DE10234116A1 - Verfahren zur Expression von gegen virale Proteine gerichtete scFv-Fragmenten in Pflanzen und deren Verwendung - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von gegen Nicht-Hüllproteine von Pflanzenviren gerichtete "single-chain Fv" (scFv)-Fragmente in Pflanzen und deren Verwendung zur Bekämpfung von viralen Erkrankungen in Pflanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Expression eines scFv gegen ein Motiv der "Palm"-Domäne einer viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp). Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten scFv-Fragmente zur Behandlung von anderen RNA-Viren, insbesondere des Nicht-Pflanzenvirus HCV (Hepatitis C Virus).

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von gegen Nicht-Hüllproteine von Pflanzenviren gerichtete "single-chain Fv" (scFv)-Fragmente in Pflanzen und deren Verwendung zur Bekämpfung von viralen Erkrankungen in Pflanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Expression eines scFv gegen ein Motiv der „Palm" Domäne einer viralen RNA-abhängigen RNA Polymerase (RdRp). Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben genannten scFv-Fragmente gegen durch Pflanzenviren der Gruppe Tombusvirus (wie z.B. TBSV und CNV = Cucumber Necrosis Virus = Gurken-Nekrose Virus) und Carmovirus (wie z.B. TCV = Turnip Crincle Virus = Kohl-Verkrüpplungs Virus) verursachten Erkrnakungen. In einem letzten Aspekt betrifft die Erfindung zudem die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten scFv-Fragmente zur Behandlung von anderen RNA-Viren, insbesondere des Nicht-Pflanzenvirus HCV (Hepatitis C Virus).
  • Trotz der Anwendung von Pestiziden um die Populationen von Insekten als Überträgern zu verringern und den herkömmlichen Züchtungsansätzen, stellen Viren immer noch eine wichtige Bedrohung der landwirtschaftlichen Produktion von vielen Anbaupflanzen dar. Rekombinante Ansätze, einschließlich der Transformation von viralen Sequenzen in die Pflanzengenome kann ausreichend sein eine Virusresistenz zu übertragen, wird jedoch immer noch durch die Öffentlichkeit kontrovers diskutiert. Antikörper sind als in der Natur omnipräsent bekannt und stellen keine Bedrohung der menschlichen Gesundheit nach deren Verzehr dar. Die sogenannte „Plantibody"-übertragene Virusresistenz kann daher das Verfahren der Wahl im Hinblick auf sowohl technische und soziale Aspekte sein.
  • Die Expression von funktionellen rekombinanten Antikörpern in transgenen Pflanzen wurde während der letzten 10 Jahre entwickelt (zusammengefaßt durch Fiedler, U., 0. Artsaenko, J. Phillips and U. Conrad. Transgenic plants- a low tost production system for recombinant antibodies, in Harper, K. and A. Ziegler (eds.):Recombinant Antibodies-applications in plants science and plant pathology. Taylor and Francis, London, 1999, pp. 129-144 (1999), Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N. Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol Chem. 380(7-8):825-39 (1999), De Jaeger, G., De Wilde C., Eeekhout D., Fiers E., Depieker A. The plantibody approach: expression of antibody genes in plants to modulate plant metabolism or to obtain pathogen resistance. Plant Molecular Biology 43: 419-428 (2000)). Rekombinante Antikörper wurden auch als in verschiedene Kompartimente von Pflanzenzellen gerichtet (beschrieben durch Fiedler U, Conrad U High level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds Bio/Technology 10, 1090-1094 (1995)) sowie als exprimiert in Speicherorganen, wie Samen (Fiedler und Conrad, 1995) und Kartoffelknollen (Artsaenko 0., Kettig B., Fiedler U., Conrad U., During K. Potato tubers as a biofactory for recombinant antibodies Mol. Breeding 4: 313-319 (1998)) gezeigt. Rekombinante Antikörper wurden ebenfalls zur Immunmodulation von Hormonfunktionen verwendet (Artsaenko 0, Peisker M, zur Nieden U, Fiedler U, Weiler EW, Muntz K, Conrad U. Expression of a single chain Fv antibody against abscisic acid creates a wildtype phenotype in transgenic tobacco. Plant J 8: 745-750 (1995), Phillips, J., Artsaenko 0, Fiedler U, Horstmann C, Mock H-P, K. Muntz K, Conrad U. Seed-specific immunomodulation of abscisic acid activity induces a developmental switch. EMBO J. 16,4489-4611 (1997)).
  • Alle positiv-Strang RNA-Viren kodieren für eine RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRp), die als die katalytische Untereinheit bei der Replikation des viralen Genoms fungiert. Konservierte Motive wurden innerhalb dieser viralen Proteine identifiziert, die an spezifischen Funktionen bei der Genomreplikation, wie z.B. Polymerase- Helikase- und RNA-capping Aktivitäten beteiligt sind (Koonin, E. V, The phytogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology 72, 2197-2206 (1991), Rozanov, M.N., Koonin, E.V. and Gorbelenya A.E. Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark of the "Sindbis-like" supergroup of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology.73, 2129-2134 (1992)). Im Augenblick bestehen 8 konservierte RdRp Motive (Koonin, E. V, The phytogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology 72, 2197-2206 (1991), Poch, 0., Sauvageut, I., Delarue, M. and Tordo, N. Identification of four conserved motifs among RNAdependent polymerase encoding elements. EMBO Journal 8, 3867-38-74 (1989)). Vier dieser 8 konservierten Motive sind als in allen Klassen von Polymerasen vorhanden bekannt und führen zu dem katalytischen Teil der sogenannten "Palm" oder auch "Handflächen"-Domäne" (Hansen, J.L. Long, A.M. and Schulz, S.C. Structure of RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. Structure 5, 1109-1122(1997), Ollis, D.L., Brick, P., Hamlin, R., Xuong, N.G. and Steitz, T.A. Structure of large fragments of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP. Nature 313, 762-766 (1985)). Diese funktionellen Domänen erscheinen als ein vielversprechendes Ziel für die antivirale Intervention und könnten eine Art von Breitspektrum-Resistenz ermöglichen.
  • Der Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV; Tomatenzwergbusch-Virus), ein Mitglied der Gruppe der Tombusviren, ist ein kleiner kugelförmiger Pflanzenvirus, der ein einzelnes positiv-Sinnstrang-RNA-Genom von 4775 Nukleotiden enthält, das für 5 Gene kodiert. Der erste offene Leserahmen kodiert für ein 33-kDa Protein, das als an der viralen RNA-Replikation beteiligt nachgewiesen wurde, jedoch erhält seine Aminosäuresequenz keine bekannten Motive, die es als ein solches Protein definieren würden. Das Lesen über das Amber Stopcodon des p33 offenen Leserahmens führt zu der Translation eines 92 kDa Fusionsproteins, dessen durchgelesener Teil hochkonservierte Motive enthält, die in den katalytischen Untereinheiten von RdRp's gefunden werden. Die Produkte der offenen Leserahmen 3 (Hüllenprotein) und Leserahmen 5 („nested p19/p22 movement" Proteine) werden jeweils von 2 subgenomischen (sg) m-RNA's translatiert. Das TBSV-92kDa Protein enthält Motive, die von allen RdRp's geteilt werden und besitzt die klassischen Finger, Handflächen ("palm") und Daumen("thumb) untereinheiten.
