DE102019219948A1 - Microarray - Google Patents

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Abstract

Mikroarray zum Durchführen von Analysen an mindestens einer Proben, die in Arrayzellen (16, 26) des Mikroarrays (10, 20) aufzunehmen ist, wobei die Arrayzellen (16, 26) in einer Scheibe ausgebildet sind und die Arrayzellen (16, 26) an einer Vorderseite der Scheibe zur Aufnahme der mindestens einen Probe offen und an einer Rückseite der Scheibe abgeschlossen sind, wobei die Arrayzellen (16, 26) im Bereich der Rückseite der Scheibe mit einem hydrophoben und gasdurchlässigen Material abgeschlossen sind.Microarray for performing analyzes on at least one sample which is to be accommodated in array cells (16, 26) of the microarray (10, 20), the array cells (16, 26) being formed in a disk and the array cells (16, 26) on a front side of the disk for receiving the at least one sample are open and closed at a rear side of the disk, the array cells (16, 26) being closed in the area of the rear side of the disk with a hydrophobic and gas-permeable material.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mikroarray, ein Verfahren zum Herstellen eines solchen Mikroarrays und ein Verfahren zum Verwenden eines solchen Mikroarrays.The invention relates to a microarray, a method for producing such a microarray and a method for using such a microarray.

Stand der TechnikState of the art

Unter einem Microarray wird hierin ein Untersuchungssystem, insbesondere ein molekularbiologisches Untersuchungssystem, verstanden, das die parallele Analyse von mehreren, insbesondere mehreren zehn oder mehreren hundert bis tausend, Einzelnachweisen in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials ermöglicht. Es gibt unterschiedliche Arten von Microarrays, die auch als Genchips oder Biochips bezeichnet werden, da diese vergleichbar einem Computerchip viele Informationen auf kleinstem Raum enthalten können. Die Proben bzw. Probenmaterialien werden dabei in Zellen des Mikroarrays, die auch als Trenchzellen bezeichnet werden, eingebracht.A microarray is understood here to mean an examination system, in particular a molecular biological examination system, which enables the parallel analysis of several, in particular several tens or several hundred to thousands, individual records in a small amount of biological sample material. There are different types of microarrays, which are also known as gene chips or biochips, as these can contain a lot of information in a very small space, comparable to a computer chip. The samples or sample materials are introduced into cells of the microarray, which are also referred to as trench cells.

Mikroarrays und insbesondere Silizium-Mikorarrays werden bspw. für die Durchführung von molekularbiologischen Reaktionen, wie bspw. PCR-Reaktionen (PCR: Polymerase Chain Reaction; Polymerase-Kettenreaktion), im Hochmultiplex, d. h. typischerweise mehr als 100 Einzelmerkmale, die parallel amplifiziert und abgeprüft werden, verwendet. Es ist bekannt, solche Mikroarrays auf verschiedene Weise physikalisch und/oder biologisch zu funktionalisieren und in eine Lab-on-Chip-Umgebung zu integrieren.Microarrays and in particular silicon microarrays are used, for example, for carrying out molecular biological reactions, such as, for example, PCR reactions (PCR: polymerase chain reaction), in a highly multiplexed manner, i. H. typically more than 100 individual features, which are amplified and tested in parallel, are used. It is known to functionalize such microarrays physically and / or biologically in various ways and to integrate them into a lab-on-chip environment.

Ein Lab-on-Chip-System (LoC-System) bezeichnet ein mikrofluidisches System, das die gesamte Funktionalität eines makroskopischen Labors auf einem nur plastikkartengroßen Kunststoffsubstrat unterbringt. Mit dieser Technologie lassen sich geringste Probenmengen auf einem einzigen Chip vollständig und automatisch analysieren. Der Transport der Probenflüssigkeit zwischen den verschiedenen Reaktions- und Analysekammern findet mithilfe von Kapillarkräften oder besonders bevorzugt durch aktives Pumpen statt. Aktives Pumpen wird ermöglicht durch elastische Membranen, die durch Beaufschlagung mit mechanischen Kräften oder Drücken wiederum Ventilfunktionen und Pumpfunktionen bereitstellen können. Das erfindungsgemäße Microarray, das auch als Microarray-Chip, bezeichnet wird, ist eine wesentliche Komponente eines solchen Lab-on-Chip Systems.A lab-on-chip system (LoC system) describes a microfluidic system that accommodates the entire functionality of a macroscopic laboratory on a plastic substrate the size of a plastic card. With this technology, the smallest sample quantities can be analyzed completely and automatically on a single chip. The sample liquid is transported between the various reaction and analysis chambers with the help of capillary forces or, particularly preferably, active pumping. Active pumping is made possible by elastic membranes, which can in turn provide valve functions and pumping functions when subjected to mechanical forces or pressures. The microarray according to the invention, which is also referred to as a microarray chip, is an essential component of such a lab-on-chip system.

Ein Problem, das insbesondere im Zusammenhang mit einer Lab-on-Chip-Integration von Mikroarray-Chips auftaucht, ist die zuverlässige und hocheffiziente Befüllung der Mikroarrays, d. h. die Befüllung der Zellen, bspw. mit einem Eluat in einem molekularbiologischen Prozessablauf. Ein Eluat ist ein ausgetragenes Gemisch aus Lösungsmitteln und gelösten Substanzen.A problem that arises particularly in connection with a lab-on-chip integration of microarray chips is the reliable and highly efficient filling of the microarrays, i. E. H. the filling of the cells, for example with an eluate in a molecular biological process. An eluate is a discharged mixture of solvents and dissolved substances.

Hierbei ist zu beachten, dass eine vollständige und gasblasenfreie Befüllung von Mikroarrays in vielen Fällen einen großen Überschuss an Eluat, d. h. an probenhaltiger Reaktionsflüssigkeit, voraussetzt, mit dem das Mikroarray langsam überspült werden muss, um alle Arrayzellen bzw. Trenchzellen zuverlässig und gasblasenfrei mit diesem zu befüllen, wobei regelmäßig nur ein sehr kleiner Teil der Reaktionsflüssigkeit, bspw. in einer Größenordnung von Nanolitern oder einigen zehn Nanolitern pro Arrayzelle, in die Arrayzellen gelangt und der Rest, z. B. in einer Größenordnung von einigen Mikrolitern bzw. einigen 10 Mikrolitern, verworfen werden muss, was einen entsprechend großen Verlust an Probenmaterial, wie bspw. DNA- oder RNA-Stränge, und damit einen Verlust an Empfindlichkeit bzw. Sensitivität bedeutet.It should be noted here that a complete and gas bubble-free filling of microarrays in many cases requires a large excess of eluate, i.e. H. of sample-containing reaction liquid, with which the microarray must be slowly flushed in order to fill all array cells or trench cells with it reliably and without gas bubbles, with only a very small part of the reaction liquid, for example in the order of magnitude of nanoliters or tens of nanoliters per array cell, gets into the array cells and the rest, e.g. B. in an order of magnitude of a few microliters or a few tens of microliters, must be discarded, which means a correspondingly large loss of sample material, such as DNA or RNA strands, and thus a loss of sensitivity or sensitivity.

Unter dem Begriff „effizient“ oder „hocheffizient“ ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass nur minimale Mengen an Probenüberstand nicht in die Arrayzelle gefüllt und somit verworfen werden, so dass ein möglichst großer Teil der Probenmenge in die Arrayzellen gelangt und eine hohe Empfindlichkeit bzw. Sensitivität für den Nachweis des Probenmaterials erreicht werden kann. Gleichzeitig wird die Zuverlässigkeit der Befüllung durch die vorgeschlagenen Maßnahmen signifikant verbessert.In this context, the term “efficient” or “highly efficient” means that only minimal amounts of sample supernatant are not filled into the array cell and are thus discarded, so that as large a portion of the sample as possible gets into the array cells and a high sensitivity or . Sensitivity for the detection of the sample material can be achieved. At the same time, the proposed measures significantly improve the reliability of the filling.

Die Befülleigenschaften solcher Mikroarrays, insbesondere Silizium-Mikroarrays, lassen sich bspw. durch eine Reihe von Maßnahmen einer Oberflächenfunktionalisierung verbessern, um bspw. gezielt lokal hydrophile oder hydrophobe Oberflächeneigenschaften zu erreichen, um auf diese Weise die Probenflüssigkeit gezielt in die Zellen bzw. Mikrokavitäten zu leiten.The filling properties of such microarrays, in particular silicon microarrays, can be improved, for example, by a series of surface functionalization measures in order, for example, to achieve specifically locally hydrophilic or hydrophobic surface properties in order to guide the sample liquid specifically into the cells or microcavities .

Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention

Vor diesem Hintergrund wird ein Mikroarray mit den Merkmalen des Anspruchs 1, ein Verfahren zum Herstellen eines Mikroarrays nach Anspruch 5 und ein Verfahren zum Verwenden eines solchen Mikroarrays gemäß Anspruch 9 vorgestellt. Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und aus der Beschreibung.Against this background, a microarray having the features of claim 1, a method for producing a microarray according to claim 5 and a method for using such a microarray according to claim 9 are presented. Embodiments emerge from the dependent claims and from the description.

Das vorgestellte Mikroarray dient zum Durchführen von Analysen an mindestens einer Probe, die in Arrayzellen des Mikroarrays aufzunehmen ist. Es kann somit eine Probe einer Art bzw. aus einem Material oder es können verschiedene Proben untersucht werden. Die Arrayzellen sind in einer Scheibe ausgebildet, wobei die Arrayzellen an einer Vorderseite der Scheibe zur Aufnahme der mindestens einen Probe offen und an einer Rückseite der Scheibe abgeschlossen sind. Weiterhin sind die Arrayzellen im Bereich der Rückseite der Scheibe mit einem hydrophoben und gasdurchlässigen Material, wie bspw. porösem PTFE (Polytetrafluorethen) oder einem PTFE-Schwamm oder einem Gewebe mit PTFE-Beschichtung, abgeschlossen.The presented microarray is used to carry out analyzes on at least one sample that is to be received in array cells of the microarray. A sample of one type or from a material or different samples can thus be examined. The array cells are formed in a disc, the array cells being open on a front side of the disc for receiving the at least one sample and being closed on a rear side of the disc. Furthermore, the array cells are in the area of the rear side of the pane with a hydrophobic and gas-permeable material such as porous PTFE (polytetrafluoroethene) or a PTFE sponge or a fabric with a PTFE coating.

Zu beachten ist, dass die genannte Scheibe eine beliebige Form, insbesondere einen beliebigen Umrissverlauf haben kann. So kann diese Scheibe einen kreisrunden Umriss haben, dies ist aber nicht erforderlich. Die Scheibe hat eine Oberfläche, die zur Ausbildung der Arrayzellen vorgesehen ist.It should be noted that the said disk can have any shape, in particular any outline. This disc can have a circular outline, but this is not necessary. The disk has a surface which is provided for the formation of the array cells.

