DE102023002232B3

DE102023002232B3 - Perfusion plate meander bioreactor for cell expansion

Info

Publication number: DE102023002232B3
Application number: DE102023002232.2A
Authority: DE
Inventors: Hans Hoffmeister; Rainer Mausolf
Original assignee: ZELLWERK GmbH
Current assignee: ZELLWERK GmbH
Priority date: 2023-06-01
Filing date: 2023-06-01
Publication date: 2024-06-13
Anticipated expiration: 2043-06-02

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor für die Expansion von Zellen, insbesondere von nicht adhärenten wachsenden Zellen, wie nicht wachsende adhärente T- Lymphozyten oder invariante T- Lymphozyten und NK-Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), wobei im Perfusions-Plattenmäander- Bioreaktor die Kulturmedien zu den Overlay- Medien im Gegenstrom geführt sind. Der Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor besteht aus eine Bioreaktorgefäß 1, in dem mehrere übereinander angeordnete Kultivierungsträger 7 mit durch Stege 13 gebildete Gerinne 10, mit einem oder mehreren Überläufe 14 sowie mit vor den Überläufen 14 angeordneten Überlaufsteg 33 über Spannmuttern 9 und einem Spannbügel 8 befestigt sind, wobei die Kultivierungsträger 7 untereinander um 180° verdreht sind. Über Luer- Lock-Verbinder werden die Overlay-Medien und das Kulturmedium geregelt zu- und abgeführt.The invention relates to a perfusion plate meander bioreactor for the expansion of cells, in particular non-adherent growing cells, such as non-growing adherent T lymphocytes or invariant T lymphocytes and NK cells, but also other immune cells, e.g. tumor-infiltrated NK cells (TINK) and mucous membrane-associated invariant T cells (MAIT), wherein in the perfusion plate meander bioreactor the culture media are guided in countercurrent to the overlay media. The perfusion plate meander bioreactor consists of a bioreactor vessel 1 in which several cultivation supports 7 arranged one above the other with channels 10 formed by webs 13, with one or more overflows 14 and with overflow webs 33 arranged in front of the overflows 14 are fastened via clamping nuts 9 and a clamping bracket 8, wherein the cultivation supports 7 are rotated by 180° relative to one another. The overlay media and the culture medium are supplied and removed in a controlled manner via Luer-Lock connectors.

Description

Die Erfindung betrifft einen Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor für die Expansion von Zellen, insbesondere von nicht adhärent wachsenden Zellen, wie nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten oder invariante T- Lymphozyten oder NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), wobei das Kulturmedium von den Overlay- Medien an der Oberfläche überströmt wird und das Gasgemisch bei diesem Überströmungsprozess in das Kulturmedium diffundiert, so dass das durch das Zellwachstum verbrauchte Overlay- Medium kontinuierlich ersetzt wird.The invention relates to a perfusion plate meander bioreactor for the expansion of cells, in particular non-adherently growing cells, such as non-adherently growing T lymphocytes or invariant T lymphocytes or NK cells, but also other immune cells, e.g. tumor-infiltrated NK cells (TINK) and mucous membrane-associated invariant T cells (MAIT), wherein the culture medium is overflowed by the overlay media on the surface and the gas mixture diffuses into the culture medium during this overflow process, so that the overlay medium consumed by the cell growth is continuously replaced.

Die CN 10 806 0081 A beschreibt einen mehrschichtigen Flachplatten- Bioreaktor. Der mehrschichtige Bioreaktor für flache Platten besteht aus einem Hohlraum und einem Kulturmechanismus, wobei der Kulturmechanismus in einem Behälter angeordnet ist und aus mehreren Schichten flacher Platten besteht. Ein Kulturflüssigkeitseinlassrohr und ein Kulturflüssigkeitsaustragsrohr sind auf dem Behälter angeordnet. Der Behälter ist in einen Kultivierungsraum und einen Pufferraum unterteilt. Der Kulturmechanismus ist in dem Kultivierungsraum angeordnet. Ein Auslass des Kulturflüssigkeitseinlassrohrs erstreckt sich bis zu einer Position unterhalb des mittleren Teils des Pufferraums. Der obere Teil des Pufferraums kommuniziert mit dem Kulturhohlraum. Die Erfindung zielt darauf ab, den Bioreaktor bereitzustellen, der für zellgroße In-vitro-Kultur verwendet werden kann und eine gleichmäßigere Fließfeldscherkraftumgebung für die Zellkultur bietet.The CN108060081A describes a multilayer flat plate bioreactor. The multilayer flat plate bioreactor is composed of a cavity and a culture mechanism, the culture mechanism being arranged in a container and consisting of multiple layers of flat plates. A culture liquid inlet pipe and a culture liquid discharge pipe are arranged on the container. The container is divided into a culture space and a buffer space. The culture mechanism is arranged in the culture space. An outlet of the culture liquid inlet pipe extends to a position below the middle part of the buffer space. The upper part of the buffer space communicates with the culture cavity. The invention aims to provide the bioreactor that can be used for cell-sized in vitro culture and provides a more uniform flow field shear force environment for cell culture.

In der WO 2017 025 620 A1 wird ein Bioreaktor zur Kultivierung und/oder Züchtung künstlicher oder natürlicher Gewebe offenbart, der eine obere Platte und eine Bodenplatte aufweist. Die obere und die untere Platte bilden zusammen eine Perfusionskammer zur Aufnahme und Unterstützung eines künstlichen oder natürlichen Gewebes, wobei die obere Platte eine Vielzahl von Einlassstrukturen und eine Vielzahl von Auslassstrukturen umfasst. Die Einlass- und Auslassstrukturen stehen in flüssiger Kommunikation mit der Perfusionskammer, um den Fluss von mindestens einem Medium durch die Perfusionskammer zu ermöglichen. Die Bodenplatte umfasst weiter einen höhenverstellbaren Teil zur Einstellung des Volumens der Perfusionskammer.In the WO 2017 025 620 A1 discloses a bioreactor for culturing and/or growing artificial or natural tissues, comprising an upper plate and a bottom plate. The upper and lower plates together form a perfusion chamber for receiving and supporting an artificial or natural tissue, the upper plate comprising a plurality of inlet structures and a plurality of outlet structures. The inlet and outlet structures are in fluid communication with the perfusion chamber to enable the flow of at least one medium through the perfusion chamber. The bottom plate further comprises a height-adjustable part for adjusting the volume of the perfusion chamber.

Die US 49 31 401A - beschreibt einen Bioreaktor zur biochemischen Behandlung von Flüssigkeiten, die organische Stoffe enthalten. Er besteht aus einem Behälter mit einem Einlass zur Aufnahme von Flüssigkeit, die mit mindestens einer horizontalen Platte behandelt werden soll, um ein Bett von Mikroorganismenzellen zu unterstützen, die mit der organischen Substanz reagieren, um ein flüchtiges Gas zu bilden. Eine Öffnung ist in der Platte vorgesehen, um die Flüssigkeitsflusskommunikation zwischen den oberen und unteren Fächern auf beiden Seiten der Platte zu gewährleisten. Ein Blockierungselement erstreckt sich über die Öffnung, um zu verhindern, dass die Flüssigkeit und die Mikroorganismenzellen durch die Öffnung in das untere Kompartiment zurückkehren. Ein Auslass ist für die Freisetzung des Gases aus dem Behälter vorgesehen, während ein weiterer Auslass für die Freisetzung der behandelten Flüssigkeit verwendet wirThe US 49 31 401A - describes a bioreactor for the biochemical treatment of liquids containing organic matter. It consists of a vessel having an inlet for receiving liquid to be treated with at least one horizontal plate to support a bed of microorganism cells which react with the organic matter to form a volatile gas. An opening is provided in the plate to ensure liquid flow communication between the upper and lower compartments on either side of the plate. A blocking element extends across the opening to prevent the liquid and microorganism cells from returning to the lower compartment through the opening. An outlet is provided for the release of the gas from the vessel, while another outlet is used for the release of the treated liquid.

