DE10213809C1 - Zellträger und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Abstract

Es wird ein Zellträger (40) mit einem Substrat (10) beschrieben, auf dem eine adhärente Struktur (20) gebildet ist, die adhärente Bereiche (12) umfasst, die ein erhöhtes Haftvermögen für biologische Materialien, insbesondere biologische Zellen, Zellbestandteile und/oder biologisch wirksame Makromoleküle, besitzen und die durch nicht-adhärente Bereiche (13) voneinander abgegrenzt sind, wobei das Substrat (10) aus einer transparenten Polymerfolie besteht, die an sich ein vermindertes Haftvermögen für die biologischen Materialien besitzt und deren Oberfläche (11) in den adhärenten Bereichen (12) chemisch und/oder strukturell modifiziert ist, wobei in den nicht-adhärenten Bereichen (13) die Oberfläche (11) der Polymerfolie unmodifiziert freiliegt und die Polymerfolie ein Polymer umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus Polyolefinen, insbesondere fluorinierten Polyolefinen, Polyhydroxyethylenmethacrylat, Polyurethan, Polytetrafluorethylen, Kollagen, Fibrin, Fibronektin und Polysacchariden ausgewählt ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Zellträger, insbesondere Träger­ substrate für biologische Zellen, und auf Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.

Ein Gegenstand moderner Verfahren der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Gentechnik ist insbesondere die Untersuchung der Wechselwirkung biologischer Zellen mit biologischen Materialien, wie zum Beispiel weiteren Zellen, Zellbestandteilen, Mikroorga­ nismen, Makromolekülen oder dergleichen, oder mit biologisch wirksamen Stoffen natürlichen oder synthetischen Ursprungs. Die Herbeiführung der Wechselwirkung, die Untersuchung des Wechsel­ wirkungsergebnisses oder eine Zellkultivierung vor oder nach der eigentlichen Untersuchung werden in der Regel mit adhärent auf einem festen Substrat angeordneten Zellen durchgeführt. Aus der Praxis sind die verschiedensten Zellenträger bekannt, die je nach der praktischen Aufgabe eine bestimmte Geometrie und/oder eine bestimmte Oberflächenfunktionalisierung besitzen. In der Regel bestehen Zellträger aus inerten Materialien, wie z. B. Glas, Kunststoff oder Halbleitermaterial.

Ein Nachteil herkömmlicher Zellträger besteht darin, dass diese in der Regel lediglich eine Substratfunktion besitzen. Sie bil­ den eine Auflage für die zu untersuchenden Zellen, die im We­ sentlichen ungeordnet auf einem Substrat aufwachsen. Es ist zwar aus der Praxis allgemein bekannt, Substrate lokal zu modifizie­ ren, um in bestimmten Bereichen ein verbessertes Zellwachstum zu induzieren. Hierzu sind jedoch komplizierte Substratpräparatio­ nen, wie z. B. Oberflächenätzungen oder dergleichen erforder­ lich.

Aus der Polymerphysik ist es allgemein bekannt, Polymeroberflä­ chen durch chemische oder physikalische Behandlungen zu modifi­ zieren. Zu den Behandlungen zählen beispielsweise eine Behand­ lung mit chemischen Substanzen, eine Bestrahlung mit Partikeln oder elektromagnetischen Strahlen, eine Koronaentladung, eine Plasmabehandlung, eine Flammbehandlung, eine Ozonbehandlung o­ der dgl. Es ist insbesondere bekannt, Polymeroberflächen mit UV-Licht zu modifizieren. Es kann auch eine strukturierte Modi­ fizierung vorgesehen sein, wie z. B. bei der Herstellung von Photoresists in der Mikroelektronik, wobei eine Ortsauflösung im Bereich von 100 nm erreichbar ist. Die herkömmlichen Verfah­ ren zur Behandlung von Polymeroberflächen sind auf eine Ände­ rung der chemischen Oberflächenstruktur gerichtet. Es werden Bindungen im Polymer aufgebrochen und/oder neue Bindungsstellen generiert. In WO 00/37122 wird die Modifizierung von Polytetra­ fluorethylen-Oberflächen durch gepulste Laserdeposition be­ schrieben. Diese Technik war bisher auf die Behandlung großer Polymeroberflächen (z. B. Werkstoffoberflächen) beschränkt.

