichen
Viren zur selben Supergruppe wie die Pflanzenviren-RdRp's gehören, wurde
auch die Bindungsaktivität
der vorliegenden scFv's zu der HCV RdRp untersucht. Das Hepatitis
C-Virus (HCV) gehört
zu der Familie der Flaviviridae und seine RdRp stammt aus der Pesti-Linie.
Die HCV RdRp wurde erfolgreich in vitro exprimiert und konnte als
für die
virale Replikation in vitro essentiell gezeigt werden (Lohmann V,
Korner F, Herian U, Bartenschlager R. Biochemical properties of
hepatitis C virus NS5B RNAdependent RNA polymerase and identification
of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity.
J Virol 1997 Nov;71(11):8416-28). HCV NS5B enthält Motive, die von allen RdRp's
geteilt werden. Als ein individuelles Merkmal führt die Interaktion zwischen
den Fingern und Daumen Subdomäne
der HCV RdRp's zu einem vollständig
eingeschlossenen aktiven Zentrum. Unsere Epitopkartierung zeigte,
daß die
Bindungsstelle aller scFv's sich in der Motiv E-Region befindet.
Der Abgleich der Aminosäuresequenzen,
die die E Motive von TBSV und HCV RdRp abdeckten zeigte, daß diese
RdRp's einige Aminosäurehomologien
im Motiv E teilen, nämlich
L, E, C, V, D und G. Die Mutation von Aminosäuren in dieser Region zeigte,
daß die
hydrophoben Reste in diesem Motiv für die Interaktion mit der Handflächenkernstruktur
wichtig sind. Basierend auf diesem Homologien wurde untersucht,
ob die scFv's an die HCV RdRp binden können. Daher wurde ein ELISA-Test
durchgeführt
der zeigte, daß die
scFv's ebenfalls an HCV RdRp binden können (siehe 5). Die Bin dungsaffinität war jedoch
geringer, als die Bindungsaffinität von Amab, der als die HCV
RdRp erfolgreich inhibierend gezeigt wurde (Bartenschlager R, Lohmann
V. Replication of hepatitis C virus. J Gen Virol 2000 Jul;81(Pt
7):1631-48). Diese geringe Bindungsaktivität kann wie folgt erklärt werden
(i) TBSV und HCV RdRp zeigen nur einige Reste, die unter Umständen nicht
ausreichend sind, um eine starke Bindungsreaktion von den vier scFv's
mit der HCV RdRp zu induzieren. (ü) Die Homologieregion wird
als einen α β-Strang-Turn-β-Strang Struktur in
der HCV RdRp ausbildend vermutet, jedoch als eine ?-Helix in der
TBSV RdRp. Der Unterschied in der Konformation kann ebenfalls die
Bindungsaktivität
der scFv's zu RdRp stark beeinflussen. Es ist jedoch in jedem Fall
ein sehr vielversprechendes Ergebnis, daß die scFv's in der Lage sind, die
RdRp von nur entfernt verwandten Viren zu binden. Dies läßt vermuten,
daß eine
Breitbandvirusresistenz durch das Abzielen auf konservierte Motive
in viralen RdRp's erhältlich
ist.