DE102020118369B3

DE102020118369B3 - Expositionsapparat

Info

Publication number: DE102020118369B3
Application number: DE102020118369.0A
Authority: DE
Inventors: Detlef Ritter; Katharina Schwarz; Jan Knebel; Hubert Lödding; Michael Hennig
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2021-11-18
Anticipated expiration: 2040-07-14

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Expositionsapparat zur Durchführung von in-vitro-Experimenten mit biologischen Testsystemen, die perfusiv unter Ausbildung einer Expositionsatmosphäre mit einem Expositionsmedium beaufschlagt werden.

Description

Die Erfindung betrifft einen Expositionsapparat zur Durchführung von in-vitro-Experimenten mit technischen Replikaten wenigstens eines biologischen Testsystems, die perfusiv unter Ausbildung einer Expositionsatmosphäre auf bzw. oberhalb des biologischen Testsystems mit einem Expositionsmedium beaufschlagbar sind.
Bei der Durchführung von in-vitro-Experimenten mit biologischen Testsystemen, insbesondere mit Zellen, Zellkulturen oder Geweben, wird üblicherweise - unabhängig von der Zielsetzung der Experimente bzw. der Untersuchungen - eine Substanz in Kontakt mit dem biologischen Testsystem gebracht, so genannte Exposition.
Das biologische Testsystem bzw. biologische Prüfsystem wird hierbei einer Expositionsatmosphäre, die durch ein Expositionsmedium gebildet wird, ausgesetzt. Das Expositionsmedium kann die Substanz, die auch als Test- oder Prüfsubstanz bezeichnet wird, enthalten und/oder diese bilden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, wenn das Expositionsmedium ohne Substanz bzw. Test- oder Prüfsubstanz ausgebildet ist.
Bei dem biologischen Testsystem kann es sich um eine Eukaryonten-Kultur, besonders bevorzugt um Zelllinien, Primärzellisolate, Gewebeschnitte, rekonstruierte Gewebe wie Kokulturen, oder genetisch veränderte Zellen, oder eine Prokaryonten-Kultur handeln.
Das Expositionsmedium kann flüssig oder gasförmig sein.
Das gasförmige Expositionsmedium kann als ein reines Gas oder Gasgemisch vorliegen, d. h. alle darin enthaltenen Stoffe, insbesondere Atome, Moleküle, etc., befinden sich in der Gasphase, und/oder es kann auch als Träger für Fest- und/oder Flüssigstoffe dienen. Insbesondere können so Aerosole, zerstäubte Flüssigkeiten, kleine Flüssigkeitströpfchen (beispielsweise Pflanzenschutzmittel als Sprühnebel, etc.), Schwebeteilchen, Feststoffpartikel (beispielsweise Holzstaub, etc.), gasförmige Suspensionen, zerstäubte Suspensionen oder Emulsionen als zu tragende Substanzen in dem Trägergas enthalten sein.
Bei den genannten in-vitro-Experimenten kann es sich um gezielte Manipulationen durch pharmakologisch wirksame Substanzen handeln. Es kann sich bei den genannten in-vitro-Experimenten aber auch um solche handeln, die beispielsweise im Rahmen von so genannten Tissue-Engineering-Techniken Einfluss auf Zellwachstum oder -differenzierung nehmen sollen. Auch kann es sich bei den genannten in-vitro-Experimenten um toxikologische Untersuchungen unterschiedlichster Substanzen bzw. Stoffe handeln.
Hinsichtlich der Art und Weise, wie die Substanzen mit den biologischen Testsystemen in Kontakt gebracht werden, kann man grundsätzlich zwei Arbeitsweisen unterscheiden, nämlich zum einen die statische Exposition und zum anderen die dynamische Exposition, die auch als Perfusion bzw. perfusive Exposition bezeichnet wird.
Im Falle der statischen Exposition wird die Substanz einmalig oder auch wiederholt, insbesondere additiv, aber nicht kontinuierlich zum biologischen Testsystem gegeben, auf dem sie dann für einen gewissen Zeitraum verbleibt, ohne ausgetauscht zu werden.
Im Falle der dynamischen Exposition wird die Substanz kontinuierlich zu- und abgeleitet, etwa um eine höhere Effektivität oder Sensitivität in der Untersuchung zu erzeugen, oder auch aufgrund physikalisch/chemischer oder anderer Eigenschaften der Testsubstanzen, des biologischen Testsystems oder anderer Randbedingungen der Untersuchung.
Zur Durchführung von dynamischen Expositionen bzw. Perfusionsexpositionen mit Expositionsmedien ist in der WO 2015/027998 A1 ein vorteilhafter Expositionsapparat offenbart. In der WO 2015/027998 A1 findet sich ein ausführlicher Überblick über den auf diesem technischen Gebiet relevanten Stand der Technik.
Der in der WO 2015/027998 A1 offenbarte Expositionsapparat ist derart konstruiert, dass beispielsweise folgende Anforderungen erfüllt werden:

• Verwendung von in vitro kultivierten Zellen und Geweben
• Verwendung von so genannten „Membrankulturen“, d.h. Zellen und Gewebe, die auf mikroporösen oder filterartigen Substraten kultiviert wurden
• Verwendung einer möglichst großen Anzahl von Kulturen in einem einzigen experimentellen Ansatz (in verschiedenen „Wells“) als Voraussetzung zur Realisierung von Experimenten im höheren Durchsatz („Higher Throughput“, „HT“), resultierend in einer Verkleinerung der Fläche der einzelnen Kultur.
• Oberseitige („apikale“) Heranführung eines Mediums (z.B. ein Aerosol in der Gasphase) an die Kultur („Expositionsmedium“)
• Definierte Verteilung des Expositionsmediums über unterschiedliche Kulturen (als „technische Replikate“ verwendete, identisch behandelte Wells).
• Versorgung der Kulturen mit Kulturmedium
• Konstruktive Trennung der Bereiche, die der Heranführung des Expositionsmediums dienen, und der Bereiche, die der Kulturmediumversorgung dienen, um einen Kontakt und damit die physikalisch chemische Vermischung der beiden Medien auszuschließen
• Thermostatisierung
• Gezielte Wärmeverteilung, um Effekte wie „thermische Präzipitation“, auch „Thermophorese“ genannt, durch gezielt eingestellte Temperaturgradienten vorwiegend zwischen den Oberflächen der Kulturen und dem überströmenden Expositionsmedium zu ermöglichen
• Beobachtung der Kulturen mittels fluoreszenzspektroskopischer Methoden in der Expositionssituation, z. B. durch Fluoreszenzmikroskopie oder ähnlichen Systemen, die als „Multiwell Platten Reader“ bekannt sind
• Verwirklichung der technischen Lösung in Form eines möglichst kompakten Expositionsapparats

Der in der WO 2015/027998 A1 offenbarte Expositionsapparat erfüllt vorwiegend die genannten Anforderungen, insbesondere unter Nutzung von Standard-Multiwellplatten. Die Nutzung von Plattenformaten mit höherem Durchsatz, z.B. von 96-Wellplatten, anstatt der typischerweise genutzten Standard12-Wellplatten, ist mit Schwierigkeiten verbunden.
Die Nutzung von Wellplatten mit einer höheren Anzahl von Wells resultiert in verschiedenen strömungstechnischen, physikalischen und konstruktiven Konsequenzen, die eine reine Skalierung des in der WO 2015/027998 A1 offenbarten Expositionsapparats nicht mehr zur besten Lösung werden lässt.
Weitere Expositionsapparate sind aus der DE 10 2009 039 868 A1 und der US 2010/0 112 690 A bekannt.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen Expositionsapparat zur Durchführung von in-vitro-Experimenten mit technischen Replikaten wenigstens eines biologischen Testsystems, die perfusiv unter Ausbildung einer Expositionsatmosphäre auf bzw. oberhalb des biologischen Testsystems mit einem Expositionsmedium beaufschlagbar sind, zu verbessern, insbesondere diesen so zu verbessern, dass sich dieser für Plattenformate mit höherem Durchsatz, z.B. für 96-Wellplatten, eignet.
Diese Aufgabe wird mit einem Expositionsapparat, der die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist, gelöst. Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die reine Skalierung des in der WO 2015/027998 A1 offenbarten Expositionsapparats auf eine höhere Anzahl von Wells - ebenso wie auch jedes andere Systems, das nicht auf Standard-Multiwellplatten beruht - im Kern die folgenden nachteiligen Konsequenzen hat:

• Eine Vervielfachung des Prinzips der individuellen Exposition einzelner Wells resultiert ebenso in der Notwendigkeit der entsprechenden Vervielfachung der Erzeugung von extern betriebenen Expositionsflüssen. Dies stellt einen erheblichen technischen Aufwand und eine erhöhte experimentelle Unsicherheit dar und führt zu einem massiven Raumbedarf der experimentellen Installation.
• Die geometrischen Verhältnisse der einzelnen Wells in Plattensystemen mit einer höheren Anzahl von Wells, beispielsweise bei 96- Wellplatten, sind aus der Notwendigkeit des Beibehaltens der äußeren Plattenabmessungen, insbesondere aus Kompatibilitätsgründen, deutlich anders als in Multiwellplatten mit weniger Wells, beispielsweise bei 6- oder 12-Wellplatten. Mit zunehmender Anzahl von Wells pro Multiwellplatte wird daher das geometrische Verhältnis der Höhe des Wells zu seiner Bodenfläche immer größer; die Wells werden in ihrem Querschnitt immer schmaler und höher.

Expositionsapparate, wie sie beispielsweise in der WO 2015/027998 A1 offenbart sind, verfolgen das Prinzip der so genannten „Staupunktströmung“ (engl. „stagnation- flow“). Dabei wird der Fluss des Expositionsmediums senkrecht und mittig auf die Oberfläche der Membrankulturen gelenkt. Die Heranführung geschieht dabei durch ein so genanntes „Einlassrohr“, das seiner Aufgabe entsprechend den Strömungslinien gemäß geformt sein kann. Bei einer Veränderung der Geometrie eines Wells muss dieses Einlassrohr verlängert und gleichzeitig in seinem Durchmesser verringert werden, um zum Erreichen vergleichbarer Expositionsbedingungen einen ähnlichen Abstand zur zu exponierenden Oberfläche der Zellkultur zu haben. Eine Verringerung des Innendurchmessers bedeutet wiederum eine massive Veränderung der geometrischen Verhältnisse von innerer Oberfläche und offenem Querschnitt. Wird nun beispielsweise mit Aerosolen gearbeitet, die sehr kleine Partikel, beispielsweise Nanopartikel, enthalten, deren Bewegung vorwiegend diffusiv getrieben ist, bedeutet dies einen erheblichen Verlust an Partikeln im Aerosol durch Adsorptionseffekte an der inneren Wandung des Einlassrohres. Damit sinkt aber auch die tatsächlich zur Exposition zur Verfügung stehende Konzentration an Partikeln. Ein erheblicher Verlust der Effektivität des Expositionsvorganges, beispielsweise bei der Untersuchung biologischer Effekte von einatembaren Aerosolen, ist die Folge.
Ein Arbeiten ohne jegliches Einleitungsrohr, das auf einer rein diffusiven oder durch Sedimentation getriebenen Abscheidung von Stoffen aus dem Expositionsmedium führen würde, wäre durch den hierdurch erzeugten Mangel an Effektivität und Reproduzierbarkeit ebenfalls kein vorteilhafter Weg.
Die Erfindung sieht deshalb einen Expositionsapparat zur Durchführung von in-vitro-Experimenten mit technischen Replikaten wenigstens eines biologischen Testsystems, die perfusiv unter Ausbildung einer Expositionsatmosphäre auf bzw. oberhalb des biologischen Testsystems mit einem Expositionsmedium beaufschlagbar sind, vor, der einen Expositionsaufsatz umfasst, der auf eine Multiwellplatte aufsetzbar ist, wobei der Expositionsapparat