Aus DE 199 17 532 A1 ist bekannt, Stamm- oder Vorläuferzellen von Keratinozyten auf Polymerträgern (insbesondere PTFE- Trägern) zu kultivieren.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Zellträger bereitzustellen, mit dem die Nachteile herkömmlicher Zellträger überwunden werden und der insbesondere eine definierte Zellabla­ ge und/oder ein definiertes Zellwachstum ermöglicht. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Zellträgers bereitzustellen.

Diese Aufgaben werden durch einen Zellträger, eine Reaktionskam­ mer und ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß den Ansprüchen 1, 7, 10 und 13 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwen­ dungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung ist es, ein Substrat mit einer adhä­ rent strukturierten Polymerfolie bereitzustellen, die adhärente Bereiche aufweist, die durch nichtadhärente Bereiche voneinander getrennt sind. Die Bereitstellung eines Zellträgers mit einer Polymeroberfläche, auf der die adhärenten Bereiche durch eine Polymermodifizierung geformt sind, besitzt den Vorteil, dass die Polymeroberfläche mit an sich bekannten Prozeduren definiert und reproduzierbar für eine definierte Zellablage und/oder ein defi­ niertes Zellwachstum angepasst werden kann. Die Erfinder haben festgestellt, dass eine modifizierte Polymeroberfläche eine ver­ änderte Bioreaktivität und Biokompatibilität besitzt. Eine Ober­ flächenmodifizierung umfasst eine Änderung der Bindungseigen­ schaften des Polymers auf der Oberfläche, insbesondere eine Auf­ brechen von Polymerbindungen. Es werden Bindungsstellen gene­ riert, die vorteilhafterweise für eine Zellablage und/oder ein Zellwachstum ausgenutzt werden.

Die Erfindung ist mit verschiedenen organischen Polymeren um­ setzbar, z. B. mit Polyolefinen, insbesondere fluorinierten Po­ lyolefinen, Polyhydroxyethylenmethacrylat, Polyurethan, Polytet­ rafluorethylen (PTFE), Polysachariden und Biopolymeren, wie z. B. Kollagen, Fibrin, Fibronektin und dgl. umsetzbar. Ein Vorteil dieser Materialien besteht in deren Modifizierbarkeit, insbeson­ dere durch elektromagnetische Bestrahlung, wie z. B. durch UV- und/oder Laserbestrahlung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der Zellträger aus einer transparenten, fluorhaltigen Polymerfo­ lie, insbesondere aus einer transparenten PTFE-Folie. Die erfin­ dungsgemäß verwendeten fluorhaltigen Polymerfolien besitzen die Vorteile, einerseits besonders einfach den Strukturierungsver­ fahren zur Herstellung der adhärenten Bereiche unterzogen werden zu können und andererseits eine Anpassung an die verschiedensten Anwendungen zu ermöglichen. Erfindungsgemäße Folien-Zellträger können mit besonderem Vorteil in an sich bekannten Mikrohybridi­ sierungskammern verwendet werden.

Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung bilden die adhärenten Bereiche, in denen eine bevor­ zugtes Anhaften von Zellen und/oder ein bevorzugtes Zellwachstum erfolgen, ein definiertes geometrisches Muster. Vorteilhafter­ weise kann dieses Muster mit hoher Reproduzierbarkeit mit Struk­ turgrößen von z. B. 10 µm bis 2 mm hergestellt werden. Es können aber auch größere Strukturen realisiert werden. Das Muster um­ fasst beispielsweise insel- oder streifenförmige adhärente Be­ reiche, die entsprechend durch nicht-modifizierte, nichtadhären­ te Bereiche getrennt sind. Es ergeben sich besondere Vorteile bei der Analyse der Zellen auf dem Zellträger, insbesondere mit optischen Detektoren, die für eine ortsaufgelöste Fluoreszenzde­ tektion eingerichtet sind.

Gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung können Po­ lymeroberflächen zur selektiven Zellablage eingerichtet werden, indem die adhärenten Bereiche mit spezifisch wirkenden Adsorba­ ten ausgestattet werden. Adsorbate umfassen vorzugsweise biolo­ gisch wirksame Makromoleküle, wie z. B. Proteine, Kollagene, An­ tikörper, Laminin und andere Proteine der extrazellulären Matrix biologischer Zellen.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Her­ stellung des genannten Zellträgers, bei dem eine Polymeroberflä­ che behandelt wird, um die adhärenten Bereiche herzustellen. Es wird vorzugsweise eine Behandlung mit elektromagnetischer Be­ strahlung, Teilchenbestrahlung, einer chemischen Substanz oder einer Feldbeeinflussung (z. B. Koronaentladung) realisiert. Ge­ mäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden flu­ orhaltige Polymeroberfläche mittels elektromagnetischer Bestrah­ lung strukturiert behandelt, um die adhärenten Bereiche zu er­ zeugen.

Die Erfindung ermöglicht, dass bei genügend dünner Aussaat eines Zellgemisches (bestehend aus verschiedenen Zelltypen) max. 1 Zelle pro adhärenten Bereich zur Anheftung kommt. Dadurch wird auf den adhärenten Bereichen ein klonales Zellwachstum erreicht, d. h. ein Klon entwickelt sich aus nur einer auf einem Spot zur Anheftung gebrachten Ursprungszelle. Durch die Abgrenzung von anderen Spots durch nichthaftende Bereiche (d. h. unbehandelte Oberflächen) kann es zu keiner Vermischung der Klone kommen. Bei herkömmlichen Kulturoberflächen, die nicht auf die erfindungsge­ mäße Weise hergestellt wurden, überwuchern die sich schnell tei­ lende Zellen die Kulturschale, was zur Folge hat, dass keine Klone separiert werden können und sich besonders langsam teilen­ de Zellen schnell überwuchert werden.

Viele Zelltypen haben die Eigenschaft, dass sie sich mit Hilfe ihres Zytoskelettes über Oberfläche bewegen können. Durch die vorgegebenen adhärenten Bereiche (Wachstumsflächen) können sich die Zellen nur in genau bekannten Bereichen bewegen. Das bedeu­ tet, dass es zu keiner Kreuzkontamination, d. h. keiner Vermi­ schung der Zellklone kommen kann. Besonders in der Biotechnolo­ gie stellt die garantierte Reinheit von Zellen, die über dieses Verfahren ermöglicht wird, einen großen Vorteil dar.

Da die adhärenten Bereiche eine genau definierte Abmessung be­ sitzen, ermöglicht dies auch die genaue punktförmige Isolierung von einzelnen Klonen. Dies wird dadurch erreicht, dass ein Iso­ lierungsinstrument zur Aufnahme von Zellen die gleiche Abmessung wie der adhärente Bereich besitzt. Auf diese Art können, ohne die Gefahr, versehentlich mehrere Klone zu isolieren, Zellen von dem adhärenten Bereich entfernt werden (mechanisch oder enzyma­ tisch). Das Wachstum auf den anderen adhärenten Bereichen wird dadurch nicht beeinflußt.

Durch das Aufbringen einer Markierung (Eichmarke für Koordina­ tenerfassung, z. B. optisch) auf der Polymeroberfläche (z. B. Fo­ lie) und dem definierten Punktmuster der adhärenten Bereiche (x, y Achsen) kann die Isolierung der Klone automatisiert werden.

Durch zusätzliche Modifikation der adhärenten Bereiche (z. B. Aufbringung von Makromolekülen wie Aminosäuren, Peptide, Protei­ ne, Zucker, Lipide, Nukleinsäuren, Zellen, Zellbestandteile, Vi­ ren) kann die Anhaftung und Wachstum von bestimmten Zelltypen gefördert werden.

Durch die Variation der zusätzlichen Beschichtungen der adhären­ ten Stellen innerhalb einer Folie wird die Bereitstellung eines Analytik-Zell-Chips ermöglicht. Zusammen mit einer Markierung (Eichpunkt für Koordinatensystem) und definierten Punktmustern können Reaktionen der Zellklone, z. B. über eine Veränderung der Fluoreszenz eines entsprechenden Farbstoffs automatisch ausgele­ sen und zellspezifisch analysiert werden. Es lassen sich auf diese Weise auch Zellwachstum oder andere Reaktionen erfassen.