Das beschriebene Verfahren zum Herstellen eines Mikroarrays umfasst folgende Schritten:

  • - Einbringen von Kavitäten in eine Scheibe von einer Oberseite der Scheibe her,
  • - Bewirken, dass die Kavitäten im Bereich der Unterseite der Scheibe mit einem hydrophoben und gasdurchlässigen Material abgeschlossen sind.
The described method for producing a microarray comprises the following steps:
  • - Introduction of cavities into a disk from an upper side of the disk,
  • - Causing that the cavities in the area of the underside of the pane are closed with a hydrophobic and gas-permeable material.

Das vorgestellte Mikroarray kann mit einem Verfahren zum Herstellen der hierin beschriebenen Art hergestellt werden.The presented microarray can be produced with a method for producing of the kind described herein.

Auch hier ist zu beachten, dass die Scheibe lediglich in einer Ausgestaltung eine kreisrunde Form hat. Eine Oberfläche der Scheibe ist zur Ausbildung der Arrayzellen vorgesehen.Here, too, it should be noted that the disc has a circular shape in only one embodiment. One surface of the disk is provided for forming the array cells.

Das vorgestellte Verfahren zum Verwenden eines Mikroarrays der hierin beschriebenen Art sieht vor, dass zunächst mindestens eine Probe in die Arrayzellen eingebracht wird. Anschließend werden die Arrayzellen, falls ein Freiraum vorhanden ist, bspw. mit einem perfluorierten Medium, versiegelt.The presented method for using a microarray of the type described herein provides that at least one sample is first introduced into the array cells. The array cells are then sealed, if there is free space, for example with a perfluorinated medium.

Es werden somit hierin Aufbauten von Mikroarrays, insbesondere von Silizium-Mikroarrays, vorgestellt, die eine hocheffiziente Befüllung mit Probenmaterial ermöglichen. Entsprechende Herstellungsprozesse werden beschrieben. Dabei werden Oberflächenfunktionalisierungsprozesse in einem Ausführungsbeispiel kombiniert, um ein insgesamt möglichst gutes Ergebnis zu erzielen. Weiterhin wird ein mikrofluidischer Arbeitsablauf zur Nutzung der vorgestellten Hardware beschrieben.Thus, structures of microarrays, in particular silicon microarrays, are presented here, which allow highly efficient filling with sample material. Corresponding manufacturing processes are described. Surface functionalization processes are combined in one embodiment in order to achieve the best possible result overall. A microfluidic workflow for using the presented hardware is also described.

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen.Further advantages and configurations of the invention emerge from the description and the accompanying drawings.

Es versteht sich, dass die voranstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It goes without saying that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the respectively specified combination, but also in other combinations or on their own, without departing from the scope of the present invention.

FigurenlisteFigure list

  • 1 zeigt eine erste und zweite Ausführungsform des vorgestellten Mikroarrays. 1 shows a first and second embodiment of the presented microarray.
  • 2 zeigt eine dritte und vierte Ausführungsform des vorgestellten Mikroarrays. 2 shows a third and fourth embodiment of the presented microarray.
  • 3 bis 9 zeigen Prozessschritte zur Herstellung eines hierin vorgestellten Mikroarrays. 3 to 9 show process steps for producing a microarray presented herein.
  • 10 zeigt eine dritte und vierte Ausführungsform des vorgestellten Mikroarrays. 10 shows a third and fourth embodiment of the presented microarray.
  • 11 bis 16 zeigen Prozessschritte zur Herstellung eines hierin vorgestellten Mikroarrays. 11 to 16 show process steps for producing a microarray presented herein.

Ausführungsformen der ErfindungEmbodiments of the invention

Die Erfindung ist anhand von Ausführungsformen in den Zeichnungen schematisch dargestellt und wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ausführlich beschrieben.The invention is shown schematically on the basis of embodiments in the drawings and is described in detail below with reference to the drawings.

Die 1 bis 9 beschreiben Designs und Herstellungsprozesse für Silizium-Mikroarrays, mit denen die vorstehend genannten vorteilhaften Eigenschaften erzielt werden können.The 1 to 9 describe designs and manufacturing processes for silicon microarrays with which the aforementioned advantageous properties can be achieved.

1 zeigt eine erste Ausführungsform des vorgestellten Mikroarrays, das insgesamt mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet ist, und eine zweite Ausführungsform des Mikroarrays, das mit der Bezugsziffer 20 bezeichnet ist. 1 shows a first embodiment of the presented microarray, denoted overall by the reference number 10 is denoted, and a second embodiment of the microarray that with the reference number 20th is designated.

Das erste Mikroarray 10 umfasst einen Siliziumwafer 12, dessen Oberfläche 24 durch eine Schicht aus einem Polytetrafluorethylen-artigen Material (PTFE) gebildet ist. Weiterhin sind Arrayzellen 16 und Einlaufbereiche 18 vorgesehen. The first microarray 10 includes a silicon wafer 12th , its surface 24 is formed by a layer of a polytetrafluoroethylene-like material (PTFE). Furthermore, there are array cells 16 and inlet areas 18th intended.

Das zweite Mikroarray 20 umfasst einen Siliziumwafer 22, dessen Oberfläche 14 durch eine Schicht aus PTFE-artigem Material gebildet ist. Weiterhin sind Arrayzellen 26 und Einlaufbereiche 28 vorgesehen.The second microarray 20th includes a silicon wafer 22nd , its surface 14th is formed by a layer of PTFE-like material. Furthermore, there are array cells 26th and inlet areas 28 intended.

Die beiden Mikroarrays 10 und 20 können auch als Mikroarray-Chips bezeichnet werden.The two microarrays 10 and 20th can also be referred to as microarray chips.

Bei den gezeigten Ausführungen werden somit in den Siliziumwafer 12 bzw. 22 zunächst Kavitäten, die später die Arrayzellen bzw. Trenchzellen bilden, eingebracht, bspw. eingeätzt, die von der hydrophoben Oberfläche 14 bzw. 24 und unmittelbar an sie angrenzenden hydrophilen Einlaufbereichen 18 bzw. 28 umgeben sind. Die hydrophobe Oberfläche 14 bzw. 24 ist in hohem Maße wasserabweisend gestaltet durch die Erzeugung einer PTFE-artigen Schicht auf der Oberfläche, welche bspw. durch Fluorinierung einer Lackoberfläche in einem Plasma mittels CF4-Gases (Tetrafluormethan) erreicht wird. Diese Oberfläche 14 bzw. 24 ist sowohl für wässrige als auch für mineralische Ölmedien hochgradig abweisend, jedoch nicht für perfluorierte Flüssigkeiten.In the embodiments shown, the silicon wafer 12th or. 22nd first of all cavities, which later form the array cells or trench cells, are introduced, for example etched in, by the hydrophobic surface 14th or. 24 and immediately adjoining them hydrophilic inlet areas 18th or. 28 are surrounded. The hydrophobic surface 14th or. 24 is designed to be highly water-repellent through the creation of a PTFE-like layer on the surface, which, for example, by fluorinating a lacquer surface in a plasma is achieved by means of CF 4 gas (tetrafluoromethane). This surface 14th or. 24 is highly repellent for both aqueous and mineral oil media, but not for perfluorinated liquids.

Ein wässriges Probenmedium, das den Mikroarry 10 bzw. 20 überspült, wird in die hydrophilen Einlaufbereiche 18 bzw. 28 gezwungen und von dort in die ebenfalls hydrophilen Arrayzellen 16 bzw. 26 eingezogen. Ein erster Pfeil 30 bezeichnet hierzu einen Eluat-Fluss aufwärts, ein zweiter Pfeil 32 bezeichnet einen Bisnonafluortrifluormethylamin-Fluss abwärts.An aqueous sample medium that contains the microarry 10 or. 20th is flooded into the hydrophilic inlet areas 18th or. 28 forced and from there into the likewise hydrophilic array cells 16 or. 26th moved in. A first arrow 30th denotes an upward flow of eluate, a second arrow 32 denotes a downward flow of bisnonafluorotrifluoromethylamine.

Der Freiraum, der auch als Head-Space bezeichnet wird und das Totvolumen bestimmt, über dem Mikroarray 10 bzw. 20 kann minimal gehalten werden, bspw. auf einen Wert von 1 µm oder sogar unterhalb von 1 µm Höhe ausgestaltet sein, um den Verlust an Probenmaterial zu minimieren. Nach dem Befüllen der Arrayzellen 16 bzw. 26 kann der Freiraum mit einem perfluorierten Medium befüllt und die Arrayzellen 16 bzw. 26 damit versiegelt werden.The free space, which is also referred to as head space and determines the dead volume, above the microarray 10 or. 20th can be kept to a minimum, for example designed to a value of 1 µm or even below 1 µm in height, in order to minimize the loss of sample material. After filling the array cells 16 or. 26th the free space can be filled with a perfluorinated medium and the array cells 16 or. 26th be sealed with it.

2 zeigt eine dritte Ausführungsform des vorgestellten Mikroarrays, das insgesamt mit der Bezugsziffer 50 bezeichnet ist, und eine vierte Ausführungsform des Mikroarrays, das mit der Bezugsziffer 60 bezeichnet ist. 2 shows a third embodiment of the presented microarray, denoted overall by the reference number 50 is denoted, and a fourth embodiment of the microarray that with the reference number 60 is designated.

Das dritte Mikroarray 50 umfasst einen Siliziumwafer 52, dessen Oberfläche 54 durch eine Schicht aus PTFE-artigem Material gebildet ist. Weiterhin sind Arrayzellen 56 und Zulaufkanäle 58 vorgesehen.The third microarray 50 includes a silicon wafer 52 , its surface 54 is formed by a layer of PTFE-like material. Furthermore, there are array cells 56 and inlet channels 58 intended.

Das vierte Mikroarray 60 umfasst einen Siliziumwafer 62, dessen Oberfläche 64 durch eine Schicht aus PTFE-artigem Material gebildet ist. Weiterhin sind Arrayzellen 66 und Zulaufkanäle 68 vorgesehen. Ein erster Pfeil 70 bezeichnet einen Eluat-Fluss aufwärts, ein zweiter Pfeil 72 bezeichnet einen Bisnonafluortrifluormethylamin- Fluss abwärts.The fourth microarray 60 includes a silicon wafer 62 , its surface 64 is formed by a layer of PTFE-like material. Furthermore, there are array cells 66 and inlet channels 68 intended. A first arrow 70 indicates an upward flow of eluate, a second arrow 72 denotes a downward flow of bisnonafluorotrifluoromethylamine.

