DE10223960A1 - Enzyme Immunoassay - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) zur qualitativen und/oder quantitativen Erfassung von Analyten in einer Probe. Dabei wird die Probe und eine der Anzahl der zu bestimmenden Analyten entsprechende Anzahl Antikörpertypen, die mit einer der Anzahl der zu bestimmenden Analyten entsprechenden Anzahl verschiedener Enzyme gekoppelt sind, in ein gemeinsames Reaktionsgefäß gegeben. Zur Erkennung der unterschiedlichen Analyten ist jeweils ein Antikörper spezifisch für jeweils einen der Analyten, und jeweils für verschiedene Analyten spezifische Antikörper sind mit jeweils verschiedenen Enzymen gekoppelt. Durch die verschiedenen Enzyme sind jeweils verschiedene Substrate umsetzbar und/oder jeweils verschiedene Produkte erzeugbar.The present invention relates to a method for carrying out an enzyme immunoassay (EIA, ELISA) for the qualitative and / or quantitative detection of analytes in a sample. The sample and a number of antibody types corresponding to the number of analytes to be determined, which are coupled to a number of different enzymes corresponding to the number of analytes to be determined, are placed in a common reaction vessel. To recognize the different analytes, an antibody is specific for each of the analytes, and antibodies specific for different analytes are coupled with different enzymes. Different substrates can be implemented and / or different products can be produced by the different enzymes.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Enzymimmunoassay, beispielsweise EIA oder ELISA. The present invention relates to a Enzyme immunoassay, for example EIA or ELISA.

Derartige Enzymimmunoassays (ELISA) werden herkömmlicherweise verwendet, um das Vorhandensein bzw. die Menge an einem einzelnen Analyten in einer Probe mittels enzymgekoppelter Antikörper nachzuweisen. Dabei wird der enzymgekoppelte Antikörper an den Analyten gebunden und anschließend werden die freien enzymgekoppelten Antikörper entfernt. Anschließend wird das Substrat für das Enzym zugegeben, so daß das angekoppelte Enzym das Substrat umsetzt. Gewöhnlich wird dabei eine Reaktion und ein Substrat ausgewählt, bei dem durch die Enzym-Substrat-Reaktion ein Farbwechsel und eine Änderung der optischen Dichte (OD) bei einer bestimmten Wellenlänge erfolgt. Unter Verwendung einer Kalibrierkurve für die optische Dichte wird dann dieser Farbwechsel bzw. die Änderung der optischen Dichte mit der Menge an Analyten in der Probe korreliert. Such enzyme immunoassays (ELISA) conventionally used to determine the presence or Amount of a single analyte in a sample detected by means of enzyme-linked antibodies. there the enzyme-linked antibody to the analyte bound and then the free ones enzyme-linked antibody removed. Then that will Substrate for the enzyme added so that the coupled enzyme converts the substrate. Usually becomes a reaction and a substrate are selected a color change due to the enzyme-substrate reaction and a change in optical density (OD) at one certain wavelength. Under use then a calibration curve for the optical density this color change or the change in optical Density with the amount of analyte in the sample correlated.

Die meist verwendeten Enzyme und Substrate bei herkömmlichen ELISA sind Meerrettichperoxidase (HRP) mit 2,2',5,5'-Tetramethyl-Benzidin (TMB) oder Ortho- Phenylendiamin (oPD) als Substrat oder auch als Enzymalkalische Phosphatase (AP) mit Para-Nitrophenylphosphat (pNPP) als Substrat. The most commonly used enzymes and substrates traditional ELISA are horseradish peroxidase (HRP) with 2,2 ', 5,5'-tetramethyl-benzidine (TMB) or ortho- Phenylenediamine (oPD) as a substrate or as Enzyme-alkaline phosphatase (AP) with Para-nitrophenyl phosphate (pNPP) as a substrate.

