DE10210737A1 - Single-channel multi-color correlation analysis - Google Patents

Single-channel multi-color correlation analysis

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DE10210737A1
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optical
sample
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luminescent molecules
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Per Thyberg
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Gnothis Holding SA
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Abstract

The invention relates to a method for detecting luminescent molecules by optical excitation in confocal measuring volumes, wherein different species of luminescent molecules are excited at different times in a sample and the emission radiation of the different species coming from the measuring volume is picked up by a single detector. The invention also relates to a device which is suitable for implementing said method.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, wobei verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen in einer Probe zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies aus einem Messvolumen stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen wird. Weiterhin wird eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung offenbart. The invention relates to a method for determining luminescent Molecules by optical excitation in confocal measurement volumes, whereby different species of luminescent molecules in a sample be stimulated at different times and by the different species from a measurement volume Emission radiation is captured by a single detector. Furthermore, one is suitable for carrying out the method Device disclosed.

Die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum Nachweis von Analyten ist bekannt. EP-B-0 679 251 offenbart Verfahren und Vorrichtungen zur Detektion von Analyten mittels Fluoreszenzspektroskopie, wobei die Bestimmung in einem konfokalen Messvolumen durchgeführt wird, das Teil der zu untersuchenden Probe ist. The use of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) for Detection of analytes is known. EP-B-0 679 251 discloses methods and devices for the detection of analytes by means of Fluorescence spectroscopy, the determination in a confocal Measurement volume is carried out, which is part of the sample to be examined.

Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie kann in Verbindung mit einer sogenannten Kreuzkorrelationsanalyse durchgeführt werden, wobei zwei hinsichtlich mindestens einer optischen Eigenschaft verschiedenen Spezies von lumineszierenden Molekülen in einem konfokalen Messvolumen angeregt und das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit einer Korrelation zwischen beiden Messsignalen analysiert wird. Ein Nachteil bisher verwendeter Kreuzkorrelationsverfahren besteht jedoch darin, dass die von den verschiedenen lumineszierenden Spezies stammenden Emissionsstrahlungen durch jeweils separate Detektoren nachgewiesen werden musste. Fluorescence correlation spectroscopy can be used in conjunction with a So-called cross-correlation analysis are carried out, two with respect to at least one optical property of different species of luminescent molecules in a confocal measurement volume excited and the presence or absence of a correlation between the two measurement signals is analyzed. A disadvantage so far However, the cross-correlation method used is that of the various luminescent species Emission radiation detected by separate detectors had to become.

Eine der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen, insbesondere durch Mehrfarben-Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie bereitzustellen, die auf einfache Weise eine Bestimmung von Kreuzkorrelationen erlauben. One task underlying the present application was therein, methods and devices for the determination of luminescent Molecules, especially by multicolor fluorescence To provide correlation spectroscopy, which is a simple Allow determination of cross correlations.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina umfassend die Schritte:

  • a) Bereitstellen einer Probe umfassend lumineszierende Moleküle,
  • b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungs- und Fokussiereinrichtung zur optischen Anregung von lumieszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen Messvolumen, das Teil der Probe ist, und
  • c) Auffangen und Auswerten von Emissionsstrahlung aus dem mindestens einen Messvolumen,
The invention thus relates to a method for determining luminescent molecules by optical excitation in confocal measurement volumes, comprising the steps:
  • a) providing a sample comprising luminescent molecules,
  • b) irradiating the sample with an optical excitation and focusing device for optical excitation of luminescent molecules in at least one confocal measurement volume, which is part of the sample, and
  • c) collecting and evaluating emission radiation from the at least one measurement volume,

wobei in einem Messvolumen mehrere hinsichtlich einer optischen Eigenschaft verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen und ausgewertet wird. with several in terms of an optical in a measurement volume Property of different species of luminescent molecules be stimulated at different times and by the emission radiation from different species through a single Detector is collected and evaluated.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine Einkanal-Mehrfarben- Korrelationsanalyse dar, wobei mehrere, z. B. 2, 3, 4 oder noch mehr, hinsichtlich mindestens einer optischen Eigenschaft, wie Emissionswellenlänge oder/und Lumineszenz-Abklingzeit, verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen in einem einzigen Messvolumen angeregt und die Signale auf einem einzigen Detektor ausgewertet werden können. The method according to the invention represents a single-channel multicolor Correlation analysis, with several, z. B. 2, 3, 4 or more, regarding at least one optical property, such as Emission wavelength or / and luminescence decay time, various Species of luminescent molecules in a single measurement volume excited and the signals are evaluated on a single detector can.

Hierzu werden vorzugsweise 2 oder mehr, z. B. 3, separate Lichtquellen, insbesondere Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen, z. B. λ1, λ2, λ3, zur jeweiligen separaten Anregung verschiedener Spezies verwendet. Diese separaten Lichtquellen können mittels eines oder mehrerer stellbarer optischer Schaltelemente zu jeweils verschiedenen Zeiten in das konfokale Messvolumen eingestrahlt bzw. eingekoppelt und zur Anregung der Emission darin verwendet werden. Beispiele für geeignete stellbare optische Schaltelemente sind akustooptische Modulatoren, stellbare Reflexionselemente, wie etwa piezogesteuerte Spiegel, stellbare Beugungselemente, stellbare diffraktionsoptische Elemente und Kerrzellen. Zum Nachweis der Signale wird pro Messvolumen nur ein einziger Detektor verwendet, der abwechselnd die von den verschiedenen angeregten Spezies emittierten Signale aufnimmt und durch geeignete Maßnahmen, z. B. eine digitales Kodierungssignal, definiert. An den Detektor angeschlossen sind vorzugsweise weiterhin ein Signalprozessor, eine Datenspeicherungseinheit und ein Korrelator. For this purpose, preferably 2 or more, e.g. B. 3, separate light sources, especially lasers with different wavelengths, e.g. B. λ1, λ2, λ3, for each used separate excitation of different species. This separate light sources can be adjusted by means of one or more optical switching elements at different times in the confocal Measuring volume irradiated or coupled in and to excite the Emission used in it. Examples of suitable adjustable optical switching elements are acousto-optical modulators, adjustable Reflective elements, such as piezo-controlled mirrors, adjustable Diffraction elements, adjustable diffraction optical elements and Kerr cells. Only one detector per measurement volume is used to detect the signals used that alternately excited by the different Species emits signals and takes appropriate measures, z. B. defines a digital coding signal. To the detector preferably a signal processor, a Data storage unit and a correlator.

Das vom Detektor aufgenommene Signal wird vorzugsweise mit einem der Taktfrequenz der verschiedenen Lichtquellen entsprechenden Kodierungssignal in einem Korrelator ausgewertet. Alternativ können auch energiedispersive Detektoren verwendet werden, die zwischen den einzelnen Emissionsstrahlungsarten, die von den jeweils verschieden angeregten Spezies stammen, unterscheiden können. Die Taktfrequenz, mit der die verschiedenen Lichtquellen auf das Messvolumen eingestrahlt werden, steht in Relation zu dem zu erwartenden Messsignal. So wird bei der Bestimmung von Diffusionsereignissen, wo die Diffusionszeit, z. B. im Bereich von etwa 1 ms liegt, eine Taktfrequenz mit einem erheblich geringeren Taktintervall, z. B. mit einem Taktintervall von 0,1-10 µs (entsprechend 10-0,1 MHz), z. B. von etwa 1 µs (entsprechend 1 MHz), eingestellt. Bei anderen Arten von Bestimmungen erfolgt eine entsprechende Einstellung der Taktzeit. The signal picked up by the detector is preferably with one of the Clock frequency of the different light sources corresponding Coding signal evaluated in a correlator. Alternatively, you can energy dispersive detectors are used, which between the individual types of emission radiation that differ from each excited species. The clock frequency, with which radiates the different light sources onto the measuring volume is in relation to the measurement signal to be expected. So at the determination of diffusion events where the diffusion time, e.g. B. in Range of about 1 ms, a clock frequency with a significant shorter clock interval, e.g. B. with a clock interval of 0.1-10 microseconds (corresponding to 10-0.1 MHz), e.g. B. of about 1 µs (corresponding to 1 MHz), set. For other types of determinations, a appropriate setting of the cycle time.

