DE10208877B4 - Use of a streptavidin-binding peptide - Google Patents

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Abstract

Verwendung eines Streptavidin-Bindungspeptides enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1–6 zur Aufreinigung eines in einem Proteinbiosynthesesystem hergestellten definierten Proteins, wobei eine für das definierte Protein und, hiermit verbunden, für das Streptavidin-Bindungspeptid codierende Nukleinsäure einer Transkription und/oder Translation unterworfen wird, wobei eine Lösung enthaltend das so erhaltene Translationsprodukt mit immobilisiertem Streptavidin kontaktiert und daran gebunden wird und wobei nach Abtrennung der Lösung mit nicht an Streptavidin gebundenen Substanzen das Translationsprodukt eluiert wird.use a streptavidin-binding peptide containing an amino acid sequence according to Seq. ID 1-6 to Purification of a protein produced in a protein biosynthesis system defined protein, one for the defined protein and, associated with this, for a nucleic acid encoding the streptavidin binding peptide Transcription and / or translation is subjected, with a solution containing the resulting translation product with immobilized Streptavidin is contacted and bound to it and wherein Separation of the solution with substances not bound to streptavidin, the translation product is eluted.

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Description

Gebiet der ErfindungField of the invention

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Streptavidin-Bindungspeptides zur Aufreinigung eines in einem Proteinbiosynthesesystem hergestellten definierten Proteins, sowie die Verwendung eines Streptavidin-Bindungspeptides zur Markierung eines definierten Proteins.The The invention relates to the use of a streptavidin-binding peptide for purifying a protein produced in a protein biosynthesis system defined protein, as well as the use of a streptavidin-binding peptide for labeling a defined protein.

Stand der TechnikState of the art

Verfahren zur effizienten Expression von definierten Proteinen in verschiedensten pro- und eukaryontischen Organismen sind bekannt und bedürfen keiner weiteren Erläuterung. Unter definierten Proteinen werden in diesem Zusammenhang Peptide und/oder Proteine verstanden, die in dem zur Expression verwendeten Organismus oder zellfreien Expressionssystem natürlicherweise oder nach Transformation bzw. Einsatz definierter RNA exprimiert und in Aufreinigungsschritten angereichert werden.method for the efficient expression of defined proteins in a wide variety of Pro and eukaryotic organisms are known and require no further explanation. Under defined proteins become peptides in this context and / or proteins used in the organism used for expression or cell-free expression system naturally or after transformation or use of defined RNA expressed and in purification steps be enriched.

Verfahren zur zellfreien Expression von definierten Proteinen sind beispielsweise aus den Literaturstellen EP 0312 617 B1 , EP 0401 369 B1 und EP 0 593 757 B1 bekannt. Demgemäß werden die für eine Transkription und/oder Translation notwendigen Komponenten neben einem für ein definiertes Protein kodierenden Nukleinsäurestrang in einem Reaktionsgefäß inkubiert und nach der Expression die Polypeptide/Proteine aus der Reaktionslösung isoliert. Sowohl die für die Transkription, als auch die für die Translation notwendigen Komponenten lassen sich aus den Überstanden pro- oder eukaryontischen Zelllysaten nach einer Zentrifugation gewinnen.Methods for the cell-free expression of defined proteins are, for example, from the literature EP 0312 617 B1 . EP 0401 369 B1 and EP 0 593 757 B1 known. Accordingly, the components necessary for transcription and / or translation are incubated next to a nucleic acid strand coding for a defined protein in a reaction vessel and after expression the polypeptides / proteins are isolated from the reaction solution. Both the components required for transcription and for translation can be obtained from the supernatants of prokaryotic or eukaryotic cell lysates after centrifugation.

Ein wesentliches Problem bei der Expression von definierten Proteinen in pro- und eukaryontischen Organismen und bei der zellfreien Expression liegt in der Aufreinigung und/oder der Detektion der exprimierten definierten Proteine. Dies ist insbesondere bei definierten Proteinen problematisch, für die es keine Antiseren oder monoklonale Antikörper gibt. Zur Vereinfachung der Aufreinigung und der Detektion solcher definierten Proteine werden diese als sogenannte Fusionsproteine exprimiert. Hierbei wird dem definierten Protein N- und/oder C-terminal eine Aminosäuresequenz angefügt oder zwischen zwei Proteindomänen (intern) eingefügt, der Fusionspartner. Dies geschieht auf der Nukleinsäureebene, so daß sowohl das definierte Protein, als auch der zur Detektion und/oder Reinigung angefügte Fusionspartner während eines Transkriptions-/Translationsvorganges zusammen als ein chimäres (Fusions-)Protein exprimiert werden, bestehend aus dem definierten Protein und dem Fusionspartner. Hierbei kann es sich bei dem angefügten Fusionspartner um einzelne Aminosäuren, aber auch um Peptide oder Proteine handeln. Für diese angefügten Fusionspartner stehen zur Aufreinigung immobilisierte Bindungspartner zur Verfügung, mit denen die Fusionsproteine isoliert werden können. Neben der Möglichkeit der Reinigung der Proteine können diese auch mit für den Fusionspartner spezifischen Bindungspartner nachgewiesen werden. Diese Bindungspartner können für den Fusionspartner spezifische Antikörper oder auch andere Proteine, Peptide oder chemische Verbindungen sein, die an den Fusionspartner spezifisch binden.One significant problem in the expression of defined proteins in pro- and eukaryotic organisms and in cell-free expression lies in the purification and / or detection of the expressed defined Proteins. This is particularly problematic for defined proteins, for the there are no antisera or monoclonal antibodies. For simplification the purification and detection of such defined proteins these are expressed as so-called fusion proteins. in this connection the defined protein is N- and / or C-terminal an amino acid sequence added or between two protein domains inserted (internally), the fusion partner. This happens at the nucleic acid level, so that both the defined protein as well as the one for detection and / or purification attached During the merger a transcription / translation process together as a chimeric (fusion) protein consisting of the defined protein and the Fusion partner. This may be the attached fusion partner around individual amino acids, but also to act on peptides or proteins. For these attached fusion partners are available for purification immobilized binding partner, with where the fusion proteins can be isolated. Besides the possibility the purification of proteins can this also with for the fusion partner specific binding partner can be detected. These binding partners can for the Fusion partner specific antibodies or other proteins, peptides or chemical compounds, which specifically bind to the fusion partner.

