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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene zum Mikroskopieren einer Probe.
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Gerade ungefärbte oder fluoreszenzgefärbte mikroskopische Proben zeigen häufig nur einen geringen Kontrast in einer Durchlichtaufnahme beim Mikroskopieren. Daher kann die optimale Position der Fokalebene, die auch als Fokus der Probe bezeichnet werden kann, in vielen Fällen nicht mit einem kontrastbasierten Softwareautofokus, bei dem mehrere Durchlichtbilder mit verschiedenen Arbeitsabständen bzw. „Fokuspositionen“ aufgenommen werden und eine Schärfemaßauswertung durchgeführt wird, bestimmt werden. Um den Kontrast ungefärbter Proben zu erhöhen, können optische Kontrastverfahren wie DIC oder Phasenkontrastverfahren genutzt werden. Dazu sind jedoch optische Elemente notwendig, welche für die dann gewünschte und durchzuführende Fluoreszenzaufnahme aus dem Strahlengang entfernt werden müssen oder, falls sie nicht entfernt werden, die Fluoreszenzaufnahmen beeinträchtigen. Ferner ist bekannt, den Fokus mit Fluoreszenzaufnahmen zu bestimmen, wobei dann z.B. bei konfokaler Detektion anstelle der Schärfe im Bild die Höhe des Fluoreszenzsignals genutzt wird. Jedoch benötigen Fluoreszenzaufnahmen in der Regel längere Belichtungszeiten, so dass die Fokusprozedur längere Zeit benötigt. Außerdem besteht die Gefahr, dass der Fluoreszenzfarbstoff schon bei dieser Fokusbestimmung oder durch nachfolgende weitere Lichtdosen bleicht oder im Falle von Lebendzellbildgebung die Zelle durch das Anregungslicht beeinträchtigt wird.
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Ausgehend hiervon ist es daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene zum Mikroskopieren in der Art weiterzubilden, dass die optimale Position der Fokalebene robust, schnell und möglichst ohne zusätzliche Kosten für das System bestimmt werden kann.
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Die Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen 1 und 9 definiert. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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In den Intensitätsbildern der beleuchteten Probe gemäß Schritt a) sind die Phasenunterschiede in der Probe je nach Position der Fokalebene als Intensitätsänderung im Bild erkennbar. Daher zeigen die Phasenbilder gemäß Schritt b) Phasenkontraste, die umso größer sind, je näher man an der optimalen Position der Fokalebene die Intensitätsbilder aufgenommen hat. Ferner ändert sich nicht nur der Phasenkontrast sondern auch die Strukturen im Bild, sodass in der optimalen Position der Fokalebene das Phasenkontrastbild auch die größeren hochfrequenten Anteile besitzt. Je nach Schärfemaß können daher solche Frequenzanteile im Phasenkontrastbild zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene verwendet werden.
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Die Phasenbilder können dann im Schritt d) mit einem bekannten Schärfemaß (insbesondere einem kontrastbasierten Schärfemaß) bewertet werden, so dass für jedes Phasenbild ein entsprechender Schärfemaßwert berechnet werden kann. Aus der Folge der Schärfemaßwerte kann dann die optimale Position der Fokalebene zum Mikroskopieren bestimmt werden. So kann beispielsweise das Maximum der Schärfemaßwerte gesucht und eine Parabel an das Maximum und seine Nachbarwerte gefittet werden. Die Lage der Parabel gibt dann an, wo die optimale Position der Fokalebene liegt. Dies kann auch zwischen den Positionen der Fokalebene der Intensitätsbilder liegen. Es ist jedoch auch möglich, das Maximum der Schärfemaßwerte zu ermitteln und die Fokalebenenposition des entsprechenden Phasenbildes als optimale Position der Fokalebene zu bestimmen.