Eine abgewandelte Anwendung des Analytik-Zell-Chips besteht dar­ in, dass verschiedene Zelltypen (z. B. Tumorzellen) auf einer Fo­ lie aufgebracht und kultiviert werden. Adhärente Bereiche sind dabei auf die Haftungseigenschaften der jeweiligen Zellen abge­ stimmt. Durch die Zugabe eines Pharmakons kann der Einfluß auf das Wachstum analysiert werden (z. B. für eine Suche nach Zytos­ tatika). Zusammen mit einer Markierung (Eichpunkt für Koordina­ tensystem) und definiertem Punktmuster können die Klone automa­ tisch ausgelesen werden und zusammen mit der Art der Beschich­ tung analysiert werden. Es kann z. B. schnell erfasst werden, ob ein Wachstum stattgefunden hat oder nicht.

Erfindungsgemäße Zellträger ermöglichen eine räumliche Teilung zweier oder mehrerer verschiedener Zellpopulationen. Verschiede­ ne Zelltypen benötigen zum Wachstum die Unterstützung von Füt­ terzellen (z. B. Keratinozyten und Fibroblasten). Nachdem die Zielzellen gewachsen sind, müssen diese sogenannten Fütterzel­ len (feeder cells) abgetrennt werden. Durch die räumliche Tren­ nung durch nichtadhärente Bereiche auf der Folie kann es zu kei­ ner Durchmischung kommen und die Zielzellen können von separaten Spots isoliert werden, ohne dass es zu einer signifikanten Ver­ mischung mit den Fütterzellen kommt.

Die Orientierung von Zellen auf einer Wachstumsoberfläche ist zunächst zufällig. Im Organismus sind jedoch die Zellen nach ei­ nem genauen Muster orientiert, um als Gewebe (z. B. Muskel) zu funktionierten. Durch flächige Muster der adhärenten Bereiche (z. B. Linien) wird den Zellen ein orientiertes Wachstum ermög­ licht. Zusätzlich können durch unterschiedliche zusätzliche Be­ schichtung der einzelnen Spots verschiedene Zelltypen an defi­ nierten Stellen zur Anhaftung gebracht werden, was ein definier­ tes Wachstumsmuster (z. B. Ausrichtung von Muskelzellen zu Mus­ kelfasern) und in der Folge zweidimensionales organotypisches Zellwachstum auf einer so behandelten Oberfläche auch außerhalb des Körpers ermöglicht.

Die Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Erfin­ dungsgemäße Zellträger besitzen einen erweiterten Anwendungsbe­ reich. Sie erfüllen neben der Substratfunktion zusätzlich eine Modifizierungsfunktion, indem sie die Zellablage und/oder das Zellwachstum je nach der Geometrie und/oder stofflichen Zusam­ mensetzung der adhärenten Bereiche beeinflussen. Es ergeben sich vorteilhafte Anwendungen bei der Sammlung von Zellen auf Zell­ trägern, insbesondere zu deren Anhaftung, Proliferation, Wachs­ tum oder Kultivierung.

Weitere Vorteile und Einzelheiten werden im Folgenden unter Be­ zug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 bis 3 schematische Illustrationen der Herstellung er­ findungsgemäßer Zellträger, und

Fig. 4 eine schematische Schnittansicht einer Perfu­ sionskammer, die mit dem erfindungsgemäßen Zell­ träger ausgestattet ist.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht in der lokalen Behandlung von Polymeroberflächen zur Erzeugung bestimmter Mus­ ter adhärenter Bereiche (Wechselwirkungsbereiche, Interaktions­ bereiche) und/oder bestimmter stofflicher Modifizierungen. Die Erfindung wird im Folgenden am Beispiel der Modifizierung von fluorhaltigen Polymerfolien, insbesondere PTFE-Folien erläutert, ohne auf diese Polymere und diese flexible Substratform einge­ schränkt zu sein. Vielmehr können Substrate aus beliebigen fes­ ten Materialien, insbesondere Glas, Halbleitermaterial oder Kunststoff, verwendet werden, auf deren Oberfläche eine Polymer­ schicht gebildet ist. Transparente PTFE-Folien werden jedoch be­ vorzugt verwendet, da diese Vorteile bei der optischen Analyse der auf dem Zellträger gesammelten Zellen bieten.

