DE102019214929A1 - Compact light sheet microscope - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop (1) zur Beobachtung eines in einem Probenvolumen (31) angeordneten Objektes (41), umfassend ein Beleuchtungsobjektiv (5) zur Transmission von Beleuchtungslicht (21) von einer Beleuchtungsseite (23) zu einer Probenseite (25) in das Probenvolumen (31), und ein Detektionsobjektiv (7) zur Transmission von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht (55) vom Probenvolumen (31) zu einer Detektorseite (53) des Detektionsobjektivs (7). Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines auf endlich korrigierten Objektivs (63) in einem Lichtblattmikroskop (1). Lichtblattmikroskope (1) haben den Nachteil, dass deren Aufbau Ist und keinen Zugang zu den konjugierten Ebenen (65) erlaubt. Das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop (1) verbessert die Lösungen aus dem Stand der Technik dadurch, dass das Beleuchtungsobjektiv (5) einen Abstand (47) zwischen dem Probenvolumen (31) und der probenvolumenseitigen Hauptebene (45b) des Beleuchtungsobjektiv (5) aufweist, der größer ist als die Brennweite (46b) des Beleuchtungsobjektivs (5) und/oder dass das Detektionsobjektiv (7) einen Abstand (47) zwischen dem Probenvolumen (31) und der probenvolumenseitigen Hauptebene (45b) des Detektionsobjektivs (7) aufweist, der größer ist als die Brennweite (46b) des Detektionsobjektivs (7).The invention relates to a light sheet microscope (1) for observing an object (41) arranged in a sample volume (31), comprising an illuminating objective (5) for transmitting illuminating light (21) from an illuminating side (23) to a specimen side (25) into the Sample volume (31), and a detection objective (7) for the transmission of scattered and / or fluorescent light (55) from the sample volume (31) to a detector side (53) of the detection objective (7). The invention also relates to the use of an objective (63) corrected to finite in a light sheet microscope (1). Light sheet microscopes (1) have the disadvantage that their structure is identical and does not allow access to the conjugate planes (65). The light sheet microscope (1) according to the invention improves the solutions from the prior art in that the illumination objective (5) has a greater distance (47) between the sample volume (31) and the main plane (45b) of the illumination objective (5) on the sample volume side than the focal length (46b) of the illumination objective (5) and / or that the detection objective (7) has a distance (47) between the sample volume (31) and the main plane (45b) of the detection objective (7) on the sample volume side which is greater than the Focal length (46b) of the detection lens (7).
Description
Die Erfindung betrifft ein Lichtblattmikroskop zur Beobachtung eines in einem Probenvolumen angeordneten Objektes, umfassend ein Beleuchtungsobjektiv zur Transmission von Beleuchtungslicht von einer Beleuchtungsseite zu einer Probenseite in das Probenvolumen, und ein Detektionsobjektiv zur Transmission von Streu- und/oder Fluoreszenzlicht vom Probenvolumen zu einer Detektorseite des Detektionsobjektivs.The invention relates to a light sheet microscope for observing an object arranged in a sample volume, comprising an illumination objective for the transmission of illumination light from an illumination side to a sample side into the sample volume, and a detection objective for the transmission of scattered and / or fluorescent light from the sample volume to a detector side of the detection objective .
