DE10208626A1 - Triple quadrupole mass spectrometer, for the analysis of a mixture of substances, especially biological, comprises using structured mass/charge quotients after ionizing - Google Patents

Abstract

A triple quadrupole mass spectrometer is used to analyze mixtures of substances which have been ionized. A triple quadrupole mass spectrometer is used to analyze mixtures of substances which have been ionized. In the first quadrupole, a mass/charge quotient is selected of an ion developed by the ionizing. The selected ion is fragmented by an acceleration voltage in the next quadrupole, acting as a collision chamber filled with a collision gas. A mass/charge quotient is selected of an ion formed by the fragmentation in a further quadrupole. The three stages are performed at least once. The mass charge quotients of all the ions formed by ionizing are analyzed, where the second quadrupole is filled with a collision gas without an acceleration voltage. The stages can be executed in a reverse order.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanzgemischen mit einem Tripel- Quadrupol-Massenspektrometer. The present invention relates to a mass spectrometric Method for the analysis of substance mixtures with a triple Quadrupole mass spectrometer.

Bei der Analyse komplexer Substanzgemische biologischen und/oder chemischen Ursprungs stellt sich dem Analytiker neben der Aufgabe der Identifizierung der Struktur einzelner im Gemisch enthaltenden Substanzen immer wieder das Problem alle im Gemisch vorhandenen Substanzen zu erfassen und möglichst zu quantifizieren. Dies sollte möglichst rasch und mit einer hohen Genauigkeit, das heißt mit einer geringen Fehlerabweichung erfolgen. Dies wird um so wichtiger, wenn Informationen über ein biologisches System beispielsweise über ein unter bestimmten Fermentationsbedingungen angezogenen Mikroorganismus oder über eine unter verschiedenen Umweltbedingungen angewachsene Pflanze oder über einen Wildtyp- Organismus wie einem Mikroorganismus oder einer Pflanze im Vergleich zu deren genetisch veränderten Mutante gewonnen werden sollen. Derartige Vergleiche sind erforderlich, um eine Zuordnung von Mutationen unbekannter Gene im Genom dieser Organismen zu einem bestimmten metabolischen Phänotyp zu ermöglichen. When analyzing complex mixtures of substances biological and / or chemical origin faces the analyst in addition to the task the identification of the structure of individuals in the mixture substances containing the problem again and again all in the mixture capture existing substances and quantify them if possible. This should be as quick as possible and with high accuracy, that is with a small error deviation. This becomes all the more more important when information about a biological system for example, under a certain fermentation conditions attracted microorganism or via one among different Plant grown over environmental conditions or via a wild-type Organism such as a microorganism or a plant in the Comparison to their genetically modified mutant can be obtained should. Such comparisons are required to make an assignment mutations of unknown genes in the genome of these organisms to enable a certain metabolic phenotype.

Der Erfolg bei der Analyse dieser Substanzgemische beispielsweise chemischer Syntheseansätze aus der kombinatorischen Chemie oder aus Extrakten von Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenteile hängt dabei im großen Ausmaß vom der Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit der verwendeten Analytik ab. In einem solchen Screening müssen eine Vielzahl von Proben durchgemustert werden, es sind daher schnelle, einfache, hochempfindliche und hochspezifische Analysenverfahren erforderlich. The success in the analysis of these substance mixtures, for example chemical synthesis approaches from combinatorial chemistry or from extracts of microorganisms, plants or parts of plants depends to a large extent on the speed and Reproducibility of the analytics used. In one Screening requires a variety of samples to be screened, there are therefore quick, easy, highly sensitive and highly specific analysis procedures required.

Ein Hauptproblem dieser Analytik ist die rasche, einfache, reproduzierbare und quantifizierbare Identifizierung der in den Gemischen enthaltenen Substanzen. In der Regel werden zur Analyse der Produkte Trennverfahren wie die Dünnschichtchromatographie (= DC), die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (= HPLC) oder die Gaschromatographie (= GC) verwendet. Mit Hilfe dieser chromatographischen Verfahren kann allerdings nicht rasch und einfach eine breite Palette von Substanzen identifiziert und quantifiziert werden. Auch Verfahren wie NMR oder Massenspektrometrie werden für diese Aufgabe beschrieben. In der Regel ist jedoch eine gewisse Vorbereitung der Proben für diese Analyseverfahren erforderlich, wie Aufarbeitung über zum Beispiel Salzfällung und/oder anschließender Chromatographie, Aufkonzentrierung, Entsalzung der Proben, Pufferaustausch oder Entfernung eventuell in der Probe enthaltener Detergentien. Nach dieser Vorbehandlung sind die Proben für die vorgenannten Analytiken verwendbar und es können einzelne Substanzen in ausgesuchten Proben identifiziert und quantifiziert werden. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und lassen nur einen beschränkten Probendurchsatz zu, so daß derartige Analysenverfahren im sogenannten High-Throughput-Screening (= HTS) oder dem breiten Screening von Substanzgemischen in biologischen oder chemischen Proben keine Anwendung finden. Von Vorteil bei sehr präzisen Methoden wie der NMR- oder IR-Spektroskopie ist, daß sie Informationen sowohl über die Struktur als auch gegebenenfalls über die Quantität einer Substanz liefern. A major problem with this analytics is the quick, simple, reproducible and quantifiable identification of the in the Mixtures contained substances. They are usually used to analyze the Products separation processes like thin layer chromatography (= DC), high pressure liquid chromatography (= HPLC) or Gas chromatography (= GC) used. With the help of this However, chromatographic procedures cannot be quick and easy a wide range of substances identified and be quantified. Also methods like NMR or mass spectrometry are described for this task. As a rule, however some preparation of the samples for these analysis procedures required, such as working up, for example, salt precipitation and / or subsequent chromatography, concentration, Desalination of the samples, buffer exchange or removal possibly in the Sample of detergents contained. After this pretreatment are the samples can be used for the aforementioned analyzes and it can identify and identify individual substances in selected samples be quantified. However, these procedures are time consuming and only allow a limited sample throughput, so that such analytical methods in so-called high-throughput screening (= HTS) or the broad screening of substance mixtures in biological or chemical samples are not used. Of Advantage with very precise methods such as the NMR or IR spectroscopy is that it has information about both the structure and if necessary deliver the quantity of a substance.

Um einen höheren Probendurchsatz im HTS zu ermöglichen, werden vielfach indirekte, leicht messbare Verfahren wie Farbreaktionen im sichtbaren Bereich, Trübungsmessungen, Fluoreszenz, Leitfähigkeitsmessungen etc. verwendet. Diese sind zwar im Prinzip sehr empfindlich, aber auch störanfällig. Von Nachteil hierbei ist vor allem, daß bei diesem Vorgehen viele falsch positive Proben analysiert werden und da es sich um indirekte Nachweisverfahren handelt, keine Informationen über die Struktur und/oder die Quantität einer Verbindung vorliegen. Um diese falsch Positiven beim weiteren Vorgehen ausschließen zu können, werden in der Regel weitere Analysenverfahren nach einer ersten raschen Analyse wie beispielsweise NMR, IR, HPLC/MS oder GC/MS verwendet. Dies ist wiederum sehr zeitaufwendig. To enable a higher sample throughput in the HTS, often indirect, easily measurable processes such as color reactions in the visible range, turbidity measurements, fluorescence, Conductivity measurements etc. used. In principle, these are very sensitive, but also prone to failure. The disadvantage here is before all that with this procedure many false positive samples be analyzed and since it is indirect detection methods acts, no information about the structure and / or the Quantity of a connection. To these false positives in To be able to rule out further procedures are usually further analysis methods after a first quick analysis such as for example NMR, IR, HPLC / MS or GC / MS used. This is again very time consuming.

Generell kann gesagt werden, daß die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Aussagekraft der Detektionsverfahren zu einer Verlangsamung in der Geschwindigkeit einer Analytik führt. In general, it can be said that the improvement of Sensitivity and the informative value of the detection methods to one Slowing down in the speed of analytics leads.

Bei der Arbeit mit komplexen biologischen Gemischen wie beispielsweise Extrakten aus Mikroorganismen, Pflanzen und/oder Tieren ist außerdem zu beachten, dass einzelne Verbindungen in den Gemischen nur in sehr geringen Mengen vorhanden sind bzw. nur geringe Mengen der einzelnen Probe selbst für die Analytik zur Verfügung stehen, so dass die verwendete Methode eine Hohe Sensitivität besitzen muss. Weiterhin stellen für einige Analysenmethoden die häufig in biologischen Proben vorhandenen nicht flüchtigen Puffer und/oder Salze ein Problem dar, da diese die Sensitivität der Methoden oder deren Verwendung überhaupt negativ beeinflussen. Gleiches gilt für die Anwesenheit von Detergentien in diesen Proben. When working with complex biological mixtures like for example extracts from microorganisms, plants and / or Animals should also note that individual connections in the Mixtures are only present in very small quantities or only small amounts of the individual sample itself for analysis Are available, so the method used is high Must have sensitivity. Still pose for some Analytical methods that are not often found in biological samples volatile buffers and / or salts pose a problem because these are the Sensitivity of the methods or their use at all negative influence. The same applies to the presence of detergents in these samples.

Zur Analyse komplexer Probengemische sind aus dem Stand der Technik massenspektrometrische Verfahren bekannt, die beispielsweise von der Analyse von Proben der synthetischen Chemie, der Petrochemie, von Umweltproben und biologischen Material reichen. Diese Methoden werden jedoch nur für die Analyse einzelner bekannter Verbindungen in diesen Proben eingesetzt. Breite Messreihen beispielsweise im Rahmen eines HTS oder in der Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Verbindungen in diesen Proben werden nicht beschrieben. For the analysis of complex sample mixtures from the state of the art Technique known mass spectrometric methods, for example from the analysis of samples of synthetic chemistry, the Petrochemicals range from environmental samples and biological material. This However, methods are only known for the analysis of individual ones Compounds used in these samples. Wide series of measurements for example as part of an HTS or in identification and Quantify a variety of compounds in these samples are not described.

