DE102022103501A1 - Use of peptide ligands of the 3CL protease of SARS-CoV-2 for the therapy of COVID-19 - Google Patents
Use of peptide ligands of the 3CL protease of SARS-CoV-2 for the therapy of COVID-19 Download PDFInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, dessen Verwendung zur Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease, ein solches Peptid zur Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease und ein solches Peptid zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung von COVID-19.The present invention relates to a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 and homologues, fragments and parts thereof, its use for inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease such a peptide for inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease and such a peptide for use as a medicament, in particular for use in the treatment of COVID-19.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 sowie Homologe, Fragmente und Teile davon, dessen Verwendung zur Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease, ein solches Peptid zur Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease und ein solches Peptid zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung von COVID-19.The present invention relates to a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 and homologues, fragments and parts thereof, its use for inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease such a peptide for inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease and such a peptide for use as a medicament, in particular for use in the treatment of COVID-19.
Die Menschheit leidet seit Anbeginn der Zeit an Viruserkrankungen, und da derzeit nur gegen eine begrenzte Anzahl von Virusinfektionen geimpft werden kann, ist die Bereitstellung von Medikamenten gegen Viruserkrankungen von großer Bedeutung.Mankind has suffered from viral diseases since the beginning of time, and since there is only a limited number of viral infections that can be vaccinated at present, the provision of antiviral medicines is of great importance.
Eine Viruserkrankung tritt in der Regel auf, wenn pathogene Viren in den Körper eines Organismus eindringen und infektiöse Viruspartikel an empfängliche Zellen andocken und in diese eindringen.Viral disease usually occurs when pathogenic viruses invade an organism's body and infectious virus particles dock and invade susceptible cells.
Das neu entdeckte Coronavirus mit der Bezeichnung Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das bisher unter seinem vorläufigen Namen 2019 novel coronavirus (2019-nCOV) bekannt war, ist das siebte bekannte Coronavirus, das Menschen infiziert.The newly discovered coronavirus, dubbed Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), previously known by its tentative name 2019 novel coronavirus (2019-nCOV), is the seventh known coronavirus to infect humans.
Von diesen sieben Coronaviren haben SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 gezeigt, dass sie schwere Krankheiten verursachen können. Diese Viren haben in den letzten zwanzig Jahren Pandemien großen Ausmaßes verursacht.Of these seven coronaviruses, SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2 have shown that they can cause serious diseases. These viruses have caused large-scale pandemics over the past twenty years.
SARS-CoV-2 ist ein umhülltes, nicht segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Virus ((+)ssRNA linear) und verursacht die Atemwegserkrankung Corona Virus Disease 19 oder auch COVID-19 genannt. Seit seinem ersten dokumentierten Auftreten Ende 2019 in China hat sich das Virus bzw. die dadurch hervorgerufene Krankheit COVID-19 zu einer weltweiten Pandemie entwickelt.SARS-CoV-2 is an enveloped, non-segmented, single-stranded RNA virus ((+)ssRNA linear) and causes the respiratory disease Corona Virus Disease 19, also known as COVID-19. Since its first documented appearance in China in late 2019, the virus, or the disease it causes, COVID-19, has become a global pandemic.
Coronaviren verursachen bei Menschen in erster Linie milde Erkaltungskrankheiten, können jedoch auch schwerere Verläufe mit Lungenentzündungen hervorrufen. Das Anfang 2020 als Auslöser von COVID-19 identifizierte Beta-Coronavirus SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) hat nach Datenlage der WHO zum heutigen Stand über 111 Mio. Menschen weltweit infiziert und über 2,4 Mio. Todesopfer gefordert.Corona viruses primarily cause mild colds in humans, but can also cause more severe courses with pneumonia. According to data from the WHO, the beta coronavirus SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2), which was identified as the cause of COVID-19 at the beginning of 2020, has infected over 111 million people worldwide and killed over 2.4 million people required.
Das Ausmaß der COVID-19-Pandemie zeigt die Dringlichkeit, Therapien für diese Art von Virusinfektionen zu finden. Eine wirksame Therapie trägt dazu bei, die Zahl der Todesfälle zu verringern. Außerdem könnten angesichts einer solchen wirksamen Therapie weniger harte epidemiologische Maßnahmen wie Quarantänen und Abriegelungen notwendig sein, mit all ihren negativen wirtschaftlichen und sozialen Auswirkungen auf Länder und Gesellschaften.The scale of the COVID-19 pandemic demonstrates the urgency of finding therapies for these types of viral infections. Effective therapy helps reduce the number of deaths. Also, in the face of such an effective therapy, less harsh epidemiological measures such as quarantines and lockdowns might be necessary, with all their negative economic and social impacts on countries and societies.
Die vorliegende Erfindung betrifft diese Dringlichkeit.The present invention addresses this urgency.
Insbesondere war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung effektive Therapeutika zur Behandlung von COVID-19 bereitzustellen.In particular, it was the object of the present invention to provide effective therapeutics for the treatment of COVID-19.
Nach Angabe des National Institute of Neurological Disorders and Strake (https://www.ninds.nih.gov/) gibt es zurzeit einzelne zugelassene Wirkstoffe für COVID-19, wobei zwischen Substanzen für Menschen mit milden bis moderaten Symptomen und Substanzen für stationär im Krankenhaus befindliche Personen unterschieden wird.According to the National Institute of Neurological Disorders and Strake (https://www.ninds.nih.gov/), there are currently single approved agents for COVID-19, ranging between agents for people with mild to moderate symptoms and agents for inpatients hospitalized persons is distinguished.
Zu den Wirkstoffen, welche den nicht-stationär aufgenommenen Betroffenen unter bestimmten Voraussetzungen verabreicht werden können, zählen die monoklonalen Antikörper Bamlanivimab, Casirivimab und Imdevimab, welche den Virus mit Hilfe des Immunsystems eliminieren.The active ingredients that can be administered to those affected who are not hospitalized under certain conditions include the monoclonal antibodies bamlanivimab, casirivimab and imdevimab, which eliminate the virus with the help of the immune system.
Stationär befindlichen Personen kann das Medikament Remdesivir verabreicht werden, welches die Virusverbreitung im menschlichen Körper hemmt. Des Weiteren können Baricitinib, Corticosteroide oder Plasma von Genesenen den COVID-19-Erkrankten verabreicht werden, deren Hauptwirkung vorrangig eine Reduktion allgemeiner Entzündungsprozesse ist.The drug remdesivir, which inhibits the spread of the virus in the human body, can be administered to people in hospital. Furthermore, baricitinib, corticosteroids or Plasma from convalescents are administered to COVID-19 sufferers, the main effect of which is primarily a reduction in general inflammatory processes.
Ein möglicher Ansatzpunkt für ein Therapeutikum zur Behandlung von COVID-19 ist die 3C-ähnliche Protease (3CL Protease oder SARS-CoV-2 3CLpro), die formell als C30-Endopeptidase bekannt ist. Diese ist die wichtigste Protease in Coronaviren. Sie ist eine Cystein-Protease und besitzt eine katalytische Cystein-Histidin-Dyade in ihrem aktiven Zentrum und spaltet eine Gln-(Ser/Ala/Gly)-Peptidbindung.A possible target for a therapeutic to treat COVID-19 is the 3C-like protease (3CL protease or SARS-CoV-2 3CL pro ), formally known as C30 endopeptidase. This is the most important protease in coronaviruses. It is a cysteine protease and has a catalytic cysteine-histidine dyad in its active site and cleaves a Gln (Ser/Ala/Gly) peptide bond.
Die Protease ist wichtig für die Prozessierung des Coronavirus-Replikase-Polyproteins (P0C6U8).The protease is important for processing the coronavirus replicase polyprotein (P0C6U8).
Damit ist die 3CL Protease ein potenzieller Angriffspunkt für Medikamente gegen Coronavirus-Infektionen, da sie eine wesentliche Rolle bei der Verarbeitung der Proteine spielt, die aus der viralen RNA übersetzt werden.This makes the 3CL protease a potential target for drugs against coronavirus infections because it plays an essential role in processing the proteins that are translated from the viral RNA.
Die in der Therapie einzusetzenden Inhibitoren sollen möglichst affin und spezifisch an die 3CL Protease von SARS-CoV-2 binden und deren enzymatische Funktion inhibieren. So soll die virale Replikation gehemmt werden.The inhibitors to be used in therapy should bind as affinely and specifically as possible to the 3CL protease of SARS-CoV-2 and inhibit its enzymatic function. This is to inhibit viral replication.
Vor diesem Hintergrund war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, chemische Einheiten zur Verfügung zu stellen, welche die 3CL Protease von SARS-CoV-2 binden und deren enzymatische Funktion möglichst umfassend hemmen. Durch diese inhibitorische Aktivität sollen die neuen chemischen Einheiten die virale Replikation von SARS-CoV-2 inhibitieren um somit zur COVID-19-Therapie eingesetzt werden zu können.Against this background, it was the object of the present invention to provide chemical units which bind the 3CL protease of SARS-CoV-2 and inhibit its enzymatic function as comprehensively as possible. Through this inhibitory activity, the new chemical entities are said to inhibit the viral replication of SARS-CoV-2 so that they can be used for COVID-19 therapy.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19, sowie Homologe, Fragmente und Teile davon.This object is achieved by a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, and homologues, fragments and parts thereof.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.Further preferred embodiments are defined in the dependent claims.
Im Folgenden soll der Begriff „umfassen“ auch „bestehend aus“ beinhalten.In the following, the term “comprise” should also include “consisting of”.