  • Als Wirtsspektren der hier näher betrachteten RNA-Viren befallen Tombus-, Carmo- und Dianthoviren nur dicotyledone Wirtspflanzen, bei TBSV wurde in mehr als 120 Spezies aus mehr als 20 Familien gefunden, so z.B. Tomate, Artischocke, Geranie, Petunie, Kirsche, Pfeffer, Nelke und Wein. CNV wird nur in Gurke (Cucumis sativus), Cowpea (Vigna sinensis) und Zinnie (Zinnia elegans) systemisch, führt aber bei verschiedenen Spezies von Amaranthacaen, Chenopodiacaen, Compositen, Cucubitacaen, Leguminosen und Solanacaen zu Lokalinfektionen. TNC führt zu Infektionen in Kohl und Brassica-Arten. Flaviviren infizieren Vertebraten (einschließlich Mensch) und Pestiviren Säugetiere (einschließlich Mensch).
  • Tavladoraki et al. (Tavladoraki P, et al. Nature 1993 Dec 2;366(6454):469-72) beschreiben transgene Pflanzen, die einen funktionellen single-chain Fv Antikörper exprimieren und dadurch gegen einen spezifischen Virusangriff geschützt sind, in diesem Fall gegen den icosahedralen Artischocke "mottled crinkle" Tombusvirus. Zudem wird durch die Expression lediglich eine Verringerung der Infektionshäufigkeit und eine Verzögerung dr Symptome erreicht.
  • McCormick et al. (Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Jan 19;96(2):703-8) beschreiben die Herstellung von spezifischen Lymphoma-Impfstoffen durch Expression des Tumor-abgeleiteten single-chain Fv Epitops in Tabakpflanzen.
  • Franconi et al. (Franconi R, et al. Immunotechnology 1999 Mar;4(3-4):189-201) beschreiben die funktionelle Expression eines scFv Antikörperfragments gegen Tospoviren, insbesondere den Tomaten "spotted wilt" Tospovirus (TSWV), in Bakterien und Pflanzen. Das scFv Antikörperfragment stammte von einem Antikörper gegen ein Epitop des Glycoproteins G1, eines "envelope" spezifischen Virusproteins. Lediglich die Produktion von sekretierten Fragmenten war erfolgreich. Zudem wird das PVX Virus-Vektorkonstrukt verwendet, das kein infektiöser Klon des homologen Virus ist, gegen das der scFV Antikörper gerichtet ist. Ähnlich beschreiben Hendy et al (Hendy S, et al. J Immunol Methods 1999 Dec 10;231(1-2):137-46) die Produktion eines Hüllprotein spezifischen scFv Antikörperfragments in Pflanzen auf Basis des Kartoffelvirus X (PVX) episomalen Vektors. Hierbei soll die Pflanze nicht gegen virale Infektion geschützt werden. Fecker et al. (Fecker LF, et al. Plant Mol Biol 1996 Dec;32(5):979-86) beschreiben die Expression eines scFv Antikörperfragments gegen Rüben "necrotic yel-low vein" Virushüllenprotein in Nicotiana benthamiana.
  • WO 96/27612 beschreibt die Produktion von stabilen Antikörperfragmenten in Hefezellen. US 5,316,931 beschreibt Pflanzen virale Vektoren, die heterologe subgenomische Promotoren aufweisen, zur systemischen Expression von fremden Gene. US 5,811,653 beschreibt die virale Amplifikation von rekombinanter messenger RNA in transgenen Pflanzen.
  • Die Brauchbarkeit des immunmodulierenden Ansatzes wurde erfolgreich für menschliche Viren angewendet (Marasco, W.A. Intracellular antibodies (intrabodies) as research reagents and therapeutic molecules for gene therapy. Immunotechnology 1, 1-19 (1995)), jedoch ist deren Anwendung in der Pflanzenvirologie unterrepräsentiert. Bis heute wurden lediglich die Expressionen von rekombinanten Antikörpern gegen Hüllproteindomänen (CP) von Pflanzenviren berichtet. Bei der Expression von Anti-TMV-CP-Antikörpern konnten Voss et al. (Voss A, Niersbach M, Hain R, Hirseh HJ, Liao YC, Kreuzaler F, Fischer R. Reduced virus infectivity in N. tabaccum secreting aTMV-specific full-size antibody. Mol. Breed. 1: 39-50 (1995)) eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber TMV in Tabakpflanzen zeigen. Auch ergab die intrazelluläre Expression von scFv gegen die CP von TMV eine verbesserte Virusresistenz gegen TMV (Zimmermann S, Sehillberg S, Liao Y-C, Fischer R. Intracellular ex pression of TMV-specific single chain Fv fragments leads to improved virus resistance in Nicotiana tabacum. Mol. Breed. 4:369-379 (1998)). Die Expression von Anti-CP rekombinanten Antikörpern führte jedoch nicht zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Resistenzstrategien gegen Pflanzenviren. Da Hüllenproteine von Pflanzenviren eine hohe Variabilität zeigen, können in Pflanzen Breitspektrum-Resistenzen nicht erwartet werden. Darüber hinaus akkumulieren sich Hüllproteine in großen Mengen in Pflanzenzellen, was es. schwierig macht, einen ausreichend hohen scFv-Titer in den Pflanzenzellen zu erreichen, um eine voll-ständige Neutralisierung des Antigens zu erhalten.
  • Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Therapie von pflanzenviralen Erkrankungen dadurch entscheidend zu verbessern, daß in den Pflanzen effektive scFv-Fragmente exprimiert werden, die sich gegen ein breites Spektrum von RNA-Pflanzenviren einsetzen lassen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die in den Pflanzen produzierten scFv-Fragmente zur Therapie von RNA Viruserkrankungen zu verwenden.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten scFv-Fragments in einer Pflanze gelöst, das ein zur Verfügung stellen einer DNA, die für ein nicht gegen virale Hüllproteine gerichtetes scFv-Fragment kodiert, die Klonierung der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transformation oder Infektion einer Pflanze mit dem Vektor, und die Expression des nicht gegen virale Hüllproteine gerichteten scFv-Fragments in der Pflanze umfaßt.
  • Bis heute wurden lediglich die Expressionen von rekombinanten Antikörpern gegen Hüllproteindomänen (CP) von Pflanzenviren berichtet. Die Expression von Anti-CP rekombinanten Antikörpern führte jedoch nicht zu einer bemerkenswerten Verbesserung der Resistenzstrategien gegen Pflanzenviren. Darüber hinaus akkumulieren sich Hüllproteine in großen Mengen in Pflanzenzellen, was es schwierig machte, einen ausreichend hohen scFv-Titer in den Pflanzenzellen zu erreichen. Daher weicht die vorliegende Erfindung vom Konzept der Hüllproteine ab, in dem nicht-Hüllproteine verwendet werden, die die oben genannten Nachteile nicht aufweisen.
  • Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist. Diese RdRp hat sich überraschenderweise als ideales Target für die Herstellung von scFv-Fragmenten erwiesen. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist, die aus der Supergruppe 2 von positiv Strang viralen RdRps, und insbesondere von einem Virus der (i) Tombus-, Carmo-, und Dianthoviren, insbesondere CNV, TCV oder TBSV, (ii) Pestiviren, (iii) Flaviviren, insbesondere HCV oder (iv) ssRNA Bakteriophagen, abstammt.
  • Innerhalb der oben genannten RdRps kann das erfindungsgemäße Verfahren gegen konservierte Bereiche der RdRp gerichtete scFv-Fragmente zur Verfügung stellen, wobei besonders die scFv-Fragmente, die gegen die Handflächen ("palm") Domäne einer viralen RdRp gerichtet sind, bevorzugt sind.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäß hergestellten scFv-Fragmente, insbesondere die VH und/oder VL-Ketten eines scFv-Fragments, insbesondere die VH-Ketten der scFv H2C6 (Seq ID No. 1), H1E11 (Seq ID No. 2), P55H9 (Seq ID No. 3) oder 28H3 (Seq ID No. 4), deren entsprechende scFv-Fragmente sich alle als besonders wirksam erwiesen haben, sowie deren funktionell identische Derivate, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, die die Funktion nicht verändern, oder die Marker oder sogenannte "Tags" enthalten. Die Peptide können auch in Form von Fusionsproteinen vorliegen, die das scFv-Fragment oder Ketten-Bestandteile davon als funktionellen Teil enthalten.. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Polynucleotide, die für erfindungsgemäße scFv-Fragmente kodieren, insbesondere die für die VH-Ketten der scFv-Fragmente H2C6 (Seq. ID. No 5), H1E11 (Seq. ID. No 6), P55H9 (Seq. ID. No 7) oder 28H3 (Seq. ID. 8) kodierenden Polynukleotide und deren z.B. durch stumme Mutationen veränderten homologe Sequenzen. Bevorzugt sind erfindungsgemäße Polynucleotide, die in Form einer DNA, PNA oder RNA, insbesondere einer plus-Sinnstrang-RNA, vorliegen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynucleotid enthält, insbesondere ein Vektor in For eines pET 23a+ pET 26b+- Derivats. Besonders bevorzugt ist ein rekombinanter Vektor in Form eines infektiösen Klons des Virus, in den das gegen die virale RdRp gerichtete scFv-Fragments integriert vorliegt, insbesondere TBSV-BS3-FC811. Dieser Vektor erlaubt als Testsystem die Entwicklung und Überprüfung der effektiv auf das zu bekämpfende Virus (in diesem Falle z.B. TBSV) abgestimmte Therapie von viralen Erkrankungen und kann somit eine Basis für diese Therapie bilden. Die Erfindung stellt somit das Konzept zur Verfügung, daß eine effektivere Behandlung durch die Abstimmung des Konstrukts zusammen mit dem scFv-Fragment gegen das nicht-CP erreicht werden kann. Dieser Ansatz ist den bisherigen Ansätzen in jeder Hinsicht überlegen. So betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von oder der Prophylaxe vor viralen Pflanzenerkrankungen, umfassend die Expression von rekombinanten scFv-Fragmenten in der Pflanze, die nicht gegen virale Hüllproteine gerichtet sind. Der Prophylaxe-Aspekt ist in diesem Fall ebenfalls eine erhebliche Verbesserung gegenüber en bisherigen Verfahren. Bevorzugt ist eine Behandlung, bei der das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist, die insbesondere eine Pflanzen-virale RdRp ist, die aus der Supergruppe 2 von positiv Strang Pflanzen-viralen RdRps, und insbesondere von einem Virus der Tombus-, Carmo-, und Dianthoviren, insbesondere CNV, TCV oder TBSV stammt. Bevorzugt ist dabei ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem das scFv-Fragment gegen die Handflächen ("palm") Domäne der viralen RdRp gerichtet ist.
  • Die zu behandelnden Pflanze können aus einer Vielzahl von dicotyledonen Kultur- und Anbaupflanzen, wie zum Beispiel Gurke, Tomate, Rübe, Raps, Wein, Kartoffel und/oder Tabak, insbesondere ausgewählt aus den Solanaceae sein. Als Wirtsspektren der hier näher betrachteten RNA-Viren befallen Tombus-, Carmo- und Dianthoviren Wirtspflanzen in mehr als 120 Spezies aus mehr als 20 Familien gefunden, so z.B. Tomate, Artischocke, Geranie, Petunie, Kirsche, Pfeffer, Nelke und Wein. CNV wird nur in Gurke (Cucumis sativus), Cowpea (Vigna sinensis) und Zinnie (Zinnia elegans) systemisch, führt aber bei verschiedenen Spezies von Amaranthacaen, Chenopodiacaen, Compositen, Cucubitacaen, Leguminosen und Solanacaen zu Lokalinfektionen. TNC führt zu Infektionen in Kohl und Brassica-Arten. Die vorliegende Erfindung liefert somit die Basis für die Behandlung einer Vielzahl von viralen Erkrankungen in den oben genannten Pflanzen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft schließlich die Verwendung eines oben genannten erfindungsgemäßen scFv-Polypeptids oder eines wie oben genannten erfindungsgemäßen Polynucleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von all-gemein durch Viren verursachten Erkrankungen. Dabei können auch die funktionell identischen Derivate, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, die die Funktion nicht verändern, oder die Marker oder sogenannte "Tags" enthalten zur Herstellung verwendet werden. Die Peptide können auch in Form von Fusionsproteinen vorliegen, die das scFv-Fragment als funktionellen Teil enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Polynucleotide, die für erfindungsgemäße scFv-Fragmente kodieren und deren z.B. durch stumme Mutationen veränderten homologe Sequenzen. Bevorzugt sind erfindungsgemäße Polynucleotide, die in Form einer DNA, PNA oder RNA, insbesondere einer plus-Sinnstrang-RNA, vorliegen.
  • Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung eines gegen die RdRp eines Flavivirus, insbesondere HCV, oder Pestivirus gerichteten erfindungsgemäßen scFv-Fragments oder des dafür kodierenden Polynucleotids. Flaviviren infizieren Vertebraten (einschließlich Mensch) und Pestiviren Säugetiere (einschließlich Mensch).
  • Die Erfinder haben das Konzept des Schutzes von Pflanzen gegen Virusinfektionen, basierend auf der Expression von single-chain Fv (scFv) Fragmenten gegen ein Motiv der Handflächendomäne der RNA-abhängigen RNA Polymerase (RdRp) des BS3 Isolats von Tomaten "Bushy Stunt Virus" (TBSV-BS3) verwendet. Verschiedene E. coli exprimierte Fragmente der RdRp wurden verwendet, um scFv's aus einer Phagenbibliothek auszuwählen. Die inhibitorischen Aktivitäten dieser scFv's wurden in in vitro und in vivo Experimenten untersucht. Eine Epitopkartierung zeigte, daß die vier scFv's mit dem höchsten Potential an Inhibierung auf dem Motiv E die Handflächendomäne der RdRp kartierten. Motiv E wird als eine große Rolle bei der Templatbindung spielend betrachtet und ist daher für die RdRp Aktivität essentiell. Die ausgewählten scFv's inhibierten nicht nur die Aktivität der TBSV RdRp, sondern auch die RdRp von CNV und TCV. CNV gehört zu derselben Gruppe von Viren wie TBSV (Tombusvirus), wohingegen TCV zu der eng verwandten Gruppe von Carmoviren zählt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß einige unserer scFv's an die RdRp des nur entfernt verwandten Hepatitis Virus C (HCV) binden, möglicherweise aufgrund einiger Sequenzhomologien in dem Motiv E der RdRp's. Dies ist der erste Bericht, daß scFv's gegen RdRp's von Pflanzenviren die virale Replikation in vivo inhibieren können.