In Fig. 1 sind mit den Teilbildern (A) bis (D) schematisch die Schritte eines Verfahrens zur Herstellung eines Zellträgers 40 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung dargestellt. Die il­ lustrierten Größenverhältnisse entsprechen nicht den Größenver­ hältnissen in der Realität. Der Zellträger umfasst ein Substrat 10 mit einer fluorpolymerhaltigen Oberfläche 11. Beim darge­ stellten Beispiel wird eine transparente PTFE-Folie verwendet. Die Foliendicke beträgt bspw. 1 mm bis 10 µm.

Gemäß Fig. 1 (B) erfolgt eine Oberflächenmodifizierung der PTFE-Folie zur Herstellung von adhärenten Bereichen. Die Modifi­ zierung erfolgt nach dem Verfahren der gepulsten Laserdepositi­ on, die an sich zur Modifizierung von PTFE-Oberflächen bekannt ist (siehe WO 00/37122). Die PTFE-Folie 10 wird einer Laserbe­ strahlung ausgesetzt, bei der eine Änderung des Vernetzungsgra­ des und der Kettenlängen im oberflächennahen Polymermaterial in­ duziert wird. Zur strukturierten Modifizierung wird die Laserbe­ strahlung 51 durch eine Maske 52 mit lichtdurchlässigen Berei­ chen 53 auf die PTFE-Folie 10 gerichtet. Die Folienmodifizierung erfolgt an den Orten der Belichtung. Im dargestellten Beispiel werden adhärente Bereiche 12 in Form von Inseln 21 (Fig. 1 (C)) gebildet, deren matrixartige Anordnung in geraden Reihen und Spalten der Maskengestalt entspricht. Die Inseln 21 besitzen bspw. einen Durchmesser von 0.001 bis 3 mm. Sie sind vollständig von nichtadhärenten Bereichen 13, d. h. von unbehandelten Ober­ flächenteilen umschlossen. Jeder adhärente Bereich, z. B. jede Insel 21, wird von einem nichtadhärenten Bereich umgeben. Der Abstand zwischen den Rändern der adhärenten Bereiche beträgt vorzugsweise mindestens 500 µm. Auf die modifizierte PTFE-Folie werden Zellen 30 (vergrößert gezeigt) aufgebracht. Die Erfinder haben erstmalig festgestellt, dass die Zellen 30 auf den adhä­ renten Bereichen 12 (Inseln 21) gut anhaften und weiterwachsen, während in den dazwischen liegenden, nichtadhärenten Bereichen 13 ein Anhaften oder Wachsen der Zellen behindert oder ausge­ schlossen ist. Es wurde festgestellt, dass in den nichtadhären­ ten Bereichen 13 keine Wechselwirkungs-Bindungen für die Zellen gegeben sind, die Bereiche 13 bieten keinen Halt für Pseudopo­ dien der Zellen oder andere Bestandteile von Zellmembranen. Da­ mit wachsen auf dem fertigen Zellträger 40 gemäß Fig. 1 (D) die Zellen 30 mit einem Muster entsprechend der Geometrie der adhä­ renten Bereiche 12. Diese Musteranordnung besitzt besondere Vor­ teile bei der nachfolgenden Analyse von Fällen, beispielsweise durch Fluoreszenzmessungen.

Alternativ zur genannten Laserbehandlung einer PTFE-Folie kann beispielsweise eine UV-Bestrahlung vorgesehen sein. Je nach Auf­ gabe kann die Bestrahlung mit einer chemischen Behandlung kombi­ niert werden. Hierzu wird der interessierende Oberflächenbereich in einem reaktiven, gasförmigen oder flüssigem Medium bestrahlt, so dass ggf. chemische Gruppen an der Oberfläche durch neue che­ mische Gruppen und/oder Verbindungsstellen ersetzt werden. Die UV-Bestrahlung erfolgt mit an sich bekannten Bestrahlungsquellen vorzugsweise im Bereich von 150 nm bis 360 nm. Je nach dem ver­ wendeten Material kann auch eine Wellenlänge im sichtbaren Wel­ lenlängenbereich zur Bestrahlung verwendet werden.