Die Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 wurden mit Hilfe einer optimierten Spiegelbild-PhagendisplaySelektion und anschließender NGS-Analyse gefunden.The peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 were found using optimized mirror image phage display selection and subsequent NGS analysis.
Im Spiegelbild-Phagendisplay wird z. B. eine rekombinante Bibliothek von randomisierten Peptidsequenzen, präsentiert am gp3 Protein des M13-Phagen und codiert in dessen Genom, gegen das genaue Spiegelbild (D-enantiomer) eines L-enantiomeren Zielmoleküls selektiert. Das gp3-Molekül, auch gene product 3 genannt, ist ein Protein, welches in der Hülle des Phagen sitzt und für den Kontakt mit der Wirtszelle benötigt wird.In mirror-image phage display, e.g. B. a recombinant library of randomized peptide sequences displayed on the gp3 protein of M13 phage and encoded in its genome, selected against the exact mirror image (D-enantiomer) of an L-enantiomeric target molecule. The gp3 molecule, also known as gene product 3, is a protein that sits in the phage coat and is required for contact with the host cell.
Die Peptidsequenz wird vorteilhaft am N-Terminus des gp3-Proteins des M13-Phagen präsentiert und liegt codiert in dessen Genom vor.The peptide sequence is advantageously presented at the N-terminus of the gp3 protein of M13 phage and is encoded in its genome.
Die DNA-Sequenz des p3-Gens eines selektierten Phagen ist verknüpft mit der DNA-Sequenz, die die genetische Information über die korrespondierende Peptidsequenz am gp3-Molekül enthält, wodurch diese sequenziert werden kann. The DNA sequence of the p3 gene of a selected phage is linked to the DNA sequence containing the genetic information about the corresponding peptide sequence on the gp3 molecule, allowing it to be sequenced.
Nach der Sequenzierung kann die genomische Sequenz in eine Aminosäuresequenz umgeschrieben werden und als D-enantiomeres Peptid, welches an die L-enantiomere Form des Zielmoleküls bindet, synthetisiert werden. Die Gesamtheit der Phagen, welche unterschiedliche Peptide als Fusionsprotein mit gp3 auf ihrer Oberfläche präsentieren wird im Folgenden als Phagenbibliothek bezeichnet. Die entsprechenden Peptide stellen die im Versuch zu selektierenden Biomoleküle dar.After sequencing, the genomic sequence can be transcribed into an amino acid sequence and synthesized as a D-enantiomeric peptide that binds to the L-enantiomeric form of the target molecule. The entirety of the phages which present different peptides as a fusion protein with gp3 on their surface is referred to below as a phage library. The corresponding peptides represent the biomolecules to be selected in the experiment.
Es können sogenannte panning-Runden (Selektionsrunden) durchgeführt werden, z. B. drei Runden. Dabei wird die Phagenbibliothek mit einem fixierten Zielmolekül, auch Köder genannt, in Kontakt gebracht und bindende Phagen aus dem milliardenfachen Hintergrund anderer, nicht-bindender Phagen isoliert.So-called panning rounds (selection rounds) can be carried out, e.g. B. three rounds. The phage library is brought into contact with a fixed target molecule, also known as a bait, and binding phages are isolated from the billions of background other, non-binding phages.
Um eine Anreicherung von Plastik-, BSA- oder Streptavidin-affinen Phagen zu verringern, werden erfindungsgemäß zudem in vorzugsweise allen panning-Runden verschiedene Substratoberflächen verwendet. Als Substratoberfläche ist in diesem Fall eine Kombination aus dem verwendeten biotinylierten Substrat (Polystyrol oder Polypropylen Oberfläche, die mit Streptavidin derivatisiert wurde) und den verwendeten Blockierungs- bzw. Quenchingagenzien definiert. In den aufeinanderfolgenden Selektionsrunden wird sukzessive der Selektionsdruck erhöht. Dazu wird, während die Konzentration des Zielmoleküls stabil bleibt, ab der 2. Selektionsrunde kontinuierlich die Waschschrittanzahl nach der Phageninkubation erhöht.In order to reduce accumulation of phages with an affinity for plastic, BSA or streptavidin, according to the invention different substrate surfaces are preferably used in all panning rounds. In this case, a combination of the biotinylated substrate used (polystyrene or polypropylene surface which has been derivatized with streptavidin) and the blocking or quenching agents used is defined as the substrate surface. In the successive selection rounds, the selection pressure is successively increased. For this purpose, while the concentration of the target molecule remains stable, the number of washing steps after the phage incubation is continuously increased from the 2nd round of selection.
Des Weiteren wird in jeder Selektionsrunde des Phagendisplay eine andere Substratoberfläche gewählt, indem nach der Immobilisierung des Zielmoleküls auf dem Substrat andere Agenzien zum Blockieren der Oberfläche genutzt werden (z. B. BSA, Milchpulver, keine Blockierung).Furthermore, in each selection round of phage display, a different substrate surface is chosen by using different agents to block the surface (e.g., BSA, milk powder, no blocking) after the target molecule has been immobilized on the substrate.
Beispielhaft kann zwischen einer BSA-blockierten Polystyrenoberfläche in Runde 1, einer Milchpulver-blockierten Polypropylen-Oberfläche in Runde 2 und einer BSA-blockierten Polystyren-Oberfläche in Runde 3 gewechselt werden.For example, you can switch between a BSA-blocked polystyrene surface in
Der Wechsel zwischen verschiedenen Substratoberflächen steigert die Spezifität für das Zielmolekül bzw. den Köder, gegenüber der Oberfläche. Außerdem erfolgt eine Reduzierung der Liganden, die unspezifisch an Plastikoberflächen, BSA oder andere Komponenten der Substratoberfläche außer dem Ködermolekül binden. The change between different substrate surfaces increases the specificity for the target molecule or the bait compared to the surface. In addition, there is a reduction in the number of ligands that bind non-specifically to plastic surfaces, BSA, or other components of the substrate surface other than the bait molecule.
Parallel zur eigentlichen Phagendisplayselektion können beispielhaft Kontrollselektionen durchgeführt werden, welche in Bezug auf die Durchführung mit der Hauptselektion identisch sind - mit dem wichtigen Unterschied, dass hier kein Köder eingesetzt wird. Eine Datenanalyse der Sequenzen, welche aus den Kontrollselektionen resultieren, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden, welche sich auch ohne Köder während der Selektion anreichern und somit für alle folgenden Schritte irrelevant sind.Parallel to the actual phage display selection, control selections can be carried out, for example, which are identical to the main selection in terms of implementation - with the important difference that no bait is used here. A data analysis of the sequences resulting from the control selections enables the identification of peptides that accumulate during the selection even without decoy and are therefore irrelevant for all subsequent steps.
Das Verfahren ist somit gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- a) Bereitstellen eines immobilisierten Köders auf einer Substratoberfläche.
- b) In Kontakt bringen des als Köder fungierenden immobilisierten Moleküls mit einer Lösung, die eine Bibliothek von zu selektierenden Molekülen enthält.
- c) In Kontakt bringen der mit den Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit einer Waschlösung.
- d) Trennung und Vermehrung der nach dem in Kontakt bringen der mit den Molekülen besetzten immobilisierten Köder mit Waschlösung weiterhin an den Köder gebundenen Moleküle.
- e) Wiederholung der genannten Schritte, wobei bei jeder Wiederholung ein unterschiedliches Substrat verwendet wird,
- f) Identifizierung der Sequenz der nach der Wiederholung auf den Ködern verbleibenden Moleküle.
- a) providing an immobilized bait on a substrate surface.
- b) contacting the baited immobilized molecule with a solution containing a library of molecules to be selected.
- c) Bringing the immobilized bait, which has been occupied with the molecules, into contact with a washing solution.
- d) Separation and multiplication of the molecules still bound to the bait after bringing the immobilized bait occupied with the molecules into contact with washing solution.
- e) repetition of said steps, using a different substrate for each repetition,
- f) Identification of the sequence of molecules remaining on the baits after repetition.
Ein unterschiedliches Substrat wird z. B. durch den Wechsel der Substratart und/oder dessen Blockierung oder Nichtblockierung mittels Reagenzien genutzt.A different substrate is z. B. by changing the type of substrate and / or its blocking or non-blocking by means of reagents.
Als Köder wird ein Molekül aus der Gruppe bestehend aus der rekombinant erzeugten 3CLpro aus COV-2 (PMID: 34068686) eingesetzt.A molecule from the group consisting of the recombinantly produced 3CLpro from COV-2 (PMID: 34068686) is used as a decoy.
Als Oberfläche, an die der Köder immobilisiert wird, wird z. B. eine Komponente aus der Gruppe bestehend aus Mikrotiterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepharosekügelchen eingesetzt.As a surface to which the bait is immobilized, z. B. used a component from the group consisting of microtiter plates, magnetic particles, agarose or sepharose beads.