  • Es konnte außerdem gezeigt werden, daß scFv's gegen konservierte Domänen hoch effizient bei der Inhibierung von nicht nur Replikationen von homologen, sondern auch heterologen Viren sind und daher die beste Wahl für einen Plantibody-basierten Ansatz sind, um Virusresistenz zu erreichen.
  • Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele näher verdeutlicht werden, wobei Bezug genommen wird auf die beigefügten Zeichnungen und das Sequenzprotokoll, in denen
  • 1 zeigt: die scFv vermittelte Inhibierung von CNV RdRp, in vitro Test. Verschiedene Mengen von scFvs wurden mit CNV RdRp für 30 Min. inkubiert, bevor die RdRp Reaktion durch die Zugabe von dem Templat (Di-72 (–)) gestartet wurde. Die verbleibende Replikaseaktivität wird in Prozent der nicht-inhibierten Replikaseaktivität ohne die Zugabe von scFvs gezählt. Wie in 1 gezeigt, wurde die RNA-Synthese durch die ausgewählten scFv's in verschiedenem Ausmaß blockiert, sogar wenn die Menge von scFv zu niedrig wie 98 ng war.
  • 2 zeigt: die scFv vermittelte Inhibierung von E. coli exprimierter TCV RdRp, in vitro Test. Repräsentative denaturierende Gelanalysen von radiomarkierten RNA Produkten, synthetisiert durch in vitro Transkription mit E. coli exprimiertem TCV in der Abwesenheit (Spur 1) und Anwesenheit (Spur 2) von scFv P55. Das Fehlen von Replikationsprodukten in Spur 2 zeigt klar die Inhibierung der TCV Replikase durch scFv P55.
  • 3 zeigt: die scFv vermittelte Inhibierung der Replikation des TBSV-BS3 Wild-typ Virus, in vivo Test. Eine Suspension von Agrobacterium, die verschiedene scFv Konstrukte einhielt, wurde in N. benthamiana Blätter infiltriert. 4 Tage nach Infiltration, wurden infiltrierte Blätter mechanisch mit 1 μg von TBSV-BS3 Viruspartikeln beimpft und Die Etablierung der systemischen Infektion wurde überwacht. Sieben Tage nach der Inokulation, wurde die systemische Infektion in allen Planzen außer denjenigen, die scFv H2C6 und P55 exprimierten, nachgewiesen. A, B Symptome in Pflanzen, die scFv Grud Und P55 exprimieren, sowie in wt Kontrollpflanzen 7 Tage nach Virusinokulation. Apikale Blätter von wt und scFv Grud exprimierenden Pflanzen zeigen typische Mißbildungen und Mosaiksymptome, wo hingegen scFv P55 exprimierende Pflanzen Symptom-frei nach Virusinokulation bleiben. C, D Western blot, die die Expression von scFvs nach Agro-Infiltration zeigen. Infiltrierte Blätter wurden 4 Tni und 7 Tni (D) geerntet. Tni = Tage nach Infiltration (dpi – day post infiltration). M = Marker (Pflanze, die scFv exprimierte)
  • 4 zeigt: Symptom-Expression (7 Tage nach Inokulation) in wt N. benthamiana Pflanzen, die mit einem infektiösen TBSV-BS3 Klon inokuliert wurden, der verschiedene scFv Gene trägt. A Symptom-Expression in Pflanzen, die alle verschiedene scFvs exprimieren. Wt Kontrollpflanzen und Pflanzen, die scFv Grud, 28H3 und H1E11 exprimieren, zeigen alle systemische Infektion, einschließlich verkrüppeltem Wachstum und Mißbildungen von apikalen Blättern, wo hingegen Pflanzen, die scFv H2C6 und P55 exprimierten, Symptom-frei blieben. B Vergleich zwischen N. benthamiana Pflanzen, die scFv Grud (negative Kontrolle) und scFv P55 (am meisten effizienter scFv) exprimieren.
  • 5 zeigt: die Bindung von scFvs an NSB5 HCV in vitro. Immobilisierter NSSB wurde mit scFvs in Microtiterplatten inkubiert. Gebundene scFv Proteine wurden nach Inkubation mit anti-Myc, gefolgt von alkalischer Phosphatase-konjugiertem anti-Maus IgG und Konversion des Phosphatasesubstrats p-Nitrophenylphosphat durch Messen der Absorption bei 405 nm nachgewiesen. Die Werte sind Mittelwerte von dreifachen Bestimmungen, wobei die Standardabweichungen durch die Fehlerbalken angegeben sind.
  • Seq ID Nos 1 bis 4 zeigen die Aminosäuresequenzen der VH-Ketten der scFv-Fragmente H2C6 (Seq. ID. No 1), H1E11 (Seq. ID. No 2), P55H9 (Seq. ID. No 3) und 28H3 (Seq. ID. No 4),
  • Seq ID Nos 5 bis 8 zeigen die Nukleinsäuresequenzen der VH-Ketten der scFv-Fragmente H2C6 (Seq. ID. No 5), H1E11 (Seq. ID. No 6), P55H9 (Seq. ID. No 7) und 28H3 (Seq. ID. No 8).
  • Beispiele
  • Drei verschiedene Fragmente des offenen Leserahmens 1, das mit dem Amber Codon des Vollängenklons von TBSV-BS3 beginnt (Galetzka, D., Russo, M., Lubino, L and Krczal, G. Molecular characterisation of a Tombusvirus associated with a disease of statice [Goniolimon Tataricum (L.) Boiss]. Journal of plant pathology 82 (2), 151-155 (2000)) wurden in die BamHI/Sal I Stelle von pET 23a+ und 26a+ zur Expression als His-tag Fusionsproteine in BL21 (DE3) kloniert. Die Zielproteine wurden durch induzierte Expressionen der Klone mit IPTG exprimiert. Die Proteine wurden mit 8 M Harnstoff, pH 8 gelöst, gereinigt durch Metallaffinitätsharz (Ni-NTA) und mit 8 M Harnstoff pH 4,5 eluiert.