Aus dem Zeitverlauf der einzelnen, von jeweils verschiedenen lumineszierenden Spezies stammenden Emissionssignalen, z. B. µ1, µ2, µ3, können Autokorrelationsfunktionen (lediglich Berücksichtigung eines einzelnen Signals) sowie Kreuzkorrelationen (gemeinsame Berücksichtigung mehrerer Signale), z. B. µ1 × µ2, µ2 × µ3, µ1 × µ3 oder µ1 × µ2 × µ3, berechnet werden. Es handelt sich somit um ein Multiplexverfahren, das grundsätzlich auf eine größere Anzahl von Laserfrequenzen übertragbar ist. From the course of time of the individual, each different emission signals originating from luminescent species, e.g. B. µ1, µ2, µ3, can autocorrelation functions (only taking into account a individual signal) and cross correlations (joint consideration several signals), e.g. B. µ1 × µ2, µ2 × µ3, µ1 × µ3 or µ1 × µ2 × µ3, be calculated. It is therefore a multiplex method that is generally transferable to a larger number of laser frequencies.

Durch entsprechende elektronische Hintergrundanalyse kann eine Korrelations- oder/und Koinzidenzkurve berechnet werden, bei der "korrekt" auftretende Signale von solchen Signalen unterschieden werden können, die durch unerwünschte Interferenz (Crosstalk) mehrerer Markierungsgruppen entstehen. By means of appropriate electronic background analysis, a Correlation or / and coincidence curve are calculated in which "correct" occurring signals can be distinguished from such signals, caused by unwanted interference (crosstalk) by several Marker groups are created.

Um die Genauigkeit des Verfahrens zu verbessern, insbesondere um ein Übersprechen der Emissionslinien µ1, µ2, µ3 und vor allem der Exzitationslinien λ1, λ2, λ3 zu verringern, können dichroitische Filter oder/und Blockierungsfilter, z. B. Interferenzfilter verschiedener Ordnungen oder Notch-Filter zur Regelung der Strahlung, z. B. für eine selektive Durchlässigkeit bei bestimmten Wellenlängen, eingesetzt werden. In order to improve the accuracy of the method, in particular by a Crosstalk of the emission lines µ1, µ2, µ3 and especially the Dichroic filters can reduce excitation lines λ1, λ2, λ3 or / and blocking filters, e.g. B. interference filters of different orders or notch filter to regulate the radiation, e.g. B. for a selective Permeability at certain wavelengths can be used.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst eine parallele Bestimmung von lumineszierenden Molekülen in mehreren Proben. Dabei kann das von der optischen Anregungseinrichtung ausgestrahlte Licht in multiple Lichtstrahlen bzw. Foci aufgespalten werden, die auf Messvolumina in mehreren Proben fokussiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Aufspaltung des ausgestrahlten Lichts durch Verwendung eines oder mehrerer diffraktiver optischer Elemente, wie in DE 101 26 083.0 beschrieben. Besonders bevorzugt wird für jede Lichtquelle ein diffraktives optisches Element verwendet, das vor der Strahlenvereinigung in den Strahlengang angeordnet wird. A particularly preferred embodiment of the invention The method involves a parallel determination of luminescent Molecules in multiple samples. This can be from the optical Excitation device emitted light into multiple light beams or Foci are split up on measurement volumes in multiple samples be focused. In a particularly preferred embodiment splitting the emitted light by using an or several diffractive optical elements, as in DE 101 26 083.0 described. A diffractive one is particularly preferred for each light source optical element used before the radiation union in the Beam path is arranged.

Als diffraktive optische Elemente können beispielsweise dreidimensionale, gegebenenfalls auf einen optisch transparenten Träger aufgebrachte optische Gitter verwendet werden, welche hindurchtretendes Licht beugen und in der Objektebene durch konstruktive und destruktive Interferenz ein vorbestimmtes Beugungsmuster, d. h. eine gewünschte Anordnung multipler optischer Foci, in beliebigen Anordnungen erzeugt werden können. Die multiplen optischen Foci werden dabei günstigerweise durch Interferenzen 1. Ordnung gebildet, wobei nur geringe Lichtverluste durch Interferenzen der 0. bzw. höherer Ordnungen auftreten. For example, three-dimensional, optionally applied to an optically transparent carrier optical gratings are used which diffract light passing through and in the object plane through constructive and destructive interference predetermined diffraction pattern, d. H. a desired arrangement multiple optical foci, can be generated in any arrangement can. The multiple optical foci are favorably through First-order interferences are formed, with only slight light losses through Interferences of the 0th or higher orders occur.

Die Herstellung geeigneter diffraktiver optischer Elemente ist beispielsweise in der Dissertation von F. Nikolaefam Chalmers Institute of Technologies (1999), in der Dissertation von M. Johansson am Chalmers Institute of Technologies (2001) sowie in der Publikation Johansson und Hård (Applied Optics 38 (1999), 1302-1310) beschrieben. Als Materialien zur Herstellung der optischen Elemente sind Kunststoffe, Glas und Verbundstoffe bzw. andere Materialien mit optischer Transparenz für eine gegebene Wellenlänge geeignet, die durch photolithographische Ätzung bearbeitet werden können. The production of suitable diffractive optical elements is, for example in the dissertation by F. Nikolaefam Chalmers Institute of Technologies (1999), in the dissertation by M. Johansson at the Chalmers Institute of Technologies (2001) and in the publication Johansson and Hård (Applied Optics 38 (1999), 1302-1310). As manufacturing materials the optical elements are plastics, glass and composite materials or other materials with optical transparency for a given Suitable wavelength, processed by photolithographic etching can be.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren betrifft den Nachweis von in den konfokalen Messvolumina lumineszierenden Molekülen durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Das Verfahren kann grundsätzlich nach der in EP-B-0 679 251 beschriebenen Methode durchgeführt werden. Dabei erfolgt vorzugsweise die Messung von einem oder wenigen Analytmolekülen in einem Messvolumen, wobei die Konzentration der zu bestimmenden Analytmoleküle vorzugsweise ≤ 10-6 mol/l beträgt und das Messvolumen vorzugsweise ≤ 10-14 l ist. Es werden stoffspezifische Parameter bestimmt, die durch Lumineszenzmessung an den Analytmolekülen ermittelt werden. Bei diesen Parametern kann es sich um Translationsdiffusions- Koeffizienten, Rotationsdiffusions-Koeffizienten oder/und um die Exzitationswellenlänge, die Emissionswellenlänge oder/und die Lebensdauer eines angeregten Zustandes eines lumineszierenden Moleküls oder die Kombination von einer oder mehrerer dieser Messgrößen handeln. Auf Einzelheiten zu apparativen Details wird auf die Offenbarung von EP 0 679 251 verwiesen. A preferred embodiment of the method according to the invention relates to the detection of molecules luminescent in the confocal measurement volumes by fluorescence correlation spectroscopy. The method can in principle be carried out according to the method described in EP-B-0 679 251. The measurement of one or a few analyte molecules in a measurement volume is preferably carried out, the concentration of the analyte molecules to be determined preferably being 10 10 -6 mol / l and the measurement volume preferably being 10 10 -14 l. Substance-specific parameters are determined, which are determined by luminescence measurement on the analyte molecules. These parameters can be translational diffusion coefficients, rotational diffusion coefficients or / and the excitation wavelength, the emission wavelength and / or the lifetime of an excited state of a luminescent molecule or the combination of one or more of these measurement variables. For details of apparatus details, reference is made to the disclosure of EP 0 679 251.

