DE102020004634A1 - Bromelain protease inhibitor for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal and methods for purifying a bromelain protease inhibitor - Google Patents

Bromelain protease inhibitor for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal and methods for purifying a bromelain protease inhibitor Download PDF

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Rolf Müller
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Bromelain-Proteaseinhibitor enthaltend oder bestehend aus mindestens einem Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 90%, bevorzugt 95%, besonders bevorzugt 100%, identisch mit einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1-7 ist, wobei das mindestens eine Peptid bevorzugt eine Reinheit von mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 95% aufweist, zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier.The present invention relates to a bromelain protease inhibitor containing or consisting of at least one peptide with an amino acid sequence which is at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, identical to one of the sequences from SEQ ID NO: 1-7, with the at least one peptide preferably has a purity of at least 80%, more preferably at least 95% for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal.

Description

Angesichts der fortdauernden COVID-19-Pandemie besteht nach wie vor das akute Bedürfnis, zusätzliche Wirkstoffe bzw. Wirkstoffklassen für die Behandlung von Viruserkrankungen bereitzustellen.In view of the ongoing COVID-19 pandemic, there is still an acute need to provide additional active ingredients or active ingredient classes for the treatment of viral diseases.

Die vorliegende Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, Wirkstoffklassen aufzuzeigen, mit denen Viruserkrankungen in einem Mensch oder Tier behandelt werden können. Die Behandlung schließt dabei die akute Behandlung einer bereits vorhandenen Viruserkrankung wie auch die Prophylaxe derselbigen mit ein.The present invention therefore has the task of showing classes of active substances with which viral diseases in a human or animal can be treated. The treatment includes the acute treatment of an already existing viral disease as well as the prophylaxis of the same.

Die Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt einen Extrakt aus dem Stamm und/oder der Frucht einer Ananas-Pflanze zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier.In a first aspect, the invention thus relates to an extract from the stem and / or the fruit of a pineapple plant for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal.

Bei der Ananas-Pflanze kann es sich insbesondere um Ananas comosus und Ananas sativus handeln.The pineapple plant can in particular be Ananas comosus and Ananas sativus.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Jacalin-ähnliches Lectin (Jacalin-related lectin) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier.In a second aspect, the present invention relates to a jacalin-related lectin for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal.

Das Jacalin-ähnliche Lectin ist hierbei insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mannose-spezifischen und Glucose-spezifischen Lectinen.The jacalin-like lectin is selected in particular from the group consisting of mannose-specific and glucose-specific lectins.

Besonders bevorzugt ist das Jacalin-ähnliche Lectin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ananas-Lectin (jacalin-related lectin aus Ananas comosus (AcmJRL)), Jacalin, Artocarpin Lectin MPA Heituba lectin Agglutinin, Griffithsin, sowie Mischungen und Kombinationen hiervon.The jacalin-like lectin is particularly preferably selected from the group consisting of pineapple lectin (jacalin-related lectin from Ananas comosus (AcmJRL)), jacalin, artocarpine lectin MPA Heituba lectin agglutinin, Griffithsin, and mixtures and combinations thereof.

Zudem betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem dritten Aspekt ein Kombinationspräparat, enthaltend mindestens eine Bromelain-Protease sowie mindestens ein Jacalin-ähnliches Lectin (Jacalin-related lectin) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virus-infektionen in einem Mensch oder Tier.In addition, according to a third aspect, the present invention relates to a combination preparation containing at least one bromelain protease and at least one jacalin-like lectin for use in the treatment or prophylaxis of virus infections in a human or animal.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Gewichtsverhältnis der Gesamtheit der mindestens einen Bromelain-Protease zur Gesamtheit des mindestens einen Jacalin-ähnlichen Lectins (Jacalin-related lectin) von 50 : 50 bis 0,1 : 99,9, bevorzugt 40 : 60 bis 1 : 99, weiter bevorzugt 30 : 70 bis 2 : 98, weiter bevorzugt 20 : 80 bis 3 : 97, besonders bevorzugt 10 : 90 bis 5 : 95.In a preferred embodiment, the weight ratio of the total of the at least one bromelain protease to the total of the at least one jacalin-related lectin is from 50:50 to 0.1: 99.9, preferably 40:60 to 1: 99, more preferably 30:70 to 2:98, more preferably 20:80 to 3:97, particularly preferably 10:90 to 5:95.

Weiter vorteilhaft beim erfindungsgemäßen Kombinationspräparat ist, dass mindestens eine Bromelain-Protease enthalten ist, bevorzugt die Gesamtkonzentration aller Bromelain-Proteasen im Extrakt oder Kombinationspräparat von 0,01 bis 30,0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0,1 bis 20,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1,0 bis 10,0 Gew.-% beträgt.Another advantage of the combination preparation according to the invention is that it contains at least one bromelain protease, preferably the total concentration of all bromelain proteases in the extract or combination preparation of 0.01 to 30.0% by weight, more preferably 0.1 to 20.0% by weight .-%, particularly preferably from 1.0 to 10.0% by weight.

Zudem ist beim Kombinationspräparat von Vorteil, wenn mindestens ein Jacalin-ähnliches Lectin (Jacalin-related lectin) enthalten ist, bevorzugt die Gesamtkonzentration des mindestens einen Jacalin-ähnlichen Lectins im Extrakt von 0,01 bis 60,0 Gew.-%, weiter bevorzugt 1,5 bis 50,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 2,0 bis 30 Gew.-% beträgt.In addition, with the combination preparation it is advantageous if at least one jacalin-related lectin is contained, preferably the total concentration of the at least one jacalin-like lectin in the extract of 0.01 to 60.0% by weight, more preferred 1.5 to 50.0% by weight, particularly preferably from 2.0 to 30% by weight.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Bromelain-Protease zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier. Bei der Bromelain-Protease handelt es sich insbesondere um eine Bromelain-Protease, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stamm-Bromelain (SBM) (EC 3.4.22.32), Frucht-Bromelain (EC 3.4.22.33) sowie Mischungen und Kombinationen hiervon.In a fourth aspect, the present invention relates to a bromelain protease for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal. The bromelain protease is in particular a bromelain protease selected from the group consisting of parent bromelain (SBM) (EC 3.4.22.32), fruit bromelain (EC 3.4.22.33) and mixtures and combinations thereof.

Bromelain weist neben direkten antiviralen Wirkungen auch systemische Effekte auf, welche insgesamt bei der Behandlung von Virusinfektionen hilfreich sind. Hier sind insbesondere anti-inflammatorische Wirkungen, die eine überschießende Immunreaktion bremsen, anti-ödematöse Effekte, die beispielsweise Ödemen in der Lunge entgegenwirken, sowie gerinnungshemmende Wirkungen anzuführen, welche entzündlich und/oder durch ein überaktives Gerinnungssystem bedingten Thrombosen entgegenwirken.In addition to direct antiviral effects, bromelain also has systemic effects, which are generally helpful in the treatment of viral infections. In particular, anti-inflammatory effects that slow down an excessive immune reaction, anti-edematous effects that counteract edema in the lungs, for example, and anticoagulant effects that counteract inflammatory and / or thrombosis caused by an overactive coagulation system are particularly important.

1973 entdeckten Perlstein & Kezdy in Bromelain Base Powder (BBP), welcher aus dem Stamm der Ananas-Pflanze gewonnen wird, Protease-Inhibitoren ( Perlstein & Kezdy, Struct., Vol. 1, 249-254 ). Diese Protease-Inhibitoren konnten die enzymatische Aktivität der Bromelain-Proteasen aus BBP hemmen.In 1973 Perlstein & Kezdy discovered protease inhibitors in bromelain base powder (BBP), which is obtained from the stem of the pineapple plant ( Perlstein & Kezdy, Struct., Vol. 1, 249-254 ). These protease inhibitors were able to inhibit the enzymatic activity of the bromelain proteases from BBP.

Ursprünglich wurden im Jahr 1973 sieben Isoformen dieser Bromelain-Proteaseinhibitoren beschrieben ( Perlstein & Kezdy., Struct., Vol. 1, 249-254 ). 1975 klärten Reddy et al. die Primärstruktur der Isoform VII vollständig auf und wiesen auf die Mikroheterogenität der sieben isolierten Isoformen hin ( Reddy et al., J. Biol. Chem., Vol. 250, 1741-1750 ).Originally, seven isoforms of these bromelain protease inhibitors were described in 1973 ( Perlstein & Kezdy., Struct., Vol. 1, 249-254 ). In 1975, Reddy et al. the primary structure of isoform VII completely and indicated the microheterogeneity of the seven isolated isoforms ( Reddy et al., J. Biol. Chem., Vol. 250, 1741-1750 ).

Lenarcic et al. klärten 1992 die Primärstruktur eines weiteren Bromelain-Proteaseinhibitoren auf und zeigten auch eine inhibitorische Wirkung gegen Cathepsin L ( Lenarcic et al., Biol. Chem., Vol. 373, 459-464 ). Lenarcic et al. clarified the primary structure of another bromelain protease inhibitor in 1992 and also showed an inhibitory effect against cathepsin L. ( Lenarcic et al., Biol. Chem., Vol. 373, 459-464 ).

Von Hatano et al. wurde die Primär- und Sekundärstruktur von Bromelain-Proteaseinhibitor VI im Jahr 1995 veröffentlicht ( Hatano et al., Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 ). Im darauf folgenden Jahr wurde die Ähnlichkeit von Bromelain-Proteaseinhibitor VI mit dem bereits beschriebenen Bowman-Birk Trypsin-Inhibitor aufgezeigt ( Hatano et al., Biochemistry, Vol. 35, 5379-5384 ). Die Aminosäuresequenzen aller bisher beschriebenen sieben Isoformen der Bromelain-Proteaseinhibitoren wurden schließlich von Hatano et al. im Jahr 1998 veröffentlicht ( Hatano et al., J. Biochem., Vol. 124, 457-461 ). From Hatano et al. became the primary and secondary structure of bromelain protease inhibitor VI in 1995 released ( Hatano et al., Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 ). In the following year, the similarity of bromelain protease inhibitor VI with the Bowman-Birk trypsin inhibitor already described was demonstrated ( Hatano et al., Biochemistry, Vol. 35, 5379-5384 ). The amino acid sequences of all seven isoforms of the bromelain protease inhibitors described so far were finally determined by Hatano et al. in 1998 released ( Hatano et al., J. Biochem., Vol. 124, 457-461 ).