  • Phage-Display
  • Die Untersuchung eines Gemischs von zwei Phagenbibliotheken (A und B) (Durch das MRC, Cambridge, England zur Verfügung gestellt) wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt (Nunc Maxisorb, 96 Napf), die bei 4°C über Nacht mit 1 μg/Napf von gereinigtem denaturiertem Protein beschichtet waren (6 Napf/Antigen). Für die erste Runde an Selektionen wurden 0,5 ml (2,54 x 1013 t.u) der Phagenbibliothek A und 0,25 ml (3,97 x 1014 t.u) der Phagenbibliothek B verwendet. Drei Runden Screening wurden gegen die 3 RdRp-Domänen durchgeführt, die in den Mikrotiterplatten immobilisiert waren. Elutierte Phagen wurden dazu verwendet, um TG1-Zellen zu infizieren und mit M13Ko7 Helferphagen gerettet. Der Kulturüberstand, der die polyklonalen Phagen aus jeder Runde enthielt, wurde dazu verwendet, um die Bindung an Zielproteine durch ELISA zu untersuchen. Um die Bindung von monoklonalen Phagen-scFv zu untersuchen, wurden einzelne Kolonien von Titrationsplatten der 3. Runde kultiviert und durch ELISA getestet. Die Klone, die die höchsten Signale ergaben, wurden dazu ausgewählt, um HB2151-Zellen zu infizieren, um dann lösliche scFv's zu exprimieren. Die infizierten HB2151-Zellen wurden durch IPTG induziert und der Überstand, der lösliche scFv's enthielt, wurde durch ELISA und Western-blot untersucht.
  • Reinigung von scFv's
  • E. coli HB2105, infiziert mit ausgewählten monoklonalen Phagen wurde in einem LB-Medium angezogen, das mit 1 % Glucose ergänzt war, bis zu einer Dichte von OD600 = 0,8 und dann über Nacht mit 1 mM IPTG bei 30°C induziert. Die induzierten Zellen wurden geerntet und die scFv's wurden aus dem Überstand mit einer Protein-L Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die scFv's wurden mit 0,1 M Glycin pH 2,0 eluiert. Jede Fraktion wurde durch Western-blot getestet, und unter der Verwendung eines Anti-myc Antikörpers. Die Fraktionen, die scFv's enthielten wurden vereinigt und gegen PBS-Puffer dialysiert.
  • Herstellung von RNA-Templaten
  • DI-72(–) wurde als RdRp-Templat hergestellt und für die in vitro Tests verwendet. Nach T7 RNA-Transkription und Phenol/Chloroform Extraktion wurden nicht inkorporierte Nukleotide durch wiederholte Ammoniumacetat/Isopropanolfällung entfernt. Nach Ethanolfällung wurden die RNA-Transkripte in sterilem Wasser gelöst und ihre Menge und Größe durch ein UV-Spektrophotometer gemessen und auf einem 5% Polyacrylamid/8 M Harnstoffgel (denaturierende PAGE) analysiert.
  • ScFv-vermittelte Inhibierung von RdRp, in vitro-Test.
  • Ein CNV Replikase-Komplex wurde wie beschrieben durch Nagy & Pogany (Nagy PD, Pogany J. Partial purification and characterisation of Cucumber necrosis virus and Tomato bushy stunt virus RNA-dependent RNA polymerases similarities and differences in template usage between tombusvirus and cannovirus RNA-dependent RNA polymerases. Virology.25;276(2):279-88.(2000)) hergestellt. Die teilweise gereinigte CNV RdRp (10 μl) und verschiedene Mengen von scFv von 0,1 μg bis 0,3 μg wurden jeweils gemischt und bei 0°C für 30 min inkubiert. Dann wurde die RdRp-Reaktion wie vorher beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Reaktion bei 25°C für 2 Stunden inkubiert wurde. Jede RdRp-Reaktion enthielt 3 μg Templat-RNA. Nach Phenol/Chloroform Extraktion und Ammoniumacetat/Isopropanolfällung wurden die RdRp-Trankriptionsprodukte auf 20- oder 30-cm-langen denaturierenden 5%PAGE/8 M Harnstoffgelen analysiert, gefolgt von Analyse mit einem Phosphorimager, wie im Stand der Technik beschrieben.
  • ScFv-vermittelte Inhibierung von RdRp, in vivo-Test (Agrobakterium-Infiltration)
  • Die cDNA-Fragmente, die für die ausgewählten scFv's kodierten, wurden durch PCR mit 5'spezifischen Primern amplifiziert, die eine NcoI-Stelle einführten und 3'spezifischen Primern, die eine NotI-Stelle einführten. Diese Restriktionsstellen wurden für Subklonierung in pRTI eingeführt, welcher den 35S Promotor und den Blumenkohl-Mosaikvirus-Terminator enthält. Die Expressionskassetten wurden in die HindIII-Stelle des pGJ-Pflanzen-Expressionsvektors kloniert. Agrobacterium tumefaciens Stamm ATHV wurde mir jedem der Expressionsplasmide durch Elektroporation transformiert. Die Agrobakterien wurden in die Blätter von fünf N. benthamiana-Wildtyp-Pflanzen wie beschrieben infiltriert (Y. Yang, R. Li and M. Qi. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. The Plant Journal. 22(6):543-551(2000)). 4 Tage nach der Infiltration wurden die infiltrierten Blätter mechanisch mit 1 μg TBSV-BS3-Viruspartikeln beimpft und die lokalen und systemischen Symptome wurden nach 7, 14 und 25 Tagen nach der Beimpfung untersucht.
  • ScFv's-vermittelte Inhibierung von RdRp (Expression von scFv's über einen infektiösen Klon des homologen Virus)
  • Ein infektiöser Vektor (FC811) wurde durch Entfernung des Großteils des Hüllenproteingens in Leserahmen 3 des Vollängen TBSV-BS3-Klons entfernt, indem eine multiple cloning Site in diese Region eingeführt wurde. Die cDNA-Fragmente, die für die ausgewählten scFv's kodierten, wurden durch PCR mit 5'spezifischen Primern, die eine SphI-Stelle einführten und 3'spezifischen Primern, die eine KpnI-Stelle einführten amplifiziert, um in den infektiösen Klon FC811 subkloniert zu werden. Das mit SmaI linearisierte Plasmid wurde als Templat für die in vitro-Transkription verwendet und zur mechanischen Beimpfung auf N. benthamiana-Wildtyppflanzen (vier Pflanzen pro scFv). Die Virusinfektion wurde durch Nachweis von lokalen und systemischen Symptomen nach der Beimpfung verfolgt.
  • Epitopkartierung
  • Verschiedene Fragmente der TBSV-Replikase, die verschiedene Motive darstellen wurden kloniert, expremiert und gereinigt gemäß dem bei der Reinigung der scFv's beschriebenen Verfahren. 96/Napf Mikotiterplatten (Nunc Maxisorb) wurden mit 1 μg der verschiedenen Antigene beschichtet. Die Bindung von scFv's an die verschiedenen Replikasefragmente wurde durch ELISA mit Anti-myc und alkalischer Phosphatase(AP)-konjugiertem und Anti-Maus Antikörpern nachgewiesen, gefolgt von Inkubation in Substratpuffer. Die Absorption wurde bei 405 nm in einem Spektrophotometer gemessen.
