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Die vorliegende Erfindung betrifft
Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) von lebenden Organismen.
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Transmissible Spongiforme Encephalopathien
(TSE) sind beim Menschen und bei verschiedenen Tierarten auftretende,
infektiöse
und stets tödlich
verlaufende degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Die dabei auftretenden histopathologischen Veränderungen im Gehirn gehen einer
mit der Akkumulation von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc), einem Konformer des natürlich vorkommenden zellulären Prion-Proteins
(PrPC). Die im Krankheitsverlauf auftretende
Prionen-Replikation erfolgt durch direkte Wechselwirkung zwischen
PrPSc und PrPC,
wodurch dem normalen PrPC die Konformation
des pathologischen PrPSc aufgezwungen wird.
PrPSc ist im Unterschied zu PrPC durch
einen erhöhten β-Faltblatt-Anteil sowie eine hohe
Resistenz gegenüber
Proteasen (z.B. Proteinase K) gekennzeichnet.
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Diese Resistenz des PrPSc wird
derzeit in der in-vitro-Diagnostik zum Nachweis der Bovinen Spongiformen
Enzephalopathie (BSE) genutzt. Das Prinzip der derzeitigen Testsysteme
besteht dann, dass Gewebeteile des Stammhirns (Obex-Region) homogenisiert
und mit Proteinase K behandelt werden. Durch die Protease-Behandlung
wird das normale PrPC vollständig abgebaut,
während
PrPSc aus BSE-infizierten Tieren lediglich
um einige Aminosäuren
verkürzt
wird, was eine Reduktion der relativen Molekülmasse von 33–35 kDa auf
27–30
kDa zur Folge hat. Im Anschluss daran wird das verbleibende PrP
mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern
im Western-Blot oder ELISA-Verfahren visualisiert.
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Der entscheidende Nachteil dieses
Testsystems ist die geringe Sensitivität. Da die PrPSc-Konzentration bei
BSE-infizierten Rindern ausschließlich im zentralen Nervensystem
(ZNS) ausreichend hoch ist, beschränkt sich die bisherige Diagnostik
auf post-mortem-Tests und setzt eine Inkubationszeit des infizierten
Organisimus von mindestens 18 Monaten bis zu mehreren Jahren voraus.
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Neben dem oben beschriebenen Nachweis
von PrPSc gibt es zwei weitere methodische
Verfahren zur Diagnostik von TSEs: die histopathologische Detektion
der typischen schwammartigen Veränderungen
im ZNS und ein Bioassay, welches die Infektiösität der Proben im Mausmodell
nachweist. Beide Methoden haben ebenfalls entscheidende Nachteile.
Die Histopathologie ist nicht zur präklinischen Diagnostik geeignet,
da die strukturellen Veränderungen
im Gehirn erst zu einem späten
Zeitpunkt der Inkubation, kurz vor der klinischen Phase auftreten.
Zudem erfolgt die Diagnose hier post mortem, da die Entnahme des
notwendigen Hirnmaterials am lebenden Organismus nicht möglich ist.
Der Bioassay ist zwar theoretisch in der Lage, eine einzige infektiöse Einheit
zu detektieren, dauert jedoch mindestens mehrere Monate oder auch
Jahre.
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Um die Diagnostik so schnell wie
möglich
nach einer eventuellen Infektion bzw. bereits an einem noch lebenden
Organismus durchführen
zu können,
muss die Sensitivität
der bisherigen Nachweisverfahren wesentlich erhöht und der Nachweis in anderen
Geweben/Körperflüssigkeiten
als dem ZNS ermöglicht
werden.