Alle bisher in der Literatur beschriebenen Isolationsverfahren von Bromelain-Proteaseinhibitoren verwenden ein zweistufiges chromatographisches Verfahren. Das grundlegende Prinzip dieser Methode wurde schon im Jahr 1973 von Perlstein & Kezdy publiziert ( Perlstein & Kezdy, Struct., Vol. 1, 249-254 ). In der ersten Dimension, d.h. in dem ersten Reinigungsschritt, wird hierbei das chromatographische Verfahren der Größenausschluss-chromatographie (Size-Exclusion-Chromatography = SEC) appliziert. Mit der SEC lassen sich die im BBP enthaltenen Moleküle aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe voneinander trennen. Insbesondere lassen sich damit die Bromelain-Proteasen (ca. 25 kDa) und die Bromelain-Proteaseinhibitoren (ca. 6 kDa) voneinander trennen.All isolation processes of bromelain protease inhibitors described in the literature so far use a two-stage chromatographic process. The basic principle of this method was already published in 1973 by Perlstein & Kezdy ( Perlstein & Kezdy, Struct., Vol. 1, 249-254 ). In the first dimension, ie in the first purification step, the chromatographic method of size exclusion chromatography (SEC) is applied. With the SEC, the molecules contained in the BBP can be separated from one another due to their different sizes. In particular, the bromelain proteases (approx. 25 kDa) and the bromelain protease inhibitors (approx. 6 kDa) can be separated from one another.

Gemäß dem Verfahren von Perlstein & Kezdy wird in einer zweiten chromatographischen Trennung generell eine Anionenaustauschchromatographie (z. B. eine Weak-Anion-Exchange-Chromatography = WAX) angewandt. Mit dieser Methode gelang Perlstein & Kezdy die Isolation von sieben Bromelain-Proteaseinhibitoren (sieben verschiedene Isoformen) aus BBP.According to the Perlstein & Kezdy method, anion exchange chromatography (e.g. weak anion exchange chromatography = WAX) is generally used in a second chromatographic separation. With this method, Perlstein & Kezdy succeeded in isolating seven bromelain protease inhibitors (seven different isoforms) from BBP.

Bei Verwendung dieses Verfahrens wird von einer Ausbeute von etwa 3 mg der Bromelain-Proteaseinhibitor Isoform VII bzw. 1 mg der Bromelain-Proteaseinhibitor Isoform VI aus 1 g BBP berichtet. ( Reddy et al., Biol. Chem., Vol. 250, 1741-1750; Hatano et al., Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 ).Using this method, a yield of about 3 mg of the bromelain protease inhibitor isoform VII or 1 mg of the bromelain protease inhibitor isoform VI from 1 g of BBP is reported. ( Reddy et al., Biol. Chem., Vol. 250, 1741-1750; Hatano et al., Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 ).

Das von Perlstein & Kezdy publizierte Reinigungsverfahren, das auch als SEC/WAX bezeichnet werden kann, hat den Nachteil, dass die Isolation einer Bromelain-Proteaseinhibitor Isoform in hoher Reinheit bzw. Reinform bisher nicht gelungen ist.The purification process published by Perlstein & Kezdy, which can also be referred to as SEC / WAX, has the disadvantage that the isolation of a bromelain protease inhibitor isoform in high purity or pure form has so far not been successful.

Es herrscht Konsens, dass es sich bei allen bisher gereinigten Bromelain-Proteaseinhibitor-Isoformen tatsächlich um Gemische aus verschiedenen Isoformen von Bromelain-Proteaseinhibitoren handelt ( Hatano et al., Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156 ).There is consensus that all bromelain protease inhibitor isoforms purified so far are actually mixtures of different isoforms of bromelain protease inhibitors ( Hatano et al., Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156 ).

Darüber hinaus ist die Aufskalierung der SEC/WAX-Methode in den industriellen Maßstab nicht wirtschaftlich. Maßgeblich ist hierbei die Verwendung der SEC-Methode in der ersten Dimension, d.h. im ersten Reinigungsschritt. Sowohl die Kapazität als auch die Trennleistung der SEC ist im Vergleich zu adsorptionschromatographischen Proteinreinigungsmethoden geringer. Besonders im konkreten Fall wird dies dadurch deutlich, dass Hatano et al. zur Isolation von 1 mg Bromelain-Proteaseinhibitor VI den ersten SEC-Schritt dreimal wiederholt haben, was sogar in diesem kleinen Maßstab (1 g BBP) einen erheblichen Zeitaufwand darstellt ( Hatano et al. 2002, Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 ).In addition, scaling up the SEC / WAX method to an industrial scale is not economical. The decisive factor here is the use of the SEC method in the first dimension, ie in the first cleaning step. Both the capacity and the separation efficiency of the SEC are lower compared to protein purification methods using adsorption chromatography. This is particularly clear in the specific case that Hatano et al. have repeated the first SEC step three times to isolate 1 mg bromelain protease inhibitor VI, which is a considerable expenditure of time even on this small scale (1 g BBP) ( Hatano et al. 2002, Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 ).

Da im Allgemeinen drei chromatographische Schritte als wirtschaftliche Obergrenze angesehen werden, ist die wiederholte SEC-Chromatographie für eine industrielle Anwendung unwirtschaftlich. Um mit der SEC/WAX-Methode beispielsweise eine Ausbeute von ca. 1 g Bromelain-Proteaseinhibitor-Gemisch zu erhalten, müsste eine SEC-Säule mit einem Volumen von ca. 100 Litern eingesetzt werden. Folglich ist das SEC/WAX-Verfahren sowohl aus materialtechnischer als auch zeitökonomischer Sicht unwirtschaftlich und für die gewerbliche Anwendung uninteressant.Since three chromatographic steps are generally considered to be the economical upper limit, repeated SEC chromatography is uneconomical for industrial use. In order to obtain a yield of approx. 1 g of bromelain-protease inhibitor mixture with the SEC / WAX method, for example, an SEC column with a volume of approx. 100 liters would have to be used. As a result, the SEC / WAX process is uneconomical in terms of both material technology and time and is of no interest for commercial use.

Im Fall der Reinigung von Bromelain-Proteasen sind in der Literatur verschiedene Methoden beschrieben ( Rowan et al., Arch. Biochem. Biophys., Vol. 267, 262-270; Harrach et al., Protein Chem., Vol. 14, 41-52 ).In the case of the purification of bromelain proteases, various methods are described in the literature ( Rowan et al., Arch. Biochem. Biophys., Vol. 267, 262-270; Harrach et al., Protein Chem., Vol. 14, 41-52 ).

Es war daher ebenso Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Isolation von Bromelain-Proteaseinhibitoren und Bromelain-Proteasen und darüber hinaus ein Bromelain-Proteaseinhibitor- und ein Bromelain-Protease-Gemisch in hoher Reinheit und angereicherter biologischer Aktivität bereitzustellen.It was therefore also an object of the present invention to provide an improved method for isolating bromelain protease inhibitors and bromelain proteases and, moreover, a bromelain protease inhibitor and a bromelain protease mixture in high purity and enriched biological activity.

Die Erfindung betrifft somit in einem fünften Aspekt einen Bromelain-Proteaseinhibitor enthaltend oder bestehend aus mindestens einem Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 90%, bevorzugt 95%, besonders bevorzugt 100%, identisch mit einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1-7 ist, wobei das mindestens eine Peptid bevorzugt eine Reinheit von mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 95% aufweist, zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier.The invention thus relates in a fifth aspect to a bromelain protease inhibitor containing or consisting of at least one peptide with an amino acid sequence which is at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, identical to one of the sequences from SEQ ID NO: 1-7 is, wherein the at least one peptide preferably has a purity of at least 80%, particularly preferably at least 95%, for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal.

Erfindungsgemäß wird ebenso ein Verfahren zur Reinigung von mindestens einem Bromelain-Proteaseinhibitor bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine wässrige Lösung enthaltend einen gelösten Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze bei einem pH-Wert im Bereich von pH 6,5 bis 9,5 über Kationenaustauschchromatographie gereinigt wird, wobei das Kationenaustauschermaterial bei einem pH-Wert in diesem Bereich Bromelain-Proteasen bindet und der Durchlauf der Chromatographie mindestens einen Bromelain-Proteaseinhibitor enthält.According to the invention, a method for purifying at least one bromelain protease inhibitor is also provided, which is characterized in that an aqueous solution containing a dissolved extract from the stem of the pineapple plant at a pH in the range of pH 6.5 to 9.5 is purified by means of cation exchange chromatography, the cation exchange material binding bromelain proteases at a pH in this range and the run of the chromatography containing at least one bromelain protease inhibitor.

Optional enthält die wässrige Lösung und/oder weitere Lösungen, welche in der Kationenaustauscherchromatographie verwendet werden können (z. B. ein Elutionspuffer), eine Puffersubstanz, welche in einem Bereich von pH 6,5 bis 9,5 Pufferwirkung aufweist.The aqueous solution and / or further solutions which can be used in cation exchange chromatography (e.g. an elution buffer) optionally contain a buffer substance which has a buffer effect in a range from pH 6.5 to 9.5.

Für eine hohe Kapazität und Trennleistung kann eine starke oder schwache Kationenaustauscherchromatographie (SCX oder WCX) verwendet werden d.h. eine Kationenaustauschchromatographie, bei welcher ein starkes oder schwaches Kationenaustauschmaterial verwendet wird.For high capacity and separation efficiency, strong or weak cation exchange chromatography (SCX or WCX) can be used, i.e. cation exchange chromatography in which a strong or weak cation exchange material is used.