• mehrere Ableitungsrohre aufweist, die jeweils einem bestimmten, mit biologischem Testsystem versehenen Well der Multiwellplatte zugeordnet sind, wobei das Ableitungsrohr nach dem Aufsetzen des Expositionsaufsatzes auf die Multiwellplatte mit dem unteren Ende in den Well ragt,
• zumindest einen Ableitungsraum aufweist, in den die Ableitungsrohre mit ihren oberen Enden münden,
• zumindest einen Ableitungsanschluss aufweist, der mit zumindest einem Ableitungsraum strömungsverbunden ist und an dem eine Unterdruck erzeugende Vorrichtung anschließbar ist,
• mehrere Zuleitungsrohre aufweist, die jeweils einem bestimmten, mit biologischem Testsystem versehenen Well der Multiwellplatte zugeordnet sind, wobei das Zuleitungsrohr nach dem Aufsetzen des Expositionsaufsatzes auf die Multiwellplatte mit seinem unteren Ende in den Well mündet,
• zumindest einen Zuleitungsraum aufweist, in den die Zuleitungsrohre mit ihren oberen Enden münden,
• zumindest einen Zuleitungsanschluss aufweist, der mit zumindest einem Zuleitungsraum strömungsverbunden ist und an dem eine Expositionsmediumquelle anschließbar ist,