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In der WO 93/11155 wird beschrieben,
das Antikörper
gegen die Prion-Proteine generiert werden, indem kurze synthetische
Proteine mit einer Aminosäuresequenz
wie sie in den Prion-Proteinen vorkommt, eingesetzt werden. In der
WO 02/07781 werden zur in vivo Sichtbarmachung von Amyloidfibrillen
bei Alzheimererkrankungen Amyloid-bindende Moleküle verwendet. Um eine Amyloidbildung
zu hemmen wird in der Wo 97/21728 vorgeschlagen, kurze Peptide zur
Bindung an das Amyloid-β-Peptid
einzusetzen, und so die Amyloidbildung zu verhindern. In WO 00/40966
wird ein Verfahren zur Isolierung von Prion-Proteinen aus biologischen
Proben unter Verwendung eines polaren organischen Lösungsmittels
beschrieben. Die WO 01/23524 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis
von pathologischen Prion-Proteinen, wobei eine Probe mit einem festen
Träger
inkubiert wird, an den eine Prionen-Bindungsstelle, nämlich Plasminogen,
gebunden ist.
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Von Fischer et al. [Fischer, MB;
Roeckl, C; Parizek, P; Schwarz, HP; Aguzzi, A (2000): Binding of
disease-associated prion protein to plasminogen. Nature, 408:479–483] wurde
eine Bindung des pathologischen PrPSc an
humane Serumproteine wie z.B. Plasminogen beschrieben. Die Bindung
des Prion-Proteins an Plasminogen ist abhängig von der Konformation des
Proteins, da PrPC nicht gebunden werden
kann. Fibrinogen ist ebenfalls in der Lage, PrPSc zu
binden, jedoch nicht in Abwesenheit von Ca2+-Ionen.
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Nach WO 02/00713 A1 wird die spezifische
Bindung von PrPSc an humanes Plasminogen
zur Isolation von PrPSc aus ZNS-Material
verwendet. Dazu wird humanes Plasminogen an magnetischen Partikeln
immobilisiert. Dieses Verfahren ist jedoch nur für den Nachweis von PrPSc in solchen Körperflüssigkeiten und Geweben geeignet,
die kein Plasminogen enthalten und ist z.B. für den Nachweis von PrPSc in Serum ungeeignet. Weitere Nachteile,
dieses Verfahrens sind der hohe Preis und die begrenzte Proteinbindungs-Kapazität der darin
verwendeten Plasminogen-beladenen magnetischen Partikel.
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Daher liegt der Erfindung die Aufgabe
zu Grunde, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine Diagnose
von TSE von noch lebenden Organismen ermöglicht.
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Die Aufgabe wird durch den in den
Patentansprüchen
definierten Gegenstand gelöst.
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Die nachfolgenden Figuren erläutern die
Erfindung.
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1 zeigt
in einer graphischen Darstellung das Prinzip eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Anreicherung und zum Nachweis von PrPSc unter
Verwendung von Festphasen-gekoppelten β-Faltblatt bindenden Molekulen.
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2 zeigt
schematisch das Prinzip eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung
des PrPSc-Plasminogen-Komplexes aus Körperflussigkeiten
mit anschließendem
Nachweis des angereicherten PrPSc mittels
Plasminogen-Affinitätschromatographie.
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3 zeigt
den Aufbau des PrPSc-Bindungsassays im MTP-Format
(Beispiel 1). Verschiedene BSB-Peptide wurden als potentielle PrPSc-Fänger
an einem Träger
immobilisiert, nach Inkubation mit dem Probenmaterial wurde gebundenes
PrPSc mittels monoklonaler anti-PrP-Antikörper visualisiert.
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Der Begriff "β-Faltblatt-bindendes
Molekül" wie hier verwendet
beschreibt ein organisches Molekül, welches
aufgrund seiner dreidimensionalen Struktur und/oder seiner physikalischen
Eigenschaften in der Lage ist, in Wechselwirkungen mit β-Faltblatt-Strukturen
in Proteinen zu treten und diese aufgrund dessen zu binden. Beispielhafte β-Faltblatt-bindende
Moleküle
sind in SEQ ID NO: 1 bis 10 aufgeführt.
