DE10228187A1

DE10228187A1 - Testsystem zum Nachweis von Krebserkrankungen

Info

Publication number: DE10228187A1
Application number: DE2002128187
Authority: DE
Inventors: Ulf R. Rapp; Hans-Harald Sedlacek
Original assignee: Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH,
Current assignee: Medinnova Gesellschaft fuer Medizinische Innovationen aus Akademischer Forschung mbH,
Priority date: 2002-06-24
Filing date: 2002-06-24
Publication date: 2004-01-22
Also published as: WO2004001367A3; WO2004001367A2; AU2003250765A1; AU2003250765A8

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testsystem mit Mitteln zur Detektion zumindest eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie sowie mit Mitteln zur Detektion zumindest eines Mitgliedes der Raf Familie sowie Verwendungen eines solchen Testsystems.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Testsystem zum Nachweis von Krebserkrankungen oder dem Risiko einer Krebserkrankung, Screening Verfahren zur Findung von Substanzen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebserkrankungen, Zellen und transgene nicht menschliche Säugetiere zur Durchführung des Screening Verfahrens sowie Verwendungen mittels solcher Screening Verfahren identifizierter Wirkstoffe.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.
Ein Großteil von Tumoren ist vergesellschaftet mit genetischen Veränderungen. Zu diesen zählen im Besonderen Punktmutationen der Raf-aktivierenden Onkogene, hauptsächlich von ras (Fong und Minna, Clin Chest Med 23: 83–101 (2002)) und Überexpression von C-Raf (Rapp et al., J Int Assoc for the Study of Lung Cancer 4: 162–167, (1988)) oder Bcl-2 (Ranger et al., Nat Genet 28: 113–118 (2001)).
Raf-Kinasen sind an der Signalübertragung von Rezeptoren unterschiedlicher Wachstumsfaktoren in entscheidender Weise beteiligt.
Zum einen läuft diese Beteiligung über den klassischen Raf-MEK-ERK Signalübertragungsweg, welcher Zellwachstum, Differenzierung, Proliferation und Überleben reguliert (Daum et al., Trends Biochem Sci 19: 474–480 (1994)). Hierbei scheint ein entscheidender Faktor die Intensität des Raf-Signales zu sein: geringe Intensität stimuliert die Proliferation und hohe Intensität inhibiert die Zellteilung und Differenzierung (Kerkhoff und Rapp Oncogene 17: 1457–1462, (1998)). Drei Raf-Isoenzyme (A-,B- und C-Raf) sind bislang bekannt. Diese haben überlappende Funktionen bei der Kontrolle des klassischen Signalübertragungsweges. Sie besitzen jedoch auch jeweils spezifische Funktionen bei der Interaktion mit metabolischen Enzymen, Proteasom-Regulator-Proteinen und Proteinen der Bcl-2-Familie. Raf-Kinasen beeinflussen desweiteren den Raf-MEKK-IKK-NFkB Signalübertragungsweg. Aktivierung von NFkB ist vergesellschaftet mit der Zelltransformation durch Raf-Oncogene. Dominant-negativ-Mutanten, die die Aktivierung von NFkB blockieren, hemmen zugleich auch die Zelltransfomation durch oncogenes C-Raf (Baumann et a1., PNAS USA 97: 4615–4620 (2000)).
Ein weiterer Signalübertragungsweg verbindet C-Raf mit Bcl-2, einigen Bcl-2 interagierenden Proteinen wie BAG-1 und dem Porenprotein VDAC (voltage-dependent anion channel) in der äußeren Membran der Mitochondrien. C-Raf verbindet sich mit diesen Proteinen, ist mit ihnen an der Außenmembran der Mitochondrien lokalisiert und kooperiert mit Bcl-2 in der Inhibition der Cytochrom C Freisetzung und der Apoptose (Wang et al., Oncogene 9: 2751–2756 (1994); Wang et al., Cell 87: 629–638 (1996); Wiese et al., Nat Neurosi 4: 137–142 (2001); Troppmaier et al., Curr Top Microbiol Immunol 182: 453–460 (1992).