Lichtblattmikroskope sind aus dem Stand der Technik bekannt. In diesen wird mittels eines Beleuchtungsobjektivs Beleuchtungslicht in ein Probenvolumen fokussiert, wobei ein resultierender Fokus bevorzugt kein eindimensionaler Fokuspunkt bzw. Lichtfleck ist, sondern ein zweidimensional ausgedehnter Fokusbereich. Dies kann beispielsweise durch Einsatz einer Zylinderlinse erreicht werden. In diesem Fall spricht man von einem statischen Lichtblatt. Ebenso kann das Lichtblatt erzeugt werden, indem ein fokussierter Strahl des Beleuchtungslichts entlang einer Richtung gescannt wird, sodass sich ein sogenanntes virtuelles Lichtblatt herausbildet. Das Lichtblatt erstreckt sich entlang einer Längsrichtung, die parallel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs orientiert ist, entlang einer Breitenrichtung, die senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs orientiert ist und entlang einer Höhenrichtung, die ebenfalls senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs orientiert ist. Die Ausdehnung des Lichtblattes ist im Allgemeinen in Längs- und Breitenrichtung um ein Vielfaches größer als die Ausdehnung in Höhenrichtung. Letztere wird auch als Dicke des Lichtblattes bezeichnet.Light sheet microscopes are known from the prior art. In these, illuminating light is focused into a sample volume by means of an illuminating objective, a resulting focus preferably not being a one-dimensional focal point or light spot, but a two-dimensionally extended focal area. This can be achieved, for example, by using a cylinder lens. In this case one speaks of a static light sheet. The light sheet can also be generated by scanning a focused beam of the illuminating light along a direction, so that a so-called virtual light sheet is formed. The light sheet extends along a longitudinal direction that is oriented parallel to the optical axis of the illumination objective, along a width direction that is oriented perpendicular to the optical axis of the illumination objective, and along a height direction that is also oriented perpendicular to the optical axis of the illumination objective. The expansion of the light sheet is generally many times greater in the longitudinal and width directions than the expansion in the height direction. The latter is also referred to as the thickness of the light sheet.
Ein Objekt, welches sich im Probenvolumen befindet, wird folglich im Wesentlichen in einem lokal begrenzten Bereich beleuchtet. Ist das Objekt transparent bzw. semitransparent, so wird ein Querschnitt beleuchtet. Lichtundurchlässige Objekte werden lediglich entlang des Umfangs beleuchtet und können in Beleuchtungsrichtung einen Schattenwurf aufweisen.An object which is located in the sample volume is consequently illuminated essentially in a locally limited area. If the object is transparent or semi-transparent, a cross-section is illuminated. Opaque objects are only illuminated along the perimeter and can cast shadows in the direction of illumination.
Ein Detektionsobjektiv ist derart angeordnet, dass dessen optische Achse senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs orientiert ist. Streu- und/oder Fluoreszenzlicht, welches von der beleuchteten Ebene des Objektes gestreut oder in der beleuchteten Ebene des Objektes emittiert (Fluoreszenzlicht) wurde, wird durch das Detektionsobjektiv aufgenommen und zu einem Detektor und/oder zu einer Beobachtungsvorrichtung weitergeleitet.A detection objective is arranged in such a way that its optical axis is oriented perpendicular to the optical axis of the illumination objective. Scattered and / or fluorescent light that has been scattered from the illuminated plane of the object or emitted in the illuminated plane of the object (fluorescent light) is picked up by the detection lens and passed on to a detector and / or to an observation device.
Die Beleuchtungs- und Detektionsobjektive der Lichtblattmikroskope aus dem Stand der Technik haben den Nachteil, dass in deren Aufbauten Tubuslinsen verwendet werden. Allerdings ist ein solcher Aufbau, in dem Tubuslinse und Objektiv zumindest näherungsweise ein 4f-System bilden, sehr lang und zudem ein Zugang zur hinteren Brennebene bzw. Pupille des Beleuchtungsobjektivs und des Detektionsobjektivs nicht möglich, da diese Brennebenen in den Objektiven liegen. Lösungen aus dem Stand der Technik, die es erlauben, auf die hintere Brennebene bzw. Pupille zuzugreifen sind beispielsweise telezentrische 4f-Optiken: Diese benötigen sehr viel Platz. Typischerweise weist ein Scansystem aus dem Stand der Technik eine Baulänge von etwa 0,5 m auf. Linsenfreie Scansysteme aus dem Stand der Technik verwenden zusätzliche Spiegel und/oder teure und aufwendige parabolische Spiegel, die zudem präzise und zeitaufwendig justiert werden müssen.The illumination and detection objectives of the light sheet microscopes from the prior art have the disadvantage that tube lenses are used in their structures. However, such a structure, in which the tube lens and objective form at least approximately a 4f system, is very long and, in addition, access to the rear focal plane or pupil of the illumination objective and the detection objective is not possible, since these focal planes lie in the objectives. Solutions from the prior art that allow access to the rear focal plane or pupil are, for example, telecentric 4f optics: These require a great deal of space. A scanning system from the prior art typically has an overall length of approximately 0.5 m. Lens-free scanning systems from the prior art use additional mirrors and / or expensive and complex parabolic mirrors, which also have to be adjusted precisely and in a time-consuming manner.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein kompaktes Lichtblattmikroskop zu schaffen, das einfach zu justieren ist, und bei dem die hintere Brennebene des Beleuchtungs- und/oder Detektionsobjektivs unmittelbar zugänglich ist.The object of the present invention is therefore to create a compact light sheet microscope which is easy to adjust and in which the rear focal plane of the illumination and / or detection objective is directly accessible.