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Der Begriff „β-sheet-breaker (BSB)" wie hier verwendet
beschreibt kurze Peptide, die an β-Faltblatt-Strukturen
von β-Amyloid
(Proteinaggregate bei der Alzheimerschen Erkrankung) und Amyloid-ähnlichen Strukturen
binden und deren abnormale Faltung blockieren bzw. rückgängig machen
können.
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Als „BSE-positive Rinder" werden hier solche
Tiere bezeichnet, in deren Stammhirn-Gewebe post mortem Proteinase
K-resistentes Prion-Protein nachgewiesen werden kann.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc), umfassend die folgenden Schritte:
- a) Inkubieren einer Probe mit einem festen
Träger,
wobei der feste Träger
mit einem β-Faltblatt-bindenden Molekül gekoppelt
ist,
- b) Entfernen der nicht an den β-Faltblatt-bindenden Molekülen gebundenen
Probenbestandteile, und
- c) Nachweis der an den β-Faltblatt-bindenden
Molekulen gebundenen Probenbestandteile (1).
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Die zu untersuchende Probe kann eine
Körperflüssigkeit,
z.B. Blut, Serum, Plasma, Liquor, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Lymphe,
oder ein Zell-Lysat, z.B. aus Leukozyten oder von Zellen der lymphatischen Gewebe,
oder ein Gewebehomogenat, z.B. von Geweben des zentralen Nervensystems,
von Lymphgewebe (z.B. Milz, Tonsillen, Lymphknoten) oder anderen
Organen sein.
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Vor der Inkubation kann die Probe
gegebenenfalls einer Probenvorbereitung unterzogen werden. Dies kann
insbesondere für
Gewebeproben erforderlich sein. Diese können nach Zugabe einer geeigneten
Puffer-Lösung,
z.B. 50mM Phosphat-Puffer, pH 7,5, mechanisch zerkleinert, z.B.
durch Ultraschall- oder Ribolyser-Behandlungen, und homogenisiert
werden, um deren Bestandteile in Lösung bzw. Suspension zu bekommen.
Zur Abtrennung fester Bestandteile kann die Probe ferner einem Zentrifugations-
und/oder Filtrationsschritt unterzogen werden.
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Gegebenenfalls kann die Probe mit
oder ohne Probenvorbereitung vor der Inkubation zusätzlich oder ausschließlich einer
Proteinase-Behandlung zum proteolytischen Abbau von PrPC unterzogen
werden. Dazu wird das Probenmaterial mit einer Protease, z.B. Proteinase
K behandelt. Der Protease-Verdau kann bei Standardbedingungen für die jeweilige
Protease oder nach Angaben des Herstellers, vorzugsweise bei 37°C für 1h durchgeführt werden.
Die verwendete Enzymkonzentration kann je nach Probenmaterial im
Bereich von etwa 10μg/ml
und etwa 1mg/ml liegen, vorzugsweise werden etwa 50μg/ml Enzym
bei einem Proteingehalt des Probenmaterials von etwa 0,5 bis etwa
10mg/ml verwendet.
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Feste Träger können sphärische Polymere (z.B. Sepharose,
Agarose oder Latex), Plastik-Oberflächen (z.B.
Mikrotiterplatten), Kieselgel-beschichtete Glasplatten (z.B. für Dünnschichtchromatographie),
Kapillaren oder Membranen sein. Die sphärischen Polymere können als
Träger
in einer Säulen-Chromatographie
oder im Batch-Verfahren (z.B. Magnetic Beads) verwendet werden.
Werden die Polymere zur Säulen-Chromatographie
eingesetzt, werden sie vorzugsweise in vorgepackten Einweg-Säulen verwendet.
Neben den hier aufgeführten
festen Trägern
ist ferner jeder feste Träger
geeignet, der zur Kopplung von β-Faltblatt-bindenden
Molekülen
verwendet werden kann.
