DE102021122511A1 - Method and kit for detecting nucleotide sequences - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Kit zum Nachweis mindestens einer Target-Nukleotidsequenz unter Verwendung eines Durchflussstreifens und mindestens eines Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins umfassend eine Target-spezifische guide-RNA (CRISPR/Cas-System) sowie die Verwendung des Verfahrens und/oder Kits zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, insbesondere zum Auslesen einer Nukleotidsequenz-Kodierung oder zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere Pathogenen; Krankheiten oder Gensequenzen in Proben von Patienten, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Pilzen.

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The invention relates to a method and kit for detecting at least one target nucleotide sequence using a flow strip and at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein comprising a target-specific guide RNA (CRISPR/Cas system) and the use of the Methods and/or kits for detecting nucleotide sequences, in particular for reading out a nucleotide sequence coding or for detecting microorganisms, in particular pathogens; Diseases or gene sequences in samples from patients, animals, plants, microorganisms or fungi.
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Kit zum Nachweis mindestens einer Target-Nukleotidsequenz unter Verwendung eines Durchflussstreifens und mindestens eines Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins umfassend mindestens eine Target-spezifische guide-RNA (CRISPR/Cas-System) sowie die Verwendung des Verfahrens und/oder Kits zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, insbesondere zum Auslesen einer Nukleotidsequenz-Kodierung oder zum Nachweis von Viren und/oder Mikroorganismen, insbesondere Pathogenen; Krankheiten oder Gensequenzen in Proben von Patienten, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Pilzen.The invention relates to a method and kit for detecting at least one target nucleotide sequence using a flow strip and at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein comprising at least one target-specific guide RNA (CRISPR/Cas system) and the use the method and/or kit for detecting nucleotide sequences, in particular for reading out a nucleotide sequence coding or for detecting viruses and/or microorganisms, in particular pathogens; Diseases or gene sequences in samples from patients, animals, plants, microorganisms or fungi.

Die hohe Sensitivität und Spezifität der Cas-Proteine des bakteriellen CRISPR/Cas-Systems in Kombination mit einer globalen Pandemie hat in den letzten Jahren zu einer rasanten Expansion des Forschungsfeldes der DNA-sequenzspezifischen Schnelltests geführt.The high sensitivity and specificity of the Cas proteins of the bacterial CRISPR/Cas system in combination with a global pandemic has led to a rapid expansion of the research field of DNA sequence-specific rapid tests in recent years.

Bisher waren aufwendige Sequenzierungen und PCR-Tests in Laboren die einzige Möglichkeit sequenzspezifischer Nachweise. Die Kombination von Cas-Proteinen mit schnellen, einfach anwendbaren Testkonzepten und den klaren visuellen Auslesemethoden von Durchflussstreifen hat eine neue Ära der DNA-spezifischen Tests eingeleitet.Until now, laborious sequencing and PCR tests in laboratories were the only way of providing sequence-specific evidence. The combination of Cas proteins with fast, easy-to-use test concepts and the clear visual reading methods of flow strips has ushered in a new era of DNA-specific testing.

Der aktuelle Forschungsstand basiert auf Durchflussstreifen und/oder Fluoreszenz-basierter Detektion in Kombination mit Cas-Proteinen, wie Cas9, Cas12 oder Cas13.The current state of research is based on flow strips and/or fluorescence-based detection in combination with Cas proteins such as Cas9, Cas12 or Cas13.

DNA-sequenzspezifische Schnelltests wurden bereits in verschiedenen Variationen publiziert, insbesondere zur Krankheitsdiagnose.DNA-sequence-specific rapid tests have already been published in various variations, especially for disease diagnosis.

Gootenberg et al. offenbaren eine Nukleotid-Detektionsplattform unter Verwendung von Cas13, Cas12a und Csm6, die sogenannte SHERLOCK-Methode (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) (Gootenberg et al. 2018). Gootenberg et al. beschreiben die Kombination einer isothermen Präamplifikation und Detektion des resultierenden Amplikons mittels CRISPRvermittelter kollateraler Reporterfreischaltung zum Nachweis von einzelnen RNA- oder DNA-Molekülen. Der Nachweis erfolgt mittels Fluoreszenz- oder Durchflussstreifen-Auslese. Ein positives Ergebnis zeigt sich bei der SHERLOCK-Methode durch eine Testbande, wenn der doppelt-modifizierte Reporter-Oligo geschnitten wird. Ein negatives Ergebnis entsteht, wenn alle nicht geschnittenen Reportermoleküle auf der Kontrolllinie gebunden werden und alle Gold-Nanopartikel (GNP)-Antikörper binden, bevor sie die Testbande erreichen. Nicht gebundene GNP-Antikörper führen auch bei einem negativen Ergebnis zu einer leichten Farbänderung der Testbande, was das Auslesen der Testergebnisse erschwert.Gootenberg et al. disclose a nucleotide detection platform using Cas13, Cas12a and Csm6, the so-called SHERLOCK method (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) (Gootenberg et al. 2018). Gootenberg et al. describe the combination of isothermal preamplification and detection of the resulting amplicon using CRISPR-mediated collateral reporter activation for the detection of individual RNA or DNA molecules. Detection is by means of fluorescence or flow strip readout. A positive result is shown by a test band in the SHERLOCK method when the double-modified reporter oligo is cut. A negative result occurs when all uncleaved reporter molecules bind to the control line and all gold nanoparticle (GNP) antibodies bind before reaching the test band. Even with a negative result, unbound GNP antibodies lead to a slight color change in the test band, which makes it difficult to read the test results.

Bei der SHERLOCK-Methode Version 2 (SHERLOCKv2) wird (i) ein Vier-Kanal-Einzelreaktions-Multiplexing mit orthogonalen CRISPR-Enzymen, (ii) eine quantitative Messung ab 2 attomolar, (iii) eine 3,5-fache Erhöhung der Signalempfindlichkeit durch Kombination von Cas13 mit Csm6, einem CRISPR-assoziierten Hilfsenzym, und (iv) eine Durchflussstreifen-Auslese ermöglicht. Gootenberg et al. beschreiben insbesondere den Nachweis von einzelsträngiger Dengue- oder Zika-Viren-RNA sowie Mutationen in Flüssigbiopsie-Proben von Patienten mittels Durchflussstreifen-Verfahren.The SHERLOCK method version 2 (SHERLOCKv2) achieves (i) a four-channel single-reaction multiplexing with orthogonal CRISPR enzymes, (ii) a quantitative measurement from 2 attomolar, (iii) a 3.5-fold increase in signal sensitivity by combining Cas13 with Csm6, a CRISPR-associated helper enzyme, and (iv) allowing flow streak readout. Gootenberg et al. specifically describe the detection of dengue or Zika virus single-stranded RNA and mutations in liquid biopsy specimens from patients using flow strip methods.

Joung et al. offenbaren die Verwendung der SHERLOCK-Methode zum Nachweis von SARS-CoV-2, insbesondere die Entwicklung eines vereinfachten Tests, genannt STOP (SHERLOCK Testing in One Pot) (Joung et al. 2020). Die STOP-Methode hat eine Nachweisgrenze von 100 Kopien des viralen Genoms in Speichel oder Nasopharyngealabstrichen (Nasen-Rachen-Abstrichen) pro Reaktion und liefert ein Ergebnis innerhalb von 80 Minuten unter Verwendung von Durchflussstreifen-Auslese und innerhalb von 45 Minuten unter Verwendung der Fluoreszenzauslese. Ali et al. offenbaren Probleme in der Anwendung der One Pot-Methode, da die Nukleaseaktivität des Cas-Proteins die Effizienz der Amplifikation der Target-Nukleotidsequenz in demselben Gefäß verringert (Ali et al. 2020), da aufgrund der Spaltung neuer Kopien des Target-Nukleotids durch das Cas-Protein eine exponentielle Amplifikation nicht stattfinden kann.Young et al. disclose the use of the SHERLOCK method for the detection of SARS-CoV-2, in particular the development of a simplified test, called STOP (SHERLOCK Testing in One Pot) (Joung et al. 2020). The STOP method has a detection limit of 100 copies of the viral genome in saliva or nasopharyngeal swabs (nose and throat swabs) per reaction and provides a result within 80 minutes using flow strip readout and within 45 minutes using fluorescence readout. Ali et al. reveal problems in the application of the one pot method, since the nuclease activity of the Cas protein reduces the efficiency of amplification of the target nucleotide sequence in the same vessel (Ali et al. 2020), since due to the cleavage of new copies of the target nucleotide by the Cas protein an exponential amplification cannot take place.

Azhar et al. beschreiben eine semi-quantitative, molekulare Diagnosemethode, welche an verschiedene Signaldetektionsplattformen angepasst werden kann, die sogenannte FELUDA-Methode (FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay), insbesondere zur COVID-19-Diagnose (Azhar et al. 2021). Bei der FELUDA-Methode erfolgt eine direkte Cas9-basierte enzymatische Bestimmung von Nukleobasen- und Nukleotidsequenzen ohne Trans-Spaltung von Reportermolekülen. Vorteilhaft weist die FELUDA-Methode eine hohe Genauigkeit bei der Detektion von Einzelnukleotidvarianten (SNVs), einschließlich heterozygoter Träger, auf. Azhar et al. beschreiben die Verwendung eines Durchflussstreifens zur Durchführung der FELUDA-Methode, insbesondere zur Immobilisierung der Target-DNA.Azhar et al. describe a semi-quantitative, molecular diagnostic method that can be adapted to different signal detection platforms, the so-called FELUDA method (FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay), in particular for COVID-19 diagnosis (Azhar et al. 2021). The FELUDA method uses a direct Cas9-based enzymatic determination of nucleobase and nucleotide sequences without trans-cleavage of reporter molecules. Advantageously, the FELUDA method has a high accuracy in the detection of single nucleotide variants (SNVs), including heterozygous Trä eng, up. Azhar et al. describe the use of a flow-through strip to perform the FELUDA method, in particular to immobilize the target DNA.

WO 2021/111466 A1 beschreibt ein Verfahren und ein Kit zur Detektion eines Target-Polynukleotids unter Verwendung eines CRISPR-Effektor-Systems umfassend Cas9 aus Francisella novicida, einer synthetischen guideRNA und eines Detektionsschemas basierend auf Bindung des Target-Polynukleotids an die Testbande des Durchflussstreifens. WO 2021/111466 A1 describes a method and kit for detecting a target polynucleotide using a CRISPR effector system comprising Cas9 from Francisella novicida, a synthetic guideRNA and a detection scheme based on binding of the target polynucleotide to the test band of the flow strip.

WO 2021/111466 A1 offenbart die Immobilisierung der Biotin-gelabelten Target-Nukleotidsequenzen mittels Biotin-Liganden, die auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, sowie die Verwendung von FAM-gelabelter tracrRNA und Anti-FAM-Antikörpern konjugiert mit GNP zur Visualisierung von Test- und Kontrolllinie auf einem Durchflussstreifen. WO 2021/111466 A1 discloses the immobilization of the biotin-labeled target nucleotide sequences using biotin ligands immobilized on the flow strip and the use of FAM-labeled tracrRNA and anti-FAM antibodies conjugated with GNP to visualize test and control lines on a flow strip.

Zhang et al. beschreiben ein Cas12a- und Durchflussstreifen-basiertes Testsystem zum Nachweis von Spinaler Muskelatrophie, welches eine Sensitivität und Spezifität von 100 % und eine Nachweisegrenze von 526 aM aufweist (Zhang et al. 2021). Die Methode umfasst eine Cas12a-basierte Nukleinsäure-Detektion, eine isothermale Amplifikation sowie die Verwendung eines Durchflussstreifens. Mit der Methode konnten Durchlaufzeiten von 1,5 h erreicht werden. Osborn et al. beschreiben ein Cas9-, Durchflussstreifen- und Fluoreszenz-basiertes Testsystem zum Nachweis von SARS-CoV-2-Nukleotidsequenzen (Osborn et al. 2021).Zhang et al. describe a Cas12a and flow strip-based test system for the detection of spinal muscular atrophy, which has a sensitivity and specificity of 100% and a detection limit of 526 aM (Zhang et al. 2021). The method includes Cas12a-based nucleic acid detection, isothermal amplification, and use of a flow strip. Throughput times of 1.5 hours could be achieved with the method. Osborn et al. describe a Cas9, flow strip and fluorescence-based test system for the detection of SARS-CoV-2 nucleotide sequences (Osborn et al. 2021).

Die bekannten Systeme haben hohe Spezifität (bis auf einzelne Nukleotide) und Sensitivität (bis auf zehn Nukleinsäuremoleküle). Nachtteilig sind die langen Durchlaufzeiten (30 bis 90 Minuten) mit teilweise komplexen Protokollabläufen und in einigen Fällen die aufwendige Anpassung dieser Tests an verschiedene Zielsequenzen sowie die erschwerten Serialisierungsmöglichkeiten.The known systems have high specificity (up to individual nucleotides) and sensitivity (up to ten nucleic acid molecules). Disadvantages are the long throughput times (30 to 90 minutes) with sometimes complex protocol processes and, in some cases, the time-consuming adaptation of these tests to different target sequences, as well as the more difficult serialization options.

Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein schnelles, einfach anwendbares und leicht adaptierbares Verfahren zum Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen bereitzustellen.The object of the present invention is therefore to provide a rapid, easily applicable and easily adaptable method for detecting target nucleotide sequences.

Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum simultanen Nachweis von verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen bereitzustellen.Furthermore, it is an object of the invention to provide a method for the simultaneous detection of different target nucleotide sequences.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch das Verfahren zum Nachweis mindestens einer Target-Nukleotidsequenz umfassend

  1. a) Bereitstellung mindestens eines Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins, wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein eine guideRNA und einen Protein-Tag aufweist,
  2. b) Kontaktierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einer Probe enthaltend mindestens eine Target-Nukleotidsequenz, wobei die Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins bindet,
  3. c) Kontaktierung des mindestens einem Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einem Durchflussstreifen umfassend
    1. i. mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit, und
    2. ii. einen immobilisierten Nukleotid-Tag oder einer immobilisierten Bindeeinheit, welche einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet (Positivkontrolle),

wobei die Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und der Nukleotid-Tag oder die Bindeeinheit lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind,
wobei der Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins an die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit bindet, und
  • d) Kontaktierung der Target-Nukleotidsequenz mit einem Detektionsmarker.
According to the invention, the object is achieved by the method for detecting at least one target nucleotide sequence
  1. a) providing at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has a guideRNA and a protein tag,
  2. b) contacting the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a sample containing at least one target nucleotide sequence, wherein the target nucleotide sequence in the sample binds to the guideRNA of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein,
  3. c) contacting the at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a flow-through strip
    1. i. at least one immobilized anti-protein tag binding moiety, and
    2. ii. an immobilized nucleotide tag or an immobilized binding entity that binds an anti-nucleotide tag antibody (positive control),

wherein the anti-protein tag binding unit and the nucleotide tag or the binding unit are immobilized locally separately on the flow-through strip,
wherein the protein tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein binds to the immobilized anti-protein tag binding moiety, and
  • d) Contacting the target nucleotide sequence with a detection label.

Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren sequenzspezifisch, und dabei schnell, einfach und günstig. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren ohne Laborausstattung, ausgebildetes Personal und Elektrizität durchgeführt werden. Somit bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine Point-of-Care-Diagnosemethode. Unter dem Begriff „Point-of-Care-Diagnosemethode“ wird eine Diagnosemethode verstanden, welche patientennah und nicht in einem Diagnoselabor durchgeführt wird, insbesondere direkt in einem Krankenhaus, in einer Arztpraxis, in einer Apotheke oder sogar in einem privaten Haushalt.The method according to the invention is advantageously sequence-specific and, at the same time, quick, simple and inexpensive. In particular, the method according to the invention can be carried out without laboratory equipment, trained personnel and electricity. The method according to the invention thus offers a point-of-care diagnostic method. The term "point-of-care diagnostic method" refers to a diagnostic method ver which is carried out close to the patient and not in a diagnostic laboratory, in particular directly in a hospital, in a doctor's surgery, in a pharmacy or even in a private household.

Weiterhin vorteilhaft ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren weder eine Modifizierung der guideRNA noch ein zusätzliches Reportermolekül nötig, da das modifizierte Cas-Enzym direkt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert wird.A further advantage of the method according to the invention is that neither a modification of the guideRNA nor an additional reporter molecule is necessary, since the modified Cas enzyme is immobilized directly on the flow-through strip.

Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren somit einfacher, schneller und beinhaltet weniger Schritte als das FELUDA- oder SHERLOCK-Verfahren. FELUDA benötigt eine vorherige Inkubation bei 37 °C der guideRNA mit dem FnCas9-Protein, um einen Ribonukleoprotein-Komplex zu formen. Darauf folgt eine zusätzliche Inkubation dieses Komplexes mit der amplifizierten Target-Nukleotidsequenz bei 37 °C. Des Weiteren benötigt FELUDA eine Modifikation der guideRNA und des Target-Nukleotids. Die Modifikation von RNA-Molekülen ist sehr kostenaufwendig.The method according to the invention is therefore advantageously simpler, faster and includes fewer steps than the FELUDA or SHERLOCK method. FELUDA requires a prior incubation at 37 °C of the guideRNA with the FnCas9 protein to form a ribonucleoprotein complex. This is followed by an additional incubation of this complex with the amplified target nucleotide sequence at 37°C. Furthermore, FELUDA requires a modification of the guideRNA and the target nucleotide. The modification of RNA molecules is very expensive.

Die Testung neuer Sequenzen erfordert bei den Cas-basierten Nachweisverfahren einen Wechsel der guideRNA. Dies wäre bei FELUDA aufgrund dieser Modifikation mit höheren Kosten verbunden als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Darüber hinaus ist die Anwendung des FELUDA-Verfahrens teurer als das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund des Verbrauchs der teuren, modifizierten guideRNA.The testing of new sequences requires a change of the guideRNA with the Cas-based detection methods. Due to this modification, this would involve higher costs for FELUDA than for the method according to the invention. In addition, the use of the FELUDA method is more expensive than the method according to the invention due to the consumption of the expensive, modified guideRNA.

SHERLOCK benötigt ein zusätzliches Reporter-Oligo, damit benötigt das System mehr Komponenten und ist komplexer als das erfindungsgemäße Verfahren.SHERLOCK requires an additional reporter oligo, so the system requires more components and is more complex than the method according to the invention.

Die Protokolle für SHERLOCK und FELUDA benötigen längere Inkubationszeiten. Das erfindungsgemäße Verfahren kann damit schneller durchgeführt werden, als SHERLOCK und FELUDA.The protocols for SHERLOCK and FELUDA require longer incubation times. The method according to the invention can thus be carried out faster than SHERLOCK and FELUDA.

Weiterhin vorteilhaft ist im erfindungsgemäßen Verfahren die Detektion eines oder mehrerer Target-Nukleotids bei Zimmertemperatur möglich.In the method according to the invention, it is also advantageously possible to detect one or more target nucleotides at room temperature.