Das eingangs erwähnte erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop löst die obigen Aufgaben dadurch, dass das Beleuchtungsobjektiv einen Abstand zwischen dem Probenvolumen und der probenvolumenseitigen Hauptebene des Beleuchtungsobjektivs aufweist, der größer ist als die Brennweite des Beleuchtungsobjektivs und/oder dass das Detektionsobjektiv einen Abstand zwischen dem Probenvolumen und der probenvolumenseitigen Hauptebene des Detektionsobjektivs aufweist, der größer ist als die Brennweite des Detektionsobjektivs.The light sheet microscope according to the invention mentioned at the beginning achieves the above objects in that the illumination objective has a distance between the sample volume and the main plane of the illumination objective on the sample volume side which is greater than the focal length of the illumination objective and / or that the detection objective has a distance between the sample volume and the main plane on the sample volume side of the detection lens which is greater than the focal length of the detection lens.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines auf endlich korrigierten Objektivs als Beleuchtungs- und/oder Detektionsobjektiv in einem Lichtblattmikroskop zur Beobachtung eines in einem Probenvolumen angeordneten Objektes.The invention further relates to the use of an objective corrected to finite as an illumination and / or detection objective in a light sheet microscope for observing an object arranged in a sample volume.
Unter einem Objektiv ist hierbei ein Licht sammelndes optisches System umfassend eine Anordnung refraktiver Optiken, insbesondere Linsen, und/oder Spiegeln, zu verstehen. Die Anordnung weist hierbei bevorzugt ein gemeinsames Gehäuse auf.An objective is to be understood here as an optical system that collects light, comprising an arrangement of refractive optics, in particular lenses and / or mirrors. The arrangement here preferably has a common housing.
Die vorliegende Erfindung kann anhand beispielhafter, jeweils für sich vorteilhafter Ausgestaltungen weiter verbessert werden. Technische Merkmale der Ausgestaltungen können beliebig miteinander kombiniert und/oder weggelassen werden, sofern es nicht auf den durch das weggelassene technische Merkmal erzeugten technischen Effekt ankommt.The present invention can be further improved on the basis of exemplary configurations that are advantageous per se. Technical features of the configurations can be combined with one another and / or omitted as desired, provided that the technical effect produced by the omitted technical feature is not important.
