DE10230141B4 - Verfahren und Kit zur Anreicherung und zum Nachweis von veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) - Google Patents

Verfahren und Kit zur Anreicherung und zum Nachweis von veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) Download PDF

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Abstract

Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend die Schritte,
a) Inkubieren einer Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger mit einem β-Faltblatt-bindenden Molekül gekoppelt ist,
b) Entfernen der nicht an den β-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteilen, und
c) Nachweis der an den β-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteiln.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) von lebenden Organismen.
  • Transmissible Spongiforme Encephalopathien (TSE) sind beim Menschen und bei verschiedenen Tierarten auftretende, infektiöse und stets tödlich verlaufende degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die dabei auftretenden histopathologischen Veränderungen im Gehirn gehen einer mit der Akkumulation von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc), einem Konformer des natürlich vorkommenden zellulären Prion-Proteins (PrPC). Die im Krankheitsverlauf auftretende Prionen-Replikation erfolgt durch direkte Wechselwirkung zwischen PrPSc und PrPC, wodurch dem normalen PrPC die Konformation des pathologischen PrPSc aufgezwungen wird. PrPSc ist im Unterschied zu PrPC durch einen erhöhten β-Faltblatt-Anteil sowie eine hohe Resistenz gegenüber Proteasen (z.B. Proteinase K) gekennzeichnet.
  • Diese Resistenz des PrPSc wird derzeit in der in-vitro-Diagnostik zum Nachweis der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie (BSE) genutzt. Das Prinzip der derzeitigen Testsysteme besteht dann, dass Gewebeteile des Stammhirns (Obex-Region) homogenisiert und mit Proteinase K behandelt werden. Durch die Protease-Behandlung wird das normale PrPC vollständig abgebaut, während PrPSc aus BSE-infizierten Tieren lediglich um einige Aminosäuren verkürzt wird, was eine Reduktion der relativen Molekülmasse von 33–35 kDa auf 27–30 kDa zur Folge hat. Im Anschluss daran wird das verbleibende PrP mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern im Western-Blot oder ELISA-Verfahren visualisiert.
  • Der entscheidende Nachteil dieses Testsystems ist die geringe Sensitivität. Da die PrPSc-Konzentration bei BSE-infizierten Rindern ausschließlich im zentralen Nervensystem (ZNS) ausreichend hoch ist, beschränkt sich die bisherige Diagnostik auf post-mortem-Tests und setzt eine Inkubationszeit des infizierten Organisimus von mindestens 18 Monaten bis zu mehreren Jahren voraus.
  • Neben dem oben beschriebenen Nachweis von PrPSc gibt es zwei weitere methodische Verfahren zur Diagnostik von TSEs: die histopathologische Detektion der typischen schwammartigen Veränderungen im ZNS und ein Bioassay, welches die Infektiösität der Proben im Mausmodell nachweist. Beide Methoden haben ebenfalls entscheidende Nachteile. Die Histopathologie ist nicht zur präklinischen Diagnostik geeignet, da die strukturellen Veränderungen im Gehirn erst zu einem späten Zeitpunkt der Inkubation, kurz vor der klinischen Phase auftreten. Zudem erfolgt die Diagnose hier post mortem, da die Entnahme des notwendigen Hirnmaterials am lebenden Organismus nicht möglich ist. Der Bioassay ist zwar theoretisch in der Lage, eine einzige infektiöse Einheit zu detektieren, dauert jedoch mindestens mehrere Monate oder auch Jahre.
  • Um die Diagnostik so schnell wie möglich nach einer eventuellen Infektion bzw. bereits an einem noch lebenden Organismus durchführen zu können, muss die Sensitivität der bisherigen Nachweisverfahren wesentlich erhöht und der Nachweis in anderen Geweben/Körperflüssigkeiten als dem ZNS ermöglicht werden.