Anwendung findet dabei die Gaschromatographische-Massenspektrometrie (= GC/MS) für Substanzen, die aus den Substanzgemischen extrahierbar und leicht flüchtig sind. Für die Analyse von Substanzen bzw. Analyten, die nicht einfach oder nur schwer in die Gasphase überführt werden können und bei denen dabei ein großer Überschuss an vorliegenden Lösungsmittel entfernt werden muss, wird die sogenannte Liquid-Ghromatography- oder High-Pressure- Liquid-Chromatography-Hass-Spectrometry (= HPLC/MS) verwendet. Eine Übersicht über die verschiedenen LC/MS-Methoden und ihr Equipment ist der Veröffentlichung von Niessen et al. (Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37-57) zu entnehmen. In den US- Schriften US 4,540,884 und US 5,397,894 werden Massenspektrometer und ihr Aufbau beschrieben und beansprucht. The Gas chromatographic mass spectrometry (= GC / MS) for substances that consist of the substance mixtures are extractable and volatile. For the analysis of Substances or analytes that are not easy or difficult to get into the Gas phase can be transferred and in which a large Excess solvent must be removed the so-called liquid ghromatography or high pressure Liquid Chromatography Hass Spectrometry (= HPLC / MS) was used. An overview of the different LC / MS methods and their Equipment is the publication of Niessen et al. (Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37-57). In the US Writings US 4,540,884 and US 5,397,894 become mass spectrometers and described and claimed their structure.

Mit Hilfe der vorgenannten Methoden lassen sich Substanzen in einem Molekulargewichtsbereich von bis zu 100 KD (= KiloDalton) bestimmen, das heißt es läßt sich eine breite Palette von Substanzen beispielsweise in einem unteren Massenbereich von bis etwa 5000 D (= Dalton) wie Fettsäuren, Aminosäuren, Carbonsäuren, Oligo- oder Polysaccharide, Steroide etc. und/oder in einem höheren Massenbereich über 5000 D wie Peptide, Proteine, Oligonukleotide und Oligosaccharide oder sonstigen Polymere bestimmen. Auch hochmolekulare Materialien wie Kohleteer, Huminsäure, Fulvinsäure oder Kerogene lassen sich analysieren (Zenobie and Knochenmuss, Mass Spec. Rev., 1998, 17, 337-366). Es lassen sich sowohl die Identität als auch die Struktur von Substanzen bestimmen, wobei die Strukturanalyse jedoch nicht immer eindeutig ist, so dass sie mit anderen Methoden beispielsweise NMR bestätigt werden muss. With the help of the aforementioned methods, substances can be in a molecular weight range of up to 100 KD (= KiloDalton) determine, that means it can be a wide range of Substances, for example, in a lower mass range from to about 5000 D (= Dalton) such as fatty acids, amino acids, carboxylic acids, Oligo- or polysaccharides, steroids etc. and / or in one higher mass range above 5000 D such as peptides, proteins, Determine oligonucleotides and oligosaccharides or other polymers. Also high molecular weight materials such as coal tar, humic acid, fulvic acid or kerogens can be analyzed (zenobia and bone loss, Mass Spec. Rev., 1998, 17, 337-366). Both the Identify as well as structure of substances, whereby however, the structural analysis is not always clear, so it NMR has to be confirmed with other methods.

Von G. Hopfgartner und F. Vilbois (Analusis, 2001, 28, No. 10, 906-914) wird ein Verfahren zum Screenen mit Hilfe der LC/MS von in vitro oder in vivo entstandenen Metaboliten von strukturell bekannten Verbindungen beschrieben, die als Wirkstoffe in verschiedenen Phasen der Wirkstoffentwicklung sind. Dieses Verfahren läuft in zwei Schritten ab. Im ersten Suchschritt werden in einem raschen "Full Scan-Modus" interessante Ionen erfasst, die als Kandidaten für die weiteren Untersuchungen in Frage kommen. Dabei kann es sich um Ionen handeln, die Ionen besonders hoher Intensität entsprechen oder als Kandidaten möglicher Abbauprodukte bzw. Metabolite der Wirkstoffe in Frage kommen. Diese Ionen werden in einem zweiten Scan zur Identifizierung der chemischen Struktur dieser Ionen bzw. Verbindungen nach einer Fragmentierung in einer Kollisionskammer des Massenspektrometers verwendet. Um eine rasche Aufklärung der Ionen- bzw. Metabolitstruktur zu ermöglichen, enthält die Kollisionskammer ständig Kollisionsgas. Von Nachteil bei der Strukturermittlung ist, dass eine bekannte Masse eines Vorläuferions, eines Fragments oder eines Ionenaddukts erforderlich ist. Vorteilhaft sollte die Ausgangsstruktur der zu untersuchenden Substanz für die HPLC/MS in diesen Experimenten bekannt sein. Da die HPLC/MS allein nicht für die absolute Strukturbestimmung geeignet ist. Ist jedoch die Struktur der Ausgangsverbindung bekannt, lassen sich Aussagen über die Struktur eventueller Metabolite machen. Da die Struktur des Substanz, die als Wirkstoff entwickelt werden soll, bekannt ist, lassen sich Aussagen über die Struktur der unbekannten Metabolite des Wirkstoffs mit einiger Sicherheit machen. Allerdings wird die Aussage durch mögliche Überlagerungen anderen als Verunreinigungen vorhandener Verbindungen gleicher Masse erschwert bzw. verhindert. Eine Quantifizierung der Verbindungen ist mit dieser Methode nicht möglich. By G. Hopfgartner and F. Vilbois (Analusis, 2001, 28, No. 10, 906-914) is a method of screening using LC / MS of in vitro or in vivo metabolites of structurally known compounds described as active ingredients in different phases of drug development. This The process runs in two steps. In the first search step interesting ions are captured in a rapid "full scan mode", who are considered as candidates for further investigation come. These can be ions, especially the ions correspond to high intensity or possible as a candidate Degradation products or metabolites of the active substances come into question. This Ions are used in a second scan to identify the chemical structure of these ions or compounds according to a Fragmentation in a collision chamber of the mass spectrometer used. For a quick clarification of the ion or metabolite structure contains the collision chamber constantly Collision gas. The disadvantage of structure determination is that a known mass of a precursor ion, a fragment or one Ion adducts are required. That should be advantageous Initial structure of the substance to be investigated for HPLC / MS in these Experiments. Since HPLC / MS is not for the absolute structure determination is suitable. However, is the structure the output connection is known, statements about the Make structure of any metabolites. Since the structure of the Substance that is to be developed as an active ingredient is known statements about the structure of the unknown metabolites can be made of the active ingredient with some certainty. However, the Statement by possible overlays other than Contamination of existing connections of the same mass is made more difficult or prevented. A quantification of the compounds is with this Method not possible.

Eine Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl oder aller Einzelkomponenten in einem Substanzgemisch ohne zur Verfügung stehende Reinsubstanzen stellt auch heute noch ein ungelöstes Problem in der Massenspektrometrie dar. An identification and quantification of a variety or all individual components in a substance mixture without being available standing pure substances still represent an unsolved one Problem in mass spectrometry.

Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Analyse einer Vielzahl von Verbindungen und bevorzugt deren Quantifizierung zu entwickeln. There was therefore the task of a method for analyzing a Variety of compounds and preferably their quantification develop.

Diese Aufgabe wurde gelöst durch ein massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanzgemischen mit einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer, wobei die Substanzgemische vor der Analyse ionisiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

• a) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) eines durch Ionisation entstandenen Ions in einem ersten analytischen Quadrupol (I) des Massenspektrometers,
• b) Fragmentieren des unter (a) ausgewählten Ions unter Anlegung einer Beschleunigungsspannung in einem weiteren folgenden Quadrupol (II), das mit einem Kollisionsgas gefüllt ist und als Kollisionskammer fungiert,
• c) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotient eines durch die Fragmentierung (b) entstandenen Ions in einem weiteren nachfolgenden Quadrupol (III), wobei die Verfahrensschritte (a) bis (c) mindestens einmal durchlaufen werden und
• d) Analysieren der Masse/Ladungs-Quotienten aller im Substanzgemisch durch die Ionisation vorhandenen Ionen, wobei das Quadrupol (II) mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch während der Analyse keine Beschleunigungsspannung angelegt ist;

wobei die Schritt (a) bis (c) und der Schritt (d) auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden können. This object was achieved by a mass spectrometric method for analyzing substance mixtures with a triple quadrupole mass spectrometer, the substance mixtures being ionized before the analysis, characterized in that the method comprises the following steps:

• a) selecting a mass / charge quotient (m / z) of an ion formed by ionization in a first analytical quadrupole (I) of the mass spectrometer,
• b) fragmenting the ion selected under (a) by applying an acceleration voltage in a further subsequent quadrupole (II) which is filled with a collision gas and acts as a collision chamber,
• c) selecting a mass / charge quotient of an ion formed by the fragmentation (b) in a further subsequent quadrupole (III), the process steps (a) to (c) being carried out at least once and
• d) analyzing the mass / charge quotients of all ions present in the mixture of substances by the ionization, the quadrupole (II) being filled with collision gas, but no acceleration voltage being applied during the analysis;

wherein steps (a) to (c) and step (d) can also be carried out in the reverse order.