So kann in einer Ausgestaltung das Beleuchtungsobjektiv und/oder das Detektionsobjektiv ein auf endlich korrigiertes Objektiv sein (auch als „Endlich-Objektiv“ bezeichnet). Ein solches auf endlich korrigiertes Objektiv kann als Beleuchtungs- und/oder Detektionsobjektiv in einem Lichtblattmikroskop zur Beobachtung eines in einem Probenvolumen angeordneten Objektes verwendet werden, wobei das Beleuchtungsobjektiv einen Abstand zwischen dem Probenvolumen und der probenvolumenseitigen Hauptebene des Beleuchtungsobjektivs aufweist, der größer ist als die Brennweite des Beleuchtungsobjektivs und/oder das Detektionsobjektiv einen Abstand zwischen dem Probenvolumen und der probenvolumenseitigen Hauptebene des Detektionsobjektivs aufweist, der größer ist als die Brennweite des Detektionsobjektivs.Thus, in one embodiment, the illumination objective and / or the detection objective can be a finitely corrected objective (also referred to as a “finite objective”). Such a finite-corrected objective can be used as an illumination and / or detection objective in a light sheet microscope can be used to observe an object arranged in a sample volume, the illumination objective having a distance between the sample volume and the main plane of the illumination objective on the sample volume side which is greater than the focal length of the illumination objective and / or the detection objective has a distance between the sample volume and the main plane of the sample volume Has detection lens which is greater than the focal length of the detection lens.
Das Probenvolumen kann als abgegrenzter Bereich angesehen werden, der beispielsweise durch eine Küvette oder ein entsprechendes Volumenelement zur Aufnahme einer Probe oder eines Objektes begrenzt ist. Ebenso ist es denkbar, dass Charakteristika des Lichtblattes das Probenvolumen definieren. Der Scanbereich kann dabei eine Breite des Probenvolumens definieren, die Ausdehnung des Lichtblattes entlang der optischen Achse über die zweifache Rayleigh-Länge kann beispielsweise eine Länge des Probenvolumens definieren und die Dicke des Lichtblattes in Höhenrichtung kann eine Höhe des Probenvolumens definieren.The sample volume can be viewed as a delimited area which is limited, for example, by a cuvette or a corresponding volume element for receiving a sample or an object. It is also conceivable that characteristics of the light sheet define the sample volume. The scan area can define a width of the sample volume, the extension of the light sheet along the optical axis over twice the Rayleigh length can define, for example, a length of the sample volume and the thickness of the light sheet in the vertical direction can define a height of the sample volume.
Unter der jeweiligen probenvolumenseitigen Hauptebene ist die Hauptebene des Beleuchtungsobjektivs bzw. des Detektionsobjektivs zu verstehen, welche näher am Probenvolumen angeordnet ist. Die Brennweite der entsprechenden Objektive wird von den entsprechenden Hauptebenen aus gemessen. Erfindungsgemäß ist jeder Raumpunkt des Probenvolumens weiter von der probenvolumenseitigen Hauptebene entfernt als die Brennweite.The respective main plane on the sample volume side is to be understood as the main plane of the illumination objective or of the detection objective, which is arranged closer to the sample volume. The focal length of the respective lenses is measured from the respective main planes. According to the invention, each point in space of the sample volume is further away from the main plane on the sample volume side than the focal length.
Unter einem auf endlich korrigiertem Objektiv (Endlich-Objektiv) ist zu verstehen, dass dieses auf die Abbildung endlich entfernter konjugierter Ebenen optimiert ist. D.h., dass ein abzubildendes Objekt und das reelle Bild des Objektes in endlicher Entfernung von der jeweiligen objektseitigen oder bildseitigen Hauptebene entfernt sind. Äquivalent hierzu ist der Begriff einer auf endlich korrigierten Optik (Endlich-Optik) zu verstehen. Im Gegensatz dazu liegt bei einer sogenannten Unendlich-Optik oder einem Unendlich-Objektiv eine konjugierte Ebene unendlich weit entfernt von der Optik bzw. dem Objektiv. Die Optimierung eines Endlich-Objektivs oder einer Endlich-Optik erfolgt bezüglich der Form und des Materials der verwendeten Linsen zur gleichmäßigen Verteilung der Brechung auf alle Ober- bzw. Grenzflächen. Endlich-Optiken und Endlich-Objektive sind somit nicht dafür optimiert, kollimiertes Licht im Brennpunkt zu fokussieren bzw. Licht aus einer punktförmigen, im Brennpunkt angeordneten Lichtquelle zu kollimieren.A finitely corrected objective (finite objective) is to be understood as meaning that it is optimized for the imaging of finitely distant conjugate planes. This means that an object to be imaged and the real image of the object are at a finite distance from the respective object-side or image-side main plane. The term “finite optics” is to be understood as equivalent to this. In contrast to this, in so-called infinite optics or an infinite lens, a conjugate plane is infinitely far away from the optics or the lens. The optimization of a finite lens or a finite optic takes place with regard to the shape and the material of the lenses used for the uniform distribution of the refraction on all surfaces or interfaces. Finite optics and finite lenses are therefore not optimized to focus collimated light in the focal point or to collimate light from a point-shaped light source arranged in the focal point.