Alternativ erfolgt die Oberflächenmodifizierung durch Ionen­ bestrahlung (Ionenimplantation durch eine Maske). Die Ionen­ bestrahlung führt zu einer chemischen und/oder strukturellen Veränderung der Oberfläche. Es werden bspw. C-, N-, O-, Ne- oder Ar-Ionen verwendet. Die Bestrahlung erfolgt mit an sich verfüg­ baren Implantationsgeräten bei Raumtemperatur im Vakuum oder in einem reaktiven Plasma. Es werden typischerweise Ionenenergien von einigen 10 bis einigen 100 keV mit Stromdichten im Bereich von rd. 1012 Ionen/cm bis 1016 Ionen/cm 2 verwendet.

Gemäß einer weiteren Alternative ist eine Oberflächenbehandlung mit einem reaktiven oder einem nicht-reaktiven Plasma vorgese­ hen. Die Plasmabehandlung führt entsprechend zu chemischen und/oder strukturellen Änderungen der Oberfläche.

In Fig. 2 sind die gleichen Verfahrensschritte wie in Fig. 1 illustriert, wobei hier jedoch nichtadhärente Inseln, sondern adhärente Streifen 29 gebildet sind. Der erfindungsgemäße Zell­ träger zeichnet sich durch eine orientierte Beschichtung und da­ mit ein orientiertes Wachstum der Zellen gemäß Fig. 1 (D) aus.

Ein besonderer Vorteil der orientierten Zellkultivierung auf ei­ nem Zellträger gemäß Fig. 2 besteht darin, dass Zellen mit ei­ nem bestimmten Wachstumsmuster kultiviert werden, das der Zell­ ausrichtung in einem biologischen System, insbesondere in einem Gewebe entspricht. Erfindungsgemäße Zellträger ermöglichen eine Simulation des Wachstums von Zellen gleicher oder verschiedener Typen unter geometrischen Bedingungen, die den Bedingungen in einem Organ angepasst sind.

Die Oberflächenmodifizierung des Zellträgers kann gemäß Fig. 3 auch eine stoffliche Modifizierung umfassen. Gemäß Fig. 3 (B) erfolgt während der gepulsten Laserdeposition ein Adsorbatzusatz 54. Es werden bspw. Aminosäuren, Peptide, Nukleinsäuren, Zucker, Proteine oder dgl. in die adhärenten Bereiche aufgenommen, die hier Adsorbatbereiche 23 bilden. Alternativ erfolgt die Modifi­ zierung der adhärenten Bereiche nach deren Bildung. Die Funktio­ nalisierung der adhärenten Bereiche kann darauf gerichtet sein, dass auf dem Zellträger nur eine bestimmte Art von Zellen wach­ sen. Beispielsweise umfassen die Zellen 30 gemäß Fig. 3 einen ersten Zelltyp 31 (große Zellen) und einen zweiten Zelltyp 32 (kleine Zellen). Die Modifizierung der PTFE-Folie ist durch Aus­ wahl spezifischer Bindungsstellen so gewählt, dass lediglich der erste Zelltyp 31 auf dem Zellträger 40 anhaftet.

Alternativ zum Einbau der Adsorbate während oder nach der Poly­ merbehandlung (z. B. Laserdeposition) kann ein zusätzlicher Schritt eines Aufsynthetisierens von weiteren Substanzen, z. B. eines Aufsynthetisierens von Proteinen, vorgesehen sein. Des Weiteren können die in den Figuren illustrierten Modifizierungen gemeinsam durchgeführt werden. Es kann bspw. eine strukturierte Oberflächenmodifizierung gemäß den Fig. 1 oder 2 gebildet werden, bei der die adhärenten Bereiche 12 spezifisch bindende Adsorbate enthalten.

Erfindungsgemäße Zellträger bilden folienförmige Zellmatrizen, die je nach Anwendung selbst Untersuchungen unterzogen werden oder als Detektoren verwendet werden. Vorteilhafterweise können die adhärenten Bereiche mit einer hohen Dichte angeordnet werden (z. B. 10 Inseln 21 pro mm²). Die Aufbringung der Zellen 30 er­ folgt vorzugsweise aus einer Suspension mit einer ausreichend geringen Verdünnung, so dass auf jeder Insel 21 eine einzelne Zelle anhaftet. Damit wird eine sog. Klonierungsfolie herge­ stellt, die aus einem erfindungsgemäßen Zellträger 40 mit im Mittel höchstens einer Zelle pro adhärentem Bereich 12 besteht.