Unter Substanzgemische im Sinne der Erfindung sind prinzipiell alle Gemische, die mehr als eine Substanz enthalten zu verstehen, wie beispielsweise komplexe Reaktionsmischungen chemischer Synthesen wie Syntheseprodukte aus der kombinatorischen Chemie oder Substanzgemische biologischen Ursprungs wie Fermentationsbrühen einer aeroben oder anaeroben Fermentation, Körperflüssigkeiten wie Blut, Lymphe, Urin oder Stuhl, Reaktionsprodukte eine biotechnologischen Synthese mit einem oder mehreren freien oder gebundenen Enzymen, Extrakte tierischen Materials wie Extrakte aus verschiedenen Organen oder Geweben oder pflanzliche Extrakte wie Extrakte der gesamten Pflanze oder einzelner Organe wie Wurzel, Stiel, Blatt, Blüte oder Samen oder deren Mischungen. Vorteilhaft werden in diesem Verfahren Substanzgemische biologischen Ursprungs wie Extrakte tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, vorteilhaft pflanzlichen Ursprungs analysiert. In principle, substance mixtures within the meaning of the invention are to understand all mixtures that contain more than one substance such as complex chemical reaction mixtures Syntheses such as synthesis products from combinatorial chemistry or Mixtures of substances of biological origin such as fermentation broths an aerobic or anaerobic fermentation, body fluids such as blood, lymph, urine or stool, reaction products biotechnological synthesis with one or more free or bound enzymes, extracts from animal material such as extracts various organs or tissues or herbal extracts such as Extracts of the entire plant or individual organs such as roots, Stalk, leaf, flower or seeds or their mixtures. Advantageous In this process, mixtures of substances are biological Of origin such as extracts of animal or vegetable origin, analyzed advantageously of vegetable origin.

Die im Verfahren verwendbaren Massenspektrometer setzen sich in der Regel aus einem Probeneinlass-System, einem Ionisationsraum, einem Interface, einer Ionenoptik, einem oder mehreren Massefilter und einem Detektor zusammen. The mass spectrometers that can be used in the process settle in usually from a sample inlet system, an ionization room, an interface, ion optics, one or more Mass filter and a detector together.

Zur Erzeugung von Ionen im Verfahren können prinzipiell alle dem Fachmann bekannten Ionenquellen verwendet werden. Diese Ionenquellen werden je nach verwendeter Ionenquelle über ein sogenanntes Interface an die folgenden Komponenten des Massenspektrometers beispielsweise der Ionenoptik, dem oder den Massefiltern oder dem Detektor gekoppelt. Die Zwischenschaltung eines Interfaces hat den Vorteil, dass die Analyse ohne Verzögerung durchgeführt werden kann. Weiterhin können durch die Ionenquelle nichtflüchtige und/oder flüchtige bevorzugt nichtflüchtige Substanzen direkt in die Gasphase gebracht werden. Es können dadurch auch Vorreinigungen von Substanzgemischen über eine vorteilhafte chromatographische Auftrennung durchgeführt werden, die unterschiedlich breite Stoffflüsse in der Analytik aufweisen, da über das Interface diese Stoffflüsse verarbeitet werden können. Die zu analysierenden Proben bzw. die darin enthaltenen Substanzen können dadurch außerdem angereichert werden. Weiterhin kann eine breite Palette von Lösungsmitteln bei geringstem Verlust an Probe verarbeitet werden. In principle, all of this can be used to generate ions in the process Ion sources known to those skilled in the art can be used. This Depending on the ion source used, ion sources are selected via a so - called interface to the following components of the Mass spectrometers, for example of ion optics, the mass filter or mass filters or coupled to the detector. Interposing a Interfaces has the advantage of analysis without delay can be carried out. Furthermore, through the ion source non-volatile and / or volatile preferably non-volatile substances be brought directly into the gas phase. It can also Pre-cleaning of mixtures of substances via an advantageous chromatographic separation can be performed have differently wide material flows in the analysis, because Interface these material flows can be processed. The too analyzing samples or the substances contained therein can also be enriched. Furthermore, a wide range of solvents with minimal loss of sample are processed.

Bei der Ionisation werden im wesentlichen drei Prozesse zur Erzeugung der geladenen Teilchen (Ionen) verwendet:

• a) Verdampfung der Substanzgemische und Ionisation der Moleküle bzw. des Substanzgemisches in der Gasphase, beispielsweise wie bei der Elektronenstoss-Ionisation (E1), bei der die Moleküle mit einem Elektronenstrahl in einer Ionisationskammer bei niedrigem Druck (< 10^-2 Pa) verdampft werden oder wie bei der chemischen Ionisation (CI) mit einem Reaktandgas bei die Ionen bei einem erhöhtem Druck ca. 100 Pa erzeugt werden. Typische Reaktandgase sind beispielsweise Methan, Isobutan, Ammonium, Argon oder Wasserstoff. Wird die chemische Ionisation bei Atmosphärendruck durchgeführt, so spricht man von der sogenannten "Atmospheric-Pressure Chemical Ionization (APCI).
• b) Desorption der Substanzgemische von einer Oberfläche beispielsweise wie bei der Plasma Desorption (PD), der Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry (LSIMS), dem Fast Atom Bombardment (FAB), der Laser Desorption (LD) oder dem Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI).
  Bei all diesen Methoden werden die Substanzgemische durch einfallende energiereiche Partikel (radioaktiver Zerfall, UV-, IR-Photonen, Ar⁺- oder Cs⁺-Ionen, Laserstrahlen) in einer Kollisionskaskade vibratorisch angeregt und dadurch ionisiert.
• c) Zerstäubung der Substanzgemische im elektrischen Feld, wie bei der Electrospray-Ionisation (ESI). Bei der Zerstäubung der Substanzgemische im elektrischen Feld werden die Proben bei Atmosphärendruck zerstäubt.
  Die Electrospray-Ionisation ist eine sehr schonende Methode. Bei der ESI werden kontinuierlich Ionen gebildet. Diese kontinuierliche Ionenbildung hat den Vorteil, dass sie mühelos in Verbindung mit fast jedem Analysatortyp gekoppelt werden kann und dass sie sich problemlos mit einer chromatographischen Auftrennung wie einer Auftrennung über Kapillar-Elektrophorese (CE), Liquid Chromatography (LC) oder High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) verbinden läßt, da sie eine gute Toleranz für hohe Flussraten bis zu 2 ml/min Eluat hat. Dabei wird das Versprühen des Eluenten pneumatisch durch ein sogenanntes Vernebelungsgas beispielsweise Stickstoff unterstützt. Hierzu wird das Gas unter einem Druck von bis zu 4 bar, vorteilhaft bis zu 2 bar aus einer Kapillare ausgeblasen, die die Einlasskapillare des Eluenten umschließt. Auch höhere Drücke sind prinzipiell möglich. Bei der vorgeschalteten chromatographischen Auftrennung sind sogenannte Normalphasen- (z. B. Kieselgel-, Aluminiumoxid-, Aminodesoxyhexit-, Aminodesoxy-d-glucose-, Triethylentetramin-, Polyethylenoxid- oder Aminodicarboxy-Säulen) und/oder Reversed-Phase-Säulen bevorzugt Reversed-Phase-Säulen wie Säulen mit einer C₄, C₈ oder C₁₈ stationären Phase bevorzugt. Unter Standardbedingungen führt die Elektrospray-Technik aufgrund der äußerst schonenden Ionisierung zum (Quasi-)Molekülion. Meist sind dies Addukte mit bereits in der Probenlösung vorhandenen Ionen (z. B. Protonen, Alkali- und/oder Ammoniumionen). Weiterhin von Vorteil ist, dass sich auch mehrfach geladene Ionen detektieren lassen, so dass Ionen mit einem Molekulargewicht von bis zu hunderttausend Dalton detektieren lassen, vorteilhaft lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren Molekulargewichte in einem Bereich von 1 bis 10000 Dalton, bevorzugt in einem Bereich von 50 bis 8000 Dalton, besonders bevorzugt in einem Bereich von 100 bis 4000 Dalton detektieren. Als weitere beispielhafte Methoden sei die Ionenspray-Ionisation, die Atmospheric Pressure Ionisation (APCI) oder die Thermospray-Ionisation genannt.
  Bei den vorgenannten Ionisierungsmethoden läuft der Ionisierungsprozeß unter Atmosphärendruck ab und gliedert sich im wesentlichen in drei Phasen: Zunächst wird die zu analysierende Lösung in einem starken elektrostatischen Feld, das durch Erzeugen einer Potentialdifferenz von 2-6 kV zwischen der Einlasskapillare und einer Gegenelektrode erzeugt wird, versprüht. Ein elektrisches Feld zwischen der Einlasskapillarspitze und dem Massenspektrometer durchdringt dabei die Analytlösung und trennt dabei die Ionen in einem elektrischen Feld auf. Positive Ionen werden dabei im sogenannten positive Mode an die Oberfläche der Flüssigkeit gezogen, negative Ionen in die Gegenrichtung oder umgekehrt bei Messungen im sogenannten positiv Mode. Die an der Oberfläche akkumulierten positiven Ionen werden im folgenden weiter in Richtung der Kathode gezogen. Bei der Verwendung von Sprühkappilaren (NanoSpray), in denen die zu untersuchende Lösung nicht durch das Anlegen von Druck aus der Kapillare gepresst wird, bildet sich ein Flüssigkeitskonus, der sog. Taylor-Konus aus, da die Oberflächenspannung der Flüssigkeit dem elektrischen Feld entgegen wirkt. Ist das elektrische Feld stark genug, ist der Konus stabil und emittiert an seiner Spritze kontinuierlich einen Flüssigkeitsstrom. Beim druckunterstützten Versprühen der zu untersuchenden Lösung (z. B. mit HPLC) ist der Taylor- Konus nicht so ausgeprägt.
  Dabei bildet sich jeweils ein Aerosol aus, das aus Analyt und Lösungsmittel besteht. Im folgenden Stadium findet die Desolvatisierung der gebildeten Tropfen statt, was zur sukzessiven Verringerung der Tropfengröße führt. Die Verdampfung des Lösungsmittels wird durch thermische Einwirkung, z. B. durch Zuführung heißen Inertgases, erreicht. Durch die Verdampfung in Zusammenwirken mit den elektrostatischen Kräften steigt die Ladungsdichte an der Oberfläche der eingesprühten Substanzgemischtröpfchen ständig. Überschreitet dabei schließlich die Ladungsdichte bzw. deren Ladungsrepulsionskräfte die Oberflächenspannung der Tröpfchen (sogenannte Raleigh- Grenze), so explodieren (Coulomb-Explosion) diese Tröpfchen in kleinere Teiltröpfchen. Dieser Prozess "Lösungsmittel-Verdampfung/Coulomb-Explosion" wird mehrfach durchlaufen bis schließlich die Ionen in die Gasphase übertreten. Um gute Messergebnisse zu erhalten, müssen der Gasfluss im Interface, die angelegte Heiztemperatur, die Flussrate des Heizgases, der Druck des Vernebelungsgases und die Kapillarspannung genau überwacht und gesteuert werden.