Ein bevorzugtes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probenflüssigkeit und der Fokussieroptik der Lichtquelle ≥ 1 mm, vorzugsweise 1,5 bis 10 mm und besonders bevorzugt 2 bis 5 mm beträgt. Weiterhin ist bevorzugt, dass zwischen dem die Probenflüssigkeit enthaltenden Träger und der optischen Fokussiereinrichtung ein Gasphasenbereich angeordnet ist, der Luft, Schutzgas oder Vakuum enthalten kann. Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von FCS mit großem Abstand zwischen Fokussieroptik und konfokalem Messvolumen sind in DE 101 11 420.6 beschrieben. Für gewisse Anwendungen kann jedoch selbstverständlich auch ein geringerer Abstand zwischen Fokussieroptik und Messvolumen von < 1 mm gewählt werden. Ebenso kann auch ein unmittelbarer Kontakt zwischen Probe und Fokussieroptik, z. B. durch Verwendung einer Immersionsflüssigkeit, bestehen. A preferred feature of the method according to the invention is that the distance between the measurement volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source ≥ 1 mm, preferably 1.5 to 10 mm and particularly preferably 2 to 5 mm. It is further preferred that between the carrier containing the sample liquid and the optical one Focusing device a gas phase area is arranged, the air, May contain inert gas or vacuum. Methods and devices for Implementation of FCS with a large distance between focusing optics and Confocal measurement volumes are described in DE 101 11 420.6. For Certain applications can of course also be a smaller one Distance between focusing optics and measuring volume of <1 mm selected become. Direct contact between the sample and Focusing optics, e.g. B. by using an immersion liquid, consist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zur Durchführung beliebiger Bestimmungsverfahren geeignet. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, z. B. für diagnostische Anwendungen oder für ein Screening zur Identifizierung von Wirkstoffen, die mit einer Zielsubstanz wechselwirken. Hierzu werden eine oder mehrere Analyt-bindende Substanzen der Probe zugegeben, die eine durch Lumineszenzmessung nachweisbare Markierungsgruppe, insbesondere Fluoreszenz-Markierungsgruppe tragen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in diesem Fall vorzugsweise eine Bestimmung der Bindung der Markierungssubstanz an den nachzuweisenden Analyten. Dieser Nachweis kann beispielsweise durch Mehrfarben-Kreuzkorrelationsbestimmung erfolgen, wobei mindestens zwei unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, eingesetzt werden, deren korreliertes Signal innerhalb des Messvolumens bestimmt wird. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwille et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) und Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109) beschrieben. The method according to the invention is basically to be carried out suitable for any determination method. A preferred one Embodiment relates to the determination of an analyte in a sample, z. B. for diagnostic applications or for a screening Identification of active substances that interact with a target substance. For this purpose, one or more analyte-binding substances of the sample added, which is detectable by luminescence measurement Wear labeling group, especially fluorescent labeling group. In this case, the method according to the invention preferably comprises one Determination of the binding of the labeling substance to the analytes to be detected. This proof can, for example, by Multi-color cross-correlation determination is carried out, with at least two different labels, especially fluorescent labels, are used, their correlated signal within the measurement volume is determined. This cross-correlation determination is, for example, at Schwille et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) and Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109).

Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, z. B. Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen, in lebenden Organismen, insbesondere in Säugern wie dem Menschen vorkommenden, Analytmolekülen. Darüber hinaus können auch Analyten nachgewiesen werden, die in vitro aus biologischen Proben erzeugt worden sind, z. B. cDNA-Moleküle, die durch Reverse Transkription aus mRNA hergestellt worden sind, oder Proteine, die durch in vitro Translation aus mRNA bzw. aus DNA hergestellt worden sind. Weiterhin eignet sich das Verfahren zum Nachweis von Analyten, die als Elemente einer Bibliothek vorliegen und vorbestimmte Charakteristika, z. B. Bindung an das Nachweisreagenz, zeigen sollen. Beispiele solcher Bibliotheken sind Phagenbibliotheken oder ribosomale Bibliotheken. The method according to the invention is particularly suitable for detection of biomolecules, e.g. B. nucleic acids, proteins or other, in living Organisms, especially those found in mammals such as humans, Analyte molecules. In addition, analytes can also be detected which have been generated in vitro from biological samples, e.g. B. cDNA molecules made by reverse transcription from mRNA or proteins which have been translated from mRNA or have been made from DNA. The method is also suitable for Detection of analytes that are available as elements of a library and predetermined characteristics, e.g. B. binding to the detection reagent, should show. Examples of such libraries are phage libraries or ribosomal libraries.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung eine Nukleinsäurehybridisierung, wobei eine oder mehrere lumineszenzmarkierte Sonden an eine Zielnukleinsäure als Analyten binden. Derartige Hybridisierungsverfahren können beispielsweise zur Analyse der Genexpression, z. B. zur Ermittlung eines Genexpressionsprofils, zur Analyse von Mutationen, z. B. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch auch zur Bestimmung enzymatischer Reaktionen oder/und zur Bestimmung von Nukleinsäureamplifikationen, insbesondere in einem Thermocycling- Prozess. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäure- Polymorphismen sind in DE 100 56 226.4 und DE 100 65 631.5 beschrieben. Dabei wird besonders bevorzugt eine Zwei- oder Mehrfarben- Kreuzkorrelationsbestimmung durchgeführt. In a particularly preferred embodiment, the determination comprises a nucleic acid hybridization, wherein one or more Bind luminescence-labeled probes to a target nucleic acid as analytes. Such hybridization methods can be used, for example, to analyze the Gene expression, e.g. B. to determine a gene expression profile, Analysis of mutations, e.g. B. Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) be used. However, the method according to the invention is suitable also for the determination of enzymatic reactions and / or for the determination nucleic acid amplifications, especially in a thermocycling Process. Preferred methods for determining nucleic acid Polymorphisms are in DE 100 56 226.4 and DE 100 65 631.5 described. A two-color or multi-color Cross correlation determination carried out.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung den Nachweis einer Protein-Protein- oder Protein-Ligand- Wechselwirkung, wobei als Proteinliganden z. B. niedermolekulare Wirkstoffe, Peptide, Nukleinsäuren etc. eingesetzt werden können. Auch für derartige Bestimmungen wird bevorzugt eine Zwei- oder Mehrfarbenkorrelationsmessung durchgeführt. In a further particularly preferred embodiment, the Determining the detection of a protein-protein or protein-ligand Interaction, with z. B. low molecular weight Active ingredients, peptides, nucleic acids etc. can be used. Also for such determinations a two or is preferred Multi-color correlation measurement carried out.

In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform können sogenannte "Molecular Beacon" Sonden oder Primer eingesetzt werden, die - wenn sie in freier Form vorliegen - ein hinsichtlich der Lumineszenzintensität oder/und -abklingzeit verschiedenes Messsignal als in gebundenem Zustand ergeben. In an alternative preferred embodiment, so-called "Molecular Beacon" probes or primers can be used, if - are in free form - one in terms of luminescence intensity or / and decay time different measurement signal than in the bound state result.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Verfahren zur Selektion von Partikeln in einer Substanzbibliothek, wobei ein Partikel mit einer vorbestimmten Eigenschaft aus einer Population, umfassend eine Vielzahl von unterschiedlichen Partikeln, selektioniert wird. Hierzu wird vorzugsweise eine Population von unterschiedlichen Partikeln bereitgestellt, Partikel, die eine vorbestimmte Eigenschaft aufweisen, markiert, die Partikel in einem Mikrokanal durch ein Detektionselement, umfassend multiple konfokale Volumenelemente, geleitet, um zwischen markierten und nichtmarkierten Partikeln zu unterscheiden und markierte Partikel abgetrennt. Die Schritte des Leitens und des Abtrennens werden vorzugsweise mindestens einmal wiederholt, wobei die Konzentration der Partikel in einem nachfolgenden Zyklus gegenüber einem vorhergehenden Zyklus vorzugsweise um mindestens den Faktor 104 verringert wird. Die Partikel können beispielsweise aus Zellen, Teilen von Zelloberflächen, Zellorganellen, Viren, Nukleinsäuren, Proteinen und niedermolekularen Substanzen ausgewählt werden. Das Verfahren eignet sich auch zur Selektion von Partikeln aus einer kombinatorischen Bibliothek, die genetische Packungen wie Phagen, Zellen, Sporen oder Ribosomen enthalten kann. Die Partikelpopulation enthält vorzugsweise mehr als 106 und besonders bevorzugt mehr als 1010 unterschiedliche Partikel. Die Partikel werden vorzugsweise mit einer Lumineszenzmarkierungsgruppe markiert. A further preferred embodiment of the invention comprises a method for the selection of particles in a substance library, wherein a particle with a predetermined property is selected from a population comprising a large number of different particles. For this purpose, a population of different particles is preferably provided, particles which have a predetermined property are marked, the particles in a microchannel are passed through a detection element, comprising multiple confocal volume elements, in order to distinguish between marked and unmarked particles and separated marked particles. The steps of conducting and separating are preferably repeated at least once, the concentration of the particles in a subsequent cycle preferably being reduced by at least a factor of 104 compared to a previous cycle. The particles can be selected, for example, from cells, parts of cell surfaces, cell organelles, viruses, nucleic acids, proteins and low-molecular substances. The method is also suitable for the selection of particles from a combinatorial library, which can contain genetic packages such as phages, cells, spores or ribosomes. The particle population preferably contains more than 10 6 and particularly preferably more than 10 10 different particles. The particles are preferably labeled with a luminescent labeling group.