Der in der WO 2015/027998 A1 offenbarte Expositionsapparat offenbart bereits viele vorteilhafte Merkmale, die selbstverständlich auch bei dem erfindungsgemäßen Expositionsapparat vorhanden sein können. Bei den Merkmalen handelt es sich beispielsweise um die konstruktive Trennung der Bereiche von Exposition und Kulturmedium, die konstruktive Verankerung der Möglichkeit, durch Realisierung von Wärmegradienten nach dem Thermophorese-Prinzip zu arbeiten (Schichtaufbau), und die Verwirklichung in einer Form, die die Beobachtung der Zellen und Gewebe während der Exposition „von unten“ und die in ihrer Konstruktion die Nutzung normierter Multiwellplatten zulässt.
Der erfindungsgemäße Expositionsapparat zeichnet sich gegenüber dem in der WO 2015/027998 A1 offenbarten Expositionsapparat dadurch aus, dass eine Umkehrung des Strömungsweges des Expositionsmediums erfolgt. Die Umkehrung bewirkt, dass die Geometrie des Zuleitungsrohres im Bereich der Heranführung des Expositionsmediums an die Kulturen wesentlich günstiger, also mit größerem Volumen / Oberfläche -Verhältnis, konstruiert werden können. Der nachteilige Weg des Expositionsmediums durch ein zentrales und - bei einer Multiwellplatte mit höherem Durchsatz notwendigerweise - enges und langes Zuleitungsrohr wird umgangen.
Eine gestaltbare dichte Heranführung des Expositionsmediums an das biologische Testsystem wird dennoch möglich durch das Ableitungsrohr, das vorteilhaft in gewünschter Weise eng gestaltet werden kann, da Verluste durch ein ungünstiges Querschnitt/LängenVerhältnis beim Abtransport des Expositionsmedium vom biologischen Testsystem keine Bedeutung mehr haben.
Es kann vorteilhaft sein, wenn die Multiwellplatte temperierbar ist, wobei vorzugsweise zumindest eine elektrische Heizvorrichtung, insbesondere eine Heizplatte, oder eine Thermostatisierungseinrichtung, welche vorzugsweise unterhalb der Multiwellplatte angeordnet ist, einsetzbar ist. Die Heizvorrichtung oder Thermostatisierungseinrichtung ist vorteilhaft derart ausgebildet und angeordnet, dass diese die Temperatur eines oder mehrerer Wells bzw. eines Wachstumsmediums zur Optimierung der Wachstumsbedingungen des biologischen Testsystems steuert, wodurch auf einen separaten Inkubator bzw. Brutschrank verzichtet werden kann und insbesondere auch ein laborferner Betrieb des Expositionsapparats möglich ist. Vorteilhaft ist die Heizvorrichtung oder Thermostatisierungseinrichtung derart ausgebildet und angeordnet, dass sich innerhalb des Expositionsapparats ein thermischer Gradient ausbildet, der insbesondere zur gezielten Abscheidung von Substanzen aus einem Aerosolstrom mittels Thermophorese nutzbar ist. Zur Ausbildung des thermischen Gradienten kann es vorteilhaft sein, wenn auch an wenigstes einer anderen nicht unterhalb der Multiwellplatte vorgesehenen Stelle des Expositionsapparates, beispielsweise am Expositionsaufsatz, eine Heizvorrichtung oder Thermostatisierungseinrichtung angeordnet ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das untere Ende des Ableitungsrohres im unteren Drittel, vorzugsweise im unteren Viertel, besonders bevorzugt im unteren Fünftel, ganz besonders bevorzugt im unteren Sechstel des Wells angeordnet ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das Ableitungsrohr austauschbar ist, vorzugsweise durch ein Ableitungsrohr mit einer anderen Bemaßung, beispielsweise mit einem anderen inneren Durchmesser und/oder einer anderen Länge, und/oder mit einem anderen Material. Durch die Materialauswahl lassen sich die Eigenschaften des Ableitungsrohres in gewünschter Weise gezielt beeinflussen. So kann die Materialauswahl Einfluss auf die Oberflächeneigenschaft der Innenwandung des Ableitungsrohres haben, wodurch ein Effekt im Hinblick auf die Partikeladsorption an der Innenwandung erzielt wird. Zudem lässt sich durch die Materialauswahl die Elektrostatik, die Wärmeleitung und Wärmekapazität des Ableitungsrohres in gewünschter Weise beeinflussen.
Zudem kann es vorteilhaft sein, wenn die Länge, mit der das Ableitungsrohr in das Well ragt, einstellbar ist, vorzugsweise durch Verschieben des Ableitungsrohrs innerhalb des Expositionsaufsatzes.
Das Zuleitungsrohr, das auch sehr kurz als einfache Öffnung innerhalb einer Wandung oder als Hülse ausgebildet sein kann, ermöglicht durch seine Ausgestaltung in Länge und Form, auf die strömungstechnische Heranführung des Expositionsmediums an die Oberfläche des biologischen Testsystems, insbesondere an die Zelloberfläche, Einfluss zu nehmen.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das untere Ende des Zuleitungsrohres im oberen Drittel, vorzugsweise im oberen Viertel, besonders bevorzugt im oberen Fünftel, ganz besonders bevorzugt im oberen Sechstel des Wells angeordnet ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das Zuleitungsrohr austauschbar ist, vorzugsweise durch ein Zuleitungsrohr mit einer anderen Bemaßung, beispielsweise mit einem anderen inneren Durchmesser und/oder einer anderen Länge, und/oder mit einem anderen Material. Durch die Materialauswahl lassen sich die Eigenschaften des Zuleitungsrohres in gewünschter Weise gezielt beeinflussen. So kann die Materialauswahl Einfluss auf die Oberflächeneigenschaft der Innenwandung des Zuleitungsrohres haben, wodurch ein Effekt im Hinblick auf die Partikeladsorption an der Innenwandung erzielt wird. Zudem lässt sich durch die Materialauswahl die Elektrostatik, die Wärmeleitung und Wärmekapazität des Zuleitungsrohres in gewünschter Weise beeinflussen.
Es kann vorteilhaft sein, wenn die Länge, mit der das Zuleitungsrohr in das Well ragt, einstellbar ist, vorzugsweise durch Verschieben des Zuleitungsrohrs innerhalb des Expositionsaufsatzes.
Durch das Vorsehen zumindest eines Ableitungsraumes, in den mehrere Ableitungsrohre münden, und zumindest eines Zuleitungsraumes, von dem mehrere Zuleitungsrohre abgehen, und die erfindungsgemäß vorgesehene Strömungsrichtung des Expositionsmediums, wird eine erhebliche Reduktion des technischen Aufwandes für die notwendigen Steuerungs- und Regelungsaufgaben erreicht.
Ohne das Vorsehen solcher Zu- und Ableitungsräume und die damit einhergehende Zusammenfassung der Zu- und Ableitungsräume müssten beispielsweise in einer üblichen 96-Wellplatte 96 einzelne Versorgungen mit Expositionsflüssen und 96 Heranführungen des Expositionsmediums realisiert werden. Das entspräche 192 Schlauchanschlüsse auf einer Grundfläche der Multiwellplatte in einem Format von 13 x 8,5 cm und wäre damit nicht mehr handhabbar.
Es kann vorteilhaft sein, wenn die Wells der Multiwellplatte in verschiedene Gruppen unterteilbar sind, wobei verschiedene Gruppen von Wells über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohren mit verschiedenen Zu- und/oder Ableitungsräumen in Verbindung stehen, so dass jede Gruppe von Wells individuell mit gleichen oder unterschiedlichen Expositionsvolumenströmen eines Expositionsmediums mit oder ohne Testsubstanz durchströmt wird.
Die Verbindung zu einer Gruppe führt zu einem um Faktor 8 bei Zusammenlegung von Spalten einer 12 x 8 Multiwellplatte im 96- Wellformat oder um Faktor 12 bei Zusammenlegung von Reihen einer 12 x 8 Multiwellplatte im 96-Wellformat reduzierten vorgenannten Aufwand.
Es kann vorteilhaft sein, wenn die Unterteilung entlang der Reihen und/oder Spalten der Multiwellplatte ausführbar ist. Dabei können auch mehrere Reihen und/oder mehrere Spalten von Wells zu einer Gruppe von Wells gehören.