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Die Probe kann in einem geschlossenen
Gefäß für etwa 5
bis etwa 120min bei einer Temperatur im Bereich von etwa 4°C bis etwa
50°C mit
der festen Träger,
z.B. Glasplatten, Mikrotiterplatten, inkubiert werden. Vorzugsweise
erfolgt die Inkubation bei 37°C
für 1h
in einem Schüttelinkubator
mit niedriger Rotationsfrequenz (z.B. 80rpm). Durch die Inkubation
der Probe mit dem festen Träger
wird das in der Probe enthaltene PrPSc an das
an der festen Träger
immobilisierte β-Faltblatt-bindende
Molekül
gebunden. Wird als feste Träger
z.B. ein sphärisches
Polymer als Träger
in einer Säulen-Chromatographie
verwendet, findet die Inkubation in der Säule statt. Je nach Säule kann
die Inkubationszeit variieren, abhängig vom Anschluss der Säule an eine
Apparatur.
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Die an den festen Träger gekoppelten β-Faltblatt-bindenden
Moleküle
sind in der Lage, PrPSc, nicht jedoch PrPC zu binden. Erfindungsgemäß sind die β-Faltblatt-bindenden
Moleküle
Oligopeptide bestehend aus 3 bis etwa 30 Aminosäuren, vorzugsweise 4, 5 oder
6 Aminosäuren.
Diese Peptide können
C- und/oder N-terminal modifiziert sein, z.B. um eine bessere Löslichkeit
zu erreichen. Insbesondere bevorzugte β-Faltblatt-bindende Moleküle sind
in Tab. 1 und als SEQ ID NO: 1 bis 10 aufgeführt. Das β-Faltblatt-bindende Molekül kann ebenfalls
ein substituierter heterocyclischer Aromat sein, vorteilhaft ein
Flavonoid, beispielsweise Thioflavin T, Baicalin oder Quercitrin.
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Die Immobilisierung der β-Faltblatt-bindenden
Moleküle
an den festen Träger
erfolgt vorzugsweise über
eine kovalente Bindung. Zur Kopplung an den Träger werden funktionelle Gruppen,
wie z.B. Amino-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen, am β-Faltblatt-bindenden
Molekül
genutzt. Ist das β-Faltblatt-bindende
Molekül ein
Peptid, erfolgt die Kopplung vorzugsweise über die Amino-Gruppe am N-Terminus
oder die Carboxyl-Gruppe am C- Terminus.
Ist das Oligopeptid das Pentapeptid mit der Sequenz KLVFF (SEQ ID
NO:2), wird vorzugsweise über
die Carboxyl-Gruppe am C-Terminus gekoppelt, da bei einer Amino-Gruppenkopplung das
Peptid auch an der Seitenkette des Lysin-Restes fixiert werden würde, was
zur sterischen Behinderung der PrPSc-Bindung
führen
könnte.
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Im Anschluss an die Inkubation der
Probe mit dem festen Träger
erfolgt das Entfernen der nicht am β-Faltblatt-bindenden Molekül gebundenen
Probenbestandteile, vorzugsweise durch einen Waschschritt. Als Waschlösung dient
eine gepufferte Lösung,
mit geeigneten, Stringenzerhöhenden
Zusätzen.
Der pH-Wert der Waschlösung
liegt im neutralen Bereich, vorzugsweise bei pH 7,5. Zum Puffern
der Lösung
dient vorzugsweise 50mM Phosphatpuffer. Darüber hinaus ist jeder Puffer
geeignet, mit dem ein pH-Wert im neutralen Bereich eingestellt werden
kann. Die Stringenz-erhöhenden
Zusätze
können
anorganische Salze, z.B. NaCl, sowie Detergenzien, z.B. SDS, Triton
X 100 oder Tween 20, oder chaotrope Reagenzien, z.B. Harnstoff,
Guanidinium Hydrochlorid oder Guanidinium Isothiocyanat, sein. Vorteilhaft
wird eine gepufferte Lösung
mit 1 bis 4M NaCl als Waschlösung
eingesetzt.