Noch eine weitere Ausführungsform umfasst die Durchführung einer Sequenzanalyse von Polymeren, insbesondere Biopolymeren, wobei lumeszierende Fragmente eines in der Probe vorhandenen Analyten bestimmt werden. Diese Ausführungsform ist insbesondere zur Durchführung einer Nukleinsäure-Sequenzierung geeignet. Hierzu wird vorzugsweise ein Trägerpartikel mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindesten einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Das Trägerpartikel wird in eine Sequenziervorrichtung umfassend einen Mikrokanal eingebracht, dort, z. B. mit einem IR-Einfanglaser festgehalten und, z. B. durch Behandlung mit einer Exonuklease, fortschreitend einzelne Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül abgespalten. Die abgespaltenen Nukleotidbausteine werden dann durch einen Mikrokanal, vorzugsweise mittels eines hydrodynamischen Flusses, geleitet und dort in konfokalen Volumenelementen die Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine bestimmt. Yet another embodiment involves performing one Sequence analysis of polymers, especially biopolymers, where luminescent fragments of an analyte present in the sample be determined. This embodiment is particularly for Suitable for performing nucleic acid sequencing. This will preferably a carrier particle with an immobilized thereon Nucleic acid molecule provided, essentially all Nucleotide building blocks of at least one base type in at least one Wear a strand of the nucleic acid molecule with a fluorescent label. The Carrier particles are placed in a sequencing device Micro-channel introduced, there, for. B. held with an IR capture laser and Z. B. by treatment with an exonuclease, progressively individual Nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecule cleaved. The cleaved nucleotide building blocks are then through a microchannel, preferably by means of a hydrodynamic flow, directed and there in confocal volume elements the base sequence of the Nucleic acid molecule due to the sequence of the cleaved Nucleotide building blocks determined.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Aufspaltung der von den Lichtquellen stammenden Lichtstrahlen in mehrere optische Foci. Vorzugsweise wird der Lichtstrahl in 2-32, insbesondere in 4-16 optische Foci aufgespalten. Durch Verwendung einer geeigneten Fokussieroptik werden aus diesen optischen Foci konfokale Volumenelemente in der Probe abgebildet. Die konfokalen Volumenelemente haben günstigerweise eine Größe von 10-18 bis 10-9 l, vorzugsweise von 10-18 bis 10-12 l und besonders bevorzugt von 10-16 bis 10-14 l. In a preferred embodiment, the light beams originating from the light sources are split into several optical foci. The light beam is preferably split into 2-32, in particular 4-16 optical foci. By using suitable focusing optics, confocal volume elements are imaged in the sample from these optical foci. The confocal volume elements advantageously have a size of 10 -18 to 10 -9 l, preferably 10 -18 to 10 -12 l and particularly preferably 10 -16 to 10 -14 l.

Zum Auffangen von Strahlung, insbesondere Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen, wird vorzugsweise jeweils ein separater Detektor pro Volumeneinheit oder eine ortsauflösende Detektionsmatrix, z. B. eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder eine elektronische Detektormatrix, z. B. eine CCD-Kamera, verwendet. For collecting radiation, especially emission radiation from the multiple confocal volume elements, is preferably one each separate detector per volume unit or a spatially resolving Detection matrix, e.g. B. an avalanche photodiode matrix or electronic detector matrix, e.g. B. a CCD camera used.

Die Aufspaltung des Lichtstrahls in mehrere optische Foci erlaubt die parallele Bestimmung in separaten konfokalen Volumenelementen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese konfokalen Volumenelemente in jeweils separaten Behältnissen eines Träger, vorzugsweise einer Mikrostruktur, vorgesehen. The splitting of the light beam into several optical foci allows the parallel determination in separate confocal volume elements. In a preferred embodiment, these confocal volume elements are in each separate container of a carrier, preferably one Microstructure.

Das Volumen dieser Behältnisse liegt vorzugsweise im Bereich von ≤ 10-6 l und besonders bevorzugt ≤ 10-8 l bis 10-12 l. So kann der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen zur Aufnahme von Probeflüssigkeit umfassen, die beispielsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1000 µm aufweisen. Geeignete Mikrostrukturen sind z. B. in DE 100 23 421.6 und DE 100 65 632.3 beschrieben. Diese Mikrostrukturen können beispielsweise zur Bestimmung einer Nukleinsäure-Hybridisierung in Lösung eingesetzt werden. Weiterhin umfasst der Träger vorzugsweise mindestens ein Temperatur-Steuerungselement, z. B. ein Peltier-Element, welches eine Temperaturregelung des Träger oder/und einzelner Probenbehältnisse darin ermöglicht. The volume of these containers is preferably in the range from 10 10 -6 l and particularly preferably 10 10 -8 l to 10 -12 l. The carrier can thus comprise a microwave structure with a plurality of depressions for receiving sample liquid, which for example have a diameter between 10 and 1000 μm. Suitable microstructures are e.g. B. described in DE 100 23 421.6 and DE 100 65 632.3. These microstructures can be used, for example, to determine nucleic acid hybridization in solution. Furthermore, the carrier preferably comprises at least one temperature control element, e.g. B. a Peltier element, which enables temperature control of the carrier and / or individual sample containers therein.

Der für das Verfahren verwendete Träger ist zweckmäßigerweise so ausgestaltet, dass er eine optische Detektion der Probe ermöglicht. Vorzugsweise wird daher ein zumindest im Bereich der Probenbehältnisse optisch transparenter Träger verwendet. Der Träger kann dabei entweder vollständig optisch transparent sein oder eine optisch transparente Basis und eine optisch undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den Probenbehältnissen enthalten. Geeignete Materialien für Träger sind beispielsweise Verbundstoffträger aus Metall (z. B. Silicium für die Deckschicht) und Glas (für die Basis). Derartige Träger können beispielsweise durch Aufbringen einer Metallschicht mit vorgegebenen Aussparungen für die Probenbehältnisse auf das Glas erzeugt werden. Alternativ können Plastikträger, z. B. aus Polystyrol oder Polymeren auf Acrylat- oder Methacrylatbasis eingesetzt werden. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Träger eine Abdeckung für die Probenbehältnisse aufweist, um während der Messung ein geschlossenes und von der Umgebung im Wesentlichen isoliertes System bereitzustellen. The carrier used for the method is expediently so designed to enable optical detection of the sample. Therefore, at least in the area of the sample containers is preferred optically transparent carrier used. The carrier can either be completely optically transparent or an optically transparent base and an optically opaque top layer with cutouts in the Sample containers included. Suitable materials for carriers are for example metal composite supports (e.g. silicon for the Top layer) and glass (for the base). Such carriers can for example by applying a metal layer with predetermined Cutouts for the sample containers are created on the glass. Alternatively, plastic carriers, e.g. B. made of polystyrene or polymers Acrylate or methacrylate base can be used. It is further preferred that the carrier has a cover for the sample containers in order to during the measurement a closed and from the environment in To provide an essentially isolated system.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Träger verwendet, der ein Linsenelement enthält, das im Strahlengang zwischen Messvolumen und Lichtquelle bzw. Detektor der optischen Vorrichtung angeordnet ist. Beispielsweise kann das Linsenelement am Boden einer Mikrowellstruktur angebracht sein. Ein derartiges Linsenelement lässt sich beispielsweise durch Erhitzen und Formen eines Fotoresists unter Verwendung einer Master-Form, z. B. aus Metall wie Silicium, erzeugen und dann auf den Träger aufgebracht werden. Alternativ können - z. B. bei Verwendung von Trägern aus Vollplastikstruktur - die Linsenelemente in den Träger integriert, z. B. während der Herstellung durch Spritzgießen erzeugt werden. Durch Verwendung eines Linsenelements, vorzugsweise eines konvexen Linsenelements, kann die numerische Apertur der optischen Messanordnung vergrößert werden. Diese numerische Apertur liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 1,2. In a particularly preferred embodiment, a carrier used, which contains a lens element in the beam path between Measuring volume and light source or detector of the optical device is arranged. For example, the lens element at the bottom of a Microwave structure can be attached. Such a lens element can be for example by heating and molding a photoresist under Using a master form, e.g. B. made of metal such as silicon, and then applied to the carrier. Alternatively - e.g. B. at Use of supports made of full plastic structure - the lens elements in integrated the carrier, e.g. B. during manufacture by injection molding be generated. By using a lens element, preferably of a convex lens element, the numerical aperture of the optical measuring arrangement can be enlarged. This numerical aperture is preferably in the range from 0.5 to 1.2.