Es kann vorteilhaft sein, wenn einer Gruppe von Wells der Multiwellplatte keine Zu- und Ableitungsrohre zugeordnet sind, wobei diese Gruppe von Wells als so genannte Kontrollprobe im in-vitro-Experiment mitführbar ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn eine Gruppe von Wells über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohre mit einem Zu- und Ableitungsraum in Verbindung steht, durch welche das Expositionsmedium ohne Testsubstanz der Gruppe von Wells zuleitbar und als so genannte Blindprobe im in-vitro-Experiment mitführbar ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn eine Gruppe von Wells über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohre mit einem Zu- und Ableitungsraum in Verbindung steht, durch welche das Expositionsmedium mit Testsubstanz der Gruppe von Wells zuleitbar und als eigentliche Probe im in-vitro-Experiment mitführbar ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das Ableitungsrohr mit einem strömungsbestimmenden, vorzugsweise den Innenquerschnitt des Ableitungsrohrs verengenden Element versehen ist, das vorzugsweise austauschbar am oberen Ende des Ableitungsrohres angeordnet ist.
Durch die Querschnittsverengung wird der Strömungswiderstand zur Erzeugung eines Druckabfalles erhöht. Dadurch können unterschiedliche Expositionsbedingungen und unterschiedliche Expositionsdosierungen eingestellt werden.
Unterschiedlich ausgebildete Elemente können auch vorteilhaft dazu genutzt werden, um unterschiedliche Gruppen oder innerhalb von Gruppen unterschiedliche Untergruppen zu definieren. Solche Gruppen oder Untergruppen können auch durch die Verwendung unterschiedlicher biologischer Testsysteme definiert werden.
Die durch die Ableitungs- und Zuleitungsräume und die zugehörigen Ab- und Zuleitungsrohren vorgenommene Organisation in Reihen oder Spalten führt somit aufgrund der Bildung von Untergruppen zu keiner Beschränkung der Möglichkeiten, die durch die hohe Anzahl von Wells erwünscht sind.
Zur technischen Realisation von definierten, unterdruckgetriebenen Expositionsmediumflüssen gibt es unterschiedliche Möglichkeiten, beispielsweise mechanische Nadelventile oder elektrische Massenflusskontroller. Entscheidend für den sinnvollen technischen Einsatz sind neben der strömungstechnischen Funktionalität auch Bedienbarkeit und Preis. Im erfindungsgemäßen Expositionsapparat soll zuverlässig eine hohe Anzahl von Expositionsmediumflüssen realisiert werden. Gleichzeitig sollen die notwendigen Maßnahmen für den Anwender möglichst geringgehalten werden, da im Vordergrund der Anwendung des Expositionsapparats die Untersuchungen mit den biologischen Testsystemen, beispielsweise Zellkulturen, stehen, die vom Anwender erhebliche Aufmerksamkeit verlangen.
Strömungsbestimmende Elemente, insbesondere auch so genannte „kritische Düsen“, die durch einen Druckabfall bei gegebenen negativem Vordruck definierte Volumenflüsse erzeugen, sind erfindungsgemäß bevorzugt. Die konstruktive Zusammenführung mit dem Ableitungsrohr ermöglicht zudem eine extrem kompakte Bauweise.
Es kann von Vorteil sein, wenn der Expositionsaufsatz derart auf die Multiwellplatte aufsetzbar und mit dieser verbindbar ist, dass die sich während des in-vitro-Experiments innerhalb jedes bestimmten Wells ausbildendende Expositionsatmosphäre dicht abgeschlossen ist, wobei nur über das jeweils dem Well zugeordnete Zuleitungsrohr Expositionsmedium dem Well zuleitbar ist und nur über das jeweils dem Well zugeordnete Ableitungsrohr Expositionsmedium aus dem Well ableitbar ist.
Es kann von Vorteil sein, wenn zum dichten Abschließen der Expositionsatmosphäre ein oder mehr als ein Dichtmittel zwischen Expositionsaufsatz und Multiwellplatte vorgesehen ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das Dichtmittel eine das jeweilige Well bzw. die Öffnung des jeweiligen Wells und/oder eine das jeweilige Zuleitungs- und/oder Ableitungsrohr umlaufende Dichtung ist.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das Dichtmittel eine auf die Multiwellplatte aufbringbare bzw. aufgebrachte und/oder an der zur Multiwellplatte weisenden Seite des Expositionsaufsatzes anbringbare bzw. angebrachte Dichtmatte mit entsprechenden Aussparungen für die bestimmten Wells bzw. Öffnungen der bestimmten Wells und/oder mit entsprechenden Aussparungen für die den bestimmten Wells zugeordneten Zuleitungs- und/oder Ableitungsrohren ist.
Es kann von Vorteil sein, wenn das Ableitungsrohr zumindest teilweise innerhalb des Zuleitungsrohres angeordnet ist und aus dieser in Richtung Well vorsteht. Zuleitungsrohr und Ableitungsrohr können insoweit zumindest teilweise konzentrisch ausgebildet sein. Vorteilhaft kann die Strömungsführung somit nach dem Rohr-in-Rohr-Prinzip zumindest teilweise entsprechend koaxial im Gegenstrom erfolgen. Es kann vorteilhaft sein, wenn sich das Ableitungsrohr in seinem zum biologischen Testsystem weisenden Endbereich aufweitet, insbesondere konisch oder durch nicht-lineare Veränderung seines Innendurchmessers mit der Länge, z.B. hyperbolisch
Es kann vorteilhaft sein, wenn das durch die Leitungselemente leitbare Expositionsmedium flüssig oder gasförmig ist, wobei das Expositionsmedium mit oder ohne Testsubstanz versehbar ist.
Erfindungsgemäß sind einzelne Wells, die auch als Vertiefungen oder Kavitäten bezeichnet werden, zur Aufnahme der biologischen Testsysteme auf einer Multiwellplatte im Wesentlichen matrixförmig angeordnet. Bei den Wells kann es sich um Aufnahmen handeln, die bereits in der Multiwellplatte integriert sind, oder um solche, die als separate Kulturgefäße, so genannte Inserts, in vorhandene integrierte Wells oder in entsprechend angeordnete Aussparungen der Multiwellplatte aufgenommen sind. Es kann von Vorteil sein, wenn der Boden wenigstens eines Wells der Multiwellplatte als permeabler Träger ausgebildet ist oder einen solchen gegebenenfalls auch zusätzlich aufweist, wobei auf diesem das biologische Testsystem angeordnet ist. Vorzugsweise kann der permeable Träger eine mikroporöse Membran sein. Zur Aufnahme des biologischen Testsystems kann das Well auch durch ein in die Multiwellplatte einbringbares kommerziell erhältliches so genanntes Cell Culture Insert ausgeführt sein, wobei der permeable Träger die Bodenmembran des Wells bildet.
Es kann von Vorteil sein, wenn die einen Unterdruck erzeugende Vorrichtung eine Peristaltik-Pumpe für flüssige oder eine Membranpumpe für gasförmige Expositionsmedien ist.
Es kann von Vorteil sein, wenn der Multiwellplatte ein Erhaltungsmedium zuführbar oder zugeordnet ist, das zur Versorgung des biologischen Testsystems in direktem Kontakt mit der Unterseite des Wells bzw. des permeablen Trägers steht, auf der bzw. dem das biologische Testsystem angeordnet ist. Unter einem Erhaltungsmedium im Sinne der Erfindung wird hier und im Folgenden ein Kulturmedium, auch als Nährmedium bezeichnet, mit oder ohne Zusätzen oder eine Salzlösung verstanden.
Es kann von Vorteil sein, wenn das Erhaltungsmedium perfusiv, also im kontinuierlichen Durchfluss zuführbar ist, um damit beispielsweise die Anwendung für so genannte „Organ-on-a-chip“ Ansätze, in denen unterschiedliche Organkulturen gemeinsam kultiviert werden, zu ermöglichen, oder so genannte kinetische Transportuntersuchungen hinsichtlich des Stoffübergangs über die exponierten Zellen zu ermöglichen, oder gleichzeitig den exponierten Zellen beispielsweise pharmakologisch wirksame Substanzen durch das Kulturmedium zuführen zu können.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert, das in der Zeichnung dargestellt ist. In dieser zeigt