Die Pufferbedingungen werden bevorzugt so gewählt, dass bei der Kationenaustauschchromatographie die Bromelain-Proteaseinhibitoren aus dem Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze erst gar nicht an das Kationenaustauschermaterial (Kationenaustauschersäule) binden, aber alle Bromelain-Proteasen binden. Die Bromelain-Proteaseinhibitoren befinden sich folglich im Durchlauf der Kationenaustauschchromatographie, welcher gesammelt und einem weiteren Chromatographieschritt unterzogen werden kann.The buffer conditions are preferably chosen so that in cation exchange chromatography the bromelain protease inhibitors from the extract from the stem of the pineapple plant do not even bind to the cation exchange material (cation exchange column), but do bind all the bromelain proteases. The bromelain protease inhibitors are therefore in the process of cation exchange chromatography, which can be collected and subjected to a further chromatography step.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pufferbedingungen so gewählt, dass die Kationenaustauschchromatographie bei einem pH-Wert von 7.0-9.5 durchgeführt wird. Beispielsweise kann die wässrige Lösung in dem Verfahren eine Puffersubstanz enthalten, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tris, Hepes, Natriumphosphat und/oder Kaliumphosphat. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die wässrige Lösung eine geringe Leitfähigkeit auf. Die Puffersubstanz kann in einer Konzentration von 5-100 mM, bevorzugt 10-50 mM, in der wässrigen Lösung enthalten sein.In a preferred embodiment, the buffer conditions are chosen so that the cation exchange chromatography is carried out at a pH of 7.0-9.5. For example, the aqueous solution in the method can contain a buffer substance which is selected from the group consisting of Tris, Hepes, sodium phosphate and / or potassium phosphate. In a preferred embodiment, the aqueous solution has a low conductivity. The buffer substance can be contained in the aqueous solution in a concentration of 5-100 mM, preferably 10-50 mM.

Die Bromelain-Proteasen, welche an das Kationenaustauschermaterial gebunden sind, können in einem weiteren Schritt von dem Kationenaustauschmaterial gelöst und isoliert werden. Dies kann durch Elution der Bromelain-Proteasen mit einem geeigneten Elutionspuffer geschehen.The bromelain proteases which are bound to the cation exchange material can be detached from the cation exchange material and isolated in a further step. This can be done by eluting the bromelain proteases with a suitable elution buffer.

Die Pufferbedingungen im Elutionspuffer sind so gewählt, dass die Bindung der Bromelain-Proteasen an das Kationenaustauschermaterial aufgehoben wird. Der Puffer kann eine Konzentration von 0,01-1,0 M, bevorzugt 0,10-0,5 M an Salz (z. B. NaCI oder KCI) aufweisen. Alternativ kann die Elution von dem Kationenaustauschermaterial über einen Elutionspuffer mit einem pH erfolgen, welcher höher ist als der pH der wässrigen Lösung bzw. eines Waschpuffers.The buffer conditions in the elution buffer are chosen so that the binding of the bromelain proteases to the cation exchange material is abolished. The buffer can have a concentration of 0.01-1.0 M, preferably 0.10-0.5 M, of salt (e.g. NaCl or KCl). Alternatively, the elution from the cation exchange material can take place via an elution buffer with a pH which is higher than the pH of the aqueous solution or a washing buffer.

Die Elution kann in einem Stufengradienten oder linearen Gradienten erfolgen. Falls mindestens ein weiterer Aufreinigungsschritt der Bromelain-Proteasen vorgesehen ist, wird bevorzugt mit einem linearen Gradienten eluiert. Hierbei werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform einzel-ne Fraktionen des Eluats isoliert. Die Elution in einem Stufengradienten führt zu einem Bromelain-Proteasen-Gemisch mit einer angereicherten biologischen Aktivität im Vergleich zum Bromelain Base Powder.The elution can take place in a step gradient or a linear gradient. If at least one further purification step of the bromelain proteases is provided, elution is preferably carried out with a linear gradient. In a particularly preferred embodiment, individual fractions of the eluate are isolated. The elution in a step gradient leads to a bromelain protease mixture with an enriched biological activity compared to the bromelain base powder.

Das Eluat des Kationenaustauschmaterials enthält Bromelain-Proteasen, welche im Wesentlichen frei von Inhibitoren sind. Hierbei können die Bromelain-Proteasen weniger als 0,5 % (w/w), bevorzugt weniger als 0,2 % (w/w), besonders bevorzugt weniger als 0,1 % (w/w), Bromelain-Proteaseinhibitoren, in Bezug auf die Gesamtpeptidmasse, enthalten. Der Reinheitsgrad der Bromelain-Proteasen kann durch SE-HPLC oder RP-HPLC bestimmt werden.The eluate of the cation exchange material contains bromelain proteases, which are essentially free of inhibitors. The bromelain proteases can contain less than 0.5% (w / w), preferably less than 0.2% (w / w), particularly preferably less than 0.1% (w / w), bromelain protease inhibitors in In relation to the total peptide mass. The degree of purity of the bromelain proteases can be determined by SE-HPLC or RP-HPLC.

Falls die Bromelain-Proteaseinhibitoren weiter aufgereinigt werden sollen, kann in einem nachfolgenden zweiten Schritt der Durchlauf des Kationenaustauschermaterials, welcher Bromelain-Proteaseinhibitoren enthält, über Anionenaustauscherchromatographie (AX), Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Reversed-Phase-HPLC (RP-HPLC) oder Gelfiltrations-Chromatographie (SEC) gereinigt werden.If the bromelain protease inhibitors are to be purified further, the cation exchange material, which contains bromelain protease inhibitors, can be passed through in a subsequent second step via anion exchange chromatography (AX), hydrophobic interaction chromatography (HIC), reversed-phase HPLC (RP-HPLC) or Gel Filtration Chromatography (SEC) purified.

Die Pufferbedingungen können hier so gewählt werden, dass mindestens ein Bromelain-Proteaseinhibitor an das Anionenaustauschermaterial, das Material der hydrophoben Interaktionschromatographie oder das Material der Reversed-Phase-HPLC bindet und dann isoliert wird. Außer bei der SEC geschieht die Isolation bevorzugt dadurch, dass mit Puffer gewaschen und anschließend mit einem weiteren Puffer eluiert wird. Bei der SEC ist dieser Schritt nicht erforderlich, da die Bromelain-Proteaseinibitoren gar nicht an das SEC-Chromatographiematerial binden. Für die jeweiligen Materialien sind dem Fachmann geeignete Pufferbedingungen (für die Bindung, das Waschen und/oder die Elution von Peptiden bzw. Proteinen) aus dem Stand der Technik bekannt.The buffer conditions can be chosen here so that at least one bromelain protease inhibitor binds to the anion exchange material, the material of the hydrophobic interaction chromatography or the material of the reversed-phase HPLC and is then isolated. Apart from SEC, the isolation is preferably done by washing with buffer and then eluting with another buffer. This step is not necessary with SEC, since the bromelain protease inhibitors do not bind to the SEC chromatography material at all. Suitable buffer conditions (for binding, washing and / or eluting peptides or proteins) for the respective materials are known to the person skilled in the art from the prior art.

Der Begriff „Waschen“ ist dem Fachmann bekannt. Bevorzugt ist unter „Waschen“ das Kontaktieren des Chromatographiematerials mit einem Puffer zu verstehen, welcher die Bindung von unerwünschtem Material an die Chromatographiesäule abschwächt, besonders bevorzugt ganz aufhebt, während die Bindung der Bromelain-Proteaseinhibitoren an das Chromatographiematerial erhalten bleibt.The term “washing” is known to the person skilled in the art. "Washing" is preferably to be understood as the contacting of the chromatography material with a buffer which weakens the binding of undesired material to the chromatography column, particularly preferably completely removes it, while the binding of the bromelain Protease inhibitors are retained on the chromatography material.

Die Elution kann mit einem Stufengradienten oder linearen Gradienten erfolgen, wobei das Eluat optional in einzelnen Fraktionen gesammelt wird.The elution can take place with a step gradient or a linear gradient, with the eluate optionally being collected in individual fractions.

Je nach erforderlicher Qualität der Bromelain-Proteaseinhibitoren kann im Anschluss an den zweiten Schritt noch ein dritter Chromatographieschritt durchgeführt werden. In diesem dritten Schritt erfolgt eine weitere Aufreinigung, in welcher mindestens ein isolierter Bromelain-Proteaseinhibitor über RP-HPLC, Anionenaustauschchromatographie (AX) oder Gelfiltrations-Chromatographie (SEC), gereinigt wird, wobei die Pufferbedingungen so gewählt werden, dass mindestens ein Bromelain-Proteaseinhibitor an das Material der Reversed-Phase-HPLC oder das Anionenaustauschermaterial bindet und dann isoliert wird. Außer bei der SEC geschieht die Isolation bevorzugt dadurch, dass zunächst mit Puffer gewaschen und anschließend mit einem weiteren Puffer eluiert wird. Da die Bromelain-Proteaseinhibitoren nicht an das SEC-Material binden, ist kein Waschen und Eluieren nötig (es reicht ein Laufpuffer).Depending on the required quality of the bromelain protease inhibitors, a third chromatography step can be carried out after the second step. In this third step, a further purification takes place in which at least one isolated bromelain protease inhibitor is purified via RP-HPLC, anion exchange chromatography (AX) or gel filtration chromatography (SEC), the buffer conditions being chosen so that at least one bromelain protease inhibitor binds to the material of the reversed phase HPLC or the anion exchange material and is then isolated. Apart from SEC, isolation is preferably carried out by first washing with buffer and then eluting with another buffer. Since the bromelain protease inhibitors do not bind to the SEC material, washing and eluting are not necessary (a running buffer is sufficient).

In allen erfindungsgemäßen Verfahren kann das Kationenaustauschermaterial ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus starken und schwachen Kationenaustauschern, das Anionenaustauschermaterial kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus starken und schwachen Anionenaustauschern, das Material der Hydrophoben Interaktionschromatographie kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus linearen, zyklischen, nichtaromatischen und aromatischen Liganden mit einer Kohlenstoffanzahl von C3 bis C20, das Material der RP-HPLC kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus linearen, zyklischen, nichtaromatischen und aromatischen Liganden (bevorzugt linearen Liganden) mit einer Kettenlänge von C4 bis C18, das Material der Gelfiltrations-Chromatographie kann ein Superdex™-Material sein (z. B. Superdex30Prepgrade von GE Healthcare).In all processes according to the invention, the cation exchange material can be selected from the group consisting of strong and weak cation exchangers, the anion exchange material can be selected from the group consisting of strong and weak anion exchangers, the material of hydrophobic interaction chromatography can be selected from the group consisting of linear, cyclic , non-aromatic and aromatic ligands with a carbon number of C3 to C20, the material of the RP-HPLC can be selected from the group consisting of linear, cyclic, non-aromatic and aromatic ligands (preferably linear ligands) with a chain length of C4 to C18, the material gel filtration chromatography can be a Superdex ™ material (e.g. Superdex30Prepgrade from GE Healthcare).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze um Bromelain Base Powder (BBP).In a preferred embodiment of the method according to the invention, the extract from the stem of the pineapple plant is bromelain base powder (BBP).