Die Inhibition der Apoptose durch C-Raf ist jedoch nicht zwingend an die Anwesenheit von Bcl-2 gebunden, da an Mitochondrien lokalisiertes C-Raf auch ohne Bcl-2 antiapoptotisch wirken kann (Zhong et al., Oncogene 20: 137-142 (2001)) .
Untersuchungen zur Bildung von Tumoren in Mäusen in Abhängigkeit von der Expression von Raf alleine oder in Kombination mit myc ergaben, dass die Neigung bzw. Suszeptibilität für die Entstehung von Raf- oder Myc-exprimierenden Tumoren von wenigen, möglicherweise nur von einem Gen kontrolliert wird (Klinken et al., J Virol 63: 2411–2414 (1989)). Dieses Suszeptibilitätsgen war bislang jedoch unbekannt. Seine Kenntnis würde es ermöglichen, Patienten zu identifizieren, welche mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit Tumoren entwickeln. Bei derartigen Patienten könnten gezielte Vorsorgeprogramme zu Verhinderung von Tumoren bzw. für deren Früherkennung eingesetzt werden.
Die Bcl-2 Protein-Familie besteht sowohl aus Inhibitoren wie auch aus Promotoren der Apoptose. Ihre wesentlichen Funktionen sind die eines Ionen-Kanales und eines Bindeproteins.
Zu den Inhibitoren der Apoptose gehören Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Brag-1, Mc-1, und Al1. Mitglieder dieser Gruppe besitzen 4 Domänen, inklusiv der BH4 Domäne, über welche diese Inhibitoren der Apoptose C-Raf und andere regulatorische Proteine binden und an die Mitochondrien- Membran koppeln können.
Zu den Promotoren der Apoptose gehören Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, und Hrk. Diesen Promotoren fehlt zumindest eine Domäne, in den meisten Fällen (mit Ausnahme von Bcl-Xs) die BH4 Domäne. (Übersicht siehe bei Kroemer et al., Nature Med, 3: 614 (1997); Chang et al., EMBO J 16: 968–977 (1997)).
Alle Inhibitoren der Apoptose der Bcl-2 Familie gelten als onkogen. Ihre Expression wird beispielsweise durch Myb, Ras, und AML-ETO induziert (Klampfer et al., PNAS USA, 93: 14059–14064, (1996); Taylor et al., Genes Dev 10: 2732– 2744, (1996)). Die Expression von Bcl-2 ist häufig gesteigert bei der myeloischen Leukämie und bei Tumoren der Speiseröhre, des Magens, des Kolons und des Rektums und häufig umgekehrt proportional der Expression von p53 und c-myc (Choi et al., Oncogene 11: 1693–1698, (1995); Delia et al., Blood 79: 1291–1298, (1992), Popescu et al., Eur J Cancer 34: 1268–1273, (1998); Torzewski et al., Clin Cancer Res 4: 577–583, (1998) Kroemer und Reed, Nat Med 6: 513–519 (2000)) .
Promotoren der Apoptose der Bcl-2 Familie gelten als Tumorsuppressoren. Negativ-Mutationen können in Tumoren gefunden werden (Rampino et al., Science 275: 967–969, (1997), Ouyang et al., Clin Cancer Res 4: 1071–1074, (1998)) .
Alle Mitglieder der Bcl-2 Familie bilden Homodimere oder ausgewählte Kombinationen von Heterodimere. Die Bildung von Heterodimeren aus Inhibitoren der Apoptose mit Promotoren der Apoptose neutralisiert die antiapoptotische Wirkung der Inhibitoren.
In Anbetracht des onkogenen Potentials von Bcl-2 oder von Raf wurde versucht, durch antisense-Oligonukleotide die Translation von bcl-2 spezifisch zu inhibieren (Tamm et al., Lancet 358: 489–497 (2001); Ackermann et al., WO 00/40595 ; Zangemeister-Wittke et al., WO 00/66724 ; Warrel et al., WO 02/17852 ). Alternativ wurden kleinmolekulare Inhibitoren (Huang et al., WO 00/04901 ; Hockenberry et al., WO 01/14365 ; Wang et al., WO 02/13833 ) oder Antikörper gegen Bcl-2 (Rüben et al., WO 01/57060 ) zur Inhibition von Bcl-2 verwendet.