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Im Schritt a) können die Fokalebenenpositionen zur Aufnahme der Intensitätsbilder in einem Start-Stopp-Modus angefahren werden. Es ist jedoch auch möglich, eine kontinuierliche Bewegung über den gesamten abzufahrenden z-Bereich (alle gewünschten Positionen der Fokalebene) durchzuführen und die Probe an den vorgesehenen Fokalebenenpositionen aufzunehmen. Indem beim Erreichen der Fokalebenenposition die Aufnahme durchgeführt und nur mit kurzen Lichtpulsen (beispielsweise im Bereich von 10 µs) beleuchtet wird, um eine Bewegungsunschärfe in den Intensitätsbildern zu minimieren. Alternativ ist es auch möglich, die Belichtungszeit der für die Aufnahme benutzten Kamera ausreichend kurz einzustellen, so dass dann eine kontinuierliche Beleuchtung bzw. eine andauernde Beleuchtung möglich ist
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Um die Position der Fokalebene bei der Aufnahme der Probe möglichst genau zu kennen bzw. definieren zu können, kann in vorteilhafter Weise die Aufnahme, die Beleuchtung und/oder die Bewegung der Probe mit einem Trigger gesteuert werden.
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Die Aufnahmen im Schritt a) können insbesondere Durchlichtaufnahmen sein. Es ist jedoch auch möglich, Auflichtaufnahmen durchzuführen.
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Im Schritt b) werden bevorzugt drei Intensitätsbilder zur Berechnung eines Phasenbildes genutzt. Es können auch vier, fünf, sechs oder mehr Intensitätsbilder zur Berechnung eines Phasenbildes genutzt werden.
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Der Abstand der Positionen der Fokalebene zweier benachbarter Intensitätsbilder, die im Schritt a) aufgenommen werden, kann insbesondere der doppelten Schärfentiefe der Aufnahmeoptik zur Aufnahme der Bilder entsprechen. Bevorzugt ist der Abstand der Positionen der Fokalebene benachbarter Intensitätsbilder konstant. Es ist jedoch auch möglich, dass dieser Abstand variiert.
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Die Positionen der Fokalebene aller Intensitätsbilder, die im Schritt a) aufgenommen werden, kann auch als z-Stapelbereich bezeichnet werden. Ein solcher z-Stapelbereich kann beispielsweise an einen vorhergehend erhaltenen Fokuswert angepasst werden (z.B. in dem Lage und Größe des Bereiches des z-Stapels geändert wird). Wenn z.B. eine Fokusposition bereits in der Nähe (also in lateraler Richtung) ermittelt werden konnte, kann der z-Stapelbereich daran angepasst (beispielsweise minimiert) werden. Falls keine Fokusposition ermittelt werden konnte, kann der z-Stapelbereich daran angepasst (beispielsweise erweitert) werden. Es ist jedoch auch möglich, einen fest vorgelegten z-Stapelbereich vorzugeben und diesen im Schritt a) abzufahren. Ein vorhergehend ermittelter Fokuswert kann z.B. als Zentrum des nachfolgenden z-Stapels verwendet werden.
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Erfindungsgemäß können im Schritt b) den mindestens zwei Intensitätsbildern jeweils direkt benachbarte Positionen der Fokalebene zugeordnet werden. Um ein Phasenkontrastbild berechnen zu können, kann es vorteilhaft sein, Intensitätsbildern heranzuziehen, die nicht direkte Nachbarn im z-Stapel sind. Diese haben dann beispielsweise einen größeren Abstand zueinander als die Intensitätsbilder im aufgenommenen z-Stapel. So kann z.B. das übernächste oder das dritt- oder viertnächste Bild im Stapel zur Berechnung des Phasenkonstrastbildes verwendet werden.