  • In der WO 93/11155 wird beschrieben, das Antikörper gegen die Prion-Proteine generiert werden, indem kurze synthetische Proteine mit einer Aminosäuresequenz wie sie in den Prion-Proteinen vorkommt, eingesetzt werden. In der WO 02/07781 werden zur in vivo Sichtbarmachung von Amyloidfibrillen bei Alzheimererkrankungen Amyloid-bindende Moleküle verwendet. Um eine Amyloidbildung zu hemmen wird in der Wo 97/21728 vorgeschlagen, kurze Peptide zur Bindung an das Amyloid-β-Peptid einzusetzen, und so die Amyloidbildung zu verhindern. In WO 00/40966 wird ein Verfahren zur Isolierung von Prion-Proteinen aus biologischen Proben unter Verwendung eines polaren organischen Lösungsmittels beschrieben. Die WO 01/23524 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von pathologischen Prion-Proteinen, wobei eine Probe mit einem festen Träger inkubiert wird, an den eine Prionen-Bindungsstelle, nämlich Plasminogen, gebunden ist.
  • Von Fischer et al. [Fischer, MB; Roeckl, C; Parizek, P; Schwarz, HP; Aguzzi, A (2000): Binding of disease-associated prion protein to plasminogen. Nature, 408:479–483] wurde eine Bindung des pathologischen PrPSc an humane Serumproteine wie z.B. Plasminogen beschrieben. Die Bindung des Prion-Proteins an Plasminogen ist abhängig von der Konformation des Proteins, da PrPC nicht gebunden werden kann. Fibrinogen ist ebenfalls in der Lage, PrPSc zu binden, jedoch nicht in Abwesenheit von Ca2+-Ionen.
  • Nach WO 02/00713 A1 wird die spezifische Bindung von PrPSc an humanes Plasminogen zur Isolation von PrPSc aus ZNS-Material verwendet. Dazu wird humanes Plasminogen an magnetischen Partikeln immobilisiert. Dieses Verfahren ist jedoch nur für den Nachweis von PrPSc in solchen Körperflüssigkeiten und Geweben geeignet, die kein Plasminogen enthalten und ist z.B. für den Nachweis von PrPSc in Serum ungeeignet. Weitere Nachteile, dieses Verfahrens sind der hohe Preis und die begrenzte Proteinbindungs-Kapazität der darin verwendeten Plasminogen-beladenen magnetischen Partikel.
  • Daher liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine Diagnose von TSE von noch lebenden Organismen ermöglicht.
  • Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
  • Die nachfolgenden Figuren erläutern die Erfindung.
  • 1 zeigt in einer graphischen Darstellung das Prinzip eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Anreicherung und zum Nachweis von PrPSc unter Verwendung von Festphasen-gekoppelten β-Faltblatt bindenden Molekulen.
  • 2 zeigt schematisch das Prinzip eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung des PrPSc-Plasminogen-Komplexes aus Körperflussigkeiten mit anschließendem Nachweis des angereicherten PrPSc mittels Plasminogen-Affinitätschromatographie.
  • 3 zeigt den Aufbau des PrPSc-Bindungsassays im MTP-Format (Beispiel 1). Verschiedene BSB-Peptide wurden als potentielle PrPSc-Fänger an einem Träger immobilisiert, nach Inkubation mit dem Probenmaterial wurde gebundenes PrPSc mittels monoklonaler anti-PrP-Antikörper visualisiert.
  • Der Begriff "β-Faltblatt-bindendes Molekül" wie hier verwendet beschreibt ein organisches Molekül, welches aufgrund seiner dreidimensionalen Struktur und/oder seiner physikalischen Eigenschaften in der Lage ist, in Wechselwirkungen mit β-Faltblatt-Strukturen in Proteinen zu treten und diese aufgrund dessen zu binden. Beispielhafte β-Faltblatt-bindende Moleküle sind in SEQ ID NO: 1 bis 10 aufgeführt.