Eine der von der jeweiligen Hauptebene endlich weit entfernten konjugierten Ebenen liegt bevorzugt im Probenvolumen. Bevorzugt liegt diese konjugierte Ebene zentral im Probenvolumen oder definiert das Zentrum des Probenvolumens. Das Probenvolumen kann sich von der korrigierten Ebene ausgehend hin zum und weg vom jeweiligen Objektiv erstrecken. Die zugehörige zweite konjugierte Ebene ergibt sich durch Abbildung der ersten konjugierten Ebene durch das Objektiv.One of the conjugate planes finitely distant from the respective main plane is preferably located in the sample volume. This conjugate plane is preferably located centrally in the sample volume or defines the center of the sample volume. The sample volume can extend from the corrected plane towards and away from the respective objective. The associated second conjugate plane results from the imaging of the first conjugate plane through the objective.
Die zweite konjugierte Ebene befindet sich auf der dem Probenvolumen abgewandten Seite des jeweiligen Objektivs und befindet sich beim Beleuchtungsobjektiv in einem Abstand zur lichtquellenseitigen Hauptebene, beim Detektionsobjektiv in einem Abstand zur detektorseitigen Hauptebene, wobei der jeweilige Abstand größer ist als die Brennweite des entsprechenden Beleuchtungsobjektivs oder Detektionsobjektivs.The second conjugate plane is located on the side of the respective objective facing away from the sample volume and is at a distance from the main plane on the light source side in the case of the illumination objective and at a distance from the main plane on the detector side in the case of the detection objective, the respective distance being greater than the focal length of the corresponding illumination objective or detection objective .
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops ist es vorteilhaft, wenn das Beleuchtungsobjektiv und/oder das Detektionsobjektiv ein Spiegelobjektiv ist. Spiegelobjektive sind frei von jeglichen refraktiven Optiken und somit können chromatische Abbildungsfehler vermieden werden. Objektive, die auf refraktiven Optiken basieren, können zwar Korrektur- oder Kompensationselemente aufweisen, welche chromatische Abbildungsfehler minimieren oder korrigieren, allerdings erhöhen diese den technischen Aufwand und die Kosten. Insbesondere, wenn ein breiter Spektralbereich, der beispielsweise den UV-Bereich, den sichtbaren Bereich und den Nahinfrarotbereich (NIR) abdecken soll, gewünscht ist, lässt sich eine adäquate Korrektur über diesen gesamten Bereich nicht realisieren. Ferner erfordert die Verwendung refraktiver Optiken im Ultravioletten oder Infraroten Materialien, welche in diesen Spektralbereichen nicht absorbieren.In a further embodiment of the light sheet microscope according to the invention, it is advantageous if the illumination objective and / or the detection objective is a mirror objective. Mirror lenses are free of any refractive optics and thus chromatic aberrations can be avoided. Objectives based on refractive optics can indeed have correction or compensation elements which minimize or correct chromatic imaging errors, but these increase the technical effort and costs. In particular, if a broad spectral range, which is intended to cover the UV range, the visible range and the near infrared range (NIR), for example, is desired, an adequate correction over this entire range cannot be implemented. Furthermore, the use of refractive optics in the ultraviolet or infrared requires materials that do not absorb in these spectral ranges.
Die Verwendung von katadioptrischen Objektiven ist ebenso möglich. Diese umfassen reflektive und brechende optische Elemente. Letztere sind bevorzugt chromatisch korrigiert.The use of catadioptric lenses is also possible. These include reflective and refractive optical elements. The latter are preferably corrected chromatically.