In Ausführungsschritten erfolgt das Verfahren mit der Reihenfolge der Schritte Schritt b) vor Schritt c), gleichzeitig mit Schritt c) oder nach Schritt c). In Ausführungsschritten erfolgt das Verfahren mit den Schritten b), c) und d) gleichzeitig. In Ausführungsformen erfolgt das Verfahren mit der Reihenfolge der Schrittea), b), c) und d) oder a), c), b) und d) oder a), b), d) und c) oder a), b) und die Schritte c) und d) gleichzeitig oder a), c) und die Schritte b) und d) gleichzeitig oder a) und die Schritte b) bis d) gleichzeitig. In Ausführungsformen erfolgt das Verfahren mit den Schritten a), b), c) und d) gleichzeitig.In execution steps, the method takes place with the sequence of steps step b) before step c), simultaneously with step c) or after step c). In execution steps, the method with steps b), c) and d) takes place simultaneously. In embodiments, the method takes place with the sequence of steps a), b), c) and d) or a), c), b) and d) or a), b), d) and c) or a), b) and steps c) and d) simultaneously or a), c) and steps b) and d) simultaneously or a) and steps b) to d) simultaneously. In embodiments, the method including steps a), b), c) and d) occurs simultaneously.

Die Formulierungen „bestehend aus“ und „umfassend“ werden verwendet, um die Anwesenheit der benannten Verfahrensschritte, Komponenten, Elemente und Eigenschaften zu beschreiben ohne dadurch die Anwesenheit zusätzlicher Verfahrensschritte, Komponenten, Elemente und Eigenschaften auszuschließen.The phrases "consisting of" and "comprising" are used to describe the presence of the specified process steps, components, elements and properties without thereby excluding the presence of additional process steps, components, elements and properties.

Unter „lokal getrennt“ wird die Immobilisierung von Bestandteilen auf dem Durchflussstreifen in räumlich getrennten Bereichen verstanden.“Locally separated” means the immobilization of components on the flow strip in spatially separated areas.

Unter dem Begriffen „Nukleotid“, „Nukleotidsequenz“, „Nukleinsäure“ oder „Polynukleotid“ wird eine DNA oder RNA verstanden, die linear, zirkulär, verzweigt, einzel- oder doppelsträngig ist. Der Begriff schließt auch DNA-RNA Hybride ein. Der Begriff schließt sowohl Sequenzen aus natürlich-vorkommenden Nukleotiden (d.h. A, G, T, C, U) ein, sowie Sequenzen die synthetisch hergestellte Nukleotid-Analoge (z.B. BEN, MM, MM2, DM) enthalten.The terms "nucleotide", "nucleotide sequence", "nucleic acid" or "polynucleotide" means a DNA or RNA which is linear, circular, branched, single- or double-stranded. The term also includes DNA-RNA hybrids. The term includes both sequences of naturally occurring nucleotides (i.e. A, G, T, C, U) as well as sequences containing synthetically produced nucleotide analogues (e.g. BEN, MM, MM2, DM).

Unter dem Begriff „Cas-Protein“ wird eine große Gruppe von Endonukleasen verstanden, die in CRISPR-Systemen doppelsträngige Nukleotide spalten, die sie über Hybridisierung mit komplementären Sequenzbereichen einer guideRNA binden.The term "Cas protein" refers to a large group of endonucleases that cleave double-stranded nucleotides in CRISPR systems, which they bind to by hybridizing with complementary sequence regions of a guideRNA.

In Ausführungsformen ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein aus Cas9, Cas12 oder Cas13 ausgewählt.In embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is selected from Cas9, Cas12 or Cas13.

Unter dem Begriff „Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Protein“ (dCas) wird ein Cas-Protein verstanden, welches derart ausgebildet ist, dass das dCas-Protein eine Target-Nukleotidsequenz spezifisch bindet, insbesondere durch Wechselwirkung mit einem guideRNA-Molekül und Bindung einer zumindest teilweise zu der guideRNA komplementären Nukleotidsequenz (Target-Nukleotidsequenz), nach der Bindung aber keine Nuklease-Aktivität aufweist, d.h. dass es nicht länger in der Lage ist, Nukleotide zu spalten. In Ausführungsformen liegt mindestens eine Mutation vor, die insbesondere eine Punktmutation ist, insbesondere eine Genmutation, bei der ein Nukleotid ausgetauscht, insertiert (Insertionsmutante) oder deletiert (Deletionsmutation) wird, bevorzugt innerhalb der katalytisch-aktiven Nuklease- Domäne(n) zum Zweck der Inhibierung der Nukleaseaktivität.The term "nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein" (dCas) is understood to mean a Cas protein which is designed in such a way that the dCas protein specifically binds a target nucleotide sequence, in particular through interaction with a guideRNA molecule and binding of a nucleotide sequence that is at least partially complementary to the guideRNA (target nucleotide sequence), but after binding has no nuclease activity, ie it is no longer able to cleave nucleotides. In embodiments, there is at least one mutation, which is in particular a point mutation, in particular a gene mutation in which a nucleotide is exchanged, inserted (insertion mutant) or deleted (deletion mutation), preferably within the catalytically active nuclease domain(s) for the purpose of inhibition of nuclease activity.

In Ausführungsformen ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein ein Cas-Protein der Klasse 2, insbesondere des Typ II, V oder VI, mit mindestens einer Mutation.In embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is a class 2 Cas protein, in particular of type II, V or VI, with at least one mutation.

In Ausführungsformen ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein dCas9, dCas12 oder dCas13.In embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is dCas9, dCas12, or dCas13.

In Ausführungsformen ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein aus Streptococcus pyogenes Cas9, Staphylococcus aureus Cas9, Streptococcus thermophilus Cas9, Neisseria meningitidis Cas9, Neisseria lactamica Cas9, Francisella novicida Cas9, Treponema denticola Cas9, Legionella pneumophila str. Paris Cas9, Campylobacter jejuni Cas9, Acidaminococcus spp. Cas12a (Cpf1), Lachnospiraceae Cas12a (Cpf1), Francisella cf. novicida Cas12a (Cpf1), Leptotrichia buccalis Cas13a (C2c2), Leptotrichia shahii Cas13a (C2c2), Ruminococcus flavefaciens Cas13d, Prevotella sp. P5-125 Cas13b oder Leptotrichia wadeii Cas13a mit mindestens einer Mutation ausgewählt.In embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein from Streptococcus pyogenes Cas9, Staphylococcus aureus Cas9, Streptococcus thermophilus Cas9, Neisseria meningitidis Cas9, Neisseria lactamica Cas9, Francisella novicida Cas9, Treponema denticola Cas9, Legionella pneumophila str. Paris Cas9, Campylobacter jejuni Cas9, Acidaminococcus spp. Cas12a (Cpf1), Lachnospiraceae Cas12a (Cpf1), Francisella cf. novicida Cas12a (Cpf1), Leptotrichia buccalis Cas13a (C2c2), Leptotrichia shahii Cas13a (C2c2), Ruminococcus flavefaciens Cas13d, Prevotella sp. P5-125 Cas13b or Leptotrichia wadeii Cas13a with at least one mutation selected.

In bevorzugten Ausführungsformen ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein aus nuklease-defizienten Varianten von SpCas9, Cpf1, AapCas12b, LsaCas13a, RfxCas13d, PspCas13b oder FnCas9 ausgewählt.In preferred embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is selected from nuclease-deficient variants of SpCas9, Cpf1, AapCas12b, LsaCas13a, RfxCas13d, PspCas13b or FnCas9.

Besonders bevorzugt ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein aus SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 20 oder SEQ ID No. 21 ausgewählt.The nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein from SEQ ID no. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 20 or SEQ ID no. 21 selected.

In Ausführungsformen ist der Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins aus Biotin, FLAG-Tag, Myc-Tag, GST-Tag, His-Tag, TAP-Tag, V5-Tag, TrxTag oder HA-Tag ausgewählt.In embodiments, the protein tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is biotin, FLAG-tag, Myc-tag, GST-tag, His-tag, TAP-tag, V5-tag, Trx-tag or HA-tag selected.

In Ausführungsformen erfolgt die Herstellung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit Protein-Tag mittels Binden eines Tags an ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein, bevorzugt an ein Cas-Protein mit mindestens einem Cysteinrest.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Bereitstellung eines biotinylierten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins durch Biotinylierung, bevorzugt über Reaktion eines Cysteinrests mit Maleimid-nPEG-Biotin (Click-Chemie).
In alternativen Ausführungsformen erfolgt die Herstellung das Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit Protein-Tag durch Fusion der Sequenz des Cas-Proteins mit der Sequenz eines genetisch-kodierbaren Protein-Tags und darauf basierend Herstellung eines Fusionsproteins. In Ausführungsformen erfolgt die Herstellung das Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit Protein-Tag am N- oder C-Terminus.In embodiments, the production of the protein-tagged nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is accomplished by binding a tag to a nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, preferably to a Cas protein having at least one cysteine residue.
In preferred embodiments, a biotinylated nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is provided by biotinylation, preferably by reacting a cysteine residue with maleimide-nPEG-biotin (Click-Chemie).
In alternative embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a protein tag is produced by fusing the sequence of the Cas protein with the sequence of a genetically codable protein tag and producing a fusion protein based thereon. In embodiments, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is produced with a protein tag at the N or C terminus.

Vorteilhaft ermöglicht der Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins die Immobilisierung des Cas-Proteins auf einem Durchflussstreifen mittels Anti-Protein-Tag-Bindeeinheiten.Advantageously, the protein tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein enables the Cas protein to be immobilized on a flow-through strip using anti-protein tag binding units.

Zweckmäßig vermittelt die guideRNA die Bindung des Cas-Proteins an die Target-Nukleotidsequenz, falls diese in der Probe vorhanden ist. Unter dem Begriff „guideRNA“ wird ein RNA-Molekül verstanden, welches von dem Cas-Protein, insbesondere an der Scaffold-Sequenz, gebunden wird und welche, insbesondere über die Spacer-Sequenz, eine Target-Nukleotidsequenz bindet (CRISPR-Cas-System). Vorteilhaft ist das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein mit guideRNA in der Lage, eine spezifische NukleotidSequenz zu binden. Durch Variation der guideRNA, insbesondere der Spacer-Sequenz, kann das Verfahren an verschiedene Target-Nukleotidsequenzen angepasst werden.Conveniently, the guideRNA mediates binding of the Cas protein to the target nucleotide sequence if present in the sample. The term "guideRNA" means an RNA molecule which is bound by the Cas protein, in particular to the scaffold sequence, and which binds a target nucleotide sequence, in particular via the spacer sequence (CRISPR-Cas system ). The nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with guideRNA is advantageously able to bind a specific nucleotide sequence. By varying the guideRNA, in particular the spacer sequence, the method can be adapted to different target nucleotide sequences.

Zweckmäßig ist die guideRNA in dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgebildet, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden.In the method according to the invention, the guideRNA is expediently designed to bind a target nucleotide sequence.

In Ausführungsformen erfolgt das Design der Targetstelle (Spacer-Sequenz) der guideRNA mit dem Fachmann bekannten Methoden, wie dem Onlinetool CHOPCHOP. In Ausführungsformen erfolgt ein Vergleich mit Referenz-Nukleotidsequenzen mit dem Fachmann bekannten Methoden, wie dem online-Alignement-Tool ntBLAST, insbesondere mit Referenz-Nukleotidsequenzen aus dem gleichen Organismus, bevorzugt dem Genom des Organismus, zur Bestimmung von off-target-Sequenzen (ähnliche oder übereinstimmende Sequenzen außerhalb der gewünschten Ziel-Sequenz). Zweckmäßig werden Targetstellen (Spacer-Sequenzen) nur verwendet, wenn keine off-target-Sequenzen vorliegen.In embodiments, the target site (spacer sequence) of the guideRNA is designed using methods known to those skilled in the art, such as the online tool CHOPCHOP. In embodiments, a ver same with reference nucleotide sequences using methods known to those skilled in the art, such as the online alignment tool ntBLAST, in particular with reference nucleotide sequences from the same organism, preferably the genome of the organism, for determining off-target sequences (similar or matching sequences outside the desired target sequence). Target sites (spacer sequences) are expediently used only if no off-target sequences are present.

In Ausführungsformen weist das DNA-Oligonukleotid, von dem die guideRNA transkribiert wird, einen 5'-T7-Promoter (SEQ ID No. 14) auf.In embodiments, the DNA oligonucleotide from which the guideRNA is transcribed has a 5' T7 promoter (SEQ ID No. 14).

In Ausführungsformen weist die guideRNA eine komplementäre Sequenz für die PCR-Amplifikation mit einem Gerüst-Oligo GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGA TAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (SEQ ID No. 16) oder TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCAC TTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCAC (SEQ ID No. 17) auf.In embodiments, the guideRNA has a complementary sequence for PCR amplification with a scaffolding oligo GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGA TAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (SEQ ID No. 16) or TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGTCCAATGGCCAC TTTCCAGGTGGCAAA IDGCCCGTGAGTGACTGATGTCAAAT7.

In weiteren Ausführungsformen ist die guideRNA chemisch modifiziert. Vorteilhaft wird durch eine chemisch modifizierte guideRNA die Bindung an die Target-Nukleotidsequenz erhöht, die Stabilität der guideRNA erhöht oder die Detektion verbessert. In Ausführungsformen umfasst die chemische Modifikation der guideRNA den Einbau von Fehlpaarungen zu der Target-Nukleotidsequenz.In further embodiments, the guideRNA is chemically modified. A chemically modified guideRNA advantageously increases binding to the target nucleotide sequence, increases the stability of the guideRNA or improves detection. In embodiments, the chemical modification of the guideRNA includes the incorporation of mismatches to the target nucleotide sequence.

In Ausführungsformen ist die Probe aus isoliertem Gewebe, isolierten Ausscheidungen oder isolierten Körperflüssigkeiten, Pflanzenmaterial, Pilzmaterial oder Mikroorganismenmaterial ausgewählt.In embodiments, the sample is selected from isolated tissue, excreta, or body fluids, plant material, fungal material, or microorganism material.

In Ausführungsformen liegt die Probe in Form einer Lösung, bevorzugt einer Pufferlösung, oder in trockener Form vor.In embodiments, the sample is in the form of a solution, preferably a buffer solution, or in dry form.

In Ausführungsformen ist die Target-Nukleotidsequenz eine DNA oder RNA.In embodiments, the target nucleotide sequence is DNA or RNA.

In Ausführungsformen ist die Target-Nukleotidsequenz eine DNA oder RNA von einem pathogenen oder nicht-pathogenen Organismus, eine Gensequenz, eine Telomersequenz, eine kodierende oder nicht-kodierende DNA oder RNA, ein virales Genom oder eine teilweise oder vollkommen synthetische DNA.In embodiments, the target nucleotide sequence is DNA or RNA from a pathogenic or non-pathogenic organism, a gene sequence, a telomere sequence, a coding or non-coding DNA or RNA, a viral genome, or a partially or fully synthetic DNA.

In weiteren Ausführungsformen ist die Target-Nukleotidsequenz ein Plasmid oder Minicircle-DNA.In other embodiments, the target nucleotide sequence is a plasmid or minicircle DNA.

In Ausführungsformen erfolgt eine Isolation der Target-Nukleotidsequenz aus der Probe vor Schritt b).In embodiments, the target nucleotide sequence is isolated from the sample before step b).

Unter dem Begriff „DNA oder RNA von einem pathogenen Organismus“ wird eine Nukleotidsequenz von einem Organismus verstanden, welcher gesundheitsschädigende Abläufe in Organismen, bevorzugt in Menschen, Tieren oder Pflanzen, verursacht.The term “DNA or RNA from a pathogenic organism” is understood to mean a nucleotide sequence from an organism which causes processes that are harmful to health in organisms, preferably in humans, animals or plants.

In Ausführungsformen ist die Target-Nukleotidsequenz eine RNA, insbesondere eine Virus-RNA. In Ausführungsformen wird die Probe vor Schritt b) mittels reverser Transkriptase behandelt.In embodiments, the target nucleotide sequence is an RNA, particularly a viral RNA. In embodiments, the sample is treated with reverse transcriptase before step b).

In Ausführungsformen ist die Target-Nukleotidsequenz in Schritt b) eine modifizierte Target-Nukleotidsequenz, wobei die modifizierte Target-Nukleotidsequenz einen Nukleotid-Tag aufweist und die modifizierte Target-Nukleotidsequenz an die guideRNA des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins bindet.In embodiments, the target nucleotide sequence in step b) is a modified target nucleotide sequence, wherein the modified target nucleotide sequence has a nucleotide tag and the modified target nucleotide sequence binds to the guideRNA of the nuclease-deficient nucleotide sequence-binding Cas protein.

In Ausführungsformen wird die modifizierte Target-Nukleotidsequenz durch Amplifikation einer Target-Nukleotidsequenz mittels mindestens einem Nukleotid-Tag-modifizierten Primer und einer Polymerase oder durch Synthese einer modifizierten Target-Nukleotidsequenz, insbesondere durch kovalente Bindung eines Nukleotid-Tags an eine Nukleotidsequenz, z. B. durch Ligation, erhalten.In embodiments, the modified target nucleotide sequence is obtained by amplifying a target nucleotide sequence using at least one nucleotide tag-modified primer and a polymerase or by synthesizing a modified target nucleotide sequence, in particular by covalently binding a nucleotide tag to a nucleotide sequence, e.g. B. obtained by ligation.

In weiteren Ausführungsformen wird die modifizierte Target-Nukleotidsequenz durch Einbau in Plasmid-DNA (pDNA) erhalten, indem Bakterienkulturmedien mit Nukleosidanaloga (z. B. BrdU) ergänzt wird und der zufällige Einbau des Nukleotid-Tags in die replizierende pDNA ermöglicht wird.In further embodiments, the modified target nucleotide sequence is obtained by incorporation into plasmid DNA (pDNA), by supplementing bacterial culture media with nucleoside analogs (e.g., BrdU) and allowing random incorporation of the nucleotide tag into the replicating pDNA.

In Ausführungsformen erfolgt die Amplifikation der Target-Nukleotidsequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), isothermale PCR, Schleifen-vermittelter isothermaler Amplifikation (Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP), RCA (Rolling circle amplification) oder Ramification-Amplifikation (RAM). Durch Zugabe einer reversen Transkriptase kann eine reverse Transkription durchgeführt werden.
Unter dem Begriff „Polymerase-Kettenreaktion (PCR)“ wird eine Methode zur Vervielfältigung von DNA unter Verwendung iterativ alternierender Temperaturzyklen in vitro mittels einer DNA-Polymerase verstanden.In embodiments, the target nucleotide sequence is amplified by polymerase chain reaction (PCR), isothermal PCR, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), rolling circle amplification (RCA), or ramification amplification (RAM). Reverse transcription can be performed by adding a reverse transcriptase.
The term "polymerase chain reaction (PCR)" is understood to mean a method for amplifying DNA using iteratively alternating temperature cycles in vitro using a DNA polymerase.