In der US 10 590 374 B2 wird ein Bioreaktorsystem offenbart, bestehend aus einem geschlossenen Kulturgefäß, wobei das Kulturgefäß mehrere Schalen besitzt, die mindestens zwei rechteckige Zellkulturfächer mit einem Deckel, einem Boden, zwei Seiten und zwei Enden umfasst, die in einer gestapelten Ausrichtung zueinander angeordnet und so konfiguriert sind, dass sich Zellen als Monoschicht auf der Unterseite anheften und wachsen können. Das Kulturgefäß weist mindestens einen Anschluss für Medium oder Gas in und aus dem Behälter auf, wobei für jedes Zellkulturfach das Gas/Fluid-Kommunikation zwischen allen Zellkulturfächern über einem Gas/Fluid-Strömungsweg erfolgt, damit Gas/Flüssigkeit durch einen Verteiler und in jedes Zellkulturfach fließen kann; einem Längsstützgefäß, wobei ein Rohr so positioniert ist, dass es entlang einer Längsachse des Rohres liegt und das Rohr Enden mit mindestens einer Endöffnung hat, damit Kulturmaterial oder-gas in das Rohr ein- oder ausströmen können; einer Plattform, die so konfiguriert ist, dass sie mindestens ein geschlossenes Kulturgefäß hält, sichert und manipuliert, wobei die Plattform eine Wippenplattform ist, die entlang der Achse senkrecht zum Drehpunkt mit einem Neigungswinkel von weniger als 90 Grad auf jeder Seite des Drehpunktes geschwenkt ist und der Drehpunkt auf dem Rohr befestigt ist und eine treibende und rotierende Baugruppe, die so konfiguriert ist, dass die Position des Stützgefäßes und des Kulturgefäßes um die Längsachse des Rohrs in einer Winkelposition von weniger als 360 Grad und während einer Haltezeit gedreht und geändert wird, wobei die Achse senkrecht zur ersten Achse steht, die von der Wippenplattform geschwungen wird.In the US 10 590 374 B2 discloses a bioreactor system comprising a closed culture vessel, the culture vessel having a plurality of trays comprising at least two rectangular cell culture compartments having a lid, a bottom, two sides and two ends arranged in a stacked orientation relative to one another and configured to allow cells to attach and grow as a monolayer on the bottom. The culture vessel has at least one port for medium or gas into and out of the vessel, wherein for each cell culture compartment, gas/fluid communication between all cell culture compartments occurs via a gas/fluid flow path to allow gas/liquid to flow through a manifold and into each cell culture compartment; a longitudinal support vessel, wherein a tube is positioned to lie along a longitudinal axis of the tube and the tube has ends with at least one end opening to allow culture material or gas to flow into or out of the tube; a platform configured to hold, secure and manipulate at least one closed culture vessel, the platform being a rocker platform pivoted along the axis perpendicular to the pivot point at an angle of inclination of less than 90 degrees on each side of the pivot point, the pivot point being fixed to the tube, and a driving and rotating assembly configured to rotate and change the position of the support vessel and the culture vessel about the longitudinal axis of the tube at an angular position of less than 360 degrees and during a holding time, the axis being perpendicular to the first axis swung by the rocker platform.

In der DE 42 06 585 A1 wird ein Gerät zur Behandlung von Zellkulturen, insbesondere Hepatozyten beschrieben, wobei auf plattenartigen Kulturobjektträgern zumindest ein Teil der Oberflächen dieser Objektträger gaspermeabel ist und Sauerstoff in sie eingebracht werden kann. Auf den Kulturträgern wird eine Beschichtung aus Kollagen aufgetragen, auf oder in der sich die Zellkultur befindet. Der nächste Zellkulturträger ist dicht über der Kollagenbeschichtung angeordnet. Das Kulturmedium kann in den Raum zwischen der Kollagenbeschichtung und dem nächsten Kulturträger eingebracht werden.In the DE 42 06 585 A1 A device for treating cell cultures, in particular hepatocytes, is described, whereby at least part of the surface of plate-like culture slides is gas-permeable and oxygen can be introduced into them. A coating of collagen is applied to the culture slides, on or in which the cell culture is located. The next cell culture slide is arranged close to the collagen coating. The culture medium can into the space between the collagen coating and the next culture carrier.

Die DE 69 434 052 T2 offenbart eine Vorrichtung für das Abscheiden von Säugetier-Zellen aus einer Zellüberstandsflüssigkeit unter aseptischen oder sterilen Bedingungen, wobei die Vorrichtung aus einem Kastenelement besteht, das aus Mitteln, die mehrere entfernbare, aus spiegelpoliertem rostfreiem Stahl erzeugte Platten bilden und die zur Vertikalen geneigt sind, besteht und Mittel aufweist, die bewirken, dass Flüssigkeit, in der die Zellen enthalten sind, nach oben über die Platten mit einer solchen Geschwindigkeit fließt, dass die Zellen von der Flüssigkeit abgeschieden werden können, um Sedimentschichten auf den Platten zu bilden und an diesen hinunterzugleiten, wobei die Platten in einem Gehäuse enthalten sind, das mit einem am Boden der Platten angeordneten Einlass für Flüssigkeiten, in der die abzuscheidenden Zellen enthalten sind, einem Auslass für Flüssigkeit, aus den Zellen ausgeschieden wurden und einem Sammelauslass für abgeschiedene Zellen ausgestattet ist und wobei jeder Einlass und jeder Auslass mit einem Sanitärverbinder versehen ist,The EN 69 434 052 T2 discloses an apparatus for separating mammalian cells from a cell supernatant fluid under aseptic or sterile conditions, the apparatus comprising a box member comprising means forming a plurality of removable plates made of mirror-polished stainless steel and inclined to the vertical, and having means for causing fluid containing the cells to flow upwards over the plates at such a rate that the cells can be separated from the fluid to form and slide down sediment layers on the plates, the plates being contained in a housing provided with an inlet arranged at the bottom of the plates for fluid containing the cells to be separated, an outlet for fluid from which cells have been separated and a collecting outlet for separated cells, each inlet and each outlet being provided with a sanitary connector,

Die DE 10 2018 000 561 B4 beschreibt einen Mäander- Bioreaktor bestehend aus einen rechteckigen Bioreaktorgefäß aus vorzugsweise klarem Polymermaterial, das mit einem Deckel steril verschlossen ist, wobei dass das Bioreaktorgefäß in drei übereinander angeordneten Kammern unterteilt ist und die unterste Kammer als Underlay- Kammer, die über der Underlay-Kammer angeordnete Kammer als Mäander- Perfusions- Kammer und die über der Mäander- Perfusions- Kammer angeordnete Kammer als Overlay- Kammer ausgebildet sind. Die Underlay- Kammer und die Mäander- Perfusions- Kammer sind durch eine gelochte Bodenplatte mit einer unten an der gelochten Bodenplatte angeordneten semipermeablen Folie voneinander getrennt, wobei Sauerstoff bevorzugt gegenüber anderen Gasen durch die Folie diffundiert.The EN 10 2018 000 561 B4 describes a meander bioreactor consisting of a rectangular bioreactor vessel made of preferably clear polymer material, which is sealed with a sterile lid, wherein the bioreactor vessel is divided into three chambers arranged one above the other and the lowest chamber is designed as an underlay chamber, the chamber arranged above the underlay chamber as a meander perfusion chamber and the chamber arranged above the meander perfusion chamber as an overlay chamber. The underlay chamber and the meander perfusion chamber are separated from one another by a perforated base plate with a semi-permeable film arranged at the bottom of the perforated base plate, with oxygen diffusing through the film preferentially than other gases.

Bei diesem Mäander- Bioreaktor fließt das Kulturmedium horizontal durch die parallel liegenden Mäander- Gerinne, wobei die Züchtung der Anzahl von Zellen begrenzt ist. Um eine hohe Anzahl von Zellen, insbesondere von T- Lymphozyten für eine therapeutische Behandlung zur züchten, ist es erforderlich mehrere Bioreaktoren hintereinander oder parallel zu schalten. Dies erfordert einen hohen apparativen Aufwand mit einem hohen Aufwand zur Erreichung der erforderlichen Sterilität.In this meander bioreactor, the culture medium flows horizontally through the parallel meander channels, whereby the number of cells that can be cultivated is limited. In order to cultivate a large number of cells, especially T lymphocytes for therapeutic treatment, it is necessary to connect several bioreactors in series or in parallel. This requires a high level of equipment and a high level of effort to achieve the required sterility.