Bei diesen beiden Ausführungen werden in den Siliziumwafer 50 bzw. 60 zunächst Kavitäten, die später die Arrayzellen 56 bzw. 66 bilden, eingebracht bzw. eingeätzt, die von der hydrophoben Oberfläche 54 bzw. 64 und einem Netzwerk von hydrophilen Zulaufkanälen 58 bzw. 68 umgeben sind. Ein wässriges Probenmedium wird durch das hydrophile Kanalnetzwerk, das durch die Zukaufkanäle 58 bzw. 68 gebildet ist, eingesogen bzw. in dieses hineingepumpt und gelangt so in die hydrophilen Arrayzellen 56 bzw. 66. Ist ein expliziter Freiraum über dem Mikroarray 50 bzw. 60 vorgesehen, so kann dieser anschließend wiederum mit einem perfluorierten Medium aufgefüllt und die Arrayzellen 56 bzw. 66 somit versiegelt werden.In these two versions, the silicon wafer 50 or. 60 first cavities, which will later become the array cells 56 or. 66 form, introduced or etched in by the hydrophobic surface 54 or. 64 and a network of hydrophilic inlet channels 58 or. 68 are surrounded. An aqueous sample medium is passed through the hydrophilic channel network, which is created by the additional channels 58 or. 68 is formed, sucked in or pumped into this and thus reaches the hydrophilic array cells 56 or. 66 . Is an explicit space above the microarray 50 or. 60 provided, this can then again be filled with a perfluorinated medium and the array cells 56 or. 66 thus be sealed.

Ist kein Freiraum über dem Mikroarray 50 bzw. 60 vorgesehen, bspw. indem dieser mit einem transparenten Deckel verschlossen oder gegen ein entsprechendes Fenster des Lab-on-Chips gedrückt wird, erübrigt sich diese Versiegelung mit einem perfluorierten Medium auf der Mikroarray-Chipoberseite, da es kein zu versiegelndes Totvolumen über dem Mikroarray 50 bzw. 60 gibt.There is no free space above the microarray 50 or. 60 provided, for example by closing it with a transparent cover or pressing it against a corresponding window of the lab-on-chip, this sealing with a perfluorinated medium on the top of the microarray chip is unnecessary, since there is no dead volume to be sealed above the microarray 50 or. 60 gives.

Im letzteren Fall steht die Probenflüssigkeit dann zwischen den Arrayzellen in dem Netzwerk der Befüllungskanäle, welche sehr flach, z. B. 1 µm hoch oder sogar weniger als 1 µm hoch, gestaltet werden kann, indem auf die Oberfläche der hydrophoben Oberflächenschicht eine Abdeckung geklebt oder mechanisch gegen diese geklemmt werden kann. Die Abdeckung kann auch durch ein Fenster des Lab-on-Chips realisiert sein, bspw. indem der Mikroarray-Chip dagegen geklemmt wird.In the latter case, the sample liquid is then between the array cells in the network of filling channels, which are very flat, e.g. B. 1 micron high or even less than 1 micron high, can be made by gluing a cover on the surface of the hydrophobic surface layer or mechanically clamped against it. The cover can also be implemented through a window in the lab-on-chip, for example by clamping the microarray chip against it.

Die nach folgenden 2 bis 8 zeigen Prozessschritte zur Herstellung eines hierin vorgestellten Mikroarrays.The following 2 to 8th show process steps for producing a microarray presented herein.

3 zeigt eine Siliziumoberfläche 100 einer Scheibe 101 bzw. eines Wafers, die abschnittsweise eine SiO2-Maske 102 mit einer Dicke von 1 µm und darauf einen ersten Fotolack 104 trägt. Die Darstellung zeigt den Zwischenschritt in der Herstellung nach einem ersten Lithografieschritt, bei dem ein Fenster 106 in der SiO2-Maske 102 für eine Arrayzelle geöffnet wurde. 3 shows a silicon surface 100 a disc 101 or a wafer, which has an SiO 2 mask 102 with a thickness of 1 μm in sections and a first photoresist thereon 104 wearing. The illustration shows the intermediate step in the production after a first lithography step in which a window 106 was opened in the SiO 2 mask 102 for an array cell.

4 zeigt die Siliziumoberfläche 100, die abschnittsweise mit einem zweiten Fotolack 120 bedeckt ist. Die Darstellung verdeutlicht einen zweiten Litografieschritt zur Ausbildung eines Silizium-Kanalbereichs 122, der auch als Einlaufbereich ausgebildet sein kann. 4th shows the silicon surface 100 , which are partially covered with a second photoresist 120 is covered. The illustration clarifies a second lithography step for the formation of a silicon channel area 122 , which can also be designed as an inlet area.

5 zeigt den Zwischenschritt nach dem Durchätzen durch den Wafer im Bereich des Fensters 106, so dass eine Trenchzelle 130 entsteht. 5 shows the intermediate step after etching through the wafer in the area of the window 106 so that a trench cell 130 arises.

6 zeigt den nächsten Zwischenschritt nach dem Öffnen der SiO2-Maske 102 in Einlaufbereichen bzw. im Kanalbereich 122. 6th shows the next intermediate step after opening the SiO 2 mask 102 in the inlet areas or in the channel area 122 .

7 zeigt den Zwischenschritt nach dem Fluorieren des Restlacks mittels CF4-Plasmas und dann einer Hydrophilisierung des Siliziums des Wafers bspw. mittels H2O2/H2O-Dampf, PEG usw. In der Darstellung sind Einströmbereiche mit Bezugsziffer 140 bezeichnet. Der zweite Fotolack 120 bildet eine fluorierte, PTFE-artige Oberfläche. 7th shows the intermediate step after fluorination of the residual varnish by means of CF 4 plasma and then hydrophilization of the silicon of the wafer, for example by means of H 2 O 2 / H 2 O vapor, PEG, etc. In the illustration, inflow areas are denoted by reference numbers 140 designated. The second photoresist 120 forms a fluorinated, PTFE-like surface.

8 zeigt den Zwischenschritt nach dem Verbinden der Scheiben- bzw. Waferrückseite mit einer Bodenmatte 150, bspw. aus PTFE-Gewebe oder aus einem PTFE-Schwamm, einem Einspotten des Biocontent und einer Einzelchip-Vereinzellung. 8th shows the intermediate step after connecting the rear side of the wafer or the wafer with a floor mat 150 , for example. Made of PTFE fabric or from a PTFE sponge, a spotting of the biocontent and a single chip isolation.

9 zeigt eine Alternative zum Schritt aus 8. Bei diesem wird ein Stopfen 160, bspw. aus PTFE-Gewebe oder aus einem PTFE-Schwamm, von der Waferrückseite her in die Trenchzelle eingepresst. Es folgt weiterhin ein Einspotten von Biocontent und eine Einzelchip-Vereinzellung. 9 shows an alternative to step out 8th . This is a stopper 160 , for example made of PTFE fabric or a PTFE sponge, pressed into the trench cell from the back of the wafer. This is followed by a spotting of bio content and a single chip singulation.

Ein entscheidendes Funktionselement ist die Entlüftung der Trenchzellen, d. h. die kontrollierte Verdrängung von in den Arrayzellen bzw. Trenchzellen befindlichen Gasvolumina durch die eindringende Probenflüssigkeit. Hierzu ist in bevorzugter Ausgestaltung vorgesehen, die Trenchzellen durch den Wafer bzw. die Waferdicke hindurchzuätzen. Die Waferdicke kann z. B. 380 µm betragen, welche mit dem sogenannten „Bosch-Prozess“ zur Siliziumtiefenstrukturierung problemlos durchätzt werden kann. Zum ausgangsseitigen Abschluss der Trenchzellen wird auf die Waferrückseite ein poröses PTFE-Gewebematerial aufgebracht, z. B. ganzflächig aufgeklebt. Es ist auch möglich und ggf zweckmäßig, dieses poröse PTFE-Gewebematerial in die Trenchzelle einzupressen. Dies kann zum einen mittels einer Pick-and-place-Vorrichtung geschehen, bei der in jede Trenchzelle manuell und sequenziell ein poröser PTFE-Gewebematerialstopfen eingepresst werden kann. Es ist ebenfalls möglich, eine Matte von porösem PTFE-Gewebematerial vorzusehen, die vorstrukturiert ist, z. B. nach Art einer Eierkartonstruktur. Dabei passen Erhebung der Matte exakt zu der Anordnung der Trenchzelle, so dass beim Anpressen der Waferrückseite gegen die eierkartonartige strukturierte PTFE-Gewebematerialmatte die Erhebungen in die Trenchzellen eingepresst werden. Im Anschluss kann man den Überstand an PTFE-Gewebematerial bspw. mittels einer scharfen Klinge abtrennen, so dass die PTFE-Gewebematerialerhebungen in den Trenchzellen verbleiben und die restliche Matte abgeschnitten wird. Alternativ ist es möglich, sog. Sollbruchstellen an den Erhebungen vorzusehen, mit denen die Matte nach dem Einpressen der Erhebungen in die Trenchzellen durch Abscheren kontrolliert abgerissen werden kann.A crucial functional element is the ventilation of the trench cells, i. H. the controlled displacement of gas volumes in the array cells or trench cells by the penetrating sample liquid. For this purpose, a preferred embodiment provides for the trench cells to be etched through the wafer or the wafer thickness. The wafer thickness can e.g. B. 380 µm, which can be easily etched through with the so-called "Bosch process" for deep structuring of silicon. To terminate the trench cells on the output side, a porous PTFE fabric material is applied to the back of the wafer, e.g. B. glued over the entire surface. It is also possible and, if necessary, expedient to press this porous PTFE fabric material into the trench cell. On the one hand, this can be done by means of a pick-and-place device, in which a porous PTFE fabric material plug can be manually and sequentially pressed into each trench cell. It is also possible to provide a mat of porous PTFE fabric material which is pre-structured, e.g. B. in the manner of an egg carton structure. The elevations of the mat exactly match the arrangement of the trench cell, so that when the back of the wafer is pressed against the egg-box-like structured PTFE fabric material mat, the elevations are pressed into the trench cells. The excess of PTFE fabric material can then be cut off, for example by means of a sharp blade, so that the PTFE fabric material bumps remain in the trench cells and the remaining mat is cut off. Alternatively, it is possible to provide so-called predetermined breaking points on the elevations, with which the mat can be torn off in a controlled manner by shearing off after the elevations have been pressed into the trench cells.

Als geeignete PTFE-Gewebematerialien eignet sich bspw. in der Textilindustrie verwendete PTFE-beschichtete textile Gewebe bzw. Fasermaterialien. Ebenfalls geeignet sind Schwämme aus PTFE-Material oder Anordnungen von extrudierten und dadurch porosifizierten PTFE-Filmen. Wesentlich ist nur eine poröse Beschaffenheit und perfluorierte innere Oberflächen der Struktur, um wasserabweisende Eigenschaften zu gewährleisten.Suitable PTFE fabric materials are, for example, PTFE-coated textile fabrics or fiber materials used in the textile industry. Also suitable are sponges made of PTFE material or arrangements of extruded and thereby porosified PTFE films. All that is essential is a porous nature and perfluorinated inner surfaces of the structure in order to ensure water-repellent properties.