  • Der Begriff „β-sheet-breaker (BSB)" wie hier verwendet beschreibt kurze Peptide, die an β-Faltblatt-Strukturen von β-Amyloid (Proteinaggregate bei der Alzheimerschen Erkrankung) und Amyloid-ähnlichen Strukturen binden und deren abnormale Faltung blockieren bzw. rückgängig machen können.
  • Als „BSE-positive Rinder" werden hier solche Tiere bezeichnet, in deren Stammhirn-Gewebe post mortem Proteinase K-resistentes Prion-Protein nachgewiesen werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend die folgenden Schritte:
    • a) Inkubieren einer Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger mit einem β-Faltblatt-bindenden Molekül gekoppelt ist,
    • b) Entfernen der nicht an den β-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteile, und
    • c) Nachweis der an den β-Faltblatt-bindenden Molekulen gebundenen Probenbestandteile (1).
  • Die zu untersuchende Probe kann eine Körperflüssigkeit, z.B. Blut, Serum, Plasma, Liquor, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Lymphe, oder ein Zell-Lysat, z.B. aus Leukozyten oder von Zellen der lymphatischen Gewebe, oder ein Gewebehomogenat, z.B. von Geweben des zentralen Nervensystems, von Lymphgewebe (z.B. Milz, Tonsillen, Lymphknoten) oder anderen Organen sein.
  • Vor der Inkubation kann die Probe gegebenenfalls einer Probenvorbereitung unterzogen werden. Dies kann insbesondere für Gewebeproben erforderlich sein. Diese können nach Zugabe einer geeigneten Puffer-Lösung, z.B. 50mM Phosphat-Puffer, pH 7,5, mechanisch zerkleinert, z.B. durch Ultraschall- oder Ribolyser-Behandlungen, und homogenisiert werden, um deren Bestandteile in Lösung bzw. Suspension zu bekommen. Zur Abtrennung fester Bestandteile kann die Probe ferner einem Zentrifugations- und/oder Filtrationsschritt unterzogen werden.
  • Gegebenenfalls kann die Probe mit oder ohne Probenvorbereitung vor der Inkubation zusätzlich oder ausschließlich einer Proteinase-Behandlung zum proteolytischen Abbau von PrPC unterzogen werden. Dazu wird das Probenmaterial mit einer Protease, z.B. Proteinase K behandelt. Der Protease-Verdau kann bei Standardbedingungen für die jeweilige Protease oder nach Angaben des Herstellers, vorzugsweise bei 37°C für 1h durchgeführt werden. Die verwendete Enzymkonzentration kann je nach Probenmaterial im Bereich von etwa 10μg/ml und etwa 1mg/ml liegen, vorzugsweise werden etwa 50μg/ml Enzym bei einem Proteingehalt des Probenmaterials von etwa 0,5 bis etwa 10mg/ml verwendet.
  • Feste Träger können sphärische Polymere (z.B. Sepharose, Agarose oder Latex), Plastik-Oberflächen (z.B. Mikrotiterplatten), Kieselgel-beschichtete Glasplatten (z.B. für Dünnschichtchromatographie), Kapillaren oder Membranen sein. Die sphärischen Polymere können als Träger in einer Säulen-Chromatographie oder im Batch-Verfahren (z.B. Magnetic Beads) verwendet werden. Werden die Polymere zur Säulen-Chromatographie eingesetzt, werden sie vorzugsweise in vorgepackten Einweg-Säulen verwendet. Neben den hier aufgeführten festen Trägern ist ferner jeder feste Träger geeignet, der zur Kopplung von β-Faltblatt-bindenden Molekülen verwendet werden kann.
  • Die Probe kann in einem geschlossenen Gefäß für etwa 5 bis etwa 120min bei einer Temperatur im Bereich von etwa 4°C bis etwa 50°C mit der festen Träger, z.B. Glasplatten, Mikrotiterplatten, inkubiert werden. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation bei 37°C für 1h in einem Schüttelinkubator mit niedriger Rotationsfrequenz (z.B. 80rpm). Durch die Inkubation der Probe mit dem festen Träger wird das in der Probe enthaltene PrPSc an das an der festen Träger immobilisierte β-Faltblatt-bindende Molekül gebunden. Wird als feste Träger z.B. ein sphärisches Polymer als Träger in einer Säulen-Chromatographie verwendet, findet die Inkubation in der Säule statt. Je nach Säule kann die Inkubationszeit variieren, abhängig vom Anschluss der Säule an eine Apparatur.