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In Abhängigkeit von der Beschaffenheit
des Trägermaterials
wird das an die β-Faltblatt-bindenden Moleküle gebundene
PrPSc gegebenenfalls von dem festen Träger eluiert
(z.B. bei Einsatz von sphärischen
Polymeren in der Säulen-Chromatographie).
Bei anderen Trägern,
z.B. Membranen oder Plastikoberflächen, kann der Nachweis des
PrPSc direkt an dem festen Träger erfolgen.
Falls gewünscht,
kann jedoch auch hier eluiert werden.
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Zur Elution des PrPSc vom β-Faltblatt-bindenden
Molekül
und damit von dem festen Träger
wird der Träger
mit einem möglichst
kleinen Volumen Elutionslösung
gespült.
Um einen für
die Sensitivität
des verwendeten Nachweissystems ausreichenden Konzentrationseffekt
zu erzielen, ist das Elutionsvolumen um ein Vielfaches kleiner,
als das Probenvolumen. Vorteilhaft ist das Elutionsvolumen um den
Faktor 100 bis 10000 kleiner als das verwendete Probenvolumen.
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Beim Vergleich der Elutionseffizienzen
(Tab. 2) erwies sich insbesondere ein Detergenz-haltiger Puffer (mit
5% SDS) als geeignet, PrPSc vollständig vom
Fänger-Molekül zu eluieren.
In Anwesenheit von chaotropen Reagenzien (z.B. 6M Harnstoff) wurde
PrPSc nur teilweise eluiert. In Elutionspuffern
mit niedrigem pH-Wert (z.B. pH3) bzw. hoher Innenstärke (z.B.
2M NaCl) blieb PrPSc nahezu vollständig am
Fänger-Molekül gebunden.
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Als Elutionslösung wird eine gepufferte Lösung verwendet,
Zusätze
enthaltend, welche die Bindung zwischen PrPSc und
dem Fänger-Molekül lösen. Der
pH-Wert der Elutionslösung
liegt im Bereich von etwa pH 6 bis etwa pH 8,5, vorzugsweise bei
pH 7,5. Zum Puffern der Lösung
dient vorzugsweise 50mM Phosphatpuffer. Darüber hinaus ist jeder Puffer
geeignet, mit dem ein pH-Wert im vorstehend beschriebenen, vorzugsweise im
neutralen Bereich, eingestellt werden kann. Die Zusätze können beispielsweise
Detergenzien, z.B. SDS, Triton X 100 oder Tween 20, chaotrope Reagenzien,
z.B. Harnstoff, Guanidinium Hydrochlorid oder Guanidinium Isothiocyanat,
anorganische Salze, z.B. NaCl, oder organische Verbindungen, z.B.
e-Aminocapronsäure oder
Lysin, sein. Vorzugsweise enthält
die Elutionslösung
Detergenzien, beispielsweise 5% SDS.
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Anschließend wird das in den vorhergehenden
Verfahrensschritten angereicherte PrPSc nachgewiesen.
Dazu können
immunchemische (z.B. ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation),
biophysikalische (z.B. Massenspektrometrie, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie),
biochemische (z.B. Bestimmung biochemischer Parameter, wie z.B.
relative Molmasse, N-terminale
bzw. C-terminale Aminosäuresequenz,
Assoziations- und Dissoziationskonstanten von Bindungspartnern)
oder biologische (z.B. Cytotoxizitätsassay) Nachweisverfahren
zum Einsatz kommen.
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Vorzugsweise wird der Nachweis mit
einem Verfahren durchgeführt,
das eine schnelle Detektion der PrPSc ermöglicht.
Das kann z.B. ein immunologisches Nachweisverfahren vorzugsweise
ein Sandwich-ELISA sein. Der Sandwich-ELISA wird nach bekanntem
Verfahren durchgeführt.