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass ein Gemisch an Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen erhalten wird, das frei von anderen Bestandteilen des Extrakts aus dem Stamm der Ananas-Pflanze ist.The advantage of the method according to the invention is that a mixture of bromelain protease inhibitor isoforms is obtained which is free from other constituents of the extract from the stem of the pineapple plant.

Durch das Verfahren ist es möglich, ein Bromelain-Proteaseinhibitor-Gemisch (d.h. die Gesamtheit aller Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen) in einer Ausbeute von etwa 5-30% (w/w) in Bezug auf die Ausgangssubstanz Bromelain Base Powder („BBP“ = kommerziell erhältlicher Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze) bereitzustellen. Da im Stand der Technik Ausbeuten einzelner Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen von 0,1% (w/w) bzw. 0,3% (w/w) berichtet sind, bedeutet dies für das erfindungsgemäße Verfahren eine starke Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik. Folglich ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Bromelain-Proteaseinhibitor-Isoformen aus BBP deutlich effizienter und wirtschaftlicher als Verfahren aus dem Stand der Technik.The process makes it possible to produce a bromelain protease inhibitor mixture (ie the entirety of all bromelain protease inhibitor isoforms) in a yield of around 5-30% (w / w) in relation to the starting substance bromelain base powder ("BBP" = commercially available extract from the stem of the pineapple plant). Since the prior art reports yields of individual bromelain protease inhibitor isoforms of 0.1% (w / w) or 0.3% (w / w), this means a great improvement for the process according to the invention over the prior art. Consequently, the method according to the invention for isolating bromelain protease inhibitor isoforms from BBP is significantly more efficient and more economical than methods from the prior art.

Auch die Bereitstellung von einzelnen, hochreinen Bromelain-Proteaseinhibitor-Isoformen ist möglich. Dies kann dadurch erreicht werden, dass in der zweiten Dimension (= 2. Schritt) eine AX und in der dritten Dimension (= 3. Schritt) eine RP-HPLC Chromatographie gefahren wird. Dadurch können einzelne, hochreine Bromelain-Proteaseinhibitor-Isoformen aus einem Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze isoliert werden.It is also possible to provide individual, highly pure bromelain protease inhibitor isoforms. This can be achieved by running an AX in the second dimension (= 2nd step) and RP-HPLC chromatography in the third dimension (= 3rd step). This enables individual, highly pure bromelain protease inhibitor isoforms to be isolated from an extract from the stem of the pineapple plant.

Die vorliegende Erfindung umfasst einen Bromelain-Proteaseinhibitor enthaltend oder bestehend aus mindestens einem Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 90%, bevorzugt 95%, besonders bevorzugt 100%, identisch ist mit einer der Sequenzen aus SEQ ID NO. 1-7 (Sequenz der bekannten Bromelain-Proteaseinhibitoren I-VII).The present invention comprises a bromelain protease inhibitor containing or consisting of at least one peptide with an amino acid sequence which is at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, identical to one of the sequences from SEQ ID NO. 1-7 (sequence of the known bromelain protease inhibitors I-VII).

Erfindungsgemäß kann das mindestens eine Peptid in dem Bromelain-Proteaseinhibitor (z. B. mindestens eine Isoform eines Bromelain-Proteaseinhibitors) eine Reinheit von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, in Bezug auf kontaminierende Moleküle und andere Bromelain-Protease-Isoformen, aufweisen.According to the invention, the at least one peptide in the bromelain protease inhibitor (e.g. at least one isoform of a bromelain protease inhibitor) can have a purity of at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, with respect to contaminating molecules and other bromelain Protease isoforms.

Ferner kann erfindungsgemäß ein Bromelain-Proteaseinhibitor bereitgestellt werden, welcher ein Gemisch von mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier, Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen ist. Optional kann das Gemisch alle sieben bekannten Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen enthalten (siehe SEQ ID NO. 1-7). Das Gemisch mehrerer Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen hat den Vorteil einer verbesserten Wirkung gegenüber einzelnen Bromelain-Proteaseinhibitor Isoformen, da somit eine größere Bandbreite an molekularen Targets gebunden werden kann.Furthermore, according to the invention, a bromelain protease inhibitor can be provided which is a mixture of at least two, preferably at least three, particularly preferably at least four, bromelain protease inhibitor isoforms. The mixture can optionally contain all seven known bromelain protease inhibitor isoforms (see SEQ ID NO. 1-7). The mixture of several bromelain protease inhibitor isoforms has the advantage of an improved effect compared to individual bromelain protease inhibitor isoforms, since a larger range of molecular targets can thus be bound.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäße Bromelain-Proteaseinhibitor zumindest die Bromelain-Proteaseinhibitor Isoform IV (SEQ ID NO. 4) und/oder die Bromelainprotease Inhibitor Isoform V (SEQ ID NO. 5).In a further preferred embodiment, the bromelain protease inhibitor according to the invention contains at least the bromelain protease inhibitor isoform IV (SEQ ID NO. 4) and / or the bromelain protease inhibitor isoform V (SEQ ID NO. 5).

Das Gemisch kann eine Reinheit von mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, besonders bevorzugt mindestens 95 % aufweisen, bezogen auf das Verhältnis von Bromelain-Proteaseinhibitor(en) zu kontaminierenden Molekülen, welche keine Bromelain-Proteaseinhibitoren sind (z. B. Bromelain-Proteasen).The mixture can have a purity of at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, based on the ratio of bromelain protease inhibitor (s) to contaminated molecules which are not bromelain protease inhibitors (e.g. bromelain Proteases).

Das mindestens eine Peptid in dem erfindungsgemäßen Bromelain-Proteaseinhibitor kann ferner,

  1. a) eine für die Ananas-Pflanze charakteristische post-translationale Modifizierung, bevorzugt Glykosylierung, und/oder
  2. b) keine post-translationale Modifizierung, aufweisen.
The at least one peptide in the bromelain protease inhibitor according to the invention can furthermore
  1. a) a post-translational modification characteristic of the pineapple plant, preferably glycosylation, and / or
  2. b) have no post-translational modification.

Bevorzugt ist der erfindungsgemäße Bromelain-Proteaseinhibitor herstellbar nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.The bromelain protease inhibitor according to the invention can preferably be produced by the process according to the invention.

Der erfindungsgemäße Bromelain-Proteaseinhibitor kann in der Medizin verwendet werden, bevorzugt in der Behandlung und/oder Vorbeugung einer Erkrankung, welche durch verstärkte Expression mindestens einer zellulären Protease, bevorzugt mindestens einer Cysteinprotease, gekennzeichnet ist.The bromelain protease inhibitor according to the invention can be used in medicine, preferably in the treatment and / or prevention of a disease which is characterized by increased expression of at least one cellular protease, preferably at least one cysteine protease.

Zusätzlich umfasst die Erfindung ein Gemisch aus Bromelain-Proteasen, welches weniger als 0,5 % (w/w), bevorzugt weniger als 0,2 % (w/w), besonders bevorzugt weniger als 0,1 % (w/w), Bromelain-Proteaseinhibitoren, in Bezug auf die Gesamtpeptidmasse, enthält. Beispielsweise kann der Fachmann den Restgehalt an Bromelain-Proteaseinhibitoren in einem Gemisch aus Bromelain-Proteasen über analytische SEC- oder RP-HPLC bestimmen.In addition, the invention comprises a mixture of bromelain proteases, which is less than 0.5% (w / w), preferably less than 0.2% (w / w), particularly preferably less than 0.1% (w / w) , Bromelain protease inhibitors in terms of total peptide mass. For example, the person skilled in the art can determine the residual content of bromelain protease inhibitors in a mixture of bromelain proteases via analytical SEC- or RP-HPLC.

Das erfindungsgemäße Bromelain-Proteasen-Gemisch kann gemäß einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden.The bromelain protease mixture according to the invention can be produced according to a variant of the method according to the invention.

Anhand der nachfolgenden Figuren und des nachfolgenden Beispiels soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen.

  • 1: Primärstruktur und molekulare Masse bisher bekannter Isoformen von Bromelain-Proteaseinhibitoren (siehe auch: Hatano et al., (2002) Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156) .
  • 2: Elutionsprofil einer Größenausschlusschromatographie (SEC) mit BBP.
  • 3: Reinigungsprofil einer starken Kationenaustauschchromatographie (SCX) mit BBP.
The subject according to the invention is intended to be explained in more detail with the aid of the following figures and the following example, without wishing to restrict it to the specific embodiments shown here.
  • 1 : Primary structure and molecular mass of previously known isoforms of bromelain protease inhibitors (see also: Hatano et al., (2002) Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156) .
  • 2 : Elution profile of a size exclusion chromatography (SEC) with BBP.
  • 3 : Purification profile of strong cation exchange chromatography (SCX) with BBP.

1 zeigt in tabellarischer Form die Primärstruktur (Aminosäuresequenz) der sieben bekannten Bromelain-Proteaseinhibitoren I, II, III, IV, V, VI und VII. Darüber hinaus ist jeweils für jede Isoform die durchschnittliche und monoisotopische molekulare Masse in Dalton angegeben. 1 shows in tabular form the primary structure (amino acid sequence) of the seven known bromelain protease inhibitors I, II, III, IV, V, VI and VII. In addition, the average and monoisotopic molecular mass is given in daltons for each isoform.