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Die Probe kann mit inkohärentem Licht beleuchtet werden. Bevorzugt wird die Probe mit teilkohärentem Licht beleuchtet. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass eine eingeschränkte räumliche Kohärenz und/oder zeitliche Kohärenz vorliegt. Eine eingeschränkte räumliche Kohärenz kann beispielsweise dadurch erzeugt werden, dass die numerische Apertur eines Beleuchtungsmoduls zur Beleuchtung der Probe mit Licht im Schritt a) kleiner ist als die numerische Apertur eines Abbildungsmoduls zur Aufnahme der Bilder der beleuchteten Probe im Schritt a) ist. Insbesondere kann die numerische Apertur des Beleuchtungsmoduls kleiner oder gleich 0,9 mal 0,8 mal 0,7 mal 0,66 mal 0,6 mal oder 0,5 mal die numerische Apertur des Abbildungsmoduls sein. Als absoluter Wert der numerischen Apertur des Beleuchtungsmoduls kann ein Wert von kleiner oder gleich 0,16, von 0,1 oder von 0,09 vorliegen.
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Die zeitliche Kohärenz kann durch Einschränkung des Wellenlängenspektrums des Beleuchtungslichtes erzeugt werden. Dazu können entsprechende Filter vorgesehen werden. Insbesondere ist es möglich, dass das Wellenlängenspektrum kleiner oder gleich 70 nm oder 60 nm ist.
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Des Weiteren ist es möglich, die zeitliche Kohärenz detektionsseitig in der Art und Weise einzuschränken, dass das von der Probe kommende Licht so gefiltert wird, dass das Spektrum eine Bandbreite von kleiner oder gleich 70 nm oder 60 nm aufweist, wobei mit dem gefilterten Licht im Schritt a) die Bilder aufgenommen werden. Dazu kann z.B. der in einem Fluoreszenzmikroskop vorgesehene Fluoreszenzemissionsfilter im Detektionsstrahlengang genutzt werden.
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Ferner ist es auch möglich, das Licht zur Beleuchtung einer Probe im Schritt a) mit einer Lichtquelle mit schmalem Spektrum zu erzeugen. Eine solche Lichtquelle kann eine LED-Lichtquelle oder eine Laser-Lichtquelle sein. Die Wellenlänge des Lichtes zur Beleuchtung der Probe im Schritt a) kann im sichtbaren Wellenlängenbereich oder auch im nahen Infrarotbereich liegen.
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Im Schritt d) können die Werte von zwei, drei oder mehreren verschiedenen Schärfemaßen berechnet werden. Diese Werte der verschiedenen Schärfemaße können im Schritt e) z.B. gewichtet oder in einer Mehrheitsentscheidung berücksichtigt werden.
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Mit der bestimmten optimalen Position der Fokalebene kann dann beispielsweise eine möglichst scharfe Aufnahme der Probe (wobei ein Offset zur optimalen Position der Fokalebene hinzugefügt werden kann, um z.B. chromatische Längsfehler der Aufnahmeoptik bei Aufnahmen mit unterschiedlichen Wellenlängen oder Wellenlängenbereichen zu berücksichtigen) durchgeführt werden und/oder ein Fokusmap der Probe erstellt werden. Das Mikroskopieren der Probe kann mit einem Mikroskop durchgeführt werden, das insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop sein kann. Bei der Probe kann es sich um eine ungefärbte oder eine fluoreszenzgefärbte Probe handeln. Das Mikroskop kann als Durchlichtmikroskop und/oder Auflichtmikroskop ausgebildet sein.
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Insbesondere kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene zum Mikroskopieren einer Probe mittels eines Mikroskops realisiert sein.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die ebenfalls erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Diese Ausführungsbeispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht als einschränkend auszulegen. Beispielsweise ist eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit einer Vielzahl von Elementen oder Komponenten nicht dahingehend auszulegen, dass alle diese Elemente oder Komponenten zur Implementierung notwendig sind. Vielmehr können andere Ausführungsbeispiele auch alternative Elemente und Komponenten, weniger Elemente oder Komponenten oder zusätzliche Elemente oder Komponenten enthalten. Elemente oder Komponenten verschiedener Ausführungsbespiele können miteinander kombiniert werden, sofern nichts anderes angegeben ist. Modifikationen und Abwandlungen, welche für eines der Ausführungsbeispiele beschrieben werden, können auch auf andere Ausführungsbeispiele anwendbar sein. Zur Vermeidung von Wiederholungen werden gleiche oder einander entsprechende Elemente in verschiedenen Figuren mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet und nicht mehrmals erläutert. Von den Figuren zeigen:
- 1 eine schematische Ansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene zum Mikroskopieren einer Probe;
- 2 eine schematische Darstellung zur Erörterung der aufgenommenen Intensitätsbilder und der daraus berechneten Phasenbilder, und
- 3 eine schematische Darstellung eines Ablaufdiagramms für eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene zum Mikroskopieren einer Probe.