Untersuchungen über die Wechselwirkung zwischen Bcl-2 und Raf in Hinblick auf eine Zytokin-abhängige Proliferation von hämatopoietischen Zellen ergaben, dass eine Bcl-2 Überexpression die Cytokin-Abhängigkeit von Raf überexprimierenden Zellen nicht reduzieren konnte und andererseits eine Bcl-2 Überexpression eine protektive Wirkung auf Raf überexprimierende Zellen dadurch hatte, dass Bcl-2 den Exit aus den S- und G2/M Phasen der Zellteilung verzögerte (Moye et al., Leukemia 14: 1060–1079 (2000)). Auch aus anderen Systemen ist bekannt, dass hohe Spiegel an Bcl-2 die Zellzyklusprogression inhibieren können (Pietenpol et al., Cancer Res 54: 3714–3717 (1994)); O'Connor et al Curr Opin Cell Biol 12: 257–263 (2000)).
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, die Diagnosesicherheit für Krebserkrankungen, insbesondere von Risiken einer Krebserkrankung, zu verbessern, sowie Mittel zur verbesserten Behandlung von Krebserkrankungen anzugeben.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Testsystem mit Mitteln zur Detektion zumindest eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie sowie mit Mitteln zur Detektion zumindest eines Mitgliedes der Raf Familie.
Weiterhin lehrt die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Testsystems zur (in vitro) Diagnose einer Krebserkrankung oder eines Risikos einer Krebserkrankung bei menschlichen und/oder nicht-menschlichen Säugetieren. Mit der Erfindung kann somit ein Diagnoseverfahren ausgeübt werden, wobei in vitro oder in vivo Zellen eines Patienten auf Co-Expression eines Mitgliedes der Bcl-2 Familie und eines Mitgliedes der Raf Familie, ggf. auf Überexpression eines Mitgliedes einer oder beider Familien, untersucht werden.
Als weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Testsystems lehrt die Erfindung den Einsatz beim Screenen nach Substanzen, welche in einer Zelle, die sowohl ein antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert, die Expression oder Funktion des Mitgliedes der Bcl-2 Familie reduziert.
Weiterhin lehrt die Erfindung eine isolierte menschliche oder nicht-menschliche Zelle oder ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, insbesondere Rodent, zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Zelle oder Zellen eines definierten Gewebes des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers sowohl ein antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert und ein Verfahren zum Screenen nach Wirksubstanzen zur Behandlung von Krebs, wobei der Zelle oder dem nicht-menschlichen Säugetier eine prospektive Wirksubstanz oder eine Mischung solcher Substanzen in einer physiologisch wirksamen Dosis zugeführt werden, wobei anschließend die Menge und/oder Aktivität des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie gemessen wird, wobei die Mengen und/oder Aktivitäten des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie vor und nach der Zugabe der prospektiven Wirksubstanz oder der Mischung miteinander verglichen werden und wobei eine prospektive Wirksubstanz, die zu einer Verringerung der Menge und/oder Aktivität geführt hat, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird.
Schließlich lehrt die Erfindung die Verwendung einer mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Wirksubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs. Mit der Erfindung kann ein Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen ausgeübt werden, wobei einem Patienten, ggf. nach vorheriger Anwendung des vorstehend erläuterten Diagnoseverfahrens, eine physiologisch wirksame Dosis der identifizierten Wirksubstanz, in geeigneter galenischer Herrichtung, verabreicht wird. Die Verabreichung kann in einem definierten Behandlungsplan erfolgen, wobei die Dosierung (Mengen einer Gabe und Zeitintervalle zwischen Gaben) mit der Maßgabe einer nachweisbaren Reduktion der Menge und/oder Aktivität des Mitgliedes der Bcl-2 Familie oder einer pathologisch detektierbaren Verbesserung des Krankheitsbildes erfolgt.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Expression eines antiapoptotisch wirkenden Mitgliedes der Bcl-2 Familie die Empfänglichkeit einer Zelle zur Tumorentwicklung durch das Raf Protein steigert. So wurde im Rahmen der Erfindung gefunden, dass beispielsweise die Expression von Bcl-2 die Tumorentwicklung durch ein onkogenes Raf-Protein beschleunigt, wobei diese Wirkung von Bcl-2 nicht durch eine konstitutive Expression, d. h. verstärkte Wirkung des onkogenen Raf-Proteins kompensiert werden kann. Der Nachweis von beispielsweise Bcl-2 und onkogenem Raf ist letztendlich prädiktiv für die Entwicklung eines Tumors in dem Gewebe, aus welchem die Zellen des Befundes stammen.
Antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind beispielsweise Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1 und A1. Bevorzugt im Rahmen der Erfindung wird Bcl-2 nachgewiesen.
Mitglieder der Raf-Familie sind beispielsweise C-Raf, A-Raf, B-Raf und onkogene Mutationen von C-Raf, A-Raf oder B-Raf. Bevorzugt im Rahmen der Erfindung wird C-Raf oder mutiertes C-Raf nachgewiesen.
Der Nachweis der Expression mindestens eines Mitgliedes der Bcl-2 Familie und mindestens eines Mitgliedes der Raf Familie erfolgt durch den Nachweis der mRNA oder über den Nachweis des Proteins. Der Nachweis der jeweiligen mRNA wird vorzugsweise mit Hilfe der reverse transcriptase – polychain-reaktion (RT-PCR) mit Hilfe von spezifischen Primern durchgeführt, der Nachweis der jeweiligen Proteine vorzugsweise mit Hilfe von spezifischen Liganden, beispielsweise mit Hilfe von spezifischen Antikörpern oder Mimikryverbindungen solcher Antikörper. Beide Nachweismethoden sind dem Fachmann bekannt. Antikörper gegen Bcl-2 sind beispielsweise sind käuflich zu erwerben (Santa Cruz Biotech, Dako).
Die konstitutive Expression im Rahmen eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers oder einer isolierten transformierten menschlichen oder nicht-menschlichen Zelle kann dadurch eingerichtet sein, daß das Gen der Bcl-2 Familie und das Gen der Raf Familie unter die Kontrolle geeigneter Promotoren gestellt ist. Im Falle des Raf Gens kommt beispielsweise der SP-C-Promotor in Frage. Dann erfolgt die konstitutive Expression vorwiegend in Lungenzellen. Im Falle des Bcl-2 Gens kommt beispielsweise der HSK Promotor in Frage. Dies erlaubt insbesondere das Screenen nach Wirksubstanzen, welche zur Behandlung von Lungenkrebs geeignet sind. Für andere Indikationen lassen sich unschwer andere geeignete Promotoren anwenden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems, das heißt durch den Nachweis von mindestens einem antiapoptotisch wirkenden Mitglied der Bcl-2 Familie und mindestens einem Mitglied der Raf Familie in einer Zelle oder in einem Gewebe, beispielsweise in Bronchialepithelzellen, lässt sich gemäß dieser Erfindung aussagen, ob ein Risiko besteht, dass sich das jeweilige Gewebe zu einem Tumorgewebe transformieren wird. Falls dieses Risiko detektiert wird, ermöglicht dieses Testsystem die frühzeitige Anwendung von Vorbeugemaßnahmen, wie beispielsweise die Vermeidung von Expositionen mit carcinogenen Substanzen und die Anwendung diätetischer, pharmakotherapeutischer und/oder chirurgischer Maßnahmen.
Zu erfindungsgemäßen, vorzugsweise in Suspension gehaltenen, mit dem erfindungsgemäßen Testsystem geprüften Zellen wird die zu prüfende prospektive Wirksubstanz in Konzentrationen von 0.1 nmol bis zu 100 μmol hinzugegeben und es wird geprüft, ob die Wirksubstanz in der Lage ist, die Expression eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie und/oder eines Mitgliedes der Raf Familie zu reduzieren.
Definitionen.