Beispiele für solche Fusionspartner sind der Myc-tag (Munro & Pelham (1986) Cell 46, 291–300; Ward et al. (1998) Nature 341, 544–546), das Flag Peptid (Hopp et al. (1988) Bio/Technology 6 1204–1210), das KT3 Epitop Peptid (Martinet et al. (1990) Cell 63, 843–849; Martin et al. (1992) Science 255, 192–194) und das alpha-tubulin Epitop Peptid (Skinner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 14163–14166), die alle erfolgreich für die Detektion und teilweise auch für die Reinigung von Proteinen genutzt wurden. Es konnte für einen Teil der Fusionspartner, die normalerweise 3 bis 12 Aminosäuren lang sind, gezeigt werden, daß sie nicht die biologische Funktion der definierten Proteine beeinflussen. Die biologische Funktion des definierten Proteins wird dagegen mit zunehmender Länge des Fusionspartners beeinflußt, da die zusätzlich exprimierten Aminosäuren z. B. die Ausbildung der Sekunder-, Tertiär und/oder Quartärstruktur beeinflussen können. Längere Fusionspartner sind daher zur Detektion der Proteine, aber weniger zur Reinigung der Proteine geeignet. Auf der anderen Seite weisen längere Fusionspartner oft eine höhere Affinität mit ihren spezifischen Bindungspartnern auf.Examples for such Fusion partners are the Myc-tag (Munro & Pelham (1986) Cell 46, 291-300; Ward et al. (1998) Nature 341, 544-546), the flag peptide (Hopp et al. (1988) Bio / Technology 6 1204-1210), the KT3 epitope peptide (Martinet et al. (1990) Cell 63, 843-849; Martin et al. (1992) Science 255, 192-194) and the alpha-tubulin epitope peptide (Skinner et al., (1991) J. Biol. Chem. 266, 14163-14166), all successful for the detection and partly also for the purification of proteins were used. It could for some of the fusion partners, which are usually 3 to 12 amino acids long are shown do not affect the biological function of the defined proteins. The biological function of the defined protein is, however, with increasing length of the merger partner, since the addition expressed amino acids z. B. the formation of the secondary, tertiary and / or quaternary structure can influence. longer Fusion partners are therefore used to detect the proteins but less so suitable for the purification of proteins. On the other side longer Merger partners often higher affinity with their specific binding partners.

Ein wesentlicher Nachteil der oben genannten Fusionspartner bei der Aufreinigung ist darin begründet, daß die Bindung an den Bindungspartner auf einer Antigen/Antikörperbindung beruht und die Herstellung und Reinigung der als Bindungspartner genutzten Antikörper aufwendig und teuer ist. Ein weitere Nachteil liegt darin begründet, daß die Antigen/Antikörperbindung eine sehr starke Bindung zwischen dem Bindungspartner, z. B. an eine Matrix immobilisierten Antikörper, und dem Fusionspartner bedingt. Diese hat zur Folge, daß bei der Elution der über den Fusionspartner gebundenen Fusionsproteine, teilweise extrem unphysiologische Bedingungen bezogen auf das definierte Protein geschaffen werden müssen. Unter unphysiologischen Bedingungen sind in diesem Zusammenhang Bedingungen zu verstehen mit z. B. sehr hohe oder äußerst geringe Salzkonzentrationen, Einsatz von chaotrophen Salzen und pH-Werte, die weit von dem natürlichen pH-Wert des definierten Proteins abweichen. Diese kann u. U. die Struktur und/oder Funktionalität des definierten Proteins beeinflussen oder irreversibel zerstören. Dementsprechend sollte die Reinigung der definierten Proteine unter möglichst schonenden, physiologischen Bedingungen geschehen, um die Funktionalität der Proteine zu erhalten. Zwar konnte bei drei der oben genannten Fusionspartnern (Hopp et al. (1988) (Martin et et al. (1990) (Skinner et al. (1991)) eine Elution auch unter schonenden Bedingungen mittels kompetetiver Peptide erzielt werden, doch bleibt das Problem der aufwendig und teuer herzustellenden und zu reinigenden (als Bindungspartner dienenden) Antikörper und deren Bindung an die Matrix.A significant disadvantage of the abovementioned fusion partners in the purification is that the binding to the binding partner is based on an antigen / antibody binding and the preparation and purification of the antibodies used as binding partners is complicated and expensive. Another disadvantage lies in the fact that the antigen / antibody binding a very strong bond between the binding partner, z. As immobilized to a matrix antibody, and the fusion partner. This has the consequence that in the elution of the bound via the fusion partner fusion proteins, sometimes extremely unphysiological conditions have to be created based on the defined protein. Under unphysiological conditions conditions are to be understood in this context conditions with z. As very high or extremely low salt concentrations, use of chaotropic salts and pH values that differ widely from the natural pH of the defined protein. This can u. U. influence the structure and / or functionality of the defined protein or irreversibly destroy. Accordingly, the purification of the defined proteins should be carried out under as mild, physiological conditions as possible in order to preserve the functionality of the proteins. Although three of the abovementioned fusion partners (Hopp et al., 1988) (Martin et al., 1990 (Skinner et al., 1991)) eluted under competitive conditions using competitive peptides, the problem remains the complex and expensive to produce and clean (serving as binding partner) antibodies and their binding to the matrix.