In der eigenen früheren DE 10 2022 000 456 B3 wird ein Plattenmäander-Bioreaktor zur Isolierung und Vermehrung von Zellen, insbesondere von adhärent wachsenden mesenchymalen Stroma-Zellen, bestehend aus einem Mäander-Bioreaktorgefäß mit einem Deckel, zwei Seitenwänden , zwei Stirnseiten, einem Boden mit Fußleisten, wobei in dem Plattenmäander- Bioreaktorgefäß mehrere, aber mindestens zwei übereinander, in engen Abstand zueinander, angeordnete, Kultivierungsplatten angeordnet sind, wobei auf den Kultivierungsplatten Stege zur Bildung eines oder mehrerer Gerinne in einem Abstand a voneinander und in einem Abstand b von Stirnwänden angeordnet sind, die Kultivierungsplatten einen oder mehrere Überläufe aufweisen, die Kultivierungsplatten in im Plattenmäander-Bioreaktorgefäß angeordnete Spannbügeln gehalten werden, jede zweite Kultivierungsplatte um 180° mit ihren Überläufen zu der über ihr liegenden Kultivierungsplatte gedreht angeordnet ist und über und unter den Kultivierungsplatten eine obere und eine untere Auffangkammer für das Kulturmedium angeordnet sind. Der Abstand a der Stege voneinander ist so gewählt und die zugeführte und abgeführte Menge an Kulturmedium ist so eingestellt, dass sich in dem Stromfaden, in dem durch die Stege gebildeten Gerinne, eine gemittelte laminare Oberströmung mit einer Froudezahl von 0,1 bis < 0,005 bildet und die Bodenströmung dabei nahe einer Froudezahl 0 verbleibt.Die Kulturmedien und die Overlay- Medien werden über oben im Plattenmäander- Bioreaktor angeordnete und die Kulturmedien über eine unten im Plattenmäander- Bioreaktor angeordnete Schnellverschlusskupplungen im Gleichstromprinzip geführt.In their own former EN 10 2022 000 456 B3 a plate meander bioreactor for isolating and multiplying cells, in particular adherently growing mesenchymal stroma cells, consisting of a meander bioreactor vessel with a lid, two side walls, two end faces, a base with skirting boards, wherein several, but at least two, cultivation plates are arranged one above the other, closely spaced from one another, in the plate meander bioreactor vessel, wherein webs for forming one or more channels are arranged on the cultivation plates at a distance a from one another and at a distance b from end walls, the cultivation plates have one or more overflows, the cultivation plates are held in clamps arranged in the plate meander bioreactor vessel, every second cultivation plate is arranged with its overflows rotated by 180° to the cultivation plate above it, and an upper and a lower collecting chamber for the culture medium are arranged above and below the cultivation plates. The distance a between the webs is selected and the amount of culture medium supplied and removed is adjusted so that an average laminar upper flow with a Froude number of 0.1 to < 0.005 is formed in the flow thread, in the channel formed by the webs, and the bottom flow remains close to a Froude number of 0. The culture media and the overlay media are fed via quick-release couplings arranged at the top in the plate meander bioreactor and the culture media via a quick-release coupling arranged at the bottom in the plate meander bioreactor using the cocurrent principle.

Die Froude-Zahl beschreibt das Verhältnis von Fließgeschwindigkeit und der Ausbreitungsgeschwindigkeit einer Flachwasserwelle. Die Welle breitet sich gleichmäßig in alle Richtungen, also kreisförmig aus und zeigt ein parabelförmiges Muster. Sie gibt keine Auskunft über die Rückvermischung und ermöglicht keine Aussagen darüber, ob und wie stark sich Volumenelemente oder Stoffe, wie die Overlay- Atmosphäre und das Kulturmedium innerhalb eines Reaktors durch die herrschenden Strömungen vermischen und damit auch keine Aussage, ob die Zellen zur Expansion genügend mit den Overlay- Medien versorgt werden.The Froude number describes the relationship between the flow velocity and the propagation speed of a shallow water wave. The wave spreads evenly in all directions, i.e. in a circle, and shows a parabolic pattern. It does not provide any information about backmixing and does not allow any statements to be made about whether and to what extent volume elements or substances, such as the overlay atmosphere and the culture medium within a reactor, are mixed by the prevailing currents, and therefore also does not provide any statement about whether the cells are sufficiently supplied with the overlay media for expansion.

Auch ist es mit den im Stand der Technik beschriebenen Lösungen nicht möglich, nicht adhärenten Zellen, wie nicht adhärenten T- Lymphozyten oder invarianten T-Lymphozyten und NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), in solchen Mengen zu expandieren, die für therapeutischen Anwendungen erforderlich sind, da sie nur ungenügend mit Overlay- Medien versorgt werden können.With the solutions described in the prior art, it is also not possible to expand non-adherent cells, such as non-adherent T lymphocytes or invariant T lymphocytes and NK cells, but also other immune cells, such as tumor-infiltrated NK cells (TINK) and mucosa-associated invariant T cells (MAIT), in the quantities required for therapeutic applications, since they can only be insufficiently supplied with overlay media.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Perfusions- Mäander- Bioreaktor zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe die Mängel aus dem Stand der Technik beseitigt werden und für eine therapeutischen Behandlung genügende Menge an nicht adhärenten wachsenden Zellen, wie nicht adhärenten wachsende T- Lymphozyten oder invarianten T- Lymphozyten und NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) zur Verfügung zu stellen.The object of the invention is to provide a perfusion meander bioreactor which eliminates the shortcomings of the prior art and is suitable for therapeutic To provide sufficient quantities of non-adherent growing cells, such as non-adherent growing T lymphocytes or invariant T lymphocytes and NK cells, but also other immune cells, such as tumor-infiltrated NK cells (TINK) and mucosa-associated invariant T cells (MAIT), for treatment.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch einen Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor gelöst, der aus einem Bioreaktorgefäß 1 aus glasklarem Polymermaterial mit einem Boden 2, einem Deckel 3, Stirnwänden 4 und 5, Seitenwänden 6, und Füßen 17 besteht, wobei im Bioreaktorgefäß 1 mittels Spannmuttern 9 und einem Spannbügel 8 mehrere übereinander angeordnete Kultivierungsträger 7 befestigt sind, auf denen durch Stege 13 gebildete Gerinne 10, ein oder mehrere Überläufe 14 und vor den Überläufen 14 über die gesamte Breite der Kultivierungsträger 7 ein Überlaufsteg 33 mit einer Höhe von 3 bis 5 mm angeordnet sind. Jeder zweite Kultivierungsträger 7 ist mit seinen Überläufen 14 zu dem über ihm liegenden Kultivierungsträger 7 um 180° gedreht und im Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor sind unter den Kultivierungsträgern 7 eine untere Auffangkammer für das Kulturmedium 15 und oberhalb der Kultivierungsplatten 7 eine Overlay- Auffangkammer 24 angeordnet. Das Kulturmedien wird im Bioreaktorgefäß 1 in den Gerinnen 10 auf den Kultivierungsträgern 7 des Bioreaktorgefäßes 1 horizontal geführt und durch die Überläufe 14 sowie über den Überlaufsteg 33 auf den darunterliegenden Kultivierungsträger 7 vertikal mäandrierend von Kultivierungsplatte 7 zu Kultivierungsplatte 7 bis zum Abfluss 23 für das Kulturmedium geführt. Die Overlay-Medien sind zur Gasdiffusion der Overlay- Medien in das Kulturmedium und zur Konstanthaltung der Konzentration der gelösten Overlay- Medien in dem Kulturmedium oberhalb der Oberfläche des Kulturmediums in den Gerinnen 10 bis zur Overlay- Auffangkammer 24 geführt.The object of the invention is achieved by a perfusion plate meander bioreactor which consists of a bioreactor vessel 1 made of crystal-clear polymer material with a bottom 2, a lid 3, end walls 4 and 5, side walls 6, and feet 17, wherein in the bioreactor vessel 1 several cultivation supports 7 arranged one above the other are fastened by means of clamping nuts 9 and a clamping bracket 8, on which channels 10 formed by webs 13, one or more overflows 14 and in front of the overflows 14 over the entire width of the cultivation supports 7 an overflow web 33 with a height of 3 to 5 mm are arranged. Every second cultivation carrier 7 is rotated by 180° with its overflows 14 relative to the cultivation carrier 7 above it, and in the perfusion plate meander bioreactor, a lower collecting chamber for the culture medium 15 is arranged below the cultivation carriers 7 and an overlay collecting chamber 24 is arranged above the cultivation plates 7. The culture media is guided horizontally in the bioreactor vessel 1 in the channels 10 on the cultivation carriers 7 of the bioreactor vessel 1 and is guided through the overflows 14 and over the overflow web 33 onto the cultivation carrier 7 below, meandering vertically from cultivation plate 7 to cultivation plate 7 to the outlet 23 for the culture medium. The overlay media are guided in the channels 10 to the overlay collection chamber 24 for gas diffusion of the overlay media into the culture medium and for maintaining the concentration of the dissolved overlay media in the culture medium above the surface of the culture medium.