Bei dem Köder nach Punkt a) handelt es sich also um eine Verbindung, an die das zu selektierende Biomolekül gebunden werden soll. Er wird nach dem Stand der Technik bekannten Methoden an eine erste Oberfläche fixiert. Beispielhaft aber nicht beschränkend können als Köder Proteine, Peptide, RNA oder DNA-Moleküle genannt werden. Als mögliche Oberflächen können beispielhaft Mikrotiterplatten, Magnetpartikel, Agarose- oder Sepharosekügelchen verwendet werden. Die Oberfläche mit dem immobilisierten Köder kann anschließend gequencht werden, wobei die funktionellen Gruppen des Substrates inaktiviert werden. Außerdem kann eine Blockierung der auf dem Substrat verbleibenden hydrophoben freien Flächen mit geeigneten Agenzien erfolgen.The bait according to point a) is therefore a compound to which the biomolecule to be selected is to be bound. It is fixed to a first surface using methods known in the art. Proteins, peptides, RNA or DNA molecules can be mentioned as baits by way of example but not limitation. Microtiter plates, magnetic particles, agarose or sepharose beads can be used as possible surfaces, for example. The surface with the immobilized bait can then be quenched, thereby inactivating the functional groups of the substrate. In addition, the hydrophobic free areas remaining on the substrate can be blocked with suitable agents.
Im zweiten Schritt b) wird der immobilisierte Köder mit einer randomisierten Bibliothek von Molekülen - speziell Biomolekülen - in Kontakt gebracht. Diese Biomoleküle konkurrieren um die Bindung an den Köder. Bei der randomisierten Bibliothek handelt es sich um eine Mischung von sehr vielen, beispielsweise 10-hoch-10, aber auch 1000 oder nur 100 verschiedenen Molekülen in einer Mischung. Eine solche Bibliothek kann beispielsweise jeweils aus Peptiden, Proteinen, DNA, RNA oder m-RNA bestehen, welche an bestimmten Vehikeln gebunden vorliegen, und die an Köder anbinden können. Als Vehikel kommen beispielsweise Phagen, Polysomen oder Bakterienoberflächen in Betracht. Die Bibliothek kann aus artifiziellen oder aus der Natur isolierten Bestandteilen oder aus einer Mischung von beidem bestehen. Unter artifiziell im Sinne der Erfindung sind beispielsweise aus der Oligonukleotidsynthese hergestellte Verbindungen zu verstehen.In the second step b), the immobilized bait is brought into contact with a randomized library of molecules, specifically biomolecules. These biomolecules compete to bind to the bait. The randomized library is a mixture of very many, for example 10 to the power of 10, but also 1000 or only 100 different molecules in a mixture. Such a library can consist, for example, of peptides, proteins, DNA, RNA or mRNA, which are bound to specific vehicles and which can bind to baits. Examples of suitable vehicles are phages, polysomes or bacterial surfaces. The library can consist of artificial components or components isolated from nature, or a mixture of both. For the purposes of the invention, artificially means, for example, compounds produced from oligonucleotide synthesis.
Es kann der mit Biomolekülen besetzte immobilisierte Köder in Schritt c) mit einer Waschsubstanz in Kontakt gebracht werden. Hierzu wird in Schritt c) ein Waschschritt durchgeführt, bei dem eine Pufferlösung mit den immobilisierten Ködern in Kontakt gebracht bzw. gespült wird. Dies bedeutet, dass die Lösung mit der Bibliothek von Biomolekülen vorzugsweise wiederholt durch eine ggf. ähnliche oder identische Lösung ausgetauscht wird. Somit werden diejenigen Bibliotheksmoleküle entfernt, welche weniger schnell von den immobilisierten Ködern abdissoziieren als andere Bibliotheksmoleküle. Die Geschwindigkeit der Ablösungsreaktion der bindenden Bibliotheksmoleküle wird dabei hauptsächlich durch die unterschiedlichen Dissoziationskonstanten (insbesondere die koff-Werte) der einzelnen Moleküle bestimmt. Solche mit einem kleinen koff-Wert bleiben statistisch gesehen am längsten am immobilisierten Köder gebunden und haben damit eine geringere statistische Wahrscheinlichkeit, durch den Waschpuffer weggewaschen zu werden. Die den Waschpuffer enthaltende Flüssigkeit ist vorzugsweise wässrig und kann einen pH-Puffer enthalten. Fakultative Komponenten der Lösung für den Spezifitätswaschschritt können Salze, Detergenzien oder Reduktionsmittel sein.The immobilized bait covered with biomolecules can be brought into contact with a washing substance in step c). For this purpose, a washing step is carried out in step c), in which a buffer solution is brought into contact with or rinsed with the immobilized baits. This means that the solution with the library of biomolecules is preferably repeatedly exchanged for a possibly similar or identical solution. Thus, those library molecules are removed which dissociate less quickly from the immobilized decoys than other library molecules. The speed of the detachment reaction of the binding library molecules is mainly determined by the different dissociation constants (in particular the koff values) of the individual molecules. Statistically speaking, those with a low koff value remain bound to the immobilized bait the longest and therefore have a lower statistical probability of being washed away by the wash buffer. The liquid containing the wash buffer is preferably aqueous and may contain a pH buffer. Optional components of the solution for the specificity wash step can be salts, detergents or reducing agents.
Nach dem Spezifitätswaschschritt in Schritt c) werden in Schritt d) die gebundenen Biomoleküle vom Köder getrennt und vermehrt. Die Trennung bzw. Elution kann beispielsweise durch Änderung des pH-Wertes, Erhitzen oder andere Änderungen, insbesondere Erhöhung der Salzkonzentration erfolgen. Anschließend werden die getrennten bzw. eluierten Biomoleküle nach bekannten Methoden vermehrt. Hierzu können beispielsweise nach den Schritten a) bis c) gewonnene und eluierte Phagenpartikel, welche die Biomoleküle auf ihrer Oberfläche tragen, in Zellen eingebracht und vermehrt werden.After the specificity washing step in step c), the bound biomolecules are separated from the bait and multiplied in step d). The separation or elution can take place, for example, by changing the pH, heating or other changes, in particular increasing the salt concentration. The separated or eluted biomolecules are then multiplied using known methods. For this purpose, for example, phage particles obtained and eluted according to steps a) to c), which carry the biomolecules on their surface, can be introduced into cells and multiplied.
Bei Schritt e) ist die Konzentration der selektierten Biomoleküle in der Lösung, die dem Köder nach Schritt a) zugeführt wird, erhöht. Vorzugsweise werden 3 bis 6 Selektionsrunden, die die Schritte a) bis e) enthalten, durchgeführt. Es können aber auch 1 bis 10 oder 1 bis 20 Wiederholungen durchgeführt werden.In step e), the concentration of the selected biomolecules in the solution that is fed to the bait after step a) is increased. Preferably 3 to 6 rounds of selection containing steps a) to e) are carried out. However, 1 to 10 or 1 to 20 repetitions can also be carried out.
Eine dabei vorzugsweise vorgenommene Erhöhung der Waschschritte in Schritt c) bei zunehmender Zyklenzahl führt zu einer verbesserten Selektion.An increase in the washing steps in step c), which is preferably carried out, with an increasing number of cycles leads to improved selection.
Auf diese Weise wurden 19 Peptide, die spezifisch an die 3CL Protease von SARS-CoV-2 binden, entwickelt.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch durch ein Peptid enthaltend Homologe, Fragmente und Teile der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis 19.The object according to the invention is also achieved by a peptide containing homologues, fragments and parts of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 to 19.
„Homologe Sequenzen“ oder „Homologe“ bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% aufweist. Bevorzugt sind hierbei 80% und 90%. Anstelle des Begriffs „Identität“ werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe „homolog“ oder „Homologie“ gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T. F. und Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S. B. und Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.In the context of the invention, "homologous sequences" or "homologs" means that an amino acid sequence has an identity with one of the above-mentioned amino acid sequences of the monomers of at least 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% . 80% and 90% are preferred here. Instead of the term “identity”, the terms “homologous” or “homology” are used interchangeably in the present description. The identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is calculated by comparison using the BESTFIT program based on the algorithm of Smith, TF and Waterman, MS (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) using the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids: gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3. The identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is preferably defined by the identity of the nucleic acid sequence/polypeptide sequence over the entire sequence length in each case, as determined by comparison using the program GAP based on the algorithm of Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48:443-453) setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch, wenn sie dieselbe Aminosäuresequenz besitzen.Two amino acid sequences are identical for the purposes of the present invention if they have the same amino acid sequence.
Unter Homologe sind in einer Variante die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen zu verstehen, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu zwei oder drei Aminosäuren unterscheiden.In one variant, homologues are to be understood as meaning the peptide sequences according to the invention which differ from the specified sequences by up to two or three amino acids.
In einer Ausführungsform ist die Homologie bzw. die Identität unabhängig davon ob es sich um D- oder L-Aminosäuren handelt. Die Homologie bzw. die Identität bezieht sich hier nur auf die Aminosäuresequenz.In one embodiment, the homology or identity is independent of whether it is D- or L-amino acids. The homology or identity relates here only to the amino acid sequence.
Ferner können als Peptide auch Sequenzen eingesetzt werden, die die oben genannten Sequenzen enthalten.Furthermore, sequences which contain the above-mentioned sequences can also be used as peptides.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) oder eine COH-Gruppe, COCl-Gruppe, COBr-Gruppe, CONH-alkyl-Rest oder ein CONH-alkyl-Amin-Rest vorliegt oder aber das Peptid zyklisiert vorliegt.The peptides according to the invention are also preferably characterized in that an acid amide group (CONH 2 group) or a COH group, COCl group, COBr group, CONH-alkyl radical or a CONH- alkyl-amine residue is present or the peptide is present in cyclized form.