Ein weiterer Vorteil von Spiegelobjektiven ist eine im Vergleich zu refraktiven Objektiven typischerweise größere numerische Apertur (NA) bei gleichem freiem Arbeitsabstand und Baulänge. Der freie Arbeitsabstand ist der Abstand zwischen dem vorderen, dem Probenvolumen zugewandten optischen Element (Linse oder Spiegel) und der abzubildenden Ebene. Ein großer freier Arbeitsabstand ist für die Lichtblattmikroskopie wünschenswert.Another advantage of mirror objectives is a typically larger numerical aperture (NA) compared to refractive objectives with the same free working distance and overall length. The free working distance is the distance between the front optical element (lens or mirror) facing the sample volume and the plane to be imaged. A large free working distance is desirable for light sheet microscopy.
Besonders bevorzugt ist das als Spiegelobjektiv ausgestaltete Beleuchtungsobjektiv und/oder Detektionsobjektiv eine auf endlich entfernte konjugierte Ebenen korrigierte Optik. Ferner kann das Spiegelobjektiv asphärische Oberflächen zur Korrektur von sphärischen Aberrationen aufweisen.Particularly preferably, the illumination objective and / or detection objective configured as a mirror objective is an optical system corrected to finitely distant conjugate planes. Furthermore, the Mirror lens have aspherical surfaces for correcting spherical aberrations.
Das Beleuchtungsobjektiv und/oder das Detektionsobjektiv kann in einer weiteren Ausgestaltung ein Immersionsobjektiv sein. Bevorzugt können die verwendeten Objektive Immersionsobjektive im Endlich-Aufbau sein, weiter bevorzugt zusätzlich Spiegelobjektive sein.In a further embodiment, the illumination objective and / or the detection objective can be an immersion objective. The objectives used can preferably be immersion objectives in the finite structure, more preferably also mirror objectives.
Hierbei kann sich das Probenvolumen in einer Probenkammer befinden, welche mit einem Immersionsmedium gefüllt ist. Insbesondere kann das Objektiv bzw. können die Objektive eine transparente, zum Probenvolumen weisende und sich im Immersionsmedium befindliche Grenzfläche aufweisen, die sphärisch oder zylindrisch im Mittelpunkt der Krümmung eines Spiegels des Spiegelobjektiv angeordnet ist. Die transparente Grenzfläche kann beispielsweise eine dünne Membran aus Fluorethylenpropylen (FEP) oder aus Glas sein.Here, the sample volume can be located in a sample chamber which is filled with an immersion medium. In particular, the objective or objectives can have a transparent interface, facing the sample volume and located in the immersion medium, which is arranged spherically or cylindrically in the center of the curvature of a mirror of the mirror objective. The transparent interface can be, for example, a thin membrane made of fluoroethylene propylene (FEP) or made of glass.
Im Strahlengang des Beleuchtungsobjektivs kann die Krümmung der Grenzfläche auf eine ideale Strahlqualität in der Fokusebene des Detektionsobjektivs optimiert sein. Im Strahlengang des Detektionsobjektivs kann die Krümmung der Grenzfläche auch für abzubildende Bereiche, die nicht auf der optischen Achse des Detektionsobjektivs liegen, für eine ideale Bildqualität optimiert sein. Hierfür kann die Verwendung einer asphärischen Krümmung oder einer zusätzlichen Linse vorteilhaft sein. Ebenso kann eine zusätzliche Meniskuslinse an der der Probe bzw. dem Objekt zugewandten Seite des Objektivs vorgesehen sein, sodass eine dispersionsfreie Nutzung des Objektivs in beliebigen Immersionsmedien möglich ist.In the beam path of the illumination objective, the curvature of the interface can be optimized for an ideal beam quality in the focal plane of the detection objective. In the beam path of the detection objective, the curvature of the boundary surface can also be optimized for ideal image quality for areas to be imaged that do not lie on the optical axis of the detection objective. The use of an aspherical curvature or an additional lens can be advantageous for this. An additional meniscus lens can also be provided on the side of the objective facing the sample or the object, so that dispersion-free use of the objective in any immersion media is possible.