Unter dem Begriff „isothermale Polymerase-Kettenreaktion (PCR)“ wird eine Methode zur Vervielfältigung von DNA in vitro mittels einer DNA-Polymerase bei konstanter Temperatur verstanden.The term "isothermal polymerase chain reaction (PCR)" refers to a method for amplifying DNA in vitro using a DNA polymerase at a constant temperature.

Unter dem Begriff „Schleifen-vermittelter isothermaler Amplifikation (Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)“ wird eine Methode zur Vervielfältigung von DNA in vitro mittels einer strangversetzenden DNA-Polymerase und speziellen Sekundärstruktur formenden Primern bei konstanter Temperatur (isothermal) verstanden.The term "loop-mediated isothermal amplification (LAMP)" is a method for amplifying DNA in vitro using a strand-transferring DNA polymerase and special secondary structure-forming primers at constant temperature (isothermal).

Unter dem Begriff „RCA (Rolling circle amplification)“ wird eine Methode zur Vervielfältigung von zirkulärer DNA, insbesondere Plasmiden, mittels einer DNA- oder RNA-Polymerase unter Verwendung eines kurzen DNA- oder RNA-Primers bei konstanter Temperatur (isothermal) verstanden.The term "RCA (rolling circle amplification)" is understood to mean a method for amplifying circular DNA, in particular plasmids, using a DNA or RNA polymerase using a short DNA or RNA primer at constant temperature (isothermal).

Unter dem Begriff „Ramification-Amplifikation (RAM)“ wird eine Methode zur Vervielfältigung von zirkulärer DNA, insbesondere Plasmiden, mittels einer DNA-Polymerase unter Verwendung zweier Verlängerungs-Primer bei konstanter Temperatur (isothermal) verstanden, wobei eine zirkuläre Sonde (C-Sonde) verwendet wird, die durch eine DNA-Ligase kovalent gebunden wird, wenn sie mit einer Target-Nukleotidsequenz hybridisiert. Dann verlängert die DNA-Polymerase den gebundenen Vorwärtsprimer entlang der C-Sonde und verdrängt kontinuierlich einen stromabwärts gelegenen Strang, wodurch eine multimere einzelsträngige DNA (ssDNA) erzeugt wird.The term "ramification amplification (RAM)" is understood to mean a method for amplifying circular DNA, in particular plasmids, using a DNA polymerase using two extension primers at constant temperature (isothermal), with a circular probe (C probe ) which is covalently bound by a DNA ligase when hybridized to a target nucleotide sequence. Then, the DNA polymerase extends the bound forward primer along the C-probe and continuously displaces a downstream strand, generating a multimeric single-stranded DNA (ssDNA).

Jede Modifikation, die von einem Antikörper bzw. einer Bindeeinheit erkannt und gebunden werden kann, kann als Nukleotid-Tag verwendet werden. In Ausführungsformen ist der Nukleotid-Tag aus FAM, DIG, DNP, TEG, oder Cy5 ausgewählt. In Ausführungsformen weist der Nukleotid-Tag, insbesondere aus FAM, DIG, DNP, TEG, oder Cy5 ausgewählt, ein gebundenes Nukleinsäure-bindendes Molekül, wie N-Methylpyrrol, N-Methylimidazol oder 3-Chlorothiophen, auf.Any modification that can be recognized and bound by an antibody or binding moiety can be used as a nucleotide tag. In embodiments, the nucleotide tag is selected from FAM, DIG, DNP, TEG, or Cy5. In embodiments, the nucleotide tag, in particular selected from FAM, DIG, DNP, TEG, or Cy5, has an attached nucleic acid-binding molecule such as N-methylpyrrole, N-methylimidazole or 3-chlorothiophene.

In alternativen Ausführungsformen ist der Nukleotid-Tag eine modifizierte Nukleobase, bevorzugt BrdU, IdU, CldU oder EdU.In alternative embodiments, the nucleotide tag is a modified nucleobase, preferably BrdU, IdU, CldU or EdU.

In Ausführungsformen erfolgt die Modifizierung der Target-Nukleotidsequenz mittels Click-Chemie. Der Fachmann weiß, wie entsprechende Modifizierungen erfolgen, u. a. beschreiben Fantoni et al. die Modifizierung von Nukleinsäure mittels Click-Chemie (Fantoni et al. 2021).In embodiments, the target nucleotide sequence is modified using click chemistry. Those skilled in the art know how to make appropriate modifications, e.g. describe Fantoni et al. the modification of nucleic acids using click chemistry (Fantoni et al. 2021).

In Ausführungsformen können über mit Azidgruppen-modifizierte Nukleotide in die Target-Nukleotidsequenz eingebracht werden und anschließend eine Modifikation über Click-Chemie erfolgen. Dabei können beispielsweise Alkin-modifizierte Cytosine oder Azid-modifizierte Thymine verwendet werden.In embodiments, nucleotides modified with azide groups can be introduced into the target nucleotide sequence and then modified via click chemistry. For example, alkyne-modified cytosines or azide-modified thymines can be used.

In Ausführungsformen ist die Target-Nukleotidsequenz in Schritt b) FAM-modifiziert. Diese Modifikation kann durch Amplifikation mit einem FAM-modifizierten Primer vor Schritt b) eingeführt werden.In embodiments, the target nucleotide sequence in step b) is FAM-modified. This modification can be introduced by amplification with a FAM-modified primer before step b).

Erfindungsgemäß erfolgt in Schritt c) das Kontaktieren von mindestens einem Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einem Durchflussstreifen. In Ausführungsformen erfolgt das Kontaktieren durch Fließen einer Lösung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins durch den Durchflussstreifen oder durch vorherige Immobilisierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins auf dem Durchflussstreifen, beispielsweise in lyophilisierter Form.According to the invention, in step c) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is brought into contact with a flow-through strip. In embodiments, the contacting occurs by flowing a solution of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein through the flow strip or by previously immobilizing the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein on the flow strip, for example in lyophilized form.

Unter dem Begriff „Bindeeinheit“ wird ein Molekül, insbesondere ein Peptid, ein Protein oder eine Nukleotidsequenz, verstanden, welche ein Antigen, bevorzugt einen Tag, insbesondere einen Protein-Tag oder einen Nukleotid-Tag, bindet, d.h. in seiner dreidimensionalen Struktur erkennt. Der Begriff „Bindeeinheit“ schließt Antikörper, insbesondere Primärantikörper oder Sekundärantikörper; Antikörperfragmente, insbesondere Einzeldomänenantikörper oder Nanobodies oder Nanoantikörper, Aptamere oder Liganden mit hoher Affinität zu den Tags ein.The term "binding unit" means a molecule, in particular a peptide, a protein or a nucleotide sequence, which binds an antigen, preferably a tag, in particular a protein tag or a nucleotide tag, i.e. recognizes it in its three-dimensional structure. The term "binding moiety" includes antibodies, particularly primary antibodies or secondary antibodies; Antibody fragments, in particular single domain antibodies or nanobodies or nanoantibodies, aptamers or ligands with high affinity to the tags.

In Ausführungsformen ist die Bindeeinheit ausgewählt aus Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Biotin-Liganden, wie Streptavidin.In embodiments, the binding moiety is selected from antibodies, antibody fragments, or biotin ligands such as streptavidin.

In bevorzugten Ausführungsformen ist die mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit ein Biotin-Ligand, insbesondere Streptavidin.In preferred embodiments, the at least one immobilized anti-protein tag binding moiety is a biotin ligand, in particular streptavidin.

Unter dem Begriff „Durchflussstreifen“ wird eine poröse Membran verstanden. In Ausführungsformen besteht der Durchflussstreifen aus Nitrocellulose. In Ausführungsformen weist der Durchflussstreifen ein Trägermaterial auf, wobei sich die poröse Membran an der Oberfläche des Trägermaterials befindet.The term "flow strip" means a porous membrane. In embodiments, the flow strip is made of nitrocellulose. In embodiments, the flow strip comprises a substrate, with the porous membrane being on the surface of the substrate.

Erfindungsgemäß weißt der Durchflussstreifen mindestens einen immobilisierten Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und einen immobilisierten Nukleotid-Tag oder eine immobilisierte Bindeeinheit auf, wobei die Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und der Nukleotid-Tag oder die Bindeeinheit lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind.According to the invention, the flow-through strip has at least one immobilized anti-protein tag binding unit and an immobilized nucleotide tag or an immobilized binding unit, the anti-protein tag binding unit and the nucleotide tag or the binding unit being immobilized locally separately on the flow-through strip .

Erfindungsgemäß dient der immobilisierte Nukleotid-Tag oder die immobilisierte Bindeeinheit, bevorzugt ein immobilisierter Sekundärantikörper gegen den Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper, als Positivkontrolle und mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit bindet den Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins, wodurch das Cas-Protein auf dem Durchflussstreifen gebunden wird. In Ausführungsformen ist die Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit eine Cas-Protein-spezifische Bindeeinheit, die direkt das verwendete Cas-Protein erkennt und bindet, wodurch kein Tag notwendig istAccording to the invention, the immobilized nucleotide tag or the immobilized binding unit, preferably an immobilized secondary antibody against the anti-nucleotide tag antibody, serves as a positive control and at least one immobilized anti-protein tag binding unit binds the protein tag of the nuclease-deficient nucleotide sequence -binding Cas protein, thereby binding the Cas protein on the flow strip. In embodiments, the anti-protein tag binding moiety is a Cas protein-specific binding moiety that directly recognizes and binds to the Cas protein used, eliminating the need for a tag

Der Fachmann weiß, wie entsprechende Durchflussstreifen hergestellt werden können. In Ausführungsformen werden die Durchflussstreifen kommerziell erhalten. In Ausführungsformen ist der Durchflussstreifen der HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec).The person skilled in the art knows how corresponding flow strips can be produced. In embodiments, the flow strips are obtained commercially. In embodiments, the flow-through strip is the HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec).

In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Durchflussstreifen

  1. i. mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit, und
  2. ii. einen immobilisierten Antikörper, welcher einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet (Positivkontrolle),
wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und der Antikörper lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind.In preferred embodiments, the flow strip comprises
  1. i. at least one immobilized anti-protein tag binding moiety, and
  2. ii. an immobilized antibody that binds an anti-nucleotide tag antibody (positive control),
wherein the immobilized anti-protein tag binding moiety and the antibody are immobilized locally separately on the flow-through strip.

Erfindungsgemäß erfolgt durch die Kontaktierung des mindestens einem Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einem Durchflussstreifen und die Kontaktierung der Target-Nukleotidsequenz mit einem Detektionsmarker in Schritt d) die Visualisierung des Ergebnisses des erfindungsgemäßen Verfahrens. Erfindungsgemäß wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein mindestens einer Target-Nukleotidsequenz über einen Durchflussstreifen abgelesen, der im Falle eines positiven Ergebnisses (Target-Nukleotidsequenz vorhanden) mindestens zwei Banden oder im Falle eines negativen Ergebnisses (Target-Nukleotidsequenz nicht vorhanden) eine Bande (Positivkontrolle) zeigt. Vorteilhaft liefert das erfindungsgemäße Verfahren eindeutige Ergebnisse, insbesondere im Vergleich zum SHERLOCK-Verfahren.According to the invention, the result of the method according to the invention is visualized by contacting the at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a flow-through strip and contacting the target nucleotide sequence with a detection marker in step d). According to the invention, the presence or absence of at least one target nucleotide sequence is read via a flow strip, which shows at least two bands in the case of a positive result (target nucleotide sequence present) or one band (positive control) in the case of a negative result (target nucleotide sequence absent). . The method according to the invention advantageously delivers unambiguous results, in particular in comparison to the SHERLOCK method.

Die Positivkontrolle stellt dabei die Bindung des Detektionsmarkers an den immobilisierten Nukleotid-Tag oder die Bindung des Detektionsmarkers durch die immobilisierte Bindeeinheit dar. Unter dem Begriff „Positivkontrolle“ wird eine experimentelle Anordnung verstanden, die bei der fehlerfreien Durchführung des Verfahrens ein positives Ergebnis liefert. Vorteilhaft liefert die Positivkontrolle einen Beweis dafür, dass das Verfahren und/oder das Kit korrekt angewendet wurden. In bevorzugten Ausführungsformen liefert die Positivkontrolle weiterhin einen Beweis dafür, dass das Verfahren und das Kit bzw. die Komponenten des Kits fehlerfrei funktionieren.The positive control represents the binding of the detection marker to the immobilized nucleotide tag or the binding of the detection marker by the immobilized binding unit. The term “positive control” is understood to mean an experimental arrangement that delivers a positive result when the method is carried out correctly. Advantageously, the positive control provides evidence that the method and/or kit has been used correctly. In preferred embodiments, the positive control also provides evidence that the method and kit or kit components are functioning correctly.

In Ausführungsformen erfolgt Schritt d) durch Kontaktieren der modifizierten Target-Nukleotidsequenz mit einer Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, wobei die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag der modifizierten Target-Nukleotidsequenz und den auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Bindeeinheit gebunden wird. Vorteilhaft ermöglicht der Detektionsmarker und die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit auch die visuelle Detektion der Kontrollbande, durch Bindung des immobilisierten Nukleotid-Tags oder durch die immobilisierte Bindeeinheit (siehe 1i).In embodiments, step d) is carried out by contacting the modified target nucleotide sequence with an anti-nucleotide tag binding moiety bound to a detection marker, wherein the anti-nucleotide tag binding moiety to the nucleotide tag of the modified target nucleotide sequence and the on the Flow strip binds nucleotide tag immobilized or is bound by the binding moiety immobilized on the flow strip. Advantageously, the detection marker and the anti-nucleotide tag binding unit also enable the visual detection of the control band, by binding the immobilized nucleotide tag or by the immobilized binding unit (see 1i ).

In Ausführungsformen ist die mindestens eine Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit ein Antikörper oder ein Antikörperfragment.In embodiments, the at least one anti-nucleotide tag binding moiety is an antibody or an antibody fragment.

In Ausführungsformen ist die auf dem Durchflussstreifen immobilisierte Bindeeinheit (ii) ein sekundärer Antikörper gegen den Wirtsorganismus des Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper, bevorzugt ein Anti-Kaninchen-Antikörper, ein Anti-Ziegen-Antikörper, ein Anti-Maus-Antikörper oder ein Anti-human-Antikörper.In embodiments, the binding moiety immobilized on the flow strip is (ii) a secondary antibody against the host organism of the anti-nucleotide tag antibody, preferably an anti-rabbit antibody, an anti-goat antibody, an anti-mouse antibody or a anti-human antibodies.

In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt Schritt d) durch Kontaktieren der FAM-modifizierten Target-Nukleotidsequenz mit einem Anti-FAM-Antikörper gebunden an GNP, wobei auf der Testbande der Anti-FAM-Antikörper an den FAM-Tag der Target-Nukleotidsequenz bindet und auf der Kontrollbande der Anti-FAM-Antikörper durch die auf dem Durchflussstreifen immobilisierte Bindeeinheit, bevorzugt den sekundären Antikörper gegen den Wirtsorganismus des Anti-FAM-Antikörpers, gebunden wird, was zur Bildung mindestens einer sichtbaren Bande auf dem Durchflussstreifen führt.In preferred embodiments, step d) is carried out by contacting the FAM-modified target nucleotide sequence with an anti-FAM antibody bound to GNP, with the anti-FAM antibody binding to the FAM tag of the target nucleotide sequence on the test band and on the Control band of the anti-FAM antibody is bound by the binding moiety immobilized on the flow strip, preferably the secondary antibody against the host organism of the anti-FAM antibody, resulting in the formation of at least one visible band on the flow strip.

In alternativen Ausführungsformen erfolgt Schritt d) durch Kontaktieren der Target-Nukleotidsequenz mit einer zu der Target-Nukleotidsequenz zumindest teilweise komplementären Detektionsmarker-modifizierten Nukleotidsequenz, insbesondere einem Primer, welcher mit der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert. Zweckmäßig dient bei der Verwendung einer Detektionsmarker-modifizierten Nukleotidsequenz zur Visualisierung als Positivkontrolle eine Bindeeinheit, welche die Nukleotidsequenz oder einen weiteren Tag an der Nukleotidsequenz auf der Kontrolllinie bindet, insbesondere eine immobilisierte Nukleotidsequenz oder ein sekundärer Antikörper.In alternative embodiments, step d) is carried out by contacting the target nucleotide sequence with a detection marker-modified nucleotide sequence which is at least partially complementary to the target nucleotide sequence, in particular a primer which hybridizes with the target nucleotide sequence. When using a detection marker-modified nucleotide sequence for visualization, a binding unit that binds the nucleotide sequence or another tag to the nucleotide sequence on the control line, in particular an immobilized nucleotide sequence or a secondary antibody, serves expediently as a positive control.

In weiteren alternativen Ausführungsformen erfolgt Schritt d) durch Kontaktieren der Target-Nukleotidsequenz mit einer zu der Target-Nukleotidsequenz zumindest teilweise komplementären Nukleotid-Tag-modifizierten Nukleotidsequenz, insbesondere einem Primer, welcher mit der Target-Nukleotidsequenz hybridisiert, und einer Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, wobei die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag der zu der Target-Nukleotidsequenz zumindest teilweise komplementären Nukleotid-Tag-modifizierten Nukleotidsequenz bindet und den auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Bindeeinheit, bevorzugt den sekundären Antikörper gegen den Wirtsorganismus der Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit, gebunden wird.In further alternative embodiments, step d) is carried out by contacting the target nucleotide sequence with a nucleotide tag-modified nucleotide sequence which is at least partially complementary to the target nucleotide sequence, in particular a primer which hybridizes with the target nucleotide sequence, and an anti-nucleotide tag - Binding unit bound to a detection marker, wherein the anti-nucleotide tag binding unit binds to the nucleotide tag of the nucleotide tag-modified nucleotide sequence which is at least partially complementary to the target nucleotide sequence and binds the nucleotide tag immobilized on the flow-through strip or from the binding moiety immobilized on the flow strip, preferably the secondary antibody against the host organism of the anti-nucleotide tag binding moiety.

In Ausführungsformen ist der Detektionsmarker aus Nanopartikeln, bevorzugt Metallnanopartikeln, besonders bevorzugt GNP, oder Farbstoffen, bevorzugt Fluoreszenzfarbstoffen, ausgewählt.In embodiments, the detection marker is selected from nanoparticles, preferably metal nanoparticles, particularly preferably GNP, or dyes, preferably fluorescent dyes.

In Ausführungsformen sind Nanopartikel Metallnanopartikel, Kunststoffnanopartikel, insbesondere Polystyren-Beads, SiO2 (Siliziumdioxid)-Beads oder Latex-Beads.In embodiments, nanoparticles are metal nanoparticles, plastic nanoparticles, in particular polystyrene beads, SiO 2 (silicon dioxide) beads or latex beads.

In Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin die Zugabe eines Puffers, bevorzugt vor Schritt c).In embodiments, the method according to the invention also includes the addition of a buffer, preferably before step c).