2 zeigt das Elutionsprofil von BBP, welches auf eine präparative SEC aufgetragen wurde. Die y-Achse steht für die Absorptionsstärke bei 280 nm, während die x-Achse das Elutionsvolumen widerspiegelt. Bei dem ersten Signal des Elutionsprofils (1) handelt es sich um eine Komponente aus BBP mit einer molekularen Masse von ca. 24 kDa, welche als Bromelain-Proteasen identifiziert wurden. Bei dem zweiten Signal des Elutionsprofils (2) handelt es sich um eine Komponente aus BBP mit einer molekularen Masse von ca. 6 kDa, welche als ein Gemisch von Bromelain-Protease-Inhibitoren identifiziert wurde. Die beiden Signale bei (3) sind das Ergebnis einer ersten und zweiten Rechromatographie der gepoolten Fraktion des zweiten Signals (2). 2 shows the elution profile of BBP, which was applied to a preparative SEC. The y-axis stands for the absorption strength at 280 nm, while the x-axis reflects the elution volume. The first signal of the elution profile (1) is a component of BBP with a molecular mass of approx. 24 kDa, which has been identified as bromelain proteases. The second signal of the elution profile (2) is a component of BBP with a molecular mass of approx. 6 kDa, which was identified as a mixture of bromelain protease inhibitors. The two signals at (3) are the result of a first and second rechromatography of the pooled fraction of the second signal (2).

3 (a) zeigt das Profil einer Reinigung von BBP über eine starke Kationenaustauschersäule (SCX). Die y-Achse stellt das Absorptionssignal bei 280 nm dar, während die x-Achse das Volumen an Elutionspuffer kennzeichnet. (a) Es tritt ein starkes Signal im Durchlauf der SCX-Säule auf (Signal I.) d.h. Moleküle, welche bei 280 nm absorbieren, binden offensichtlich nicht an die SCX-Säule. Diese Moleküle konnten über SDS-PAGE und Massenspektrometrie als Bromelain-Protease-Inhibitoren identifiziert werden. Bei höherem Volumen an Elutionspuffer und höherer lonenkonzentration (linearer Gradient) tritt ein weiteres Signal auf (Signal II.). Durch SDS-PAGE und Massenspektrometrie konnte die Vermutung bestätigt werden, dass es sich hierbei um Bromelain-Proteasen handelt. (b) Eine Rechromatographie der gepoolten Fraktionen des ersten Signals (Signal I.), also des Durchlaufs der ersten Chromatographie, mit der gleichen SCX-Säule unter den gleichen Bedingungen wie im ersten Lauf demonstriert, dass das zweite Signal (Peak II.) nicht mehr auftritt. Die Bromelain-Proteasen, welche für das zweite Signal verantwortlich sind, konnten somit von den Bromelain-Proteaseinhibitoren getrennt werden. 3 (a) shows the profile of a purification of BBP over a strong cation exchange column (SCX). The y-axis represents the absorption signal at 280 nm, while the x-axis denotes the volume of elution buffer. (a) There is a strong signal as it passes through the SCX column (signal I.) ie molecules which absorb at 280 nm obviously do not bind to the SCX column. These molecules could be identified as bromelain protease inhibitors by SDS-PAGE and mass spectrometry. With a higher volume of elution buffer and a higher ion concentration (linear gradient), a further signal occurs (signal II.). SDS-PAGE and mass spectrometry confirmed the assumption that these are bromelain proteases. (b) Rechromatography of the pooled fractions of the first signal (signal I.), i.e. the run of the first chromatography, with the same SCX column under the same conditions as in the first run demonstrates that the second signal (peak II.) does not occurs more. The bromelain proteases, which are responsible for the second signal, could thus be separated from the bromelain protease inhibitors.

In einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Bromelain-Proteasen-Gemisch, welches weniger als 0,5 % (w/w), bevorzugt weniger als 0,2 % (w/w), besonders bevorzugt weniger als 0.1 % (w/w), Bromelain-Proteaseinhibitoren, in Bezug auf die Gesamtpeptidmasse, enthält, zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier.In a sixth aspect, the present invention relates to a bromelain protease mixture which contains less than 0.5% (w / w), preferably less than 0.2% (w / w), particularly preferably less than 0.1% (w / w), bromelain protease inhibitors, by total peptide mass, for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal.

Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung in einem siebten Aspekt ein durch exogene nicht-enzymatische Glykation entstandenes glykiertes Bromelain-Protein, insbesondere ein glykiertes Jacalin-ähnliches Lectin, eine glykierte Bromelain-Protease, ein glykierter Bromelain-Proteaseinhibitor oder Mischungen hiervon, enthaltend mindestens eine kovalent an das Bromelain-Protein gebundene Zuckereinheit.Furthermore, in a seventh aspect, the present invention relates to a glycation produced by exogenous non-enzymatic glycation glycated bromelain protein, in particular a glycated jacalin-like lectin, a glycated bromelain protease, a glycated bromelain protease inhibitor or mixtures thereof, containing at least one sugar unit covalently bound to the bromelain protein.

Bevorzugt wird das glykierte Bromelain-Protein bei der Behandlung oder Prophylaxe von Viruserkrankungen an einem Mensch oder Tier verwendet.The glycated bromelain protein is preferably used in the treatment or prophylaxis of viral diseases in a human or animal.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform hierzu sieht vor, dass die mindestens eine kovalent an das Bromelain-Protein gebundene Zuckereinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus monomeren oder oligomeren Hexosen, insbesondere Glucose, Galaktose und/oder Mischungen und Kombinationen hiervon.Another preferred embodiment of this provides that the at least one sugar unit covalently bound to the bromelain protein is selected from the group consisting of monomeric or oligomeric hexoses, in particular glucose, galactose and / or mixtures and combinations thereof.

Insbesondere sind 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5, besonders bevorzugt 1, 2 oder 3 Zuckereinheiten an das Bromelain-Protein kovalent gebunden sind, gebunden durch eine Maillard-Reaktion.In particular, 1 to 10, preferably 1 to 5, particularly preferably 1, 2 or 3 sugar units are covalently bound to the bromelain protein, bound by a Maillard reaction.

Das zuvor genannte glykierte Bromelain-Protein ist insbesondere herstellbar durch Mischen mindestens eines Bromelain-Proteins mit mindestens einem reduzierenden Zucker und Durchführung einer Maillard-Reaktion.The aforementioned glycated bromelain protein can in particular be produced by mixing at least one bromelain protein with at least one reducing sugar and performing a Maillard reaction.

Bei sämtlichen der zuvor genannten Aspekte der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, wenn diese zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen durch behüllte oder unbehüllte Viren, insbesondere Coronaviren, Adenoviren, Rhinoviren, Influenzaviren, Parainfluenzaviren, Herpesviren, Respiratory-Syncytial-Viren, Morbilliviren, Rubulaviren, HIV, Ebola-Viren, West-Nil-Virus und/oder Lassaviren, Zika-Virus angewandt werden.In all of the aforementioned aspects of the present invention, it is advantageous if these are used in the treatment or prophylaxis of infections caused by enveloped or non-enveloped viruses, in particular coronaviruses, adenoviruses, rhinoviruses, influenza viruses, parainfluenza viruses, herpes viruses, respiratory syncytial viruses, morbilliviruses , Rubula virus, HIV, Ebola virus, West Nile virus and / or Lassavirus, Zika virus can be used.

Beispielsweise kann das Coronavirus ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Orthocoronavirinae, bevorzugt Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus oder Deltacoronavirus sowie Letovirinae, bevorzugt Alphaletovirus, insbesondere Milecovirus, z. B. Microhyla letovirus 1 (MLeV-1).For example, the coronavirus can be selected from the group consisting of Orthocoronavirinae, preferably Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus or Deltacoronavirus and Letovirinae, preferably Alphaletovirus, in particular Milecovirus, z. B. Microhyla letovirus 1 (MLeV-1).

Die Orthocoronavirinae sind dabei insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend ausThe Orthocoronavirinae are in particular selected from the group consisting of

Alphacoronavirinae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Colacovirus, wie z. B. Bat coronavirus CDPHE15; Decacovirus, wie z. B. Rhinolophus ferrumequinum alphacoronavirus HuB-2013; Duvinacovirus, wie z. B. Humanes Coronavirus 229E (eng. Human coronavirus 229E, HCoV-229E); Luchacovirus, wie z. B. Lucheng Rn rat coronavirus; Minacovirus, wie z. B. Ferret coronavirus oder Mink coronavirus 1; Minunacovirus, wie z. B. Miniopterus bat coronavirus 1 oder Miniopterus bat coronavirusHKU8; Myotacovirus, wie z. B. Myotis ricketti alphacoronavirus Sax-2011 oder Nyctalus velutinus alphacoronavirus SC-2013; Pedacovirus, wie z. B. Porzines Epidemische-Diarrhoe-Virus (eng. Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) oder Scotophilus bat coronavirus512; Rhinacovirus, wie z. B. Rhinolophus bat coronavirusHKU2 oder Swine Acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus (SADS-CoV); Setracovirus, wie z. B. Human coronavirus NL63 (HCov-NL63) oder NL63-related bat coronavirus strain BtKYNL63-9b; Tegacovirus, wie z. B. Alphacoronavirus 1, insbesondere Canines Coronavirus (eng. Canine coronavirus, CCoV), Felines Coronavirus (Feline coronavirus, FCoV), oder Transmissible-Gastroenteritis-Virus (TGEV);Alphacoronavirinae selected from the group consisting of Colacovirus, such as. B. Bat coronavirus CDPHE15; Decacovirus, such as B. Rhinolophus ferrumequinum alphacoronavirus HuB-2013; Duvinacovirus, such as B. Human coronavirus 229E (Eng. Human coronavirus 229E, HCoV-229E); Luchacovirus such as B. Lucheng Rn rat coronavirus; Minacovirus such as B. Ferret coronavirus or Mink coronavirus 1; Minunacovirus such as B. Miniopterus bat coronavirus 1 or Miniopterus bat coronavirus HKU8; Myotacovirus, such as B. Myotis ricketti alphacoronavirus Sax-2011 or Nyctalus velutinus alphacoronavirus SC-2013; Pedacovirus such as B. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) or Scotophilus bat coronavirus512; Rhinacovirus such as B. Rhinolophus bat coronavirusHKU2 or Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus (SADS-CoV); Setracovirus, such as B. Human coronavirus NL63 (HCov-NL63) or NL63-related bat coronavirus strain BtKYNL63-9b; Tegacovirus such as B. Alphacoronavirus 1, in particular canine coronavirus (canine coronavirus, CCoV), feline coronavirus (feline coronavirus, FCoV), or transmissible gastroenteritis virus (TGEV);