Der Träger ist weiterhin vorzugsweise mit einem transparenten Antireflexionsüberzug beschichtet, um einen höheren Brechungsindex zu erzeugen. Als Antireflexionsüberzüge können beispielsweise transparente Oxide oder Nitride eingesetzt werden. Antireflexionsbeschichtungen werden vorzugsweise auch auf der Optik verwendet. The carrier is also preferably transparent Anti-reflective coating coated to give a higher refractive index produce. Transparent, for example, can be used as anti-reflection coatings Oxides or nitrides can be used. Anti-reflective coatings are preferably also used on optics.

Weiterhin können im Träger elektrische Felder, insbesondere im Bereich der Probenbehältnisse erzeugt werden, um eine Konzentrierung der zu bestimmenden Analyten im Messvolumen zu erreichen. Beispiele für Elektroden, die zur Erzeugung solcher elektrischen Felder geeignet sind, sind z. B. in DE 101 03 304.4 beschrieben. Furthermore, electrical fields, in particular in the area of the Sample containers are created to allow for a concentration of the determining analytes in the measurement volume. examples for Electrodes that are suitable for generating such electric fields, are z. B. described in DE 101 03 304.4.

Das zu bestimmende Molekül kann - insbesondere bei einer Bestimmung im Mikrowellformat oder bei der Einzelmolekülsequenzierung - an ein Trägerpartikel gebunden sein. Das Trägerpartikel hat eine Größe, die eine Bewegung in Mikrokanälen und das Festhalten an einer gewünschten Position innerhalb einer Sequenzierungsvorrichtung ermöglicht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5-10 µm und besonders bevorzugt von 1-3 µm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe, wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle, wie Silicium, Metalloxide, wie Siliciumdioxid, oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt. The molecule to be determined can - especially when determined in the Microwave format or single molecule sequencing - on one Carrier particles be bound. The carrier particle has a size that one Movement in microchannels and sticking to a desired one Allows position within a sequencing device. The Particle size is preferably in the range of 0.5-10 µm and particularly preferably from 1-3 µm. Examples of suitable materials from Carrier particles are plastics, such as polystyrene, glass, quartz, metals or Semimetals, such as silicon, metal oxides, such as silicon dioxide, or Composite materials that contain several of the aforementioned components contain. Optically transparent ones are particularly preferred Carrier particles, for example made of plastics or particles with a Plastic core and a silicon dioxide shell used.

Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihr 5'-Ende auf dem Trägerpartikel immobilisiert, z. B. durch kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkung. Besonders bevorzugt erfolgt die Bindung von Polynukleotiden an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin etc. Alternativ können Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv oder kovalent an den Träger gebunden werden. Nucleic acid molecules are preferably on their 5 'end on the Immobilized carrier particles, e.g. B. by covalent or non-covalent Interaction. Binding of is particularly preferred Polynucleotides on the carrier through high affinity interactions between the partners of a specific binding pair, e.g. B. Biotin / streptavidin or avidin etc. Alternatively, nucleic acid molecules are also adsorptively or covalently bound to the support.

Vorzugsweise verwendet man Trägerpartikel, an die nur ein einziges Nukleinsäuremolekül gebunden ist. Derartige Trägerpartikel können dadurch erzeugt werden, dass die zur Bestimmung vorgesehenen Nukleinsäuremoleküle in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 20, z. B. 1 : 10, mit den Trägerpartikeln unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen eine Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger stattfindet. It is preferred to use carrier particles to which only a single particle is attached Nucleic acid molecule is bound. Such carrier particles can thereby generated that the intended for determination Nucleic acid molecules in a molar ratio of preferably 1: 5 to 1:20, e.g. B. 1:10, in contact with the carrier particles under conditions brought in which immobilization of the nucleic acid molecules to the carrier takes place.

Die an einen Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle, z. B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, können in einzelsträngiger Form oder doppelsträngiger Form vorliegen. Vorzugsweise liegen die Nukleinsäuremoleküle in einzelsträngiger Form vor. Beim Einsatz für die Sequenzierung tragen im Wesentliche alle, z. B. mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95% aller Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp, eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe. Es können auch im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens 2 Basentypen, beispielsweise 2, 3 oder 4 Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung tragen, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe enthält. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nukleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z. B. einerthermostabilen DNA-Polymerase, erzeugt werden. Eine genaue Beschreibung dieses Verfahrens findet sich in DE 100 31 840.1 und DE 100 65 626.9 sowie den dort angegebenen Literaturzitaten. The nucleic acid molecules bound to a support, e.g. B. DNA molecules or RNA molecules, can be single-stranded or double-stranded Form. The nucleic acid molecules are preferably in single-stranded form. When used for sequencing wear in Essential all, e.g. B. at least 90%, preferably at least 95% all nucleotide building blocks of at least one base type, one Fluorescent labeling group. It can also be essentially all Nucleotide building blocks of at least 2 base types, for example 2, 3 or 4 base types, carry a fluorescent label, each base type conveniently a different fluorescent label group contains. Such labeled nucleic acids can by enzymatic Primer extension on a nucleic acid template using a suitable polymerase, e.g. B. a thermostable DNA polymerase become. A detailed description of this method can be found in DE 100 31 840.1 and DE 100 65 626.9 and those specified there Cites.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens wie zuvor beschrieben, umfassend

  • a) einen Träger zur Aufnahme einer Probe, die mehrere verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen enthält,
  • b) eine optische Anregungs- und Fokussiereinrichtung, umfassend mehrere separate Lichtquellen, und ein stellbares optisches Schaftelement zur Einkopplung der separaten Lichtquellen zu verschiedenen Zeiten auf ein konfokales Messvolumen, das Teil der Probe ist, und
  • c) eine optische Detektionseinrichtung, umfassend jeweils einen einzigen Detektor pro Messvolumen zum Nachweis von Lumineszenz.
Yet another object of the present invention is a device for determining luminescent molecules, in particular for carrying out a method as described above
  • a) a carrier for receiving a sample which contains several different species of luminescent molecules,
  • b) an optical excitation and focusing device, comprising a plurality of separate light sources, and an adjustable optical shaft element for coupling the separate light sources at different times to a confocal measurement volume, which is part of the sample, and
  • c) an optical detection device, each comprising a single detector per measurement volume for the detection of luminescence.

Der Träger ist vorzugsweise eine Mikrostruktur mit mehreren, vorzugsweise mindestens 10, besonders bevorzugt mindestens 102 Behältnissen zur Aufnahme einer Probeflüssigkeit, wobei die Probeflüssigkeit in den separaten Behältnissen aus einer oder mehreren Quellen stammen kann. Das Einbringen der Probeflüssigkeit in die Behältnisse des Trägers kann z. B. mittels einer piezoelektrischen Flüssigkeitsabgabe-Vorrichtung erfolgen. The carrier is preferably a microstructure with several, preferably at least 10, particularly preferably at least 102 containers for Inclusion of a sample liquid, the sample liquid in the separate containers can come from one or more sources. The introduction of the sample liquid into the containers of the carrier can, for. B. by means of a piezoelectric liquid dispensing device.

Die Behältnisse des Trägers sind so ausgestaltet, dass sie eine Bindung des Nachweisreagenz mit dem Analyten in Lösung ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Behältnissen um Vertiefungen in der Trägeroberfläche, wobei diese Vertiefungen grundsätzlich eine beliebige Form aufweisen können, z. B. kreisförmig, quadratisch, rautenförmig etc. Der Träger kann auch 103 oder mehr separate Behältnisse umfassen. The containers of the carrier are designed so that they bind the Allow detection reagent with the analyte in solution. Preferably the containers are recesses in the Carrier surface, these recesses basically any Can have shape, e.g. B. circular, square, diamond-shaped etc. The carrier may also include 103 or more separate containers.