Basically, three processes are used to generate the charged particles (ions):

• a) Evaporation of the substance mixtures and ionization of the molecules or the substance mixture in the gas phase, for example as in electron impact ionization (E1), in which the molecules are evaporated with an electron beam in an ionization chamber at low pressure (<10 ^-2 Pa) or as in chemical ionization (CI) with a reactant gas in which the ions are generated at an increased pressure of approx. 100 Pa. Typical reactant gases are, for example, methane, isobutane, ammonium, argon or hydrogen. If chemical ionization is carried out at atmospheric pressure, one speaks of the so-called "Atmospheric-Pressure Chemical Ionization (APCI).
• b) Desorption of the substance mixtures from a surface, for example as in plasma desorption (PD), liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS), fast atom bombardment (FAB), laser desorption (LD) or matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI).
  In all of these methods, the substance mixtures are vibrationally excited by incident energy-rich particles (radioactive decay, UV, IR photons, Ar ⁺ or Cs ⁺ ions, laser beams) in a collision cascade and thereby ionized.
• c) atomization of the substance mixtures in an electrical field, as in electrospray ionization (ESI). When the substance mixtures are atomized in the electric field, the samples are atomized at atmospheric pressure.
  Electrospray ionization is a very gentle method. Ions are continuously formed at ESI. This continuous ion formation has the advantage that it can be effortlessly coupled with almost any type of analyzer and that it can be easily combined with a chromatographic separation such as separation via capillary electrophoresis (CE), liquid chromatography (LC) or high pressure liquid chromatography ( HPLC) because it has a good tolerance for high flow rates up to 2 ml / min eluate. The spraying of the eluent is pneumatically supported by a so-called nebulizing gas, for example nitrogen. For this purpose, the gas is blown out of a capillary under a pressure of up to 4 bar, advantageously up to 2 bar, which encloses the inlet capillary of the eluent. In principle, higher pressures are also possible. In the preceding chromatographic separation, so-called normal phase (e.g. silica gel, aluminum oxide, aminodeoxyhexite, aminodeoxy-d-glucose, triethylenetetramine, polyethylene oxide or aminodicarboxy columns) and / or reversed-phase columns are preferably reversed -Phase columns such as columns with a C ₄ , C ₈ or C ₁₈ stationary phase are preferred. Under standard conditions, electrospray technology leads to the (quasi) molecular ion due to the extremely gentle ionization. These are usually adducts with ions already present in the sample solution (e.g. protons, alkali and / or ammonium ions). Another advantage is that multiply charged ions can also be detected, so that ions with a molecular weight of up to a hundred thousand daltons can be detected; in the method according to the invention, molecular weights in a range from 1 to 10,000 daltons, preferably in a range of 50, can advantageously be detected Detect up to 8000 daltons, particularly preferably in a range from 100 to 4000 daltons. Ion spray ionization, atmospheric pressure ionization (APCI) or thermospray ionization may be mentioned as further exemplary methods.
  With the aforementioned ionization methods, the ionization process takes place under atmospheric pressure and is essentially divided into three phases: First, the solution to be analyzed is in a strong electrostatic field, which is generated by generating a potential difference of 2-6 kV between the inlet capillary and a counter electrode. sprayed. An electrical field between the inlet capillary tip and the mass spectrometer penetrates the analyte solution and separates the ions in an electrical field. Positive ions are drawn to the surface of the liquid in the so-called positive mode, negative ions in the opposite direction or vice versa in measurements in the so-called positive mode. The positive ions accumulated on the surface are then pulled further towards the cathode. When using spray capillaries (NanoSpray), in which the solution to be examined is not pressed out of the capillary by applying pressure, a liquid cone, the so-called Taylor cone, is formed because the surface tension of the liquid counteracts the electrical field , If the electric field is strong enough, the cone is stable and continuously emits a liquid flow at its syringe. The Taylor cone is not as pronounced when pressure-assisted spraying of the solution to be examined (e.g. with HPLC).
  An aerosol is formed, which consists of analyte and solvent. The desolvation of the drops formed takes place in the following stage, which leads to a successive reduction in the drop size. The evaporation of the solvent is by thermal action, for. B. achieved by supplying hot inert gas. Evaporation in conjunction with the electrostatic forces increases the charge density on the surface of the sprayed substance mixture droplets. Finally, if the charge density or its charge repulsion forces exceeds the surface tension of the droplets (so-called Raleigh limit), these droplets explode (Coulomb explosion) into smaller partial droplets. This process "solvent evaporation / Coulomb explosion" is repeated several times until the ions finally pass into the gas phase. In order to obtain good measurement results, the gas flow in the interface, the heating temperature applied, the flow rate of the heating gas, the pressure of the nebulizing gas and the capillary voltage must be monitored and controlled precisely.

Mit den verschiedenen Ionisiationsverfahren können einfach oder mehrfach geladene Ionen erzeugt werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren werden als Ionisationsverfahren Verfahren zur Zerstäubung des Substanzgemisches im elektrischen Feld wie das Thermospray-, das Electrospray- (= ES) oder das Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (= APCI)-Verfahren vorteilhaft verwendet. Bei der APCI-Ionisation erfolgt die Ionisierung in einer sogenannten Coronna-Entladung. Bevorzugt wird das Thermospray- oder Electrospray-Verfahren, besonders bevorzugt ist das Electrospray-Verfahren. Der Ionisationsraum steht über ein Interface, das heißt über einer Mikroöffnung (100 µm) mit dem folgenden Massenspektrometer in Verbindung. Auf der Seite der Ionisierungskammer ist noch eine Interface-Platte mit einer größeren Öffnung angebracht. Zwischen dieser Platte und dem sogenannten "orifice" wird ein aufgeheizter Trägergas (= Curtain-Gas) beispielsweise Stickstoff eingeblasen. Der Stickstoff kollidiert dabei mit den beispielsweise durch Electrospray erzeugten Ionen, die im Substanzgemisch erzeugt wurden. Durch Einblasen des Curtain-Gas wird vorteilhaft verhindert, dass Neutralteilchen in das Hochvakuum des nachfolgenden Massenspektrometer gesaugt werden. Weiterhin wird durch das Curtain-Gas die Desolvatisierung der Ionen unterstützt. With the different ionization processes you can simply or multiply charged ions are generated. For the invention Processes are called ionization processes Atomization of the mixture of substances in the electric field like that Thermospray, electrospray (= ES) or atmospheric pressure Chemical ionization (= APCI) process advantageously used. at APCI ionization is carried out in a so-called Coronna discharge. Thermospray or Electrospray method, this is particularly preferred Electro spray method. The ionization space is above an interface, that is, above a micro aperture (100 µm) with the following mass spectrometer in connection. There is another on the side of the ionization chamber Interface plate with a larger opening attached. Between this plate and the so-called "orifice" becomes a heated one Carrier gas (= curtain gas), for example, nitrogen is blown in. The nitrogen collides with those, for example Electrospray generated ions that are generated in the substance mixture were. Blowing in the curtain gas advantageously prevents that neutral particles into the high vacuum of the subsequent one Mass spectrometer are sucked. Furthermore, the curtain gas supports the desolvation of the ions.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit allen dem Fachmann bekannten Quadrupolmassenspektrometern wie den Tripel-Quadrupol- Massenspektrometern durchgeführt werden. In US 2,939,952 beschreibt und beansprucht Paul et al. ein erstes derartiges Gerät. Diese Geräte haben einen vorteilhaften Massenbereich bis etwa m/z = 4000 und erzielen Auflösungswerte zwischen 500 und etwa 5000. Sie verfügen über eine hohe Ionentransmission von der Quelle bis zum Detektor, sind leicht zu fokussieren und zu kalibrieren und verfügen vorteilhaft über eine große Stabilität der Kalibrierung im Dauerbetrieb. Tripel-Quadrupol-Instrumente bilden die Standard-Instrumente für Niedrigenergie-Kollisionsaktivierungsstudien. Üblicherweise bestehen diese Geräte aus einem ersten Quadrupol, das zur Analyse des Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) der in dem Substanzgemisch nach Ionisation enthaltenen Ionen im Hochvakuum (ca. 10^-5 Torr) geeignet ist, wobei die Masse(n) einzelner Ionen, mehrerer oder aller Ionen gemessen werden können. Diesem ersten analytischen Quadrupol (= I oder Q1) können ein oder mehrere Quadrupole (= Q0) vorgeschaltet sein, die in der Regel zur Fokussierung der Ionen verwendet werden. Anstelle dieses oder dieser vorgeschalteten Quadrupole können auch sogenannte "Cones" Linsen oder Linsensysteme zur Fokussierung und Einbringung der Ionen in das erste analytische Quadrupol verwendet werden. Auch Kombinationen aus Quadrupolen und Cones sind realisiert und verwendbar. The method according to the invention can be carried out with all quadrupole mass spectrometers known to the person skilled in the art, such as the triple quadrupole mass spectrometers. In US 2,939,952, Paul et al. a first such device. These devices have an advantageous mass range up to approximately m / z = 4000 and achieve resolution values between 500 and approximately 5000. They have a high ion transmission from the source to the detector, are easy to focus and calibrate and advantageously have a high stability of the Calibration in continuous operation. Triple quadrupole instruments are the standard instruments for low-energy collision activation studies. These devices usually consist of a first quadrupole, which is suitable for analyzing the mass / charge quotient (m / z) of the ions contained in the substance mixture after ionization in a high vacuum (approx. 10 ^-5 Torr), the mass (s) single ions, several or all ions can be measured. This first analytical quadrupole (= I or Q1) can be preceded by one or more quadrupoles (= Q0), which are generally used to focus the ions. Instead of this or these upstream quadrupoles, so-called "cones" lenses or lens systems can also be used to focus and introduce the ions into the first analytical quadrupole. Combinations of quadrupoles and cones can also be implemented and used.