In Ausführungsformen erfolgen die Schritte b), c) und d) bei einer Temperatur im Bereich von 4 °C bis 100 °C, bevorzugt im Bereich von 10 °C bis 40 °C, besonders bevorzugt im Bereich von 20 °C bis 30 °C.In embodiments, steps b), c) and d) take place at a temperature in the range from 4° C. to 100° C., preferably in the range from 10° C. to 40° C., particularly preferably in the range from 20° C. to 30° C

In Ausführungsformen erfolgen die Schritte b), c) und d) für einen Zeitraum im Bereich von 0 min bis 10 min.In embodiments, steps b), c) and d) occur for a period of time ranging from 0 min to 10 min.

In Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen, wobei

  • - in Schritt a) mindestens zwei Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Proteine bereitgestellt werden, wobei die mindestens zwei Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteine verschiedene guideRNAs und verschiedene Protein-Tags aufweisen,
  • - in Schritt b) eine erste Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA des ersten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins und eine zweite Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA des zweiten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins bindet,
  • - in Schritt c) ein Durchflussstreifen mit mindestens zwei verschiedenen, lokal getrennt immobilisierten Anti-Protein-Tag-Bindeeinheiten bereitgestellt wird, wobei eine erste Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit den Protein-Tag des ersten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins und eine zweite Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit den Protein-Tag des zweiten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins bindet.
In embodiments, the method is for detecting at least two different target nucleotide sequences, wherein
  • - in step a) at least two nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins are provided, wherein the at least two nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins have different guideRNAs and different protein tags,
  • - in step b) a first target nucleotide sequence in the sample to the guideRNA of the first nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein and a second target nucleotide sequence in the sample to the guideRNA of the second nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas - binds proteins
  • - In step c) a flow strip is provided with at least two different, locally separately immobilized anti-protein tag binding units, wherein a first anti-protein tag binding unit binds the protein tag of the first nuclease-deficient, nucleotide sequence Cas- Protein and a second anti-protein tag binding moiety binds the protein tag of the second nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein.

In Ausführungsformen sind die zwei Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteine identisch oder verschieden.In embodiments, the two nuclease-deficient nucleotide sequence-binding Cas proteins are identical or different.

In alternativen Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen, wobei Schritt d) durch Kontaktieren der Target-Nukleotidsequenzen mit mindestens einer zu der Target-Nukleotidsequenz zumindest teilweise komplementären Detektionsmarker-modifizierten Nukleotidsequenz, insbesondere mindestens einem Primer, welche mit den Target-Nukleotidsequenzen hybridisiert. In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung von zwei unterschiedlichen zu den zwei Target-Nukleotidsequenzen jeweils zumindest teilweise komplementären Detektionsmarker-modifizierten Nukleotidsequenzen, insbesondere zwei Primern, welche mit den zwei Target-Nukleotidsequenzen hybridisieren. In Ausführungsformen sind die Detektionsmarker der zwei Detektionsmarker-modifizierten Nukleotidsequenzen unterschiedlich.In alternative embodiments, the method is used to detect at least two different target nucleotide sequences, with step d) being carried out by contacting the target nucleotide sequences with at least one detection marker-modified nucleotide sequence which is at least partially complementary to the target nucleotide sequence, in particular at least one primer, which is Target nucleotide sequences hybridized. In embodiments, the use of two different detection marker-modified nucleotide sequences that are at least partially complementary to the two target nucleotide sequences, in particular two primers, which hybridize with the two target nucleotide sequences. In embodiments, the detection markers of the two detection marker-modified nucleotide sequences are different.

In Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen, wobei Schritt d) durch Kontaktieren von mindestens zwei Nukleotid-Tag-modifizierten Target-Nukleotidsequenzen mit mindestens einer Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker erfolgt, wobei die Nukleotid-Tags identisch oder unterschiedlich sind und wobei die mindestens eine Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an die Nukleotid-Tags der modifizierten Target-Nukleotidsequenzen und den auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Bindeeinheit gebunden wird.In embodiments, the method is for detecting at least two different target nucleotide sequences, wherein step d) is carried out by contacting at least two nucleotide tag-modified target nucleotide sequences with at least one anti-nucleotide tag binding unit bound to a detection marker, wherein the Nucleotide tags are identical or different and wherein the at least one anti-nucleotide tag binding moiety binds to the nucleotide tags of the modified target nucleotide sequences and the nucleotide tag immobilized on the flow strip or is bound by the binding moiety immobilized on the flow strip.

In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen, wobei Schritt d) durch Kontaktieren der mindestens zwei Target-Nukleotidsequenzen mit mindestens zwei zu den Target-Nukleotidsequenzen zumindest teilweise komplementären Nukleotid-Tag-modifizierten Nukleotidsequenzen, insbesondere mindestens zwei Primern, welche mit den mindestens zwei Target-Nukleotidsequenzen hybridisieren, und einer Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, wobei die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag der zu der Target-Nukleotidsequenz zumindest teilweise komplementären Nukleotid-Tag-modifizierten Nukleotidsequenz bindet und den auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Bindeeinheit gebunden wird. Vorteilhaft ermöglicht die Verwendung identischer Nukleotid-Tags und die Zugabe einer Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit die simultane Visualisierung der mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen.In preferred embodiments, the method for detecting at least two different target nucleotide sequences is carried out, with step d) by contacting the at least two target nucleotide sequences with at least two nucleotide tag-modified nucleotide sequences that are at least partially complementary to the target nucleotide sequences, in particular at least two primers Which hybridize with the at least two target nucleotide sequences, and an anti-nucleotide tag binding unit bound to a detection marker, wherein the anti-nucleotide tag binding unit is attached to the nucleotide tag of the nucleotide sequence at least partially complementary to the target nucleotide Tag-modified nucleotide sequence binds and binds to the nucleotide tag immobilized on the flow strip or is bound by the binding moiety immobilized on the flow strip. Advantageously, the use of identical nucleotide tags and the addition of an anti-nucleotide tag binding moiety enables the simultaneous visualization of the at least two different target nucleotide sequences.

In alternativen Ausführungsformen umfasst das Verfahren zum Nachweis mindestens einer Target-Nukleotidsequenz die folgenden Schritte:

  1. a) Bereitstellung mindestens eines Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins, wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein eine guideRNA und einen Protein-Tag aufweist,
  2. b) Kontaktierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einer Probe enthaltend mindestens eine Target-Nukleotidsequenz, wobei die Target-Nukleotidsequenz einen Nukleotid-Tag aufweist, und wobei die Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins bindet,
  3. c) Kontaktierung des mindestens einen Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einem Durchflussstreifen umfassend
    1. i. mindestens eine immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit, und
    2. ii. eine immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder einen immobilisierten Antikörper,
    wobei die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit und die immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder der immobilisierte Antikörper lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei der Nukleotid-Tag der Target-Nukleotidsequenz an die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit bindet, und
  4. d) Kontaktierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins mit einem Detektionsmarker.
In alternative embodiments, the method for detecting at least one target nucleotide sequence comprises the following steps:
  1. a) providing at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has a guideRNA and a protein tag,
  2. b) contacting the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a sample containing at least one target nucleotide sequence, wherein the target nucleotide sequence has a nucleotide tag, and wherein the target nucleotide sequence in the sample is attached to the guideRNA of the nuclease deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein binds,
  3. c) contacting the at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a flow-through strip
    1. i. at least one immobilized anti-nucleotide tag binding moiety, and
    2. ii. an immobilized target nucleotide sequence or an immobilized antibody,
    wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding entity and the immobilized target nucleotide sequence or the immobilized antibody are immobilized locally separately on the flow strip, wherein the nucleotide tag of the target nucleotide sequence binds to the immobilized anti-nucleotide tag binding entity, and
  4. d) Contacting the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with a detection marker.

In weiteren Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen, wobei

  • - in Schritt a) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein mit einem Protein-Tag bereitgestellt wird, wobei das mindestens eine Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein mindestens zwei verschiedene guideRNAs aufweist,
  • - in Schritt b) eine erste Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die erste guideRNA und eine zweite Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die zweite guideRNA bindet, wobei die mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen jeweils einen unterschiedlichen Nukleotid-Tag aufweisen,
  • - in Schritt c) ein Durchflussstreifen mit mindestens zwei verschiedenen, lokal getrennt immobilisierten Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheiten bereitgestellt wird, wobei ein erster Nukleotid-Tag an eine erste Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit und ein zweiter Nukleotid-Tag an eine zweite Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit bindet.
In further embodiments, the method is used to detect at least two different target nucleotide sequences, where
  • - in step a) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is provided with a protein tag, wherein the at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has at least two different guideRNAs,
  • - in step b) a first target nucleotide sequence in the sample binds to the first guideRNA and a second target nucleotide sequence in the sample binds to the second guideRNA, the at least two different target nucleotide sequences each having a different nucleotide tag,
  • - in step c) a flow-through strip with at least two different, locally separately immobilized anti-nucleotide tag binding units is provided, wherein a first nucleotide tag to a first anti-nucleotide tag binding unit and a second nucleotide tag to a second Anti-nucleotide tag binding moiety binds.

Vorteilhaft löst das Verfahren das Problem des Austauschs von guideRNAs zwischen Cas-Proteinen in derselben Lösung. Weiterhin vorteilhaft können durch das Verfahren mehrere Target-Nukleotidsequenzen gleichzeitig analysiert werden, ohne orthogonale Cas-Proteine zu verwenden. Vorteilhaft kann das gleiche Cas-Protein mit dem gleichen Protein-Tag verwendet werden, um verschiedene Target-Nukleotidsequenzen nachzuweisen.Advantageously, the method solves the problem of exchanging guideRNAs between Cas proteins in the same solution. Furthermore, advantageously, several target nucleotide sequences can be analyzed simultaneously by the method without using orthogonal Cas proteins. Advantageously, the same Cas protein with the same protein tag can be used to detect different target nucleotide sequences.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Kit zum Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen umfassend

  • 1) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein, wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein einen Protein-Tag aufweist,
  • 2) mindestens eine guideRNA, wobei die guideRNA ausgebildet ist, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden,
  • 3) einen Durchflussstreifen umfassend
    1. i. mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit, und
    2. ii. einen immobilisierten Nukleotid-Tag oder eine immobilisierte Bindeeinheit, welche einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet,
    wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und der Nukleotid-Tag oder die Bindeeinheit lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit ausgebildet ist, sodass eine Bindung mit dem Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins erfolgt, und
  • 4) einen Detektionsmarker.
Another aspect of the invention relates to a kit for detecting target nucleotide sequences
  • 1) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has a protein tag,
  • 2) at least one guideRNA, the guideRNA being designed to bind a target nucleotide sequence,
  • 3) comprising a flow strip
    1. i. at least one immobilized anti-protein tag binding moiety, and
    2. ii. an immobilized nucleotide tag or an immobilized binding entity which binds an anti-nucleotide tag antibody,
    wherein the immobilized anti-protein tag binding moiety and the nucleotide tag or the binding moiety are immobilized locally separately on the flow-through strip, wherein the immobilized anti-protein tag binding moiety is configured to bind to the protein tag of the nuclease deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein occurs, and
  • 4) a detection marker.

In Ausführungsformen umfasst das Kit weiterhin mindestens einen Nukleotid-Tag modifizierten Primer und eine Polymerase oder mindestens eine Nukleotid-Tag- oder Fluoreszenz-modifizierte Nukleotidsequenz, welche komplementär zur Target-Nukleotidsequenz ist.In embodiments, the kit further comprises at least one nucleotide tag modified primer and a polymerase or at least one nucleotide tag or fluorescence modified nucleotide sequence complementary to the target nucleotide sequence.

In Ausführungsformen umfasst das Kit weiterhin mindestens eine Nukleotid-Tag modifizierte Target-Nukleotidsequenz.In embodiments, the kit further comprises at least one nucleotide tag modified target nucleotide sequence.

In Ausführungsformen des Kits ist der Detektionsmarker eine Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, wobei die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag einer modifizierten Target-Nukleotidsequenz und den auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Bindeeinheit gebunden wird.In embodiments of the kit, the detection marker is an anti-nucleotide tag binding moiety bound to a detection marker, wherein the anti-nucleotide tag binding moiety binds to the nucleotide tag of a modified target nucleotide sequence and the nucleotide tag immobilized on the flow strip or bound by the binding moiety immobilized on the flow strip.

In Ausführungsformen umfasst das Kit weiterhin mindestens einen Puffer. In Ausführungsformen ist der Puffer ein TBS (Tris-buffered saline)-Puffer, insbesondere umfassend 100 bis 500 mM NaCl oder KCl, 50 mM Tris-HCl und einen pH-Wert von 7,6, oder ein Cas9-Reaktionspuffer, insbesondere umfassend 20 bis 50 mM Hepes-Puffer, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA und einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8, bevorzugt bei pH-Wert 7,2. Zweckmäßig erfolgt die Verwendung weiterer Salze, Tenside und/oder Blockierungsreagenzien, um die Fließgeschwindigkeit, Spezifität und Gesamtstabilität der Komponenten des Kits zu optimieren. In Ausführungsformen liegt der Puffer in Lösung oder getrocknet auf einer Membran vor. In weiteren Ausführungsformen enthält der Puffer weiterhin < 0,1 % (m/m) Natriumazid als bakteriostatisches Konservierungsmittel.In embodiments, the kit further comprises at least one buffer. In embodiments, the buffer is a TBS (Tris-buffered saline) buffer, in particular comprising 100 to 500 mM NaCl or KCl, 50 mM Tris-HCl and a pH of 7.6, or a Cas9 reaction buffer, in particular comprising 20 to 50mM Hepes buffer, 100mM NaCl, 5mM MgCl 2 , 0.1mM EDTA and a pH in the range 6 to 8, preferably at pH 7.2. Other salts, surfactants and/or blocking reagents are conveniently used to optimize the flow rate, specificity and overall stability of the components of the kit. In embodiments, the buffer is in solution or dried on a membrane. In further embodiments, the buffer further contains <0.1% (w/w) sodium azide as a bacteriostatic preservative.

In Ausführungsformen liegen die Komponenten des Kits dehydriert, insbesondere gefriergetrocknet, und/oder in Pufferlösung vor.In embodiments, the components of the kit are dehydrated, in particular freeze-dried, and/or in a buffer solution.

In Ausführungsformen umfasst das Kit zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen

  • 1) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein, wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein einen Protein-Tag aufweist,
  • 2) mindestens zwei guideRNAs, wobei die guideRNAs ausgebildet sind, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden,
  • 3) einen Durchflussstreifen umfassend
    1. i. mindestens zwei verschiedene immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheiten, und
    2. ii. einen immobilisierten Nukleotid-Tag oder eine immobilisierte Bindeeinheit, welche einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet, wobei die immobilisierten Anti-Protein-Tag-Bindeeinheiten und der Nukleotid-Tag oder die Bindeeinheit lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit ausgebildet ist, sodass eine Bindung mit dem Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins erfolgt, und
  • 4) einen Detektionsmarker.
In embodiments, the kit includes for detecting at least two different target nucleotide sequences
  • 1) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has a protein tag,
  • 2) at least two guideRNAs, the guideRNAs being designed to bind a target nucleotide sequence,
  • 3) comprising a flow strip
    1. i. at least two different immobilized anti-protein tag binding moieties, and
    2. ii. an immobilized nucleotide tag or an immobilized binding moiety which binds an anti-nucleotide tag antibody, wherein the immobilized anti-protein tag binding moieties and the nucleotide tag or the binding moiety are locally immobilized separately on the flow strip, the immobilized Anti-protein tag binding unit is formed so that a binding with the protein tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein occurs, and
  • 4) a detection marker.

In Ausführungsformen umfasst das Kit weiterhin mindestens zwei Nukleotid-Tag modifizierte Target-Nukleotidsequenzen.In embodiments, the kit further comprises at least two nucleotide tag modified target nucleotide sequences.

In alternativen Ausführungsformen umfasst das Kit zum Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen die folgenden Komponenten:

  • 1) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein, wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein einen Protein-Tag aufweist,
  • 2) mindestens eine guideRNA, wobei die guideRNA ausgebildet ist, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden,
  • 3) einen Durchflussstreifen umfassend
    1. i. mindestens eine immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit, und
    2. ii. eine immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder einen immobilisierten Antikörper, wobei die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit und die immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder der immobilisierte Antikörper lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit ausgebildet ist, sodass eine Bindung mit einem Nukleotid-Tag erfolgt, und
  • 4) einen Detektionsmarker.
In alternative embodiments, the kit for detecting target nucleotide sequences includes the following components:
  • 1) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has a protein tag,
  • 2) at least one guideRNA, the guideRNA being designed to bind a target nucleotide sequence,
  • 3) comprising a flow strip
    1. i. at least one immobilized anti-nucleotide tag binding moiety, and
    2. ii. an immobilized target nucleotide sequence or an immobilized antibody, wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding moiety and the immobilized target nucleotide sequence or the immobilized antibody are immobilized locally separately on the flow strip, wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding moiety is formed , such that binding occurs with a nucleotide tag, and
  • 4) a detection marker.

In Ausführungsformen bindet der auf dem Durchflussstreifen immobilisierte Antikörper den Detektionsmarker (Positivkontrolle).In embodiments, the antibody immobilized on the flow strip binds the detection marker (positive control).

In weiteren Ausführungsformen umfasst das Kit zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen

  • 1) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein, wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein einen Protein-Tag aufweist,
  • 2) mindestens zwei guideRNAs, wobei die guideRNAs ausgebildet sind, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden,
  • 3) einen Durchflussstreifen umfassend
    • i. mindestens zwei immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheiten, und
    • ii. eine immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder ein immobilisierter Antikörper,
    • wobei die immobilisierten Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheiten und die immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder der immobilisierte Antikörper lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit ausgebildet ist, sodass eine Bindung mit einem Nukleotid-Tag erfolgt, und
  • 4) einen Detektionsmarker.
In further embodiments, the kit comprises for the detection of at least two different target nucleotide sequences
  • 1) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein has a protein tag,
  • 2) at least two guideRNAs, the guideRNAs being designed to bind a target nucleotide sequence,
  • 3) comprising a flow strip
    • i. at least two immobilized anti-nucleotide tag binding moieties, and
    • ii. an immobilized target nucleotide sequence or an immobilized antibody,
    • wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding moieties and the immobilized target nucleotide quenz or the immobilized antibody are immobilized locally separately on the flow strip, wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding unit is formed so that a binding occurs with a nucleotide tag, and
  • 4) a detection marker.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des Kits zum Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere Pathogenen; Krankheiten oder Gensequenzen in Proben von Patienten, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Pilzen. Zweckmäßig erfolgt die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des Kits zu diagnostischen Zwecken und/oder zur Forschung, um beispielsweise die Verbreitung verschiedener Spezies nachzuvollziehen oder um die Zusammensetzung einer mikrobiellen Probe zu analysieren.A further aspect of the invention relates to the use of the method according to the invention and/or the kit for detecting microorganisms, in particular pathogens; Diseases or gene sequences in samples from patients, animals, plants, microorganisms or fungi. The method and/or the kit according to the invention is expediently used for diagnostic purposes and/or for research, for example to understand the distribution of different species or to analyze the composition of a microbial sample.