Bei diesen herkömmlichen ELISA kann in jedem einzelnen Näpfchen einer Mikrotiterplatte, d. h. in einem einzelnen Probengefäß, lediglich ein einzelner Test auf einem Analyten durchgeführt werden. Um mehrere Analyte nachzuweisen ist es erforderlich, in der entsprechenden Anzahl von Näpfchen die einzelnen enzymgekoppelten Reaktionen durchzuführen. These conventional ELISA can be used in any individual wells of a microtiter plate, d. H. in one single sample vessel, just a single test be carried out on an analyte. By several It is necessary to demonstrate analytes in the corresponding number of cells each perform enzyme-linked reactions.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem in der selben Probe im selben Probengefäß mehrere Analyten gleichzeitig erfaßt werden können. Based on this state of the art, it is a task the present invention, a method to create with that in the same sample in the same Multiple analytes can be detected at the same time can.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben. This object is achieved by the method according to claim 1 solved. Advantageous further developments of the inventive method are in the respective dependent claims given.

Erfindungsgemäß wird die Erfassung zweier Analyten in demselben Probengefäß, beispielsweise im selben Näpfchen einer Mikrotiterplatte dadurch realisiert, daß zwei verschiedene enzymgekoppelte Antikörper verwendet werden. Dabei ist jeweils einer der Antikörper für jeweils einen der Analyten spezifisch. Jeder der verschiedenen Antikörpertypen ist mit einem anderen Enzym gekoppelt. Bedingung ist nun für eine Trennung der Erkennung der Analyte durch die jeweiligen Antikörper, daß die beiden verschiedenen Enzyme Reaktionen katalysieren, die zu unterschiedlichen Signalen führen. Hierzu kann es ausreichend sein, wenn die Enzyme verschiedene Substrate verstoffwechseln oder verschiedene Endprodukte erzeugen, so daß dann mittels Voltammetrie oder spektroskopisch die Veränderung der Menge an Substrat bzw. Produkt nachgewiesen werden kann. According to the invention, the detection of two analytes is carried out in the same sample vessel, for example in the same Well of a microtiter plate realized in that two different enzyme-linked antibodies be used. One of the antibodies is one of them specific for each of the analytes. Everyone who different antibody types is with another Enzyme coupled. Condition is now for separation the recognition of the analytes by the respective Antibodies that the two different enzymes Catalyze reactions that lead to different signals to lead. For this it may be sufficient if the Enzymes metabolize different substrates or produce different end products so that using voltammetry or spectroscopically Change in the amount of substrate or product detected can be.

Dies allein würde jedoch noch nicht den vorliegenden ELISA ermöglichen. Denn es ist weiterhin hier noch zusätzlich zu fordern, daß die Enzyme unter gleichen Bedingungen aktiv sind, so daß tatsächlich in dem Probengefäß auch beide Enzymreaktionen gleichzeitig und quantitativ ablaufen. However, this alone would not be the present one Enable ELISA. Because it's still here in addition to requiring that the enzymes be among the same Conditions are active, so that actually in the Sample vessel also both enzyme reactions simultaneously and run quantitatively.

Vorteilhaft ist es weiterhin, wenn beide Enzymreaktionen mittels derselben Reagenzien, mittels Einstellung derselben Bedingung in der Probe oder auf andere, jedoch gleichartige Weise gestoppt werden können. In diesem Falle können beide Enzymreaktionen über dieselbe Zeit aufrechterhalten und gemeinsam gestoppt und dann auch gemeinsam ausgewertet werden. It is also advantageous if both Enzyme reactions using the same reagents, using Setting the same condition in the sample or on other, but similar ways can be stopped. In this case, both enzyme reactions can over maintain the same time and stop together and then be evaluated together.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Signale, die für jede der beiden Enzymreaktionen gemessen werden, unabhängig voneinander sind, so daß sie ohne Einfluß aufeinander ausgewertet werden können. It is also advantageous if the signals that be measured for each of the two enzyme reactions, are independent of each other so that they have no influence can be evaluated on each other.