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In 1 ist schematisch der Aufbau einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene zum Mikroskopieren einer Probe 2 gezeigt, die hier als Mikroskop 1 zur Bestimmung der optimalen Position der Fokalebene einer Probe 2 verwirklicht ist. Bei dieser Ausführungsform ist das Mikroskop 1 als inverses Durchlichtmikroskop ausgebildet, das ein Beleuchtungsmodul 3, ein Abbildungsmodul 4 und eine Steuereinheit 5 zur Steuerung von Beleuchtungs- und Abbildungsmodul 3, 4 (durch gestrichelte Linien 13 angedeutet) umfasst. Ferner ist schematisch die optische Achse OA eingezeichnet.
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Das Beleuchtungsmodul 3 weist eine Lichtquelle 6 (z.B. eine LED-Lichtquelle), eine Kondensoroptik 7 sowie einen spektralen Bandpassfilter 8 auf. Der Bandpassfilter 8 kann zwischen der in 1 gestrichelten Position, in der er außerhalb des Strahlengangs positioniert ist, und der mit der durchgezogener Linie gezeigten Position, in der er innerhalb des Strahlengags positioniert ist, hin und her bewegt werden.
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Die Lichtquelle 6 kann bevorzugt Licht aus dem sichtbaren Wellenlängenbereich und/oder aus dem Infrarotbereich abgeben.
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Das Abbildungsmodul 4 kann einen Probentisch 9, eine Abbildungsoptik 10 sowie eine Kamera 11 mit einem Bildsensor 12 (z.B. ein CCD-Sensor oder ein CMOS-Sensor) aufweisen.
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Bei der Probe 2 kann es sich um einen ungefärbte oder eine fluoreszenzgefärbte Probe 2 handeln, die häufig nur einen sehr geringen Kontrast in einer Durchlichtaufnahme zeigt, so dass es mit bisher bekannten Verfahren schwierig oder unmöglich ist, die optimale Position der Fokalebene der Probe zu ermitteln.
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Erfindungsgemäß steuert für die Ermittlung der optimalen Position der Fokalebene die Steuereinheit 5 das Beleuchtungsmodul 3 so an, dass die Probe 2 mit teilkohärentem Licht beleuchtet wird, wodurch eine mittels der Abbildungsoptik 10 und der Kamera 11 aufgenommene Durchlichtaufnahme der Probe 2 kontrastreicher wird.
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Da eine Durchlichtbeleuchtung bei einem herkömmlichen Mikroskop meist mit einer inkohärenten Lichtquelle ausgestattet ist, kann erfindungsgemäß die räumliche und/oder zeitliche Kohärenz dadurch erhöht werden, dass auf Komponenten des Mikroskops zurückgegriffen wird, die häufig zu einer Grundausstattung eines Mikroskops gehören. Die räumliche Kohärenz einer inkohärenten Lichtquelle 6 kann z.B. dadurch erhöht werden, dass eine kleine Apertur in der Aperturebene vorgesehen wird oder eine Irisblende der Kondensoroptik 7 zugezogen und damit verkleinert wird. Bevorzugt ist die numerische Apertur des Beleuchtungsmoduls 3 kleiner als die numerische Apertur des Abbildungsmoduls 4. So kann die numerische Apertur des Beleuchtungsmoduls 3 z.B. 0,1, 0,16, 0,1 oder 0,09 betragen.