Unter dem Begriff „Mikroorganismen“ werden mikroskopisch kleine Lebewesen (Organismen) verstanden, welche als Einzelwesen nicht mit bloßem Auge erkennbar sind. In Ausführungsformen sind Mikroorganismen Einzeller oder wenigzellige Lebewesen, wie Bakterien, Pilze oder Algen, aber auch Viren.The term "microorganisms" is understood to mean microscopically small living beings (organisms) which cannot be recognized as individual beings with the naked eye. In embodiments, microorganisms are unicellular organisms or living beings with few cells, such as bacteria, fungi or algae, but also viruses.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zur Untersuchung von Pflanzen oder Tieren auf bestimmte Gensequenzen, um beispielsweise GMOs in der Landwirtschaft nachzuweisen oder um genetische Variabilität in einer Spezies in der Wildnis nachzuverfolgen.In embodiments, the method according to the invention and/or the kit according to the invention is used to examine plants or animals for specific gene sequences, for example to detect GMOs in agriculture or to track genetic variability in a species in the wild.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum Genotypisieren von Patienten, insbesondere Menschen oder Tieren.In embodiments, the method according to the invention and/or the kit according to the invention is used for genotyping patients, in particular humans or animals.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis von Punktmutationen sowie zur Unterscheidung von heterozygoten und homozygoten Genotypen.In embodiments, the method according to the invention and/or the kit according to the invention is used to detect point mutations and to differentiate between heterozygous and homozygous genotypes.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis einer Veranlagung zu monogenen Krankheiten oder zum Nachweis von Krankheiten, wie Alzheimer, Sichelzellenanämie, Glanzmann's-Thrombasthenie, Glykogenspeicherkrankheit Typ I, Hämophilie A, X-chromosomale myotubuläre Myopathie, oder Krankheiten, verursacht durch Mikroorganismen, wie Bakterien oder Viren, bevorzugt Helicobacter pylori-Infektion, HIV, SARS-CoV2, SARS-CoV1, oder zum Nachweis von Krankheitserregern.In embodiments, the method according to the invention and/or the kit according to the invention is used to detect a predisposition to monogenic diseases or to detect diseases such as Alzheimer's disease, sickle cell anemia, Glanzmann's thrombasthenia, glycogen storage disease type I, hemophilia A, X-linked myotubular myopathy, or Diseases caused by microorganisms such as bacteria or viruses, preferably Helicobacter pylori infection, HIV, SARS-CoV2, SARS-CoV1, or to detect pathogens.

In Ausführungsformen erfolgt das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Varianten von Pathogenen, wie Virusvarianten, insbesondere zwischen Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Varianten des SARS-CoV2.In embodiments, the method is for detecting at least two different target nucleotide sequences to distinguish between different variants of pathogens, such as virus variants, in particular between alpha, beta, gamma and delta variants of SARS-CoV2.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum Auslesen einer Nukleotidsequenz-Kodierung.A further aspect of the invention relates to the use of the method according to the invention and/or the kit according to the invention for reading out a nucleotide sequence coding.

Unter dem Begriff „Nukleotidsequenz-Kodierung“ wird ein Verfahren umfassend das Schreiben, Speichern und Auslesen von Informationen mittels mindestens einer Nukleotidsequenz verstanden. In Ausführungsformen erfolgt das „Schreiben“ durch das Aufbringen mindestens einer Nukleotidsequenz auf ein Produkt und das „Auslesen“ durch Isolation der mindestens einen Nukleotidsequenz und Nachweis mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder mittels des erfindungsgemäßen Kits. Dabei kann sowohl eine natürliche Nukleotidsequenz, eine Kombination verschiedener natürlicher Nukleotidsequenzen, als auch eine synthetische Nukleotidsequenz zur Kodierung als Target-Nukleotidsequenz verwendet werden.The term "nucleotide sequence coding" is understood to mean a method comprising writing, storing and reading out information using at least one nucleotide sequence. In embodiments, “writing” takes place by applying at least one nucleotide sequence to a product and “reading” by isolating the at least one nucleotide sequence and detecting it using the method according to the invention and/or using the kit according to the invention. Both a natural nucleotide sequence, a combination of different natural nucleotide sequences, and a synthetic nucleotide sequence can be used for coding as the target nucleotide sequence.

In Ausführungsformen erfolgt das „Schreiben“ durch das Bereitstellen mindestens einer Nukleotidsequenz auf einem Schreiben, Produkt bzw. Gegenstand, insbesondere einem Kunstwerk, in Form einer Target-Nukleotidsequenz enthaltenden Lösung oder einer auf einer Membran aufgebrachten Target-Nukleotidsequenz.In embodiments, the “writing” takes place by providing at least one nucleotide sequence on a writing, product or object, in particular a work of art, in the form of a solution containing the target nucleotide sequence or a target nucleotide sequence applied to a membrane.

In Ausführungsformen erfolgt das „Schreiben“ durch das Aufbringen mindestens einer dehydrierten, insbesondere gefriergetrockneten, Target-Nukleotidsequenz auf einen Gegenstand bzw. Produkt.In embodiments, the “writing” takes place by applying at least one dehydrated, in particular freeze-dried, target nucleotide sequence to an object or product.

In Ausführungsformen erfolgt das „Auslesen“ durch Isolation der mindestens einen dehydrierten, insbesondere gefriergetrockneten, Target-Nukleotidsequenz von der Oberfläche des Gegenstands bzw. Produkts und Rehydrieren. Die rehydrierte Target-Nukleotidsequenz wird mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder mittels des erfindungsgemäßen Kits untersucht.In embodiments, the “reading out” takes place by isolating the at least one dehydrated, in particular freeze-dried, target nucleotide sequence from the surface of the object or pro duct and rehydrate. The rehydrated target nucleotide sequence is examined using the method according to the invention and/or using the kit according to the invention.

In Ausführungsformen erfolgt die Nukleotidsequenz-Kodierung mittels einer Nukleotidsequenz (siehe 1i) oder mit mindestens zwei verschiedenen Nukleotidsequenzen (siehe 2i).In embodiments, the nucleotide sequence encoding is by means of a nucleotide sequence (see 1i ) or with at least two different nucleotide sequences (see 2i ).

In Ausführungsformen erfolgt die Nukleotidsequenz-Kodierung als binäre Kodierung, in welcher die Abwesenheit oder Anwesenheit einer oder mehrerer Banden auf dem Durchflussstreifen die gewünschten Informationen kodiert.In embodiments, the nucleotide sequence encoding is binary encoding, in which the absence or presence of one or more bands on the flow strip encodes the desired information.

In Ausführungsformen erfolgt die Nukleotidsequenz-Kodierung mit vier verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen und vier Test-Banden auf einem Durchflussstreifen, wodurch 16 unterschiedliche Ergebnisse ausgelesen werden können. In weiteren Ausführungsformen werden die verschiedenen Test-Banden mittels verschiedener Nuklease-defizienter, Nukleotidsequenz-bindender Cas-Proteine, welche verschiedene Protein-Tags aufweisen, generiert, wobei die Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteine orthologe Gerüstsequenzen ihrer guideRNAs aufweisen, wodurch sie nicht in der Lage sind, die guideRNAs der anderen Cas-Proteine zu binden. Unter dem Begriff „ortholog“ werden Proteine verstanden, die von einem gemeinsamen Vorfahren abstammend, in verschiedenen Spezies eine gleiche Funktion ausüben. In weiteren Ausführungsformen werden die verschiedenen Test-Banden mittels verschiedener Nukleotid-Tag modifizierter Target-Nukleotidsequenzen generiert.In embodiments, the nucleotide sequence coding is done with four different target nucleotide sequences and four test bands on a flow strip, whereby 16 different results can be read out. In further embodiments, the different test bands are generated using different nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins which have different protein tags, the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins having orthologous framework sequences of their guideRNAs, whereby they are unable to bind the guideRNAs of the other Cas proteins. The term “orthologous” refers to proteins that, originating from a common ancestor, perform the same function in different species. In further embodiments, the various test bands are generated using target nucleotide sequences modified with various nucleotide tags.

In Ausführungsformen erfolgt die Nukleotidsequenz-Kodierung mittels mindestens einer Nukleotid-Tag-modifizierten Target-Nukleotidsequenz.In embodiments, the nucleotide sequence encoding is performed using at least one nucleotide tag modified target nucleotide sequence.

In alternativen Ausführungsformen erfolgt die Nukleotidsequenz-Kodierung mittels mindestens einer unmodifizierten Target-Nukleotidsequenz und mindestens einem Nukleotid-Tag-modifizierten Primer, welcher zumindest teilweise komplementär zu der Target-Nukleotidsequenz ist.In alternative embodiments, the nucleotide sequence coding is carried out using at least one unmodified target nucleotide sequence and at least one nucleotide tag-modified primer which is at least partially complementary to the target nucleotide sequence.

In Ausführungsformen erfolgt die Nukleotidsequenz-Kodierung mittels verschiedener Detektionsmarker und unterschiedlicher Nukleotid-Tags bzw. Protein-Tags, wodurch zur Visualisierung die verschiedenen Testbanden farbkodiert vorliegen.In embodiments, the nucleotide sequence coding is carried out using different detection markers and different nucleotide tags or protein tags, as a result of which the different test bands are color-coded for visualization.

In Ausführungsformen erfolgt eine Auslese der Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens über ein Auslesegerät, welches die Abfolge der Testbanden ausliest, beispielweise ein Smartphone mit einer entsprechenden App, wobei die Auslese über die Kamera erfolgt.In embodiments, the results of the method according to the invention are read out via a readout device, which reads out the sequence of test bands, for example a smartphone with a corresponding app, the readout taking place via the camera.

In Ausführungsformen erfolgt eine Verbindung eines Auslesegeräts mit einer Datenbank, welche Informationen aus dem Durchflussstreifen dekodiert.In embodiments, a reader connects to a database that decodes information from the flow strip.

In weiteren Ausführungsformen können verschiedene Kombinationen an guideRNAs oder guideRNA-Cas-Protein-Komplexen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, die über eine Markierung, beispielsweise einen QR-Code, über das Auslesegerät mit der Datenbank verbunden werden. Damit kann eine hohe Varianz an verschiedenen Kodierungen abgedeckt werden.In further embodiments, different combinations of guideRNAs or guideRNA-Cas protein complexes can be used for the method according to the invention, which are connected to the database via a marker, for example a QR code, via the reading device. This allows a high variance of different codings to be covered.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung der Nukleotidsequenz-Kodierung zur Echtheitsprüfung, d. h. zur Unterscheidung von Gegenständen bzw. Produkten von Fälschungen, insbesondere von Kunstwerken, historischen Artefakten, Verträgen, Testamenten oder Pharmazeutika.In embodiments, the use of the nucleotide sequence coding is for authentication, i. H. to distinguish objects or products from counterfeits, in particular works of art, historical artefacts, contracts, wills or pharmaceuticals.

In Ausführungsformen erfolgt die Verwendung der Nukleotidsequenz-Kodierung zur Bereitstellung von Produktinformationen, wie Informationen über den Zeitpunkt der Produktion, Herstellungsort oder Produktionseinheit.In embodiments, the nucleotide sequence coding is used to provide product information, such as information about the time of production, place of manufacture or unit of production.

Für die Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen, Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche miteinander zu kombinieren.For the realization of the invention, it is also expedient to combine the above-described configurations, embodiments and features of the claims with one another.

Ausführungsbeispieleexemplary embodiments

Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschreiben ohne diese zu beschränken.The invention will be explained in more detail below with reference to some exemplary embodiments and associated figures. The exemplary embodiments are intended to describe the invention without restricting it.

Es zeigen die

  • 1 ein Schema des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Verwendung des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis einer Target-Nukleotidsequenz: i) und iii) Nachweis von modifizierten Target-Nukleotidsequenzen mittels 1 Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Protein mit Protein-Tag, 2 guideRNA, 3 Nukleotid-Tag-modifizierte Target-Nukleotidsequenz, 6 Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit (i) oder Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit (iii), 7 Durchflussstreifen umfassend eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit (T) (i) oder Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit (iii), und einen immobilisierten sekundären Antikörper, welcher einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper (i) oder einen Anti-Protein-Tag-Antikörper (iii) bindet oder einer immobilisierten Target-Nukleotidsequenz (iii) (K). ii) Nachweis von unmodifizierten Target-Nukleotidsequenzen mittels 1 Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Protein mit Protein-Tag, 2 guideRNA, 4 Nukleotid-Tag-modifiziertem Primer, 5 unmodifizierter Target-Nukleotidsequenz, 6 Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, 7 Durchflussstreifen umfassend eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit (T), und einen immobilisierten sekundären Antikörper, welcher einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet (K).
  • 2 ein Schema des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Verwendung des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis von zwei-drei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen auf zwei-drei getrennten Testbanden (T1, T2, T3):
    • i) Nachweis von modifizierten Target-Nukleotidsequenzen ii) Nachweis von unmodifizierten Target-Nukleotidsequenzen mittels drei Nuklease-defizienter, Nukleotidsequenz-bindender Cas-Proteine mit verschiedenen Protein-Tags (1, 2, 3), drei verschiedene guideRNAs, drei verschiedene Nukleotid-Tag-modifizierte Target-Nukleotidsequenzen bzw. drei Nukleotid-Tag-modifizierte Primer und drei verschiedene unmodifizierte Target-Nukleotidsequenzen, Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, und einen Durchflussstreifen umfassend drei immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit (T1, T2, T3), und einen immobilisierten Antikörper, welcher einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet (K).
    • iii) Nachweis von modifizierten Target-Nukleotidsequenzen mittels einem oder mehreren Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteinen mit gleichen Protein-Tags und verschiedenen guideRNAs, zwei verschiedene Nukleotid-Tag-modifizierte Target-Nukleotidsequenzen mit zwei verschiedenen Nukleotid-Tags, Anti-Proteoin-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker, und einen Durchflussstreifen umfassend zwei immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheiten (T1, T2, T3), und einen immobilisierten Antikörper, welcher einen Anti-Protein-Tag-Antikörper bindet oder eine immobilisierte Target-Sequenz (K).
  • 3 ein Schema der verschiedenen dCas9-Varianten mit deren Mutationen: 1 Lac-Operator, 2 His-Tag, 3 Maltose-Bindendes Protein, 4 3C-Spaltstelle, 5 dCas9-Proteinsequenz mutiert in verschiedenen Positionen: a) Wildtyp-dCas9 mit zwei Cysteinresten (SEQ ID No. 1), b) C80L-Variante mit dem ersten Cystein mutiert zu Leucin (SEQ ID No. 2), c) CStop-Variante (Cysstop) mit Mutation der beiden internen Cysteinen und einem zusätzlichen Cysteinrest am C-Terminus (SEQ ID No. 3).
  • 4 die Ergebnisse des elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungs-Assays (EMSA) zur Bestätigung der Bindung zwischen drei verschiedenen gereinigten dCas9-Varianten (150 ng) und der Target-DNA (0,5 µg): A) dCas9-GFP, B) dCas9-Cys-stop, C) dCas9-C80L: 1. 16S-DNA-Region (16S), 2. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 4-8), 3. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 4-8) + dCas9, 4. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 4) + dCas9, 5. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 5) + dCas9, 6. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 6) + dCas9, 7. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 7) + dCas9, 8. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 8) + dCas9, DNA-Leiter: 1kb plus (New England Biolabs).
  • 5 ein Schema der Biotinylierung der dCas9-Varianten mittels Click-Chemie-Reaktion der SH-Gruppen der Cysteine mit einem Maleimid-Molekül (gebunden an ein Biotin-Molekül) (https://vwvw.quantabiodesign.com/maleimide-reaction-chemistryn.
  • 6 die Ergebnisse des elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungs-Assays (EMSA) zum Nachweis der Bindung zwischen den biotinylierten dCas9-Varianten und der Target-DNA (16S-DNA-Region (16S)): dCas9-Cys-stop und dCas9-C80L im Vergleich zu den nicht biotinylierten Cas9-Varianten dCas9-GFP, dCas9-Cys-stop und dCas9-C80L, jeweils mit und ohne guideRNA (ts1, SEQ ID No. 4): 1 dCas9-GFP (150 ng) + 16S, 2 dCas9-GFP (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 3 dCas9-Cys-stop (150 ng) + 16S, 4 dCas9-Cys-stop (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 5 biotinyliertes dCas9-Cys-stop (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 6 biotinyliertes dCas9-Cys-stop (300 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 7 biotinyliertes dCas9-Cys-stop (600 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 8 dCas9-C80L (150 ng) + 16S, 9 dCas9-C80L (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 10 biotinyliertes dCas9-C80L (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 11 biotinyliertes dCas9-C80L (300 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 12 biotinyliertes dCas9-C80L (600 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S.
  • 7 die Ergebnisse des Durchflussstreifen-Tests durchgeführt mittels HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) und zwei verschiedenen, biotinylierten dCas9-Varianten dCas9-Cys-stop (A) und dCas9-C80L (B) mit guideRNA (SEQ ID No. 4) und FAM-modifizierter Target-DNA (16S-DNA-Region, FAM-16S) nach Inkubation bei 37 °C für 15 min: 1 FAM-16S (150 ng), 2 FAM-16S (150 ng) + Cas (150 ng), 3 Cas (150 ng), 4 Cas (150 ng) + guideRNA (1 µg), 5 FAM-16S (150 ng) + Cas (150 ng) + guideRNA (1 µg), 6 FAM-16S (300 ng) + Cas (300 ng) + guideRNA (2 µg), 7 FAM-16S (600 ng) + Cas (600 ng) + guideRNA (4 µg).
  • 8 die Ergebnisse der Untersuchung des Detektionslimits des Durchflussstreifen-Tests durchgeführt mittels HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) der dCas9-Variante dCas9-Cys-stop mit guideRNA (SEQ ID No. 4) und FAM-modifizierter Target-DNA (16S-DNA-Region, FAM-16S) nach Inkubation bei 37 °C für 15 min: 1 FAM-16S (1 µg) + Cas (600 ng), 2 FAM-16S (1 µg) + Cas (300 ng), 3 FAM-16S (1 µg) + Cas (150 ng), 4 FAM-16S (0,5 µg) + Cas (600 ng), 5 FAM-16S (0,5 µg) + Cas (300 ng), 6 FAM-16S (0,5 µg) + Cas (150 ng), 7 FAM-16S (0,25 µg) + Cas (600 ng), 8 FAM-16S (0,25 µg) + Cas (300 ng), 9 FAM-16S (0,25 µg) + Cas (150 ng), 10 FAM-16S (125 ng) + Cas (600 ng), 11 FAM-16S (125 ng) + Cas (300 ng), 12 FAM-16S (125 ng) + Cas (150 ng), 11 FAM-16S (60 ng) + Cas (600 ng), 12 FAM-16S (60 ng) + Cas (300 ng), 13 FAM-16S (60 ng) + Cas (150 ng), 16 FAM-16S (30 ng) + Cas (600 ng), 17 FAM-16S (30 ng) + Cas (300 ng), 18 FAM-16S (30 ng) + Cas (150 ng).
  • 9 die Ergebnisse der Untersuchung der Inkubationszeit des Durchflussstreifen-Tests durchgeführt mittels HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) der dCas9-Variante dCas9-Cys-stop (15 ng, 300ng oder 600 ng) mit guideRNA (SEQ ID No. 4) und FAM-modifizierter Target-DNA (16S-DNA-Region, FAM-16S) nach Inkubation bei 37 °C für (1) 10 min, (2) 5 min, (3) 1 min, (4) 30 s, und nach Inkubation bei Raumtemperatur für (5) 0 min, d.h. mit einer direkten Zugabe der Mischung ohne vorherigen Inkubation auf den Durchflussstreifen.
It show the
  • 1 a scheme of the method according to the invention and the use of the kit according to the invention for detecting a target nucleotide sequence: i) and iii) detection of modified target nucleotide sequences using 1 nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with protein tag, 2 guideRNA, 3 Nucleotide tag modified target nucleotide sequence, 6 anti-nucleotide tag binding moiety (i) or anti-protein tag binding moiety (iii), 7 flow strips comprising an immobilized anti-protein tag binding moiety (T) (i) or anti-nucleotide tag binding moiety (iii), and an immobilized secondary antibody which binds an anti-nucleotide tag antibody (i) or an anti-protein tag antibody (iii) or an immobilized target nucleotide sequence ( iii) (K). ii) Detection of unmodified target nucleotide sequences using 1 nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein with protein tag, 2 guideRNA, 4 nucleotide tag-modified primer, 5 unmodified target nucleotide sequence, 6 anti-nucleotide tag binding unit bound to a detection marker, 7 flow strips comprising an immobilized anti-protein tag binding moiety (T), and an immobilized secondary antibody which binds an anti-nucleotide tag antibody (K).
  • 2 a scheme of the method according to the invention and the use of the kit according to the invention for the detection of two-three different target nucleotide sequences on two-three separate test bands (T1, T2, T3):
    • i) Detection of modified target nucleotide sequences ii) Detection of unmodified target nucleotide sequences using three nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins with different protein tags (1, 2, 3), three different guideRNAs, three different nucleotide tags -modified target nucleotide sequences or three nucleotide tag-modified primers and three different unmodified target nucleotide sequences, anti-nucleotide tag binding unit bound to a detection marker, and a flow strip comprising three immobilized anti-protein tag binding unit (T1, T2, T3), and an immobilized antibody that binds an anti-nucleotide tag antibody (K).
    • iii) Detection of modified target nucleotide sequences using one or more nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins with the same protein tags and different guideRNAs, two different nucleotide tag-modified target nucleotide sequences with two different nucleotide tags, anti- Proteoin tag binding moiety bound to a detection marker, and a flow strip comprising two immobilized anti-nucleotide tag binding moieties (T1, T2, T3), and an immobilized antibody which binds an anti-protein tag antibody or an immobilized target -Sequence (K).
  • 3 a scheme of the different dCas9 variants with their mutations: 1 Lac operator, 2 His tag, 3 maltose binding protein, 4 3C cleavage site, 5 dCas9 protein sequence mutated in different positions: a) wild-type dCas9 with two cysteine residues ( SEQ ID No. 1), b) C80L variant with the first cysteine mutated to leucine (SEQ ID No. 2), c) CStop variant (Cysstop) with mutation of the two internal cysteines and an additional cysteine residue at the C terminus ( SEQ ID No. 3).
  • 4 the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) results confirming the binding between three different purified dCas9 variants (150 ng) and the target DNA (0.5 µg): A) dCas9-GFP, B) dCas9-Cys-stop , C) dCas9-C80L: 1. 16S DNA region (16S), 2. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 4-8), 3. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 4-8) + dCas9, 4. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 4) + dCas9, 5. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 5) + dCas9, 6. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 6) + dCas9, 7. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 7) + dCas9, 8. 16S + guideRNA (SEQ ID No. 8) + dCas9, DNA ladder: 1kb plus (New England Biolabs).
  • 5 a scheme of the biotinylation of the dCas9 variants by means of a click chemistry reaction of the SH groups of the cysteines with a maleimide molecule (bound to a biotin molecule) (https://vwvw.quantabiodesign.com/maleimide-reaction-chemistryn.
  • 6 the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) results demonstrating binding between the biotinylated dCas9 variants and the target DNA (16S DNA region (16S)): dCas9-Cys-stop and dCas9-C80L compared to the non biotinylated Cas9 variants dCas9-GFP, dCas9-Cys-stop and dCas9-C80L, each with and without guideRNA (ts1, SEQ ID No. 4): 1 dCas9-GFP (150 ng) + 16S, 2 dCas9-GFP (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 3 dCas9-Cys-stop (150 ng) + 16S, 4 dCas9-Cys-stop (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 5 biotinylated dCas9-Cys-stop (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 6 biotinylated dCas9-Cys-stop (300 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 7 biotinylated dCas9-Cys -stop (600 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 8 dCas9-C80L (150 ng) + 16S, 9 dCas9-C80L (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 10 organic tinylated dCas9-C80L (150 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 11 biotinylated dCas9-C80L (300 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S, 12 biotinylated dCas9-C80L (600 ng) + guideRNA (SEQ ID No. 4) + 16S.
  • 7 the results of the flow strip test performed using HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) and two different, biotinylated dCas9 variants dCas9-Cys-stop (A) and dCas9-C80L (B) with guideRNA (SEQ ID No. 4) and FAM-modified Target DNA (16S DNA region, FAM-16S) after incubation at 37 °C for 15 min: 1 FAM-16S (150 ng), 2 FAM-16S (150 ng) + Cas (150 ng), 3 Cas (150 ng), 4 Cas (150 ng) + guideRNA (1 µg), 5 FAM-16S (150 ng) + Cas (150 ng) + guideRNA (1 µg), 6 FAM-16S (300 ng) + Cas ( 300 ng) + guideRNA (2 µg), 7 FAM-16S (600 ng) + Cas (600 ng) + guideRNA (4 µg).
  • 8th the results of the investigation of the detection limit of the flow strip test performed using HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) of the dCas9 variant dCas9-Cys-stop with guideRNA (SEQ ID No. 4) and FAM-modified target DNA (16S DNA region, FAM-16S) after incubation at 37 °C for 15 min: 1 FAM-16S (1 µg) + Cas (600 ng), 2 FAM-16S (1 µg) + Cas (300 ng), 3 FAM-16S (1 µg) + Cas (150 ng), 4 FAM-16S (0.5 µg) + Cas (600 ng), 5 FAM-16S (0.5 µg) + Cas (300 ng), 6 FAM-16S (0, 5 µg) + Cas (150 ng), 7 FAM-16S (0.25 µg) + Cas (600 ng), 8 FAM-16S (0.25 µg) + Cas (300 ng), 9 FAM-16S (0 .25 µg) + Cas (150 ng), 10 FAM-16S (125 ng) + Cas (600 ng), 11 FAM-16S (125 ng) + Cas (300 ng), 12 FAM-16S (125 ng) + Cas (150ng), 11 FAM-16S (60ng) + Cas (600ng), 12 FAM-16S (60ng) + Cas (300ng), 13 FAM-16S (60ng) + Cas (150ng) , 16 FAM-16S (30 ng) + Cas (600 ng), 17 FAM-16S (30 ng) + Cas (300 ng), 18 FAM-16S (30 ng) + Cas (150 ng).
  • 9 the results of the investigation of the incubation time of the flow strip test performed using HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) of the dCas9 variant dCas9-Cys-stop (15 ng, 300ng or 600 ng) with guideRNA (SEQ ID No. 4) and FAM-modified target -DNA (16S DNA region, FAM-16S) after incubation at 37 °C for (1) 10 min, (2) 5 min, (3) 1 min, (4) 30 s, and after incubation at room temperature for (5) 0 min, ie with a direct addition of the mixture to the flow strip without prior incubation.