Damit wird besonders vorteilhaft zusätzlich die Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negative Ladung am C-terminus, bereitgestellt wird. Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, dass dieses mit höherer Affinität an das Zielmolekül binden kann, als ein Peptid, welches eine Carboxylgruppe am freien C-terminus aufweist. Peptide mit freier, nichtmodifizierter Carboxylgruppe weisen im physiologischen Zustand eine negative Ladung an diesem Ende auf.In this way, the problem of providing a peptide without a negative charge at the C-terminus is additionally achieved in a particularly advantageous manner. This has the advantageous effect that it can bind to the target molecule with higher affinity than a peptide which has a carboxyl group at the free C-terminus. In the physiological state, peptides with a free, unmodified carboxyl group have a negative charge at this end.
In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide im physiologischen Zustand, insbesondere bei pH 6-8, insbesondere 6,5-7,5, insbesondere bei pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5 pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3, pH 7,4, pH 7,5, pH 7,6, pH 7,7, pH 7,8, pH 7,9 bzw. pH 8,0 derart modifiziert, dass der C-terminus keine negative Ladung trägt, sondern stattdessen neutral ist oder eine oder mehrere positive Ladungen aufweist.In one embodiment of the invention, the peptides according to the invention are in the physiological state, in particular at pH 6-8, in particular 6.5-7.5, in particular at pH 6.0, pH 6.1, pH 6.2, pH 6.3 , pH 6.4, pH 6.5 pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, pH 7.5, pH 7.6, pH 7.7, pH 7.8, pH 7.9 or pH 8.0 modified in such a way that the C-terminus does not carry a negative charge, but instead is neutral or has one or more positive charges.
In einer Ausführungsform ist das Peptid dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus an Stelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe vorliegt. Statt der Carboxylgruppe (-COOH-Gruppe) ist also eine Säureamidgruppe (-CONH2-Gruppe) am C-terminus angeordnet.In one embodiment, the peptide is characterized in that an acid amide group is present at the free C-terminus instead of the carboxyl group. Instead of the carboxyl group (-COOH group), an acid amide group (-CONH 2 group) is arranged at the C-terminus.
Dadurch wird besonders vorteilhaft die weitere Aufgabe gelöst, dass ein Peptid ohne negativen Ladungsüberschuss vorliegt, welches affiner an das Zielmolekül binden kann und auf einfache Weise erhältlich ist.In this way, the further object is achieved in a particularly advantageous manner, namely that a peptide is present without excess negative charge, which can bind to the target molecule with greater affinity and is easily obtainable.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung liegen folgende weitere Gruppen an Stelle der Carboxylgruppe vor: COH, COCI, COBr, CONH-alkyl-Rest, CONH-alkyl-Amin-Rest (positive Netto-Ladung) etc., wobei man hierauf nicht beschränkt ist, sofern der technischen Lehre des Hauptanspruchs gefolgt wird.In a further embodiment of the invention, the following additional groups are present instead of the carboxyl group: COH, COCl, COBr, CONH-alkyl radical, CONH-alkyl-amine radical (net positive charge), etc., without being restricted to this , provided that the technical teaching of the main claim is followed.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide dadurch gekennzeichnet, dass am freien N-terminus anstelle der Aminogruppe eine chemisch modifizierte Gruppe vorliegt, insbesondere in Form einer Acetylaminogruppe.In a further embodiment of the invention, the peptides according to the invention are characterized in that a chemically modified group is present at the free N-terminus instead of the amino group, in particular in the form of an acetylamino group.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide dadurch gekennzeichnet, dass am freien C-terminus anstelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe vorliegt und am freien N-terminus anstelle der Aminogruppe eine Acetylaminogruppe vorliegt.In a further embodiment of the invention, the peptides according to the invention are characterized in that an acid amide group is present at the free C-terminus instead of the carboxyl group and an acetylamino group is present at the free N-terminus instead of the amino group.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr Kopien der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 enthält.The peptide according to the invention is further preferably characterized in that it contains 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more copies of the sequences from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
Es sind auch Varianten denkbar, wobei das Peptid 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Peptide mit der aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 enthält.Variants are also conceivable, where the peptide 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more peptides with the from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
Insbesondere bevorzugt sind Dimere der Sequenzen mit der aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19, wobei es sich bei den beiden Monomeren des Dimers um Peptide mit der gleichen SEQ ID oder mit einer verschiedenen SEQ ID handelt.Particularly preferred are dimers of the sequences with the from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, wherein the two monomers of the dimer are peptides with the same SEQ ID or with a different SEQ ID.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehen.The peptides according to the invention are further preferably characterized in that they consist essentially of D-amino acids.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus D-enantiomeren Aminosäuren“, dass die erfindungsgemäß einzusetzenden Peptide mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70% bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-enantiomeren Aminosäuren aufgebaut sind.For the purposes of the present invention, the term "essentially composed of D-enantiomeric amino acids" means that the peptides to be used according to the invention contain at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, preferably 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, 95%, in particular 96%, 97%, 98%, 99%, 100% are made up of D-enantiomeric amino acids.
Es ist in der Literatur (siehe: Through the looking glass, mechanistic insights from enantiomeric human defensins. Wei et al. 2009, Journal of Biological Chemistry; Analysis of endogenous D-amino acid-containing peptides in metazoa. Bai et al. 2009, Bioanalytical reviews) gut beschrieben, dass eine strukturelle Umwandlung oder sterische Inkompatibilität im D-Enantiomer (Im Vergleich zum L-Enantiomer) die Hemmung oder das Bindungsverhalten der getesteten D-Peptide mit dem Zielmolekül beeinflussen kann.It is in the literature (see: Through the looking glass, mechanistic insights from enantiomeric human defensins. Wei et al. 2009, Journal of Biological Chemistry; Analysis of endogenous D-amino acid-containing peptides in metazoa. Bai et al. 2009, Bioanalytical reviews) well described that a structural transformation or steric incompatibility in the D-enantiomer (compared to the L-enantiomer) can affect the inhibition or the binding behavior of the tested D-peptides with the target molecule.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 besteht.The peptide according to the invention is further preferably characterized in that it consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einer weiteren Substanz verknüpft ist.The peptide according to the invention is also preferably characterized in that the peptide is linked to another substance.
Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1, Seite 650 ff, Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvalenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.In the context of the invention, the link is a chemical bond as defined in Rompp Chemie Lexikon, 9th edition,
Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arzneilich wirksame Stoffe verwendet werden.In one variant, the substances are drugs or active ingredients, defined in accordance with the Drugs Act §2 or. §4 (19), as of September 2012. In an alternative, active substances are therapeutically active substances that are used as medicinally active substances.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen, die die Wirkung der Peptide verstärken.In another variant, the substances are compounds that enhance the effect of the peptides.
In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen, die die Löslichkeit der Peptide verbessern.Another alternative involves compounds that improve the solubility of the peptides.
In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jeder beliebigen Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen.In an alternative, according to the invention, the peptides have any combination of at least two or more features of the variants, embodiments and/or alternatives described above.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und/oder SEQ ID NO: 19 kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind. In einer Ausführungsform der Erfindung wird dabei eine Linker-Gruppe in Form eines Polyarginin-Linkers eingesetzt.The peptide according to the invention is further preferably characterized in that several peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and/or SEQ ID NO: 19 are covalently or non-covalently linked to one another. In one embodiment of the invention, a linker group in the form of a polyarginine linker is used.
Eine kovalente Verbindung bzw. Verknüpfung der Peptid-Einheiten liegt im Sinne der Erfindung vor, falls die Peptide Kopf an Kopf, Schwanz an Schwanz oder Kopf an Schwanz linear miteinander verknüpft werden, mit oder ohne dazwischen eingefügten Linken oder Linker-Gruppen.A covalent connection or linkage of the peptide units is present within the meaning of the invention if the peptides are linearly linked head to head, tail to tail or head to tail, with or without links or linker groups inserted in between.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19 ohne Linker, also unmittelbar miteinander verknüpft, oder mit einer Linker-Gruppe miteinander verknüpft sind.The peptide according to the invention is also preferably characterized in that a plurality of peptides from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 without a linker, ie linked directly to one another, or are linked to one another with a linker group.
Eine nicht kovalente Verknüpfung im Sinne der Erfindung liegt vor, falls die Peptide beispielsweise über Biotin und Streptavidin, insbesondere Streptavidin-Tetramer miteinander verknüpft sind.A non-covalent linkage within the meaning of the invention is present if the peptides are linked to one another, for example via biotin and streptavidin, in particular streptavidin tetramer.
Das erfindungsgemäße Peptid ist ferner vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Peptide der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und/oder SEQ ID NO: 19 linear oder verzweigt miteinander verknüpft sind.The peptide according to the invention is also preferably characterized in that a plurality of peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and/or SEQ ID NO: 19 are linked to one another in a linear or branched manner.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung können die Peptide linear miteinander verknüpft sein, insbesondere wie oben beschrieben. In einer anderen Variante sind die Peptide verzweigt miteinander zu dem erfindungsgemäßen Peptid verknüpft.In a variant of the present invention, the peptides can be linked to one another in a linear manner, in particular as described above. In another variant, the peptides are linked to one another in a branched manner to form the peptide according to the invention.
Bei einem verzweigten Peptid kann es sich erfindungsgemäß um ein Dendrimer handeln, bei dem die Monomere kovalent oder nicht kovalent miteinander verknüpft sind.According to the invention, a branched peptide can be a dendrimer in which the monomers are linked to one another covalently or non-covalently.
Alternativ können die Peptide auch mit einem Plattform-Molekül (wie z. B. PEG oder Zucker) verknüpft sein und so ein verzweigtes Peptid bilden.Alternatively, the peptides can also be linked to a platform molecule (such as PEG or sugar) to form a branched peptide.