  • Die an den festen Träger gekoppelten β-Faltblatt-bindenden Moleküle sind in der Lage, PrPSc, nicht jedoch PrPC zu binden. Erfindungsgemäß sind die β-Faltblatt-bindenden Moleküle Oligopeptide bestehend aus 3 bis etwa 30 Aminosäuren, vorzugsweise 4, 5 oder 6 Aminosäuren. Diese Peptide können C- und/oder N-terminal modifiziert sein, z.B. um eine bessere Löslichkeit zu erreichen. Insbesondere bevorzugte β-Faltblatt-bindende Moleküle sind in Tab. 1 und als SEQ ID NO: 1 bis 10 aufgeführt. Das β-Faltblatt-bindende Molekül kann ebenfalls ein substituierter heterocyclischer Aromat sein, vorteilhaft ein Flavonoid, beispielsweise Thioflavin T, Baicalin oder Quercitrin.
  • Die Immobilisierung der β-Faltblatt-bindenden Moleküle an den festen Träger erfolgt vorzugsweise über eine kovalente Bindung. Zur Kopplung an den Träger werden funktionelle Gruppen, wie z.B. Amino-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen, am β-Faltblatt-bindenden Molekül genutzt. Ist das β-Faltblatt-bindende Molekül ein Peptid, erfolgt die Kopplung vorzugsweise über die Amino-Gruppe am N-Terminus oder die Carboxyl-Gruppe am C- Terminus. Ist das Oligopeptid das Pentapeptid mit der Sequenz KLVFF (SEQ ID NO:2), wird vorzugsweise über die Carboxyl-Gruppe am C-Terminus gekoppelt, da bei einer Amino-Gruppenkopplung das Peptid auch an der Seitenkette des Lysin-Restes fixiert werden würde, was zur sterischen Behinderung der PrPSc-Bindung führen könnte.
  • Im Anschluss an die Inkubation der Probe mit dem festen Träger erfolgt das Entfernen der nicht am β-Faltblatt-bindenden Molekül gebundenen Probenbestandteile, vorzugsweise durch einen Waschschritt. Als Waschlösung dient eine gepufferte Lösung, mit geeigneten, Stringenzerhöhenden Zusätzen. Der pH-Wert der Waschlösung liegt im neutralen Bereich, vorzugsweise bei pH 7,5. Zum Puffern der Lösung dient vorzugsweise 50mM Phosphatpuffer. Darüber hinaus ist jeder Puffer geeignet, mit dem ein pH-Wert im neutralen Bereich eingestellt werden kann. Die Stringenz-erhöhenden Zusätze können anorganische Salze, z.B. NaCl, sowie Detergenzien, z.B. SDS, Triton X 100 oder Tween 20, oder chaotrope Reagenzien, z.B. Harnstoff, Guanidinium Hydrochlorid oder Guanidinium Isothiocyanat, sein. Vorteilhaft wird eine gepufferte Lösung mit 1 bis 4M NaCl als Waschlösung eingesetzt.
  • In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Trägermaterials wird das an die β-Faltblatt-bindenden Moleküle gebundene PrPSc gegebenenfalls von dem festen Träger eluiert (z.B. bei Einsatz von sphärischen Polymeren in der Säulen-Chromatographie). Bei anderen Trägern, z.B. Membranen oder Plastikoberflächen, kann der Nachweis des PrPSc direkt an dem festen Träger erfolgen. Falls gewünscht, kann jedoch auch hier eluiert werden.