Ein weiteres Q1 folgendes Quadrupol (= II oder Q2) dient als Kollisionskammer. In ihm werden die Ionen vorteilhaft unter Anlegung einer Fragmentierungsspannung fragmentiert. Zur Fragmentierung werden Ionisierungspotenziale im Bereich von 5-11 Elektronenvolt (eV), bevorzugt von 8-11 Elektronenvolt (eV) angelegt. Q2 ist außerdem für die Fragmentierung im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Kollisionsgas wie einem Edelgas wie Argon oder Helium oder einem anderen Gas wie CO₂ oder Stickstoff oder Mischungen dieser Gase wie Argon/Helium oder Argon/Stickstoff gefüllt. Aus kostengründen ist Argon und/oder Stickstoff bevorzugt. In der Kollisionskammer liegt das Kollisionsgas im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Druck von 1 × 10^-5 bis 1 × 10^-1 Torr, bevorzugt 10^-2 vor. Besonders bevorzugt ist Stickstoff. Auch ohne die Anlegung einer Fragmentierungsspannung kann es zu einer vereinzelten Fragementierung der Ionen in der Kollisionskammer bei Anwesenheit eines Kollisionsgases kommen. Zwischen dem Quadrupol Q1 und Q2 können weitere Quadrupole oder Cones zur Lenkung der Ionen vorhanden sein. Another quadrupole following Q1 (= II or Q2) serves as a collision chamber. The ions are advantageously fragmented in it by applying a fragmentation voltage. For fragmentation, ionization potentials in the range of 5-11 electron volts (eV), preferably 8-11 electron volts (eV), are applied. Q2 is also filled with a collision gas such as a noble gas such as argon or helium or another gas such as CO ₂ or nitrogen or mixtures of these gases such as argon / helium or argon / nitrogen for the fragmentation in the method according to the invention. Argon and / or nitrogen is preferred for cost reasons. In the collision chamber, the collision gas is present in the process according to the invention with a pressure of 1 × 10 ^-5 to 1 × 10 ^-1 Torr, preferably 10 ^-2 . Nitrogen is particularly preferred. Even without the application of a fragmentation voltage, there may be occasional fragmentation of the ions in the collision chamber in the presence of a collision gas. Additional quadrupoles or cones for directing the ions can be present between the quadrupole Q1 and Q2.

An das Quadrupol Q2, das als Kollisionskammer dient, schließt sich schließlich ein weiteres Quadrupol (= III oder Q3) an. In diesem Q3 können entweder die m/z-Quotienten einzelner ausgewählter Fragemente, mehrerer oder aber aller in den Substanzgemischen nach Ionisation vorhandenen m/z-Quotienten (in dieser Anmeldung der einfachheithalber als Masse oder Massen bezeichnet) bestimmt werden. Auch zwischen dem Quadrupol Q2 und Q3 können weitere Quadrupole oder Cones zur Lenkung der Ionen vorhanden sein. Connects to the quadrupole Q2, which serves as a collision chamber finally another quadrupole (= III or Q3). In This Q3 can either be the m / z quotient of individual selected fragments, several or all in the substance mixtures m / z quotients after ionization (in this application referred to simply as mass or masses) become. Also between the quadrupole Q2 and Q3 can be more Quadrupoles or cones can be used to direct the ions.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können einzelne Quadrupole zur Sammlung von Ionen auch als Ionenfallen betrieben werden, aus denen dann die Ionen nach einiger Zeit wieder zur Analyse freigegeben werden. In the method according to the invention, individual quadrupoles can be used Collection of ions can also be operated as ion traps which then the ions return to analysis after some time be released.

Die in den Tripel-Quadrupol-Massenspektrometern verwendeten Quadrupole erzeugen ein dreidimensionales elektrisches Feld in dem die erzeugten Ionen gehalten bzw. gelenkt werden können. Sie bestehen in der Regel aus 4, 6 oder 8 Stäben oder Stangen mit deren Hilfe wird ein oszillierendes elektrisches Feld erzeugt wird, wobei gegenüberliegende Stäbe elektrisch verbunden sind. Neben der Bezeichnung Quadrupol werden auch die Bezeichnungen Hexa- oder Octapol verwendet. In der vorliegenden Anmeldung sollen diese Bezeichnungen mit umfasst sein, wenn der Begriff Quadrupol verwendet wird. Vorteilhaft sind in den Quadrupolen des Tripel- Quadrupol-Massenspektrometer zur Lenkung der Ionen nur geringe Beschleunigungsspannungen von wenigen Volt bevorzugt von einigen 10 V erforderlich. Those used in the triple quadrupole mass spectrometers Quadrupoles create a three-dimensional electric field in the the ions generated can be held or directed. she usually consist of 4, 6 or 8 rods or rods with their Help an oscillating electric field is generated opposite rods are electrically connected. Next the designation quadrupole, the designations hexa- or Octapol used. In the present application these terms should be included when the term quadrupole is used. In the quadrupoles of the triple Quadrupole mass spectrometer for guiding the ions only slight Acceleration voltages of a few volts, preferably a few 10 V required.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft Substanzgemische wie tierische oder pflanzliche Extrakte, bevorzugt pflanzliche Extrakte verwendet. In the method according to the invention are advantageous Mixtures of substances such as animal or vegetable extracts, preferred herbal extracts used.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden nach der Ionisierung der Substanzgemische die weitern Verfahrensschritte durchlaufen

• A) In den Verfahrensschritten (a) bis (c) wird die Masse mindestens eines im Substanzgemisch nach Ionisation in Q1 vorhandenen Ions analysiert und ausgewählt. Dieses ausgewählte Ion wird anschließend in Q2 in Gegenwart von Kollisionsgas und einer Fragmentierungsspannung fragmentiert und danach wird eines der entstandenen Fragment-Ionen in einem weiteren analytischen Quadrupol Q3 identifiziert und vorteilhaft auch quantifiziert. Dabei erfolgt die Auswahl des zu analysierenden Fragment-Ions in der Weise, dass diese Ion vorteilhaft eine hohe Intensität, eine leicht identifizierbare charakteristische Masse hat und in einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens eine leichte Quantifizierung ermöglicht.
• B) Anschließend werden im Verfahrensschritt (d) die Massen aller im Substanzgemisch nach Ionisation vorhandenen Ionen analysiert, wobei das als Kollisionskammer benutzte Quadrupol Q2 immer mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch in Verfahrensschritt (d) keine Fragmentierungsspannung an Q2 anliegt. Diese Analyse kann prinzipiell sowohl mit Q1 und als auch mit Q3 erfolgen, vorteilhafter ist es jedoch die Analyse mit Q3 durchzuführen, da zwischen Q1 und dem an das Massenspektrometer anschließenden Detektor als Kollisionskammer verwendete Quadrupol Q2 liegt. Sollte in Q2 eine Fragmentierung trotz dem fehlen anliegender Fragmentierungsspannung auftreten, so hat dies keinen Einfluss auf eine mögliche Erfassung der Ionenmassen am Detektor. Im Falle einer Massenanalyse mit Q1 würde eine solche Fragementation in Q2 jedoch zu Fehlschlüssen bei der Detektion führen. Deshalb ist eine Massendetektion mit Q3 bevorzugt, da mögliche Fehlerquellen eliminiert werden bzw. vernachlässigbar sind.

In the process according to the invention, the further process steps are carried out after the ionization of the substance mixtures

• A) In process steps (a) to (c), the mass of at least one ion present in the substance mixture after ionization in Q1 is analyzed and selected. This selected ion is then fragmented in Q2 in the presence of collision gas and a fragmentation voltage and then one of the fragment ions formed is identified in a further analytical quadrupole Q3 and advantageously also quantified. The fragment ion to be analyzed is selected in such a way that this ion advantageously has a high intensity, an easily identifiable characteristic mass and, in an advantageous embodiment of the method, enables easy quantification.
• B) Then, in process step (d), the masses of all the ions present in the substance mixture after ionization are analyzed, the quadrupole Q2 used as the collision chamber being always filled with collision gas, but in process step (d) no fragmentation voltage being applied to Q2. In principle, this analysis can be carried out both with Q1 and with Q3, but it is more advantageous to carry out the analysis with Q3, since Q2 lies between Q1 and the quadrupole Q2 used as a collision chamber as a collision chamber. If fragmentation occurs in Q2 despite the absence of a fragmentation voltage, this has no influence on a possible detection of the ion masses at the detector. In the case of a mass analysis with Q1, such a fragmentation in Q2 would lead to incorrect conclusions in the detection. Mass detection with Q3 is therefore preferred because possible sources of error are eliminated or are negligible.