Alternativ sind auch Kombinationen dieser Optionen möglich.Alternatively, combinations of these options are also possible.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Peptid dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Peptides vorliegt, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und/oder SEQ ID NO: 10, wobei am freien C-terminus anstelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) vorliegt.In one embodiment of the present invention, the peptide according to the invention is characterized in that it is in the form of a peptide consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and/or SEQ ID NO: 10, where an acid amide group (CONH2 group) is present at the free C-terminus instead of the carboxyl group present.
In dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung also folgende Peptide:
- 3CVL-1 (N-term frei, C-term amidiert) ANYKMTNNWDALTWAS-NH2
- 3CVL-2 (N-term frei, C-term amidiert) SPHGWPSQSIEVQPQW-NH2
- 3CVL-3 (N-term frei, C-term amidiert) SHNQEKSTYDHRMPE-NH2
- 3CVL-4 (N-term frei, C-term amidiert) AHEGWTWDWTPQYSWK-NH2
- 3CVL-5 (N-term frei, C-term amidiert) WADALNHVPKNNWPMR-NH2
- 3CVL-7 (N-term frei, C-term amidiert) TVAPLHAHYWDVEERH-NH2
- 3CVL-8 (N-term frei, C-term amidiert) QPWEHR AQPQWQQPMR -NH2
- 3CVL-9 (N-term frei, C-term amidiert) HLSSASSPNANHHMQK-NH2
- 3CVL-10 (N-term frei, C-term amidiert) QPYMNGMHWDKTQWM R-NH2
- 3CVL-11 (N-term frei, C-term amidiert) DHLSWQQNWYWAWQYE-NH2
- 3CVL-1 (N-term free, C-term amidated) ANYKMTNNWDALTWAS-NH2
- 3CVL-2 (N-term free, C-term amidated) SPHGWPSQSIEVQPQW-NH2
- 3CVL-3 (N-term free, C-term amidated) SHNQEKSTYDHRMPE-NH2
- 3CVL-4 (N-term free, C-term amidated) AHEGWTWDWTPQYSWK-NH2
- 3CVL-5 (N-term free, C-term amidated) WADALNHVPKNNWPMR-NH2
- 3CVL-7 (N-term free, C-term amidated) TVAPLHAHYWDVEERH-NH2
- 3CVL-8 (N-term free, C-term amidated) QPWEHR AQPQWQQPMR -NH2
- 3CVL-9 (N-term free, C-term amidated) HLSSASSPNANHHMQK-NH2
- 3CVL-10 (N-term free, C-term amidated) QPYMNGMHWDKTQWM R-NH2
- 3CVL-11 (N-term free, C-term amidated) DHLSWQQNWYWAWQYE-NH2
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Peptid dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Peptides vorliegt, bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 und/oder SEQ ID NO: 13, wobei das Peptid aus D-Aminosäuren besteht (mit Ausnahme des achiralen Glycin), am freien C-terminus anstelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) vorliegt und am freien N-terminus anstelle der Aminogruppe eine Acetylaminogruppe vorliegt.In one embodiment of the present invention, the peptide according to the invention is characterized in that it is in the form of a peptide consisting of SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and/or SEQ ID NO: 13, the peptide consisting of D-amino acids (with the exception of the achiral glycine), an acid amide group (CONH2 group) is present at the free C-terminus instead of the carboxyl group, and an acetylamino group is present at the free N-terminus instead of the amino group.
In dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung also folgende Peptide:
- 3CVLri-2 (N-term acetyliert, C-term amidiert) Ac-wqpqveisqspwGhpsr-NH2
- 3CVLri-4 (N-term acetyliert, C-term amidiert) Ac-kwsyqptwdwtwGehar-NH2
- 3CVLri-7 (N-term acetyliert, C-term amidiert) Ac-hreevdwyhahlpavtr-NH2
- 3CVLri-2 (N-term acetylated, C-term amidated) Ac-wqpqveisqspwGhpsr-NH2
- 3CVLri-4 (N-term acetylated, C-term amidated) Ac-kwsyqptwdwtwGehar-NH2
- 3CVLri-7 (N-term acetylated, C-term amidated) Ac-hreevdwyhahlpavtr-NH2
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Kombination von zwei oder mehr erfindungsgemäßen Peptiden. Insbesondere hat sich gezeigt, dass durch den kombinierten Einsatz von Peptid 3CVLri-2 mit 3CVLri-4 bzw. von 3CVLri-4 mit 3CVLri-7 eine noch effizientere Inhibierung der 3CL Protease erreicht wurde.The present invention also relates to the combination of two or more peptides according to the invention. In particular, it has been shown that an even more efficient inhibition of the 3CL protease was achieved through the combined use of peptide 3CVLri-2 with 3CVLri-4 or of 3CVLri-4 with 3CVLri-7.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Peptid dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Peptides vorliegt, bestehend aus SEQ ID NO: 14 und/oder SEQ ID NO: 15, wobei das Peptid aus D-Aminosäuren besteht, am freien C-terminus anstelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) vorliegt und am freien N-terminus anstelle der Aminogruppe eine Acetylaminogruppe vorliegt. In dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung also folgende Peptide:
- 3CVLri-2a (N-term acetyliert, C-term amidiert) Ac-wqpwveisqspwshpsr-NH2
- 3CVLri-4a (N-term acetyliert, C-term amidiert) Ac-kwsyqptwdwtwsehar-NH2
- 3CVLri-2a (N-term acetylated, C-term amidated) Ac-wqpwveisqspwshpsr-NH2
- 3CVLri-4a (N-term acetylated, C-term amidated) Ac-kwsyqptwdwtwsehar-NH2
Es hat sich gezeigt, dass die Peptide 3CVLri-2a und 3CVLri-4a in Bezug auf ihre Proteasestabilität besonders gute Eigenschaften aufweisen.It has been shown that the peptides 3CVLri-2a and 3CVLri-4a have particularly good properties with regard to their protease stability.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Peptid dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Peptides vorliegt, bestehend aus SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und/oder SEQ ID NO: 19, wobei das Peptid aus D-Aminosäuren besteht, am freien C-terminus anstelle der Carboxylgruppe eine Säureamidgruppe (CONH2-Gruppe) vorliegt und am freien N-terminus anstelle der Aminogruppe eine Acetylaminogruppe vorliegt. In dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung also folgende Peptide:
- 3CVLri-2a6r4a (N-term acetyliert, C-term amidiert)
- Ac-wqpsveisqspwshpsrrrrrrrkwsyqptwdwtwsehar -NH2
- 3CVLri-4a6r2a (N-term acetyliert, C-term amidiert)
- Ac-kwsyqptwdwtwseharrrrrrrwqpqveisqspwshpsr-NH2
- 3CVLri-4a6r7 (N-term acetyliert, C-term amidiert)
- Ac-kwsyqptwdwtwseharrrrrrrhreevdwyhahlpavtr-NH2
- 3CVLri-76r4a (N-term acetyliert, C-term amidiert)
- Ac-hreevdwyhahlpavtrrrrrrrkwsyqptwdwtwsehar-NH2
- 3CVLri-2a6r4a (N-term acetylated, C-term amidated)
- Ac-wqpsveisqspwshpsrrrrrrrkwsyqptwdwtwsehar -NH2
- 3CVLri-4a6r2a (N-term acetylated, C-term amidated)
- Ac-kwsyqptwdwtwseharrrrrrrwqpqveisqspwshpsr-NH2
- 3CVLri-4a6r7 (N-term acetylated, C-term amidated)
- Ac-kwsyqptwdwtwseharrrrrrrhreevdwyhahlpavtr-NH2
- 3CVLri-76r4a (N-term acetylated, C-term amidated)
- Ac-hreevdwyhahlpavtrrrrrrrkwsyqptwdwtwsehar-NH2
Bei den Peptiden 3CVLri-2a6r4a, 3CVLri-4a6r2a, 3CVLri-4a6r7, 3CVLri-76r4a handelt es sich um Tandemskonstrukte der Peptide 3CVLri-2a, 3CVLri-4a und 3CVLri-7, die mit einem Polyarginin-Linker verknüpft sind. Diese Tandemkonstrukte wurden zu weiteren Steigerungen der Affinität zu 3CL sowie im Hinblick auf eine effizientere Inhibierung der Protease entwickelt.The peptides 3CVLri-2a6r4a, 3CVLri-4a6r2a, 3CVLri-4a6r7, 3CVLri-76r4a are tandem constructs of the peptides 3CVLri-2a, 3CVLri-4a and 3CVLri-7 linked with a polyarginine linker. These tandem constructs were designed to further increase affinity for 3CL and to inhibit the protease more efficiently.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Entwicklung von effizienten Inhibotoren der SARS-CoV-2 3 CL Protease. In einer Ausgestaltung der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide somit über den IC50 gegen die SARS-CoV-2 3CL Protease definiert.The aim of the present invention is to develop efficient inhibitors of the SARS-CoV-2 3 CL protease. In one embodiment of the invention, the peptides according to the invention are thus defined via the IC 50 against the SARS-CoV-2 3CL protease.
Als mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) wird die Konzentration eines Inhibitors (synonym Hemmstoff) bezeichnet, bei der eine halbmaximale Inhibition (halbmaximale Hemmung) beobachtet wird.The mean inhibitory concentration (IC 50 ) is the concentration of an inhibitor (synonymous with inhibitor) at which half-maximal inhibition (half-maximal inhibition) is observed.