  • Zur Elution des PrPSc vom β-Faltblatt-bindenden Molekül und damit von dem festen Träger wird der Träger mit einem möglichst kleinen Volumen Elutionslösung gespült. Um einen für die Sensitivität des verwendeten Nachweissystems ausreichenden Konzentrationseffekt zu erzielen, ist das Elutionsvolumen um ein Vielfaches kleiner, als das Probenvolumen. Vorteilhaft ist das Elutionsvolumen um den Faktor 100 bis 10000 kleiner als das verwendete Probenvolumen.
  • Beim Vergleich der Elutionseffizienzen (Tab. 2) erwies sich insbesondere ein Detergenz-haltiger Puffer (mit 5% SDS) als geeignet, PrPSc vollständig vom Fänger-Molekül zu eluieren. In Anwesenheit von chaotropen Reagenzien (z.B. 6M Harnstoff) wurde PrPSc nur teilweise eluiert. In Elutionspuffern mit niedrigem pH-Wert (z.B. pH3) bzw. hoher Innenstärke (z.B. 2M NaCl) blieb PrPSc nahezu vollständig am Fänger-Molekül gebunden.
  • Als Elutionslösung wird eine gepufferte Lösung verwendet, Zusätze enthaltend, welche die Bindung zwischen PrPSc und dem Fänger-Molekül lösen. Der pH-Wert der Elutionslösung liegt im Bereich von etwa pH 6 bis etwa pH 8,5, vorzugsweise bei pH 7,5. Zum Puffern der Lösung dient vorzugsweise 50mM Phosphatpuffer. Darüber hinaus ist jeder Puffer geeignet, mit dem ein pH-Wert im vorstehend beschriebenen, vorzugsweise im neutralen Bereich, eingestellt werden kann. Die Zusätze können beispielsweise Detergenzien, z.B. SDS, Triton X 100 oder Tween 20, chaotrope Reagenzien, z.B. Harnstoff, Guanidinium Hydrochlorid oder Guanidinium Isothiocyanat, anorganische Salze, z.B. NaCl, oder organische Verbindungen, z.B. e-Aminocapronsäure oder Lysin, sein. Vorzugsweise enthält die Elutionslösung Detergenzien, beispielsweise 5% SDS.
  • Anschließend wird das in den vorhergehenden Verfahrensschritten angereicherte PrPSc nachgewiesen. Dazu können immunchemische (z.B. ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation), biophysikalische (z.B. Massenspektrometrie, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie), biochemische (z.B. Bestimmung biochemischer Parameter, wie z.B. relative Molmasse, N-terminale bzw. C-terminale Aminosäuresequenz, Assoziations- und Dissoziationskonstanten von Bindungspartnern) oder biologische (z.B. Cytotoxizitätsassay) Nachweisverfahren zum Einsatz kommen.
  • Vorzugsweise wird der Nachweis mit einem Verfahren durchgeführt, das eine schnelle Detektion der PrPSc ermöglicht. Das kann z.B. ein immunologisches Nachweisverfahren vorzugsweise ein Sandwich-ELISA sein. Der Sandwich-ELISA wird nach bekanntem Verfahren durchgeführt. Dabei kann die Markierung des Detektions-Antikörpers z.B. ein Enzym (z.B. Meerrettich-Peroxidase), eine gefärbte Verbindung, ein Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein), ein Goldpartikel oder eine Nukleinsäure (z.B. ein DNA- oder RNA-Oligonucleotid) sein.
  • Bei einer Enzym-Markierung wird die Farbintensität nach Substratumsetzung photometrisch erfasst und ist der in der Probe enthaltenen PrPSc-Menge proportional. Ist die Antikörpermarkierung eine gefärbte Verbindung oder ein Fluoreszenzfarbstoff, wird die Farb- bzw. Fluoreszenzintensität direkt gemessen. Ist die Antikörpermarkierung ein Nukleinsäure, wird die Menge an gebundenem Antikörper über die Absorption des DNA- bzw. RNA-Labels bestimmt, wobei das Signal durch PCR (z.B. real-time-PCR) amplifiziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Kit zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) in Körperflüssigkeiten, Zell-Lysaten, Gewebehomogenaten oder anderen Flussigkeiten. Erfindungsgemäß enthält der Test-Kit einen festen Träger zur Anreicherung von PrPSc, ein immunologisches Nachweissystem, Solubilisierungs-, Wasch- und Elutionspufferkonzentraten, verschiedenen Kontrollen, einem Enzym-markierten anti-PrP-Antikörper sowie einer entsprechenden Substrat- und Stopplösung.