Sollte sich jedoch ein gewisser Einfluß zwischen den beiden Signalen ergeben, so kann durch eine entsprechende Dekonvolution der jeweiligen Signale dennoch eine präzise Auswertung erfolgen. Vorteilhafterweise erfolgt die Auswertung des ELISA mittels herkömmlicher spektroskopischer Techniken und/oder Voltammetrie. Insbesondere eignet sich auch die lineare Votammetrie (Linear Sweep Voltrammetrie, LSV). In diesem Falle kann die Quantifikation der Enzymreaktionen beispielsweise bei zwei verschiedenen Potentialen in der LSV-Kurve an denjenigen Punkten durchgeführt werden, an denen die amperometrischen Signale unabhängig voneinander die jeweilige Konzentration an Substrat bzw. Produkt anzeigen. However, should there be any influence between the result in both signals, so by one corresponding deconvolution of the respective signals a precise evaluation. advantageously, the ELISA is evaluated using conventional spectroscopic techniques and / or Voltammetry. The linear one is also particularly suitable Votammetry (Linear Sweep Voltrammetry, LSV). In In this case, the quantification of the enzyme reactions for example at two different potentials in the LSV curve at those points on which the amperometric signals are independent the respective concentration of substrate from one another or display product.

Wie oben bereits beschrieben, werden für herkömmliche ELISA im wesentlichen die Enzyme HRP und AP verwendet. Bei der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz dieser beiden Enzyme zur Erfassung zweier verschiedener Analyte nicht möglich. Dies liegt daran, daß HRP im sauren pH-Bereich (pH 5-6) aktiv ist, während AP im basischen pH-Bereich (pH 9-10) aktiv ist. Beide Reaktionen können daher nicht in derselben Probenlösung zeitgleich ablaufen. Weiterhin ist hier nachteilig, daß die Reaktion des HRP durch Zugabe einer starken Säure gestoppt wird, während die Aktivität des AP durch Zugabe einer starken Base gestoppt wird. Damit können die Reaktionen von HRP und AP nicht gleichzeitig gestoppt werden, was einen erheblichen Arbeitsaufwand und Auswerteunsicherheit bedeutet. Aus diesen Gründen ist es daher nicht möglich bei der vorliegenden Erfindung, lediglich auf die bekannten ELISA-Tests mit HRP bzw. AP als Enzyme zurückzugreifen und diese in einem Probengefäß zu kombinieren. As described above, for conventional ELISA essentially the enzymes HRP and AP used. In the present invention is the insert of these two enzymes to detect two different analytes not possible. This is because HRP is active in the acidic pH range (pH 5-6), while AP is active in the basic pH range (pH 9-10). Both Reactions cannot therefore take place in the same Run off the sample solution at the same time. Furthermore, here disadvantageous that the reaction of the HRP by adding a strong acid is stopped during activity the AP is stopped by adding a strong base. So the reactions of HRP and AP cannot be stopped at the same time, which is a significant Workload and uncertainty of evaluation means. Out for these reasons it is therefore not possible for the present invention, only to the known ELISA tests with HRP or AP as enzymes access and combine them in a sample vessel.

Ausgehend hiervon und unter Zugrundelegung der oben beschriebenen vorliegenden Erfindung wurde jedoch ein Enzympaar gefunden, mit dem zwei Analyten gleichzeitig erfaßt werden können. Vorteilhafterweise wird hierzu das Enzym HRP und gleichzeitig das Enzym Glykoseoxidase (GOD) verwendet. Diese Enzyme katalysieren die folgenden Reaktionen:

• 1. HRP: TMB + H₂O₂ → oxidiertes TMB + SO₂ + H₂O
• 2. GOD: Glucose + SO₂ + H₂O → Glukonsäure + H₂O₂

On the basis of this and on the basis of the present invention described above, however, an enzyme pair was found with which two analytes can be detected simultaneously. The enzyme HRP and at the same time the enzyme glycose oxidase (GOD) are advantageously used for this purpose. These enzymes catalyze the following reactions:

• 1. HRP: TMB + H ₂ O ₂ → oxidized TMB + SO ₂ + H ₂ O
• 2. GOD: glucose + SO ₂ + H ₂ O → gluconic acid + H ₂ O ₂