Alternativ kann der Träger auch eine Mikrokanalstruktur mit einem oder mehreren Mikrokanälen enthalten, die insbesondere für ein Einzelmolekül- Sequenzierungsverfahren, wie in DE 100 31 840.1 und DE 100 65 626.9 beschrieben, oder für ein Partikel-Selektionsverfahren, wie in DE 100 31 028.1 beschrieben, geeignet sind. Alternatively, the carrier can also have a microchannel structure with or contain several microchannels, which are particularly suitable for a single molecule Sequencing methods as in DE 100 31 840.1 and DE 100 65 626.9 described, or for a particle selection method, as in DE 100 31 028.1 described, are suitable.

Die optische Anregungs- und Fokussiereinrichtung umfasst mehrere stark fokussierte Lichtquellen, vorzugsweise Laserstrahlen, die mittels entsprechender optischer Einrichtungen auf das Messvolumen in der Probenflüssigkeit fokussiert werden. Die einzelnen Laserstrahlen werden mit stellbaren optischen Schaltelementen zu jeweils verschiedenen Zeiten in einem vorgegebenen Zeittakt auf das Messvolumen fokussiert. The optical excitation and focusing device comprises several strong focused light sources, preferably laser beams, by means of appropriate optical devices on the measurement volume in the Sample liquid to be focused. The individual laser beams are with adjustable optical switching elements at different times focused on the measurement volume in a predetermined time cycle.

Weiterhin enthält die optische Einrichtung vorzugsweise dichroitische Filter oder/und Blockierungsfilter sowie - zur Aufspaltung der Laserstrahlen in multiple Foci - ein oder mehrere diffraktive optische Elemente. Die diffraktiven optischen Elemente können vor oder/und nach der Vereinigung der unterschiedlichen Laserstrahlen angeordnet werden. Vorzugsweise wird je ein diffraktives optisches Element für jeden Laser vor der Strahlenvereinigung verwendet. Furthermore, the optical device preferably contains dichroic filters or / and blocking filters and - for splitting the laser beams in multiple foci - one or more diffractive optical elements. The diffractive optical elements can be before or / and after union of different laser beams are arranged. Preferably one diffractive optical element for each laser in front of the Radiation union used.

Die Detektionseinrichtung kann beispielsweise einen fasergekoppelten Avalanche-Fotodiodendetektor oder einen elektronischen Detektor enthalten. Es können jedoch auch Anregungs- oder/und Detektions- Matrices, bestehend aus einer Punktmatrix von Laserpunkten, erzeugt durch eine Diffraktionsoptik oder einen Quanten-Well-Laser sowie einer Detektormatrix, erzeugt durch eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder eine elektronische Detektormatrix, z. B. eine CCD-Kamera, verwendet werden. The detection device can, for example, be a fiber-coupled device Avalanche photodiode detector or an electronic detector contain. However, excitation and / or detection Matrices consisting of a dot matrix of laser dots by diffraction optics or a quantum well laser and one Detector matrix, generated by an avalanche photodiode matrix or electronic detector matrix, e.g. B. a CCD camera can be used.

Der Träger kann in vorgefertigter Form bereit gestellt werden, wobei in mehrere separate Behältnisse des Trägers lumineszenzmarkierte Nachweisreagenzien, vorzugsweise lumineszenzmarkierte Hybridisierungssonden bzw. -primer eingefüllt werden. Anschließend wird der die Nachweisreagenzien enthaltende Träger günstigerweise getrocknet. The carrier can be provided in a prefabricated form, wherein in several separate containers of the carrier luminescence-labeled Detection reagents, preferably luminescence-labeled Hybridization probes or primers are filled. Then will the carrier containing the detection reagents is advantageously dried.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein vorgefertigter Träger bereitgestellt, der eine Vielzahl von separaten, z. B. 100 Behältnissen enthält, in die jeweils unterschiedliche Nachweisreagenzien, z. B. Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäurehybridisierung wie Primer oder/und Sonden eingefüllt vorliegen. Dieser Träger kann dann mit einer aus einem zu untersuchenden Organismus, z. B. einem menschlichen Patienten, stammenden Probe gefüllt werden, so dass in den jeweiligen Behältnissen unterschiedliche Analyten aus einer einzigen Probe bestimmt werden. Derartige Träger können beispielsweise zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, z. B. für die Diagnostik von Krankheiten, oder zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen, z. B. zum Nachweis einer bestimmten genetischen Prädisposition, verwendet werden. In a preferred embodiment of the invention, a prefabricated Carrier provided that a variety of separate, e.g. B. 100 containers contains, in each of which different detection reagents, for. B. Reagents for the detection of nucleic acid hybridization such as primers or / and probes are present. This carrier can then with a from an organism to be examined, e.g. B. a human Patients, originating sample are filled, so that in the respective Containers different analytes determined from a single sample become. Such carriers can be used, for example, to create a Gene expression profile, e.g. B. for the diagnosis of diseases, or Determination of nucleic acid polymorphisms, e.g. B. to prove a certain genetic predisposition.

Weiterhin soll die Erfindung durch die beiliegenden Figuren erläutert werden. The invention is further illustrated by the attached figures become.

Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Drei Lichtquellen, z. B. Laser (1, 2, 3) mit Wellenlängen λ1, λ2 und λ3, werden mittels geeigneter optischer Schaltelemente, z. B. akustooptischen Modulatoren, verbunden, um ein Einkoppeln der einzelnen Laserstrahlen über einen vorgegebenen Zeittakt in den Strahlengang zu ermöglichen. Der Laserstrahl, der - im vorgegebenen Zeittakt - zwischen den Wellenlängen, λ1, λ2 und λ3 alterniert, trifft auf einen dichroitischen Filter (6), der ihn über ein Fokussierobjektiv (8) auf ein konfokales Messvolumen in der Probe (10) lenkt. Von lumineszierenden Molekülen in der Probe (10) ausgehende Emissionsstrahlung wird durch den dichroitischen Filter (6) und einen Blockierungsfilter (12) und anschließend über eine Lochblende (14) in einen Detektor (16) mit Signalprozessor, Datenspeicherung und Korrelator geleitet. Fig. 1 shows the schematic representation of an embodiment of the method according to the invention. Three light sources, e.g. B. lasers ( 1 , 2 , 3 ) with wavelengths λ1, λ2 and λ3, are by means of suitable optical switching elements, for. B. acousto-optic modulators connected to enable coupling of the individual laser beams over a predetermined timing in the beam path. The laser beam, which - alternates between the wavelengths, λ1, λ2 and λ3 - at the specified time, strikes a dichroic filter ( 6 ), which directs it via a focusing lens ( 8 ) to a confocal measurement volume in the sample ( 10 ). Emission radiation emanating from luminescent molecules in the sample ( 10 ) is passed through the dichroic filter ( 6 ) and a blocking filter ( 12 ) and then via a pinhole ( 14 ) into a detector ( 16 ) with a signal processor, data storage and correlator.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des zeitabhängigen Signalflusses I(t) am Detektor. Das aus der Emissionsstrahlung µ1, µ2, µ3 von in der Probe befindlichen lumineszierenden Molekülen stammende Signal wird vom Detektor aufgezeichnet und mit einem Kodierungssignal für den jeweiligen Zeittakt der Wellenlängen λ1, λ2 und λ3 versehen. Aus den Zeitverläufen von µ1, µ2 und µ3 können die entsprechenden Auto- und Kreuzkorrelationsfunktionen berechnet werden. Fig. 2 is a schematic representation showing the time-dependent signal flow I (t) at the detector. The signal originating from the emission radiation µ1, µ2, µ3 from luminescent molecules in the sample is recorded by the detector and provided with a coding signal for the respective time pulse of the wavelengths λ1, λ2 and λ3. The corresponding auto and cross correlation functions can be calculated from the time profiles of µ1, µ2 and µ3.

Fig. 3A zeigt die von der Wellenlänge λ abhängige Reflexion (R) bzw. Transmission (T) des dichroitischen Filters (6) gemäß Fig. 1. Die Transmission ist bei den Anregungswellenlängen λ1, λ2 und λ3 minimal. FIG. 3A shows the reflection (R) or transmission (T) of the dichroic filter ( 6 ) according to FIG. 1, which is dependent on the wavelength λ . The transmission is minimal at the excitation wavelengths λ1, λ2 and λ3.