Weitere Fusionspartner, bestehend aus 8 bis 9 Aminosäuren, sind aus den Literaturstellen US 5,506,121 und Schmidt & Skerra (Protein Engineering, vol. 6, no. 1, 109–122, 1993) bekannt. Die dort offenbarten Fusionspartner sind in der Lage an das Streptavidin oder an das "core" Streptavidin, ein proteolytisch gespaltenes Produkt des Streptavidin, zu binden (Bayer et al. (1989) Biochem. J. 259, 369–376).Further fusion partners, consisting of 8 to 9 amino acids, are from the literature US 5,506,121 and Schmidt & Skerra (Protein Engineering, vol. 6, no. 1, 109-122, 1993). The fusion partners disclosed therein are capable of binding to streptavidin or to the "core" streptavidin, a proteolytically cleaved product of streptavidin (Bayer et al (1989) Biochem J. 259, 369-376).

Alle bekannten Fusionspartner, die an das Streptavidin binden enthalten die Aminosäureabfolge HPQ, das sog. HPQ-Bindungsmotiv, welches mit der Biotin-Bindungstasche des Streptavidin in Wechselwirkung tritt. Zu den Bereits bekannten Peptiden gehören dem sog. Strep-tag I: AWRHPQFGG mit einer Dissoziationskonstanten Kd von 10–37 μM, der sog. Strep-tag II: WSHPQFEK mit einer Dissoziationskonstanten Kd von 18–72 μM und der sog. SBP-tag: MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP mit einer Dissoziationskonstanten Kd von 2,5 nM. Im Gegensatz zu den beiden kurzen Strep-tags I und II besitzt der längere SBP-tag eine wesentlich stärkere Bindung zum Streptavidin. Allerdings wird, wie oben ausgeführt, die Funktion des definierten Proteins insbesondere mit zunehmender Länge des Fusionspartners beeinflußt. Auch stören besonders lange Fusionspartner bei der Kristallisation der definierten Proteine.All known fusion partners that bind to the streptavidin the amino acid sequence HPQ, the so-called HPQ binding motif, which interacts with the biotin binding pocket of streptavidin occurs. Known peptides include the so-called Strep-tag I: AWRHPQFGG with a dissociation constant Kd of 10-37 μM, the so-called Strep-tag II: WSHPQFEK with a dissociation constant Kd of 18-72 μM and the so-called SBP-tag: MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP with a dissociation constant Kd of 2.5 nM. In contrast to the two short Strep-tags I and II have the longer SBP-tag a much stronger one Binding to streptavidin. However, as stated above, the Function of the defined protein, in particular with increasing length of the Affiliated with the merger partner. Also disturb especially long fusion partners in the crystallization of the defined proteins.

Aus den Literaturstellen US 5021347 , WO 01/90331 A2 und WO 01/01748 A2 sind Peptide mit Teilsequenzen DVEAW, DVEA oder VEAW bekannt.From the literature US 5021347 . WO 01/90331 A2 and WO 01/01748 A2 peptides with partial sequences DVEAW, DVEA or VEAW are known.

Technisches Problem der ErfindungTechnical problem of the invention

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein möglichst kurzes Streptavidin-Bindungspeptid mit einer starken Bindung zum Streptavidin zur Verfügung zu stellen.Of the Invention is based on the technical problem, a possible short streptavidin-binding peptide with a strong binding to the Streptavidin available to deliver.

Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.Broad features of the invention and preferred embodiments.

Zur Lösung des technischen Problems lehrt die Erfindung die Gegenstände der Ansprüche 1 und 2.to solution of the technical problem, the invention teaches the objects of claims 1 and 2.

