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Die Erfindung betrifft ein Scanmikroskop
mit einer Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten
einer Probe emittiert, der entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges
verläuft
und der mit einer Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist
und mit einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht,
das entlang eines Detektionsstrahlenganges verläuft, empfängt, und mit einer weiteren
Lichtquelle, die einen Manipulationslichtstrahl, der entlang eines
Manipulationsstrahlenganges verläuft,
erzeugt.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Scanmikroskopie.
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In der Scanmikroskopie wird eine
Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte
Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines
Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung,
im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene
bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen,
so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die
Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird
in Abhängigkeit
von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente
mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird
ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen
abgetastet.
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Ein konfokales Rastermikroskop umfasst
im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das
Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert
wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung,
eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum
Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen
Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz-
oder Reflexionslicht gelangt über
die Strahlablenkeinrichtung zurück
zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende
fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht,
das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen
Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine
Punktinformation erhält,
die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen
Bild führt.
Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme
erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem
Objekt Idealerweise einen Mäander
beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position,
anschließend
x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung
auf die nächste
abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position,
diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise
Bilddatennahme zu ermöglichen,
wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht
verschoben und so die nächste
abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 199 54 933 A1 ist
eine Anordnung zur Einkopplung mindestens eines Strahles einer optischen
Pinzette zum Einfangen von Teilchen und/oder zur Einkopplung eines
Bearbeitungsstrahles in einen mikroskopischen Strahlengang, vorzugsweise
in einem Laser-Scanning-Mikroskop,
bekannt, wobei Mittel zur frei einstellbaren Veränderung der Lage des Strahlfokus
der optischen Pinzette und/oder des Bearbeitungsstrahles bezüglich der
Veränderung
der Fokusposition des Mikroskops vorgesehen sind. In dieser Anordnung
ist der Fokus des Bearbeitungsstrahles, bzw. der optischen Pinzette,
durch Verschieben einer Optik im Strahlengang des Bearbeitungsstrahles, bzw.
der optischen Pinzette in z-Richtung verschiebbar. Eine Verschiebung
des Fokus in x-y-Richtung ist nur durch Verschieben des Objekttisches
möglich. Dies
ist für
den Benutzer nachteilig, weil das Verschieben des Fokus zwangsläufig mit
einem Wechsel des Bildausschnitts einher geht. Darüber hinaus
ist ein schnelles Bewegen des Fokus nicht möglich.
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Aus der Deutschen Offenlegungsschrift
DE 100 39 520 A1 ist
eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung und Manipulation
von mikroskopischen Objekten, mit einem Mikroskop, einer zur Beleuchtung
des Objekts dienenden Lichtquelle, einem Beleuchtungsstrahlengang,
einem zur Detektion des vom Objekt zurückkehrenden Lichts dienenden
Detektor, einem Detektionsstrahlengang, einer zur Objektmanipulation
dienenden Lichtquelle und einem Manipulationslichtstrahlengang offenbart.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung
bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
eine dreidimensionale Untersuchung und Manipulation von Objekten,
deren Ausdehnung entlang der optischen Achse größer als der Tiefenschärfenbereich
des verwendeten Mikroskopobjektivs ist, wobei eine Objektmanipulation
auch an allen Stellen des dreidimensionalen Objekts möglich sein
soll. Darüber
hinaus soll eine dreidimensionale Detektion des Objekts möglich sein,
bei der eine Diskriminierung der Objektlichtbeiträge erfolgt,
die von Bereichen kommen, die jenseits des Tiefenschärfenbereichs
des Mikroskopobjektivs liegen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop
ist. Die Vorrichtung beinhaltet eine Strahlablenkeinrichtung zum
Führen
des Beleuchtungslichtstrahles und eine weitere zum Führen des
Manipulationslichtstrahls, wobei vorgesehen sein kann, dass die
Strahlablenkvorrichtungen synchron zueinander arbeiten. Die Vorrichtung
ist daher sehr flexibel und erlaubt darüber hinaus ein schnelles Bewegen
des Manipulationslichtstrahls. Die Vorrichtung ist jedoch sehr aufwendig
und komplex im Aufbau und der Bedienung.