In der Pharmakologie wird die IC50 verwendet, um die Wirkstärke eines Antagonisten anzugeben. Dieser ist vergleichbar mit der EC50 eines Agonisten.In pharmacology, the IC 50 is used to indicate the potency of an antagonist. This is comparable to the EC 50 of an agonist.
Nach der Definition der FDA ist IC50 die Konzentration einer Substanz, die für eine 50%ige Inhibierung in vitro notwendig ist.According to the FDA definition, IC 50 is the concentration of a substance necessary for 50% inhibition in vitro.
In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die einen IC50 gegen die SARS-CoV-2 3CL Protease von höchstens 500 µM, bevorzugt 250, 100, 50 µM, besonders bevorzugt 25, 10, 1 µM, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (KD-Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.In a variant of the invention, peptides are used which have an IC 50 against the SARS-CoV-2 3CL protease of at most 500 μM, preferably 250, 100, 50 μM, particularly preferably 25, 10, 1 μM, particularly preferably with a dissociation constant (K D value) of at most 500 nM, 250, 100, 50, more preferably 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 , 4, 3, 2, 1 pM to sub-pM, with any intermediate value.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind ferner vorzugsweise, dadurch gekennzeichnet, dass einen IC50 gegen die gegen die SARS-CoV-2 3CL Protease von kleiner als kleiner als 100 µM, bevorzugt kleiner als 10 µM, weiter bevorzugt kleiner als 1 µM, noch stärker bevorzugt kleiner als 100 nM, insbesondere zwischen 10 µM und 50 nM aufweisen.The peptides according to the invention are also preferably characterized in that an IC 50 against the SARS-CoV-2 3CL protease of less than less than 100 μM, preferably less than 10 μM, more preferably less than 1 μM, even more preferably less than 100 nM, in particular between 10 μM and 50 nM.
In einer Variante der Erfindung werden solche Peptide eingesetzt, die an die SARS-CoV-2 3CL Protease mit einer Dissoziationskonstante (KD-Wert) von höchstens 500 µM, bevorzugt 250, 100, 50 µM, besonders bevorzugt 25, 10, 1 µM, besonders bevorzugt mit einer Dissoziationskonstante (KD-Wert) von höchstens 500 nM, 250, 100, 50, besonders bevorzugt 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM bis sub-pM bindet, wobei jeder Zwischenwert angenommen werden kann.In a variant of the invention, such peptides are used that bind to the SARS-CoV-2 3CL protease with a dissociation constant (K D value) of at most 500 μM, preferably 250, 100, 50 μM, particularly preferably 25, 10, 1 μM , particularly preferably with a dissociation constant (K D value) of at most 500 nM, 250, 100, 50, particularly preferably 25, 10, 1 nM, 500 pM, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8 , 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pM to sub-pM, with any intermediate value.
Die Peptide können beispielsweise über chemische Synthese bzw. Peptidsynthese hergestellt werden.The peptides can be produced, for example, via chemical synthesis or peptide synthesis.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Peptids wie vorstehend beschrieben zur Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease.The present invention also relates to the use of a peptide as described above for inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease.
Diese Verwendung kann sich auf die in vitro oder die in vivo Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease beziehen.This use may relate to in vitro or in vivo inhibition of SARS-CoV-2 3CL protease.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid wie vorstehend beschrieben zur Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease.The present invention also relates to a peptide as described above for inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease.
Das Peptid zur Verwendung in der Inhibierung der SARS-CoV-2 3CL Protease kann dabei in vitro oder in vivo verwendet werden.The peptide for use in inhibiting the SARS-CoV-2 3CL protease can be used in vitro or in vivo.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid wie vorstehend beschrieben zur Verwendung als Arzneimittel.The present invention also relates to a peptide as described above for use as a medicament.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Peptid wie vorstehend beschrieben zur Verwendung in der Behandlung von COVID-19.The present invention also relates to a peptide as described above for use in the treatment of COVID-19.
Figurenlistecharacter list
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1 : Primäre Inhibitionstests von 3CVL-1, 3CVL-2, 3CVL-3, 3CVL-4, 3CVL-5, 3CVL-6, 3CVL-7, 3CVL-8, 3CVL-9, 3CVL-10 und 3CVL-11 gegen SARS-CoV-2 3CLpro. 3CVL-1, 3CVL-2, 3CVL-4 und 3CVL-7 hemmen die Proteaseaktivität um mehr als 50%. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Messungen (n = 3). Sternchen bedeuten, dass sich die Daten von der Kontrolle (0 uM Inhibitor) signifikant unterscheiden, bei p <0,05 (*), p <0,01 (**) und p <0,001 (***).1 : Primary inhibition assays of 3CVL-1, 3CVL-2, 3CVL-3, 3CVL-4, 3CVL-5, 3CVL-6, 3CVL-7, 3CVL-8, 3CVL-9, 3CVL-10 and 3CVL-11 against SARS CoV-2 3CL per . 3CVL-1, 3CVL-2, 3CVL-4 and 3CVL-7 inhibit protease activity by more than 50%. Data shown are the mean ± standard error of three independent measurements (n=3). Asterisks indicate that the data are significantly different from the control (0 µM inhibitor) at p<0.05 (*), p<0.01 (**), and p<0.001 (***). -
2 : 3CVL-1 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-1 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-1 und SARS-CoV-2 3CLpro.2 : 3CVL-1 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-1 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-1 and SARS-CoV-2 3CL per . -
3 : 3CVL-2 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-2 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-2 und SARS-CoV-2 3CLpro.3 : 3CVL-2 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-2 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-2 and SARS-CoV-2 3CL per . -
4 : 3CVL-4 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-2 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-2 und SARS-CoV-2 3CLpro.4 : 3CVL-4 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-2 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-2 and SARS-CoV-2 3CL per . -
5 : 3CVL-7 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-7 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-7 und SARS-CoV-2 3CLpro.5 : 3CVL-7 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-7 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-7 and SARS-CoV-2 3CL per . -
6 : Lineweaver-Burk-Diagramm zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von 3CVL-1 gegen SARS-CoV-2 3CLpro. [S] ist die Substratkonzentration; v ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Ergebnisse deuten auf eine nicht kompetitive Hemmung der SARS-CoV-2 3CLproAktivität durch 3CVL-1 hin.6 : Lineweaver-Burk plot to determine the mode of inhibition of 3CVL-1 versus SARS-CoV-2 3CL per . [S] is the substrate concentration; v is the reaction rate. The results indicate non-competitive inhibition of SARS-CoV-2 3CL per activity by 3CVL-1. -
7 : Lineweaver-Burk-Diagramm zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von 3CVL-2 gegen SARS-CoV-2 3CLpro. [S] ist die Substratkonzentration; v ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Ergebnisse deuten auf eine kompetitive Hemmung der SARS-CoV-2 3CLproAktivität durch 3CVL-2 hin.7 : Lineweaver-Burk plot to determine the mode of inhibition of 3CVL-2 versus SARS-CoV-2 3CL per . [S] is the substrate concentration; v is the reaction rate. The results indicate competitive inhibition of SARS-CoV-2 3CL per activity by 3CVL-2. -
8 : Lineweaver-Burk-Diagramm zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von 3CVL-4 gegen SARS-CoV-2 3CLpro. [S] ist die Substratkonzentration; v ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Ergebnisse deuten auf eine nicht kompetitive Hemmung der SARS-CoV-2 3CLproAktivität durch 3CVL-4 hin.8th : Lineweaver-Burk plot to determine the mode of inhibition of 3CVL-4 versus SARS-CoV-2 3CL per . [S] is the substrate concentration; v is the reaction rate. The results indicate non-competitive inhibition of SARS-CoV-2 3CL per activity by 3CVL-4. -
9 : Lineweaver-Burk-Diagramm zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von 3CVL-7 gegen SARS-CoV-2 3CLpro. [S] ist die Substratkonzentration; v ist die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Ergebnisse deuten auf eine kompetitive Hemmung der SARS-CoV-2 3CLproAktivität durch 3CVL-7 hin.9 : Lineweaver-Burk plot to determine the mode of inhibition of 3CVL-7 versus SARS-CoV-2 3CL per . [S] is the substrate concentration; v is the reaction rate. The results indicate competitive inhibition of SARS-CoV-2 3CL per activity by 3CVL-7. -
10 : Kombinierte 3CVL-1+2 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLprogegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-1+2 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-1+2 und SARS-CoV-2 3CLpro.10 : Combined 3CVL-1+2 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-1+2 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-1+2 and SARS-CoV-2 3CL per . -
11 : Kombinierte 3CVL-1 und 3CVL-7 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLprogegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-1+7 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-1 und 3CVL-7 und SARS-CoV-2 3CLpro.11 : Combined 3CVL-1 and 3CVL-7 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-1+7 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-1 and 3CVL-7 and SARS-CoV-2 3CL per . -