Mit besonderem Vorteil wird der erfindungsgemäße Zellträger bei einem Verfahren zur Analyse von Zellen verwendet. Zellen werden aus einer Suspension auf die modifizierte Oberfläche aufgebracht und nach Anhaftung mit an sich bekannten optischen Methoden, insbesondere Fluoreszenzmessungen untersucht.

Die Zellen auf dem Zellträger 40 besitzen definierte Raumkoordi­ naten. Die Position jeder Zelle kann mit X- und Y-Koordinaten angegeben werden. Dies erleichtert die Messung und die Ablage von Messdaten gemeinsam mit der jeweiligen geometrischen Posi­ tion. Zur Angabe der geometrischen Position kann ein erfindungs­ gemäßer Zellträger mindestens eine Referenzmarkierung tragen. Es ist bspw. als Eichmarke eine kreuzförmige Referenzmarkierung 14 (siehe Fig. 2) vorgesehen, die einen Koordinatenursprung defi­ niert. Damit wird vorteilhafterweise die Zuordnung der Koordina­ ten der adhärenten Bereiche oder der auf diesen angeordneten Zellen für ein optisches Detektionssystem erleichtert.

In Fig. 4 ist in vergrößerter schematischer Schnittansicht eine Reaktionskammer 60 illustriert, die mit einem erfindungsgemäßen Zellträger ausgestattet ist. Die Reaktionskammer 60, die bspw. eine Klonierungskammer oder eine Perfusionskammer bildet, ist selbst Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Sie umfasst einen erfindungsgemäßen Zellträger 40, der auf mindestens einer Wand 61 der Reaktionskammer 60 angeordnet ist. Die gegenüberliegende Wand wird durch einen Deckel 63 gebildet. In den Seitenwänden 64 sind Fluidanschlüsse 65 zum Zufluss oder Abfluss einer Zellsus­ pension oder einer Behandlungslösung in das Innere der Reakti­ onskammer 60 vorgesehen. Die Seitenwände 64 sind vorzugsweise mit einer schematisch illustrierten Höhenverstellung 66 ausges­ tattet, mit der der Deckel 63 in verschiedenen Abständen vom Zellträger 40 angeordnet werden kann (siehe Doppelpfeil). Das Bezugszeichen 67 verweist auf eine Elektrodeneinrichtung, mit der im Innern der Reaktionskammer 60 elektrische Felder zur Be­ handlung oder Manipulierung von Zellen erzeugt werden können. Mit der Elektrodeneinrichtung 67 kann eine zusätzliche Beein­ flussung der Zellbewegung auf der Grundlage dielektrophoreti­ scher Kraftwirkungen erzielt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der Deckel 63 aus einem transparenten Material. Dies ermöglicht eine Beobachtung des Zellträgers 40 mit einem optischen Detekti­ onssystem 70 von der Oberseite der Reaktionskammer her. Das De­ tektionssystem 70 enthält bspw. eine CCD-Kamera, mit der Fluo­ reszenzemissionen von Zellen auf dem Zellträger 40 erfasst wer­ den können.

Die Reaktionskammer 60 bildet gemäß einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform der Erfindung einen sog. Biochip, d. h. ein Verbund­ bauteil aus einem Kunststoff- oder Halbleitermaterial, in das die Struktur der Reaktionskammer 60 und der Zellträger 40 integ­ riert sind. Ein erfindungsgemäßer Biochip enthält vor Verwendung einen Zellträger 40 mit den oben beschriebenen adhärenten Berei­ chen. Vom Anwender wird der Zellträger 40 im Biochip mit einer Zellsuspensionslösung in Kontakt gebracht. Nach einem vorgegebe­ nen Protokoll erfolgt ein Anheften von Zellen auf den adhärenten Bereichen. Anschließend erfolgt eine Kultivierung oder eine Ma­ nipulierung der Zellen je nach der Aufgabenstellung.

Die verstellbare Höhe des Deckels 63 besitzt den Vorteil, dass die Strömungsgeschwindigkeit in der Reaktionskammer 60 einstell­ bar ist. Durch Absenkung des Deckels 63 (Verringerung der Kam­ merhöhe) wird die Strömungsgeschwindigkeit erhöht und damit die Kontaktzeit der in einer Zellsuspension befindlichen Zellen mit dem Zellträger 40 verringert. Gleichzeitig wird mit einer ver­ ringerten Kammerhöhe die Wahrscheinlichkeit eines kurzzeitigen Kontakts der Zellen mit dem Zellträger erhöht.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl ein­ zeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeu­ tung sein.