Beide Reaktionen können in derselben Reaktionslösung mit 0,2 M Zitratpuffer, pH 5,0, 0,1% (Volumen/Volumen) von Wasserstoffperoxid (30%) durchgeführt werden. Vorteilhafterweise wird als anfängliche Konzentration der Substrate 0,1 mg/ml DMB und 10 mg/ml Glucose eingesetzt. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 1 M NaOH gestoppt. Anschließend ist dann eine optische Erfassung der gebildeten Produkte möglich. Both reactions can be in the same reaction solution with 0.2 M citrate buffer, pH 5.0, 0.1% (Volume / volume) of hydrogen peroxide (30%) be performed. Advantageously, as an initial Concentration of substrates 0.1 mg / ml DMB and 10 mg / ml glucose used. The enzyme reaction will stopped by adding 1 M NaOH. Then is then an optical detection of the products formed possible.

Im folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemäßer Enzymimmunoassays gegeben. Es zeigen The following are some examples given enzyme immunoassays according to the invention. Show it

Fig. 1 ein Schema der Erfassung von A zwei Typen von Antigenen als Analyten und B eines Antigens und eines Antikörpers als Analyten; FIG. 1 is a schematic of the detection of two types of A antigens as analyte and B of an antigen and an antibody as analyte;

Fig. 2 die Analyse einer linearen Voltammetrie; FIG. 2 shows the analysis of a linear voltammetry;

Fig. 3 ein weiteres Ergebnis einer linearen Voltammetrie; Fig. 3 shows another result of a linear voltammetry;

Fig. 4 die Korrelation zwischen amperometrischem Signal und optischer Dichte für oxidiertes TMB; FIG. 4 shows the correlation between amperometric and optical density signal for oxidized TMB;

Fig. 5 eine Kalibrationskurve für die Quantifizierung von Glukonsäure. Fig. 5 is a calibration curve for the quantification of gluconic acid.

Fig. 1 zeigt das Schema eines Enzymimmunoassays, wobei in Fig. 1A die Erfassung zweier Antigene als Analyten und in Fig. 1B die Erfassung eines Antigens und eines Antikörpers als Analyten dargestellt sind. Auf einem Substrat 1 sind analytspezifische Antikörper 3 immobilisiert. Auf dieses Substrat wird nun eine Probe gegeben, die beispielsweise die Antigene 2, 2' als Analyten enthält. Weiterhin werden in die Probe enzymgekoppelte Antikörper 5, 5' hinzugegeben, wobei der Antikörperbestandteil jeweils für einen der Analyten spezifisch ist. An diesen jeweiligen Antikörperbestandteil ist ein Enyzm 4, 4' gebunden, wobei die Enzyme 4, 4' (E1, E2) Substrate 51 bzw. 52 verstoffwechseln. Der für den Analyten 2 spezifische Antikörper ist dabei immer mit dem Enzym E1 gekoppelt und der für den Analyten 2' spezifische Antikörper ist immer mit dem Enzym E2 gekoppelt. Nach Zugabe der Probe und dem enzymgekoppelten Antikörper wird das Substrat gewaschen, wobei lediglich die an das Substrat immobilisierten Analyten und die enzymgekoppelten Antikörper auf dem Substrat verbleiben. Auf das Substrat 1 wird nun eine Lösung mit den Enzymreaktions-Substraten 51 und 52 gegeben, wobei die Bedingungen in der Lösung so eingestellt sind, daß die Enzyme E1 und E2 aktiv sind. Die Substrate 51 und 52 werden nun durch die Enzyme E1 und E2 verstoffwechselt. Durch Einstellung bestimmter Bedingungen wird anschließend die Enzymreaktion der Enzyme E1 und E2 gestoppt und anschließend das gebildete Produkt oder auch das verbrauchte Substrat gemessen. FIG. 1 shows the scheme of an enzyme immunoassay, the detection of two antigens as analytes being shown in FIG. 1A and the detection of an antigen and an antibody as analyte being shown in FIG. 1B. Analyte-specific antibodies 3 are immobilized on a substrate 1 . A sample is then placed on this substrate, which contains, for example, antigens 2 , 2 'as analytes. Furthermore, enzyme-linked antibodies 5 , 5 'are added to the sample, the antibody component being specific for one of the analytes. An enzyme 4 , 4 'is bound to this respective antibody component, the enzymes 4 , 4 ' (E1, E2) metabolizing substrates 51 and 52, respectively. The antibody specific for analyte 2 is always coupled to enzyme E1 and the antibody specific for analyte 2 'is always coupled to enzyme E2. After adding the sample and the enzyme-linked antibody, the substrate is washed, leaving only the analytes immobilized on the substrate and the enzyme-linked antibodies remaining on the substrate. A solution with the enzyme reaction substrates 51 and 52 is now placed on the substrate 1 , the conditions in the solution being set such that the enzymes E1 and E2 are active. The substrates 51 and 52 are now metabolized by the enzymes E1 and E2. By setting certain conditions, the enzyme reaction of the enzymes E1 and E2 is then stopped and then the product formed or the used substrate is measured.