Die Sequenzen der genannten Gene bzw. Proteine sind aus der NIH Gendatenbank bekannt (AccNrs.: Bcl-2: M14745; Bcl-XL: Z23115; Bcl-w: U59747; MCL-1: L08246; A1/Bfl1: NM 004049; Diva/boo: NM 020396; NRH (humanes Homolog von NR 13): CAD30221; BAD (enthaltend die BH-3 Domäne): AF031523; C-Raf: X03484; A-Raf: X04790; B-Raf: M95712; die drei letztgenannten Gene sind Mitglieder der Raf-Familie, die vorherigen sind antiapoptotisch wirkende Mitglieder der Bcl-2 Familie). Im Rahmen der Erfindung sind aber auch Homologe umfaßt, wobei die Homologie mit den bekannten Genen bzw. Proteinen zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%, beträgt. Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder allelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der bekannten Sequenzen darstellen mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 50 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an ein protein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle mit den bekannten Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfaßt, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98: 503ff (1975)) hybridisieren. Insbesondere sind auch Punktmutationen der bekannten Gene mit umfaßt, wie beispielsweise onkogene C-Raf Mutanten. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i. e. eine oder mehrere der erfindungsgemäß eingesetzten Nukleinsäuresequenzen für ein Bcl-2 Mitglied und Raf Mitglied mit jeweils mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz.
Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Bcl-2 Familien und/oder Raf Familien Nukleinsäuren oder Proteine neben den Volllängen der angesprochenen Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen hieraus, und zwar mit einer Mindestlänge von 12 Nukleotiden, vorzugsweise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nukleinsäuren und einer Mindestlänge von 4 Aminosäuren, vorzugsweise 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Peptide oder Proteine.
Die Begriffe der Diagnose und/oder der Behandlung von Krebs umfassen auch die Detektion und/oder Behandlung von Metastasen aus Primärtumoren.
Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich eines Antikörpers, nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden, wie der zu Grunde liegende Antikörper.
Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, sowie Phage-Display-Antikörper, aber auch chimäre Antikörper und antiidiotypische Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden.
Eine im Rahmen einer Detektorsubstanz eingerichtete Reportergruppe ist ein Atom, Molekül oder eine Verbindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung mittels Phosphoimager. Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzählung.
Im Rahmen der vorstehenden Definition gegenüber dem engen Wortsinn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch die bestimmten Begriffe im engen Wortsinn.
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1: Herstellung und Typisierung transgener Mäuse.
Folgende Mäusestämme wurden gemäß der veröffentlichten Methoden wie folgt hergestellt: Mäuse, transgen für eine verkürzte aktivierte C-Raf-Kinase (C-Raf B×B) unter der Kontrolle des Surfactant Protein-C (SP-C) Promotors (Kerkhoff et al., Cell Growth Diff 11: 185–190 (2000)), Mäuse, defizient in bcl-2 (Michaelidis et al., Neuron 17: 75–89 (1996) und Mäuse, transgen für humanes bcl-2 unter Kontrolle des HSK Promoters (Domen et al., Blood 91: 2272–2282 (1998)). Durch Hybridisierung und Rückkreuzung wurden Mäusestämme gezüchtet, welche die jeweiligen Transgene wie folgt exprimieren: SP-CcrafBXB/bcl-2(-/-); SP-CcrafBXB/bcl-2(+/-). Desweiteren wurden durch Kreuzung die dreifach transgene Mäuse SP-CcrafBXB/bcl-2(-/-)/ HSKbcl-2 erzeugt.
Die jeweiligen Mäusestämme wurden mit Hilfe der PCR (Reagentien von Invitrogen) und Primern, spezifisch für die jeweiligen Transgene genotypisiert. Im Besonderen wurden folgende Primer (siehe auch die Sequenzprotokolle Seq.-ID 1 bis 6 in der folgenden Reihenfolge) verwendet:
craf: 5'-ATC TCC GTG CCA TTT ACC-3'
SP-C 5'-GAG AGG AGA GCA TAG CAC-3'
bcl-2 sense: 5'-CAC CAG AAT CAA GTG TTC GGT G-3'
bcl-2 antisense: 5'-GGT AGC GAC GAG ARG AGT CAT C-3'
H2K sense: 5'-CGC GGA CGC TGG ATA TAA AGT C-3'
H2k antisense 5'-ACA TCT CCC GCA TCC CAC TC-3'
Von für SP-C crafBxB transgenen Mäusen ist bekannt, dass sie mit einer relativ kurzen Latenzzeit alle Adenome der Lunge entwickeln (Kerkhoff et al., Cell Groth Diff 11: 185–190 (2000)).
Beispiel 2: Beeinflussung der Entstehung von Tumoren.