In die Stirnwand 4 ist ein Zufuhrkanal 11 mit einem Luer-Lock-Verbinder 20 für Overlay-Medien eingearbeitet, der über Zuführungen 12 mit den Overlay- Räumen 16 über dem Kulturmedium 25 verbunden ist. In der Stirnwand 5 ist ein, mit einer, sich über den Kultivierungsträgern 7 befindlichen Overlay- Auffangkammer 24 verbundener Luer- Lock- Verbinder 22 für den Abfluss der Overlay- Medien angeordnet. In der Stirnwand 5 sind ein Luer- Lock- Verbinder 21 für die Zuführung des Kulturmediums und ein Luer- Lock-Verbinder 23 für die Abführung der Kulturmedien angeordnet, wobei der Luer- Lock-Verbinder 23 mit der unter den Kultivierungsplatten 7 angeordneten Auffangkammer 15 für Kulturmedien verbunden ist. Außen am Boden 2 des Bioreaktorgefäßes 1 ist unter einem poliertem Lichtfenster 19 eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von zwischen 750 nm und 950 nm, insbesondere mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm, mit einer Kamera 32 befestigt, wobei das Bioreaktorgefäß 1 auf einem Rütteltisch 30 angeordnet sein kann.A supply channel 11 with a Luer-Lock connector 20 for overlay media is incorporated into the front wall 4 and is connected to the overlay spaces 16 above the culture medium 25 via inlets 12. A Luer-Lock connector 22 for the drainage of the overlay media is arranged in the front wall 5 and is connected to an overlay collecting chamber 24 located above the cultivation supports 7. A Luer-Lock connector 21 for the supply of the culture medium and a Luer-Lock connector 23 for the drainage of the culture media are arranged in the front wall 5, with the Luer-Lock connector 23 being connected to the collecting chamber 15 for culture media located under the cultivation plates 7. A light source with a wavelength of between 750 nm and 950 nm, in particular with a wavelength in the fluorescence spectrum for blood of 830 nm, is attached to a camera 32 on the outside of the bottom 2 of the bioreactor vessel 1 under a polished light window 19, wherein the bioreactor vessel 1 can be arranged on a vibrating table 30.

Auf den Kultivierungsträger 7 sind Stege 13 zur Bildung eines oder mehrerer Gerinne 10 in einem Abstand a voneinander und in einem Abstand b von Stirnwänden 4 und 5 und ein oder mehrere Überläufe 14 sowie eine Überlaufsteg 32 angeordnet, wobei der Abstand a der Stege 13 voneinander so gewählt und die zugeführte und abgeführte Menge an Kulturmedien so eingestellt ist, dass sich in dem Stromfaden in dem durch die Stege 13 gebildeten Gerinne 10 eine laminare Strömung mit einer Bodensteinzahl von 0,001 bis 0,1 und die Bodenströmung dabei nahe bei einer Bodensteinzahl 0 verbleibt. Der Abstand b der Stege 13 von den Stirnwänden ist so gewählt, dass das Kulturmedium ohne Strömungsverluste über die Überläufe 14 abfließen kann.On the cultivation support 7, webs 13 for forming one or more channels 10 are arranged at a distance a from one another and at a distance b from end walls 4 and 5 and one or more overflows 14 as well as an overflow web 32, wherein the distance a of the webs 13 from one another is selected and the amount of culture media supplied and discharged is set so that a laminar flow with a Bodenstein number of 0.001 to 0.1 and the bottom flow remains close to a Bodenstein number of 0 in the flow thread in the channel 10 formed by the webs 13. The distance b of the webs 13 from the end walls is selected so that the culture medium can flow off via the overflows 14 without flow losses.

Die Bodenstein-Zahl ist eine dimensionslose Kennzahl, die das Verhältnis der konvektiv zugeführten zu den durch Diffusion zugeführten Molen beschreibt. Damit charakterisiert die Bodenstein-Zahl die Rückvermischung innerhalb eines Systems (je größer die Bodenstein-Zahl, desto geringer die Rückvermischung) und ermöglicht Aussagen darüber, ob und wie stark sich Volumenelemente oder Stoffe innerhalb der Gerinne 10 durch die herrschenden Strömungen vermischen.The Bodenstein number is a dimensionless number that describes the ratio of moles supplied by convection to those supplied by diffusion. The Bodenstein number thus characterizes the backmixing within a system (the larger the Bodenstein number, the lower the backmixing) and enables statements to be made about whether and to what extent volume elements or substances within the channel 10 are mixed by the prevailing currents.

Bei der Bodensteinzahl 0 oder nahe 0 ist die Rückvermischung am größten, das heißt, dass bei einer Bodensteinzahl nahe 0 die Overlay- Medien optimal mit dem Kulturmedium vermischt sind und so die Zellen bei ihrer Expansion optimal mit den Overlay- Medien versorgt werden können.Backmixing is greatest at a Bodenstein number of 0 or close to 0, which means that at a Bodenstein number close to 0 the overlay media are optimally mixed with the culture medium and thus the cells can be optimally supplied with the overlay media during their expansion.

Die Kultivierungsträger 7 mit den Stegen 13 und die damit gebildeten Gerinne 10 können aus einem hydrophilen mit Niedertemperatur- Plasma behandelten Kunststoff mit einer zelladhäsiven Beschichtung, wie Flbronektin, RetroNectin, Collagen, Gelatine, Laminin, Chitin und/oder aus Kombinationen davon, bestehen, wobei in die zelladhäsive Beschichtung aktivierende Antikörper, wie Immunglobuline, Lymphozyten, Anti CD 16, Anti CD3, Anti CD28, AntiCD137, Anti CD39, Anti CD103 und/oder aus Kombinationen davon, insbesondere 4-1 bb in Kombination mit den Cykinen Interleukin 12 oder mit einem Gemisch aus Interleukin 12 und Interleukin 2 eingearbeitet sein können.The cultivation supports 7 with the webs 13 and the channels 10 formed thereby can consist of a hydrophilic plastic treated with low-temperature plasma with a cell-adhesive coating such as flbronectin, retronectin, collagen, gelatin, laminin, chitin and/or combinations thereof, wherein activating antibodies such as immunoglobulins, lymphocytes, anti CD 16, anti CD3, anti CD28, antiCD137, anti CD39, anti CD103 and/or combinations thereof, in particular 4-1 bb in combination with the cykines interleukin 12 or with a mixture of interleukin 12 and interleukin 2, can be incorporated into the cell-adhesive coating.