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Es ist Aufgabe der Erfindung ein
Scanmikroskop anzugeben, das bei breiter Flexibilität auf einfache
Weise eine Manipulation der Probe mit einem schnell bewegbaren Manipulationslichtstrahl
ermöglicht.
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Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop
gelöst,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Manipulationslichtstrahl
ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung über oder durch die Probe führbar ist.
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Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung
ein Verfahren zur Scanmikroskopie anzugeben mit dem einfach, unkompliziert
und gleichzeitig schnell und flexibel eine Manipulation der Probe
ermöglicht
ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren
gelöst,
das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:
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- – Erzeugen
eines Beleuchtungslichtstrahles, der entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges
verläuft,
mit einer Lichtquelle,
- – Erzeugen
eines Manipulationslichtstrahls, der entlang eines Manipulationsstrahlenganges
verläuft,
mit einer weiteren Lichtquelle,
- – Führen des
Beleuchtungslichtstrahles und des Manipulationslichtstrahls gemeinsam über oder durch
eine Probe mit einer Strahlablenkeinrichtung,
- – Detektieren
des von der Probe ausgehenden Detektionslichtes, das entlang eines
Detektionsstrahlenganges verläuft,
mit einem Detektor.
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Die Erfindung hat den Vorteil, dass
auf einfache Weise ermöglicht
wird, eine Probe gezielt in gewünschten
Teilbereichen zu manipulieren und darüber hinaus gleichzeitig die
Probe störungsfrei
abzubilden.
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Vorteilhafter Weise ist der Manipulationsstrahlengang
vom Beleuchtungsstrahlengang verschieden, wobei der Manipulationsstrahlengang
und der Detektionsstrahlengang vorzugsweise nicht – auch nicht
auf Teilstücken – koaxial
verlaufen, sondern sich allenfalls schneiden. Diese offaxis-Einkopplung
hat bei einem konfokalen Scanmikroskop zur Folge, dass Restlicht
des Manipulationslichtstrahls, z.B. aufgrund von Reflexion oder
Streuung, in keinem Fall zum Detektor gelangen kann, da er aufgrund
des konfokalen Prinzips durch das Detektionspinhole ausgeblendet
wird und so die Abbildung der Probe durch die Manipulation nicht
gestört
wird.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung
sind der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl
gemeinsam über
oder durch die Probe führbar. Vorzugsweise
sind der und der Manipulationslichtstrahl gemeinsam zeilenweise
und/oder gemeinsam mäanderförmig über oder
durch die Probe führbar. Hierbei
können
der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl jeweils
in derselben Zeile oder in unterschiedlichen Zeilen geführt werden.
Beide Strahlen, der Beleuchtungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl,
werden gemeinsam von einem Objektiv auf die Probe fokussiert, wobei
vorzugsweise der Fokus des Manipulationslichtstrahls dem Beleuchtungslichtstrahl
auf seiner Scanbahn vorauseilt. Durch Einstellen des Winkels zwischen
dem Beleuchtungslichtstrahl und dem Manipulationslichtstrahl lässt sich
der Abstand der Fokusse innerhalb der Probe und bei Kenntnis der
Scangeschwindigkeit der zeitliche Abstand des Eintreffens der Fokusse
an einem Rasterpunkt einstellen. Dies kann besonders vorteilhaft
bei FRAP-Untersuchungen (fluorescence recovery after photo-bleaching)
und bei FCS-Untersuchungen (fluorescence correlated spectroscopy) ausgenutzt
werden. Hierbei bleicht der Manipulationslichtstrahl die Probe zumindest
partiell, wobei typischennreise einige μs danach das Verhalten der gebleichten
Bereiche durch Abtasten mit dem Beleuchtungslichtstrahl untersucht
wird. Der zeitliche Abstand kann erfindungsgemäß auch durch Variieren der
Scangeschwindigkeit eingestellt werden; hierzu ist die Strahlablenkeinrichtung
geeignet vorzugsweise über
einen PC steuerbar.
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In einer anderen Variante schneidet
der Manipulationslichtstrahl die Probe, was beispielsweise das Heraustrennen
eines Zellkerns umfassen könnte.