Betacoronavirinae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Embecovirus, wie z. B. Betacoronavirus 1, insbesondere Bovines Coronavirus (BCoV), Equines Coronavirus (ECoV-NC99), Humanes Coronavirus OC43 (HCoV-OC43), Porzines hämagglutinierendes Enzephalomyelitis-Virus (HEV), Puffinosis-Coronavirus (PCoV), Humanes Enterisches Coronavirus (HECoV); China Rattus coronavirus HKU24; Human coronavirusHKU1 (HCoV-HKU1), Murine coronavirus, wie z. B. Murines Hepatitis-Virus (eng. Mouse hepatitis virus, MHV) oder Ratten-Coronavirus (RtCoV); Hibecovirus, wie z. B. Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang2013; Merbecovirus (früher MERS-related coronaviruses, MERSr-CoV), wie z. B. Hedgehog coronavirus 1, MERS-Coronavirus (eng. Middle East respiratory syndrome-related coronavirus, MERS-CoV), Pipistrellus bat coronavirusHKU5, Tylonycteris bat coronavirusHKU4; Nobecovirus, wie z. B. Rousettus bat coronavirus GCCDC1 oder Rousettus bat coronavirus HKU9; Sarbecovirus, wie z. B. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus („SARS-assoziiertes Coronavirus“, insbesondere severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV, SARS-Coronavirus, auch SARS-CoV-1), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), oder BatCoV RaTG13, Manis-CoV SRR10168377 und SRR10168378;Betacoronavirinae selected from the group consisting of embecovirus, such as e.g. B. Betacoronavirus 1, especially bovine coronavirus (BCoV), equine coronavirus (ECoV-NC99), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV), puffinosis coronavirus (HECoV), coronavirus (PCoV) ); China Rattus coronavirus HKU24; Human coronavirus HKU1 (HCoV-HKU1), murine coronavirus such as B. Murine hepatitis virus (eng. Mouse hepatitis virus, MHV) or rat coronavirus (RtCoV); Hibecovirus such as B. Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang 2013; Merbecovirus (formerly MERS-related coronaviruses, MERSr-CoV), such as B. Hedgehog coronavirus 1, MERS coronavirus (Middle East respiratory syndrome-related coronavirus, MERS-CoV), Pipistrellus bat coronavirusHKU5, Tylonycteris bat coronavirusHKU4; Nobecovirus, such as B. Rousettus bat coronavirus GCCDC1 or Rousettus bat coronavirus HKU9; Sarbecovirus, such as B. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus ("SARS-associated coronavirus", in particular severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV, SARS-Coronavirus, also SARS-CoV-1), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV -2), or BatCoV RaTG13, Manis-CoV SRR10168377 and SRR10168378;

Gammacoronavirinae ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cegacovirus, wie z. B. Beluga whale coronavirusSW1; oder Igacovirus, wie z. B. Vogel-Coronavirus (eng. Avian coronavirus), insbesondere Truthahn-Coronavirus (TCoV), Fasanen-Coronavirus (PhCoV), Infektiöse-Bronchitis-Virus (IBV); sowieGammacoronavirinae selected from the group consisting of cegacovirus, such as. B. Beluga whale coronavirusSW1; or Igacovirus, such as e.g. B. avian coronavirus, in particular turkey coronavirus (TCoV), pheasant coronavirus (PhCoV), infectious bronchitis virus (IBV); such as

Deltacoronavirinae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Andecovirus, wie z. B. Wigeon coronavirus HKU20; Buldecovirus, wie z. B. Bulbul coronavirus HKU11 (BuCoV HKU11), Coronavirus HKU15, Bronzemännchen-Coronavirus HKU13 (eng. Munia coronavirus HKU13, MunCoV HKU13), White-eye coronavirusHKU16 oder Drossel-Coronavirus HKU12 (eng. Thrush coronavirus HKU12, ThCoV HKU12); Herdecovirus, wie z. B. Night heron coronavirus HKU19; sowie Moordecovirus, wie z. B Common moorhen coronavirus HKU21.Deltacoronavirinae selected from the group consisting of andecovirus, such as e.g. B. Wigeon coronavirus HKU20; Buldecovirus such as B. Bulbul coronavirus HKU11 (BuCoV HKU11), Coronavirus HKU15, Bronzemännchen-Coronavirus HKU13 (Eng.Munia coronavirus HKU13, MunCoV HKU13), White-eye coronavirusHKU16 or Thrush coronavirus HKU12 (Thrush coronavirus HKU12, ThCoV HKU12); Herdecovirus such as B. Night heron coronavirus HKU19; and moor decovirus, such as. B Common moorhen coronavirus HKU21.

Beim zuvor genannten Extrakt bzw. Kombinationspräparat ist es von Vorteil wenn das Gewichtsverhältnis der Gesamtheit der mindestens einen Bromelain-Protease zur Gesamtheit des mindestens einen Jacalin-ähnlichen Lectins (Jacalin-related lectin) von 1 : 99 bis 99,9 : 0,1, bevorzugt 50 : 50 bis 99 : 1, weiter bevorzugt 60 : 40 bis 98 : 2, weiter bevorzugt 70 : 30 bis 97 : 3, weiter bevorzugt 80 : 20 bis 96: 4, besonders bevorzugt 90 : 10 bis 95 : 5 beträgtIn the case of the aforementioned extract or combination preparation, it is advantageous if the weight ratio of the total of the at least one bromelain protease to the total of the at least one jacalin-related lectin is 1:99 to 99.9: 0.1, preferably 50:50 to 99: 1, more preferably 60:40 to 98: 2, more preferably 70:30 to 97: 3, more preferably 80:20 to 96: 4, particularly preferably 90:10 to 95: 5

In den Ansprüchen 15-17 sind die Gewichtsverhältnisse bzw. Mengen von JRL/Bromelain angegeben, wie sie im natürlichen Produkt (Extrakt) vorkommen, bzw. wenn sie in ihrem natürlichen Verhältnis eingesetzt werden. Vorzugsweise ist hierbei eine Bromelain-Protease enthalten, bevorzugt die Gesamtkonzentration aller Bromelain-Proteasen im Extrakt oder Kombinationspräparat von 0,1 bis 80,0 Gew.-%, weiter bevorzugt 1,0 bis 50,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 5,0 bis 20,0 Gew.-% beträgt.Claims 15-17 specify the weight ratios or amounts of JRL / bromelain as they occur in the natural product (extract) or when they are used in their natural ratio. It preferably contains a bromelain protease, preferably the total concentration of all bromelain proteases in the extract or combination preparation from 0.1 to 80.0% by weight, more preferably from 1.0 to 50.0% by weight, particularly preferably from Is 5.0 to 20.0 weight percent.

Weiter von Vorteil ist beim Extrakt oder Kombinationspräparat, wenn mindestens ein Jacalin-ähnliches Lectin (Jacalin-related lectin) enthalten ist, bevorzugt die Gesamtkonzentration des mindestens einen Jacalin-ähnlichen Lectins im Extrakt von 0,01 bis 50,0 Gew.-%, weiter bevorzugt 0,1 bis 10,0 Gew.%, besonders bevorzugt von 2,0 bis 8,0 Gew.-% beträgt.It is also advantageous with the extract or combination preparation if it contains at least one jacalin-like lectin, preferably the total concentration of the at least one jacalin-like lectin in the extract of 0.01 to 50.0% by weight, more preferably 0.1 to 10.0% by weight, particularly preferably from 2.0 to 8.0% by weight.

Bei sämtlichen zuvor genannten Ausführungsformen ist es von Vorteil, wenn diese in Form oder als Bestandteil eines Pulvers, eines Granulats, einer Tablette, insbesondere einer Filmtablette, einer Hartkapsel, einer Weichkapsel, einer Brausetablette, einer Lösung, insbesondere einer Injektionslösung oder einer Infusionslösung, einer Emulsion, einer Suspension, einer Salbe, einer Creme, einer Paste, eines Gels, einer Tinktur, von Augentropfen, eines Inhalationspulvers, eines Nasensprays, eines Suppositoriums, oder eines transdermalen Pflasters enthalten sind.In all of the aforementioned embodiments, it is advantageous if these are in the form or as a component of a powder, granules, a tablet, in particular a film tablet, a hard capsule, a soft capsule, an effervescent tablet, a solution, in particular an injection solution or an infusion solution, a Emulsion, suspension, ointment, cream, paste, gel, tincture, eye drops, inhalable powder, nasal spray, suppository, or transdermal patch.

Bei sämtlichen zuvor genannten Aspekten der vorliegenden Erfindung ist es ebenso von Vorteil, wenn die Applikation des Extrakts, der Bromelain-Protease, des Jacalin-ähnliches Lectins, des Bromelain-Proteaseinhibitors, des Bromelain-Proteasen-Gemischs oder des glykierten Bromelain-Proteins peroral oder oral,
per intravenöser, subkutaner oder intramuskulärer Injektion,
per Infusion auf die Schleimhäute der Nase, des Mundes oder des Rachens, per Inhalation,
per Applikation auf die Augenoberfläche,
rektal, und/oder
mittels eines transdermalen Pflasters
erfolgt.In all of the aforementioned aspects of the present invention, it is also advantageous if the application of the extract, the bromelain protease, the jacalin-like lectin, the bromelain protease inhibitor, the bromelain protease mixture or the glycated bromelain protein orally or orally,
by intravenous, subcutaneous or intramuscular injection,
by infusion on the mucous membranes of the nose, mouth or throat, by inhalation,
by application to the surface of the eye,
rectal, and / or
by means of a transdermal patch
he follows.

Eine weitere beispielhafte Ausführungsform für sämtliche Aspekte der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass die Administration einmal pro Woche bis zu einmal pro Stunde, bevorzugt einmal pro Tag bis 10 mal pro Tag, besonders bevorzugt 1 bis 3 mal pro Tag oder kontinuierlich erfolgt.Another exemplary embodiment for all aspects of the present invention provides that administration takes place once a week up to once an hour, preferably once a day up to 10 times a day, particularly preferably 1 to 3 times a day, or continuously.