  • Die verwendeten festen Träger sind vorzugsweise affinitätschromatographische Materialien, z.B. Sepharose oder Agarose, die in Einwegsäulen verwendet werden und, die mit den erfindungsgemäßen β-Faltblatt-bindenden Molekülen gekoppelt sind. Die festen Träger mit den erfindungsgemäßen Kopplungen können als Suspension, in getrockneter Form oder bereits in Einweg-Säulen gepackt im Test-Kit enthalten sein.
  • Das immunologische Nachweissystem ist vorzugsweise ein Sandwich-ELISA, bei dem ein zweiter fester Träger z.B. eine Mikrotiterplatte mit einem spezifischen Antikörper gegen PrP, vorzugsweise mit monoklonalen anti-PrP-Antikörper, insbesondere Maus-anti-PrP-Antikörper, beschichtet ist. Die festen Träger liegen dem Test-Kit insbesondere vakuumverpackt bei.
  • Als Kontrollen werden vorzugsweise rekombinant hergestelltes PrP bzw. PrP-Peptide verwendet. Als Antikörper-Markierung wird vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase verwendet.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren und Test-Kits ermöglichen breit angelegte Untersuchungen mit hohen Probenzahlen, wie sie in den Bereichen Medizin und Landwirtschaft gefordert werden. Im Unterschied zu allen bisher beschriebenen Verfahren sind die erfindungsgemäßen Verfahren auch für die TSE-Diagnostik am lebenden Tieren und Menschen geeignet.
  • Anhand der nachfolgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.
  • Beispiel 1: Isolierung von PrPSc mittels BSB-Peptiden im MTP-Format
  • Eine MTP (Mikrotiterplatte) (Nunc-ImmunoTM Plate MaxisorpTM Surface, F96 (NUnc, Roskilde, Dänemark)), wurde mit verschiedenen BSB-Peptiden beschichtet (3). Die Beschichtung erfolgte durch Inkubation mit 100μl Peptidlösung (10μg/ml in 0,1M Carbonatpuffer pH 9,6) pro Kavität für 16h bei 4°C. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgesaugt und die MTP dreimal mit 300μl Waschpuffer (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) pro Kavität gewaschen. Freie Bindungsplätze wurden durch Inkubation mit 0,5% Casein in Waschpuffer bei Raumtemperatur für 1h blockiert. Nach einem Waschschritt (dreimal 300μl Waschpuffer pro Kavität) wurde die beschichtete MTP mit 100μl pro Kavität der PrPSc-haltigen Probe (Hirnhomogenat von BSE-positiven Rindern) für 1h bei 37°C mit Folie abgedeckt inkubiert. Nicht gebundenes Probenmaterial wurde abgesaugt und die MTP dreimal mit 300μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen. Die Inkubation mit dem Detektions-Antikörper (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) erfolgte für 1h bei Raumtemperatur. Überschüssiges Konjugat wurde durch fünfmaliges Waschen mit 300μl Waschpuffer pro Kavität entfernt. Nach Zugabe der Substratlösung (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) wurde die Farbentwicklung nach 30min durch Zusatz von 1M HCl abgestoppt und die Farbintensität durch Extinktions-Messung bei 450nm (Referenz 620nm) registriert.
  • Die gemessene Extinktion ist der am BSB-Peptid gebundenen Menge an PrPSc proportional und somit ein Maß für die Effizienz des Fänger-Moleküls. Die relativen Bindungseffizienzen der getesteten BSB-Peptide sind in Tab. 1 zusammengefasst, wobei das Signal des besten β-Faltblatt-bindenden Moleküls (Peptid 2) gleich 100% gesetzt wurde.