guideRNA-Design und In-vitro-TranskriptionguideRNA design and in vitro transcription

Das guideRNA-Zielstellendesign wurde mit dem Online-Tool CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) für die ribosomale 16S-DNA-Region aus dem Bakterium Paenibacillus larvae erstellt, wobei das Genom von P. thiaminolyticus als Referenz verwendet wurde, um Off-Target-Sequenzen zu erkennen. Zur Bestimmung der Spezifität der guideRNA für die Ziel-16S Region P. larvae erfolgte ein multiples Sequenz-Alignment (MSA) mit 16S rDNA-Sequenzen aus der NCBI GenBank (z. B. durch BLAST mit dem Eintrag NR_042947.1, um das Taxon P. larvae auszuschließen). Das MSA wurde mit MAFFT V7 erstellt (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), mit der G-INS-i Strategie für Sequenzen mit globaler Homologie. Die 16S-Regionen, die ausschließlich eine hohe Variabilität zwischen den Spezies aufwiesen, wurden für die Auswahl der Zielorte berücksichtigt:

  • ts1 AGTAACTGCCCCTGGAGTGACGG (SEQ ID No. 4)
  • ts2 CCAAGGAAGAACGGCCAGGGGAG (SEQ ID No. 5)
  • ts3 CGGCTTTTGAGGATTGGCTCCGG (SEQ ID No. 6)
  • ts4 GTTTCTCTTCGGGAGACGCCAGG (SEQ ID No. 7)
  • ts5 CGGACCTTGTGTTTCTCTTCGGG (SEQ ID No. 8)
The guideRNA target site design was generated with the online tool CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) for the 16S ribosomal DNA region from the bacterium Paenibacillus larvae, using the genome of P. thiaminolyticus as a reference was used to detect off-target sequences. To determine the specificity of the guideRNA for the target 16S region P. larvae, a multiple sequence alignment (MSA) was performed with 16S rDNA sequences from the NCBI GenBank (e.g. by BLAST with the entry NR_042947.1 to the taxon exclude P. larvae). The MSA was generated with MAFFT V7 (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), using the G-INS-i strategy for sequences with global homology. The 16S regions, which exclusively exhibited high interspecies variability, were considered for the selection of target sites:
  • ts1 AGTAACTGCCCCTGGAGTGACGG (SEQ ID No. 4)
  • ts2 CCAAGGAAGAACGGCCAGGGGAG (SEQ ID No. 5)
  • ts3 CGGCTTTTGAGGATTGGCTCCGG (SEQ ID No. 6)
  • ts4 GTTTCTCTTCGGGAGACGCCAGG (SEQ ID No. 7)
  • ts5 CGGACCTTGTGTTTCTCTTCGGG (SEQ ID No. 8)

Diese Zielstellen wurden verwendet, um Protospacer-Oligos zu erzeugen (SEQ ID No. 9 bis 13), die einen 5'-T7-Promoter (SEQ ID No. 14) und eine komplementäre Sequenz (SEQ ID No. 15) für die PCR-Amplifikation (Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase, Invitrogen) mit einem Gerüst-Oligo (GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTT ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAAC, SEQ ID No. 16) aufweisen. In alternativen Ausführungsbeispielen wurde als Gerüst-Oligo für Cas12b SEQ ID No. 17: TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCA CTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCAC verwendet. Dieses PCR-Produkt wurde dann als Vorlage für die In-vitro-Transkription mit dem MEGAShortscript™ T7 Transcription Kit (Invitrogen) verwendet. Die transkribierten guideRNAs wurden mit dem Phenol:Chloroform:lsoamylalkohol-Protokoll aufgereinigt, wie im MEGAShortscript Kit vom Hersteller beschrieben.These target sites were used to generate protospacer oligos (SEQ ID Nos. 9 to 13) containing a 5' T7 promoter (SEQ ID No. 14) and a complementary sequence (SEQ ID No. 15) for PCR -Amplification (Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase, Invitrogen) with a scaffolding oligo (GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTT ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTAAAAC, SEQ ID No. 16). In alternative embodiments, the framework oligo for Cas12b was SEQ ID no. 17: TAATACGACTCACTATAGGGTCTAGAGGACAGAATTTTTCAACGGGTGTGCCAATGGCCA CTTTCCAGGTGGCAAAGCCCGTTGAGCTTCTCAAATCTGAGAAGTGGCAC used. This PCR product was then used as a template for in vitro transcription using the MEGAShortscript™ T7 Transcription Kit (Invitrogen). The transcribed guideRNAs were purified using the phenol:chloroform:isoamyl alcohol protocol as described in the manufacturer's MEGAShortscript Kit.

Target-Amplifikation mit FAMTarget amplification with FAM

Das Target wurde mit High fidelity Q5 Polymerase mit dem vom Hersteller (NEB) angegebenen Standardprogramm amplifiziert. Das FAM wurde über einen modifizierten 27F_fwd Primer (SEQ ID No. 18) (mit FAM-Modifikation, Microsynth) eingebracht.The target was amplified with high fidelity Q5 polymerase using the standard program specified by the manufacturer (NEB). The FAM was introduced via a modified 27F_fwd primer (SEQ ID No. 18) (with FAM modification, Microsynth).

Klonierung und Aufreinigung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-ProteinsCloning and purification of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein

Das nuklease-defiziente Cas9 enthält zwei Cysteinreste in Aminosäurepositionen 80 und 574. Da jeder freie SH-Rest mit der Maleimidgruppe in einer Click-Chemie-Reaktion reagieren kann, wird ein Protein mit nur einem Cysteinrest bevorzugt. Auf diese Weise kann die Bindung von einem einzigen Biotin an ein dCas9-Molekül erreicht werden. Es wurden zwei verschiedene Varianten von single-Cystein dCas9 getestet (siehe 3):

  • (i) dCas9-C80L (Cystein in Position 80 zu Leucin mutiert, Cystein in Position 574 intakt)
  • (ii) dCasS-Cys-stop (beide internen Cysteine mutiert, Cystein 80 zu Leucin und Cystein 574 zu Glutaminsäure, und neuer Cysteinrest am Ende der kodierenden Sequenz hinzugefügt).
The nuclease-deficient Cas9 contains two cysteine residues at amino acid positions 80 and 574. Since any free SH residue can react with the maleimide group in a click chemistry reaction, a protein with only one cysteine residue is preferred. In this way, binding of a single biotin to a dCas9 molecule can be achieved. Two different variants of single-cysteine dCas9 were tested (see 3 ):
  • (i) dCas9-C80L (cysteine at position 80 mutated to leucine, cysteine at position 574 intact)
  • (ii) dCasS-Cys-stop (both internal cysteines mutated, cysteine 80 to leucine and cysteine 574 to glutamic acid, and new cysteine residue added at the end of the coding sequence).

Alle Klonierungen wurden mit Standard-NEB Gibson Assembly® Cloning Kit (Katalognummer E5510S), wie vom Hersteller (NEB) beschrieben, durchgeführt. Die Aufreinigung der verwendeten Cas-Proteine (SEQ ID No. 1 bis 3) wurde wie folgt durchgeführt: Tab. 1 Lösungen für Aufreinigung (benötigtes Volumen für Lysepuffer: 50 ml/l Zellkultur + 100 ml zum Äquilibrieren des Zell-Homogenisators und Säulenvolumen zum Äquilibrieren der Säule). Lyse- und Ladepuffer Hi-Salz-Waschpuffer Elutionspuffer Spaltungspuffer Lagerungspuffer 50 mM TrisCl pH 8 1 M NaCl 1 mM DTT (frisch zugefügt) 50 mM TrisCl pH 8 1 M NaCl 1 mM DTT Gleich wie Spaltungspuffer + 10 mM Maltose 20 mM HEPES 150 mM KCl 1 mM DTT 10% glycerol pH 7,25 20 mM HEPES 250 mM KCI pH 7,25 All cloning was performed using standard NEB Gibson Assembly® Cloning Kit (catalog number E5510S) as described by the manufacturer (NEB). The purification of the Cas proteins used (SEQ ID Nos. 1 to 3) was carried out as follows: Tab. 1 Solutions for purification (volume required for lysis buffer: 50 ml/l cell culture + 100 ml for equilibrating the cell homogenizer and column volume for equilibrating the column). Lysis and loading buffer Hi-Salt Wash Buffer elution buffer cleavage buffer storage buffer 50mM TrisCl pH 8 1M NaCl 1mM DTT (freshly added) 50mM TrisCl pH 8 1M NaCl 1mM DTT Same as Cleavage Buffer + 10mM Maltose 20mM HEPES 150mM KCl 1mM DTT 10% glycerol pH 7.25 20mM HEPES 250mM KCl pH 7.25

Expression:Expression:

Die Expression erfolgt durch Inokulierung von 20 ml LB-Medium und Antibiotika mit einer frischen Transformante und Schütteln über Nacht bei 37 °C, Beimpfung von 1 x 1000 ml TB-Medium und Kanamycin (3,3 ml) und Chloramphenicol (1 ml) fürjedes Konstrukt (1:1000), Schütteln bei 37 °C, 180 rpm bis OD600 0,5, dann auf 18 °C abkühlen und für 1 h weiterschütteln. Anschließend erfolgt das Induzieren mit 0,2 mM IPTG über Nacht, die Ernte der Zellen für 5 min bei 5 K rpm, das Resuspendieren des Pellets in Lysepuffer (Gesamtvolumen von 50 ml/l Kultur) und Zufügen von 1x Proteaseinhibitoren.Expression is performed by inoculating 20 ml of LB medium and antibiotics with a fresh transformant and shaking overnight at 37°C, inoculating 1 x 1000 ml of TB medium and kanamycin (3.3 ml) and chloramphenicol (1 ml) for each Construct (1:1000), shaking at 37 °C, 180 rpm until OD 600 0.5, then cool to 18 °C and continue shaking for 1 h. This is followed by induction with 0.2 mM IPTG overnight, the cells are harvested for 5 min at 5 K rpm, the pellets are resuspended in lysis buffer (total volume of 50 ml/l culture) and 1× protease inhibitors are added.

Extraktherstellung:Extract production:

Die Herstellung eines Ganzzelllysats erfolgt bei 4 °C durch zweimalige Behandlung bei 1500 bar in einem Emulsiflex. Die lysierten Zellen werden bei 16 K rpm, für 30 min zentrifugiert.A whole cell lysate is produced at 4 °C by double treatment at 1500 bar in an Emulsiflex. The lysed cells are centrifuged at 16 K rpm for 30 min.

Polyethylenimin (PEI)-Fällung:Polyethylenimine (PEI) precipitation:

Die Fällung von DNA erfolgt mit 1/20 Volumen von 5% PEI-Stammlösung und Inkubation bei 4 °C für 10 min. Die Lösung wird für 10 min bei 16 K rpm, zentrifugiert. Der Überstand wird mittels 0,45 µm-Filter filtriert.DNA is precipitated with 1/20 volume of 5% PEI stock solution and incubation at 4° C. for 10 min. The solution is centrifuged for 10 min at 16 K rpm. The supernatant is filtered using a 0.45 µm filter.