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Zitierte Nicht-PatentliteraturNon-patent literature cited

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  • Perlstein & Kezdy., Struct., Vol. 1, 249-254 [0015]Perlstein & Kezdy., Struct., Vol. 1, 249-254 [0015]
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  • Lenarcic et al. klärten 1992 die Primärstruktur eines weiteren Bromelain-Proteaseinhibitoren auf und zeigten auch eine inhibitorische Wirkung gegen Cathepsin L [0016]Lenarcic et al. clarified the primary structure of another bromelain protease inhibitor in 1992 and also showed an inhibitory effect against cathepsin L [0016]
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  • Von Hatano et al. wurde die Primär- und Sekundärstruktur von Bromelain-Proteaseinhibitor VI im Jahr 1995 [0017]From Hatano et al. the primary and secondary structure of bromelain protease inhibitor VI in 1995 [0017]
  • Hatano et al., Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343 [0017]Hatano et al., Eur. J. Biochem., Vol. 232, 335-343.
  • Hatano et al., Biochemistry, Vol. 35, 5379-5384 [0017]Hatano et al., Biochemistry, Vol. 35, 5379-5384 [0017]
  • Hatano et al. im Jahr 1998 [0017]Hatano et al. in 1998 [0017]
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  • Hatano et al., Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156 [0022]Hatano et al., Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156 [0022]
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  • Rowan et al., Arch. Biochem. Biophys., Vol. 267, 262-270; Harrach et al., Protein Chem., Vol. 14, 41-52 [0025]Rowan et al., Arch. Biochem. Biophys., Vol. 267, 262-270; Harrach et al., Protein Chem., Vol. 14, 41-52 [0025]
  • Primärstruktur und molekulare Masse bisher bekannter Isoformen von Bromelain-Proteaseinhibitoren (siehe auch: Hatano et al., (2002) Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156) [0057]Primary structure and molecular mass of previously known isoforms of bromelain protease inhibitors (see also: Hatano et al., (2002) Biol. Chem., Vol. 383, 1151-1156) [0057]

Claims (18)