  • Tab. 1: Vergleich der PrPSc-Bindungseffizienz verschiedener BSB-Peptide
    Figure 00110001
  • Beispiel 2: Elution des an KLVFF gebundenen PrPSc im MTP-Format
  • Die Bindung zwischen PrPSc und den Fänger-Molekülen ist sehr stark, so dass zur Elution des PrPSc von dem festen Träger vergleichsweise drastische Bedingungen nötig sind. Die Elutionsbedingungen wurden ebenfalls im MTP-Format gestestet.
  • Analog Beispiel 1 wurde eine MTP mit Peptid 2 (KLVFF) beschichtet und mit PrPSc beladen. Nach dreimaligem Waschen mit 300μl Waschpuffer (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) pro Kavität wurden jeweils 100μl der potentiellen Elutionspuffer zugegeben und für 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgenommen und die eluierte Menge PrPSc im Elutionspuffer sowie die verbleibende Menge PrPSc an der MTP mit Hilfe des Platelia® BSE Detection Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) bestimmt. Beim Vergleich der Elutionseffizienzen (Tab.2) erwies sich lediglich ein Detergenz-haltiger Puffer (mit 5% SDS) als geeignet, PrPSc vollständig vom Fänger-Molekül zu eluieren. In Anwesenheit von chaotropen Reagenzien (z.B. 6M Harnstoff) wurde PrPSc nur teilweise eluiert. In Elutionspuffern mit niedrigem pH-Wert (z.B. pH3) bzw. hoher Innenstärke (z.B. 2M NaCl) blieb PrPSc nahezu vollständig am Fänger-Molekül gebunden.
  • Tab. 2: Vergleich verschiedener Elutionsbedingungen
    Figure 00120001
  • Beispiel 3: Kovalente Kopplung des BSB-Peptids KLVFF an EAH-Sepharose
  • Bei einer Kopplung über Amino-Gruppen würde das Peptid sowohl am N-Terminus als auch an der Seitenkette (Lys) fixiert werden, was zur Störung der dreidimensionalen Struktur führen könnte. Aus diesem Grund erfolgte die spezifische Bindung des β-Faltblatt-bindendes Moleküls KLVFF an den festen Träger über die Carboxyl-Gruppe am C-Terminus des Peptids. Als Trägermaterial diente EAH-Sepharose® 4B (Amersham Phannacia Biotech, Uppsala, Schweden).
  • Zur Vorbereitung der Kopplungsreaktion wurde die EAH-Sepharose mit 0,5M NaCl gewaschen und überstehende Flüssigkeit vollständig entfernt. Der Ligand, das Pentapeptid mit der Sequenz KLVFF, wurde in H2O gelöst und der pH-Wert mit HCl auf 4,5 eingestellt. Das Gel wurde in der Ligand-Lösung resuspendiert und EDC (N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid) wurde in einer Endkonzentration von 0,1M zugegeben. Die Kopplungsreaktion erfolgte bei Raumtemperatur über 24h unter leichtem Schwenken. Anschließend wurde der Überstand des abgesetzten Gels vollständig abgenommen. Gegebenenfalls vorhandene freie Bindungsplätze wurden mit 1M Essigsäure in Anwesenheit von 0,1M EDC blockiert. Das KLVFF-beladene Gel wurde in eine Chromatographiesäule gefüllt und mindestens dreimal abwechselnd mit Puffer A (0,1M Na-Acetat, 0,5M NaCl pH 4) und Puffer B (0,1M Tris/HCl, 0,5M NaCl pH 8) und anschließend mit H2O gewaschen.