Die Funktion dieser porösen PTFE-Stopfen ist die Folgende: Beim Befüllen der Trenchzellen der Mikroarray-Chips verdrängt die eindringende eingesogene oder eingepumte wässrige Probenflüssigkeit das in den Trenchzellen eingeschlossene Gasvolumen. Die hydrophilen Oberflächenwechselwirkungen mit dem hydrophilisierten Silizium verstärken den Effekt des Eindringens der wässrigen Probenflüssigkeit und das Verdrängen des Gasvolumens, das mühelos durch die poröse PTFE-Struktur dringen und so die Trenchzellen nach unten verlassen kann. Es ist einer der bekannten Eigenschaften der genannten PTFE-Gewebe, dass diese atmungsaktiv sind, d. h. Gase und auch Wasserdampf hindurchtreten lassen, wässrige Medien, wie bspw. Regen, jedoch in hohem Maße abweisen und am Durchtritt hindern. Sobald die Flüssigkeitssäule unten am PTFE-Gewebematerial ankommt, stoppt die weitere Propagation der Flüssigkeit, weil die PTFE-Barriere ein unüberwindliches Hindernis für die wässrige Lösung darstellt. Als Grenzwerte findet man in der Literatur, dass bspw. ein PTFE-Gewebe den Durchtritt von Wasser bis zu einem Druck von 0,8 bis 1 bar verhindern kann, das entspricht einer Wassersäule von 8 bis 10 m Höhe.The function of these porous PTFE stoppers is as follows: When the trench cells of the microarray chips are filled, the penetrating, sucked in or pumped-in aqueous sample liquid displaces the volume of gas enclosed in the trench cells. The hydrophilic surface interactions with the hydrophilized silicon intensify the effect of the penetration of the aqueous sample liquid and the displacement of the gas volume, which can easily penetrate through the porous PTFE structure and thus leave the trench cells below. It is one of the well-known properties of the aforementioned PTFE fabrics that they are breathable, i. H. Allow gases and steam to pass through, but repel aqueous media, such as rain, to a large extent and prevent them from passing through. As soon as the liquid column reaches the bottom of the PTFE fabric material, the further propagation of the liquid stops because the PTFE barrier represents an insurmountable obstacle for the aqueous solution. As limit values, one finds in the literature that, for example, a PTFE fabric can prevent the passage of water up to a pressure of 0.8 to 1 bar, which corresponds to a water column of 8 to 10 m in height.

Selbst bei einem Befüllen der Mikroarray-Chips mit Überdruck durch aktives Pumpen lässt sich also das Vordringen der Probenflüssigkeit an der Grenzfläche zum PTFE-Gewebematerial zuverlässig stoppen, sofern der Pumpendruck den Wert von 0,8 bis 1 bar nicht übersteigt.Even when the microarray chips are filled with overpressure by active pumping, the penetration of the sample liquid at the interface with the PTFE fabric material can be reliably stopped, provided the pump pressure does not exceed 0.8 to 1 bar.

Sobald alle Arrayzellen befüllt sind, kann von unterhalb des Mikroarraychips der sogenannte „bottom-space“ mit einer perfluorierten Flüssigkeit oder einem perfluorierten Öl gefüllt werden. Diese perfluorierten Medien befüllen als flüssiges PTFE druckfrei das PTFE-Gewebematerial, das die perfluorierten Flüssigkeiten ohne Widerstand eindringen lässt. Damit werden die Arrayzellen am Boden nun auch gasdicht bzw. wasserdampfdicht verschlossen und somit während der weiteren Reaktionen versiegelt. Die perfluorierte Flüssigkeit stellt dank ihrer hohen Wärmeleitfähigkeit auch einen exzellenten Wärmetransport zwischen Arrayzellen und Umgebung sicher, wenn die Arrayzellen bspw. abwechselnd oder kontinuierlich beheizt und/oder gekühlt werden sollen, etwa für die Durchführung einer PCR. Diese perfluorierten Flüssigkeiten werden in der Technik daher häufig auch als Wärmetauschermedien zur Übertragung von Wärme oder Kälte verwendet, bis hin zum Dampfphasenlöten in der Elektronik. As soon as all the array cells are filled, the so-called "bottom space" can be filled with a perfluorinated liquid or a perfluorinated oil from below the microarray chip. These perfluorinated media fill the PTFE fabric material as liquid PTFE without pressure, which allows the perfluorinated liquids to penetrate without resistance. In this way, the array cells on the bottom are now also closed gas-tight or water-vapor-tight and thus sealed during the further reactions. Thanks to its high thermal conductivity, the perfluorinated liquid also ensures excellent heat transport between the array cells and the environment if the array cells are to be heated and / or cooled alternately or continuously, for example to carry out a PCR. These perfluorinated liquids are therefore often used in technology as heat exchange media for the transfer of heat or cold, up to and including vapor phase soldering in electronics.

Dieses selektive Verhalten der PTFE-Gewebematerialien gegenüber wässrigen Medien einerseits und perfluorierten Medien andererseits erlaubt nicht nur die kontrollierte Befüllung und Versiegelung der Arrayzellen im Lab-on-Chip während eines praktischen molekularbiologischen Prozessablaufs. Darüberhinaus wird auch das Einspotten von Bioreagenzien, wie bspw. Primern und Sonden usw., bei der Biofunktionalisierung vor dem Einbau der Mikroarray-Chips in die Lab-on-Chip-Umgebung erleichtert. Der wässrige Spot mit den erwähnten Bioreagenzien fließt nach dem Einspotten in jede Arrayzelle einfach nach unten, verdrängt dabei vorhandene Gasvolumina und stoppt selbsttätig bei Erreichen des Bodens der Trenchzelle aus porösem PTFE-Gewebematerial, ohne in dieses einzudringen. Somit steht die gesamte Menge an Bioreagenzien in jeder Arrayzelle für die nachfolgenden molekularbiologischen Reaktionen in der Lab-on-Chip-Umgebung zur Verfügung.This selective behavior of the PTFE fabric materials towards aqueous media on the one hand and perfluorinated media on the other hand not only allows the controlled filling and sealing of the array cells in the lab-on-chip during a practical molecular biological process sequence. In addition, the spotting of bio-reagents, such as primers and probes, etc., is made easier during bio-functionalization before the microarray chips are installed in the lab-on-chip environment. The aqueous spot with the mentioned bio-reagents simply flows down into each array cell after being spotted, displacing existing gas volumes and stops automatically when it reaches the bottom of the trench cell made of porous PTFE fabric material without penetrating it. This means that the entire amount of bio-reagents in each array cell is available for the subsequent molecular biological reactions in the lab-on-chip environment.

Desweiteren können zusätzliche biologische oder physikalisch-chemische Funktionalisierungen der Arrayzellen vorgenommen werden, bspw. durch ein Einbringen von Polyethylenglykol oder PEG-haltigen Precursorn, wie z. B. PEG-Silanen, zum Aufwachsen von PEG-ilierten Schichten im Inneren der Trenchzellen oder durch Bedecken des Bioinhalts bzw. Biocontents mit PEG usw.Furthermore, additional biological or physico-chemical functionalizations of the array cells can be carried out, for example by introducing polyethylene glycol or PEG-containing precursors, such as. B. PEG-silanes, for growing PEG-ilated layers inside the trench cells or by covering the bio-content or bio-content with PEG, etc.

Ein molekularbiologischer Prozess im Lab-on-Chip kann wie folgt ablaufen:

  • - Befüllen der Arrayzellen im Lab-on-Chip mit einem wässrigen Eluat oder PCR-Mastermix, welches das zu amplifizierende und nachzuweisende Probenmaterial enthält, entweder über ein entsprechendes nach oben abgedeckeltes Kanalnetzwerk oder über einen minimalen Freiraum bis zu einem Abschlusselement oder einer Kombination aus beiden, solange bis alles Gas aus den Arrayzellen nach unten durch das PTFE-Gewebematerial verdrängt wurde. Dort stoppt die Befüllung mit dem wässrigen Medium automatisch.
  • - Gegebenenfalls Überschichten des Mikroarraychips mit einem perfluorierten Medium, falls der Mikroarraychip oben offen, also unverdeckelt, ist und somit ein minimaler Freiraum vorhanden ist, der somit vorderseitig mit dem perfluorierten Medium befüllt und dadurch versiegelt wird. Bei Vorliegen einer Verdeckelung erübrigt sich diese Maßnahme, weil der Chip ohnehin bereits durch den Deckel versiegelt ist.
  • - Unterschichten des Mikroarraychips mit einem perfluorierten Medium, das in das PTFE-Gewebematerial von der Waferrückseite her eindringt und die Arrayzellen von unten her versiegelt.
  • - Durchführen und Analyse der molekularbiologischen Analysereaktion, z. B. einer qPCR oder einer isothermalen PCR oder einer digitalen PCR. Dabei kann die exzellente Wärmeleitfähigkeit des perfluorierten Mediums von Vorteil sein.
A molecular biological process in the lab-on-chip can proceed as follows:
  • - Filling the array cells in the lab-on-chip with an aqueous eluate or PCR master mix, which contains the sample material to be amplified and detected, either via a corresponding network of channels covered at the top or via a minimal free space up to a closure element or a combination of both until all the gas from the array cells has been displaced downwards through the PTFE fabric material. There the filling with the aqueous medium stops automatically.
  • - If necessary, overlaying the microarray chip with a perfluorinated medium if the microarray chip is open at the top, that is, uncovered, and thus a minimal free space is available, which is thus filled with the perfluorinated medium on the front side and thus sealed. If there is a cover, this measure is unnecessary because the chip is already sealed by the cover.
  • - Underlayers of the microarray chip with a perfluorinated medium that penetrates the PTFE fabric material from the back of the wafer and seals the array cells from below.
  • - Carrying out and analyzing the molecular biological analysis reaction, e.g. B. a qPCR or an isothermal PCR or a digital PCR. The excellent thermal conductivity of the perfluorinated medium can be an advantage here.