In einer anderen Ausführung
wirkt der Manipulationslichtstrahl als optische Pinzette.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung wird
der Manipulationslichtstrahl über
die Strahlablenkeinrichtung in das konfokale Scanmikroskop eingekoppelt,
wobei der mögliche
Drehwinkel mindestens eines der Drehspiegels, der als Galvanometerspiegel
ausgeführt
sein kann, ausgenutzt wird.
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Es wird vorzugsweise eine Strahlablenkeinrichtung
verwendet, die insgesamt drei Drehspiegel umfasst. Ein erster Drehspiegel
lenkt dabei beispielsweise in x-Richtung ab, während ein zweiter und ein dritter
Drehspiegel die y-Ablenkung
vornehmen, wobei der zweite Drehspiegel die Drehbewegung des dritten
Drehspiegels soweit kompensiert, dass der Manipulationslichtstrahl
bzw. der Beleuchtungslichtstrahl wieder in der Mitte des ersten
Drehspiegels zu liegen kommt. Dadurch wird gewährleistet, dass eine perfekte
Abbildung des Pivot-Punktes möglich
ist. Der erste Drehspiegel kann soweit ausgelenkt werden, dass beispielsweise
zuerst der Manipulationslichtstrahl auf die Probe gelenkt wird und
bei weiterer Drehbewegung der Beleuchtungslichtstrahl. Dies ist vorzugsweise
synchronisiert. Anstelle der Drei-Spiegel-Strahlablenkeinrichtung kann für diese
besondere Ausführungsform
auch jede andere Strahlablenkeinrichtung verwendet werden, bei welcher
der erste Drehspiegel mindestens doppelt so weit ausgelenkt werden
kann, als es für
die Bildaufnahme nötig
ist. Der doppelte Scanbereich wird in einer weiteren Variante auf
zwei Strahlen verteilt, so dass immer nur einer gleichzeitig zur
Probe gelenkt wird. Nachdem der Manipulationsstrahl die Probe beleuchtet
hat, wird die gleiche Zeile mit dem Beleuchtungslichtstrahl abgerastert.
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Das Scanmikroskop ist vorzugsweise
ein konfokales Scanmikroskop. Dieses kann beispielsweise punktscannend
ausgeführt
sein, wobei die Probe Rasterpunkt für Rasterpunkt abtastbar ist.
Das Scanmikroskop kann auch zeilenscannend ausgeführt sein,
wobei ganze Zeilen auf einmal beispielsweise mit einem aufgefächerten
Beleuchtungslichtstrahl beleuchtbar sind und im Ganzen abgetastet werden.
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In einer besonders bevorzugten Ausführung sind
Mittel zum Ein- und Ausschalten oder zum Abschwächen des Manipulationslichtstrahls
und/oder des Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen. Diese Mittel sind
vorzugsweise als akustooptische Bauteile, wie beispielsweise akustooptische
Modulatoren oder akustooptische Filter, ausgeführt.
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In den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand
schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend
beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen
versehen sind. Dabei zeigt:
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1 ein
erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskop,
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2 die
Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung,
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3 die
Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung,
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4 in
einer dreidimensionalen Darstellung die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine
Strahlablenkeinrichtung und
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5 in
einer dreidimensionalen Darstellung die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine
Strahlablenkeinrichtung.
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1 zeigt
schematisch ein erfindungsgemäßes konfokales
Scanmikroskop. Das Scanmikroskop beinhaltet eine Lichtquelle 1,
die als Laser 3 ausgeführt
ist. Der von dem Laser 3 emittierte Beleuchtungslichtstrahl 5 wird
nach dem Passieren einer Anregungsblende 7 von einem Hauptstrahlteiler 9 zu
einer Strahlablenkeinrichtung 11, die einen nicht gezeigten
kardanisch aufgehängten
Scanspiegel beinhaltet, reflektiert und von der Strahlablenkeinrichtung 11 durch
die nicht gezeigte Scanoptik, die nicht gezeigte Tubusoptik und
das nicht gezeigte Objektiv über
bzw. durch die Probe 13 geführt. Die Probe 13 ist
auf einem Objekttisch 29 positioniert, der von einem Motor
angetrieben in Bezug auf die optische Achse des Beleuchtungsstrahlenganges
axial verschiebbar ist. Das von der Probe 13 ausgehende
Detektionslicht 15 gelangt auf demselben Lichtweg über die
Strahlablenkeinrichtung 11 zurück zum Hauptstrahlteiler 9,
passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionsblende 17 auf
den Detektor 19, der als Photomultiplier 21 ausgeführt ist.