In Fig. 1B ist dargestellt, wie mittels auf einem Substrat 1 immobilisierter Antikörper 3 und Antigene 2 ein Antigen 2' und ein Antikörper 3' als Analyte erfaßt werden. Die weitere Beschreibung entspricht derjenigen zu Fig. 1A und wird hier nicht weiter wiederholt. In Fig. 1B is shown, such as an antigen 2 'and an antibody 3' are detected as analytes by means of immobilized antibodies on a substrate 1 3 and 2 antigens. The further description corresponds to that of FIG. 1A and is not repeated here.

Als Enzyme E1 und E2 können nun HRP und GOD eingesetzt werden. Die Quanitifizierung der durch die Enzymreaktionen gebildeten Produkte kann sowohl optisch als auch amperometrisch erfolgen. Ein amperometrisches Verfahren ist beispielsweise in den deutschen Patentanmeldungen mit den Aktenzeichen 102 11 540.0 und 199 50 785.6 beschrieben, die beide auf dieselben Erfinder wie die vorliegende Erfindung zurückgehen. Die Offenbarung dieser Anmeldung wird vollständig insbesondere bezüglich der dort beschriebenen elektrochemischen Erfassung bei Enzymimmunoassays in die vorliegende Anmeldung aufgenommen. Eine besonders vorteilhafte Auswertung ergibt sich, sofern eine lineare Voltammetrie (Linear Sweep Voltammetrie, LSV) durchgeführt wird, um die Substrate bzw. Produkte zu quantifizieren. HRP and GOD can now be used as enzymes E1 and E2 be used. The quantification of the by the Enzyme-formed products can be both optical as well as amperometric. On amperometric method is for example in the German Patent applications with the file number 102 11 540.0 and 199 50 785.6, both of which are the same Inventors like the present invention go back. The disclosure of this application becomes complete especially with regard to those described there electrochemical detection in enzyme immunoassays in the present application added. A special one advantageous evaluation results if one linear voltammetry (LSV) is carried out to the substrates or products quantify.

Im vorliegenden Beispiel wurden zwei verschiedene enzymgekoppelte Antikörper verwendet, wobei als Enzyme die Enzyme HRP und GOD mit ihren Substraten TMP und Glucose verwendet wurden. Das Quenchen der Enzymreaktion erfolgte durch Zugabe von 1,0 M NaOH. In the present example, two were different enzyme-linked antibodies are used, being used as enzymes the enzymes HRP and GOD with their substrates TMP and Glucose were used. Quenching the Enzyme reaction was carried out by adding 1.0 M NaOH.

Die Voltammetrie wurde in einem Potentialbereich zwischen 600 mV und 0 mV durchgeführt, um den Reduktionsstrom zu erfassen. Die Abtastrate betrug 50 mV/s bei einer Probenaufnahmezeit von 0,015 s. Sämtliche LSV wurden durchgeführt unter Verwendung eines kommerziellen Potentiostaten (µAutolabII, EchoChemie EV, Holland) und unter Verwendung einer rotierenden Scheibenelektrode (Deutsche Metrohm GmbH) bei einer Drehgeschwindigkeit von 500 Upm. Diese Goldelektrode mit einem Durchmesser von 2 mm wurde vor jeder Messung poliert und anschließend in die Meßlösung eingetaucht. Zusätzlich befand sich in der Meßlösung eine Platingegenelektrode und eine Ag/AgCl-Referenzelektrode. Voltammetry was in a potential range between 600 mV and 0 mV Detect reduction current. The sampling rate was 50 mV / s with a sample acquisition time of 0.015 s. All LSV were performed using a commercial potentiostats (µAutolabII, EchoChemie EV, Holland) and using a rotating Disc electrode (Deutsche Metrohm GmbH) at one Rotation speed of 500 rpm. This gold electrode with a diameter of 2 mm was before each Measurement polished and then in the measuring solution immersed. In addition, there was one in the measurement solution Platinum counter electrode and one Ag / AgCl reference electrode.