Dabei kann die Markierung des Detektions-Antikörpers z.B. ein Enzym (z.B.
Meerrettich-Peroxidase),
eine gefärbte
Verbindung, ein Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein), ein Goldpartikel
oder eine Nukleinsäure
(z.B. ein DNA- oder RNA-Oligonucleotid) sein.
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Bei einer Enzym-Markierung wird die
Farbintensität
nach Substratumsetzung photometrisch erfasst und ist der in der
Probe enthaltenen PrPSc-Menge proportional.
Ist die Antikörpermarkierung
eine gefärbte
Verbindung oder ein Fluoreszenzfarbstoff, wird die Farb- bzw. Fluoreszenzintensität direkt
gemessen. Ist die Antikörpermarkierung
ein Nukleinsäure,
wird die Menge an gebundenem Antikörper über die Absorption des DNA-
bzw. RNA-Labels bestimmt, wobei das Signal durch PCR (z.B. real-time-PCR)
amplifiziert wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner ein Kit zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) in Körperflüssigkeiten,
Zell-Lysaten, Gewebehomogenaten oder anderen Flussigkeiten. Erfindungsgemäß enthält der Test-Kit
einen festen Träger
zur Anreicherung von PrPSc, ein immunologisches Nachweissystem,
Solubilisierungs-, Wasch- und Elutionspufferkonzentraten, verschiedenen
Kontrollen, einem Enzym-markierten anti-PrP-Antikörper sowie einer entsprechenden
Substrat- und Stopplösung.
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Die verwendeten festen Träger sind
vorzugsweise affinitätschromatographische
Materialien, z.B. Sepharose oder Agarose, die in Einwegsäulen verwendet
werden und, die mit den erfindungsgemäßen β-Faltblatt-bindenden Molekülen gekoppelt
sind. Die festen Träger
mit den erfindungsgemäßen Kopplungen
können als
Suspension, in getrockneter Form oder bereits in Einweg-Säulen gepackt
im Test-Kit enthalten sein.
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Das immunologische Nachweissystem
ist vorzugsweise ein Sandwich-ELISA, bei dem ein zweiter fester
Träger
z.B. eine Mikrotiterplatte mit einem spezifischen Antikörper gegen
PrP, vorzugsweise mit monoklonalen anti-PrP-Antikörper, insbesondere
Maus-anti-PrP-Antikörper,
beschichtet ist. Die festen Träger
liegen dem Test-Kit insbesondere vakuumverpackt bei.
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Als Kontrollen werden vorzugsweise
rekombinant hergestelltes PrP bzw. PrP-Peptide verwendet. Als Antikörper-Markierung
wird vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Verfahren und Test-Kits
ermöglichen
breit angelegte Untersuchungen mit hohen Probenzahlen, wie sie in
den Bereichen Medizin und Landwirtschaft gefordert werden. Im Unterschied
zu allen bisher beschriebenen Verfahren sind die erfindungsgemäßen Verfahren
auch für
die TSE-Diagnostik am lebenden Tieren und Menschen geeignet.
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Anhand der nachfolgenden Beispiele
wird die Erfindung näher
erläutert.
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Beispiel 1: Isolierung
von PrPSc mittels BSB-Peptiden im MTP-Format
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Eine MTP (Mikrotiterplatte) (Nunc-ImmunoTM Plate MaxisorpTM Surface,
F96 (NUnc, Roskilde, Dänemark)),
wurde mit verschiedenen BSB-Peptiden beschichtet (3). Die Beschichtung erfolgte durch Inkubation
mit 100μl
Peptidlösung
(10μg/ml
in 0,1M Carbonatpuffer pH 9,6) pro Kavität für 16h bei 4°C. Anschließend wurde die Flüssigkeit
abgesaugt und die MTP dreimal mit 300μl Waschpuffer (Platelia® BSE
Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) pro Kavität gewaschen.