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Die zeitliche Kohärenz kann z.B. durch das Einschränken des Spektrums des von der Lichtquelle 6 abgegebenen Lichtes mit dem spektralen Bandpassfilter 8 erhöht werden. Die Bandbreite des Spektrums des abgegebenen Lichtes kann z.B. kleiner oder gleich 70 nm oder 60 nm sein.
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In dieser Art und Weise kann das Licht der Lichtquelle 6 als teilkohärentes Licht auf die Probe 2 treffen und diese damit beleuchten. Dabei werden Bilder der beleuchteten Probe 2 in Durchlicht an unterschiedlichen Positionen der Fokalebene mittels der Abbildungsoptik 4 und der Kamera 11 durchgeführt, so dass ein Stapel von Intensitätsbildern der beleuchteten Probe vorliegt, wobei jedem Intensitätsbild eine Position (z-Position) der Fokalebene zugeordnet ist (Schritt S1 in 3). In dem hier beschriebenen Beispiel werden, wie in 2 schematisch dargestellt ist, beispielsweise sieben Intensitätsbilder B1, B2, ... B7 aufgenommen, denen jeweils eine z-Position (zB1, zB2 ... zB7) der Fokalebene zugeordnet ist.
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Es liegt somit ein Stapel von Intensitätsbildern B1-B7 vor, der auch als Defokusstapel B1-B7 bezeichnet werden kann.
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Aus diesen Intensitätsbildern B1-B7 wird, wie nachfolgend noch beschrieben wird, ein z-Stapel aus Phasenbildern berechnet (Schritt S2 in 3). Dabei wird ausgenutzt, dass Phasenunterschiede in der Probe 2 je nach Fokusposition (bzw. Position der Fokalebene) als Intensitätsänderungen im Bild zu sehen sind. Dabei wird jedes Phasenbild P1-P5 (2) aus mindestens zwei Intensitätsbildern B1-B7, denen jeweils direkt benachbarte Positionen der Fokalebene zugeordnet sind, berechnet. Bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel wird jedes Phasenbild P1 aus drei Intensitätsbildern berechnet. So wird z.B. das Phasenbild P1 aus den Intensitätsbildern B1-B3 und wird das Phasenbild P4 aus den Intensitätsbildern B4, B5 und B6 berechnet. Jedem berechneten Phasenbild P1-P5 wird eine Fokalebenenposition zP1, zP2, ... zP5 basierend auf den den mindestens zwei Intensitätsbildern B1-B7 zugeordneten Positionen zB1 - zB7 der Fokalebene zugewiesen. Bevorzugt wird als Fokalebenenposition zP1-zP7 der Median des Bereiches bestimmt, dessen Grenzen die am weitesten voneinander beabstandeten Positionen der Fokalebene der Intensitätsbilder B1-B7 sind, die für die Berechnung des entsprechenden Phasenbildes verwendet werden. Somit entspricht z.B. zP1 gleich ZB2 und zP4 gleich zB5.
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Für diese Berechnung der Phasenbilder P1-P5 kann beispielsweise ein Algorithmus auf Basis der Transport of Intensity Equation (TIE) eingesetzt werden. Eine vereinfachte Version der TIE ergibt sich aus der Näherung einer konstanten Intensitätsverteilung (siehe auch A. Barty, K.A. Nugent, D. Paganin and A. Roberts „Quantitative optical phase microscopy“, Opt. Lett. 23, 817-819 (1998)).
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Obwohl bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel jedes Phasenbild P1-P5 aus mindestens zwei Intensitätsbildern B1-B7, denen jeweils direkt benachbarte Positionen der Fokalebene zugeordnet sind, berechnet wird, ist dies nicht zwingend notwendig. Es kann auch vorteilhaft sein, dass benachbarte Intensitätsbildern (z.B. B1 und B3 sowie B3 und B5, wenn die Intensitätsbilder B1, B3 und B5 genutzt werden), die zur Berechnung eines Phasenbildes (z.B. P2) verwendet werden, Positionen der Fokalebene (z.B. zB1, zB3 und zB5) aufweisen, die nicht direkt benachbart sind (hier somit zB1 und zB3 sowie zB3 und zB5). Die herangezogenen Intensitätsbilder weisen somit einen größeren Abstand der Positionen der Fokaleben auf als die direkt benachbarten Intensitätsbilder B1-B7 im Stapel von Intensitätsbildern B1-B7 bzw. im Defokusstapel B1-B7.