Amylose-Affinitätsreinigung:Amylose Affinity Purification:

Eine MBP-Trap-Säule (5 ml, Katalognummer 28918780, Cyfivalifescience) wird mit 5 Säulenvolumen (CV)-Ladepuffer (LB) (1 CV/min) voräquilibriert. Anschließend wird die Probe bei 0,5 CV/min (in Lysepuffer) aufgegeben, der Durchfluss gesammelt und mit 10 CV Lysepuffer sowie 10 CV Spaltungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgt mit 24 x 2 ml Elutionspuffer und mittels Bradford-Assay detektiert. Sämtliche Fraktionen des Peaks werden vereinigt und auf maximal 10 ml konzentriert.An MBP trap column (5 mL, catalog number 28918780, Cyfivalifescience) is pre-equilibrated with 5 column volumes (CV) of loading buffer (LB) (1 CV/min). The sample is then applied at 0.5 CV/min (in lysis buffer), the flow-through is collected and washed with 10 CV lysis buffer and 10 CV cleavage buffer. The elution takes place with 24×2 ml elution buffer and is detected by Bradford assay. All fractions of the peak are pooled and concentrated to a maximum of 10 mL.

Entfernung des Tags:Tag removal:

Zur Entfernung des Tags wird 3C-Protease (1:100 verdünnt, bezogen auf die Proteinkonzentration, PreScission™ (Katalognummer 27-0843-01, Cytiva) zugegeben und für etwa 18 h bei 4 °C inkubiert. Die Reinigung der Probe erfolgt mittels Kationaustauschchromatographie. Dazu wird eine HiTrap SP-Säule (5 ml) durch Waschen mit 1 Säulenvolumen pro Minute (CV/min) mit 5 CV Wasser, 5 CV 1M KCI und 20 mM Hepes pH 7,5 sowie 15 CV 150 mM KCI und 20 mM Hepes pH 7,5 vorbereitet. Die mit Protease behandelte Probe wird auf die Hi-Trap SP-Säule (Beladung ≤ 25 mg/Lauf) gegeben, mit 5 CV 150 mM KCl, 20 mM Hepes pH 7,5 gewaschen und mit einem KCI-Gradient (100 - 1000 mM) eluiert. Die vereinigten Proben werden mittels Amicon Ultacel 30K-Zentrifugalfiltereinheiten konzentiert (2x 4000 rpm für 15 min) und der Puffer zu Lagerungspuffer gewechselt (3 x 4000 rpm für 7 min). Die Proteinkonzentration wird mittels Messung der UV/Vis-Absorption bei 280 nm gemessen.To remove the tag, 3C protease (diluted 1:100, based on the protein concentration, PreScission™ (catalog number 27-0843-01, Cytiva) is added and incubated for about 18 h at 4 °C. The sample is purified by cation exchange chromatography To do this, a HiTrap SP column (5 ml) is prepared by washing at 1 column volume per minute (CV/min) with 5 CV water, 5 CV 1M KCl and 20 mM Hepes pH 7.5 and 15 CV 150 mM KCl and 20 mM Prepared Hepes pH 7.5 The protease-treated sample is applied to the Hi-Trap SP column (loading ≤ 25 mg/run), washed with 5 CV 150 mM KCl, 20 mM Hepes pH 7.5 and washed with a KCl gradient (100 - 1000 mM) The combined samples are concentrated using Amicon Ultacel 30K centrifugal filter units (2x 4000 rpm for 15 min) and the buffer is changed to storage buffer (3x 4000 rpm for 7 min).The protein concentration is determined by measurement measured the UV/Vis absorbance at 280 nm.

Die Analyse der Proben erfolgt mittels SDS-Gelelektrophorese. Dazu werden die Proben 5 min bei 95 °C erhitzt und 5 min geschüttelt und 1-2 µg Protein jeder Probe pro Well aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgt bei 180 V für 1 h.The samples are analyzed by means of SDS gel electrophoresis. For this, the samples are heated for 5 min at 95 °C and shaken for 5 min and 1-2 µg protein of each sample is applied per well. Gel electrophoresis is performed at 180 V for 1 hour.

Bevor die aufgereinigten Proteine weiterverwendet wurden, wurde mittels elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungs-Assay (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) die Protein-DNA-Wechselwirkung untersucht. DNA, die an ein Protein gebunden ist, wandert langsamer durch das Gel. Daher kann eine Protein-Bindung durch eine „Aufwärtsverschiebung“ der entsprechenden DNA-Bande erkannt werden, insbesondere wurde damit die Bindung der Target-DNA durch die dCas-Varianten bestätigt (siehe 4). Damit konnte sichergestellt werden, dass die Aktivität des empfindlichen dCas-Proteins während des Aufreinigungsprozesses erhalten wurde.Protein-DNA interaction was analyzed using an Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) before further use of the purified proteins. DNA bound to a protein moves more slowly through the gel. Therefore, protein binding can be detected by an "upshift" of the corresponding DNA band, specifically confirming binding of the target DNA by the dCas variants (see Fig 4 ). This ensured that the activity of the sensitive dCas protein was preserved during the purification process.

Biotinylierungbiotinylation

Die Biotinylierung der dCas9-Varianten erfolgte unter Verwendung eines Maleimid-PEG2(Polyethylenglykol)-Biotin-Reagenz (Thermo Scientific, siehe 5). Dazu wurden die dCas9-Proteine in Lagerungspuffer auf eine Konzentration von 1,55 mg/ml verdünnt. 40 µl TCEP (Tris[2-carboxyethyl]phosphinhydrochlorid, Thermo Scientific) wurden zu 20 µl der dCas9-Protein-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde zentrifugiert, das Pellet mit Lagerungspuffer gewaschen. Dann wurden 20 µl der beiden 1,55 mg/ml dCas9-Varianten mit dem Pellet gemischt und die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zentrifugation wurden 20 µl des Überstands für die Biotinylierung verwendet und zu 20 µl 0,3 mM Maleimid-PEG2-Biotin-Lösung gegeben. Die Biotinylierungsreaktion wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Entfernung des ungebundenen Maleimid-PEG2-Biotins in Lösung erfolgte durch eine 30 kDa-Säule (Merck).Biotinylation of the dCas9 variants was performed using a maleimide-PEG2 (polyethylene glycol)-biotin reagent (Thermo Scientific, see 5 ). For this purpose, the dCas9 proteins were diluted in storage buffer to a concentration of 1.55 mg/ml. 40 µl of TCEP (Tris[2-carboxyethyl]phosphine hydrochloride, Thermo Scientific) was added to 20 µl of the dCas9 protein solution in a microcentrifuge tube. The tube was centrifuged, the pellet washed with storage buffer. Then 20 µl of the two 1.55 mg/ml dCas9 variants were mixed with the pellet and the mixture was incubated for 1 h at room temperature. After centrifugation, 20 µl of the supernatant was used for biotinylation and added to 20 µl of 0.3 mM maleimide-PEG2-biotin solution. The biotinylation reaction was incubated for two hours at room temperature. The unbound maleimide-PEG2-biotin in solution was removed by a 30 kDa column (Merck).

Der Nachweis der Biotinylierung der dCas9-Varianten erfolgte mittels Western Blotting. Dazu wurde 1 µg der biotinylierten Proteine mit 4x SDS-Ladefarbstoff und DTT (10 mM) gemischt, 10 min auf 95 °C erhitzt und auf ein 4 bis 12 %-iges Bis-Tris-Gel (Invitrogen) aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte für 1 h bei 180 V in MOPS-Laufpuffer. Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel mit einem Trans-Blot-Turbo-Transfer für 10 min bei 25 V auf eine PVDF-Membran (Biorad) übertragen. Die Membran wurde dann mit TBST gewaschen, 1 h mit 5 %-iger Milch in TBST geblockt, dreimal mit TBST für je 5 min gewaschen, mit 1:5000 verdünntem Alexa488-Streptavidin (Invitrogen) in Milch für 1 h gefärbt und dreimal mit TBST-Puffer für 5 min gewaschen.The biotinylation of the dCas9 variants was detected by Western blotting. For this purpose, 1 μg of the biotinylated proteins was mixed with 4x SDS loading dye and DTT (10 mM), heated to 95° C. for 10 min and applied to a 4 to 12% Bis-Tris gel (Invitrogen). Gel electrophoresis was performed for 1 h at 180 V in MOPS running buffer. After gel electrophoresis, the gel was transferred to a PVDF membrane (Biorad) using a trans-blot turbo transfer for 10 min at 25 V. The membrane was then washed with TBST, blocked with 5% milk in TBST for 1 h, washed three times with TBST for 5 min each, stained with 1:5000 diluted Alexa488-streptavidin (Invitrogen) in milk for 1 h and stained three times with TBST -Buffer washed for 5 min.

Als nächstes wurde getestet, ob biotinylierte Cysteinreste die Bildung des guideRNA-Protein-Komplexes, die Zielerkennung oder die Bindung beeinträchtigen. Hierfür wurden EMSAs mit den biotinylierten dCas9-Varianten durchgeführt (siehe 6).Next, it was tested whether biotinylated cysteine residues interfere with guideRNA-protein complex formation, target recognition, or binding. For this purpose, EMSAs were performed with the biotinylated dCas9 variants (see 6 ).

Durchflussstreifen-TestFlow Strip Test

Sämtliche zuvor getestete Komponenten wurden kombiniert und mittels HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) getestet. Die Target-Nukleotidsequenz wurde mittels FAM-modifizierter Primer amplifiziert. Die Detektion des Ergebnisses auf dem Durchflussstreifen erfolgte visuell. In den ersten Durchflussstreifenversuchen (7) wurde das Protokoll von FELUDA adaptiert: Inkubation von dCas-Protein mit guideRNA für 10 min bei 37 °C in Reaktionspuffer, Zugabe der Target-Nukleotidsequenz und erneute Inkubation bei 37 °C für 15 min, Transferieren der Reaktionsmischung aus dem Wärmeblock auf Zimmertemperatur, Zugabe des Puffers von Milenia Biotec für den HybriDetectDipSticks™ und Zugabe des Durchflussstreifens. Die zwei verschiedenen dCas9-Varianten wurden mit 150 ng FAM-modifizierter Target-Nukleotidsequenz (16S-DNA-Region, FAM-16S), 150 ng Protein und 1 µg in vitro-transkribierter guideRNA (SEQ ID No. 4) getestet. Das Protein und die guideRNA wurden im Reaktionspuffer gemischt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, um den guideRNA-Protein-Komplex zu bilden. Nach Abschluss der Inkubation wurden 100 µl des von Milenia Biotec bereitgestellten Puffers für die Durchflussstreifendetektion und 150 ng der Target-DNA zugegeben. Die Mischung wurde bei 37 °C für 15 min inkubiert (siehe 7 A, B).All previously tested components were combined and tested using HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec). The target nucleotide sequence was amplified using FAM-modified primers. The result on the flow strip was detected visually. In the first flow strip experiments ( 7 ) the protocol from FELUDA was adapted: incubation of dCas protein with guideRNA for 10 min at 37 °C in reaction buffer, addition of the target nucleotide sequence and incubation again at 37 °C for 15 min, transfer of the reaction mixture from the heat block to room temperature, Adding Milenia Biotec's buffer for the HybriDetectDipSticks™ and adding the flow strip. The two different dCas9 variants were tested with 150 ng FAM-modified target nucleotide sequence (16S DNA region, FAM-16S), 150 ng protein and 1 μg in vitro-transcribed guideRNA (SEQ ID No. 4). The protein and guideRNA were mixed in reaction buffer and incubated for 10 min at room temperature to form the guideRNA-protein complex. Upon completion of the incubation, 100 µl of flow strip detection buffer provided by Milenia Biotec and 150 ng of target DNA were added. The mixture was incubated at 37 °C for 15 min (see 7A,B ).

In den weiteren Versuchen wurde das Protokoll vereinfacht (8 und 9): Mischen aller Komponenten in dem Puffer von Milenia Biotec für den HybriDetectDipSticks™, optional Inkubation bei 37 °C (je nach Test) und Zugabe des Durchflussstreifens. Dabei wurden alle Komponenten direkt mit dem Durchflussstreifen-Puffer von Milenia Biotec gemischt (ohne vorherige Inkubation von dCas-Protein mit guideRNA und/oder Target-Nukleotidsequenz).In the further experiments, the protocol was simplified ( 8th and 9 ): Mixing of all components in Milenia Biotec's buffer for the HybriDetectDipSticks™, optional incubation at 37 °C (depending on the test) and addition of the flow-through strip. All components were mixed directly with Milenia Biotec flow strip buffer (without prior incubation of dCas protein with guideRNA and/or target nucleotide sequence).

Für die CysStop-Variante wurde eine serielle Abnahme der Target-DNA-Konzentration von 1 µg bis 30 ng getestet (siehe 8), wobei bei sämtlichen Konzentrationen die Target-DNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden konnte.For the CysStop variant, a serial decrease in the target DNA concentration from 1 µg to 30 ng was tested (see 8th ), it being possible to detect the target DNA with the method according to the invention at all concentrations.

Weiterhin wurde die CysStop-Variante mit verschiedenen Inkubationszeiten (0 min, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min) bei 37 °C vor der Zugabe des Durchflussstreifens untersucht (siehe 9). Dabei entsprachen „0 min“ einer direkten Zugabe des Durchflussstreifen zur Mischung ohne vorherige Inkubation.Furthermore, the CysStop variant was investigated with different incubation times (0 min, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min) at 37 °C before the addition of the flow strip (see 9 ). "0 min" corresponded to a direct addition of the flow-through strip to the mixture without prior incubation.

Somit konnte belegt werden, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren keine Vorinkubation nötig ist und innerhalb eines Verfahrensschrittes die Target-Nukleotidsequenz nachgewiesen werden kann.It was thus possible to prove that no pre-incubation is necessary with the method according to the invention and that the target nucleotide sequence can be detected within one method step.

Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis des Bakteriums Paenibacillus larvae (P. larvae)Use of the method according to the invention for detecting the bacterium Paenibacillus larvae (P. larvae)

Zum Nachweis der DNA des Bakteriums P. larvae, einem Pathogen, dass die Larven der gemeinen Honig Biene befällt und die weit verbreitete „American Foulbrood Disease“ auslöst, wird eine Probe aus der Futterkranzprobe der befallenen Kolonie entnommen. Genomische DNA kann durch die HotSHOT-Methode (Truett et al. 2000) aus der Probe extrahiert werden. Kurzgefasst, wird die Futterkranzprobe in einer alkalischen Lösung (z.B. NaOH) unter Zugabe von EDTA zur Stabilisierung der DNA erhitzt. Im nächsten Schritt wird Tris-HCl dazugegeben und die Probe wird sofort auf Eis gekühlt, um die DNA auszufällen. Diese Probe kann genutzt werden, um ein Amplikon der 16S ribososmalen DNA (rDNA) des pathogenen Bakteriums zu erstellen und darüber das Bakterium über das erfindungsgemäße Verfahren nachzuweisen. Die 16S rDNA enthält eine hohe genomische Variabilität, die gut charakterisiert ist und üblicherweise für die Speziescharakterisierung von Bakterien benutzt wird. Die Vervielfältigung erfolgt mittels einem 5'FAM-modifizierten, universellen 27f DNA vorwärts Primer (SEQ ID No. 18) und einem unmodifizierten 1492r rückwärts Primer (SEQ ID No. 19). Wird die Target-DNA amplifiziert, enthält die Target-DNA die FAM-Modifikation (siehe 1i). Alternativ kann ein FAM-modifizierter Primer zur Verfügung gestellt werden, der mit der Target-DNA in der Probe hybridisiert (siehe 1ii).To detect the DNA of the bacterium P. larvae, a pathogen that infects the larvae of the honey bee and causes the widespread "American Foulbrood Disease", a sample is taken from the forage sample of the infested colony. Genomic DNA can be extracted from the sample by the HotSHOT method (Truett et al. 2000). Briefly, the collar of feed sample is heated in an alkaline solution (e.g. NaOH) with the addition of EDTA to stabilize the DNA. In the next step, Tris-HCl is added and the sample is immediately cooled on ice to precipitate the DNA. This sample can be used to create an amplicon of the 16S ribosomal DNA (rDNA) of the pathogenic bacterium and to detect the bacterium using the method according to the invention. The 16S rDNA contains high genomic variability that is well characterized and commonly used for species characterization of bacteria. Amplification is carried out using a 5'FAM-modified, universal 27f DNA forward primer (SEQ ID No. 18) and an unmodified 1492r reverse primer (SEQ ID No. 19). If the target DNA is amplified, the target DNA contains the FAM modification (see 1i ). Alternatively, a FAM-modified primer can be provided that hybridizes to the target DNA in the sample (see 1ii ).

Als guideRNA wurden die Targetstellen SEQ ID No. 4 bis 8 ausgewählt (siehe „guideRNA-Design“). Diese wurden verwendet um die DNA-Oligos mit den SEQ ID No. 9 bis 13 zu erstellen. Letztere wurden verwendet um guideRNAs mit einem T7-Transcription-Kit in vitro zu synthetisieren.The target sites SEQ ID no. 4 to 8 selected (see guideRNA design). These were used to form the DNA oligos with SEQ ID nos. 9 to 13 to create. The latter were used to synthesize guideRNAs in vitro using a T7 transcription kit.

Die guideRNAs wurden mit den drei beschriebenen dCas9-Varianten (Wildtyp, C80L und Cysstop siehe SEQ ID No. 1 bis 3) in mehreren EMSAs getestet (4). Es wurde auch gezeigt, dass die biotinylierten dCas9-Varianten in der Lage sind, das Amplikon mit dieser guideRNA zu binden (6).The guideRNAs were tested with the three described dCas9 variants (wild type, C80L and Cysstop see SEQ ID No. 1 to 3) in several EMSAs ( 4 ). It was also shown that the biotinylated dCas9 variants are able to bind the amplicon containing this guideRNA ( 6 ).

Die Detektion mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde ausgeführt durch Nutzung des kommerziell erhältlichen Durchflussstreifens HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) (7). Die Testbande T war nur dann erkennbar, und der Test damit positiv, wenn alle Komponenten des Kits und die FAM-modifizierte Target-DNA anwesend waren (7 A Probe 5-7, B Probe 5-7). Die dCas9-Variante dCas9-Cys-stop (SEQ ID No. 3) konnte geringste Mengen Target-DNA, bis auf 30 ng der 16S Target-DNA von P. larvae, mit einer klaren Bande auf der T-Linie, detektieren (8 Probe 16-18). Bemerkenswerterweise, konnte das erfindungsgemäße Verfahren die Ziel-DNA ohne vorherige Inkubation der Komponenten detektieren. Damit kann der Test in kürzester Zeit bei Zimmertemperatur durchgeführt werden (9 Probe 5).Detection with the method of the invention was carried out using the commercially available flow-through strip HybriDetectDipSticks™ (Milenia Biotec) ( 7 ). The test band T was only visible, and the test therefore positive, if all components of the kit and the FAM-modified target DNA were present ( 7 A sample 5-7, B sample 5-7). The dCas9 variant dCas9-Cys-stop (SEQ ID No. 3) was able to detect minute amounts of target DNA, down to 30 ng of the 16S target DNA from P. larvae, with a clear band on the T-line ( 8th sample 16-18). Remarkably, the method of the invention could detect the target DNA without prior incubation of the components. This allows the test to be carried out at room temperature in a very short time ( 9 Sample 5).