1 schematisch im Querschnitt einen Teilausschnitt aus einem erfindungsgemäßen Expositionsapparat.

Der erfindungsgemäße Expositionsapparat zur Durchführung von in-vitro-Experimenten mit technischen Replikaten wenigstens eines biologischen Testsystems 10, die perfusiv unter Ausbildung einer Expositionsatmosphäre 12 auf bzw. oberhalb des biologischen Testsystems 10 mit einem Expositionsmedium 14 beaufschlagbar sind, umfasst einen Expositionsaufsatz 16, der auf eine Multiwellplatte 18 aufsetzbar ist, wobei der Expositionsapparat

• mehrere Ableitungsrohre 20 aufweist, die jeweils einem bestimmten, vorzugsweise mit biologischem Testsystem 10 versehenen Well 22 der Multiwellplatte 18 zugeordnet sind, wobei das Ableitungsrohr 20 nach dem Aufsetzen des Expositionsaufsatzes 16 auf die Multiwellplatte 18 mit dem unteren Ende 24 in das Well 22 ragt,
• zumindest einen Ableitungsraum 26 aufweist, in den die Ableitungsrohre 20 mit ihren oberen Enden 28 münden,
• zumindest einen hier nicht dargestellten Ableitungsanschluss aufweist, der mit zumindest einem Ableitungsraum 26 strömungsverbunden ist und an dem eine hier nicht dargestellte Unterdruck erzeugende Vorrichtung anschließbar ist,
• mehrere Zuleitungsrohre 30 aufweist, die jeweils einem bestimmten, vorzugsweise mit biologischem Testsystem 10 versehenen Well 22 der Multiwellplatte 18 zugeordnet sind, wobei das Zuleitungsrohr 30 nach dem Aufsetzen des Expositionsaufsatzes 16 auf die Multiwellplatte 18 mit seinem unteren Ende 32 in das Well 22 mündet,
• zumindest einen Zuleitungsraum 34 aufweist, in den die Zuleitungsrohre 30 mit ihren oberen Enden 36 münden,
• zumindest einen hier nicht dargestellten Zuleitungsanschluss aufweist, der mit zumindest einem Zuleitungsraum 34 strömungsverbunden ist und an dem eine hier nicht dargestellte Expositionsmediumquelle anschließbar ist,