Mit dem Streptavidin-Bindungspeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1–6 wird, verglichen mit dem Stand der Technik, eine wesentlich stärkere Bindung zwischen dem Streptavidin-Bindungspeptid und dem Streptavidin erreicht, bzw. kann bei gleicher Bindungsstärke das Streptavidin-Bindungspeptid wesentlich verkürzt werden.With the streptavidin-binding peptide containing an amino acid sequence according to Seq. ID 1-6 is compared With the prior art, a much stronger bond between the Reached streptavidin-binding peptide and streptavidin, respectively can at the same bond strength the streptavidin-binding peptide is significantly shortened.

Zur Herstellung brauchbar ist eine Nukleinsäure codierend für ein Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6, sowie ein Plasmid enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure. Es versteht sich, daß die Nukleinsäure codierend für ein Streptavidin-Bindungspeptid und/oder das Plasmid dem jeweiligen Expressionssystem/Proteinbiosynthesesystem angepaßt werden kann. Das Plasmid kann als ein Expressionsvektor, insbesondere für Bakterien, ausgelegt sein enthaltend einen Bereich mit mindestens einer Schnittstelle für ein Restriktionsenzym, in dem die Nukleinsäuresequenz codierend für ein definiertes Protein inseriert werden kann und somit das definierte Protein zusammen mit dem Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 exprimiert wird. Es versteht sich, daß der für das definierte Protein und für das Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 codierende Bereich sich unter der Kontrolle eines geeigneten Promoters und/oder Operators und Terminators befinden. Der Bereich mit mindestens einer Schnittstelle für mindestens ein Restriktionsenzym kann sowohl in 5', als auch in 3' Richtung vom Nukleinsäurebereich codierend für das Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 liegen. Der Nukleinsäurebereich codierend für das Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 muß nicht unmittelbar an den Nukleinsäurebereich codierend für das definierte Protein anschließen, vielmehr können zwischen den beiden Bereichen noch Nukleinsäuren liegen, die für 1 bis 20 Aminosäuren, insbesondere für 5 bis 10 Aminosäuren, codieren.to Useful is a nucleic acid encoding a streptavidin-binding peptide according to Seq. ID 1-6, as well a plasmid containing a nucleic acid according to the invention. It is understood that the nucleic acid encoding for a Streptavidin-binding peptide and / or the plasmid to the respective Expression system / protein biosynthesis system are adapted can. The plasmid can be used as an expression vector, especially for bacteria, be designed containing an area with at least one interface for a Restriction enzyme in which the nucleic acid sequence coding for a defined Protein can be inserted and thus the defined protein together with the streptavidin-binding peptide according to SEQ ID NOS 1-6. It understands that the for the defined protein and for the streptavidin-binding peptide according to SEQ ID 1-6 coding area itself under the control of a suitable promoter and / or operator and Terminators are located. The area with at least one interface for at least a restriction enzyme may be in both the 5 ', and 3' direction of the nucleic acid region coding for the streptavidin-binding peptide according to Seq. ID 1-6. The nucleic acid region coding for The streptavidin-binding peptide according to SEQ ID Nos. 1-6 need not be directly attached to the nucleic acid region coding for connect the defined protein, rather, you can between the two areas are still nucleic acids, which for 1 to 20 amino acids, especially for 5 to 10 amino acids, encode.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Seq.-ID 1–6 umfasst z. B., dass eine Nukleinsäure in einem zellbasierten oder zellfreien Proteinbiosynthesesystem exprimiert oder überexprimiert wird. Dieses so hergestellte Peptid läßt sich leicht über die Bindung an Streptavidin isolieren. Das erhaltene Translationsprodukt, i. e. ein Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6, wird mit immobilisiertem Streptavidin kontaktiert und daran gebunden. Nach Abtrennung der Lösung mit nicht an Streptavidin gebundenen Substanzen wird das Translationsprodukt eluiert. Als Elutionsmittel können Puffer verwendet werden, die Biotin oder verwandte Substanzen und/oder Derivate, wie Iminobiotin, Desthiobiotin und/oder Diaminobiotin, enthalten. Das erhaltene Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 trägt im Falle der Fusion mit dem definierten Protein dieses Protein. Es kann der auch unabhängig von einem definierten Protein zur Antikörperherstellung genutzt werden. Die erhaltenen Antikörper können z. B. zur Detektion oder zur Aufreinigung der Streptavidin-Bindungspeptide gemäß Seq.-ID 1–6, bzw. im Fall, daß das Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 als Fusionspartner eingesetzt wird, des an diesen Fusionspartner gebundenen definierten Proteins genutzt werden.A method for producing a streptavidin-binding peptide according to SEQ ID NOS 1-6 comprises, for example, B. that a nucleic acid in a cell-based or cell-free protein biosynthesis system expressed or over is expressed. This peptide thus prepared can be easily isolated via the binding to streptavidin. The resulting translation product, ie a streptavidin-binding peptide according to SEQ ID NOS 1-6, is contacted with immobilized streptavidin and bound thereto. After separation of the solution with substances not bound to streptavidin, the translation product is eluted. As eluents, buffers may be used which contain biotin or related substances and / or derivatives such as iminobiotin, desthiobiotin and / or diaminobiotin. The resulting streptavidin-binding peptide according to SEQ ID 1-6 carries this protein in the case of fusion with the defined protein. It can also be used independently of a defined protein for antibody production. The antibodies obtained can, for. Example, for the detection or purification of the streptavidin-binding peptides according to SEQ ID 1-6, or in the case that the streptavidin-binding peptide according Seq. ID 1-6 is used as a fusion partner, the defined protein bound to this fusion partner be used.