In Fig. 2 ist das Ergebnis dieser Messungen dargestellt. The result of these measurements is shown in FIG .

Fig. 2 zeigt Kurven gemesssen mittels LSV für TMB (Kurve 5), oxidiertes TMB (Kurve 6) sowie für verschiedene Konzentrationen von Glukonsäure (Kurven 1 bis 4) jeweils ohne Zugabe des jeweils anderen Substrates oder Produktes. Es ist zu erkennen, daß an der Stelle, die mit "B" bezeichnet ist, das amperometrische Signal sich lediglich bei Konzentrationsänderungen des oxidierten TMB ändert, während eine Änderung der Konzentration der Glukonsäure in der Lösung an diesem Meßpunkt keine erheblichen Signaländerungen bewirkt. Dementsprechend kann aus der Messung an dem Punkt "B" die Konzentration an TMB bzw. oxidiertem TMB ermittelt werden. Fig. 2 shows curves precisely measured by LSV for TMB (curve 5), oxidized TMB (curve 6), as well as for various concentrations of gluconic acid (curves 1 to 4) in each case without the addition of the other substrate or product. It can be seen that at the point labeled "B" the amperometric signal changes only with changes in the concentration of the oxidized TMB, whereas a change in the concentration of the gluconic acid in the solution at this measuring point does not cause any significant changes in the signal. Accordingly, the concentration of TMB or oxidized TMB can be determined from the measurement at point "B".

An der Stelle, die mit "A" bezeichnet ist, setzt sich das Signal aus Einflüssen aufgrund der Konzentration von Glukonsäure und oxidiertem TMB zusammen. Da aufgrund der Messung an der Stelle "B" jedoch die Menge an oxidiertem TMB bereits bekannt ist, kann nun aus der Messung an der Stelle "A" die Konzentration an Glukonsäure berechnet werden. Eine derartige Auswertung ist eine einfache Dekonvolution der Kurven, wobei jedoch auch eine vollständige Dekonvolution über den gesamten Kurvenverlauf möglich ist. At the point marked "A" sits down the signal from influences due to concentration of gluconic acid and oxidized TMB. There based on the measurement at point "B", however, the quantity of oxidized TMB is already known the measurement at point "A" Gluconic acid can be calculated. Such Evaluation is a simple deconvolution of the curves, but also complete deconvolution about the entire course of the curve is possible.

Während Fig. 2 eine Messung mit lediglich Substraten bzw. Produkten darstellt, ist in Fig. 3 das Beispiel einer realen Messung in einer Reaktionslösung, die TMB, Glucose und Glukonsäure enthält, dargestellt. Dargestellt sind hier Kurven mit Glukonsäurekonzentration zwischen 0 und 12 mg/ml ohne oxidiertes TMB. While Fig. 2 is a measurement with only substrates or products is shown in Fig. 3 an example of a real measurement in a reaction solution containing TMB, glucose and gluconic acid containing illustrated. Curves with gluconic acid concentration between 0 and 12 mg / ml without oxidized TMB are shown here.

Da kein oxidiertes TMB zugegeben wurde, verlaufen sämtliche Kurven an der Stelle "B" durch denselben Punkt. Die Auswertung kann dann so wie zu Fig. 2 beschrieben, erfolgen. Since no oxidized TMB was added, all curves at point "B" run through the same point. The evaluation can then take place as described for FIG. 2.