  • Proteinexpression und Phage-Display
  • Trotz Versuche mit verschiedenen Kombinationen von Plasmiden und Wirtsstämmen, sowie mit verschiedenen Bedingungen von Temperatur, pH und IPTG Konzentrationen konnten Fragmente der RdRp in löslicher Form in E. coli nicht exprimiert werden. Wir verwendeten daher die denaturierten gereinigten Proteine als Antigene zur Selektion von scFv's aus der Phagenbibliothek. Die Anreicherung von positiven Gebundenen in jeder Runde der Phage-Display-Selektion konnte durch erhöhten Phagentiter nachgewiesen werden. Die monoklonalen Phagen ergaben positive Signale sowohl in ELISA und Western-blots, was vermuten läßt, daß die Bindungsstellen dieser scFv's lineare Epitope sind. Die scFv's, die die höchsten Signale in sowohl ELISA und Western-blot ergaben, wurden mit Protein-L gereinigt und für weitere Experimente verwendet. In der vorliegenden Erfindung wurden somit das erste Mal unseres Wissens nach denaturierte Proteine zur erfolgreichen Selektion von scFv's in Phage-Display verwendet.
  • In vitro-Test
  • Um das Potential von ausgewählten scFv's zu untersuchen die virale Replikase zu inhibieren, ist der Nachweis von de novo-Produkten, die von der zu untersuchenden RdRp transkribiert wurden, das bevorzugte Verfahren. CNV und TBSV gehören zu derselben Gruppe von Viren (Tombusvirus) und ihre RdRp's sind relativ homolog. Der Vergleich des Templat-Gebrauchs der TBSV und CNV-RdRp's ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den zwei Replikasen (Nagy, 2000). Die Ergebnisse zeigen, daß die vier ausgewählten scFv's die CNV RdRp inhibieren. Wie in 1 gezeigt, wurde die RNA-Synthese durch die ausgewählten scFv's in verschiedenem Ausmaß blockiert, sogar wenn die Menge von scFv zu niedrig wie 98 ng war. Kontrollreaktionen zeigten, daß der inhibitorische Effekt dieser scFv's nicht aufgrund von Abbau des RNA-Templats durch eine mögliche Kontamination mit Nuklease in den scFv -Präparationen war. Da gezeigt werden konnte, daß scFvp55 zu der größten Inhibierung der RdRp führte, wurde dieser scFv für weitere Untersuchungen verwendet.
  • Rüben "Crinkle" Virus (TCV) ist ein Carmovirus, der ebenfalls zur Familie von Tombusviridae zählt und seine RdRp ist aus derselben Linie, wie diejenige von TBSV und CNV. Kürzlich wurde gezeigt, daß TCV RdRp, exprimiert in E. coli, eine RdRp-Aktivität in vitro zeigt. Um weiterhin zu untersuchen, ob unsere scFv's ebenfalls die RdRp von TCV inhibieren können, wurde ein Inhibierungstest mit scFvp55 durchgeführt (1). Das Ergebnis zeigt klar, daß scFvp55 ebenfalls die Aktivität von TCV RdRp in vitro stark inhibiert (2).
  • Um den Effekt von verschiedenen Templaten und Temperaturbedingungen auf die RdRp-Inhibierung zu untersuchen, wurde zunächst die Inhibierung von beiden Minus- und Plussträngen durch Verbindung von teilweise gereinigter CNV RdRp untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß verschiedene Template das Ausmaß der Inhibierung der RdRp nicht beeinflussen. Wenn scFv's und RdRp bei 25°C inkubiert wurden, war die Inhibierung der RNA-Syntese jedoch effizienter blockiert, als bei 4°C. Interessanterweise konnte die RNA-Synthese nicht inhibiert werden, wenn scFv's nur nach dem Beginn der Transkription des Templats durch die RdRp hinzugegeben wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die Bindungsstelle von scFv's die Konformation verändert, wenn die Aktivität der RdRp beginnt. Dies führt dazu, daß die scFv's keinen Zugang mehr zur Bindungsstelle auf der RdRp haben. Es bestätigt ebenfalls die Schlußfolgerung, daß der abnehmende Titer von transkribiertem Templat an der Inhibierung der RdRp-Aktivität durch die scFv's begründet war, und nicht aufgrund von irgendeiner Kontamination in den scFv-Präparationen.
  • In vivo-Test
  • Die scFv-vermittelte Inhibierung von viraler RdRp wurde ebenfalls in vivo untersucht, um zu bestätigen, daß die Aktivität der RdRp auch in Pflanzenzellen durch ausgewählte scFv's inhibiert werden kann. Zwei Verfahren wurden entwickelt, um die Inhibierungsaktivität zu untersuchen. Zunächst wurden intakte Blätter vom Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen mit einer Agrobakterium-Suspension infiltriert, die zu der cytoplasmatischen Expression der verschiedenen scFv's führte. Ein scFv, der die RdRp nicht betraf (scFv Grud), wurde im Test eingeschlossen, um den Effekt der Expression von heterogenen Proteinen nach der viralen Infektion auszuschließen. Drei Tage nach der Agro-Infiltration wurden TBSV-Viruspartikel mechanisch auf infiltrierte Blätter beimpft. Dies simuliert die Situation in einer transgenen Pflanze, in der Viren Blätter infizieren, die das entsprechende scFv konstitutiv exprimieren. Um zu Bestätigen, daß die transiente Expression funktionell war, wurde ein Blatt von jeder Charge von infiltrierten (nicht-Virus-beimpften) Pflanzen vier Tage nach der Infiltration geerntet und die Proteinexpression (scFv) wurde durch Western-blot gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß scFv's in infiltrierten Blättern leicht exprimiert werden können (3c). 7 Tage nach der Virusbeimpfung entwickelten die Pflanzen, die scFv Grud, 28H3 und H1E11 exprimierten eine systemische Infektion (1A). Die Pflanzen, die scFvH2C6 und P55 exprimierten zeigten jedoch zur selben Zeit keinerlei Symptome von systemischer Infektion. Am Tag 15 begann der Virus jedoch auch in den scFvH2C6 und P55 exprimierenden Pflanzen zu akkumulieren. Diese Verzögerung der systemischen Infektion in diesen Pflanzen kann durch die abnehmende Expression von scFv's in Pflanzen nach Agro-Infiltration verursacht sein. Dies wird durch die Western-blot-Analyse gestützt, die zeigt, daß die scFv's nach 15 Tagen nach Infiltration nicht mehr nachgewiesen werden konnten (3D).
  • Die verringerte Empfindlichkeit gegenüber viralen Infektionen liegt nicht an dem durch die Agro-Infiltration verursachten Streß auf die Pflanzen, wie durch die mit scFv Grud infiltrierten Pflanzen gezeigt wird. Diese Pflanzen zeigten dieselbe Empfindlichkeit gegenüber viraler Infektion als Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen.