Zitierte NichtpatentliteraturNon-patent literature cited

Ali Z, Aman R, Mahas A, Rao GS, Tehseen M, Marsic T, Salunke R, Subudhi AK, Hala SM, Hamdan SM, Pain A, Alofi FS, Alsomali A, Hashem AM, Khogeer A, Almontashiri NAM, Abedalthagafi M, Hassan N, Mahfouz MM (2020) iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Research. 288.Ali Z, Aman R, Mahas A, Rao GS, Tehseen M, Marsic T, Salunke R, Subudhi AK, Hala SM, Hamdan SM, Pain A, Alofi FS, Alsomali A, Hashem AM, Khogeer A, Almontashiri NAM, Abedalthagafi M , Hassan N, Mahfouz MM (2020) iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. virus research. 288

Azhar M, Phutela R, Kumar M, Ansari AH, Rauthan R, Gulati S, Sharma N, Sinha D, Sharma S, Singh S, Acharya S, Sarkar S, Paul D, Kathpalia P, Aich M, Sehgal P, Ranjan G, Bhoyar RC on behalf of Indian CoV2 Genomics & Genetic Epidemiology (IndiCovGEN) Consortium, Singhal K, Lad H, Patra PK, Makharia G, Chandak GR, Pesala B, Chakraborty D, Maiti S. (2021) Rapid and accurate nucleobase detection using FnCas9 and its application in COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 183, 113207.Azhar M, Phutela R, Kumar M, Ansari AH, Rauthan R, Gulati S, Sharma N, Sinha D, Sharma S, Singh S, Acharya S, Sarkar S, Paul D, Kathpalia P, Aich M, Sehgal P, Ranjan G , Bhoyar RC on behalf of Indian CoV2 Genomics & Genetic Epidemiology (IndiCovGEN) Consortium, Singhal K, Lad H, Patra PK, Makharia G, Chandak GR, Pesala B, Chakraborty D, Maiti S. (2021) Rapid and accurate nucleobase detection using FnCas9 and its application in COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 183, 113207.

Fantoni NZ, EI-Sagheer AH, Brown T (2021)A Hitchhiker's Guide to Click-Chemistry with Nucleic Acids. Chem. Rev. 121 (12), 7122-7154.Fantoni NZ, EI-Sagheer AH, Brown T (2021) A Hitchhiker's Guide to Click-Chemistry with Nucleic Acids. Chem. Rev. 121 (12), 7122-7154.

Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. (2018) Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360(6387), 439-444.Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. (2018) Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360(6387), 439-444.

Joung J, Ladha A, Saito M, Segel M, Bruneau R, Huang MW, Kim NG, Yu X, Li J, Walker BD, Greninger AL, Jerome KR, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. (2020) Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. medRxiv : the preprint server for health sciences, 2020.05.04.20091231. https://doi.org/10.1101/2020.05.04.20091231.Joung J, Ladha A, Saito M, Segel M, Bruneau R, Huang MW, Kim NG, Yu X, Li J, Walker BD, Greninger AL, Jerome KR, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Zhang F. (2020) Point- of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. medRxiv : the preprint server for health sciences, 2020.05.04.20091231. https://doi.org/10.1101/2020.05.04.20091231.

Osborn MJ, Bhardwaj A, Bingea SP, Knipping F, Feser CJ, Lees C J, Collins DP, Steer CJ, Blazar BR, Tolar J (2021) CRISPR/Cas9-based Lateral Flow and Fluorescence Diagnostics. Bioengineering 8, 23. doi:10.3390/bioengineering8020023.Osborn MJ, Bhardwaj A, Bingea SP, Knipping F, Feser CJ, Lees CJ, Collins DP, Steer CJ, Blazar BR, Tolar J (2021) CRISPR/Cas9-based Lateral Flow and Fluorescence Diagnostics. Bioengineering 8, 23. doi:10.3390/bioengineering8020023.

Zhang C, Li Z, Chen M, Hu Z, Wu L, Zhou M, Liang D. (2021) Cas12a and Lateral Flow Strip-Based Test for Rapid and Ultrasensitive Detection of Spinal Muscular Atrophy. Biosensors (Basel). 154. doi: 10.3390/bios11050154.Zhang C, Li Z, Chen M, Hu Z, Wu L, Zhou M, Liang D. (2021) Cas12a and Lateral Flow Strip-Based Test for Rapid and Ultrasensitive Detection of Spinal Muscular Atrophy. Biosensors (Basel). 154. doi: 10.3390/bios11050154.

Truett GE, Heeger P, Mynatt RL, Truett AA, Walker JA, Warman ML (2000). Preparation of PCRquality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques 29 (1), 52-54.Truett GE, Heeger P, Mynatt RL, Truett AA, Walker JA, Warman ML (2000). Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques 29 (1), 52-54.

BezugszeichenlisteReference List

11
Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein mit Protein-TagProtein-tagged nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein
22
guideRNAguideRNA
33
Nukleotid-Tag-modifizierte Target-NukleotidsequenzNucleotide tag modified target nucleotide sequence
44
Nukleotid-Tag-modifizierter PrimerNucleotide tag modified primer
55
unmodifizierte Target-Nukleotidsequenzunmodified target nucleotide sequence
66
Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen DetektionsmarkerAnti-nucleotide tag binding moiety linked to a detection label
77
Durchflussstreifen umfassend eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit, und eine immobilisierte Bindeeinheit, welche einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindetFlow strips comprising an immobilized anti-protein tag binding moiety, and an immobilized binding moiety that binds an anti-nucleotide tag antibody

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Zitierte PatentliteraturPatent Literature Cited

  • WO 2021111466 A1 [0010, 0011]WO 2021111466 A1 [0010, 0011]

Claims (17)

Verfahren zum Nachweis mindestens einer Target-Nukleotidsequenz umfassend a) Bereitstellung mindestens eines Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1), wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein (1) eine guideRNA (2) und einen Protein-Tag aufweist, b) Kontaktierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1,2) mit einer Probe enthaltend mindestens eine Target-Nukleotidsequenz, wobei die Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA (2) des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) bindet, c) Kontaktierung des mindestens einem Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) mit einem Durchflussstreifen (7) umfassend i. mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit, und ii. einen immobilisierten Nukleotid-Tag oder eine immobilisierte Bindeeinheit, welche einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet, wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und der Nukleotid-Tag oder die Bindeeinheit lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei der Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) an die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit bindet, und d) Kontaktierung der Target-Nukleotidsequenz mit einem Detektionsmarker.A method for detecting at least one target nucleotide sequence comprising a) Provision of at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1), wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) has a guideRNA (2) and a protein tag, b) contacting the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1,2) with a sample containing at least one target nucleotide sequence, the target nucleotide sequence in the sample being attached to the guideRNA (2) of the nuclease-deficient, nucleotide sequence binding Cas protein (1), c) contacting the at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) with a flow-through strip (7). i. at least one immobilized anti-protein tag binding moiety, and ii. an immobilized nucleotide tag or an immobilized binding entity which binds an anti-nucleotide tag antibody, the immobilized anti-protein tag binding entity and the nucleotide tag or the binding entity being immobilized locally separately on the flow strip, the protein - tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) binds to the immobilized anti-protein tag binding moiety, and d) Contacting the target nucleotide sequence with a detection label. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein ausgewählt ist aus Cas9, Cas12 oder Cas13.procedure after claim 1 , characterized in that the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is selected from Cas9, Cas12 or Cas13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) ausgewählt ist aus Biotin, FLAG-Tag, Myc-Tag, GST-Tag, His-Tag, TAP-Tag, V5-Tag, TrxTag oder HA-Tag.procedure after claim 1 or 2 , characterized in that the protein tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) is selected from biotin, FLAG tag, Myc tag, GST tag, His tag, TAP tag, V5 Tag, TrxTag or HA tag. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) vor Schritt c), gleichzeitig mit Schritt c) oder nach Schritt c) erfolgtProcedure according to one of Claims 1 until 3 , characterized in that step b) takes place before step c), simultaneously with step c) or after step c). Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-Nukleotidsequenz (3) in Schritt b) eine modifizierte Target-Nukleotidsequenz ist, wobei die modifizierte Target-Nukleotidsequenz (3) einen Nukleotid-Tag aufweist und die modifizierte Target-Nukleotidsequenz (3) an die guideRNA (2) des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) bindet.Procedure according to one of Claims 1 until 4 , characterized in that the target nucleotide sequence (3) in step b) is a modified target nucleotide sequence, the modified target nucleotide sequence (3) having a nucleotide tag and the modified target nucleotide sequence (3) attached to the guideRNA ( 2) the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1). Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte Target-Nukleotidsequenz (3) durch Amplifikation einer Target-Nukleotidsequenz (5) mittels mindestens einem Nukleotid-Tag-modifizierten Primer (4) und einer Polymerase oder durch Synthese einer modifizierten Target-Nukleotidsequenz (3) oder durch Hybridisierung einer Target-Nukleotidsequenz (5) mit mindestens einem Nukleotid-Tag-modifizierten Primer (4) erhalten wird.procedure after claim 5 , characterized in that the modified target nucleotide sequence (3) by amplification of a target nucleotide sequence (5) by means of at least one nucleotide tag-modified primer (4) and a polymerase or by synthesis of a modified target nucleotide sequence (3) or by Hybridization of a target nucleotide sequence (5) with at least one nucleotide tag-modified primer (4) is obtained. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Nukleotid-Tag ausgewählt ist aus FAM, DIG, DNP, TEG, oder Cy5.Procedure according to one of Claims 1 until 6 , characterized in that the nucleotide tag is selected from FAM, DIG, DNP, TEG, or Cy5. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt d) durch Kontaktieren der modifizierten Target-Nukleotidsequenz (3) mit einer Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker (6) erfolgt, wobei die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag der modifizierten Target-Nukleotidsequenz (3) und den auf dem Durchflussstreifen (7) immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen immobilisierten Bindeeinheit gebunden wird.procedure after claim 6 or 7 , characterized in that step d) is carried out by contacting the modified target nucleotide sequence (3) with an anti-nucleotide tag binding moiety bound to a detection marker (6), the anti-nucleotide tag binding moiety being attached to the nucleotide tag of the modified target nucleotide sequence (3) and the nucleotide tag immobilized on the flow strip (7) or is bound by the binding moiety immobilized on the flow strip. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsmarker ausgewählt ist aus Metallnanopartikeln, bevorzugt Gold-Nanopartikeln, oder Farbstoffen.procedure after claim 8 , characterized in that the detection marker is selected from metal nanoparticles, preferably gold nanoparticles, or dyes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zum Nachweis von mindestens zwei verschiedenen Target-Nukleotidsequenzen erfolgt, wobei - in Schritt a) mindestens zwei Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Proteine (1) bereitgestellt werden, wobei die mindestens zwei Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Proteine (1) verschiedene guideRNAs (2) und verschiedene Protein-Tags aufweisen, - in Schritt b) eine erste Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA des ersten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins und eine zweite Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA des zweiten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins bindet, - in Schritt c) ein Durchflussstreifen (7) mit mindestens zwei lokal getrennt immobilisierten Anti-Protein-Tag-Bindeeinheiten bereitgestellt wird, wobei wobei einen ersten Protein-Tag des ersten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins eine erste Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit bindet den Protein-Tag des ersten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins und der Protein-Tag des zweiten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins von einer zweiten Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit den Protein-Tag des zweiten Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins gebunden wird.Procedure according to one of Claims 1 until 9 , characterized in that the method is carried out to detect at least two different target nucleotide sequences, wherein - in step a) at least two nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas proteins (1) are provided, wherein the at least two nuclease-deficient, Nucleotide sequence-binding Cas proteins (1) have different guideRNAs (2) and different protein tags, - in step b) a first target nucleotide sequence in the sample to the guideRNA of the first nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein and a second target nucleotide sequence in the sample binds to the guideRNA of the second nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein, - in step c) a flow strip (7) is provided with at least two locally separately immobilized anti-protein tag binding units, wherein a first protein tag of the first nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is a first anti-protein -Tag binding moiety binds the protein tag of the first nuclease-deficient nucleotide sequence-binding Cas protein and the protein tag of the second nuclease-deficient nucleotide sequence-binding Cas protein from a second anti-protein tag binding moiety to the protein -Tag of the second nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein is bound. Verfahren zum Nachweis mindestens einer Target-Nukleotidsequenz umfassend a) Bereitstellung mindestens eines Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1), wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein (1) eine guideRNA (2) und einen Protein-Tag aufweist, b) Kontaktierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1,2) mit einer Probe enthaltend mindestens eine Target-Nukleotidsequenz, wobei die Target-Nukleotidsequenz einen Nukleotid-Tag aufweist, und wobei die Target-Nukleotidsequenz in der Probe an die guideRNA (2) des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) bindet, c) Kontaktierung des mindestens einem Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) mit einem Durchflussstreifen (7) umfassend i. mindestens eine immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit, und ii. eine immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder einen immobilisierten Antikörper, wobei die immobilisierte Anti- Nukleotid-Tag-Bindeeinheit und die immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder einen immobilisierten Antikörper lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei der Nukleotid-Tag an die die immobilisierte Anti- Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag der Target-Nukleotidsequenz bindet, und d) Kontaktierung des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) mit einem Detektionsmarker.A method for detecting at least one target nucleotide sequence comprising a) Provision of at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1), wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) has a guideRNA (2) and a protein tag, b) contacting the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1,2) with a sample containing at least one target nucleotide sequence, the target nucleotide sequence having a nucleotide tag, and the target nucleotide sequence in the sample the guideRNA (2) of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) binds, c) contacting the at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) with a flow-through strip (7). i. at least one immobilized anti-nucleotide tag binding moiety, and ii. an immobilized target nucleotide sequence or an immobilized antibody, wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding moiety and the immobilized target nucleotide sequence or an immobilized antibody are immobilized locally separately on the flow strip, with the nucleotide tag attached to the the immobilized anti-nucleotide -Tag binding moiety binds to the nucleotide tag of the target nucleotide sequence, and d) Contacting the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) with a detection marker. Kit zum Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen umfassend 1) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein (1), wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein (1) einen Protein-Tag aufweist, 2) mindestens eine guideRNA (2), wobei die guideRNA (2) ausgebildet ist, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden, 3) einen Durchflussstreifen (7) umfassend i. mindestens eine immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit, und ii. einen immobilisierten Nukleotid-Tag oder eine immobilisierte Bindeeinheit, welche einen Anti-Nukleotid-Tag-Antikörper bindet, wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit und der Nukleotid-Tag oder die Bindeeinheit lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei die immobilisierte Anti-Protein-Tag-Bindeeinheit ausgebildet ist, sodass eine Bindung an den Protein-Tag des Nuklease-defizienten, Nukleotidsequenz-bindenden Cas-Proteins (1) erfolgt, und 4) einen Detektionsmarker.A kit for detecting target nucleotide sequences comprising 1) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1), wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) has a protein tag, 2) at least one guideRNA (2), wherein the guideRNA (2) is designed to bind a target nucleotide sequence, 3) comprising a flow strip (7). i. at least one immobilized anti-protein tag binding moiety, and ii. an immobilized nucleotide tag or an immobilized binding moiety which binds an anti-nucleotide tag antibody, the immobilized anti-protein tag binding moiety and the nucleotide tag or the binding moiety being immobilized locally separately on the flow strip, the immobilized Anti-protein tag binding unit is formed so that binding to the protein tag of the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) takes place, and 4) a detection marker. Kit nach Anspruch 12 umfassend weiterhin mindestens einen Nukleotid-Tag modifizierten Primer (4) und eine Polymerase oder mindestens eine Nukleotid-Tag- oder Fluoreszenz-modifizierte Nukleotidsequenz, welche komplementär zur Target-Nukleotidsequenz ist.kit after claim 12 further comprising at least one nucleotide tag modified primer (4) and a polymerase or at least one nucleotide tag or fluorescence modified nucleotide sequence which is complementary to the target nucleotide sequence. Kit nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsmarker eine Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit gebunden an einen Detektionsmarker (6) ist, wobei die Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit an den Nukleotid-Tag einer modifizierten Target-Nukleotidsequenz (3) und den auf dem Durchflussstreifen (7) immobilisierten Nukleotid-Tag bindet oder von der auf dem Durchflussstreifen (7) immobilisierten Bindeeinheit gebunden wird.kit after claim 12 or 13 , characterized in that the detection marker is an anti-nucleotide tag binding moiety bound to a detection marker (6), the anti-nucleotide tag binding moiety to the nucleotide tag of a modified target nucleotide sequence (3) and the on the Flow strip (7) binds immobilized nucleotide tag or is bound by the binding moiety immobilized on the flow strip (7). Kit zum Nachweis von Target-Nukleotidsequenzen umfassend 1) mindestens ein Nuklease-defizientes, Nukleotidsequenz-bindendes Cas-Protein (1), wobei das Nuklease-defiziente, Nukleotidsequenz-bindende Cas-Protein (1) einen Protein-Tag aufweist, 2) mindestens eine guideRNA (2), wobei die guideRNA (2) ausgebildet ist, eine Target-Nukleotidsequenz zu binden, 3) einen Durchflussstreifen (7) umfassend i. mindestens eine immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit, und ii. eine immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder einen immobilisierten Antikörper, wobei die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit und die immobilisierte Target-Nukleotidsequenz oder der immobilisierte Antikörper lokal getrennt auf dem Durchflussstreifen immobilisiert sind, wobei die immobilisierte Anti-Nukleotid-Tag-Bindeeinheit ausgebildet ist, sodass eine Bindung an einen Nukleotid-Tag erfolgt, und 4) einen Detektionsmarker.Kit for detecting target nucleotide sequences comprising 1) at least one nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1), wherein the nuclease-deficient, nucleotide sequence-binding Cas protein (1) has a protein tag, 2) at least a guideRNA (2), the guideRNA (2) being adapted to bind a target nucleotide sequence, 3) a flow-through strip (7) comprising i. at least one immobilized anti-nucleotide tag binding moiety, and ii. an immobilized target nucleotide sequence or an immobilized antibody, wherein the immobilized anti-nucleotide tag binding moiety and the immobilized target nucleotide sequence or the immobili sated antibodies are immobilized locally separately on the flow-through strip, the immobilized anti-nucleotide tag binding unit being designed such that binding occurs to a nucleotide tag, and 4) a detection marker. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder des Kits nach einem der Ansprüche 12 bis 15 zum Nachweis von Mikroorganismen, Krankheiten oder Gensequenzen in Proben von Patienten, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Pilzen.Use of the method according to one of Claims 1 until 11 and/or the kit according to any one of Claims 12 until 15 for the detection of microorganisms, diseases or gene sequences in samples from patients, animals, plants, microorganisms or fungi. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder des Kits nach einem der Ansprüche 12 bis 15 zum Auslesen einer Nukleotidsequenz-Kodierung.Use of the method according to one of Claims 1 until 11 and/or the kit according to any one of Claims 12 until 15 for reading a nucleotide sequence coding.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021111466A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Council Of Scientific & Industrial Research Method and kit for detection of polynucleotide

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARSIC, T. [u.a.]: Vigilant: An Engineered VirD2-Cas9 Complex for Lateral Flow Assay-Based Detection of SARS-CoV2. Nano Lett. (12.04.2021) 21 (8) 3596-3603

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