12 : Kombinierte 3CVL-2 und 3CVL-4 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLprogegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-2+4 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-2 und 3CVL-4 und SARS-CoV-2 3CLpro.12 : Combined 3CVL-2 and 3CVL-4 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment by 3CVL-2+4 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-2 and 3CVL-4 and SARS-CoV-2 3CL per . -
13 : Kombinierte 3CVL-7 und 3CVL-4 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLprogegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVL-7+4 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVL-7 und 3CVL-4 und SARS-CoV-2 3CLpro.13 : Combined 3CVL-7 and 3CVL-4 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVL-7+4 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVL-7 and 3CVL-4 and SARS-CoV-2 3CL per . -
14 : 3CVLri-2 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVLri-2 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVLri-2 und SARS-CoV-2 3CLpro.14 : 3CVLri-2 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVLri-2 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVLri-2 and SARS-CoV-2 3CL per . -
15 : 3CVLri-4 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVLri-4 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVLri-4 und SARS-CoV-2 3CLpro.15 : 3CVLri-4 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVLri-4 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVLri-4 and SARS-CoV-2 3CL per . -
16 : 3CVLri-7 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLpro gegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVLri-7 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVLri-7 und SARS-CoV-2 3CLpro.16 : 3CVLri-7 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVLri-7 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVLri-7 and SARS-CoV-2 3CL per . -
17 : Kombinierte 3CVLri-2 und 3CVLri-4 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLprogegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVLri-2 und 3CVLri-4 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVLri-2 und 3CVLri-4 und SARS-CoV-2 3CLpro.17 : Combined 3CVLri-2 and 3CVLri-4 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVLri-2 and 3CVLri-4 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVLri-2 and 3CVLri-4 and SARS-CoV-2 3CL per . -
18 : Kombinierte 3CVLri-7 und 3CVLri-4 Titration und Dosis-Wirkungs-Kurve zur IC50-Bestimmung. Bei den Titrationsexperimenten ist die Aktivität und Inhibierung von SARS-CoV-2 3CLprogegen die Peptidkonzentration aufgetragen. Bei der Dosis-Wirkungs-Kurve ist die normalisierte Reaktion [%] von SARS-CoV-2 3CLprogegen den Logarithmus der Peptidkonzentration aufgetragen. A: Titrationsexperiment von 3CVLri-7 und 3CVLri-4 und SARS-CoV-2 3CLpro. B: Dosis-Wirkungs-Kurve von 3CVLri-7 und 3CVLri-4 und SARS-CoV-2 3CLpro.18 : Combined 3CVLri-7 and 3CVLri-4 titration and dose-response curve for IC 50 determination. In the titration experiments, the activity and inhibition of SARS-CoV-2 3CL per is plotted against the peptide concentration. The dose-response curve plots the normalized response [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the peptide concentration. A: Titration experiment of 3CVLri-7 and 3CVLri-4 and SARS-CoV-2 3CL per . B: Dose-response curve of 3CVLri-7 and 3CVLri-4 and SARS-CoV-2 3CL per . -
19 : Multicycle Experiment der Peptide 3CVL-2, 4 und 7 auf der SARS-CoV-2 3CL Protease. Die Protease wurde auf einem CMS-Sensor immobilisiert und die Peptide als Analyten im Konzentrationsbereich von 3 - 50 µM injiziert. Die Bindungskurven wurden mit einem heterogenen Liganden Modell gefittet (Fits in Schwarz). Die kinetischen Daten des Fits sind in der Tabelle zusammengefasst.19 : Multicycle experiment of the peptides 3CVL-2, 4 and 7 on the SARS-CoV-2 3CL protease. The protease was immobilized on a CMS sensor and the peptides were injected as analytes in a concentration range of 3 - 50 µM. The binding curves were fitted with a heterogeneous ligand model (fits in black). The kinetic data of the fit are summarized in the table. -
20 : Multicycle Experiment der Peptide 3CVLri-2, 4 und 7 auf der SARS-CoV-2 3CL Protease. Die Protease wurde auf einem CMS-Sensor immobilisiert und die Peptide als Analyten im Konzentrationsbereich von 3 - 50 µM injiziert. Die Bindungskurven wurden mit einem heterogenen Liganden Modell gefittet (Fits in Schwarz). Die kinetischen Daten des Fits sind in der Tabelle zusammengefasst.20 : Multicycle experiment of the peptides 3CVLri-2, 4 and 7 on the SARS-CoV-2 3CL protease. The protease was immobilized on a CMS sensor and the peptides were injected as analytes in a concentration range of 3 - 50 µM. The binding curves were fitted with a heterogeneous ligand model (fits in black). The kinetic data of the fit are summarized in the table.
Beispieleexamples
Die Erfindung wird nachfolgend in nicht beschränkenden Beispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below in non-limiting examples.
Aktivitätstest und Inhibitionstestactivity test and inhibition test
Zum Nachweis der Wirkung der identifizierten Peptide auf die SARS-CoV-2 3CLpro Aktivität wurden Inhibitionstest durchgeführt. Dabei wurde der Einfluss der Wirkstoffe einzeln und in Kombination auf die Enzym-Aktivität der SARS-CoV-2 3CLprountersucht.Inhibition assays were performed to demonstrate the effect of the identified peptides on the SARS-CoV-2 3CL per activity. The influence of the active ingredients was examined individually and in combination on the enzyme activity of SARS-CoV-2 3CL pro .
Die Aktivitätstests wurden unter Verwendung eines fluorogenen Substrats DABCYL-KTSAVLQ↓SGFRKME-EDANS (Bachem, Schweiz) in einem Puffer mit 20 mM Tris pH 7,2, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM TCEP [1-5] durchgeführt. Diese Reaktionsmischung wurde in eine Corning 96-Well-Platte (Sigma Aldrich), bestehend aus 0,5 µM Protein, pipettiert, und der Assay wurde mit der Zugabe des zuvor genannten Substrats in einer Endkonzentration von 50 µM gestartet. Die Inhibierung der SARS-CoV-2 3CLpro-Aktivität durch die identifizierten Peptide wurde mit dem oben beschriebenen Aktivitätsassay untersucht. 10 µM der Verbindungen wurden für einen vorläufigen Screening-Test verwendet (
Für die anschließenden Inhibitionstests wurden 0,5 µM des SARS-CoV-2 3CLpro Proteins mit 0-140 µM 3CVL-1 und -2, 0-120 µM 3CVL-4 und 0-100 µM 3CVL-7 inkubiert. Im Falle der retro inversen Peptide wurden folgende Konzentrationen getestet, 0-140 µM 3CVLri-2 und -4, 0-100 µM 3CVLri-7. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Nach Zugabe des Substrats mit einer Endkonzentration von 50 µM wurden die Fluoreszenzintensitäten in 60 s-Intervallen über 30 Minuten mit einem Plattenlesegerät Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die Temperatur wurde auf 37 °C eingestellt. Wenn das fluorogene Substrat von der Protease gespalten wird, erhöht sich die messbare Fluoreszenz wegen eines FRET Farbstoffes, der frei messbar wird, also entspricht eine hohe Aktivität einer hohen Fluoreszenzintensität und dem entsprechend ist einer Reduktion der Fluoreszenz bei einer Inhibierung der Protease zu beobachten.For the subsequent inhibition tests, 0.5 µM of SARS-CoV-2 3CL per protein was incubated with 0-140 µM 3CVL-1 and -2, 0-120 µM 3CVL-4 and 0-100 µM 3CVL-7. In the case of the retro-inverse peptides, the following concentrations were tested, 0-140 µM 3CVLri-2 and -4, 0-100 µM 3CVLri-7. The mixtures were incubated at RT for 30 minutes. After addition of the substrate with a final concentration of 50 μM, the fluorescence intensities were measured at 60 s intervals over 30 minutes using an Infinite 200 PRO plate reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland). The temperature was set at 37°C. When the fluorogenic substrate is cleaved by the protease, the measurable fluorescence increases because of a FRET dye that becomes freely measurable, so high activity corresponds to high fluorescence intensity, and correspondingly, a reduction in fluorescence is observed with inhibition of the protease.
Die Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 360 nm bzw. 460 nm. Die Inhibitionstests wurden als Triplikate durchgeführt und die Ergebnisse sind in 
Für die 3CVL-1+2, 3CVL-1+7, 3CVL-2+4, 3CVL-7+4, 3CVLri-2+4 und 3CVLri-7+4 Kombinationstest wurde eine Stammlösung mit einem molaren Verhältnis von 1:1 der beiden Wirkstoffe hergestellt und 0,5 µM des SARS-CoV-2 3CLpro Proteins wurden mit 0-100 µM 3CVL-1+2, 0-150 µM 3CVL-1+7, 0-75 µM 3CVL-2+4, 0-50 µM 3CVL-7+4, 0-75 µM 3CVLri-2+4 und 0-50 µM 3CVLri-7+4 dieser kombinierten Stammlösung (Quinacrin und Suramin) inkubiert.For the 3CVL-1+2, 3CVL-1+7, 3CVL-2+4, 3CVL-7+4, 3CVLri-2+4 and 3CVLri-7+4 combination test, a stock solution with a molar ratio of 1:1 was used Both active ingredients were produced and 0.5 µM of the SARS-CoV-2 3CL per protein were mixed with 0-100 µM 3CVL-1+2, 0-150 µM 3CVL-1+7, 0-75 µM 3CVL-2+4, 0 -50 µM 3CVL-7+4, 0-75 µM 3CVLri-2+4 and 0-50 µM 3CVLri-7+4 of this combined stock solution (quinacrine and suramin).
Um den Wert der halbmaximalen Inkubationskonzentration (IC50 Wert) für die einzelnen Wirkstoffe und die Stoffkombination zu bestimmen, wurde die Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gegen verschiedene Konzentrationen der Wirkstoffe mit Hilfe einer Dosis-Wirkungs-Kurve in der Software GraphPad Prism5 aufgetragen.In order to determine the value of the half-maximal incubation concentration (IC 50 value) for the individual active substances and the substance combination, the initial rate of the enzymatic reaction was plotted against various concentrations of the active substances using a dose-response curve in the GraphPad Prism5 software.