Der Detektor 19 erzeugt elektrische Detektionssignale,
die in einer nicht gezeigten Verarbeitungseinheit weiterverarbeitet
werden, um beispielsweise ein anzeigbares Abbild des abgerasterten
Bereichs der Probe 13 dem Benutzer anzeigen zu können.
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Eine weitere Lichtquelle 23 erzeugt
einen Manipulationslichtstrahl 25, der mit einem Spiegel 27 durch
den Hauptstrahlteiler 9, der für Licht der Wellenlänge des
Manipulationslichtstrahls 25 durchlässig ist, auf die Strahlablenkeinrichtung 11 gelenkt wird.
Diese führt
den Manipulationslichtstrahl 25 gemeinsam mit dem Beleuchtungslichtstrahl 5 durch die
nicht gezeigte Scanoptik, die nicht gezeigte Tubusoptik und das
nicht gezeigte Objektiv über
bzw. durch die Probe 13. Der Manipulationslichtstrahl 25 und
der Beleuchtungslichtstrahl 5 treffen versetzt zueinander
auf die Probe.
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In der Zeichnung ist der Beleuchtungslichtstrahl 5 mit
einer durchgezogenen Linie dargestellt, während der Manipulationslichtstrahl 25 gestrichelt dargestellt
ist.
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2 zeigt
die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung 11,
die insgesamt drei Drehspiegel umfasst. Ein erster Drehspiegel 31 lenkt
dabei beispielsweise in x-Richtung ab, während ein zweiter Drehspiegel 33 und
ein dritter Drehspiegel 35 die y-Ablenkung vornehmen, wobei
der zweite Drehspiegel 33 die Drehbewegung des dritten
Drehspiegels 35 soweit kompensiert, dass der Manipulationslichtstrahl 25 bzw. der
Beleuchtungslichtstrahl 5 in der Mitte des ersten Drehspiegels 31 zum
Liegen kommt. Dadurch wird gewährleistet,
dass eine perfekte Abbildung des Pivot-Punktes möglich ist. Der erste Drehspiegel 31 kann
soweit ausgelenkt werden, dass beispielsweise zuerst der Manipulationslichtstrahl 25 auf
die Probe 13 gelenkt wird und bei weiterer Drehbewegung
der Beleuchtungslichtstrahl 5. Dies ist vorzugsweise synchronisiert.
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3 zeigt
die in 2 beschriebene
Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls über eine Strahlablenkeinrichtung 11 in
der Stellung, in der der Manipulationslichtstrahl 25 auf
die Probe trifft.
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4 und 5 zeigen in dreidimensionalen
Darstellungen die Einkopplung eines Manipulationslichtstrahls 25 über eine
Strahlablenkeinrichtung 11. Zusätzlich sind schematisch eine
erste Strahlfalle 37 und eine zweite Strahlfalle 39 eingezeichnet.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf
eine besondere Ausführungsform
beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Lichtquelle
- 3
- Laser
- 5
- Beleuchtungslichtstrahl
- 7
- Anregungsblende
- 9
- Hauptstrahlteiler
- 11
- Strahlablenkeinrichtung
- 13
- Probe
- 15
- Detektionslicht
- 17
- Detektionsblende
- 19
- Detektor
- 21
- Photomultiplier
- 23
- Lichtquelle
- 25
- Manipulationslichtstrahl
- 27
- Spiegel
- 29
- Objekttisch
- 31
- erster
Drehspiegel
- 33
- zweiter
Drehspiegel
- 35
- dritter
Drehspiegel
- 37
- erste
Strahlfalle
- 39
- zweite
Strahlfalle