Die oben aufgeführten Prozessschritte (I) bzw. (II) können auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden. Fig. 1 ist der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahren zu entnehmen. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verfahrensschritte (b) bis (d) und (e) vorteilhaft innerhalb von 0,1 bis 10 Sekunden mindestens einmal durchlaufen bevorzugt innerhalb von 0,2 bis 6 Sekunden mindestens einmal, besonders bevorzugt innerhalb von 0,2 bis 2 Sekunden, ganz besonders bevorzugt mindestens einmal innerhalb von 0,3 bis unter 2 Sekunden. Um eine vorteilhafte statistische Auswertung der Messungen zu ermöglichen werden die Verfahrensschritte innerhalb von 0,2 bis 6 Sekunden zwei- bis dreimal bevorzugt dreimal durchlaufen. Um derartige rasche schnell hintereinander folgende Messungen zu ermöglichen, ist das als Kollisionskammer fungierende Quadrupol Q2 ständig mit Kollisionsgas gefüllt. Wie die eigenen Messungen zeigten, hat dies keinen negativen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit der Messungen. The process steps (I) and (II) listed above can also be carried out in the reverse order. Fig. 1 of the sequence is given in the process of the invention. In the process according to the invention, process steps (b) to (d) and (e) are advantageously carried out at least once within 0.1 to 10 seconds, preferably at least once within 0.2 to 6 seconds, particularly preferably within 0.2 to 2 Seconds, very particularly preferably at least once within 0.3 to less than 2 seconds. In order to enable an advantageous statistical evaluation of the measurements, the process steps are carried out two to three times, preferably three times, within 0.2 to 6 seconds. In order to enable such rapid subsequent measurements in succession, the quadrupole Q2 functioning as a collision chamber is constantly filled with collision gas. As our own measurements showed, this has no negative impact on the reproducibility of the measurements.

Während einer Analyse können im erfindungsgemäßen Verfahren zwischen 1 und 100 Masse/Ladungs-Quotienten verschiedener in Schritt (a) entstandener und ausgewählter Ionen analysiert werden. Vorteilhaft werden mindestens 20 m/z-Quotienten, bevorzugt mindestens 40 m/z-Quotienten, besonders bevorzugt mindestens 60 m/z- Quotienten, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 m/z-Quotienten unterschiedlicher Ionen oder mehr identifiziert und/oder quantifiziert. During an analysis, in the method according to the invention between 1 and 100 mass / charge quotients different in step (a) the ions formed and selected are analyzed. At least 20 m / z quotients are advantageous at least 40 m / z quotients, particularly preferably at least 60 m / z Quotients, very particularly preferably at least 80 m / z quotients different ions or more identified and / or quantified.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können vorteilhaft neben der Analyse aller in einem Substanzgemisch vorhandenen Massen auch einzelne Substanzen bzw. deren Massen analysiert und vorteilhaft quantifiziert werden. Using the method according to the invention can be advantageous in addition to the analysis of all existing in a mixture of substances Masses also analyzed individual substances or their masses and can be quantified advantageously.

Eine Reinigung der Substanzgemische ist im erfindungsgemäßen Verfahren prinzipiell nicht erforderlich. Die Substanzgemische können direkt nach Einbringung in eine Ionenquelle gemessen werden. Dies gilt auch für komplexe Substanzgemische. Auch müssen den Substanzgemischen als interne Standards keine markierten oder unmarkierten Reinsubstanzen möglicher in den Gemischen enthaltenden Substanzen zugesetzt werden obwohl dies natürlich möglich ist und eine anschließende Quantifizierung der in den Gemischen enthaltenden Substanzen vereinfacht. A cleaning of the substance mixtures is in the invention In principle, the procedure is not required. The substance mixtures can be measured immediately after being placed in an ion source. This also applies to complex substance mixtures. Also have to Mixtures of substances not marked as internal standards or unlabeled pure substances possibly contained in the mixtures Substances are added although this is of course possible and a subsequent quantification of the in the mixtures containing substances simplified.

Eine Aufreinigung über dem Fachmann bekannte Verfahren wie chromatographische Verfahren ist jedoch von Vorteil. Aufgrund der im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugten Ionisationsmethode über eine Zerstäubung der Substanzgemische im elektrischen Feld läßt sich eine Auf- und/oder Vorreinigung der Substanzgemische beispielsweise über eine Chromatographie sehr einfach an die massenspektrometrische Analyse ankoppeln. Als chromatographische Verfahren können dabei alle dem Fachmann bekannte Trennmethoden wie LC-, HPLC- oder Kapillarelektrophorese- verwendet werden. Trennverfahren, die auf der Adsorptions-, Gelpermeations-, Ionenpaar-, Ionenaustausch-, Ausschluss-, Affinitäts-, Normalphasen- oder Reversed Phase-Chromatographie basieren, um nur einige mögliche zu nennen, können verwendet werden. Vorteilhaft werden Normalphasen- und/oder Reversed-Phase basierende Chromatographien, bevorzugt Reversed-Phase-Säulen mit unterschiedlichen hydrophobe modifizierten Materialien wie C_4,-, C₈-, oder C₁₈-Phasen verwendet. Purification by methods known to those skilled in the art, such as chromatographic methods, is, however, advantageous. On account of the ionization method preferred in the process according to the invention by atomizing the substance mixtures in an electric field, a purification and / or pre-purification of the substance mixtures can be coupled very easily to the mass spectrometric analysis, for example by means of chromatography. All separation methods known to the person skilled in the art, such as LC, HPLC or capillary electrophoresis, can be used as the chromatographic method. Separation methods based on adsorption, gel permeation, ion pair, ion exchange, exclusion, affinity, normal phase or reversed phase chromatography, to name but a few, can be used. Chromatographies based on normal phase and / or reversed phase, preferably reversed phase columns with different hydrophobic modified materials such as C ₄ , C ₈ or C ₁₈ phases are advantageously used.

Im erfindungsgemäßen Verfahren ist eine Kopplung von Aufreinigungsmethoden vorteilhaft von Chromatographiemethoden mit einer Fließgeschwindigkeit des Eluenten (Analyten + Lösungsmittel) vorteilhaft zwischen 1 µl/min bis 2000 µl/min. bevorzugt zwischen 5 µl/min bis 600 µl/min. besonders bevorzugt zwischen 10 µl/min bis 500 µl/min beispielsweise möglich. Auch geringere oder höhere Fließgeschwindigkeiten können ohne Schwierigkeiten im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In the method according to the invention, a coupling of Purification methods advantageous from chromatography methods with a Flow rate of the eluent (analyte + solvent) advantageous between 1 µl / min to 2000 µl / min. preferably between 5 µl / min to 600 µl / min. particularly preferably between 10 ul / min up to 500 µl / min possible, for example. Even lower or higher Flow rates can be in the method according to the invention can be used.

Als Lösungsmittel für das Aufreinigungsverfahren können prinzipiell alle protischen oder aprotischen polaren oder unpolaren Lösungsmittel verwendet werden, die mit der anschließenden Analytik kompatibel sind. Ob ein Lösungsmittel mit der Massenspektrometrie kompatibel ist, kann der Fachmann durch einfache Stichversuche leicht ermitteln. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Lösungsmittel, die keine oder wenig Ladungen tragen, wie aprotische apolare Lösungsmittel, die durch eine niedrige Dielektrizitätskonstanten (E_τ < 15), niedrige Dipolmomente (µ < 2,5 D) und niedrige E_T ^N-Werte (0,0-0,5) charakterisiert sind. Aber auch dipolare organische Lösungsmittel oder deren Mischungen sind als Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Als geeignete Lösungsmittel sind seien hier beispielhaft Methanol, Ethanol, Acetonitril, Ether, Heptan genannt. Auch schwache saure Lösungsmittel wie 0,01-0,1% Ameisensäure, Essigsäure oder Trifluoressigsäure sind geeignet. Weiterhin sind auch schwach basische Lösungsmittel wie 0,01-0,1% Triethylamin oder Ammoniak geeignet. Auch stark saure oder stark basische Lösungsmittel wie 5%ige HCL oder 5%iges Triethylamin sind prinzipiell als Lösungsmittel geeignet. Auch Mischungen der vorgenannten Lösungsmittel sind vorteilhaft. Auch die in der Biochemie üblichen Puffer sind als Lösungsmittel geeignet, wobei vorteilhaft Puffer < 200 mM, bevorzugt < 100 mM, besonders bevorzugt < 50 mM, ganz besonders bevorzugt < 20 mM verwendet werden. Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn Puffer > 100 mM für die Herstellung der Substanzgemische verwendet werden, dass die Puffer beispielsweise über eine Dialyse ganz oder teilweise entfernt werden. Als Puffer seien beispielsweise Acetat-, Formiat-, Phosphat-, Tris-, MOPS-, HEPES- oder deren Mischungen genannt. Hohe Puffer und/oder Salzkonzentrationen beeinflussen die Ionisationsprozesse negativ und sind gegebenenfalls zu vermeiden. In principle, all protic or aprotic polar or non-polar solvents which are compatible with the subsequent analysis can be used as solvents for the purification process. The person skilled in the art can easily determine whether a solvent is compatible with mass spectrometry by simple puncture tests. Suitable solvents are, for example, solvents that carry little or no charges, such as aprotic apolar solvents, which have a low dielectric constant (E _τ <15), low dipole moments (µ <2.5 D) and low E _T ^N values (0, 0-0.5) are characterized. Dipolar organic solvents or mixtures thereof are also suitable as solvents for the process according to the invention. Examples of suitable solvents are methanol, ethanol, acetonitrile, ether and heptane. Weak acidic solvents such as 0.01-0.1% formic acid, acetic acid or trifluoroacetic acid are also suitable. Weakly basic solvents such as 0.01-0.1% triethylamine or ammonia are also suitable. Strongly acidic or strongly basic solvents such as 5% HCL or 5% triethylamine are also suitable in principle as solvents. Mixtures of the abovementioned solvents are also advantageous. The buffers customary in biochemistry are also suitable as solvents, buffers <200 mM, preferably <100 mM, particularly preferably <50 mM, very particularly preferably <20 mM being used advantageously. It is also advantageous, if buffers> 100 mM are used for the preparation of the substance mixtures, that the buffers are completely or partially removed, for example by dialysis. Acetate, formate, phosphate, tris, MOPS, HEPES or mixtures thereof may be mentioned as buffers. High buffers and / or salt concentrations negatively influence the ionization processes and should be avoided if necessary.