Ein möglicher erster Prozessfluss zur Herstellung des Mikroarrays ist nachfolgend aufgezeichnet:

  1. 1. Auf einem Silizium-Wafer wird ganzflächig 1000 nm thermisches Oxid abgeschieden,
  2. 2. Fotolithographie: Fotolackmaske 1 mit Trenchzellen bzw. Arrayzellen,
  3. 3. Übertragen der Fotomaske 1 in thermisches Oxid: Plasmaätzen Oxid(CHF3/Ar,CF4 + C4F8/Ar) oder Nassätzen mit Buffered Oxide Etch (BOE, ein Flusssäure/Ammoniumfluoridgemisch, das in der Halbleiterindustrie zum Ätzen von SiO2 gebräuchlich ist), beide Verfahren stoppen auf Silizium,
  4. 4. Entfernen Fotolackmaske 1,
  5. 5. Fotolithographie: Fotomaske 2 (4 µm dicker Fotolack) mit Trenchzellen und zuführendem Kanalsystem bzw. Einlaufbereichen,
  6. 6. Tieftrenchen der Silizium-Trenchzellen durch den Wafer: Maskierung durch Fotolack 2 und thermisches Oxid, wobei der Fotolack 2 nicht aufgebraucht werden darf: bspw. mit dem sogenannten BOSCH-Deep-Reactive-Ion-Etching-Prozess zum anisotropen Hochratenätzen von Silizium mit SF6/C4F8 alternierend, Lackmaske und Silizium-Oxid, Kanalbereiche sind während des Tieftrenchens durch das Silizium-Oxid abgedeckt,
  7. 7. Übertragen der Fotomaske 2 (= zuführendes Kanalsystem) in das Restoxid durch selektives Plasmaätzen des Oxids (CHF3/Ar, CF4+C4F8/Ar) oder Nassätzen (BOE) mit Stopp auf Silizium: Jetzt ist das Silizium im Kanalbereich freigelegt, ggf. kurzzeitiges Anstrippen des Wafers mit einem O2-Plasma in einem O2-Plasmastripper zur Oberflächenreinigung.
  8. 8. Fluorinierung der Rest-Lackoberfläche mit CF4-Plasma, Fluorterminierung der Lackoberfläche 2 gibt hydrophobe PTFE-artige hochstabile Oberfläche, SiliziumOberfläche wird dabei mit F-Terminierung versehen, die sich nachfolgend durch Kontakt mit Wasser oder geeigneten wässrigen Medien in hydrophile OH-Terminierung konvertieren lässt, siehe Schritt 10,
  9. 9. Waferreinigung nass mit sogenanntem SC1-clean, das ist ein Gemisch aus Ammonika (NH3), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Wasser, welches z. B. Fette und organische Verunreinigungen von der Waferoberfläche ablösen kann. Die PTFE-artige Lackoberfläche bleibt davon unbeeinflusst,
  10. 10. Finale Hydrophilisierung des Siliziums mit H2O2-Dampf, Ausbildung von OH-Gruppen an allen offenen Silizium-Flächen, d. h. evtl. noch verbliebenes Si-F oder Si-H wird vollständig in Si-OH konvertiert. Die PTFE-artige Lackoberfläche bleibt davon unbeeinflusst,
  11. 11. Anfügen einer Bodenmatte aus PTFE-Gewebe oder eines PTFE-Schwamms oder einer porösen PTFE-Gewebematerialstruktur an die Waferrückseite, z. B. durch Ankleben auf die Waferrückseite, oder alternativ Einpressen von Stopfen in die Trenchzellen von der Waferrückseite aus, z. B. ganzflächig mittels EierkartonStruktur und anschließendem Abschneiden des Überstands mit einer Klinge bzw. Abreißen über Sollbruchstellen,
  12. 12. PEG ggf. als selbst-aufgebaute Schicht (self-assembled Monolayer, SAM) aufbringen, bspw. durch PEG-Silane (Trichlorsilane, Trimethoxysilane, Triethoxsilane usw.) aus der Gasphase,
  13. 13. Biocontent in Trenchzellen spotten,
  14. 14. PEG in Trenchzellen über Biocontent spotten,
  15. 15. Mikroarray-Chips ggf. mit transparenter Abdeckung, bspw. Deckglas oder Polymerkappe, abdecken,
  16. 16. Vereinzellung zu Einzelchips, bspw. mit Sägen, Brechen, Mahoh- bzw. Stealth-Dicing, usw.,
  17. 17. Einbau in LoC-Arraykammer,
  18. 18. Befüllen mit Eluat in Richtung gegen die Schwerkraft mithilfe von Druck und hydrophilen Kräften auf der Siliziumoberfläche. Fluorierte Fotolackoberfläche weist Wasser ab und schützt dabei vor Cross-Talk zwischen benachbarten Arrayzellen. Eluat stoppt am Boden der Arrayzellen am hydrophoben PTFE-Gewebe bzw. PTFE-Schwamm: Bis zu Drücken von 0,8 bis 1bar oder 8 bis 10 Meter Wassersäule weisen solche Gewebe jedes Eindringen von wässrigen Medien zurück und lassen nur Gase hindurch bzw. perfluorierte Flüssigkeiten eindringen,
  19. 19. Befüllen des PTFE-Gewebes bzw. PTFE-Schwamms von bzw. auf der Waferrückseite mit perfluoriertem Material (flüssiges PTFE), das vom PTFE-Gewebe bereitwillig aufgenommen wird und die Arrayzellen unterseitig versiegelt und thermisch an die Umgebung anbindet.
A possible first process flow for manufacturing the microarray is shown below:
  1. 1. 1000 nm thermal oxide is deposited over the entire surface of a silicon wafer,
  2. 2. Photolithography: photoresist mask 1 with trench cells or array cells,
  3. 3. Transfer of the photomask 1 in thermal oxide: plasma etching oxide (CHF 3 / Ar, CF 4 + C 4 F 8 / Ar) or wet etching with Buffered Oxide Etch (BOE, a hydrofluoric acid / ammonium fluoride mixture used in the semiconductor industry for etching SiO 2 ), both processes stop on silicon,
  4. 4.Remove photoresist mask 1,
  5. 5. Photolithography: photomask 2 (4 µm thick photoresist) with trench cells and feeding channel system or inlet areas,
  6. 6. Deep trenching of the silicon trench cells through the wafer: Masking by photoresist 2 and thermal oxide, whereby the photoresist 2 must not be used up: e.g. with the so-called BOSCH deep reactive ion etching process for anisotropic high-rate etching of silicon SF 6 / C 4 F 8 alternating, resist mask and silicon oxide, channel areas are covered by silicon oxide during the deep trench,
  7. 7. Transfer of the photo mask 2 (= feeding channel system) into the residual oxide by selective plasma etching of the oxide (CHF 3 / Ar, CF 4 + C 4 F 8 / Ar) or wet etching (BOE) with a stop on silicon: Now the silicon is in Channel area exposed, if necessary briefly brushing the wafer with an O 2 plasma in an O 2 plasma stripper for surface cleaning.
  8. 8. Fluorination of the remaining lacquer surface with CF 4 plasma, fluorine termination of the lacquer surface 2 gives a hydrophobic PTFE-like, highly stable surface, the silicon surface is provided with F-termination, which subsequently becomes hydrophilic OH-termination through contact with water or suitable aqueous media can be converted, see step 10,
  9. 9. Wet wafer cleaning with so-called SC1-clean, which is a mixture of ammonia (NH 3 ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and water, which z. B. can remove grease and organic contaminants from the wafer surface. The PTFE-like paint surface remains unaffected,
  10. 10. Final hydrophilization of the silicon with H 2 O 2 vapor, formation of OH groups on all open silicon surfaces, ie any remaining Si-F or Si-H is completely converted into Si-OH. The PTFE-like paint surface remains unaffected,
  11. 11. Attaching a floor mat made of PTFE fabric or a PTFE sponge or a porous PTFE fabric material structure to the back of the wafer, e.g. B. by gluing onto the back of the wafer, or alternatively by pressing plugs into the trench cells from the back of the wafer, e.g. B. over the whole area by means of an egg carton structure and then cutting off the excess with a blade or tearing it off over predetermined breaking points,
  12. 12. Apply PEG if necessary as a self-assembled monolayer (SAM), e.g. using PEG-silanes (trichlorosilanes, trimethoxysilanes, triethoxsilanes, etc.) from the gas phase,
  13. 13. Mock biocontent in trench cells,
  14. 14. Mock PEG in trench cells about biocontent,
  15. 15. Cover microarray chips, if necessary with a transparent cover, e.g. cover glass or polymer cap,
  16. 16. Singulation into individual chips, e.g. with sawing, breaking, Mahoh or stealth dicing, etc.,
  17. 17. Installation in LoC array chamber,
  18. 18. Filling with eluate in the direction against gravity using pressure and hydrophilic forces on the silicon surface. Fluorinated photoresist surface repels water and protects against cross-talk between neighboring array cells. Eluate stops at the bottom of the array cells on the hydrophobic PTFE fabric or PTFE sponge: Up to pressures of 0.8 to 1 bar or 8 to 10 meters of water column, such fabrics reject any penetration of aqueous media and only allow gases or perfluorinated liquids through penetration,
  19. 19. Filling the PTFE fabric or PTFE sponge from or on the back of the wafer with perfluorinated material (liquid PTFE) that is readily absorbed by the PTFE fabric and seals the array cells on the underside and thermally binds them to the environment.

Falls die Mikroarray-Chip ungedeckelt sind, d. h. ohne Schritt 15:

  • 20. Überschichten des Freiraums mit perfluoriertem Material durch in Richtung der Schwerkraft Pumpen, dadurch wird der Eluatüberschuss durch das Kanalsystem weggespült, ohne Cross-Talk zu anderen benachbarten Arrayzellen zu verursachen. Entfällt, wenn aufgrund der Verdeckelung kein Freiraum vorhanden ist.
If the microarray chips are uncovered, i.e. without step 15:
  • 20. Covering the free space with perfluorinated material by pumping in the direction of gravity, thereby the excess eluate is flushed away through the channel system without causing cross-talk to other neighboring array cells. Not applicable if there is no free space due to the cover.

Es ist auch möglich, auf die perfluorierte Oberflächenfunktionalisierung der Chips zu verzichten und bspw. dort ein Siliziumoxid, ein Siliziumnitrid oder eine Schichtfolge aus Siliziumoxid und Siliziumnitrid aufzubringen und geeignet zu strukturieren. Die Perfluorierung der Oberfläche über den vorstehend beschriebenen Prozessablauf stellt lediglich eine vorteilhafte Ausführungsform dar, die so nicht zwingend umgesetzt sein muss.It is also possible to dispense with the perfluorinated surface functionalization of the chips and, for example, to apply a silicon oxide, a silicon nitride or a layer sequence of silicon oxide and silicon nitride there and structure them appropriately. The perfluorination of the surface via the process sequence described above merely represents an advantageous embodiment that does not necessarily have to be implemented in this way.