Fig. 3B zeigt die wellenlängenabhängige Transmission (T) eines Blockierungsfilters (12) gemäß Fig. 1. Die Transmission ist im Bereich der Anregungswellenlängen λ1, λ2 und λ3 minimal, im Bereich der Emissionswellenlängen µ1, µ2 und µ3 (nicht gezeigt) jedoch maximal. Fig. 3B shows the wavelength-dependent transmission (T) of a blocking filter (12) according to Fig. 1. The transmission is in the range of the excitation wavelengths λ1, λ2 and λ3 minimal, however, (not shown) in the region of the emission wavelengths μ1 μ2 and μ3 maximum.

Fig. 4 zeigt die schematische Darstellung einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. 3 Laser (21, 22, 23) werden mittels optischer Schaltelemente (24a, 24b) in einem vorgegebenen Zeittakt in den Strahlengang eingekoppelt. Der Laserstrahl tritt durch ein diffraktives optisches Element (26) hindurch und wird dort in eine Vielzahl, z. B. 9 optischer Foci (im Querschnitt gezeigt), mit einer im Zeittakt wechselnden Wellenlänge λ1, λ2 und λ3 aufgespalten. Der aufgespaltene Lichtstrahl wird über einen dichroitischen Spiegel (28) und ein, gegebenenfalls aus mehreren Subelementen, bestehendes Fokussierobjektiv (10) auf eine Probenmatrix (12) geleitet. Diese Probenmatrix besteht z. B. entsprechend der Matrix der multiplen optischen Foci aus mehreren separaten Proben, die jeweils ein Messvolumen enthalten. Von den Messvolumina der Probenmatrix (32) stammende Emissionsstrahlung wird durch den dichroitischen Filter (28) und einen Blockierungsfilter (34) auf eine Detektormatrix (36) gelenkt. Die Matrix von Emissionsstrahlen mit einer Wellenlänge µ1, µ2, µ3 - abhängig vom Zeittakt und den in der Probe angeregten Molekülen - ist im Querschnitt gezeigt. In der Detektormatrix (36) werden die aus den einzelnen Messvolumina stammenden Signale in separaten Detektoren aufgefangen und ausgewertet. Fig. 4 is a schematic representation showing a particularly preferred embodiment of the inventive method. 3 lasers ( 21 , 22 , 23 ) are coupled into the beam path in a predetermined time cycle by means of optical switching elements ( 24 a, 24 b). The laser beam passes through a diffractive optical element ( 26 ) and is there in a variety, z. B. 9 optical foci (shown in cross section), with a changing wavelength λ1, λ2 and λ3. The split light beam is directed onto a sample matrix ( 12 ) via a dichroic mirror ( 28 ) and a focusing lens ( 10 ), which may consist of several sub-elements. This sample matrix consists e.g. B. corresponding to the matrix of multiple optical foci from several separate samples, each containing a measurement volume. Emission radiation originating from the measurement volumes of the sample matrix ( 32 ) is directed through a dichroic filter ( 28 ) and a blocking filter ( 34 ) onto a detector matrix ( 36 ). The matrix of emission beams with a wavelength of µ1, µ2, µ3 - depending on the timing and the molecules excited in the sample - is shown in cross section. In the detector matrix ( 36 ), the signals originating from the individual measurement volumes are collected and evaluated in separate detectors.

Fig. 5 zeigt eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform. Dabei ist in Abweichung zu der in Fig. 4 gezeigten Anordnung direkt nach jedem Laser (31, 32, 33) jeweils ein diffraktives optisches Element (34, 35, 36) angeordnet. Somit kann jeder Laserstrahl in multiple optische Foci aufgespalten werden, bevor die Strahlenvereinigung mittels optischer Schaltelemente (37a, 37b) erfolgt. Ansonsten wird die Bestimmung gemäß Fig. 4 durchgeführt. Fig. 5 shows a further particularly preferred embodiment. In deviation from the arrangement shown in FIG. 4, a diffractive optical element ( 34 , 35 , 36 ) is arranged directly after each laser ( 31 , 32 , 33 ). Each laser beam can thus be split into multiple optical foci before the beams are combined using optical switching elements ( 37 a, 37 b). Otherwise, the determination according to FIG. 4 is carried out.

Die Ausführungsformen gemäß den Fig. 4 und 5 eignen sich für eine Einkanal-Multiplex-Mehrfarbenkorrelationsbestimmung. The embodiments according to FIGS. 4 and 5 are suitable for a single-channel multiplex multicolor correlation determination.

Beispielexample

Es wurde eine Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsbestimmung von 2 Markierungsgruppen in einer Probe mit 2 Laserstrahlen an dem Gerät Confocor 2 (Zeiß) durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte derart, dass eine zeitlich alternierende Änderung der Wellenlänge des Anregungslichts simuliert wurde. Die Wechselfrequenz war 1 MHz, d. h. die von einer ersten Markierungsgruppe stammende Fluoreszenz wurde auf 0 für ein Zeitsegment von 1 µs gesetzt und die von der zweiten Markierungsgruppe stammende Fluoreszenz wurde auf 0 für das nächste Zeitsegment von 1 µs gesetzt. Folglich war die Frequenz für einen kompletten Zyklus 0,5 MHz (entsprechend einer Zeitdauer von 2 µs). A fluorescence cross-correlation determination of 2 marker groups in a sample with 2 laser beams was carried out on the Confocor 2 (Zeiss) instrument. The data were evaluated in such a way that a temporally alternating change in the wavelength of the excitation light was simulated. The alternating frequency was 1 MHz, ie the fluorescence from a first marker group was set to 0 for a time segment of 1 μs and the fluorescence from the second marker group was set to 0 for the next time segment of 1 μs. Consequently, the frequency for a complete cycle was 0.5 MHz (corresponding to a period of 2 µs).

Für eine Zeitdauer von 1 s wurden 200 Mio. Datenpunkte aufgezeichnet. Pro Zeitsegment von 1 µs wurden daher 20 Datenpunkte aufgezeichnet. Um eine Verzögerung zu simulieren, die durch einen Wellenlängenwechsel entstehen könnte, wurden zusätzlich 2 bzw. 10 Datenpunkte pro Zeitsegment auf 0 gesetzt (entsprechend einer Verzögerung von 100 ns bzw. 500 ns). Die Berechnung der Kreuzkorrelation erfolgte auf Basis der Rohdaten des Geräts. 200 million data points were recorded for a period of 1 s. Therefore 20 data points were recorded per time segment of 1 µs. To simulate a delay caused by a wavelength change 2 or 10 data points per Time segment set to 0 (corresponding to a delay of 100 ns or 500 ns). The cross-correlation was calculated on the basis of the Raw data of the device.

Es wurde gefunden, dass trotz schneller wiederholter Änderung der Wellenlänge des Anregungslichts eine Auswertung der Kreuzkorrelationsfunktion möglich ist. Insbesondere bei einer Verzögerungsdauer von 200 ≥ µs (entsprechend Kreuzkorrelationskanälen von 76 und höher) waren keine signifikanten Unterschiede zu einer Standardauswertung zu erkennen. It has been found that despite repeated repeated changes in the An evaluation of the wavelength of the excitation light Cross correlation function is possible. Especially in a Delay time of 200 ≥ µs (corresponding to cross correlation channels of 76 and higher) were no significant differences to one Recognize standard evaluation.