Freie Bindungsplätze
wurden durch Inkubation mit 0,5% Casein in Waschpuffer bei Raumtemperatur
für 1h
blockiert. Nach einem Waschschritt (dreimal 300μl Waschpuffer pro Kavität) wurde
die beschichtete MTP mit 100μl
pro Kavität
der PrPSc-haltigen Probe (Hirnhomogenat
von BSE-positiven Rindern) für
1h bei 37°C
mit Folie abgedeckt inkubiert. Nicht gebundenes Probenmaterial wurde
abgesaugt und die MTP dreimal mit 300μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen.
Die Inkubation mit dem Detektions-Antikörper (Platelia® BSE
Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) erfolgte für 1h bei
Raumtemperatur. Überschüssiges Konjugat
wurde durch fünfmaliges
Waschen mit 300μl
Waschpuffer pro Kavität entfernt.
Nach Zugabe der Substratlösung
(Platelia® BSE
Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) wurde die Farbentwicklung
nach 30min durch Zusatz von 1M HCl abgestoppt und die Farbintensität durch
Extinktions-Messung bei 450nm (Referenz 620nm) registriert.
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Die gemessene Extinktion ist der
am BSB-Peptid gebundenen Menge an PrPSc proportional
und somit ein Maß für die Effizienz
des Fänger-Moleküls. Die
relativen Bindungseffizienzen der getesteten BSB-Peptide sind in
Tab. 1 zusammengefasst, wobei das Signal des besten β-Faltblatt-bindenden
Moleküls
(Peptid 2) gleich 100% gesetzt wurde.
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Tab.
1: Vergleich der PrP
Sc-Bindungseffizienz
verschiedener BSB-Peptide
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Beispiel 2: Elution des
an KLVFF gebundenen PrPSc im MTP-Format
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Die Bindung zwischen PrPSc und
den Fänger-Molekülen ist
sehr stark, so dass zur Elution des PrPSc von
dem festen Träger
vergleichsweise drastische Bedingungen nötig sind. Die Elutionsbedingungen
wurden ebenfalls im MTP-Format gestestet.
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Analog Beispiel 1 wurde eine MTP
mit Peptid 2 (KLVFF) beschichtet und mit PrPSc beladen.
Nach dreimaligem Waschen mit 300μl
Waschpuffer (Platelia® BSE Detection Kit, Bio-Rad
Laboratories, Hercules, USA) pro Kavität wurden jeweils 100μl der potentiellen
Elutionspuffer zugegeben und für
5min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit
abgenommen und die eluierte Menge PrPSc im
Elutionspuffer sowie die verbleibende Menge PrPSc an
der MTP mit Hilfe des Platelia® BSE Detection Kit (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, USA) bestimmt. Beim Vergleich der Elutionseffizienzen
(Tab.2) erwies sich lediglich ein Detergenz-haltiger Puffer (mit
5% SDS) als geeignet, PrPSc vollständig vom
Fänger-Molekül zu eluieren.
In Anwesenheit von chaotropen Reagenzien (z.B. 6M Harnstoff) wurde
PrPSc nur teilweise eluiert. In Elutionspuffern mit
niedrigem pH-Wert (z.B. pH3) bzw. hoher Innenstärke (z.B. 2M NaCl) blieb PrPSc nahezu vollständig am Fänger-Molekül gebunden.
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Tab.
2: Vergleich verschiedener Elutionsbedingungen
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Beispiel 3: Kovalente
Kopplung des BSB-Peptids KLVFF an EAH-Sepharose
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Bei einer Kopplung über Amino-Gruppen
würde das
Peptid sowohl am N-Terminus als auch an der Seitenkette (Lys) fixiert
werden, was zur Störung
der dreidimensionalen Struktur führen
könnte.