Mäuse, defizient in bcl-2, leben bis zu etwa einem Jahr ohne eine Häufung von Tumorerkrankungen aufzuweisen (Veis et al., Cell 75: 229–240 (1993)). Mäuse, welche humanes Bcl-2 exprimieren, lebten gleichermaßen ohne eine Häufung von Tumoren (Domen et al., Blood 91: 2272–2282 (1998)).
In Mäusen, transgen für SP-CcrafBXB stieg der Spiegel an endogenem bcl-2 RNA und Protein bis zu etwa 1,5 Monaten an und blieb dann auf diesem erhöhten Spiegel stabil. SP-CcrafBXB transgene Tieren, denen ein Allel des bcl-2 fehlte, zeigten keine Unterschiede in der Latenzzeit der Tumorentwicklung, während Tieren, denen beide Allele fehlten, eine deutliche Verzögerung in der Entwicklung von Tumoren aufwiesen. In den dreifach transgenen Mäusen war die Latenzzeit der Tumorentwicklung jedoch wieder etwa gleich der in bcl-2 (+/+) Mäusen.
Um die Frage zu beantworten, ob Bcl-2 die Initiation oder Promotion von Tumore beeinflusst, wurden an 1,5, an 2,5 und an 6 Monate alten Mäusen die Anzahl der Tumorherde pro mm² Lunge histologisch untersucht. Alle transgenen Mäusestämme zeigten makroskopisch wie auch histologisch eine normale Lungenentwicklung.
In Bcl-2 negativen SP-CcrafBXB transgenen Mäusen waren jedoch nach 1,5 Monaten keine Tumorherde, nach 2,5 Monaten deutlich weniger Tumorherde und erst nach 6 Monaten gleich viel Tumorherde nachzuweisen wie in Bcl-2 positiven SP-CcrafBXB transgenen Mäusen. Andererseits waren in den dreifach transgenen Mäusen, welche eine erhöhte Expression von humanem Bcl-2 aufweisen, die Entwicklung der Tumorherde im Vergleich zu SP-CcrafBXB transgenen Mäusen nicht beschleunigt.
In Lungenschnitten von 6 Monate alten Mäusen wurden zusätzlich die Anzahl der apoptotischen Zellen mit Hilfe des Tunel assays (In situ cell detection POD kit, Roche) und die Anzahl der in der S-Phase befindlichen proliferierende Zellen in den Lungentumoren mit Hilfe von Antikörpern gegen PCNA (PharMingen) bestimmt. Während bei der Anzahl von apoptotischen Zellen keine eindeutigen Unterschiede nachweisbar waren, zeigten für Bcl-2 negative Mäusestämme eine deutlich verminderte Anzahl proliferierender Tumorzellen im Vergleich zu allen anderen geprüften Mäusestämmen.
Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass die Anwesenheit von Bcl-2 die onkogene Wirkung von Raf derart verstärkt, dass Tumoren mit kürzerer Latenzzeit auftreten. Diese Wirkung von Bcl-2 kann nicht durch eine konstitutive Expression beispielsweise von C-Raf Kompensiert werden. Der Nachweis von Bcl-2 und onkogenem Raf in einem Gewebe ist demzufolge praediktiv für die Entwicklung eines Tumors in diesem Gewebe.
Beispiel 3: Bestimmung des Expressionsniveaus von Bcl-2 und Raf in Gewebebiopsien durch semiquantitative RT-PCR
In diesem Beispiel wird die Expression von Bcl-2 und C-Raf mRNA in Biopsien von Tumorgewebe mit nicht entartetem Gewebe verglichen. Die Gewinnung des Biopsiematerials erfolgt entsprechend der Lage des jeweiligen Tumors, es wird dabei sowohl gesundes Gewebe als auch Tumorgewebe entnommen .
Ausgehend von 0,5–30 mg Gewebe (idealerweise 10 mg), je nach Tumorart, nach der Biopsie weiter aufgearbeitet, wird anschließend die mRNA mit einer geeigneten Methode isoliert. Im vorliegenden Beispiel wurde aus Lungentumorgewebe und benachbartem normalem Lungengewebe mit dem kommerziell verfügbaren RNeasy Kit der Firma Quiagen entsprechend den Anweisungen des Herstellers die mRNA isoliert.