Aus den beschriebenen Messungen kann auch eine Korrelation zwischen dem optischen Signal (chromogenes Signal) und dem amperometrischen Signal an der Stelle "B" in den Fig. 2 und 3 bestimmt werden. Dabei ergab sich ein Korrelationsfaktor von -1,28 µA/OD. Fig. 4 zeigt diese Beziehung zwischen dem Wert der optischen Dichte und dem amperometrischen Signal am Potential "B". Die optische Dichte wurde hierbei gemessen, indem eine Probe (100 µl) mit TMB in der elektrochemischen Zelle durch Zugabe einer 3 M Schwefelsäure (100 µl) gequericht wurde. Daraufhin wurde in einem herkömmlichen ELISA-Lesegerät (Rainbow Thermo, Tecam GmbH) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 650 nm die optische Dichte erfaßt. Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für oxidiertes TMB von ε = 67.000 cm^-1M^-1 bei der genannten Wellenlänge von 450 nm, kann die optische Dichte in andere Einheiten wie in Joseph et al., J. Biol. Chem. 257, 3669-3675 (1982) beschrieben, umgewandelt werden. A correlation between the optical signal (chromogenic signal) and the amperometric signal at point "B" in FIGS. 2 and 3 can also be determined from the measurements described. The correlation factor was -1.28 µA / OD. Fig. 4 shows this relationship between the value of the optical density and the amperometric signal at the potential "B". The optical density was measured by quenching a sample (100 μl) with TMB in the electrochemical cell by adding a 3 M sulfuric acid (100 μl). The optical density was then recorded in a conventional ELISA reader (Rainbow Thermo, Tecam GmbH) at a wavelength of 450 nm and a reference wavelength of 650 nm. Using an extinction coefficient for oxidized TMB of ε = 67,000 cm ^-1 M ^-1 at the stated wavelength of 450 nm, the optical density can be converted into other units as described in Joseph et al., J. Biol. Chem. 257, 3669-3675 ( 1982 ).

Nachdem auf diese Weise der Anteil des oxidierten TMB über Auswertung des Signals am Potential "B" bestimmt wurde, ist es nun möglich, den Einfluß des TMB auf das amperometrische Meßsignal an der Potentialstelle "A" zu bestimmen und so aus diesem Signal die Konzentration an Glukonsäure zu ermitteln. Hierzu wird nun eine Kalibrierungskurve für die Konzentraton an Glukonsäure beim Potential "A" bei verschiedenen Konzentrationen an oxidiertem TMB bestimmt. Derartige Kalibrierungskurven sind in Fig. 5 dargestellt. Dabei wurden Kalibrierungskurven bei zwei verschiedenen Potentialen von 0,042 V und 0,058 V und drei verschiedenen Konzentrationen von oxidiertem TMB von 0,262 bzw. 0,839 OD ermittelt und dargestellt. Mit zunehmender Konzentration an oxidiertem TMB nimmt der Schnittpunkt der Kalibrierungskurve mit der y-Achse zu (105%/OD), die Steigung der Kurve verändert sich jedoch kaum (2,5%/OD). So betragen die Steigungen bei optischen Dichten für TMB von 0,262 bzw. 0,839 55,0 bzw. 55,8 (µA.ml/mg). Die Schnittpunkte mit der y-Achse bei den optischen Dichten 0,262 bzw. 0,839 betragen jedoch 1,59 bzw. 2,56 (µA). Aus diesen Kalibrierungskurven in Fig. 5 kann der Einfluß des Signals des oxidierten TMB auf das Signal der Glukonsäure zu 0,83 µA/OD (TMB) ermittelt werden. After the proportion of the oxidized TMB has been determined in this way by evaluating the signal at the potential "B", it is now possible to determine the influence of the TMB on the amperometric measurement signal at the potential point "A" and thus the concentration from this signal To determine gluconic acid. For this purpose, a calibration curve for the concentration of gluconic acid at potential "A" at different concentrations of oxidized TMB is now determined. Such calibration curves are shown in FIG. 5. Calibration curves at two different potentials of 0.042 V and 0.058 V and three different concentrations of oxidized TMB of 0.262 and 0.839 OD were determined and displayed. With increasing concentration of oxidized TMB, the intersection of the calibration curve with the y-axis increases (105% / OD), but the slope of the curve hardly changes (2.5% / OD). The gradients at optical densities for TMB of 0.262 and 0.839 are 55.0 and 55.8 (µA.ml / mg). The points of intersection with the y-axis at optical densities 0.262 and 0.839 are 1.59 and 2.56 (µA). The influence of the signal of the oxidized TMB on the signal of the gluconic acid can be determined to be 0.83 μA / OD (TMB) from these calibration curves in FIG. 5.