Es sind somit vorstehend Ausführungsformen und Herstellungsverfahren für einen Silizium-Mikroarra-Chip sowie ein molekularbiologischer Ablauf, bspw. für eine PCR in einem Lab-on-Chip, beschrieben. Es wird gezeigt, dass durch Einbringen einer porösen gasdurchlässigen hydrophoben Barriere, bspw. in Form eine PTFE-Gewebematerials, in die Arrayzellen des Mikroarray-Chips ein zuverlässiges gasblasenfreies hocheffizientes Befüllen der Arrayzellen mit der Probenlösung erreicht werden kann, d. h. die Verluste an Probenmaterial durch Totvolumina werden minimiert und die Empfindlichkeit beim Nachweis des Probenmaterials wird maximiert. Der Mikroarray-Chip wird nach dem Befüllen mit einem perfluorierten Versiegelungsmedium versiegelt, das von der Rückseite mühelos in das PTFE-Gewebematerial eindringt und dieses verschließt.Embodiments and manufacturing methods for a silicon microarray chip and a molecular biological sequence, for example for a PCR in a lab-on-chip, are thus described above. It is shown that by introducing a porous, gas-permeable hydrophobic barrier, for example in the form of a PTFE fabric material, into the array cells of the microarray chip, a reliable, gas-bubble-free, highly efficient filling of the array cells with the sample solution can be achieved. H. the loss of sample material through dead volumes is minimized and the sensitivity in the detection of the sample material is maximized. After filling, the microarray chip is sealed with a perfluorinated sealing medium that effortlessly penetrates the PTFE fabric material from the back and seals it.

Es werden nachfolgend Ausführungsformen des Verfahrens zum Verwenden eines Mikroarrys vorgestellt, die es gestatten, möglichst effizient und ohne Verlust an Probematerial Silizium-Mikroarrayzellen mit Eluat bzw. wässrigem Probenmaterial zu befüllen und anschließend zu versiegeln. Dieses Versiegeln erfolgt bspw. mit einer perfluorierten Versiegelungsflüssigkeit. Dadurch soll am Ende verhindert werden, dass eine Voramplifikation des Probenmaterials im Sinne einer vorgeschalteten PCR zur Anreicherung des Eluats mit DNA- und RNA-Strängen erforderlich wird.Embodiments of the method for using a microarray are presented below, which allow silicon microarray cells to be filled with eluate or aqueous sample material as efficiently as possible and without loss of sample material and then to be sealed. This sealing takes place, for example, with a perfluorinated sealing liquid. In the end, this is intended to prevent the need for a pre-amplification of the sample material in the sense of an upstream PCR to enrich the eluate with DNA and RNA strands.

Bei Mikroarray-Lösungen des Stands der Technik besteht nämlich der Nachteil, dass in der Regel die Verluste an Probenmaterial so erheblich sind, dass eine solche Voramplifikation bzw. vorgeschaltete PCR erforderlich wird. Eine solche vorgeschaltete PCR bedeutet einen hohen Zusatzaufwand und hohe Zusatzkosten, bedingt Qualitätsrisiken bei der Durchführung sowie anschließender Verdünnung der Voramplifikationslösung vor dem Befüllen des Mikroarray-Chips und kostet in erheblichem Ausmaß zusätzliche Prozesszeit.In microarray solutions of the prior art, there is the disadvantage that, as a rule, the loss of sample material is so significant that such a pre-amplification or upstream PCR is necessary. Such an upstream PCR means a high additional effort and high additional costs, entails quality risks in the implementation and subsequent dilution of the pre-amplification solution before filling the microarray chip and costs a considerable amount of additional process time.

Insbesondere dann, wenn in den Mikroarray-Chips im Interesse der Beschleunigung des Diagnose-Prozesses schnelle isotherme PCR-Verfahren, wie bspw. die rITA-Technologie, zum Einsatz kommen sollen, besteht die Gefahr, den Zeitvorteil der rITA durch die Voramplifikation zumindest teilweise wieder zu verlieren oder sogar insgesamt ungünstiger abzuschneiden als mit einer klassischen qPCR ohne rITA und Mikrochips. Die Verluste an Probenmaterial und daraus resultierend der günstigenfalls erreichbare Limit-of-Detection (DoL) können wie im folgenden Beispiel angegeben abgeschätzt werden.In particular, if fast isothermal PCR methods, such as rITA technology, are to be used in the microarray chips in the interest of accelerating the diagnostic process, there is a risk that the time advantage of the rITA through the preamplification is at least partially restored to lose or even to perform less well overall than with a classic qPCR without rITA and microchips. The loss of sample material and the resulting loss in the most favorable case achievable limit-of-detection (DoL) can be estimated as indicated in the following example.

Es wird zur Illustration dieses Sachverhalts beispielhaft angenommen:

  • 100 Trenchzellen zu jeweils 10 nl Teilvolumen auf einer Chipfläche von 9 mm * 9 mm = 81 mm2;
  • Gesamtprobenvolumen in den Trenchzellen: 100 * 10 nl = 1 µl;
  • Zum Vergleich beträgt das Totvolumen bei 1 µm Freiraum (wobei die Höhe des Freiraums ggf. erhöht oder auch weiter reduziert werden kann): ~ 81 mm2 * 0,001 mm = 0,081 mm3 = 0,081 µl ~ 0,1 µl <<< 1µl (Faktor 10).
To illustrate this, it is assumed as an example:
  • 100 trench cells each with 10 nl partial volumes on a chip area of 9 mm * 9 mm = 81 mm 2 ;
  • Total sample volume in the trench cells: 100 * 10 nl = 1 μl;
  • For comparison, the dead volume with 1 µm free space (whereby the height of the free space can be increased or further reduced if necessary): ~ 81 mm 2 * 0.001 mm = 0.081 mm 3 = 0.081 µl ~ 0.1 µl <<< 1 µl ( Factor 10).

LoD: ein sicherer Start einer PCR oder rITA-Raktion gelingt, wenn in jeder Trenchzelle etwa drei DNA-Stränge landen => LoD etwa 300, nämlich dreimal Anzahl der Trenchzellen des Mikroarray-Cips.LoD: a reliable start of a PCR or rITA reaction succeeds when about three DNA strands land in each trench cell => LoD about 300, namely three times the number of trench cells in the microarray chip.

Für einen Freiraum von ca. 10 µm wäre das Totvolumen entsprechend ca. 1 µl, also in einer zum gesamten Probenvolumen in den Trenchzellen vergleichbaren Größenordnung, was zu einer Verdoppelung des vorstehenden LoD führen kann.For a free space of approx. 10 µm, the dead volume would be approx. 1 µl, ie in an order of magnitude comparable to the total sample volume in the trench cells, which can lead to a doubling of the LoD above.

In allen Fällen, in denen ausreichend Probenmaterial bzw. DNA/RNA-Mengen für einen diagnostischen Nachweis zur Verfügung steht, das ist bspw. bei RTI (respiratory infections), STI (sexually transmitted infections) oder MSRA (methicillin resistant Staph Aureus) der Fall, wird man vorteilhaft von dem Zusatzaufwand, den Zusatzkosten, den Qualitäts- und Prozessrisiken und dem zusätzlichen Zeitbedarf einer Voramplifikation absehen und sich mit LoD in der genannten Größenordnung ohne weiteres zufrieden geben können, d. h. es wird auf eine Voramplifikation bzw. vorgeschaltete PCR verzichtet.In all cases in which sufficient sample material or DNA / RNA quantities are available for diagnostic detection, this is the case, for example, with RTI (respiratory infections), STI (sexually transmitted infections) or MSRA (methicillin resistant staph aureus) , one will advantageously refrain from the additional effort, the additional costs, the quality and process risks and the additional time required for pre-amplification and can be satisfied with LoD in the stated range without further ado, i. H. there is no pre-amplification or upstream PCR.

Es wird hierin nunmehr ein geeignetes Mikroarray, ein Herstellungsprozess und ein biotechnischer Ablauf vorgestellt, mit denen die genannten Vorteile zu erreichen sind.A suitable microarray, a manufacturing process and a biotechnological sequence are now presented here with which the stated advantages can be achieved.

10 bis 18 beschreiben Designs und Herstellungsprozesse für Mikroarrays, insbesondere Silizium-Mikroarrays, mit denen die vorstehend genannten Eigenschaften erreicht werden können. 10 to 18th describe designs and manufacturing processes for microarrays, in particular silicon microarrays, with which the aforementioned properties can be achieved.

10 zeigt eine fünfte Ausführungsform des vorgestellten Mikroarrays, das insgesamt mit der Bezugsziffer 200 bezeichnet ist, und eine sechste Ausführungsform des Mikroarrays, das mit der Bezugsziffer 220 bezeichnet ist. 10 shows a fifth embodiment of the presented microarray, denoted overall by the reference number 200 is denoted, and a sixth embodiment of the microarray that with the reference number 220 is designated.

Das fünfte Mikroarray 200 umfasst einen Siliziumwafer 202, dessen Oberfläche 204 durch eine PTFE-artige Schicht, d. h. aus einem fluorierten Polymer, gebildet ist. Weiterhin sind Arrayzellen 206, Einlaufbereiche 208 und Zulaufkanäle 210 vorgesehen.The fifth microarray 200 includes a silicon wafer 202 , its surface 204 is formed by a PTFE-like layer, ie from a fluorinated polymer. Furthermore, there are array cells 206 , Inlet areas 208 and inlet channels 210 intended.

Das sechste Mikroarray 220 umfasst einen Siliziumwafer 222, dessen Oberfläche 224 durch eine PTFE-artige Schicht gebildet ist. Weiterhin sind Arrayzellen 226, Einlaufbereiche 228 und Zulaufkanäle 228 vorgesehen. Pfeile 230 bezeichnen einen Eluat-Fluss und einen Fluss einer perfluorierten Flüssigkeit aufwärts.The sixth microarray 220 includes a silicon wafer 222 , its surface 224 is formed by a PTFE-like layer. Furthermore, there are array cells 226 , Inlet areas 228 and inlet channels 228 intended. Arrows 230 denote an eluate flow and a flow of a perfluorinated liquid upward.

Die nach folgenden 11 bis 16 zeigen Prozessschritte zur Herstellung eines hierin vorgestellten Mikroarrays.The following 11 to 16 show process steps for producing a microarray presented herein.

11 zeigt eine Siliziumoberfläche 300 einer Scheibe 301 bzw. eines Wafers, die abschnittsweise eine SiO2-Maske 302 mit einer Dicke von 1 µm und darauf einen ersten Fotolack 304 trägt. Die Darstellung zeigt den Zwischenschritt in der Herstellung nach einem ersten Lithografieschritt, bei dem ein Fenster 306 in der SiO2-Maske 302 für eine Arrayzelle geöffnet wurde. 11 shows a silicon surface 300 a disc 301 or a wafer, which has an SiO 2 mask 302 with a thickness of 1 μm in sections and a first photoresist thereon 304 wearing. The illustration shows the intermediate step in the production after a first lithography step in which a window 306 was opened in the SiO 2 mask 302 for an array cell.