Anschließend wird die mRNA revers transkribiert, beispielsweise mit dem Omniskript RT Kit der Firma Quiagen entsprechend den Anweisungen des Herstellers und einem Oligo-dT Primer. Nun wird mit einem Cycler, beispielsweise dem Robo-Cycler der Firma Stratagene, eine PCR Reaktion durchgeführt mit folgenden Primern und Bedingungen (Leng et al., Eur J Pharmacol 409 (2000): 123; Deshpande and Moore, Mol Cell Biochem 178 (1998): 47)): Primer (siehe auch die Sequenzprotokolle Seq.-ID 7–12 in der folgenden Reihenfolge):
Die PCR wird in einem Volumen von 50 μl mit 1 μl RT-Produkt, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 0,1% Triton X-100, 1,5 1,5 mM MgCl2, 0,3 μM des entsprechenden spezifischen 5' und 3' Primern und 2 U Taq DNA Polymerase (Stratagene) durchgeführt. Die Bedingungen sind wie folgt: 94°C, 5 min, 30 Zyklen bcl-2/b-Aktin bzw. 35 Zyklen c-raf-1/b-Aktin mit 94°C 45 s, 55°C 45 s und 72°C 1 min. Abschließend wurde eine finale Extension bei 72°C über 5 Minuten durchgeführt. Die Produkte werden über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die relative Produktkonzentration wird densiometrisch bestimmt. Dabei wird der Quotient der relativen Konzentration des bcl-2 oder c-raf-1 Produkts mit dem b-actin Produkt gebildet, was der relativen Expression von bcl-2 oder c-raf-1 gleichgesetzt wird.
Anschließend wird die relative Expression von bcl-2 und c-raf-1 zwischen Tumorgewebe und Normalgewebe verglichen. Im vorliegenden Beispiel war ein deutlicher Anstieg zu beobachten.
SEQUENCE LISTING

Claims

Testsystem mit Mitteln zur Detektion zumindest eines antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie sowie mit Mitteln zur Detektion zumindest eines Mitgliedes der Raf Familie.
Testsystem nach Anspruch 1, wobei die Mittel zur Detektion Detektorsubstanzen sind, welche spezifisch für mRNA oder Protein des jeweiligen Mitgliedes sind, wobei die Mittel im Falle der mRNA Substanzen zur spezifischen Amplifikation der mRNA umfassen können.
Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei das antiapoptotisch wirkende Mitglied der Bcl-2 Familie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1 und A1".
Testsystem einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Mitglied der Raf Familie ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C-Raf, B-Raf, A-Raf, mutiertes C-Raf, mutiertes A-Raf und mutiertes B-Raf".
Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei zumindest eine der Detektorsubstanzen ein Antikörper ist.
Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Diagnose einer Krebserkrankung oder eines Risikos einer Krebserkrankung bei menschlichen und/oder nicht-menschlichen Säugetieren.
Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Screenen nach Substanzen, welche in einer Zelle, die sowohl ein antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie exprimiert, die Expression oder Funktion des Mitgliedes der Bcl-2 Familie reduziert.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 7, insbesondere Rodent, dessen Zellen eines definierten Gewebes sowohl ein antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert.
Isolierte menschliche oder nicht-menschliche Zelle zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 7, welche sowohl ein antiapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie als auch ein Mitglied der Raf Familie konstitutiv exprimiert.
Verfahren zum Screenen nach Wirksubstanzen zur Behandlung von Krebs, wobei Zellen nach Anspruch 9 oder einem nicht-menschlichen Säugetier nach Anspruch 8 eine prospektive Wirksubstanz oder eine Mischung solcher Substanzen in einer physiologisch wirksamen Dosis zugeführt werden, wobei anschließend die Menge und/oder Aktivität des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie gemessen wird, wobei die Mengen und/oder Aktivitäten des antiapoptotischen Mitgliedes der Bcl-2 Familie vor und nach der Zugabe der prospektiven Wirksubstanz oder der Mischung miteinander verglichen werden und wobei eine prospektive Wirksubstanz, ggf. nach Dekonvolution, die zu einer Verringerung der Menge und/oder Aktivität geführt hat, selektiert wird.
Verwendung einer mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 oder 10 identifizierten Wirksubstanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.