Es versteht sich, daß die Herstellung eines solchen Streptavidin-Bindungspeptides enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1–6 z. B. auch mittels chemischer Festphasensynthese, beispielseise mit einem Syntheseautomat der Firma Abimed (Langenfeld, BRD) möglich ist. Diese Methode basiert auf den Standardprotokollen der Fmoc-Chemie (Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl).It understands that the Preparation of such a streptavidin binding peptide containing an amino acid sequence according to Seq. ID 1-6 z. B. also by means of chemical solid phase synthesis, beispielseise with a Synthesizer of the company Abimed (Langenfeld, Germany) is possible. This method is based on the standard protocols of Fmoc chemistry (Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl).

Bei der Verwendung nach Anspruch 1 kann die Elution unter schonenden Bedingungen für das definierte Protein erfolgen. Als Elutionsmittel können Puffer verwendet werden, die Biotin oder verwandte Substanzen und/oder Derivate, wie Iminobiotin, Desthiobiotin und/oder Diaminobiotin, enthalten. Das hergestellte definierte Protein kann das als Fusionspartner dienende Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 sowohl N- und/oder C-terminal enthalten.at the use according to claim 1, the elution can be gentle Conditions for the defined protein take place. The eluents may be buffers used, the biotin or related substances and / or Derivatives, such as iminobiotin, desthiobiotin and / or diaminobiotin, contain. The produced defined protein can do this as a fusion partner serving streptavidin-binding peptide according to SEQ ID NOS 1-6 both N- and / or C-terminal contain.

Bei Verwendung einer Streptavidin-Sepharose-Säule kann das zu untersuchende definierten Protein mittels des als Fusionspartner dienenden Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Seq.-ID 1–6 an der Matrix immobilisiert und aus einem Gemisch von Molekülen, z. B. einem Zelllysat, isoliert werden.at Use of a streptavidin-Sepharose column can be examined defined protein by means of serving as a fusion partner streptavidin binding peptide according to Seq. ID 1-6 the matrix immobilized and from a mixture of molecules, for. As a cell lysate isolated.

Bei der Verwendung nach Anspruch 2 kann das markierte definierte Protein das zur Markierung dienende Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 N- und/oder C-terminal enthalten. Reportermoleküle können z. B. radioaktive und/oder radioaktiv markierte Substanzen sein. Es versteht sich, daß das Streptavidin als solches auch radioaktiv markiert und/oder radioaktiv sein kann; in diesem Fall kann auf ein Reportermolekül verzichtet werden. Reportermoleküle können auch fluoreszierende Substanzen oder Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Durch solche mit einem Reportermolekül gekoppelte Streptavidinverbindungen lassen sich beispielsweise Proteine, die das Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 als Fusionspartner besitzen, auf einem Western-Blot oder im ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) nachweisen und/oder quantifizieren. Handelt es sich bei den definierten Proteinen um Bindungsproteine, können auf diese Weise auch an diese bindende andere Proteine nachgewiesen werden. Unter Bindungsproteine sind in diesem Zusammenhang Proteine zu verstehen, die selbst andere Proteine binden und/oder selber an andere Proteine binden, wie z. B. bei einer Antigen/Antikörperbindung oder bei einer Bindung eines Proteins an einen Rezeptor.at The use according to claim 2 may be the labeled defined protein the labeling streptavidin-binding peptide according to SEQ ID 1-6 N- and / or C-terminal contain. Reporter molecules may, for. B. radioactive and / or radioactively labeled substances. It understands that the Streptavidin as such also radioactively labeled and / or radioactive can be; in this case, a reporter molecule can be dispensed with become. reporter molecules can also fluorescent substances or enzymes, such as. B. alkaline Phosphatase or peroxidase. By such coupled with a reporter molecule Streptavidin compounds can be, for example, proteins, the possess the streptavidin-binding peptide according to Seq.-ID 1-6 as fusion partner, on a Western Blot or ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) and / or quantify. Is it the case of Proteins bound to binding proteins, can also in this way these binding other proteins are detected. Under binding proteins are in this context, to understand proteins that themselves others Bind proteins and / or bind to other proteins, such. In an antigen / antibody binding or upon binding of a protein to a receptor.

Bevorzugt ist es, wenn das Streptavidin-Bindungspeptid weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 20 Aminosäuren, höchstvorzugsweise weniger als 10 Aminosäuren, enthält.Prefers it is when the streptavidin-binding peptide is less than 30 amino acids, preferably less as 20 amino acids, most preferably less than 10 amino acids, contains.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen darstellenden Figuren sowie Beispielen näher erläutert.in the Below, the invention is based on merely embodiments illustrative figures and examples explained in more detail.