12 zeigt die Siliziumoberfläche 100, die abschnittsweise mit einem zweiten Fotolack 320 bedeckt ist. Die Darstellung verdeutlicht einen zweiten Litografieschritt zur Ausbildung eines Silizium-Kanalbereichs 322, der auch als Einlaufbereich ausgebildet sein kann. 12th shows the silicon surface 100 , which are partially covered with a second photoresist 320 is covered. The illustration clarifies a second lithography step for the formation of a silicon channel area 322 , which can also be designed as an inlet area.

13 zeigt den Zwischenschritt nach einem Tieftrenchen im Bereich des Fensters 306, so dass eine Arrayzelle bzw. Trenchzelle 330 entsteht, der Wafer wird hier nicht durchgeätzt. 13th shows the intermediate step after a deep trench in the area of the window 306 so that an array cell or trench cell 330 arises, the wafer is not etched through here.

14 zeigt den nächsten Zwischenschritt nach dem Öffnen der SiO2-Maske 302 mit einer Fotolackmaske 2 in Einlaufbereichen bzw. im Kanalbereich 322 mit CF4 oder C4F8/Ar-Plasma. 14th shows the next intermediate step after opening the SiO 2 mask 302 with a photoresist mask 2 in inlet areas or in the canal area 322 with CF 4 or C 4 F 8 / Ar plasma.

15 zeigt den Zwischenschritt nach Fluorieren des Restlacks im CF4-Plasma (hydrophobe OF) und dann einer Hydrophilisierung des Siliziums, bspw. mittels H2O2/H2O-Dampf, PEG usw. In der Darstellung ist ein hydrophilisierter Einlaufbereich mit Bezugsziffer 340 bezeichnet. Der zweite Fotolack 320 bildet eine fluorierte, PTFE-artige Oberfläche. Das Innere der Trenchzelle 330 ist ebenfalls hydrophilisiert. 15th shows the intermediate step after fluorination of the residual paint in CF 4 plasma (hydrophobic OF) and then hydrophilization of the silicon, for example by means of H 2 O 2 / H 2 O vapor, PEG, etc. In the illustration, a hydrophilized inlet area is given a reference number 340 designated. The second photoresist 320 forms a fluorinated, PTFE-like surface. The inside of the trench cell 330 is also hydrophilized.

16 zeigt den Aufbau nach Einspotten des Biocontent, ggf. mit PEG, Vereinzellung und Aufbau. 16 shows the structure after spotting in the bio content, possibly with PEG, isolation and structure.

Es werden somit in einen Siliziumwafer Kavitäten, die später die Trenchzellen bzw. Arrayzellen bilden, eingebracht bzw. eingeätzt, die von einer hydrophoben Oberfläche und unmittelbar an sie angrenzende hydrophile Einlaufbereiche umgeben sind, zusammen mit einem Netzwerk von die wässrige Probenlösung zuführenden feinen hydrophilen Zufuhrkanälen. Die hydrophobe Oberfläche ist in hohem Maße wasserabweisend gestaltet durch die Erzeugung eines PTFE-artigen Materials auf der Oberfläche, die bspw. durch Fluorinierung einer Lackoberfläche in einem Plasma mittels CF4-Gases (Tetrafluormethan) erreicht wird. Diese PTFE-artige Oberfläche ist sowohl für wässrige als auch für mineralische Ölmedien hochgradig abweisend, jedoch nicht für perfluorierte Flüssigkeiten, die auch als flüssiges PTFE bezeichnet werden.Thus, cavities, which later form the trench cells or array cells, are introduced or etched into a silicon wafer, which are surrounded by a hydrophobic surface and directly adjoining hydrophilic inlet areas, together with a network of fine hydrophilic ones that supply the aqueous sample solution Feed channels. The hydrophobic surface is designed to be highly water-repellent through the production of a PTFE-like material on the surface, which is achieved, for example, by fluorinating a paint surface in a plasma using CF 4 gas (tetrafluoromethane). This PTFE-like surface is highly repellent for both aqueous and mineral oil media, but not for perfluorinated liquids, which are also known as liquid PTFE.

Folglich gibt es auf diesen Oberflächen auch keine Probenmaterialverluste, weil DNA und RNA sowie Proteine nicht an solchen Oberflächen binden können. DNA und RNA weisen negative elektrische Ladungen auf und werden von PTFE-artigen Oberflächen abgewiesen, eine Anbindung an diese ist somit nicht möglich. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass das Angebot an hydrophilen, potenziell DNA und RNA bindenden Oberflächen auf die Reaktionsgefäße, also auf das Innere der Trenchzellen, selbst, auf die Mikrokanäle des Netzwerks aus hydrophilen Zuführkanälen und auf die hydrophilen Einlaufbereiche um die Trenchzellen herum beschränkt bleibt.As a result, there is no loss of sample material on these surfaces because DNA, RNA and proteins cannot bind to such surfaces. DNA and RNA have negative electrical charges and are repelled by PTFE-like surfaces, so binding to them is not possible. This ensures that the range of hydrophilic surfaces that potentially bind DNA and RNA remains limited to the reaction vessels, i.e. to the interior of the trench cells themselves, to the microchannels of the network of hydrophilic supply channels and to the hydrophilic inlet areas around the trench cells .

Ein wässriges Probenmedium, das den Mikroarray-Chip überspült, wird in die hydrophilen Zuführkanäle und über diese in die hydrophilen Einlaufbereiche gezwungen, die somit als Phasenführungen wirken und die wässrige Flüssigkeit zu den hydrophilen Arrayzellen lenken, in die sie nachfolgend eingezogen werden. Dabei wird das Gas in den Arrayzellen über den Freiraum über den Arrayzellen verdrängt. Dieser Freiraum bzw. das Totvolumen über den Mikroarray-Chips kann und sollte im Sinne eines möglichst geringen Probenverlustes minimal gehalten werden, bspw. auf 10 µm, besser auf 1 µm, oder sogar unterhalb 1 µm Höhe ausgestaltet sein, um den Verlust an Probenmaterial zu minimieren. Dies ist einfach durch Anbringen von entsprechend dimensionierten Abstandshaltern bzw. Spacern zwischen einem transparenten Deckel und der Chipoberfläche möglich, wenn der Deckel und die Chipoberfläche verklebt werden. Nach Befüllen der Arrayzellen mit Probenflüssigkeit sollte der Freiraum mit einem perfluoriertem Medium befüllt und die Arrayzellen damit versiegelt werden. Dieses perfluorierte Medium sorgt in Verbindung mit der PTFE-artigen Oberfläche der Arrayzellenumgebung auch für deren gegenseitige Isolation, um einen sogenannten Cross-Talk bzw. eine Materialverschleppung zwischen verschiedenen Arrayzellen minimal zu halten.An aqueous sample medium that washes over the microarray chip is forced into the hydrophilic feed channels and via these into the hydrophilic inlet areas, which thus act as phase guides and direct the aqueous liquid to the hydrophilic array cells, into which they are subsequently drawn. The gas in the array cells is thereby displaced via the free space above the array cells. This free space or the dead volume above the microarray chips can and should be kept to a minimum in order to minimize sample loss, for example to 10 µm, better to 1 µm, or even below 1 µm, in order to prevent the loss of sample material minimize. This is possible simply by attaching appropriately dimensioned spacers between a transparent cover and the chip surface when the cover and the chip surface are glued. After filling the array cells with sample liquid, the free space should be filled with a perfluorinated medium and the array cells should be sealed with it. This perfluorinated medium, in conjunction with the PTFE-like surface of the array cell environment, also ensures their mutual isolation in order to keep a so-called cross-talk or material carryover between different array cells to a minimum.

Im letzteren Fall steht die Versiegelungsflüssigkeit dann zwischen den Arrayzellen und in dem Netzwerk der Befüllungskanäle, das sehr flach, bspw. 1 µm hoch oder sogar weniger als 1 µm hoch gestaltet werden kann, indem auf die Oberfläche der hydrophoben Oberflächenschicht mittels eines entsprechend dünnen Abstandshalters eine Abdeckung geklebt oder mechanisch gegen diese geklemmt werden kann. Die Abdeckung kann auch durch ein Fenster des Lab-on-Chips realisiert sein, z. B. indem der Mikroarray-Chip mit dem genannten Abstandshalter dagegen geklemmt wird.In the latter case, the sealing liquid is then between the array cells and in the network of the filling channels, which can be made very flat, for example 1 µm high or even less than 1 µm high, by placing an appropriately thin spacer on the surface of the hydrophobic surface layer Cover can be glued or mechanically clamped against this. The cover can also be implemented through a window of the lab-on-chip, e.g. B. by the microarray chip is clamped against it with said spacer.

Es können des Weiteren zusätzliche biologische oder physikalisch-chemische Funktionalisierungen der Arrayzellen vorgenommen werden, bspw. ein Einbringen von Polyethylenglykol oder PEG-haltigen Precursorn, wie z. B. inm Form von PEG-Silanen, zum Aufwachsen von PEG-ilierten Schichten im Inneren der Arrayzellen. Nach dem Einbringen des Biocontents kann eine weitere Bedeckung des Biocontents mit PEG usw. stattfinden. Ein besonderer Vorteil der PTFE-artigen Oberflächenschicht ist, dass damit eine selektive Beschichtung ausschließlich der hydrophilen Siliziumflächen unter Ausschluss der PTFE-artigen Oberflächen möglich wird, bspw. in Form von Atomic Layer Deposition (ALD-) Verfahren bzw. als Verfahren zum Aufwachsen einer selbstaufgebauten (Monolagen-) Schicht (= Self Assembled (Mono-) Layer bzw. SAM-Coating), da diese Verfahren Schichten nur auf den hydrophilen Siliziumflächen aufwachsen, nicht jedoch auf den PTFE-artigen Oberflächen. Somit kann z. B. eine selektive Beschichtung mit dauerhaft hydrophilen Überzügen bzw. Abdeckungen auf den hydrophilen Siliziumoberflächen im Sinne einer selbstaufgebauten (Monolagen-) Schicht erfolgen, währenddessen auf den PTFE-artigen Oberflächen nichts aufwächst und diese folglich hydrophob bleiben.Furthermore, additional biological or physico-chemical functionalizations of the array cells can be carried out, for example an introduction of polyethylene glycol or PEG-containing precursors, such as e.g. B. in the form of PEG-silanes, for the growth of PEG-ilated layers inside the array cells. After the bio-content has been introduced, the bio-content can be further covered with PEG, etc. A particular advantage of the PTFE-like surface layer is that it enables selective coating exclusively of the hydrophilic silicon surfaces, excluding the PTFE-like surfaces, for example in the form of Atomic Layer Deposition (ALD) processes or as a process for growing a self-built one (Monolayer) layer (= Self Assembled (Mono-) Layer or SAM-Coating), since these processes only grow layers on the hydrophilic silicon surfaces, but not on the PTFE-like surfaces. Thus, for. B. a selective coating with permanently hydrophilic coatings or covers on the hydrophilic silicon surfaces in the sense of a self-built (monolayer) layer, while nothing grows on the PTFE-like surfaces and these consequently remain hydrophobic.