In einer Auslegung der Erfindung kann anstelle der Luer- Lock Verbinder 20 in der Stirnwand 4 ein Dreiwegekükenhahn 28 und in der Stirnwand 5 über dem mittig angeordneten Kultivierungsträger 7 ein mit dem Raum für das Kulturmedum 25 dieses Kultivierungsträgers 7 verbundener Luer- Lockverbinder 29 angeordnet sein, wobei das Dreiwegekükenhahn 28 und der Luer- Lockverbinder 29 über einen Bypass 26 miteinander verbunden sein können und wobei um den Bypass 26 eine elektromagnetische Schlauchklemme 27 angeordnet sein kann.In one embodiment of the invention, instead of the Luer-Lock connectors 20 in the front wall 4, a three-way cock valve 28 and in the front wall 5 above the centrally arranged cultivation carrier 7, a Luer-Lock connector connected to the space for the culture medium 25 of this cultivation carrier 7 can be provided. binder 29, wherein the three-way cock 28 and the Luer lock connector 29 can be connected to one another via a bypass 26 and wherein an electromagnetic hose clamp 27 can be arranged around the bypass 26.

In einer weiteren Auslegung der Erfindung ist eine Rüttelvorrichtung in Form eines Rütteltisches 30 und eines Impulsgebers 31 vorgesehen, auf der der Biorektor derart befestigt ist, dass die Plattenebene der Kultivierungsträger 7 horizontal liegen und mechanisch bevorzugt elektromechanisch bei Bedarf gerüttelt wird. Der Perfusions-Plattenmäander Bioreaktor wird auf dem Rütteltisch 30 befestigt und das Kulturmedium wird in Schwerkraftrichtung durch den Impulsgeber 31 einem Ruck ausgesetzt. Der eingebrachte Ruck (Änderung der Beschleunigung pro Zeiteinheit) soll bevorzugt zwischen 2-5 m/s³ betragen.In a further embodiment of the invention, a shaking device in the form of a shaking table 30 and a pulse generator 31 is provided, on which the bioreactor is fastened in such a way that the plate plane of the cultivation carrier 7 lies horizontally and is mechanically, preferably electromechanically, shaken as required. The perfusion plate meander bioreactor is fastened to the shaking table 30 and the culture medium is subjected to a jolt in the direction of gravity by the pulse generator 31. The jolt introduced (change in acceleration per unit of time) should preferably be between 2-5 m/s ³ .

Dadurch wird die Segregation der Zellen infolge Sedimentation während der Strömung in den Gerinnen verringert, die Vermehrungsrate gesteigert und die Durchlaufzeit der geplanten Zellvermehrung gesenkt. Die kritische Schichtdicke innerhalb eines Zellhaufens, ab der die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen problematisch wird, beträgt ca. 1 mm. Wird die Schichtdicke überschritten gehen die Zellen wegen Nähstoff- und Overlay-Medienmangel zugrunde. Die Kompensation dieser Nachteile der kritischen Schichtdicke des Zellhaufens wird durch Vertikalrütteln durch den Impulsgeber 31 erreicht.This reduces the segregation of cells as a result of sedimentation during flow in the channels, increases the proliferation rate and reduces the throughput time of the planned cell proliferation. The critical layer thickness within a cell cluster, from which the supply of the cells with nutrients becomes problematic, is approximately 1 mm. If the layer thickness is exceeded, the cells perish due to a lack of nutrients and overlay media. The compensation of these disadvantages of the critical layer thickness of the cell cluster is achieved by vertical shaking by the pulse generator 31.

Dies führt zu einem früheren Therapiebeginn der Behandlung mit dem positiven Effekt der höheren Heilungschancen, sowie auch zu geringeren Kosten.This leads to an earlier start of treatment with the positive effect of higher chances of recovery, as well as lower costs.

Die Erfindung wird anhand von Beispielen näher erläutert, wobei die 1 ein Schema der Fluid- und Begasungsströmung des Bioreaktors, die 2 eine schematische Seitendarstellung des Bioreaktors, die 3 eine schematische Seitendarstellung mit dem Bypass 26 des Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor mit Rütteltisch 30 und Impulsgeber 31, die 4 eine 3- D- Draufsicht auf den Bioreaktor und die 5 eine Darstellung des Kultivierungsträgers 7 darstellen, wobei

1: Bioreaktorgefäß
2: Boden
3: Deckel
4: Stirnwand
5: Stirnwand
6: Seitenwand
7: Kultivierungsträger
8: Spannbügel
9: Spannmutter
10: Gerinne
11: Zufuhrkanal Overlay- Medien
12: Zuführungen Overlay- Medien
13: Stege
14: Überlauf
15: Auffangwanne Kulturmedien
16: Raum für Overlay- Medien
17: Fuß
18: Lichtquelle
19: Lichtfenster
20: Luer- Lock-Verbinder für die Zuführung der Overlay- Medien
21: Luer- Lock-Verbinder für die Zuführung des Kulturmediums
22: Luer- Lock-Verbinder für die Abführung der Overlay- Medien
23: Luer- Lock- Verbinder für die Abführung der Kulturmedien
24: Overlay- Auffangkammer
25: Kulturmedien
26: Bypass
27: elektromagnetische Schlauchklemme
28: Dreiwegekükenhahn
29: Luer Lock- Verbinder
30: Rütteltisch
31: Impulsgeber
32: Kamera
33: Überlaufsteg

bedeuten.The invention is explained in more detail by means of examples, in which the 1 a scheme of the fluid and gas flow of the bioreactor, the 2 a schematic side view of the bioreactor, the 3 a schematic side view with the bypass 26 of the perfusion plate meander bioreactor with shaking table 30 and pulse generator 31, the 4 a 3-D top view of the bioreactor and the 5 represent a representation of the cultivation carrier 7, wherein

1: Bioreactor vessel
2: Floor
3: Lid
4: Front wall
5: Front wall
6: Side wall
7: Cultivation carrier
8th: Clamping bracket
9: Clamping nut
10: Channel
11: Feed channel overlay media
12: Overlay media feeders
13: Bridges
14: Overflow
15: Catchment tray culture media
16: Space for overlay media
17: Foot
18: Light source
19: Light window
20: Luer-Lock connector for supplying the overlay media
21: Luer-Lock connector for supplying the culture medium
22: Luer lock connector for the removal of overlay media
23: Luer-Lock connector for the drainage of culture media
24: Overlay collection chamber
25: Cultural media
26: bypass
27: electromagnetic hose clamp
28: Three-way plug valve
29: Luer Lock connector
30: Vibrating table
31: Impulse generator
32: camera
33: Overflow bridge

mean.

Beispiel1Example 1

Der Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor besteht aus einem Bioreaktorgefäß 1 aus Polystyrol, das aus einen Boden 2, einem Deckel 3, aus Stirnwänden 4,5 und aus Seitenwänden 6 gebildet wird. In dem Bioreaktorgefäß 1 sind über die Spannmuttern 9 und einem Spannbügel 8 mehrere, insbesondere acht Kultivierungsträger 7 mit einem Abstand von 11,5 mm befestigt. Auf den Kultivierungsträgern 7 werden durch Stege 13 Gerinne 10 gebildet, durch die das Kulturmedium geführt wird und wobei das Kulturmedium über einen Überlaufsteg 33 von 3 mm Höhe und durch einen oder mehrere Überläufe 14 auf den darunterliegenden Kultivierungsträger 7 abgeführt wird. Dieser darunterliegende Kultivierungsträger 7 ist mit seinem Überläufen 14 und seinem Überlaufsteg 33 gegenüber dem darüber liegenden Kultivierungsträger 7 um 180 ° gedreht, so dass das Kulturmedium mäanderartig von oben nach unten in die Auffangkammer 15 für das Kulturmedium fliest und über den Luer- Lock-Verbinder 23 aus dem Bioreaktorgefäß 1 abgeführt wird. Der Abstand a der Stege 13 voneinander ist so gewählt und die zugeführte und abgeführte Menge an Kulturmedium ist so eingestellt, dass sich in dem Stromfaden, in dem durch die Stege 13 gebildeten Gerinne 10 zur optimalen Versorgung der expandieren Zellen eine laminare Strömung mit einer Bodensteinzahl von 0,001 bis 0,1 ausbildet und die Bodenströmung dabei nahe bei einer Bodensteinzahl 0 verbleibt. Dies wird maßgeblich durch den Überlaufsteg 33 von bis zu 3 mm erreicht.The perfusion plate meander bioreactor consists of a bioreactor vessel 1 made of polystyrene, which is formed from a base 2, a lid 3, end walls 4, 5 and side walls 6. Several, in particular eight, cultivation supports 7 are fastened in the bioreactor vessel 1 via the clamping nuts 9 and a clamping bracket 8 with a distance of 11.5 mm. On the cultivation supports 7, channels 10 are formed by webs 13 through which the culture medium is guided and the culture medium is discharged via an overflow web 33 of 3 mm height and through one or more overflows 14 onto the cultivation support 7 below. This underlying cultivation The cultivation carrier 7, with its overflows 14 and its overflow web 33, is rotated by 180° with respect to the cultivation carrier 7 above it, so that the culture medium flows in a meandering manner from top to bottom into the collecting chamber 15 for the culture medium and is discharged from the bioreactor vessel 1 via the Luer-Lock connector 23. The distance a between the webs 13 is selected and the amount of culture medium supplied and discharged is adjusted so that a laminar flow with a Bodenstein number of 0.001 to 0.1 is formed in the flow thread, in the channel 10 formed by the webs 13, for the optimal supply of the expanding cells, and the bottom flow remains close to a Bodenstein number of 0. This is achieved primarily by the overflow web 33 of up to 3 mm.