Im erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Moleküle, die in den Substanzgemischen enthalten sind, von 100 Dalton (= D) bis 100 Kilodalton (= kD), bevorzugt von 100 D bis 20 kD, besonders bevorzugt von 100 D-10 kD, ganz besonders bevorzugt von 100 D bis 2000 D nachweisen, das heißt identifizieren und gegebenenfalls auch quantifizieren. In the method according to the invention, molecules that are in the Mixtures of substances are included, from 100 Daltons (= D) to 100 Kilodalton (= kD), preferably from 100 D to 20 kD, particularly preferably from 100 D-10 kD, very particularly preferably from 100 D up to 2000 D, that is, identify and if necessary, also quantify.

Vorteilhaft können die Substanzgemische für das erfindungsgemäße Verfahren, die sonst nur schlecht oder gar nicht nachweisbar sind vor der Analyse derivatisiert werden und so schließlich analysiert werden. Eine Derivatisierung ist besonders vorteilhaft in Fällen, in denen in hydrophobe bzw. flüchtige Verbindungen beispielsweise wie Ester, Amide, Lactone, Aldehyde, Ketone, Alkohole etc. hydrophile Gruppen eingeführt werden, die vorteilhaft noch eine ionisierbare Funktionalität tragen. Beispiele für derartige Derivatisierungen sind Umsetzungen von Aldehyden oder Ketonen zu Oximen, Hydrazonen oder deren Derivate oder Alkoholen zu Estern beispielsweise mit symmetrischen oder gemischten Anydriden. Dadurch kann das Nachweisspektrum des Verfahrens vorteilhaft erweitert werden. The substance mixtures can be advantageous for the invention Procedures that are otherwise difficult or impossible to detect be derivatized before analysis and so finally to be analyzed. Derivatization is particularly advantageous in Cases where in hydrophobic or volatile compounds for example like esters, amides, lactones, aldehydes, ketones, alcohols etc. hydrophilic groups are introduced, which are still advantageous wear ionizable functionality. Examples of such Derivatizations are reactions of aldehydes or ketones Oximes, hydrazone or their derivatives or alcohols to esters for example with symmetrical or mixed anhydrides. As a result, the detection spectrum of the method can be advantageous be expanded.

Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse der Substanzgemische ein interner Standard wie z. B. Peptide, Aminosäuren, Coenzyme, Zucker, Alkohole, konjugierte Alkene, organische Säuren oder Basen zugesetzt. Dieser interne Standard ermöglicht vorteilhaft die Quantifizierung der Verbindungen im Gemisch. Im Substanzgemisch enthaltende Substanzen können so leichter analysiert und letztlich quantifiziert werden. Is advantageous in the inventive method for analyzing the Substance mixtures an internal standard such as B. peptides, Amino acids, coenzymes, sugars, alcohols, conjugated alkenes, added organic acids or bases. This internal standard advantageously enables the quantification of the compounds in the Mixture. Substances contained in the substance mixture can thus easier to analyze and ultimately quantify.

Als internen Standard werden vorteilhaft markierte Substanzen verwendet, prinzipiell sind aber auch nicht markierte Substanzen als interner Standard geeignet. Derartige ähnliche chemische Verbindungen sind beispielsweise sogenannten Verbindungen einer homologen Reihe, deren Mitglieder sich nur durch beispielsweise eine zusätzliche Methylengruppe unterscheiden. Als interner Standard werden bevorzugt durch mindestens ein Isotop ausgewählt aus der Gruppe ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³³S, ³⁴S, ³⁶S, ³⁵Cl, ³⁷Cl, ²⁹Si, ³⁰Si, ⁷⁴Se oder deren Mischungen markierte Substanzen verwendet. Bevorzugt wird aus Kostengründen und aus Gründen der Zugänglichkeit ²H oder ¹³C als Isotop verwendet. Diese internen Standard brauchen für die Analyse nicht komplett, das heißt vollmarkiert zu sein. Eine Teilmarkierung ist völlig ausreichend. Vorteilhaft wird auch im Falle eines markierten internen Standards eine Substanz gewählt, die eine möglichst hohe Homologie zu den im Gemisch zu analysierenden Substanzen, das heißt strukturelle Ähnlichkeit, zu der zu messenden chemischen Verbindung hat. Je höher die strukturelle Ähnlichkeit ist, desto besser sind die Messergebnisse und desto genauer kann eine Quantifizierung der Verbindung erfolgen. Labeled substances are advantageously used as the internal standard, but in principle non-labeled substances are also suitable as the internal standard. Similar chemical compounds of this type are, for example, so-called compounds of a homologous series whose members differ only by, for example, an additional methylene group. As an internal standard, at least one isotope is preferably selected from the group ² H, ¹³ C, ¹⁵ N, ¹⁷ O, ¹⁸ O, ³³ S, ³⁴ S, ³⁶ S, ³⁵ Cl, ³⁷ Cl, ²⁹ Si, ³⁰ Si, ⁷⁴ Se or their mixtures of labeled substances are used. ² H or ¹³ C is preferably used as the isotope for reasons of cost and for reasons of accessibility. These internal standards do not need to be complete for analysis, that is, they must be fully marked. A partial marking is completely sufficient. In the case of a marked internal standard, it is also advantageous to choose a substance which has the highest possible homology to the substances to be analyzed in the mixture, that is to say structural similarity, to the chemical compound to be measured. The higher the structural similarity, the better the measurement results and the more accurately the connection can be quantified.

Für das erfindungsgemäße Verfahren und besonders für die Quantifizierung der im Gemisch vorhandenen Substanzen ist es vorteilhaft den internen Standard in einem günstigen Verhältnis zu der zu messenden Substanz einzusetzen. Verhältnisse von Analyt (= zu bestimmende Verbindung) zu internem Standard größer 1 : 15 führen zu keiner Verbesserung der Messergebnisse, sind jedoch prinzipiell möglich. Vorteilhaft wird ein Verhältnis von Analyt zu internem Standard in einem Bereich von 10 : 1 bis 6 : 1 eingestellt, bevorzugt in einem Bereich von 6 : 1 bis 4 : 1, besonders bevorzugt in einem Bereich von 2 : 1 bis 1 : 1. For the inventive method and especially for the It is quantification of the substances present in the mixture advantageous the internal standard in a favorable relation to the substance to be measured. Ratios of analyte (= to determining connection) lead to an internal standard greater than 1:15 to no improvement of the measurement results, however in principle possible. A ratio of analyte to is advantageous internal standard set in a range from 10: 1 to 6: 1, preferably in a range from 6: 1 to 4: 1, particularly preferably in a range from 2: 1 to 1: 1.

Die Substanzgemischproben im erfindungsgemäßen Verfahren können manuell oder vorteilhaft automatisch mit üblichen Laborrobotern vorbereitet werden. Auch die Analyse mit dem Massenspektrometer nach gegebenenfalls chromatographischer Auftrennung kann manuell oder vorteilhaft automatisch durchgeführt werden. Durch die Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Massenspektrometrie vorteilhaft zum schnellen Screening von verschiedenen Substanzgemischen beispielsweise Pflanzenextrakten im sogenannten High-Throughput-Screening verwendet werden. Dabei zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch eine hohe Empfindlichkeit, eine gute Quantifizierbarkeit, einer hervorragenden Reproduzierbarkeit, bei geringstem Probenverbrauch aus. Mit der Methode können also rasch Gemische biologischen Usprungs beispielsweise neue Mutanten bekannter oder unbekannter enzymatischer Aktivitäten nach einer Mutagenese beispielsweise nach einer klassischen Mutagenese mit chemischen Agentien wie NTG, Strahlung wie W-Strahlung oder Röntgenstrahlung oder nach einer sogenannten sitedirekted mutagenesis, PCR-Mutagenese, Transposon-Mutagenese oder dem sogenannten gene shuffling gefunden werden. The substance mixture samples in the method according to the invention can manually or advantageously automatically with conventional laboratory robots to get prepared. Even analysis with the mass spectrometer after chromatographic separation, if necessary, manually or advantageously be carried out automatically. Through the Automation of the method according to the invention can Mass spectrometry advantageous for the rapid screening of different Mixtures of substances, for example plant extracts in the so-called High-throughput screening can be used. It stands out the method according to the invention due to its high sensitivity, good quantifiability, excellent Reproducibility, with the lowest sample consumption. With the method can quickly mixes of biological origin, for example, new ones Mutants of known or unknown enzymatic activities after a mutagenesis, for example after a classic one Mutagenesis with chemical agents like NTG, radiation like UV radiation or X-rays or according to a so-called site direct mutagenesis, PCR mutagenesis, transposon mutagenesis or the so-called gene shuffling can be found.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Analyse einer breiten Palette von Substanzen in einem weiten Messbereich, bei guter bis sehr guter Auflösung, bei einer hohen Ionentransmission von der Quelle zum Detektor, einer hohen Scan-Geschwindigkeit sowohl im Full Scan-Modus aller Substanzen in den Substanzgemischen als auch im multiple reaction monitoring-Modus [= MRM, Verfahrensschritte (a) bis (c)]. Weiterhin hat das Verfahren eine sehr hohe Aufnahmeempflindlichkeit und eine hervorragende Kallibrierungsstabilität. Weiterhin ist es für den Dauerbetrieb und damit für die Anwendung in einem HTS-Screening ausgezeichnet geeignet. The method according to the invention enables the analysis of a wide range of substances in a wide measuring range, with good to very good resolution, with a high ion transmission of the source to the detector, a high scanning speed both in full scan mode of all substances in the substance mixtures as also in multiple reaction monitoring mode [= MRM, Process steps (a) to (c)]. Furthermore, the process has a very high one Sensitivity and excellent Kallibrierungsstabilität. Furthermore, it is for continuous operation and therefore for the application in an HTS screening is excellently suited.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert: The invention is illustrated by the following examples:

BeispieleExamples 1. Beispiele MRM + FS-Messungen1. Examples of MRM + FS measurements a) TIC der MRM + FS-Messunga) TIC of the MRM + FS measurement

In Fig. 2 ist das Total Ion Chromatogram einer MRM + Full Scan- Messung [MRM = Multiple Reaction Monitoring, FS = Full Scan, TIC = Total Ion Chromatogram, XIT = Summe mehrerer Total Ion Chromatogramme] dargestellt. Gemessen wurde ein Qualitätskontrollprobe. Diese Art von Probe enthält eine definierte Anzahl an Analyten. Diese Analyten wurden käuflich erworben und in bekannten Konzentrationen in geeignetem Lösungsmittel gelöst. In FIG. 2, the Total Ion Chromatogram is shown an MRM + Full scan measurement [MRM = multiple reaction monitoring, FS = Full scan, TIC = total ion chromatogram XIT = sum of several Total ion chromatograms]. A quality control sample was measured. This type of sample contains a defined number of analytes. These analytes were purchased and dissolved in known concentrations in a suitable solvent.

Die in Fig. 2 gewählte Darstellung der Messung zeigt die Aufsummierung der am Detektor zu den jeweiligen Zeitpunkten (x-Achse) gemessenen Intensitäten (y-Achse) aus den beiden massenspektrometrischen Experimenten des Multiple Reaction Monitoring (MRM) und des Full Scan (FS). Das Chromatogram in Fig. 2 stellt also die Summe der TIC-Chromatogramne der beiden o. g. genannten massenspektrometrischen Experimenten dar. The representation of the measurement selected in FIG. 2 shows the summation of the intensities (y-axis) measured on the detector at the respective times (x-axis) from the two mass spectrometric experiments of multiple reaction monitoring (MRM) and full scan (FS). , The chromatogram in FIG. 2 thus represents the sum of the TIC chromatograms of the two above-mentioned mass spectrometric experiments.

b) TIC des MRM-Experiment und TIC des FS-Experimentb) TIC of the MRM experiment and TIC of the FS experiment

In Fig. 3 ist das Total Ion Chromatogram des MRM-Experiments aus einer MRM + FS-Messung dargestellt. In Fig. 3, the Total Ion Chromatogram of the MRI experiment is represented + FS measurement from an MRM.

Die in Fig. 3 gewählte Darstellung der MRM-Messung zeigt die Aufsummierung der am Detektor zu den jeweiligen Zeitpunkten (x-Achse) gemessenen Intensitäten (y-Achse) aus allen vordefinierten Massenübergängen des MRM-Experiments. Die in Fig. 4 gewählte Darstellung zeigt die jeweiligen Messergebnisse jedes einzelnen Massenübergangs (hier 30 Stück) in einem Koordinatenkreuz. The representation of the MRM measurement selected in FIG. 3 shows the summation of the intensities (y axis) measured on the detector at the respective times (x axis) from all predefined mass transitions of the MRM experiment. The representation selected in FIG. 4 shows the respective measurement results of each individual mass transition (here 30 pieces) in a coordinate cross.

Claims (13)

1. Massenspektrometrisches Verfahren zur Analyse von Substanzgemischen mit einem Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer,
wobei die Substanzgemische vor der Analyse ionisiert werden,
dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) eines durch Ionisation entstandenen Ions in einem ersten analytischen Quadrupol (I) des Massenspektrometers, b) Fragmentieren des unter (a) ausgewählten Ions unter Anlegung einer Beschleunigungsspannung in einem weiteren folgenden Quadrupol (II), das mit einem Kollisionsgas gefüllt ist und als Kollisionskammer fungiert, c) Auswählen eines Masse/Ladungs-Quotient eines durch die Fragmentierung (b) entstandenen Ions in einem weiteren nachfolgenden Quadrupol (III), wobei die Verfahrensschritte (a) bis (c) mindestens einmal durchlaufen werden und d) Analysieren der Masse/Ladungs-Quotienten aller im Substanzgemisch durch die Ionisation vorhandenen Ionen, wobei das Quadrupol (II) mit Kollisionsgas gefüllt ist, jedoch während der Analyse keine Beschleunigungsspannung angelegt ist; wobei die Schritt (a) bis (c) und der Schritt (d) auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden können. 1. mass spectrometric method for the analysis of substance mixtures with a triple quadrupole mass spectrometer,
the substance mixtures are ionized before analysis,
characterized in that the method comprises the following steps: a) selecting a mass / charge quotient (m / z) of an ion formed by ionization in a first analytical quadrupole (I) of the mass spectrometer, b) fragmenting the ion selected under (a) by applying an acceleration voltage in a further subsequent quadrupole (II) which is filled with a collision gas and acts as a collision chamber, c) selecting a mass / charge quotient of an ion formed by the fragmentation (b) in a further subsequent quadrupole (III), the process steps (a) to (c) being carried out at least once and d) analyzing the mass / charge quotients of all ions present in the mixture of substances by the ionization, the quadrupole (II) being filled with collision gas, but no acceleration voltage being applied during the analysis; wherein steps (a) to (c) and step (d) can also be carried out in the reverse order. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionisation des Substanzgemisches eine chromatographische Auftrennung vorgeschaltet ist. 2. The method according to claim 1, characterized in that the Ionization of the substance mixture a chromatographic Separation is upstream. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der chromatographischen Auftrennung um eine HPLC-Auftrennung handelt. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the chromatographic separation is a HPLC separation is. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) bis (d) innerhalb von 0,1 bis 10 Sekunden mindestens einmal durchlaufen werden. 4. The method according to claims 1 to 3, characterized characterized in that steps (a) to (d) are within 0.1 to 10 seconds at least once. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a) bis (d) innerhalb von 0,2 bis 2 Sekunden mindestens einmal durchlaufen werden. 5. The method according to claims 1 to 4, characterized characterized in that steps (a) to (d) are within 0.2 to Run through at least once for 2 seconds. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisation durch Verdampfung des Substanzgemisches und Ionisation in der Gasphase, durch Desorption des Substanzgemisches an einer Oberfläche oder durch Zerstäubung des Substanzgemisches im elektrischen Feld erfolgt. 6. The method according to claims 1 to 5, characterized characterized in that the ionization by evaporation of the Substance mixture and ionization in the gas phase, by desorption of the mixture of substances on a surface or through The mixture of substances is atomized in an electrical field. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisation durch Zerstäubung des Substanzgemisches im elektrischen Feld erfolgt. 7. The method according to claims 1 to 6, characterized characterized in that the ionization by atomization of the Mixture of substances takes place in the electric field. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) zwischen 1 und 100 Masse/Ladungs- Quotienten verschiedener durch Ionisation entstandener und ausgewählter Ionen analysiert wird. 8. The method according to claims 1 to 7, characterized characterized in that in step (a) between 1 and 100 mass / charge Quotients of different ionization and selected ions is analyzed. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Substanzgemisch biologischen oder chemischen Ursprungs ist. 9. The method according to claims 1 to 8, characterized characterized that the mixture of substances biological or chemical Is of origin. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzgemische vor der Analyse oder vor der chromatographischen Auftrennung nach Anspruch 2 oder 3 derivatisiert werden. 10. The method according to claims 1 to 9, characterized characterized that the substance mixtures before the analysis or before the chromatographic separation according to claim 2 or 3 be derivatized. 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren manuell oder automatisch durchgeführt wird. 11. The method according to claims 1 to 10, characterized characterized that the procedure is carried out manually or automatically becomes. 12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem High Throughput Screening verwendet wird. 12. The method according to claims 1 to 11, characterized characterized that the procedure in a high throughput screening is used. 13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (c) analysierte Ionfragment und die in Schritt (d) analysierten (m/z)-Quotienten aller im Substanzgemisch vorhandenen Ionen oder das in Schritt (c) analysierte Ionfragment oder die in Schritt (d) analysierten (m/z)-Quotienten aller im Substanzgemisch vorhandenen Ionen quantifiziert werden. 13. The method according to claims 1 to 12, characterized characterized in that the ion fragment analyzed in step (c) and the (m / z) quotients of all im analyzed in step (d) Mixture of ions present or that in step (c) analyzed ion fragment or those analyzed in step (d) (m / z) quotients of all ions present in the substance mixture be quantified.