24

20

38

22

10

32

30

14

34

30

12

30

22

10

22

20

26

Vorliegend sind Wells 22 der Multiwellplatte 18 dargestellt, die in drei Gruppen I, II, III unterteilt sind. Weitere zu jeder Gruppe I, II, III gehörende hier nicht dargestellte Wells befinden sich hinter und vor der Papierebene. Jede Gruppe von Wells 22 steht über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohren 30, 20 mit jeweils einem Zu- und Ableitungsraum 34, 26 in Verbindung, so dass jede Gruppe I, II, III von Wells 22 individuell mit gleichen oder unterschiedlichen Expositionsvolumenströmen eines Expositionsmediums 14 mit oder ohne Testsubstanz durchströmt wird.
Der Expositionsaufsatz 16 ist derart auf die Multiwellplatte 18 aufgesetzt und mit dieser verbunden, dass die sich während des in-vitro-Experiments innerhalb jedes bestimmten Wells 22 ausbildendende Expositionsatmosphäre 12 dicht abgeschlossen ist, wobei nur über das jeweils dem Well 22 zugeordnete Zuleitungsrohr 30 Expositionsmedium 14 dem Well 22 zuleitbar ist und nur über das jeweils dem Well 22 zugeordnete Ableitungsrohr 20 Expositionsmedium 14 aus dem Well 22 ableitbar ist.
Zum dichten Abschließen der Expositionsatmosphäre 12 ist ein Dichtmittel 42 zwischen Expositionsaufsatz 16 und Multiwellplatte 18 vorgesehen. Vorliegend führt die Dichtung zur konstruktiven Trennung zwischen der Expositionsatmosphäre 12 und dem Raum 46 für das hier nicht dargestellte Erhaltungsmedium.
Erfindungsgemäß ist vorliegend jedes Ableitungsrohr 20 mit einem strömungsbestimmenden, vorzugsweise den Innenquerschnitt des Ableitungsrohrs 20 verengenden Element 40 versehen, das austauschbar am oberen Ende 28 des Ableitungsrohres 20 angeordnet ist. Die Verengung führt zu einem gewünschten Druckabfall, der gewünschte Auswirkungen auf den Volumenstrom des Expositionsmediums hat.
In 1 ist weiterhin der obere Abschluss 44 des Expositionsaufsatzes 16 dargestellt. Dieser kann beispielsweise eine elektrische Heizvorrichtung, insbesondere eine Heizfolie, oder eine Thermostatisierungseinrichtung inklusive eines Peltier-Elements aufweisen. Unterhalb der Multiwellplatte 18 ist ein Abschluss 54 dargestellt, der eine elektrische Heizvorrichtung, insbesondere eine Heizplatte, oder eine Thermostatisierungseinrichtung inklusive eines Peltier-Elements aufweist. Die Heizvorrichtung oder Thermostatisierungseinrichtung des unteren Abschlusses 54 ist vorteilhaft derart ausgebildet und angeordnet, dass diese die Temperatur eines oder mehrerer Wells 22 bzw. eines Wachstumsmediums zur Optimierung der Wachstumsbedingungen des biologischen Testsystems 10 steuert, wodurch auf einen separaten Inkubator bzw. Brutschrank verzichtet werden kann und insbesondere auch ein laborferner Betrieb des Expositionsapparats möglich ist.
Durch die Heizvorrichtung oder Thermostatisierungseinrichtung wird erreicht, dass sich innerhalb des Expositionsapparats ein thermischer Gradient ausbildet, der insbesondere zur gezielten Abscheidung von Substanzen aus einem Aerosolstrom mittels Thermophorese nutzbar ist.
Das Ableitungsrohr 20 und das strömungsbestimmende Element 40 bestehen aus hochgradig wärmeleitenden Material zur Stabilisierung des thermischen Gradienten zwischen dem Expositionsmedium 14 und der Oberfläche des biologischen Testsystems 10, insbesondere der Zelloberfläche.
Zur Ausbildung des thermischen Gradienten ist der Expositionsapparat schichtartig aufgebaut und umfasst einen oberen Abschluss 44, vorzugsweise mit einer elektrische Heizvorrichtung oder einer Thermostatisierungseinrichtung, einen oberen Teil 48 aus einem wärmeleitenden Material und in dichtender Abgrenzung 50 dazu einen mittleren Teil 52 aus einem Material mit geringer Wärmeleitfähigkeit sowie unterhalb der Multiwellplatte 18 einen unteren Abschluss 54, der eine elektrische Heizvorrichtung, insbesondere eine Heizplatte, oder eine Thermostatisierungseinrichtung aufweist.
Bezugszeichenliste

10: biologisches Testsystem
12: Expositionsatmosphäre
14: Expositionsmedium
16: Expositionsaufsatz
18: Standard-Multiwellplatte
20: Ableitungsrohr
22: Well
24: unteres Ende
26: Ableitungsraum
28: oberes Ende
30: Zuleitungsrohr
32: unteres Ende
34: Zuleitungsraum
36: oberes Ende
38: Boden
40: Element
42: Dichtmittel
44: oberer Abschluss
46: Raum für Erhaltungsmedium
48: Oberer Teil des Expositionsapparats
50: Abgrenzung (Dichtung)
52: Mittlerer Teil des Expositionsapparats
54: unterer Abschluss (mit Heizplatte)