In die Stirnwand 4 ist ein Zufuhrkanal 11 für Overlay- Medien eingearbeitet, der über Zuführungen 12 für Overlay- Medien mit Overlay- Räumen 16 verbunden ist, die sich über den Kultivierungsträgern 7 mit den fließenden Kulturmedium befinden. Über den Luer- Lock-Verbinder 20, der mit dem Zufuhrkanal 11 für Overlay- Medien verbunden ist, werden die Overlay- Medien im Gegenstrom über das Kultivierungsmedium bis in die Auffang-Kammer 24 für Overlay- Medien geführt und über den Luer- Lock-Verbinder 22 für die Abführung der Overlay- Medien aus dem Bioreaktorgefäß 1 abgeführt.
Das Kulturmedium besteht aus einem Zellwachstum-Medium, das mit einem spezifischen Gemisch aus AB Humanserum, Cytokinen, Antikörpern und irradiierten humanen Feeder Zellen zeitweilig supplementiert ist. Diesem Kulturmedium werden die während einer Operation vom Patienten entnommenen und zerkleinerten autologen Tumor- Gewebestücke in einer Größe von 1 bis 2 mm³ zugegeben und mit dem Kulturmedium über den Luer- Lock-Verbinder 21 für die Zuführung von Kulturmedium dem Bioreaktorgefäß 1 zugeführt. Die zerkleinerten Gewebestücke werden im Bioreaktor gleichmäßig verteilt und im Perfusionsbetrieb kultiviert, wobei das Kulturmedium durch die über den Zufuhrkanal 11 und die Zuführungen 12 für Overlay- Medien in die Overlay- Räume 16 zugeführten Overlay-Medien mit der entsprechenden Overlay-Atmosphäre geregelt versorgt wird. In einem Kultivierungslauf über 7 bis 14 Tage wachsen Zellen (TIL oder andere Zellen) in ausreichender Menge aus. Mit zunehmender Zellzahl wird im Verlauf der Vermehrung der Zellmenge (TIL oder andere Zellen) die Zufuhr von frischem Medium kontinuierlich erhöht, wobei das erhöhte Zuführen von frischem Medium durch einen entsprechenden Algorithmus automatisch gesteuert wird.A supply channel 11 for overlay media is incorporated into the front wall 4, which is connected via feeds 12 for overlay media to overlay chambers 16, which are located above the cultivation supports 7 with the flowing culture medium. Via the Luer-Lock connector 20, which is connected to the supply channel 11 for overlay media, the overlay media is guided in countercurrent over the cultivation medium into the collection chamber 24 for overlay media and is discharged from the bioreactor vessel 1 via the Luer-Lock connector 22 for the discharge of the overlay media.
The culture medium consists of a cell growth medium that is temporarily supplemented with a specific mixture of AB human serum, cytokines, antibodies and irradiated human feeder cells. The autologous tumor tissue pieces in a size of 1 to 2 mm ³ that are removed from the patient during an operation and chopped up are added to this culture medium and fed to the bioreactor vessel 1 with the culture medium via the Luer Lock connector 21 for the supply of culture medium. The chopped tissue pieces are evenly distributed in the bioreactor and cultivated in perfusion mode, with the culture medium being supplied with the appropriate overlay atmosphere in a controlled manner by the overlay media fed into the overlay spaces 16 via the supply channel 11 and the feeds 12 for overlay media. In a cultivation run over 7 to 14 days, cells (TIL or other cells) grow in sufficient quantities. As the number of cells increases, the supply of fresh medium is continuously increased during the proliferation of the number of cells (TIL or other cells), whereby the increased supply of fresh medium is automatically controlled by a corresponding algorithm.

Der Boden 2 des Bioreaktorgefäßes 1 weist ein Lichtfenster 19 auf, unter dem eine Lichtquelle 20 mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm mit einer Videokamera 32 angebracht ist, mit dessen Hilfe die Rückvermischung der Overlay- Medien in den Kulturmedien kontrolliert und gesteuert werden kann, wobei die Kulturmedien mit geeigneten Mitteln zur Erkennung der Rückvermischung versehen sind.The bottom 2 of the bioreactor vessel 1 has a light window 19, under which a light source 20 with a wavelength in the fluorescence spectrum for blood of 830 nm with a video camera 32 is mounted, with the aid of which the backmixing of the overlay media in the culture media can be monitored and controlled, wherein the culture media are provided with suitable means for detecting the backmixing.

Anstelle des Luer- Lock- Verbinder 20 kann in der Stirnwand 4 ein Dreiwegekükenhahn 28 und in der Stirnwand 5 kann über dem mittig angeordneten Kultivierungsträger 7 ein mit dem Raum für das Kulturmedium 25 dieses Kultivierungsträgers 7 verbundener Luer - Lock- Verbinder 29 angeordnet sein, wobei der Dreiwegekükenhahn 28 und der Luer- Lock- Verbinder 29 über einen Bypass 26 miteinander verbunden sind und wobei um den Bypass 26 eine elektromagnetische Schlauchklemme 27 angeordnet ist.
Damit kann durch Umschalten des Dreiwegekükenhahns 28 und des Luer- Lock-Verbinder 29 ein Teil der Kulturmedien über den Bypass 26 geführt und durch die Verengung des Querschnitts des Bypasses 26 auf die expandierenden Zellen in den Kulturmedien ein definierbarer Scherstress ausgeübt werden. Die Aktivierung von Zellen, insbesondere von T- Zellen, ist sowohl eine mechanischer als auch ein biochemischer Prozess. Mit der elektromagnetischen Schlauchklemme 27 wird ein reproduzierbarer definierter Scherstress auf die Zellen, insbesondere T- Zellen, ausgeübt und so die Aktivierung mechanisch stimuliert
Das Bioreaktorgefäß 1 ist auf einen Rütteltisch 30 mit einem Impulsgeber 31 angeordnet, wobei am Boden 2 des Bioreaktorgefäßes 1 unter einem poliertem Lichtfenster 19 eine Lichtquelle 18 mit einer Wellenlänge von zwischen 750 nm und 950 nm, insbesondere mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm, mit einer Kamera 32 befestigt sind.Instead of the Luer-Lock connector 20, a three-way cock valve 28 can be arranged in the front wall 4 and a Luer-Lock connector 29 connected to the space for the culture medium 25 of this culture carrier 7 can be arranged in the front wall 5 above the centrally arranged cultivation carrier 7, wherein the three-way cock valve 28 and the Luer-Lock connector 29 are connected to one another via a bypass 26 and wherein an electromagnetic hose clamp 27 is arranged around the bypass 26.
This means that by switching the three-way cock 28 and the Luer lock connector 29, part of the culture media can be passed through the bypass 26 and a definable shear stress can be exerted on the expanding cells in the culture media by narrowing the cross-section of the bypass 26. The activation of cells, particularly T cells, is both a mechanical and a biochemical process. With the electromagnetic hose clamp 27, a reproducible, defined shear stress is exerted on the cells, particularly T cells, and thus the activation is mechanically stimulated.
The bioreactor vessel 1 is arranged on a vibrating table 30 with a pulse generator 31, wherein a light source 18 with a wavelength of between 750 nm and 950 nm, in particular with a wavelength in the fluorescence spectrum for blood of 830 nm, with a camera 32 is attached to the bottom 2 of the bioreactor vessel 1 under a polished light window 19.