Ein molekularbiologischer Prozess im Lab-on-Chip kann somit wie folgt ablaufen:

  • - Befüllen der Arrayzellen im Lab-on-Chip mit einem wässrigen Eluat oder PCR-Mastermix, das das zu amplifizierende und nachzuweisende Probenmaterial enthält, über das hydrophile Kanalnetzwerk als sogenannte Phasenführungen (phase guides) für die wässrige Probenflüssigkeit, mit einem minimalen Head Space zwischen der Chipoberfläche und einem Abschlusselement, Deckel oder Fenster, wobei über den Freiraum die aus den Arrayzellen verdrängten Gasvolumina „entsorgt“ werden.
  • - Überschichten des Mikroarray-Chips mit einem perfluorierten Medium, wodurch der Mikroarray-Chip bzw. die Arrayzellen gegeneinander versiegelt werden.
  • -Durchführen und Analysieren der molekularbiologischen Reaktion, bspw. einer qPCR, einer isothermalen PCR, einer rITA oder einer digitalen PCR.
A molecular biological process in the lab-on-chip can thus proceed as follows:
  • - Filling the array cells in the lab-on-chip with an aqueous eluate or PCR master mix, which contains the sample material to be amplified and detected, via the hydrophilic channel network as so-called phase guides for the aqueous sample liquid, with a minimal head space between the chip surface and a closing element, cover or window, whereby the gas volumes displaced from the array cells are "disposed of" via the free space.
  • - Overlaying the microarray chip with a perfluorinated medium, whereby the microarray chip or the array cells are sealed against one another.
  • - Carrying out and analyzing the molecular biological reaction, e.g. a qPCR, an isothermal PCR, an rITA or a digital PCR.

Ein möglicher zweiter Prozessfluss zur Herstellung des Mikroarrays ist nachfolgend aufgezeichnet, wobei die ersten neun Schritte den ersten neun Schritten des zuvor dargestellten ersten Prozessflusses entsprechen, so dass diese nicht noch einmal hier aufgeführt sind:

  • 10. PEG als selbstaufgebaute Schicht (self-assembled monolayer = SAM-coating), z. B. in Form eines PEG-Silans, aufbringen, wobei der Prozess selektiv nur hydrophile Siliziumoberflächen bedeckt, nicht jedoch die PTFE-artigen Oberflächen, auf denen keine Beschichtung erfolgt,
  • 11. Biocontent in Arrayzellen bzw. Trenchzellen spotten,
  • 12. PEG in Arrayzellen über Biocontent spotten,
  • 13. Chips ggf. mit transparenter Abdeckung, bspw. Deckglas, Polymerkappe, abdecken,
  • 14. Vereinzellung zu Einzelchips, bspw. durch Sägen, Brechen, Mahoh-Dicing usw.,
  • 15. Einbau in LoC-Arraykammer,
  • 16. Befüllen mit Eluat in Richtung gegen die Schwerkraft mit Hilfe von Druck und hydrophilen Kräften auf der Siliziumoberfläche bzw. im Netzwerk der Zufuhrkanäle und Einlaufbereiche. Fluorierte Foltolackoberfläche weist Wasser ab und schützt dabei vor Cross-Talk zwischen benachbarten Arrayzellen,
  • 17. Auffüllen des Freiraums mit perfluorierter Flüssigkeit ebenfalls gegen die Schwerkraft, dadurch wird der Eluatüberschuss durch das Kanalsystem weggespült, ohne Cross-Talk zu anderen benachbarten Arrayzellen zu verursachen.
A possible second process flow for manufacturing the microarray is shown below, the first nine steps corresponding to the first nine steps of the first process flow presented above, so that they are not listed here again:
  • 10. PEG as a self-assembled layer (self-assembled monolayer = SAM-coating), e.g. B. in the form of a PEG-silane, the process selectively covering only hydrophilic silicon surfaces, but not the PTFE-like surfaces, on which no coating takes place,
  • 11. Mock biocontent in array cells or trench cells,
  • 12. Mock PEG in array cells about biocontent,
  • 13. Cover chips, if necessary with a transparent cover, e.g. cover glass, polymer cap,
  • 14. Singulation into individual chips, e.g. by sawing, breaking, Mahoh dicing, etc.,
  • 15. Installation in LoC array chamber,
  • 16. Filling with eluate in the direction against gravity with the aid of pressure and hydrophilic forces on the silicon surface or in the network of supply channels and inlet areas. Fluorinated Foltolack surface repels water and protects against cross-talk between neighboring array cells,
  • 17. Filling the free space with perfluorinated liquid also against gravity, thereby the excess eluate is flushed away through the channel system without causing cross-talk to other neighboring array cells.

Es werden somit vorstehend Ausführungsformen und Herstellungsverfahren für einen Mikroarray bzw. einen Mikroarray-Chip sowie ein Ablauf bspw. für eine PCR eine qPCR, eine digitale PCR oder eine rITA in einem Lab-on-Chip beschrieben. Durch minimale Totvolumina wird ein hocheffizientes Befüllen der Arrayzellen mit der wässrigen Probenlösung erreicht, d. h. die Verluste an Probenmaterial durch Totvolumina werden dergestalt minimiert und die Empfindlichkeit eines Nachweises des Probenmaterials durch die nachfolgenden PCRs in den Arrayzellen wird infolgedessen soweit verbessert, dass eine Voramplifikationsreaktion bzw. vorgeschaltete PCR entfallen kann. Der Mikroarray-Chip bzw. der Freiraum mit minimalem Totvolumen wird nach dem Befüllen mit einem perfluoriertem Versiegelungsmedium versiegelt, um einen Cross-Talk und eine Materialverschleppung zu unterdrücken.Embodiments and manufacturing methods for a microarray or a microarray chip and a sequence, for example for a PCR, a qPCR, a digital PCR or an rITA in a lab-on-chip are thus described above. A highly efficient filling of the array cells with the aqueous sample solution is achieved through minimal dead volumes; H. the loss of sample material through dead volumes is minimized in this way and the sensitivity of a detection of the sample material by the subsequent PCRs in the array cells is consequently improved to such an extent that a pre-amplification reaction or upstream PCR can be dispensed with. The microarray chip or the free space with minimal dead volume is sealed after filling with a perfluorinated sealing medium in order to suppress cross-talk and material carryover.

Claims (10)

Mikroarray zum Durchführen von Analysen an mindestens einer Probe, die in Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) des Mikroarrays (10, 20, 50, 60, 200, 220) aufzunehmen ist, wobei die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) in einer Scheibe (101, 301) ausgebildet sind und die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) an einer Vorderseite der Scheibe (101, 301) zur Aufnahme der mindestens einen Probe offen und an einer Rückseite der Scheibe (101, 301) abgeschlossen sind, wobei die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) im Bereich der Rückseite der Scheibe (101, 301) mit einem hydrophoben und gasdurchlässigen Material abgeschlossen sind.Microarray for performing analyzes on at least one sample which is to be accommodated in array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) of the microarray (10, 20, 50, 60, 200, 220), the Array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) are formed in a disk (101, 301) and the array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) on a The front side of the disk (101, 301) is open for receiving the at least one sample and closed on a rear side of the disk (101, 301), the array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) in the Area of the back of the disc (101, 301) are sealed with a hydrophobic and gas-permeable material. Mikroarray nach Anspruch 1, bei dem die Scheibe (101, 301) aus Silizium besteht.Microarray Claim 1 , in which the disc (101, 301) consists of silicon. Mikroarray nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) an der Rückseite der Scheibe (101, 301) durch Stopfen (160) aus einem PTFE-Material, das hydrophob und gasdurchlässig ist, abgeschlossen sind.Microarray Claim 1 or 2 , in which the array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) on the back of the disc (101, 301) by plugs (160) made of a PTFE material, which is hydrophobic and gas-permeable, closed are. Mikroarray nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) an der Rückseite der Scheibe (101, 301) durch eine Matte (150) aus einem PTFE-Material, das hydrophob und gasdurchlässig ist, abgeschlossen sind.Microarray Claim 1 or 2 , in which the array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) on the back of the pane (101, 301) by a mat (150) made of a PTFE material that is hydrophobic and gas-permeable, Are completed. Verfahren zum Herstellen eines Mikroarrays (10, 20, 50, 60, 200, 220) mit folgenden Schritten: - Einbringen von Kavitäten in eine Scheibe (101, 301) von einer Oberseite der Scheibe (101, 301) her, - Bewirken, dass die Kavitäten im Bereich der Unterseite der Scheibe (101, 301) mit einem hydrophoben und gasdurchlässigen Material abgeschlossen sind.Method for producing a microarray (10, 20, 50, 60, 200, 220) with the following steps: - Introducing cavities into a disk (101, 301) from an upper side of the disk (101, 301), - Causing that the cavities in the area of the underside of the disk (101, 301) are closed with a hydrophobic and gas-permeable material. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Kavitäten durchgehend in die Scheibe (101, 301) eingebracht werden und die Kavitäten im Bereich der Rückseite der Scheibe (101, 301) mit einem PTFE-haltigen Material abgeschlossen werden.Procedure according to Claim 5 , in which the cavities are continuously introduced into the disk (101, 301) and the cavities in the area of the rear side of the disk (101, 301) are sealed with a PTFE-containing material. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem Stopfen (160) aus einem PTFE-Material eingepresst werden.Procedure according to Claim 6 , in which plugs (160) made of a PTFE material are pressed in. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem eine Matte (150) aus einem PTFE-Material auf die Rückseite aufgesetzt wird.Procedure according to Claim 6 , in which a mat (150) made of a PTFE material is placed on the back. Verfahren zum Verwenden eines Mikroarrays (10, 20, 50, 60, 200, 220) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem zunächst mindestens eine Probe in die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) eingebracht wird und anschließend, falls ein Freiraum vorhanden ist, die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) vorderseitig versiegelt werden.Method for using a microarray (10, 20, 50, 60, 200, 220) according to one of the Claims 1 to 4th , in which at least one sample is first introduced into the array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) and then, if there is a free space, the array cells (16, 26, 56, 66, 130 , 206, 226, 330) are sealed on the front. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Arrayzellen (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) durch Umspülen eines perfluorierten Mediums versiegelt werden.Procedure according to Claim 9 , in which the array cells (16, 26, 56, 66, 130, 206, 226, 330) through Be sealed around a perfluorinated medium.
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