In
Bestimmung des InhibitionsmodusDetermination of the mode of inhibition
Basierend auf der bekannten Michaelis-Menten-Gleichung/ Kinetik wurden zusätzliche Proteaseaktivitätstests durchgeführt, um den Inhibitionsmodus der Peptide auf die Proteaseaktivität näher zu untersuchen.Based on the well-known Michaelis-Menten equation/kinetics, additional protease activity tests were carried out in order to investigate the mode of inhibition of the peptides on protease activity in more detail.
Dazu wurde bei verschiedenen Endkonzentrationen der Inhibitoren und des zuvor genannten Substrats die Reaktionsgeschwindigkeit der SARS-CoV-2 3CLpro bestimmt. 0,5 µM SARS-CoV-2 3CLpro wurde dazu mit den jeweiligen Peptide Inhibitoren in verschiedenen Konzentrationen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe der entsprechenden Konzentrationsreihe des Substrats eingeleitet. Die Datenanalyse wurde mit Hilfe eines Lineweaver-Burk-Plots durchgeführt. Dabei wurde der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit (1/V) gegen den Kehrwert der Substratkonzentration (1/[S]) aufgetragen [4,5]. Alle Messungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.For this purpose, the reaction speed of the SARS-CoV-2 3CL pro was determined at different final concentrations of the inhibitors and the aforementioned substrate. 0.5 µM SARS-CoV-2 3CL pro was incubated with the respective peptide inhibitors in various concentrations for 30 minutes at room temperature (RT). The reaction was then initiated by adding the appropriate concentration series of the substrate. Data analysis was performed using a Lineweaver-Burk plot. The reciprocal of the reaction rate (1/V) was plotted against the reciprocal of the substrate concentration (1/[S]) [4,5]. All measurements were performed in triplicate and data presented as mean ± standard deviation.
In
Referenzen:Credentials:
- [1] Zhang, L.; Lin, D.; Sun, X.; Curth, U.; Drosten, C.; Sauerhering, L.; Becker, S.; Rox, K.; Hilgenfeld, R. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved o-ketoamide inhibitors. Science. 2020, 368, 409-412.[1] Zhang, L.; Lin, D.; Sun, X.; Curth, U.; Drosten, C.; sour herring, L.; Becker, S.; Rox, K.; Hilgenfeld, R. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved o-ketoamide inhibitors. Science. 2020, 368, 409-412.
-
[2]
Zhang, L.; Lin, D.; Kusov, Y.; Nian, Y.; Ma, Q.; Wang, J.; De Wilde, A. a-Ketoamides as broad-spectrum inhibitors of corona-virus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J. Med. Chem. 2020, 63, 4562-4578 Zhang, L.; Lin, D.; Kusov, Y.; Nian, Y.; Ma, Q.; Wang, J.; De Wilde, A. α-Ketoamides as broad-spectrum inhibitors of corona-virus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J. Med. Chem. 2020, 63, 4562-4578 -
[3]
Ma, C.; Sacco, M.D.; Hurst, B.; Townsend, J.A.; Hu, Y.; Szeto, T.; Zhang, X.; Tarbet, B.; Marty, M.T.; Chen, Y.; Wang, J. Bo-ceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020, 30, 678-692 Ma, C.; Sacko, MD; Hurst, B.; Townsend, JA; Hu, Y.; Szeto, T.; Zhang, X.; Tarbet, B.; Marty, MT; Chen, Y.; Wang, J. Bo-ceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020, 30, 678-692 -
[4]
Eberle, R.J.; Olivier, D.S.; Amaral, M.S.; Gering, I.; Willbold, D.; Arni, RK; Coronado, M.A. The Repurposed Drugs Suramin and Quinacrine Cooperatively Inhibit SARS-CoV-2 3CLpro In Vitro. Viruses. 2021, 13, 873 Eberle, RJ; Olivier, DS; Amaral, MS; Low, I.; Willbold, D.; Arni, RK; Coronado, MA The Repurposed Drugs Suramin and Quinacrine Cooperatively Inhibit SARS-CoV-2 3CLpro In Vitro. viruses. 2021, 13, 873 -
[5]
Hernändez González, J.E.; Eberle, R.J.; Willbold, D.; Coronado, M.A. A computer-aided approach for the discovery of D-peptides as inhibitors of SARS-CoV-2 main protease. Frontiers in Molecular Biosciences. 2022, 8, 1402 Hernández González, JE; Eberle, RJ; Willbold, D.; Coronado, MA A computer-aided approach for the discovery of D-peptides as inhibitors of SARS-CoV-2 main protease. Frontiers in Molecular Biosciences. 2022, 8, 1402 -
[6]
Roy, A.; Lim, L.; Srivastava, S.; Lu, Y.; Song, J. Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants. PloS one. 2017, 12, e0180632 Roy, A.; Lim, L.; Srivastava, S.; Lu, Y.; Song, J. Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants. PlOS one. 2017, 12, e0180632 -
[7]
Motulsky, H.; Christopoulos, A. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004 Motulsky, H.; Christopoulos, A. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004
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Zitierte Nicht-PatentliteraturNon-patent Literature Cited
- Zhang, L.; Lin, D.; Kusov, Y.; Nian, Y.; Ma, Q.; Wang, J.; De Wilde, A. a-Ketoamides as broad-spectrum inhibitors of corona-virus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J. Med. Chem. 2020, 63, 4562-4578 [0131]Zhang, L.; Lin, D.; Kusov, Y.; Nian, Y.; Ma, Q.; Wang, J.; De Wilde, A. α-Ketoamides as broad-spectrum inhibitors of corona-virus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J. Med. Chem. 2020, 63, 4562-4578 [0131]
- Ma, C.; Sacco, M.D.; Hurst, B.; Townsend, J.A.; Hu, Y.; Szeto, T.; Zhang, X.; Tarbet, B.; Marty, M.T.; Chen, Y.; Wang, J. Bo-ceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020, 30, 678-692 [0131]Ma, C.; Sacco, M.D.; Hurst, B.; Townsend, J.A.; Hu, Y.; Szeto, T.; Zhang, X.; Tarbet, B.; Marty, M.T.; Chen, Y.; Wang, J. Bo-ceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020, 30, 678-692 [0131]
- Eberle, R.J.; Olivier, D.S.; Amaral, M.S.; Gering, I.; Willbold, D.; Arni, RK; Coronado, M.A. The Repurposed Drugs Suramin and Quinacrine Cooperatively Inhibit SARS-CoV-2 3CLpro In Vitro. Viruses. 2021, 13, 873 [0131]Eberle, RJ; Olivier, DS; Amaral, MS; Low, I.; Willbold, D.; Arni, RK; Coronado, MA The Repurposed Drugs Suramin and Quinacrine Cooperatively Inhibit SARS-CoV-2 3CL per In Vitro. viruses. 2021, 13, 873 [0131]
- Hernändez González, J.E.; Eberle, R.J.; Willbold, D.; Coronado, M.A. A computer-aided approach for the discovery of D-peptides as inhibitors of SARS-CoV-2 main protease. Frontiers in Molecular Biosciences. 2022, 8, 1402 [0131]Hernández González, J.E.; Eberle, R.J.; Willbold, D.; Coronado, MA A computer-aided approach for the discovery of D-peptides as inhibitors of SARS-CoV-2 main protease. Frontiers in Molecular Biosciences. 2022, 8, 1402 [0131]
- Roy, A.; Lim, L.; Srivastava, S.; Lu, Y.; Song, J. Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants. PloS one. 2017, 12, e0180632 [0131]Roy, A.; Lim, L.; Srivastava, S.; Lu, Y.; Song, J. Solution conformations of Zika NS2B-NS3 pro and its inhibition by natural products from edible plants. PlOS one. 2017, 12, e0180632 [0131]
- Motulsky, H.; Christopoulos, A. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004 [0131]Motulsky, H.; Christopoulos, A. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004 [0131]
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2022
- 2022-02-16 DE DE102022103501.8A patent/DE102022103501A1/en active Pending
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| (1) Gonzales, J. et al.,"A Computer-Aided Approach for the Discovery of D-Peptides as Inhibitors of SARS-CoV-2 Main Protease", Frontiers in Molecular Biosciences, January 2022, Volume 8, Article 816166, S.1-17 |
| Eberle, R.J.; Olivier, D.S.; Amaral, M.S.; Gering, I.; Willbold, D.; Arni, RK; Coronado, M.A. The Repurposed Drugs Suramin and Quinacrine Cooperatively Inhibit SARS-CoV-2 3CLpro In Vitro. Viruses. 2021, 13, 873 |
| Hernändez González, J.E.; Eberle, R.J.; Willbold, D.; Coronado, M.A. A computer-aided approach for the discovery of D-peptides as inhibitors of SARS-CoV-2 main protease. Frontiers in Molecular Biosciences. 2022, 8, 1402 |
| Ma, C.; Sacco, M.D.; Hurst, B.; Townsend, J.A.; Hu, Y.; Szeto, T.; Zhang, X.; Tarbet, B.; Marty, M.T.; Chen, Y.; Wang, J. Bo-ceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020, 30, 678-692 |
| Motulsky, H.; Christopoulos, A. Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004 |
| Roy, A.; Lim, L.; Srivastava, S.; Lu, Y.; Song, J. Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants. PloS one. 2017, 12, e0180632 |
| Zhang, L.; Lin, D.; Kusov, Y.; Nian, Y.; Ma, Q.; Wang, J.; De Wilde, A. a-Ketoamides as broad-spectrum inhibitors of corona-virus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J. Med. Chem. 2020, 63, 4562-4578 |
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