  • In einem zweiten Experiment wurden die scFv-Gene in einem infektiösen Klon von TBSV kloniert, der durch die Erfinder hergestellt wurde, wobei der größte Teil des offenen Leserahmens 3, der für das Hüllenprotein von TBSV kodiert, durch die entsprechende cDNA ersetzt ist. Gemäß Scholthoff et al (Scholthof HB, Scholthof KB, Kikkert M, Jackson AO. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in eell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology.10;213(2):425-38 (1999)) ist das Hüllenprotein nicht für die systemische TBSV-Infektion in Wirtspflanzen erforderlich und ist daher für unsere Experimente vernachlässigbar. Während der infektiöse Klon repliziert, wird das heterogene Gen von der subgenomischen RNA1 (sgRNA1) ähnlich dem Hüllenproteingen im Wildtypvirus exprimiert. Daher wurde in vitro transkribierte RNA, die die verschiedenen scFv-Gene enthielt, dazu verwendet, um Wildtyp N. Benthamiana-Pflanzen mechanisch zu beimpfen, um die inhibierende Aktivität der verschiedenen scFv's auf die virale Replikase zu untersuchen. 7 Tage nach der Beimpfung, wurde eine systemische Infektion in beimpften Pflanzen beobachtet, die scFv Grud und 28H3 exprimierten, jedoch nicht Pflanzen, die die anderen scFv's exprimierten. Nur ein paar lokale Symptome konnten in inokulierten Blättern von H2C6, H1E11 und P33 gefunden werden. Qiu et al (2000)verfolgten die Anreicherung von genomischer RNA (der exprimierte Leserahmen für die virale Replikase), sgRNA1 (der exprimierende Leserahmen für das Hüllenprotein) und sgRNA2 (der exprimierte Leserahmen für das Movement-Protein) von TBSV in infizierten Protoplasten. Die Autoren beobachteten, daß sgRNA2 normalerweise mit gRNA gemeinsam auftritt und das sgRNA1 nur ein paar Stunden später erscheint. Es ist bekannt, daß die Replikase, die von gRNA translatiert wird, die Regulation von sgRNA1 und 2 reguliert. Da die scFv's in den offenen Leserahmen 3 kloniert waren, der über sgRNA1 exprimiert wird, der in Pflanzenzellen nach gRNA erscheint kann die Inhibierung der Replikase durch scFv nicht in der sehr frühen Phase der Replikation/Infektion auftreten und daher nicht zu einer vollständigen RdRp-Inhibierung führen. Dies läßt vermuten, daß bei Beginn der Infektion, bevor die scFv-Herstellung stattfindet, einiges virales Material sich in ausreichenden Mengen ansammelt, um lokale Symptome in beimpften Blättern zu verursachen und Zelle- zu Zellebewegung einiger gRNA, was die Entwicklung von lokalen Symptomen in Pflanzen erklärt, die mit dem infektiösen TBSV-Klon infiziert wurden, der die Gene für scFv H2C6, H1E11 und P55 trägt. Um den Virus-Titer in beimpften Pflanzen zu verfolgen, wurden Sub-Beimpfungsexperimente mit Pflanzensaft von apikalen Blättern, mit jeder der Pflanzen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß drei Tage nach der Infektion nur Pflanzen, die mit Inokulat von Pflanzen, die scFv Grud und 28H3 beimpft wurden, lokale Symptome in beimpften Blättern zeigten und Pflanzen, die nur scFv Grud exprimierten, zeigten systemische Infektionen vier Tage nach Beimpfung. Diese Ergebnisse zeigen eine fast vollständige Reduktion des viralen Titers in Pflanzen, die scFvH2C6, H1E11 und P55H9 exprimierten. Diese Ergebnisse zeigen, daß scFv28H3 weniger aktiv bei der Inhibierung der RdRp-Aktivität ist, was als Konsequenz zu einiger Akkumulation und Translation von gRNA und sgRNA1 in den infizierten Pflanzen führt. Dies führt auch zu lokaler Infektion und sub-inokulierten Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen. Die Menge von in den Sub-Inokulationsexperimenten transferierter viraler RNA und die weitere Herunterregulierung durch den scFv, der von dem viralen Genom expremiert wurde verhinderte jedoch sie Etablierung von systemischer Infektion in den Wildtyp N. benthamiana-Pflanzen, sogar im Fall von scFv28H3.
  • Darüber hinaus wurden 21 Tage nach Infektion inokulierte Blätter von jeder Charge der scFvexprimierenden Pflanzen geerntet und die Anreicherung der scFv's wurde durch Western-blot untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß nur der scFv Grud 21 Tage nach Inokulation nachge wiesen werden kann und sich im Vergleich zu Tag 4 und Tag 7 nach der Beimpfung anzureichern scheint.
  • Dieses Ergebnis unterstützt die Schlußfolgerung, daß die virale Resistenz an der Inhibierung der viralen RdRp durch die scFv's liegt. Da scFv Grud die virale RdRp nicht beeinflußt, wird die Expression diese scFv die RdRp-Aktivität im Transkriptionsprozeß nicht inhibieren und konsequenterweise sich im Replikationsprozeß anreichern.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal, daß Antikörper direkt aus dem viralen Genom exprimiert werden können, dessen Replikation sie herunter regulieren sollen. Dieser Test ist daher besonders brauchbar, da die virale RNA und das inhibierende Mittel in einem 1-Schritt-Verfahren gleichzeitig der Pflanze zugeführt werden können und daher die Wirkung der Antikörper optimiert wird. Die Ergebnisse der RdRp-Inhibierungstests in vitro und in vivo zeigen klar, daß scFv's P55 und H2C6 eine hohe RdRp-Inhibierungsaktivität aufweisen, wohingegen scFv's 28H3 und H1E11 die RdRp-Aktivität nur zu einem bestimmten Ausmaß inhibieren. Zusammenfassend sind die scFv's P55 und H2C6 die besten Kandidaten für eine RdRp-Inhibierung und die Produktion von Virus-resistenten transgenen Pflanzen.
  • Epitopkartierung
  • Um die Bindungsdomäne der verschiedenen scFv's exakt zu definieren, wurde eine Epitopkartierung durchgeführt. Verschiedene Fragmente der TBSV RdRp wurden in Expressionsvektoren kloniert und in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Die überexprimierten Zielproteine wurden wie beschrieben gereinigt. Die Bindungsaktivität jeder der scFv's an die verschiedenen Antigene wurde durch ELISA wie beschrieben nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, daß alle der vier scFv's. in der Motiv E-Region binden. Das Motiv E von TBSV "RDRP" wird als eine ?-Helix Konformation aufweisend vermutet, es ist jedoch unbekannt, ob sie auch als eine "Daumenklammer" fungieren kann. Unsere Ergebnisse zeigen, daß die Bindung von unseren scFv's an diese Region die Aktivität von RdRp verschwinden läßt. Jedoch können die scFv's nach Beginn der Trankription nicht binden und die RdRp-Aktivität inhibieren (gefunden in den in vitro-Ergebnissen). Zusammengefaßt stützen die Daten die Hypothese, daß das Motiv E der getesteten RdRp als eine Daumenklammer während der Bindung des Templats fungiert und daher für die RdRp-Aktivität besonders wichtig ist. Die Vergleichsergebnisse des Motiv E der RdRp's von TBSV, CNV (Tombusvirus) und TCV (Carmovirus) zeigen hohe Homologie, was die Ergebnisse erklärt und unterstützt, daß unsere scFv's in der Lage sind, die RdRp von verschiedenen Gruppen von Viren zu inhibieren. Koonin (Koonin, E. V, The phytogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. Journal of General Virology 72, 2197-2206 (1991)) zeigte, daß die TBSV RdRp zur Supergruppe 2 von positiv-Strang viralen RdRp's gehört, die vier verschiedene Gruppen von viralen Polymerasen umfaßt. Diese werden in (i) Tombus-, Carmo- und Dianthovirus, (ii) Pestivirus, (iii) Flavivirus und (iv) ssRNA Bakteriophagen klassifiziert. Der Cystein-Rest im Motiv E ist in allen RdRp's dieser Supergruppe 2 enthalten. Die E, V, E/P, F, C, Q/S Reste in Motiv E sind in allen Gruppen konserviert, mit Ausnahme der Gruppe (iv). Diese Daten lassen vermuten, daß die vorliegenden scFv's auch die RdRp's von anderen (Pflanzen) Viren in dieser Supergruppe inhibieren können, die nicht zu Gruppe I gehören. Transgene Pflanzen, die die funktionellen scFv's exprimieren, werden ein attraktives Werkzeug sein, um die scFv-vermittelte Inhibierung von viralen RdRp's von verschiedenen Virusfamilien zu untersuchen, da sie leicht mit den zu untersuchenden Viren beimpft werden können, gefolgt von einer sorgfältigen Überwachung einer möglichen Virusinfektion.