1: Reinigung von FABP mit Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Motiv 3 als Fusionspartner nach zellfreier Proteinbiosynthese über eine Streptavidin-Affinitätssäule. Es wurden von jeder Fraktion eine vergleichbare Menge mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. (A) Coomassie gefärbt und (B) Autoradiogramm. Die Proben in den numerierten Spuren sind (1) Molekulargewichtsmarker; (2) Reaktionsmischung; (3) Durchlauf der Probenauftragung; (4–6) Waschfraktionen; (7–9) Elutionsfraktionen; (10) radioaktiver Molekulargewichtsmarker. 1 : Purification of FABP with streptavidin-binding peptide according to motif 3 as a fusion partner after cell-free protein biosynthesis via a streptavidin affinity column. A comparable amount of each fraction was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. (A) Coomassie stained and (B) autoradiogram. The samples in the numbered lanes are (1) molecular weight markers; (2) reaction mixture; (3) pass the sample application; (4-6) washing fractions; (7-9) elution fractions; (10) radioactive molecular weight marker.

2: Reinigung von FABP mit Streptavidin-Bindungspeptides gemäß Motiv 3 als Fusionspartner nach zellfreier Proteinbiosynthese über eine StrepTactin-Affinitätssäule. Es wurden von jeder Fraktion eine vergleichbare Menge mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. (A) Coomassie gefärbt und (B) Autoradiogramm. Die Proben in den numerierten Spuren sind (1) Molekulargewichtsmarker; (2) Durchlauf der Probenauftragung; (3–5) Waschfraktionen; (6–10) Elutionsfraktionen; (11) radioaktiver Molekulargewichtsmarker. 2 : Purification of FABP with streptavidin-binding peptide according to motif 3 as a fusion partner after cell-free protein biosynthesis via a StrepTactin affinity column. A comparable amount of each fraction was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. (A) Coomassie stained and (B) autoradiogram. The samples in the numbered lanes are (1) molecular weight markers; (2) run the sample application; (3-5) washing fractions; (6-10) elution fractions; (11) radioactive molecular weight marker.

Beispiel 1: erfindungsgeeignete Bindungspeptide und Vergleichspeptide mit DissoziationskonstantenExample 1: Binding peptides suitable for the invention and comparative peptides with dissociation constants

In fachüblicher Weise wurde das FAB Protein (fatty acid binding Protein) aus Rinderherzen in vitro in einem zellfreien Proteinbiosynthese mittels eines gekoppelten Transkriptions-Translationssystemes exprimiert. Das exprimierte FAB Protein besaß am N-Terminus jeweils ein aus fünfzehn Aminosäuren bestehendes zusätzliches Streptavidin Bindungspeptid mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen als Fusionspartner.In times the usual The FAB protein (fatty acid binding protein) from bovine heart became way in vitro in a cell-free protein biosynthesis by means of a coupled Transcriptional Translation System expressed. That expressed FAB protein possessed at N-terminus one each from fifteen amino acids existing additional Streptavidin binding peptide with different amino acid sequences as a fusion partner.

Zwei Bindungspeptide enthalten in ihrer Aminosäuresequenz das im Stand der Technik beschriebene HPQ-Motiv (Motiv 1 und 2) und zwei enthalten das erfindungsgemäße Streptavidin-Bindungspeptid gemäß Seq.-ID 1–6 (Motiv 3 und 4). Die Sequenzen der Peptide sind in der Tabelle 1 dargestellt. Zusätzlich wurden die exprimierten Proteine mit einem am C-terminus befindlichen "His-tag", bestehend aus 6 Histidinen, versehen. Die Proteine wurden mittels Affinitätschromatographie über Ni2+-IDA-Agarose in fachüblicher Weise aufgereinigt. Man erkennt, dass bei gleicher Länge Bindungspeptide mit einer erfindungsgemäßen Sequenz eine wesentlich niedrigere Dissoziationskonstante als ein Bindungspeptid mit HPQ-Motiv aufweist. Der Kd-Wert eines erfindunggemäßen Bindungspeptids liegt in der Größenordnung des SBP-Tags trotz des ca. 2,5-fachen Länge des SBP-Tags. Tabelle 1 Sequenz Dissoziationskonstante [kd] Motiv 1 D L Y D I D R N W V G H P Q G 8 μM Motiv 2 D N Y D A D L A W D T H P Q D 70 μM Motiv 3 D V E A W L D E R V P L V E T 84 nM Motiv 4 D V E A W I A D P A V H F T T 200 nM Two binding peptides contain in their amino acid sequence the HPQ motif described in the prior art (motifs 1 and 2) and two contain the streptavidin binding peptide of the invention according to SEQ ID NOS 1-6 (motifs 3 and 4). The sequences of the peptides are shown in Table 1. In addition, the expressed proteins were provided with a C-terminal "His-tag" consisting of 6 histidines. The proteins were purified by affinity chromatography over Ni 2+ -IDA agarose in a standard manner. It can be seen that, for the same length, binding peptides having a sequence according to the invention have a substantially lower dissociation constant than a binding peptide with HPQ motif. The Kd value of a binding peptide according to the invention is of the order of magnitude of the SBP tag despite the approximately 2.5 times the length of the SBP tag. Table 1 sequence Dissociation constant [kd] Motif 1 D LYDIDRNWVGHPQG 8 μM Motif 2 D NYDADLAWDTHPQD 70 μM Motif 3 D VEAWLDERVPLVET 84 nM Motif 4 D VEAWIADPAVHFTT 200 nM

Beispiel 2: Messungsweise der Dissoziationskonstanten aus Tabelle 1.Example 2: Method of Measuring the Dissociation Constant from Table 1.