Damit ermöglicht es die vorliegende Erfindung erstmals, in derselben Probenkammer innerhalb derselben Probe mittels eines Enzymimmunoassays gleichzeitig zwei verschiedene Analyte nachzuweisen. This enables the present invention for the first time, in the same sample chamber within the same Simultaneously sample using an enzyme immunoassay detect two different analytes.

Claims (6)

1. Verfahren zur Durchführung eines Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) zur qualitativen und/oder quantitativen Erfassung von Analyten in einer Probe dadurch gekennzeichnet,
daß zur simultanen quantitativen Bestimmung mindestens zweier unterschiedlicher Analyte in der Probe
die Probe und eine der Anzahl der zu bestimmenden Analyten entsprechende Anzahl Antikörpertypen, die mit einer der Anzahl der zubestimmenden Analyten entsprechenden Anzahl verschiedener Enzyme gekoppelt sind, in ein gemeinsames Reaktionsgefäß gegeben werden,
wobei zur Erkennung der unterschiedlichen Analyten jeweils ein Antikörpertyp spezifisch für jeweils einen der Analyten ist,
jeweils für verschiedene Analyten spezifische Antikörpertypen mit jeweils verschiedenen Enzymen gekoppelt sind,
durch die verschiedenen Enzyme jeweils verschiedene Substrate umsetzbar und/oder jeweils verschiedene Produkte erzeugbar sind, und
wobei die verschiedenen Enzyme unter gleichen physikalischen und/oder chemischen Bedingungen aktiv sind. 1. A method for carrying out an enzyme immunoassay (EIA, ELISA) for the qualitative and / or quantitative detection of analytes in a sample, characterized in that
that for the simultaneous quantitative determination of at least two different analytes in the sample
the sample and a number of antibody types corresponding to the number of analytes to be determined, which are coupled to a number of different enzymes corresponding to the number of analytes to be determined, are placed in a common reaction vessel,
where in order to recognize the different analytes, one type of antibody is specific for one of the analytes,
antibody types specific for different analytes are coupled with different enzymes,
different substrates can be implemented and / or different products can be produced by the different enzymes, and
the different enzymes being active under the same physical and / or chemical conditions. 2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß verschiedene Enzyme verwendet werden, deren Reaktionen durch Einstellung derselben Bedingungen und/oder Zugabe derselben Lösungen oder Reagentien gestoppt werden. 2. The method according to the preceding claim, characterized in that different enzymes are used, the reactions of which Setting the same conditions and / or addition same solutions or reagents stopped become. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme verwendet werden, deren verschiedene Substrate und/oder verschiedene Produkte unabhängig voneinander und/oder voneinander unterscheidbar quantitativ erfaßbar sind. 3. Method according to one of the preceding Claims, characterized in that enzymes are used, their various substrates and / or different products independently distinguishable from one another and / or from one another are quantifiable. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzyme Meerrettichperoxidase und Glukoseoxidase eingesetzt werden. 4. The method according to claim 1, characterized in that as enzymes Horseradish peroxidase and glucose oxidase are used become. 5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassung der Substrate und/oder Produkte durch amperometrische und/oder optische Detektion erfolgt. 5. The method according to at least one of claims 1 or 2, characterized in that the Capture of substrates and / or products amperometric and / or optical detection he follows. 6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die die Erfassung zumindest eines der Substrate und/oder Produkte durch Voltametrie, lineare Voltammetrie bzw. Voltametrie mit linearer Abtastung erfolgt. 6. The method according to claim 2, characterized characterized in that the capturing at least one of the Substrates and / or products by voltammetry, linear voltammetry or voltammetry with linear sampling takes place.