  • Bindungsaktivität von scFv's an HCV RdRp
  • Da auch die RdRp's von menschlichen Viren zur selben Supergruppe wie die Pflanzenviren-RdRp's gehören, wurde auch die Bindungsaktivität der vorliegenden scFv's zu der HCV RdRp untersucht. Das Hepatitis C-Virus (HCV) gehört zu der Familie der Flaviviridae und seine RdRp stammt aus der Pesti-Linie. Die HCV RdRp wurde erfolgreich in vitro exprimiert und konnte als für die virale Replikation in vitro essentiell gezeigt werden (Lohmann V, Korner F, Herian U, Bartenschlager R. Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNAdependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity. J Virol 1997 Nov;71(11):8416-28). HCV NS5B enthält Motive, die von allen RdRp's geteilt werden. Als ein individuelles Merkmal führt die Interaktion zwischen den Fingern und Daumen Subdomäne der HCV RdRp's zu einem vollständig eingeschlossenen aktiven Zentrum. Unsere Epitopkartierung zeigte, daß die Bindungsstelle aller scFv's sich in der Motiv E-Region befindet. Der Abgleich der Aminosäuresequenzen, die die E Motive von TBSV und HCV RdRp abdeckten zeigte, daß diese RdRp's einige Aminosäurehomologien im Motiv E teilen, nämlich L, E, C, V, D und G. Die Mutation von Aminosäuren in dieser Region zeigte, daß die hydrophoben Reste in diesem Motiv für die Interaktion mit der Handflächenkernstruktur wichtig sind. Basierend auf diesem Homologien wurde untersucht, ob die scFv's an die HCV RdRp binden können. Daher wurde ein ELISA-Test durchgeführt der zeigte, daß die scFv's ebenfalls an HCV RdRp binden können (siehe 5). Die Bin dungsaffinität war jedoch geringer, als die Bindungsaffinität von Amab, der als die HCV RdRp erfolgreich inhibierend gezeigt wurde (Bartenschlager R, Lohmann V. Replication of hepatitis C virus. J Gen Virol 2000 Jul;81(Pt 7):1631-48). Diese geringe Bindungsaktivität kann wie folgt erklärt werden (i) TBSV und HCV RdRp zeigen nur einige Reste, die unter Umständen nicht ausreichend sind, um eine starke Bindungsreaktion von den vier scFv's mit der HCV RdRp zu induzieren. (ü) Die Homologieregion wird als einen α β-Strang-Turn-β-Strang Struktur in der HCV RdRp ausbildend vermutet, jedoch als eine ?-Helix in der TBSV RdRp. Der Unterschied in der Konformation kann ebenfalls die Bindungsaktivität der scFv's zu RdRp stark beeinflussen. Es ist jedoch in jedem Fall ein sehr vielversprechendes Ergebnis, daß die scFv's in der Lage sind, die RdRp von nur entfernt verwandten Viren zu binden. Dies läßt vermuten, daß eine Breitbandvirusresistenz durch das Abzielen auf konservierte Motive in viralen RdRp's erhältlich ist.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten scFv-Fragments in einer Pflanze, umfassend – zur Verfügung stellen einer DNA, die für ein nicht gegen virale Hüllproteine gerichtetes scFv-Fragment kodiert, – Klonierung der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, – Transformation oder Infektion einer Pflanze mit dem Vektor, und – Expression des nicht gegen virale Hüllproteine gerichteten scFv-Fragments in der Pflanze.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist, die aus der Supergruppe 2 von positiv Strang viralen RdRps, und insbesondere von einem Virus der (i) Tombus-, Carmo-, und Dianthoviren, insbesondere CNV, TCV oder TBSV, (ii) Pestiviren, (iii) Flaviviren, insbesondere HCV oder (iv) ssRNA Bakteriophagen, abstammt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das scFv-Fragment gegen die Handflächen ("palm") Domäne einer viralen RdRp gerichtet ist.
  5. Polypeptid, umfassend ein scFv-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere umfassend die VH-Ketten und/oder VL-Ketten eines scFv-Fragments, insbesondere umfassend die VH-Ketten der scFv H2C6 (Seq ID No. 1), H1E11 (Seq ID No. 2), P55H9 (Seq ID No. 3) oder 28H3 (Seq ID No. 4).
  6. Polynucleotid, das für eine Kette eines scFv-Fragment nach Anspruch 5 kodiert, insbesondere gemäß Seq ID No. 5 bis Seq ID No. 8
  7. Polynucleotid nach Anspruch 6 in Form einer DNA, PNA oder RNA, insbesondere einer plus-Sinnstrang-RNA.
  8. Rekombinanter Vektor, umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 6 oder 7, insbesondere ein pET 23a+ pET 26b+- Derivat.
  9. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8 in Form eines infektiösen Klons des Virus, in den das gegen die virale RdRp gerichtete scFv-Fragments integriert vorliegt, insbesondere TBSV-BS3-FC811.
  10. Verfahren zur Behandlung von oder der Prophylaxe vor viralen Pflanzenerkrankungen, umfassend die Expression von rekombinanten scFv-Fragmenten in der Pflanze, die nicht gegen virale Hüllproteine gerichtet sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das scFv-Fragment gegen eine virale RdRp gerichtet ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das scFv-Fragment gegen eine Pflanzen-virale RdRp gerichtet ist, die aus der Supergruppe 2 von positiv Strang Pflanzen-viralen RdRps, und insbesondere von einem Virus der Tombus-, Carmo-, und Dianthoviren, insbesondere CNV, TCV oder TBNV.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das scFv-Fragment gegen die Handflächen ("palm") Domäne der viralen RdRp gerichtet ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnde Pflanze ausgewählt ist aus Kultur- und Anbaupflanzen der Dicotyledonen, wie zum Beispiel Gurke, Tomate, Rübe, Raps, Wein, Kartoffel und/oder Tabak, insbesondere ausgewählt aus den Solanaceae.
  15. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 5 oder eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von viralen Erkrankungen.
  16. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid ein gegen die RdRp eines Flavivirus, insbesondere HCV, gerichtetes scFv-Fragment oder ein dafür kodierendes Polynukleotid ist. SEQUENZPROTOKOLL
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