Die Messungen der Dissoziationskonstante wurden mit einem BiacoreX-System und dem Sensor Chip NTA der Firma Biacore durchgeführt. Vermessen wurden die aus der im Beispiel 1 beschriebenen Expression hervorgegangenen Proteine, d. h. FAB Proteine, die am N-Terminus jeweils ein aus fünfzehn Aminosäuren bestehendes Peptid als Fusionspartner und am C-Terminus 6 Histidine besaßen, die zur Immobilisierung auf dem Sensor Chip benötigt wurden. Die Bindungsaffinität der aus der im Beispiel 1 beschriebenen Expression hervorgegangenen Proteine zu Streptavidin wurde nach Herstellerangaben im Biacore-Gerät vermessen. Dabei befindet sich das zu vermessende Protein auf dem Sensor-Chip und eine Streptavidinlösung mit definierter Konzentration wird eingespritzt. Die Wechselwirkung (Bindung) zwischen den beiden Molekülen wird vom Gerät gemessen und als sog. Resonanz Units (RU) angegeben. Zur Messung wurden die vom Hersteller angegebenen Puffer verwendet.The Measurements of the dissociation constant were made with a BiacoreX system and the sensor chip NTA made by Biacore. measure were those resulting from the expression described in Example 1 Proteins, d. H. FAB proteins, each one at the N-terminus fifteen amino acids existing peptide as a fusion partner and at the C-terminus 6 histidines possessed, which were needed for immobilization on the sensor chip. The binding affinity of the the expression of the expression described in Example 1 proteins to streptavidin was measured according to the manufacturer's instructions in the Biacore device. This is the protein to be measured on the sensor chip and a streptavidin solution with defined concentration is injected. The interaction (Binding) between the two molecules is measured by the device and referred to as so-called Resonance Units (RU). For measurement, the used by the manufacturer.

Die Ergebnisse der Messungen sind in der Tabelle 2 dargestellt. Die erhaltenen Meßwerte wurden mit der zugehörigen Software ausgewertet und führten zu den in der Tabelle 1 angegebenen Dissoziationskonstanten. Tabelle 2 Motiv 1 2 3 4 Streptavidinkonz. RU RU RU RU 15 nM 98 30 nM 242 68 60 nM 461 171 125 nM 613 280 250 nM 704 384 500 nM 62 786 478 1 μM 123 - 560 2 μM 233 946 644 3 μM - 64 - 4 μM 407 - 983 6 μM - 98 8 μM 621 - 15 μM - 201 16 μM 779 - 30 μM - 337 32 μM 955 - 60 μM 536 The results of the measurements are shown in Table 2. The measured values obtained were evaluated with the associated software and led to the dissociation constants given in Table 1. Table 2 motive 1 2 3 4 Streptavidinkonz. RU RU RU RU 15 nM 98 30 nM 242 68 60 nM 461 171 125 nM 613 280 250 nM 704 384 500nM 62 786 478 1 μM 123 - 560 2 μM 233 946 644 3 μM - 64 - 4 μM 407 - 983 6 μM - 98 8 μM 621 - 15 μM - 201 16 μM 779 - 30 μM - 337 32 μM 955 - 60 μM 536

Beispiel 3Example 3

In fachüblicher weise wurde das FAB Protein, das am N-terminus ein aus fünfzehn Aminosäuren bestehendes zusätzliches Peptide mit der Aminosäuresequenz D V E A W L D E R V P L V E T (Motiv 3) als Fusionspartner besaß, in vitro in einem zellfreien Proteinbiosynthese mittels eines gekoppelten Transkriptions-Translationssystems exprimiert.In times the usual Example, the FAB protein, which at the N-terminus one of fifteen amino acids existing additional Peptides with the amino acid sequence D V E A W L D E R V P L V E T (motif 3) was a fusion partner, in vitro in a cell-free protein biosynthesis by means of a coupled Transcriptional translation system expressed.

Zur Aufreinigung des überexprimierten definierten Proteins wurde das Streptavidin an einer Festphase gekoppelt. Als Festphase diente eine Sepharose. Das exprimierte FAB Protein wurde anschließend in fachüblicher weise affinität-schromatographisch über eine Säule enthaltend Streptavidin-Sepharose oder StrepTactin-Sepharose aufgereinigt. Für die Aufreinigung wurden folgende Puffer verwendet: Waschpuffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA).to Purification of the overexpressed the protein was coupled to the streptavidin on a solid phase. The solid phase was a Sepharose. The expressed FAB protein was subsequently in usual practice wise affinity-chromatographic over a Containing column Streptavidin-Sepharose or StrepTactin-Sepharose purified. For the Purification, the following buffers were used: wash buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA).