  • Beispiel 4: Isolierung von PrPSc aus Hirnhomogenat mittels KLVFF-Sepharose
  • Zum Nachweis der Eignung der KLVFF-Sepharose als β-Faltblatt-bindendes Molekül wurde PrPSc aus Hirnhomogenat von BSE-positiven Rindern an das Säulenmaterial gebunden und anschließend wieder eluiert. Die Aufarbeitung des Hirnmaterials erfolgte mit dem BSE Purification Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) nach Angaben des Herstellers. Das Probenmaterial wurde in Probenverdünnungspuffer R6 (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) aufgenommen. Eine Tropfsäule wurde mit 1ml KLVFF-Sepharose hergestellt wie in Beispiel 3 angegeben gefüllt und mit PBS bei Raumtemperatur äquilibriert. Nach Probenauftragung wurde die Säule mit PBS gewaschen und der Durchlauf fraktioniert gesammelt. Gebundenes PrPSc wurde anschließend mit 5% SDS in PBS eluiert. Die in den einzelnen Fraktionen enthaltene Menge an PrPSc wurde immunologisch mit Hilfe des Platelia® BSE Detection Kit ermittelt.
  • Beispiel 5: Herstellung eines festen Trägers zum Einsatz in einem Test-Kit zum Nachweis von angereichertem PrPSc
  • Die Beschichtung einer MTP (Nunc-ImmunoTM Plate MaxisorpTM Surface, F96 (Nunc, Roskilde, Dänemark)) erfolgte durch Inkubation von 100μl/Kavität mit einem monoklonalen Maus-anti-PrP-Antikörper (Clone: F89/160.1.5, Dianova, Hamburg) über 12h bei 4–8°C. Nicht gebundener Maus-Anti-PrP-Antikörper wurde abgesaugt und die Platte 3× mit 300μl pro Kavität mit Waschpuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20) gewaschen. Es folgte die Blockierung der freien Bindungsstellen mit 300μl einer 1%-igen Serumalbuminlösung in Carbonatpuffer (0,1M, pH 9,6) 0,5–1h bei Raumtemperatur. Daran schloss sich ein Waschschritt von 3× 300μl Waschpuffer pro Kavität an, bevor die beschichteten und blockierten MTP 12 bis 14h im Luftstrom getrocknet wurden.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001

Claims (11)

  1. Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend die Schritte, a) Inkubieren einer Probe mit einem festen Träger, wobei der feste Träger mit einem β-Faltblatt-bindenden Molekül gekoppelt ist, b) Entfernen der nicht an den β-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteilen, und c) Nachweis der an den β-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen Probenbestandteiln.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe vor Schritt a) einer Proteinase-Behandlung unterzogen wird.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit, ein Zell-Lysat, oder ein Gewebehomogenat ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Körperflüssigkeit Blut, Serum, Plasma, Liquor, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel oder Lymphe ist, das Zell-Lysat ein Leukozytenlysat oder ein Lysat von Zellen der lymphatischen Gewebe ist, und das Gewebehomogenat aus dem zentralen Nervensystem, von Lymphgewebe oder anderen Organen ist.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger ein sphärisches Polymer, eine Plastik-Oberfläche, Kieselgel-beschichtete Glasplatte, Kapillare oder Membran ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die β-Faltblattbindenden Moleküle Oligopeptide mit einer Länge von drei bis 30 Aminosäureresten oder substituierte heterocyclische Aromaten sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Oligopeptide eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 bis 10 aufweisen.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis mittels eines immunologischen Nachweisverfahrens durchgeführt wird.
  9. Kit zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend einen ersten festen Träger gekoppelt mit β-Faltblatt-bindenden Molekülen, Wasch- und Elutionslösungen und einem Nachweissystem.
  10. Kit nach Anspruch 9, wobei das Nachweissystem ein immunologisches Nachweissystem ist und einen, zweiten festen Träger, beschichtet mit einem anti-PrP-Antikörper, einen Enzym-markierten Zweit-Antikörper und Substrat- und Stopplösungen umfasst.
  11. Kit nach Anspruch 9 oder 10, wobei der erste feste Träger in einer Einwegsäule gepackt ist und der zweite feste Träger eine Mikrotiterplatte ist.
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