Claims (32)

1. Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe, umfassend lumineszierende Moleküle, b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungs- und Fokussiereinrichtung zur optischen Anregung von lumineszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen Messvolumen, das Teil der Probe ist, und c) Auffangen und Auswerten von Emissionsstrahlung aus dem mindestens einem Messvolumen, dadurch gekennzeichnet,
dass in einem Messvolumen mehrere hinsichtlich mindestens einer optischen Eigenschaft verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen zu jeweils verschiedenen Zeiten angeregt werden und die von den verschiedenen Spezies stammende Emissionsstrahlung durch einen einzigen Detektor aufgefangen und ausgewertet wird. 1. A method for determining luminescent molecules by optical excitation in confocal measurement volumes, comprising the steps: a) providing a sample comprising luminescent molecules, b) irradiating the sample with an optical excitation and focusing device for the optical excitation of luminescent molecules in at least one confocal measurement volume, which is part of the sample, and c) collecting and evaluating emission radiation from the at least one measurement volume, characterized by
that several species of luminescent molecules that are different with respect to at least one optical property are excited at different times in a measurement volume, and the emission radiation originating from the different species is collected and evaluated by a single detector. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 2, 3 oder 4 hinsichtlich der optischen Eigenschaften verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen angeregt werden. 2. The method according to claim 1, characterized, that 2, 3 or 4 in terms of optical properties stimulated different species of luminescent molecules become. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Anregungseinrichtung mehrere separate Lichtquellen, insbesondere Laser, zur jeweiligen Anregung verschiedener Spezies in einem Messvolumen umfasst. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that the optical excitation device several separate Light sources, in particular lasers, for the respective excitation of different species in one measurement volume. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die separaten Lichtquellen durch ein stellbares optisches Schaltelement zu jeweils verschiedenen Zeiten in den Strahlengang eingekoppelt werden. 4. The method according to claim 3, characterized, that the separate light sources through an adjustable optical Switching element in the beam path at different times be coupled. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das stellbare optische Schaltelement aus akustooptischen Modulatoren, Reflexionselementen, Beugungselementen, diffraktiven optischen Elementen und Kerrzellen ausgewählt wird. 5. The method according to claim 4, characterized, that the adjustable optical switching element made of acousto-optical Modulators, reflection elements, diffraction elements, diffractive optical elements and Kerr cells is selected. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kreuzkorrelation von mindestens 2 der angeregten lumineszierenden Spezies bestimmt wird. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that a cross correlation of at least 2 of the excited luminescent species is determined. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die angeregten lumineszierenden Spezies sich in mindestens einer optischen Eigenschaft, ausgewählt aus Emissionswellenlänge und Lumineszenz-Abklingzeit, unterscheiden. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized, that the excited luminescent species are at least in an optical property selected from emission wavelength and luminescence decay time. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die separate Auswertung der von verschiedenen Spezies stammenden Emissionsstrahlungen die Einstellung eines Taktsignals auf dem Detektor umfasst. 8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized, that separate evaluation of that of different species originating emission radiation the setting of a clock signal on the detector. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Frequenz des Taktsignals im Bereich von 10-0,1 MHz einstellt. 9. The method according to claim 8, characterized, that the frequency of the clock signal is in the range of 10-0.1 MHz established. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die separate Auswertung der von verschiedenen Spezies stammenden Emissionsstrahlungen die Verwendung eines energiedispersiven Detektors umfasst. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized, that separate evaluation of that of different species emission radiation using a includes energy dispersive detector. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das auf das Messvolumen eingestrahlte Anregungslicht oder/und das vom Messvolumen abgestrahlte Emissionslicht optisch gefiltert wird. 11. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the excitation light radiated onto the measurement volume or / and the emission light emitted by the measurement volume optically is filtered. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man dichroitische Filter oder/und Blockierungsfilter zur optischen Filterung verwendet. 12. The method according to claim 11, characterized, that you can use dichroic filters and / or blocking filters optical filtering used. 13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine elektronische Hintergrundanalyse durchführt, um Signale herauszufiltern, die durch unerwünschte Interferenz mehrerer Spezies von lumineszierenden Molekülen entstehen. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that you do an electronic background analysis to Filter out signals caused by unwanted interference by several Species of luminescent molecules arise. 14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mehrere separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthält. 14. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the carrier holds several separate containers Contains samples. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen umfasst, die vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1000 µm aufweisen. 15. The method according to claim 14, characterized, that the carrier has a multi-well microwave structure which preferably has a diameter between 10 and Have 1000 µm. 16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine parallele Bestimmung von lumineszierenden Molekülen in mehreren Messvolumina, insbesondere aus mehreren Proben durchführt. 16. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that one has a parallel determination of luminescent Molecules in several measurement volumes, especially from several Performs rehearsals. 17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das von der optischen Anregungseinrichtung ausgestrahlte Licht in multiple Foci aufgespalten wird, die auf jeweils verschiedene Messvolumina fokussiert werden. 17. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that that emitted by the optical excitation device Light is split into multiple foci, each on different ones Measuring volumes are focused. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufspaltung des ausgestrahlten Lichts durch Verwendung eines oder mehrerer diffraktiver optischer Elemente erfolgt. 18. The method according to claim 17, characterized, that by using the splitting of the emitted light one or more diffractive optical elements. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass für jede Lichtquelle ein separates diffraktives optisches Element verwendet wird. 19. The method according to claim 18, characterized, that a separate diffractive optical element for each light source is used. 20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass man als diffraktives optisches Element ein dreidimensionales, gegebenenfalls auf einen optisch transparenten Träger aufgebrachte optische Gitter verwendet, das hindurchtretendes Licht beugt und ein vorbestimmtes Beugungsmuster, umfassend multiple optische Foci, erzeugt. 20. The method according to claim 18 or 19, characterized, that as a diffractive optical element, a three-dimensional, optionally applied to an optically transparent carrier uses optical gratings that diffract and diffuse light a predetermined diffraction pattern comprising multiple optical Foci. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zum parallelen Auffangen von Emissionsstrahlung aus mehreren Messvolumina eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, verwendet wird, wobei ein Detektor jeweils für ein Messvolumen vorgesehen ist. 21. The method according to any one of claims 16 to 20, characterized, that for the parallel collection of emission radiation from several Measurement volumes a detection matrix, comprising several Detectors, is used, one detector for each Measuring volume is provided. 22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen und der Fokussieroptik ≥ 1 mm beträgt. 22. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the distance between the measurement volume and the Focusing optics is ≥ 1 mm. 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen der Fokussieroptik 1,5-10 mm und besonders bevorzugt 2-5 mm beträgt. 23. The method according to claim 22, characterized, that the distance between the focusing optics is 1.5-10 mm and is particularly preferably 2-5 mm. 24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe von der Lichtquelle und insbesondere von der Fokussieroptik thermisch isoliert ist. 24. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the sample from the light source and especially from the Focusing optics is thermally insulated. 25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung eines in der Probe vorhandenen Analyten. 25. The method according to any one of the preceding claims Determination of an analyte present in the sample. 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Nukleinsäure-Analyten bestimmt. 26. The method according to claim 25, characterized, that you determine a nucleic acid analyte. 27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung umfasst: a) eine Mutationsanalyse bei Nukleinsäuren, b) eine Genexpressionsanalyse, c) eine Nukleinsäure-Sequenzierung oder d) eine Partikel-Selektion. 27. The method according to claim 25 or 26, characterized in that the determination comprises: a) a mutation analysis for nucleic acids, b) a gene expression analysis, c) nucleic acid sequencing or d) a particle selection. 28. Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27, umfassend a) einen Träger zur Aufnahme einer Probe, die mehrere verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen enthält, b) eine optische Anregungs- und Fokussiereinrichtung, umfassend mehrere separate Lichtquellen, ein stellbares optisches Schaltelement zur Einkopplung der separaten Lichtquellen zu verschiedenen Zeiten auf ein konfokales Messvolumen, das Teil der Probe ist, und c) eine optische Detektionseinrichtung, umfassend jeweils einen einzigen Detektor pro Messvolumen zum Nachweis von Lumineszenz. 28. Device for determining luminescent molecules, in particular for carrying out a method according to one of claims 1 to 27, comprising a) a carrier for receiving a sample which contains several different species of luminescent molecules, b) an optical excitation and focusing device, comprising a plurality of separate light sources, an adjustable optical switching element for coupling the separate light sources at different times to a confocal measurement volume, which is part of the sample, and c) an optical detection device, each comprising a single detector per measurement volume for the detection of luminescence. 29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin ein oder mehrere diffraktionsoptische Elemente zur Aufspaltung des Anregungslichts in multiple Foci enthält. 29. The device according to claim 28, characterized, that they continue to have one or more diffractive optical elements for splitting the excitation light into multiple foci. 30. Vorrichtung nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass für jede Lichtquelle ein separates diffraktives optisches Element vorgesehen ist. 30. The device according to claim 28 or 29, characterized, that a separate diffractive optical element for each light source is provided. 31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin eine Detektormatrix, umfassend mehrere Detektoren, zum parallelen Auffangen von Emissionsstrahlung aus mehreren Messvolumina enthält, wobei ein Detektor für jeweils ein Messvolumen vorgesehen ist. 31. Device according to one of claims 28 to 30, characterized, that they continue to have a detector matrix comprising several Detectors, for collecting emission radiation in parallel contains several measurement volumes, one detector for each Measuring volume is provided. 32. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 31 für die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. 32. Use of the device according to one of claims 28 to 31 for fluorescence correlation spectroscopy.
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