Für die Elution von Streptavidin enthielt der Waschpuffer 2 mM Biotin und für die Elution von StrepTactin enthielt der Waschpuffer 2,5 mM Desthiobiotin.For the elution of streptavidin, the washing buffer contained 2 mM biotin and for elution of StrepTactin, the wash buffer contained 2.5 mM desthiobiotin.

Die prozentuale Verteilung des eingesetzten definierten Proteins auf die verschiedenen Fraktionen der Affinitätschromatographie ist in der Tabelle 3 zu entnehmen. In der Tabelle 3 steht D für den Auftragung der Probe/Durchlauf, W für die Waschfraktion und E für die Elutionsfraktion. Tabelle 3 Fraktion D W1 W2 W3 E1 E2 E3 E4 E5 Summe Streptavidin 3,5% 6,8% 1,0% 0,3% 0,4% 76,9% 0,7% - - 89,6% StrepTactin 3,0 7,4% 1,8% 0,9% 0,9% 45,9% 23,2% 1,0% 0,3% 84,4% The percentage distribution of the defined protein used on the different fractions of the affinity chromatography is shown in Table 3. In Table 3, D is the plot of the sample / run, W is the wash fraction, and E is the elution fraction. Table 3 fraction D W1 W2 W3 E1 E2 E3 E4 E5 total streptavidin 3.5% 6.8% 1.0% 0.3% 0.4% 76.9% 0.7% - - 89.6% StrepTactin 3.0 7.4% 1.8% 0.9% 0.9% 45.9% 23.2% 1.0% 0.3% 84.4%

Bei der Verwendung von Streptavidin-Sepharose konnten 90% des aufgetragenen Proteins von der Säule wiedergewonnen werden, wobei 78% auf das Eluat entfielen. Die Qualität der Aufreinigung ist in 1 dargestellt.When streptavidin-Sepharose was used, 90% of the applied protein could be removed from the Column, with 78% attributable to the eluate. The quality of the purification is in 1 shown.

Bei der Verwendung von StrepTactin-Sepharose konnten 84% des aufgetragenen Proteins von der Säule wiedergewonnen werden, wobei 71% auf das Eluat entfielen. Die Qualität der Aufreinigung ist in 2 dargestellt.

  • Seq.-ID 1: DVEAW
  • Seq.-ID 2: DVEA
  • Seq.-ID 3: VEAW
  • Seq.-ID 4: DVE
  • Seq.-ID 5: VEA
  • Seq.-ID 6: EAW
Using StrepTactin-Sepharose, 84% of the applied protein could be recovered from the column, with 71% on the eluate. The quality of the purification is in 2 shown.
  • Seq. ID 1: DVEAW
  • Seq. ID 2: DVEA
  • Seq. ID 3: VEAW
  • Seq. ID 4: DVE
  • Seq. ID 5: VEA
  • Seq. ID 6: EAW

SEQUENCE LISTING

Figure 00160001
SEQUENCE LISTING
Figure 00160001

Figure 00170001
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Figure 00180001
Figure 00180001

Claims (2)

Verwendung eines Streptavidin-Bindungspeptides enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1–6 zur Aufreinigung eines in einem Proteinbiosynthesesystem hergestellten definierten Proteins, wobei eine für das definierte Protein und, hiermit verbunden, für das Streptavidin-Bindungspeptid codierende Nukleinsäure einer Transkription und/oder Translation unterworfen wird, wobei eine Lösung enthaltend das so erhaltene Translationsprodukt mit immobilisiertem Streptavidin kontaktiert und daran gebunden wird und wobei nach Abtrennung der Lösung mit nicht an Streptavidin gebundenen Substanzen das Translationsprodukt eluiert wird.Use of a streptavidin-binding peptide containing an amino acid sequence according to Seq. ID 1-6 for purification a defined in a protein biosynthesis system defined Protein, with one for the defined protein and, associated therewith, the streptavidin-binding peptide coding nucleic acid a transcription and / or translation is subjected, wherein a solution containing the resulting translation product with immobilized Streptavidin is contacted and bound to it and wherein Separation of the solution with substances not bound to streptavidin, the translation product is eluted. Verwendung eines Streptavidin-Bindungspeptides enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID 1–6 zur Markierung eines definierten Proteins, wobei eine für das definierte Protein und, hiermit verbunden, für das Streptavidin-Bindungspeptid codierende Nukleinsäure einer Transkription und/oder Translation unterworfen wird, wobei das so erhaltene Traslationsprodukt mit einem Streptavidin-Konjugat enthaltend ein Reportermolekül kontaktiert und daran gebunden wird.Use of a streptavidin-binding peptide containing an amino acid sequence according to SEQ ID 1-6 for labeling of a defined protein, one for the defined protein and, associated with this, for that Streptavidin-binding peptide-encoding nucleic acid of a transcription and / or Translation, wherein the Traslationsprodukt thus obtained contacted with a streptavidin conjugate containing a reporter molecule and be bound to it.
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