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Für jedes der Phasenbilder P1-P5 wird dann mindestens ein Schärfemaßwert berechnet (Schritt S3 in 3). Ein Schärfemaß ist z.B. die Summe der xy-Gradienten.
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Über die Phasenbilder P1-P5 sind den berechneten Schärfemaßwerten Fokalebenenpositionen zugeordnet. Somit kann aus der Folge der Schärfemaßwerte der Phasenbilder P1-P5 die optimale Position zopt der Fokalebene bestimmt werden. Dazu kann beispielsweise das Maximum der Schärfemaßwerte gesucht und eine Parabel an das Maximum und seine Nachbarwerte gefittet werden, wobei die Lage dieser Parabel zur genauen Bestimmung der optimalen Position zopt der Fokalebene auch zwischen den Fokalebenenpositionen zP1-zP5 und somit den Positionen der Fokalebene zB1-zB7 der Intensitätsbilder B1-B7 verwendet wird (Schritt S4 in 3). Diese bestimmte optimale Position zopt der Fokalebene, die in 2 beispielhaft eingezeichnet ist, kann z.B. anschließend angefahren werden, um die gewünschte scharfe Aufnahme der Probe 2 zu machen (Schritt S5 in 3) und/oder eine Fokusmap zu erstellen (Schritt S6 in 3). Ferner kann zu dieser bestimmten optimalen Position zopt der Fokalebene z.B. ein vorher festgelegter Offset addiert werden, um z.B. unterschiedliche Fokuspositionen bei einer Fluoreszenzaufnahme gegenüber der Durchlichtaufnahme berücksichtigen zu können. Dies kann z.B. notwendig sein, wenn die optische Abbildung chromatische Längsfehler aufweist und die Aufnahmen bei unterschiedlichen Wellenlängen/-bereichen getätigt werden.
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Eine Fokusmap kann z.B. erstellt werden, wenn ein größerer Bereich der Probe 2 vergrößert aufgenommen werden soll. Dabei wird die Probe 2 bei hoher Vergrößerung an vielen Positionen aufgenommen (jede Position wird als Bildkachel bezeichnet) und die Bildkacheln werden zu einem großen zusammenhängenden Bild zusammengefügt. Da bei hohen Vergrößerungen meist die Schärfentiefe der Abbildungsoptik 10 gering und die Probe 2 in der Größenordnung der Schärfentiefe nicht eben oder auch verkippt zur optischen Achse verfahren wird, muss die Probe 2 immer wieder nachfokussiert werden. Für einen schnellen Experimentablauf ist es daher vorteilhaft, zunächst die optimale Position der Fokalebene der Probe 2 an verschiedenen Stützstellen der Probe 2 zu bestimmen. Dabei ist es zunächst ausreichend, wenn dies in Abständen größer als eine Bildkachel erfolgt und die optimale Position der Fokalebene dazwischenliegender Bildkachelpositionen durch Interpolation bestimmt werden.