Beispiel 2:Example 2:

In einem für aus Gewebestücke auswachsenden Zellen, insbesondere von nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten, wie tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAlT), geeigneter ersten (nicht dargestelten) Bioreaktor, wie z.B. der in der DE 10 2019 007 815 B3 beschriebenen, wachsen Zellen aus zerkleinerten Gewebestücken aus, wobei als Ausgangsmaterial dafür Gewebeteile eingesetzt werden, die beispielsweise bei operativer Entfernung eines Tumors, von Tumormetastasen oder von Tumorzelten befallenen Lymphknoten anfallen. Die zerkleinerten Gewebestücke werden durch den größer dimensionierten und mit einem steril verschließenden Stopfen eingefüllt und durch Schwenken des mit Medium gefüllten ersten Bioreaktors gleichmäßig verteilt. Nach 3 bis 7 Tagen wachsen die in den tumorösen Gewebestücken enthaltenen Tumor-infiltrierten T-Lymphozyten (TIL) in Mengen aus.
Je nach gewähltem Medium und zugesetzten Supplementen werden die TIL in dieser Prozess-Phase aktiviert und durch weiteren Kontakt mit dem anfangs noch vorhandenen Gemisch von mutierten Tumorzellen aus einem individuellen Tumorstück (gewonnen aus einem Tumor-Resektat) mutierten Tumorzellen spezifisch geprimt. In der Regel wachsen innerhalb einer Woche 1,5 bis 2 × 10⁹ TIL im ersten Bioreaktor hoch. Nach Aufschütteln der im ersten Biorektor ausgewachsenen TILs werden die TILs durch den mit einem Siebgewebe versehenen Auslass-Stutzen dieses ersten (nicht dargestellten) Bioreaktors über den im Deckel 3 des Bioreaktorgefäßes 1 angeordneten Luer- Lockverbinder 29 dem erfindungsgemäßen Perfusions- Plattenmäander-Bioreaktor für die weitere Expansion von TILs gemäß Beispiel 1 geführt. Die Gewebestücke, aus denen die TILs ausgewachsen sind, werden vollständig vom Siebgewebe des zum Auswachsen von Zellen geeigneten ersten (nicht dargestellten) Bioreaktors zurückgehalten.In a first bioreactor (not shown) suitable for cells growing from tissue pieces, especially from non-adherently growing T lymphocytes, such as tumor-infiltrated NK cells (TINK) and mucosa-associated invariant T cells (MAlT), such as the one in the EN 10 2019 007 815 B3 As described above, cells grow from chopped tissue pieces, using tissue pieces as the starting material, for example, from surgical removal of a tumor, tumor metastases or lymph nodes affected by tumor cells. The chopped tissue pieces are filled through the larger dimensioned and sterile plug and evenly distributed by swirling the first bioreactor filled with medium. After 3 to 7 days, the tumor-infiltrated T lymphocytes (TIL) contained in the tumorous tissue pieces grow in quantities.
Depending on the medium selected and the supplements added, the TILs are activated in this process phase and specifically primed by further contact with the initially still present mixture of mutated tumor cells from an individual tumor piece (obtained from a tumor resectate). As a rule, 1.5 to 2 × 10 ⁹ TILs grow in the first bioreactor within a week. After shaking up the TILs that have grown in the first bioreactor, the TILs are fed through the outlet nozzle of this first bioreactor (not shown) provided with a sieve fabric via the Luer lock connector 29 arranged in the lid 3 of the bioreactor vessel 1 to the perfusion plate meander bioreactor according to the invention for the further expansion of TILs according to Example 1. The pieces of tissue from which the TILs have grown are completely retained by the sieve fabric of the first bioreactor (not shown) suitable for the outgrowth of cells.

Claims

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor für die Expansion von Zellen, insbesondere von nicht adhärenten Zellen, wie nicht adhärenten T-Lymphozyten oder invarianten T- Lymphozyten und NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), bestehend aus einem Bioreaktorgefäß (1) aus glasklarem Polymermaterial mit einem Boden (2), einem Deckel (3), Stirnwänden (4,5), Seitenwänden (6), und Füßen (17),wobei im Bioreaktorgefäß (1) mittels Spannmuttern (9) und einem Spannbügel (8) mehrere übereinander angeordnete Kultivierungsträger (7) befestigt sind, auf denen durch Stege (13) gebildete Gerinne (10) und ein oder mehrere Überläufe (14) angeordnet sind, wobei jeder zweite Kultivierungsträger (7) mit den Überläufen (14) um 180° zu dem über ihm liegenden Kultivierungsträger (7) gedreht sind und wobei unter den Kultivierungsträgern (7) eine untere Auffangkammer (15) für das Kulturmedium angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass • auf den Kultivierungsträger (7) vor den Überläufen (14) über die gesamte Breite der Kultivierungsträger (7) ein Überlaufsteg (33) mit einer Höhe von 3 bis 5 mm und • oberhalb der Kultivierungsträger (7) eine Overlay- Auffangkammer (24) angeordnet ist, • das Kulturmedium im Bioreaktorgefäß (1) in den Gerinnen (10) auf den Kultivierungsträgern (7) des Bioreaktorgefäßes (1) horizontal und durch die Überläufe (14) und über den Überlaufsteg (33) auf den darunterliegenden Kultivierungsträger (7) mäanderförmig vertikal von Kultivierungsplatte (7) zu Kultivierungsplatte (7) bis zum Luer- Lock-Verbinder (23) für die Abführung des Kulturmedium und die Overlay-Medien zur Gasdiffusion der Overlay- Medien in das Kulturmedium und zur Konstanthaltung der Konzentration der gelösten Overlay- Medien in dem Kulturmedium oberhalb der Oberfläche des Kulturmediums in den Gerinnen (10) geführt sind, • in die Stirnwand (4) ein Zuführungskanal (11) mit einer Luer- Lock-Verbinder (20) für Overlay-Medien eingearbeitet ist, der über Zuführungen (12) mit den Overlay- Räumen (16) über dem Kulturmedium (25) verbunden ist, • in der Stirnwand (5) ein, mit einer, sich über den Kultivierungsträgern (7) befindlichen, Overlay- Auffangkammer (24) verbundenen Luer-Lock- Verbinder (22) für Abführung der Overlay- Medien, ein Luer-Lock-Verbinder (21) für die Zuführung von Kulturmedium und ein Luer- Lock-Verbinder (23) für die Abführung des Kulturmediums, der mit der unter den Kultivierungsplatten (7) angeordneten Auffangkammer (15) für das Kulturmedium verbunden ist, angeordnet sind und • außen am Boden (2) des Bioreaktorgefäßes (1) unter einem poliertem Lichtfenster (19) eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von zwischen 750 nm und 950 nm mit einer Kamera (32) angeordnet ist.Perfusion plate meander bioreactor for the expansion of cells, especially non-adherent cells such as non-adherent T lymphocytes or invariant T lymphocytes and NK cells but also other immune cells e.g. B. tumor-infiltrated NK cells (TINK) and mucous membrane-associated invariant T cells (MAIT), consisting of a bioreactor vessel (1) made of crystal-clear polymer material with a bottom (2), a lid (3), end walls (4,5), side walls (6), and feet (17), wherein in the bioreactor vessel (1) by means of clamping nuts (9) and a clamping bracket (8) several cultivation supports (7) arranged one above the other are fastened, on which channels (10) formed by webs (13) and one or more overflows (14) are arranged, wherein every second cultivation support (7) with the overflows (14) is rotated by 180° to the cultivation support (7) located above it and wherein a lower collecting chamber (15) for the culture medium is arranged under the cultivation supports (7), characterized in that • on the cultivation support (7) in front of the overflows (14) over the entire width the cultivation support (7) has an overflow bar (33) with a height of 3 to 5 mm and • an overlay collecting chamber (24) is arranged above the cultivation support (7), • the culture medium in the bioreactor vessel (1) in the channels (10) on the cultivation supports (7) of the bioreactor vessel (1) is guided horizontally and through the overflows (14) and over the overflow bar (33) onto the underlying cultivation support (7) in a meandering vertical manner from cultivation plate (7) to cultivation plate (7) up to the Luer lock connector (23) for the removal of the culture medium and the overlay media for gas diffusion of the overlay media into the culture medium and for keeping the concentration of the dissolved overlay media in the culture medium constant above the surface of the culture medium in the channels (10), • a feed channel (11) with a Luer lock connector (20) is guided into the front wall (4). for overlay media is incorporated, which is connected via inlets (12) to the overlay spaces (16) above the culture medium (25), • in the front wall (5) there is arranged a Luer-Lock connector (22) for removing the overlay media, which is connected to an overlay collecting chamber (24) located above the cultivation supports (7), a Luer-Lock connector (21) for supplying culture medium and a Luer-Lock connector (23) for removing the culture medium, which is connected to the collecting chamber (15) for the culture medium arranged below the cultivation plates (7), and • a light source with a wavelength of between 750 nm and 950 nm with a camera (32) is arranged outside on the bottom (2) of the bioreactor vessel (1) under a polished light window (19).