Claims (17)

1. Zellträger (40) mit einem Substrat (10), auf dem eine ad­ härente Struktur (20) gebildet ist, die adhärente Bereiche (12) umfasst, die ein erhöhtes Haftvermögen für biologische Materia­ lien, biologische Zellen, Zellbestandteile und/oder biologisch wirksame Makromoleküle, besitzen und die durch nicht-adhärente Bereiche (13) voneinander abgegrenzt sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (10) aus einer transparenten Polymerfolie besteht, die an sich ein vermindertes Haftvermögen für die biologischen Materialien besitzt und deren Oberfläche (11) in den adhärenten Bereichen (12) chemisch und/oder strukturell modifiziert ist, wobei in den nicht-adhärenten Bereichen (13) die Oberfläche (11) der Polymerfolie unmodifiziert freiliegt und die Polymer­ folie ein Polymer umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Po­ lyolefinen, Polyhydro­ xyethylenmethacrylat, Polyurethan, Polytetrafluorethylen, Kol­ lagen, Fibrin, Fibronektin und Polysacchariden ausgewählt ist.

2. Zellträger gemäß Anspruch 1, bei dem die Polymerfolie aus PTFE-Folie besteht.

3. Zellträger gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Folie in einem Rahmen aufgespannt ist.

4. Zellträger gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die adhärenten Bereiche punkt- oder kreisförmige Inseln (21), Streifen (22) und/oder Schichten (23) mit Adsorbaten um­ fassen.

5. Zellträger gemäß Anspruch 4, bei dem punktförmige adhären­ te Bereiche vorgesehen sind, die zur adhärenten Anheftung je­ weils einer biologischen Zelle ausgelegt sind.

6. Zellträger gemäß Anspruch 4 oder 5, bei dem die Adsorbate biologisch wirksame Makromoleküle, insbesondere Kollagene, An­ tikörper, Laminin oder Proteine der extrazellulären Matrix um­ fassen.

7. Reaktionskammer (60) zur Aufnahme einer Zellsuspension, bei der an mindestens einer Seitenwand ein Zellträger (40) ge­ mäß einem der Ansprüche 1 bis 6 angeordnet ist.

8. Reaktionskammer gemäß Anspruch 7, die eine Zellkulturscha­ le umfasst, auf deren Boden der Zellträger (40) angeordnet ist.

9. Reaktionskammer gemäß Anspruch 7 oder 8, die mit einem höhenverstellbaren, transparenten Deckel (63) und/oder einer Elektrodenanordnung (67) ausgestattet ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die adhärenten Bereiche (12) auf dem Substrat (10) mit Hilfe von elektromagnetischer Bestrah­ lung, Partikelbestrahlung, chemischer Behandlung, Plasmabehand­ lung oder gepulster Laserdeposition erzeugt werden.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem die elektromagneti­ sche Bestrahlung eine UV-Bestrahlung umfasst.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem zur Erzeugung der ad­ härenten Bereiche eine Maske (52) verwendet wird, die punktför­ mige, runde oder streifenförmige, durchlässige Bereiche (53) aufweist.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem während oder nach der Erzeugung der adhärenten Bereiche (12) auf diesen Schichten mit Adsorbaten gebunden werden.

14. Verfahren zur Beladung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 mit biologischen Zellen, bei dem der Zellträ­ ger mit der Oberfläche (11), die die adhärenten Bereiche (12) aufweist, mit einer Suspension in Kontakt gebracht wird, die die Zellen enthält.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem der Zellträger dauer­ haft mit der Suspension in Kontakt gebracht wird und die Kon­ zentration der Zellen in der Suspension so gering ist, dass auf jedem adhärenten Bereich (12) maximal eine Zelle fixiert wird.

16. Verwendung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Sammlung, zur Anhaftung, zum Wachstum, zur Prolifera­ tion und/oder zur Kultivierung von biologischen Zellen, als Klonierungsfolie und/oder als biologischer Detektor.

17. Verwendung eines Zellträgers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Reaktionskammer gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Isolierung von Zellklonen.