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Für eine schnelle Aufnahme der Intensitätsbilder B1-B7 können in vorteilhafter Weise die Bilder an den jeweiligen z-Positionen nicht in einem Start-Stopp-Modus aufgenommen werden. Sondern es wird eine kontinuierliche Bewegung in z-Richtung über den gesamten Bereich des gewünschten z-Stapels durchgeführt und die Probe 2 wird mit nur kurzen Lichtimpulsen (beispielsweise von ungefähr 10 µs der Lichtquelle 6) beleuchtet, um eine Bewegungsunschärfe in der Bildaufnahme währender der z-Bewegung zu minimieren. Alternativ ist es möglich, kurze Belichtungszeiten der Kamera 11 zu verwenden und die Lichtquelle 6 kontinuierlich leuchten zu lassen. Dies hat jedoch den Nachteil, dass die Probe 2 unter Umständen unnötig mit Licht außerhalb der Belichtungszeit belastet wird. Auch kann die Wärmebelastung in der Probe 2 durch die Dauerbeleuchtung zu groß sein. Um die z-Position der Probe 2 bei der Bildaufnahme möglichst genau zu kennen bzw. definieren zu können, ist es vorteilhaft, die Aufnahme mit der Kamera 12, die kurzzeitige Beleuchtung mittels der Lichtquelle 6 und die z-Fahrt mit einem Trigger zu steuern. Eventuell kann auch die z-Position getriggert ausgelesen werden.
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Der Abstand zwischen zwei Positionen zB1-zB7 der Fokalebene bei der Aufnahme der Intensitätsbilder B1-B7 ist bevorzugt konstant. Ferner kann dieser Abstand bevorzugt größer sein als die Schärfentiefe der Abbildungsoptik 4 und kleiner oder gleich als das Doppelte der Schärfentiefe der Abbildungsoptik 4. Zur Erzeugung einer räumlichen Kohärenz kann eine Lochblende in der Aperturebene der Kondensoroptik 7 vorgesehen sein. Insbesondere kann eine quasi kollimierte Beleuchtung bereitgestellt werden.
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Die zeitliche Kohärenz kann nicht nur beleuchtungsseitig durch den beschriebenen Bandpassfilter 8 sondern auch detektionsseitig durch einen entsprechenden Bandpassfilter realisiert werden. Dabei kann z.B. ein vorhandener Fluoreszenzemissionsfilter eingesetzt werden.
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Die Lichtquelle 6 kann eine LED-Lichtquelle oder eine Laser-Lichtquelle sein.
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Die verwendete Wellenlänge kann aus dem sichtbaren Bereich oder aus dem nahen Infrarot stammen. Wenn Licht aus dem nahen Infrarot verwendet wird, kann eine geringere Probenbelastung und/oder ein geringerer Bleichen eines Farbstoffs auftreten. Auch ist es eventuell möglich, parallel eine Aufnahme im Fluoreszenzkanal durch einen wellenlängenabhängigen Strahlteiler durchzuführen. Die bestimmte optimale Position der Fokalebene kann für eine Autofokusfunktion und/oder zur Erstellung einer Fokusmap mit separaten Schnittstellen genutzt werden.
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Erfindungsgemäß ist es ferner möglich, die Probe mit inkohärentem Licht zu beleuchten und auch detektionsseitig keine die Kohärenz erhöhenden Maßnahmen vorzusehen. Auch in diesem Fall kann in der beschriebenen Art und Weise über mindestens ein Schärfemaß der Phasenbilder P1-P5 die optimale Position zopt der Fokalebene bestimmt werden.
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Neben dem bereits beschriebenen Schärfemaßwert der Summe der xy-Gradienten können auch andere dem Fachmann bekannte Schärfemaße genutzt werden, die in der Regel als grundsätzlichen Ansatz die Bildschärfe des Bildes (hier des Phasenbildes P1-P5) bewerten. Beispielhaft kann als Schärfemaß die Anwendung eines Gauß-Filters oder eines Laplace-Filters auf die Bilddaten genannt werden. Es sind auch Schwellwert-Verfahren oder Varianz-Verfahren möglich. Insbesondere können die in dem Artikel „Evaluation of autofocus measures for microscopy images of biopsy and cytology“, R. Redondo, et. al., Proc. of SPIE Vol. 8011 801194-1 bis 801194-9, beschriebenen Schärfemaße verwendet werden. Natürlich ist es auch möglich, nicht nur ein Schärfemaß sondern zwei, drei oder mehrere unterschiedliche Schärfemaße zu verwenden.