Claims

Expositionsapparat zur Durchführung von in-vitro-Experimenten mit technischen Replikaten wenigstens eines biologischen Testsystems (10), die perfusiv unter Ausbildung einer Expositionsatmosphäre (12) auf oder oberhalb des biologischen Testsystems (10) mit einem Expositionsmedium (14) beaufschlagbar sind, umfassend einen Expositionsaufsatz (16), der auf eine Multiwellplatte (18) aufsetzbar ist, wobei der Expositionsapparat • mehrere Ableitungsrohre (20) aufweist, die jeweils einem bestimmten, mit biologischem Testsystem (10) versehenen Well (22) der Multiwellplatte (18) zugeordnet sind, wobei das Ableitungsrohr (20) nach dem Aufsetzen des Expositionsaufsatzes (16) auf die Multiwellplatte (18) mit dem unteren Ende (24) in das Well (22) ragt, • zumindest einen Ableitungsraum (26) aufweist, in den die Ableitungsrohre (20) mit ihren oberen Enden (28) münden, • zumindest einen Ableitungsanschluss aufweist, der mit zumindest einem Ableitungsraum (26) strömungsverbunden ist und an dem eine Unterdruck erzeugende Vorrichtung anschließbar ist, • mehrere Zuleitungsrohre (30) aufweist, die jeweils einem bestimmten, mit biologischem Testsystem (10) versehenen Well (22) der Multiwellplatte (18) zugeordnet sind, wobei das Zuleitungsrohr (30) nach dem Aufsetzen des Expositionsaufsatzes (16) auf die Multiwellplatte (18) mit seinem unteren Ende (32) in den Well (22) mündet, • zumindest einen Zuleitungsraum (34) aufweist, in den die Zuleitungsrohre (30) mit ihren oberen Enden (36) münden, • zumindest einen Zuleitungsanschluss aufweist, der mit zumindest einem Zuleitungsraum (34) strömungsverbunden ist und an dem eine Expositionsmediumquelle anschließbar ist, wobei das untere Ende (24) des Ableitungsrohres (20) näher am Boden (38) des Wells (22) oder am biologischen Testsystem (10) angeordnet ist als das untere Ende (32) des Zuleitungsrohres (30), wobei mittels der am Ableitungsanschluss angeschlossenen und einen Unterdruck erzeugenden Vorrichtung, ein Expositionsmedium (14) aus der am Zuleitungsanschluss angeschlossenen Expositionsmediumquelle in den Zuleitungsraum (34), von dort in die mit dem Zuleitungsraum (34) verbundenen Zuleitungsrohre (30), von dort zur Ausbildung der Expositionsatmosphäre (12) in das jeweils einem Zuleitungsrohr (30) zugeordnete Well (22) oder bzw. über das darin angeordnete biologische Testsystem (10), von dort in das jeweils dem Well (22) zugeordnete Ableitungsrohr (20), von dort in den mit den Ableitungsrohren (20) strömungsverbundenen Ableitungsraum (26) zum Ableitungsanschluss leitbar oder förderbar ist.
Expositionsapparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Multiwellplatte (18) temperierbar ist.
Expositionsapparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das untere Ende (24) des Ableitungsrohres (20) im unteren Drittel des Wells angeordnet ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass untere Ende (32) des Zuleitungsrohres (30) im oberen Drittel des Wells (22) angeordnet ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zuleitungsrohr (30) austauschbar ist.
Expositionsapparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Zuleitungsrohr (30) durch ein Zuleitungsrohr (30) mit einer anderen Bemaßung und/oder mit einem anderen Material austauschbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ableitungsrohr (20) austauschbar ist.
Expositionsapparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Ableitungsrohr (20) durch ein Ableitungsrohr (20) mit einer anderen Bemaßung und/oder mit einem anderen Material austauschbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge, mit der das Zuleitungsrohr (30) und/oder das Ableitungsrohr (20) in das Well (22) ragt, einstellbar ist.
Expositionsapparat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge durch Verschieben des Zuleitungsrohrs (30) und/oder des Ableitungsrohrs (20) innerhalb des Expositionsaufsatzes (16) einstellbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Ableitungsrohr (20) mit einem strömungsbestimmenden Element (40) versehen ist.
Expositionsapparat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (40) den Innenquerschnitt des Ableitungsrohrs (20) verengt.
Expositionsapparat nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Element (40) austauschbar am oberen Ende (28) des Ableitungsrohres (20) angeordnet ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wells (22) der Multiwellplatte (18) in verschiedene Gruppen unterteilbar sind, wobei verschiedene Gruppen von Wells (22) über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohren (30, 20) mit verschiedenen Zu- und/oder Ableitungsräumen (34, 26) in Verbindung stehen, so dass jede Gruppe von Wells (22) individuell mit gleichen oder unterschiedlichen Expositionsvolumenströmen eines Expositionsmediums (14) mit oder ohne Testsubstanz durchströmt wird.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterteilung entlang der Reihen und/oder Spalten der Multiwellplatte (18) ausführbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass einer Gruppe von Wells (22) der Multiwellplatte (18) keine Zu- und Ableitungsrohre (30, 20) zugeordnet sind, wobei diese Gruppe von Wells (22) als so genannte Kontrollprobe im in-vitro-Experiment mitführbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Gruppe von Wells (22) über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohre (30, 20) mit einem Zu- und Ableitungsraum (34, 26) in Verbindung steht, durch welche das Expositionsmedium (14) ohne Testsubstanz der Gruppe von Wells (22) zuleitbar und als so genannte Blindprobe im in-vitro-Experiment mitführbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Gruppe von Wells (22) über entsprechend zugeordnete Zu- und Ableitungsrohre (30, 20) mit einem Zu- und Ableitungsraum (34, 26) in Verbindung steht, durch welche das Expositionsmedium (14) mit Testsubstanz der Gruppe von Wells (22) zuleitbar und als eigentliche Probe im in-vitro-Experiment mitführbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Expositionsaufsatz (16) derart auf die Multiwellplatte (18) aufsetzbar und mit dieser verbindbar ist, dass die sich während des in-vitro-Experiments innerhalb jedes bestimmten Wells (22) ausbildendende Expositionsatmosphäre (12) dicht abgeschlossen ist, wobei nur über das jeweils dem Well (22) zugeordnete Zuleitungsrohr (30) Expositionsmedium (14) dem Well (22) zuleitbar ist und nur über das jeweils dem Well (22) zugeordnete Ableitungsrohr (30) Expositionsmedium (14) aus dem Well (22) ableitbar ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum dichten Abschließen der Expositionsatmosphäre (12) ein oder mehr als ein Dichtmittel (42) zwischen Expositionsaufsatz (16) und Multiwellplatte (18) vorgesehen ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Dichtmittel (42) eine das jeweilige Well (22) oder die Öffnung des jeweiligen Wells (22) und/oder eine das jeweilige Zuleitungs- und/oder Ableitungsrohr (30, 20) umlaufende Dichtung ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden (38) eines Wells (22) der Multiwellplatte (18) als permeabler Träger ausgebildet ist oder einen solchen aufweist, wobei auf diesem das biologische Testsystem (10) angeordnet ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die einen Unterdruck erzeugende Vorrichtung eine Peristaltik-Pumpe für flüssige oder eine Membranpumpe für gasförmige Expositionsmedien ist.
Expositionsapparat nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Multiwellplatte (18) ein Erhaltungsmedium zuführbar oder zugeordnet ist, das zur Versorgung des biologischen Testsystems (10) in direktem Kontakt mit der Unterseite des Wells (22) oder des permeablen Trägers steht, auf der oder dem das biologische Testsystem (10) angeordnet ist.