Aus diesem Grund erfolgte die spezifische Bindung des β-Faltblatt-bindendes
Moleküls
KLVFF an den festen Träger über die
Carboxyl-Gruppe am C-Terminus des Peptids. Als Trägermaterial
diente EAH-Sepharose® 4B (Amersham Phannacia
Biotech, Uppsala, Schweden).
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Zur Vorbereitung der Kopplungsreaktion
wurde die EAH-Sepharose mit 0,5M NaCl gewaschen und überstehende
Flüssigkeit
vollständig
entfernt. Der Ligand, das Pentapeptid mit der Sequenz KLVFF, wurde
in H2O gelöst und der pH-Wert mit HCl
auf 4,5 eingestellt. Das Gel wurde in der Ligand-Lösung resuspendiert und
EDC (N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid)
wurde in einer Endkonzentration von 0,1M zugegeben. Die Kopplungsreaktion
erfolgte bei Raumtemperatur über
24h unter leichtem Schwenken. Anschließend wurde der Überstand
des abgesetzten Gels vollständig
abgenommen. Gegebenenfalls vorhandene freie Bindungsplätze wurden
mit 1M Essigsäure
in Anwesenheit von 0,1M EDC blockiert. Das KLVFF-beladene Gel wurde
in eine Chromatographiesäule
gefüllt
und mindestens dreimal abwechselnd mit Puffer A (0,1M Na-Acetat,
0,5M NaCl pH 4) und Puffer B (0,1M Tris/HCl, 0,5M NaCl pH 8) und
anschließend
mit H2O gewaschen.
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Beispiel 4: Isolierung
von PrPSc aus Hirnhomogenat mittels KLVFF-Sepharose
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Zum Nachweis der Eignung der KLVFF-Sepharose
als β-Faltblatt-bindendes
Molekül
wurde PrPSc aus Hirnhomogenat von BSE-positiven
Rindern an das Säulenmaterial
gebunden und anschließend
wieder eluiert. Die Aufarbeitung des Hirnmaterials erfolgte mit
dem BSE Purification Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) nach
Angaben des Herstellers. Das Probenmaterial wurde in Probenverdünnungspuffer
R6 (Platelia® BSE
Detection Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) aufgenommen.
Eine Tropfsäule
wurde mit 1ml KLVFF-Sepharose hergestellt wie in Beispiel 3 angegeben
gefüllt
und mit PBS bei Raumtemperatur äquilibriert. Nach
Probenauftragung wurde die Säule
mit PBS gewaschen und der Durchlauf fraktioniert gesammelt. Gebundenes
PrPSc wurde anschließend mit 5% SDS in PBS eluiert.
Die in den einzelnen Fraktionen enthaltene Menge an PrPSc wurde
immunologisch mit Hilfe des Platelia® BSE
Detection Kit ermittelt.
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Beispiel 5: Herstellung
eines festen Trägers
zum Einsatz in einem Test-Kit zum Nachweis von angereichertem PrPSc
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Die Beschichtung einer MTP (Nunc-ImmunoTM Plate MaxisorpTM Surface,
F96 (Nunc, Roskilde, Dänemark))
erfolgte durch Inkubation von 100μl/Kavität mit einem
monoklonalen Maus-anti-PrP-Antikörper (Clone: F89/160.1.5,
Dianova, Hamburg) über
12h bei 4–8°C. Nicht
gebundener Maus-Anti-PrP-Antikörper
wurde abgesaugt und die Platte 3× mit 300μl pro Kavität mit Waschpuffer (Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung
mit Tween 20) gewaschen. Es folgte die Blockierung der freien Bindungsstellen
mit 300μl
einer 1%-igen Serumalbuminlösung
in Carbonatpuffer (0,1M, pH 9,6) 0,5–1h bei Raumtemperatur. Daran
schloss sich ein Waschschritt von 3× 300μl Waschpuffer pro Kavität an, bevor
die beschichteten und blockierten MTP 12 bis 14h im Luftstrom getrocknet
wurden.
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