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor (1) auf einer Rüttelvorrichtung bestehend aus einem Rütteltisch (30) und einem Impulsgeber (31) angeordnet ist, wobei die Plattenebene der Kultivierungsträger (7) horizontal liegend angeordnet ist und das Kulturmedium durch den Impulsgeber (31) mechanisch in Richtung der Schwerkraft einem Ruck zwischen 2-5 m/s³ ausgesetzt ist.Perfusion plate meander bioreactor according to Claim 1 , characterized in that the perfusion plate meander bioreactor (1) is arranged on a shaking device consisting of a shaking table (30) and a pulse generator (31), wherein the plate plane of the cultivation carrier (7) is arranged horizontally and the culture medium is mechanically exposed to a jolt of between 2-5 m/s ³ in the direction of gravity by the pulse generator (31).

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 1-2, gekennzeichnet dadurch, dass die Wellenlänge der Lichtquelle (20) im Fluoreszenz-spektrum in Blut bei ca. 830 nm liegt.Perfusion plate meander bioreactor according to Claim 1 - 2 , characterized in that the wavelength of the light source (20) in the fluorescence spectrum in blood is approximately 830 nm.

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass anstelle des Luer- Lock-Verbinders (20) in der Stirnwand (4) ein Dreiwegekükenhahn (28) und in der Stirnwand (5) über dem mittig angeordneten Kultivierungsträger (7) ein mit dem Raum für das Kulturmedium (25) dieses Kultivierungsträgers (7) verbundener Luer - Lock-Verbinder (29) angeordnet ist, wobei der Dreiwegekükenhahn (28) und der Luer- Lock- Verbinder (29) über einen Bypass (26) miteinander verbunden sind und wobei um den Bypass (26) eine elektromagnetische Schlauchklemme (27) angeordnet ist.Perfusion plate meander bioreactor according to Claim 1 - 3 , characterized in that instead of the Luer-Lock connector (20) in the front wall (4) there is a three-way plug tap (28) and in the front wall (5) above the centrally arranged cultivation carrier (7) there is a Luer-Lock connector (29) connected to the space for the culture medium (25) of this cultivation carrier (7), wherein the three-way plug tap (28) and the Luer-Lock connector (29) are connected to one another via a bypass (26) and wherein an electromagnetic hose clamp (27) is arranged around the bypass (26).

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass auf den Kultivierungsträger (7) Stege (13) zur Bildung eines oder mehrerer Gerinne (10) in einem Abstand a voneinander und in einem Abstand b von Stirnwänden (4,5) angeordnet sind und die Kultivierungsträger (7) ein oder mehrere Überläufe (14) aufweisen.Perfusion plate meander bioreactor according to Claim 1 - 2 , characterized in that on the cultivation support (7) webs (13) for forming one or more channels (10) are provided at a distance a from each other and at a distance b from end walls (4,5) and the cultivation supports (7) have one or more overflows (14).

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand a der Stege (13) voneinander so gewählt ist und die zugeführte und abgeführte Menge an Kulturmedium so eingestellt ist, dass sich in dem Stromfaden, in dem durch die Stege (13) gebildeten Gerinne (10), eine laminare Strömung mit einer Bodensteinzahl von 0,001 bis 0,1 und die Bodenströmung dabei nahe einer Bodensteinzahl 0 verbleibt.Perfusion plate meander bioreactor according to Claim 5 , characterized in that the distance a between the webs (13) is selected and the amount of culture medium supplied and removed is adjusted so that in the flow thread, in the channel (10) formed by the webs (13), a laminar flow with a Bodenstein number of 0.001 to 0.1 and the bottom flow remains close to a Bodenstein number of 0.

Perfusions-Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch1 bis 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierungsträger (7) mit den Stegen (13) und den Gerinnen (10) aus einem hydrophilen mit Niedertemperatur- Plasma behandelten Kunststoff mit einer zelladhäsiven Beschichtung bestehen und in die zelladhäsive Beschichtung aktivierende Antikörper eingearbeitet sind.Perfusion plate meander bioreactor according to claims 1 to 2 and 5, characterized in that the cultivation supports (7) with the webs (13) and the channels (10) consist of a hydrophilic plastic treated with low-temperature plasma with a cell-adhesive coating and activating antibodies are incorporated into the cell-adhesive coating.

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, das als aktivierende Antikörper Immunglobuline, Lymphozyten, Anti CD 16, Anti CD3, Anti CD28, AntiCD137, Anti CD39, Anti CD103 und/oder aus Kombinationen davon in die zelladhäsive Beschichtung eingearbeitet sind.Perfusion plate meander bioreactor according to Claim 7 , characterized in that immunoglobulins, lymphocytes, anti CD 16, anti CD3, anti CD28, antiCD137, anti CD39, anti CD103 and/or combinations thereof are incorporated into the cell-adhesive coating as activating antibodies.

Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 7-8, dadurch gekennzeichnet, dass die zelladhäsive Beschichtung aus Flbronektin, RetroNectin, Collagen, Gelatine, Laminin, Chitin und/oder aus Kombinationen davon besteht.Plate meander bioreactor according to Claim 7 - 8th , characterized in that the cell-adhesive coating consists of flbronectin, retronectin, collagen, gelatin, laminin, chitin and/or combinations thereof.

Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 7-9, dadurch gekennzeichnet, dass in die zelladhäsive Beschichtung, als aktivierende Antikörper der Antikörper 4-1bb in Kombination mit den Cykinen Interleukin 12 oder mit einem Gemisch aus Interleukin 12 und Interleukin 2 eingearbeitet sind.Plate meander bioreactor according to Claim 7 - 9 , characterized in that the antibody 4-1bb in combination with the cykines interleukin 12 or with a mixture of interleukin 12 and interleukin 2 are incorporated into the cell-adhesive coating as activating antibodies.

Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Deckel (3) des Bioreaktorgefäßes (1) ein Luer-Lock- Verbinder (29) angeordnet ist, der mit der Overlay- Auffangkammer (24) verbunden ist und über den ein zum Auswachsen von Zellen aus Gewebestücken geeigneter (nicht dargestellter) erster Bioreaktor angeschlossen sein kann, wobei der zum Auswachsen von Zellen geeignete (nicht dargestellte) erste Bioreaktor mit einen Auslaufstutzen mit einem Siebgewebe für das Zurückhalten der Gewebestücke ausgestattet istPerfusion plate meander bioreactor according to Claim 1 - 10 , characterized in that a Luer-Lock connector (29) is arranged in the lid (3) of the bioreactor vessel (1), which is connected to the overlay collecting chamber (24) and via which a first bioreactor (not shown) suitable for growing cells out of tissue pieces can be connected, wherein the first bioreactor (not shown) suitable for growing cells is equipped with an outlet nozzle with a sieve fabric for retaining the tissue pieces