Bromelain-Proteaseinhibitor enthaltend oder bestehend aus mindestens einem Peptid mit einer Aminosäuresequenz, welche mindestens 90%, bevorzugt 95%, besonders bevorzugt 100%, identisch mit einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1-7 ist, wobei das mindestens eine Peptid bevorzugt eine Reinheit von mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 95% aufweist, zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Virusinfektionen in einem Mensch oder Tier.Bromelain protease inhibitor containing or consisting of at least one peptide with an amino acid sequence which is at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, identical to one of the sequences from SEQ ID NO: 1-7, the at least one peptide preferably being a Having a purity of at least 80%, particularly preferably at least 95%, for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal. Bromelain-Proteaseinhibitor nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Bromelain-Proteaseinhibitor mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier, Peptide enthält, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 90%, bevorzugt 95%, besonders bevorzugt 100%, identisch mit einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1-7 ist.Bromelain protease inhibitor according to the preceding claim, characterized in that the bromelain protease inhibitor contains at least two, preferably at least three, particularly preferably at least four, peptides which have an amino acid sequence that is at least 90%, preferably 95%, particularly preferably 100%, identical with one of the sequences from SEQ ID NO: 1-7. Bromelain-Proteaseinhibitor nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Peptid des Bromelain-Proteaseinhibitors eine für die Ananas-Pflanze charakteristische post-translationale Modifizierung, bevorzugt Glykosylierung, und/oder keine post-translationalen Modifizierung, aufweist.Bromelain protease inhibitor according to one of the two preceding claims, characterized in that at least one peptide of the bromelain protease inhibitor has a post-translational modification, preferably glycosylation, and / or no post-translational modification, which is characteristic of the pineapple plant. Bromelain-Proteaseninhibitor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Infektionen durch behüllte oder unbehüllte Viren, insbesondere Coronaviren, Adenoviren, Rhinoviren, Influenzaviren, Parainfluenzaviren, Herpesviren, Respiratory-Syncytial-Viren, Morbilliviren, Rubulaviren, HIV, Ebola-Viren, West-Nil-Virus und/oder Lassaviren, Zika-Virus.Bromelain protease inhibitor according to one of the preceding claims, for use in the treatment or prophylaxis of infections caused by enveloped or non-enveloped viruses, in particular coronaviruses, adenoviruses, rhinoviruses, influenza viruses, parainfluenza viruses, herpes viruses, respiratory syncytial viruses, HIV, ebulaviruses, rubulaviruses -Viruses, West Nile Virus and / or Lassaviruses, Zika Virus. Bromelain-Proteaseninhibitor nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Coronavirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Orthocoronavirinae, bevorzugt Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus oder Deltacoronavirus sowie Letovirinae, bevorzugt Alphaletovirus, insbesondere Milecovirus, z.B. Microhyla letovirus 1 (MLeV-1).Bromelain protease inhibitor according to the preceding claim, characterized in that the coronavirus is selected from the group consisting of Orthocoronavirinae, preferably Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus or Deltacoronavirus and Letovirinae, preferably Alphaletovirus, in particular Milecovirus, e.g. 1. Bromelain-Proteaseninhibitor nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet dass die Orthocoronavirinae ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alphacoronavirinae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Colacovirus, wie z.B. Bat coronavirusCDPHE15; Decacovirus, wie z.B. Rhinolophus ferrumequinum alphacoronavirus HuB-2013; Duvinacovirus, wie z.B. Humanes Coronavirus 229E (eng. Human coronavirus 229E, HCoV-229E); Luchacovirus, wie z.B. Lucheng Rn rat coronavirus; Minacovirus, wie z.B. Ferret coronavirusoder Mink coronavirus 1; Minunacovirus, wie z.B. Miniopterus bat coronavirus1 oder Miniopterus bat coronavirus HKU8; Myotacovirus, wie z.B. Myotis ricketti alphacoronavirus Sax-2011 oder Nyctalus velutinus alphacoronavirus SC-2013; Pedacovirus, wie z.B. Porzines Epidemische-Diarrhoe-Virus (eng. Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) oder Scotophilus bat coronavirus 512; Rhinacovirus, wie z.B. Rhinolophus bat coronavirus HKU2 oder Swine Acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus (SADS-CoV); Setracovirus, wie z.B. Human coronavirus NL63 (HCov-NL63) oder NL63-related bat coronavirus strain BtKYNL63-9b; Tegacovirus, wie z.B. Alphacoronavirus 1, insbesondere Canines Coronavirus (eng. Canine coronavirus, CCoV), Felines Coronavirus (Feline coronavirus, FCoV), oder Transmissible-Gastroenteritis-Virus (TGEV); Betacoronavirinae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Embecovirus, wie z.B. Betacoronavirus 1, insbesondere Bovines Coronavirus (BCoV), Equines Coronavirus (ECoV-NC99), Humanes Coronaviru OC43 (HCoV-OC43), Porzines hämagglutinierendes Enzephalomyelitis-Virus (HEV), Puffinosis-Coronavirus (PCoV), Humanes Enterisches Coronavirus (HECoV); China Rattus coronavirus HKU24; Human coronavirus HKU1 (HCoV-HKU1), Murine coronavirus, wie z.B. Murines Hepatitis-Virus (eng. Mouse hepatitis virus, MHV) oder Ratten-Coronavirus (RtCoV); Hibecovirus, wie z.B. Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang2013; Merbecovirus (früher MERS-related coronaviruses, MERSr-CoV), wie z.B. Hedgehog coronavirus 1, MERS-Coronavirus (eng. Middle East respiratory syndrome-related coronavirus, MERS-CoV), Pipistrellus bat coronavirus HKU5, Tylonycteris bat coronavirus HKU4; Nobecovirus, wie z.B. Rousettus bat coronavirus GCCDC1 oder Rousettus bat coronavirus HKU9; Sarbecovirus, wie z.B. Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus(„SARS-assoziiertes Coronavirus“, insbesondere severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV, SARS-Coronavirus, auch SARS-CoV-1), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), oder BatCoV RaTG13, Manis-CoV SRR10168377 und SRR10168378; Gammacoronavirinaem ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cegacovirus, wie z.B. Beluga whale coronavirusSW1; oder Igacovirus, wie z.B. Vogel-Coronavirus (eng. Avian coronavirus), insbesondere Truthahn-Coronavirus (TCoV), Fasanen-Coronavirus (PhCoV), Infektiöse-Bronchitis-Virus (IBV); sowie Deltacoronavirinae, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Andecovirus, wie z.B. Wigeon coronavirus HKU20; Buldecovirus, wie z.B. Bulbul coronavirus HKU11 (BuCoV HKU11), Coronavirus HKU15, Bronzemännchen-Coronavirus HKU13 (eng. Munia coronavirus HKU13, MunCoV HKU13), White-eye coronavirus HKU16 oder Drossel-Coronavirus HKU12 (eng. Thrush coronavirus HKU12, ThCoV HKU12); Herdecovirus, wie z.B. Night heron coronavirus HKU19; sowie Moordecovirus, wie z.B Common moorhen coronavirusHKU21.Bromelain protease inhibitor according to the preceding claim, characterized in that the Orthocoronavirinae are selected from the group consisting of Alphacoronavirinae, selected from the group consisting of Colacovirus, such as Bat coronavirusCDPHE15; Decacovirus, such as, for example, Rhinolophus ferrumequinum alphacoronavirus HuB-2013; Duvinacovirus, such as, for example, human coronavirus 229E (eng. Human coronavirus 229E, HCoV-229E); Luchacovirus, such as, for example, Lucheng Rn rat coronavirus; Minacovirus such as Ferret coronavirus or Mink coronavirus 1; Minunacovirus, such as, for example, Miniopterus bat coronavirus1 or Miniopterus bat coronavirus HKU8; Myotacovirus, such as, for example, Myotis ricketti alphacoronavirus Sax-2011 or Nyctalus velutinus alphacoronavirus SC-2013; Pedacovirus, such as, for example, Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) or Scotophilus bat coronavirus 512; Rhinacovirus, such as, for example, Rhinolophus bat coronavirus HKU2 or Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus (SADS-CoV); Setracovirus, such as, for example, Human coronavirus NL63 (HCov-NL63) or NL63-related bat coronavirus strain BtKYNL63-9b; Tegacovirus, such as alphacoronavirus 1, in particular canine coronavirus (canine coronavirus, CCoV), feline coronavirus (feline coronavirus, FCoV), or transmissible gastroenteritis virus (TGEV); Betacoronavirinae, selected from the group consisting of embecovirus, such as Betacoronavirus 1, especially bovine coronavirus (BCoV), equine coronavirus (ECoV-NC99), human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), porcine hemagglutinating virus (HEE) Coronavirus (PCoV), Human Enteric Coronavirus (HECoV); China Rattus coronavirus HKU24; Human coronavirus HKU1 (HCoV-HKU1), murine coronavirus, such as, for example, murine hepatitis virus (mouse hepatitis virus, MHV) or rat coronavirus (RtCoV); Hibecovirus such as Bat Hp-betacoronavirus Zhejiang2013; Merbecovirus (formerly MERS-related coronaviruses, MERSr-CoV), such as Hedgehog coronavirus 1, MERS-Coronavirus (Middle East respiratory syndrome-related coronavirus, MERS-CoV), Pipistrellus bat coronavirus HKU5, Tylonycteris bat coronavirus HKU4; Nobecovirus, such as, for example, Rousettus bat coronavirus GCCDC1 or Rousettus bat coronavirus HKU9; Sarbecovirus, such as Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus ("SARS-associated coronavirus", in particular severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV, SARS-Coronavirus, also SARS-CoV-1), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS -CoV-2), or BatCoV RaTG13, Manis-CoV SRR10168377 and SRR10168378; Gammacoronavirinaem selected from the group consisting of cegacovirus, such as Beluga whale coronavirusSW1; or Igacovirus, such as avian coronavirus, in particular turkey. Coronavirus (TCoV), Pheasant Coronavirus (PhCoV), Infectious Bronchitis Virus (IBV); and Deltacoronavirinae, selected from the group consisting of Andecovirus, such as Wigeon coronavirus HKU20; Buldecovirus, such as Bulbul coronavirus HKU11 (BuCoV) Coronavirus HKU15, Bronzemännchen-Coronavirus HKU13 (Eng.Munia coronavirus HKU13, MunCoV HKU13), White-eye coronavirus HKU16 or Thrush coronavirus HKU12 (Eng.Thrush coronavirus HKU12, ThCoV HKU12); Herdecovirus, such as, for example, Night heron coronavirus HKU19; as well as moor decovirus, such as Common moorhen coronavirusHKU21. Bromelain-Proteaseninhibitor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in Form oder als Bestandteil eines Pulvers, eines Granulats, einer Tablette, insbesondere einer Filmtablette, einer Hartkapsel, einer Weichkapsel, einer Brausetablette, einer Lösung, insbesondere einer Injektionslösung oder einer Infusionslösung, einer Emulsion, einer Suspension, einer Salbe, einer Creme, einer Paste, eines Gels, einer Tinktur, von Augentropfen, eines Inhalationspulvers, eines Nasensprays, eines Suppositoriums, oder eines transdermalen Pflasters.Bromelain protease inhibitor according to one of the preceding claims, in the form or as a component of a powder, a granulate, a tablet, in particular a film tablet, a hard capsule, a soft capsule, an effervescent tablet, a solution, in particular an injection solution or an infusion solution, an emulsion, a Suspension, an ointment, a cream, a paste, a gel, a tincture, eye drops, an inhalable powder, a nasal spray, a suppository or a transdermal patch. Bromelain-Proteaseninhibitor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikation des Extrakts, der Bromelain-Protease, des Jacalin-ähnliches Lectins, des Bromelain-Proteaseinhibitors, des Bromelain-Proteasen-Gemischs oder des glykierten Bromelain-Proteins peroral oder oral, per intravenöser, subkutaner oder intramuskulärer Injektion, per Infusion auf die Schleimhäute der Nase, des Mundes oder des Rachens, per Inhalation, per Applikation auf die Augenoberfläche, rektal, und/oder mittels eines transdermalen Pflasters erfolgt.Bromelain protease inhibitor according to one of the preceding claims, characterized in that the application of the extract, the bromelain protease, the jacalin-like lectin, the bromelain protease inhibitor, the bromelain protease mixture or the glycated bromelain protein orally or orally, by intravenous, subcutaneous or intramuscular injection, by infusion onto the mucous membranes of the nose, mouth or throat, by inhalation, by application to the surface of the eye, rectally, and / or by means of a transdermal patch. Bromelain-Proteaseninhibitor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Administration einmal pro Woche bis zu einmal pro Stunde, bevorzugt einmal pro Tag bis 10 mal pro Tag, besonders bevorzugt 1 bis 3 mal pro Tag oder kontinuierlich erfolgt.Bromelain protease inhibitor according to one of the preceding claims, characterized in that the administration takes place once a week up to once an hour, preferably once a day up to 10 times a day, particularly preferably 1 to 3 times a day or continuously. Verfahren zur Aufreinigung mindestens eines Bromelain-Proteaseinhibitors aus einem Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze, bei dem eine wässrige Lösung des Extrakts aus dem Stamm der Ananas-Pflanze bei einem pH-Wert im Bereich von pH 6,5 bis pH 9,5 über Kationenaustauschchromatographie gereinigt wird, wobei das Kationenaustauschermaterial bei einem pH-Wert in diesem Bereich Bromelain-Proteasen bindet und der Durchlauf der Chromatographie mindestens einen Bromelain-Proteaseinhibitor enthält.Process for the purification of at least one bromelain protease inhibitor from an extract from the stem of the pineapple plant, in which an aqueous solution of the extract from the stem of the pineapple plant is at a pH in the range from pH 6.5 to pH 9.5 is purified by cation exchange chromatography, the cation exchange material binding bromelain proteases at a pH in this range and the run of the chromatography containing at least one bromelain protease inhibitor. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass in einem nachfolgenden zweiten Schritt der Durchlauf über Anionenaustauscherchromatographie, Hydrophobe Interaktionschromatographie, RP-HPLC oder Gelfiltrations-Chromatographie gereinigt wird, wobei die Pufferbedingungen so gewählt werden, dass mindestens ein Bromelain-Proteaseinhibitor an das Anionenaustauschermaterial, das Material der Hydrophoben Interaktionschromatographie oder das Material der RP-HPLC bindet und dann isoliert wird.The method according to the preceding claim, characterized in that in a subsequent second step, the run is purified via anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, RP-HPLC or gel filtration chromatography, the buffer conditions being chosen so that at least one bromelain protease inhibitor is attached to the anion exchange material Material of hydrophobic interaction chromatography or the material of RP-HPLC binds and is then isolated. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass in einem dritten Schritt eine weitere Aufreinigung erfolgt, in welcher mindestens ein isolierter Bromelain-Proteaseinhibitor über RP-HPLC, Anionenaustauschchromatographie oder Gelfiltrations-Chromatographie, gereinigt wird, wobei die Pufferbedingungen so gewählt werden, dass mindestens ein Bromelain-Proteaseinhibitor an das Material der RP-HPLC oder das Anionenaustauschermaterial bindet und dann isoliert wird.The method according to the preceding claim, characterized in that a further purification takes place in a third step, in which at least one isolated bromelain protease inhibitor is purified via RP-HPLC, anion exchange chromatography or gel filtration chromatography, the buffer conditions being chosen so that at least one Bromelain protease inhibitor binds to the material of the RP-HPLC or the anion exchange material and is then isolated. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Bromelain-Proteaseinhibitor in einer Reinheit von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, isoliert wird.Method according to one of the Claims 10 until 12th , characterized in that at least one bromelain protease inhibitor is isolated in a purity of at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt die an das Kationenaustauschermaterial gebundenen Bromelain-Proteasen eluiert werden.Procedure according to Claim 10 , characterized in that the bromelain proteases bound to the cation exchange material are eluted in a further step. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Bromelain-Proteasen weniger als 0,5 % (w/w), bevorzugt weniger als 0,2 % (w/w), besonders bevorzugt weniger als 0,1 % (w/w), Bromelain-Proteaseinhibitor, in Bezug auf die Gesamtpeptidmasse, enthalten.Method according to the preceding claim, characterized in that the bromelain proteases are less than 0.5% (w / w), preferably less than 0.2% (w / w), particularly preferably less than 0.1% (w / w ), Bromelain protease inhibitor in terms of total peptide mass. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bromelain-Proteasen mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, besonders bevorzugt mindestens 95%, der ungehemmten Proteaseaktivität aufweisen.Method according to one of the two preceding claims, characterized in that the bromelain proteases have at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%, of the uninhibited protease activity. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Extrakt aus dem Stamm der Ananas-Pflanze um Bromelain Base Powder (BBP) handelt.Method according to one of the Claims 10 until 16 , characterized in that the extract from the stem of the pineapple plant is Bromelain Base Powder (BBP). Bromelain-Proteaseinhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, herstellbar nach einem Verfahren der Ansprüche 10 bis 17.Bromelain protease inhibitor according to one of the Claims 1 until 9 , produced by a method of Claims 10 until 17th .
DE102020004634.7A 2020-06-10 2020-06-10 Bromelain protease inhibitor for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal and methods for purifying a bromelain protease inhibitor Pending DE102020004634A1 (en)

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DE102020004634.7A DE102020004634A1 (en) 2020-06-10 2020-06-10 Bromelain protease inhibitor for use in the treatment or prophylaxis of viral infections in a human or animal and methods for purifying a bromelain protease inhibitor
PCT/EP2021/065709 WO2021250207A1 (en) 2020-06-10 2021-06-10 Bromelain protease, bromelain, jacalin-like lectin, extract from the stem and/or the fruit of a pineapple plant, combination preparation, bromelain protease inhibitor, protein/protease mix, and glycated bromelain protein formed by exogenous non-enzymatic glycation, for use in the treatment or prophylaxis of virus infections caused by coronaviruses in a human or animal
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Von Hatano et al. wurde die Primär- und Sekundärstruktur von Bromelain-Proteaseinhibitor VI im Jahr 1995

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