Durch eine Verschiebung des Linsensystems, d.h. des Beleuchtungs- und/oder Detektionsobjektivs und der Lichtquelle (im Falle eines Beleuchtungsstrahlenganges) bzw. des Detektors (im Falle eines Detektionsstrahlenganges) kann die Vergrößerung der Abbildung einstellbar sein. Ferner kann hierbei die Nutzung eines einstellbaren Spiegels (DM) für die Korrektur von Aberrationen vorteilhaft sein. Auch ist es denkbar, dass Korrekturoptiken in den Strahlengang einschwenkbar sind, beispielsweise statische Phasenplatten.The magnification of the image can be adjusted by shifting the lens system, i.e. the illumination and / or detection objective and the light source (in the case of an illumination beam path) or the detector (in the case of a detection beam path). The use of an adjustable mirror (DM) for correcting aberrations can also be advantageous here. It is also conceivable that correction optics can be pivoted into the beam path, for example static phase plates.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops kann auf der Beleuchtungsseite des Beleuchtungsobjektivs ein optischer Lichtwellenleiter angeordnet sein, über den Beleuchtungslicht in das Beleuchtungsobjektiv einkoppelbar ist. Die Einkopplung des Beleuchtungslichts über einen optischen Lichtwellenleiter hat den Vorteil, dass über diesen eine flexible Anbindung möglich ist. Ferner kann eine Auskoppelfacette des optischen Lichtwellenleiters, über welche das Beleuchtungslicht aus dem optischen Lichtwellenleiter ausgekoppelt wird, d.h. das Ende des optischen Lichtwellenleiters, beweglich, insbesondere verschiebbar sein. Ein weiterer Vorteil eines optischen Lichtwellenleiters ist, dass die Lichtquelle, welche das Beleuchtungslicht emittiert, vom Lichtblattmikroskop entfernt angeordnet sein kann.In a further embodiment of the light sheet microscope according to the invention, an optical light waveguide can be arranged on the illumination side of the illumination objective, via which the illumination light can be coupled into the illumination objective. Coupling in the illuminating light via an optical light wave guide has the advantage that a flexible connection is possible via this. Furthermore, a decoupling facet of the optical light waveguide, via which the illuminating light is decoupled from the optical light waveguide, i.e. the end of the optical light waveguide, can be movable, in particular displaceable. Another advantage of an optical light waveguide is that the light source which emits the illuminating light can be arranged at a distance from the light sheet microscope.
Das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop kann weiter verbessert werden, indem auf der Beleuchtungsseite des Beleuchtungsobjektivs und/oder auf der Detektorseite des Detektionsobjektivs eine Scanvorrichtung angeordnet ist, die bezüglich einer optischen Achse des jeweiligen Objektivs beweglich und/oder verkippbar ist. Mittels der Scanvorrichtung kann ein Strahlengang von in das Beleuchtungsobjektiv einzukoppelndem Beleuchtungslicht bezüglich seiner Entfernung zur optischen Achse und/oder seines Winkels zur optischen Achse variiert werden. Es können somit zwei getrennte Scanvorrichtungen auf der Detektorseite und der Beleuchtungsseite vorgesehen sein. Ebenso kann eine gemeinsam genutzte Scanvorrichtung auf der Detektorseite und der Beleuchtungsseite vorgesehen sein.The light sheet microscope according to the invention can be further improved by arranging a scanning device on the illumination side of the illumination objective and / or on the detector side of the detection objective, which is movable and / or tiltable with respect to an optical axis of the respective objective. By means of the scanning device, a beam path of illuminating light to be coupled into the illuminating objective can be varied with regard to its distance to the optical axis and / or its angle to the optical axis. Two separate scanning devices can thus be provided on the detector side and the illumination side. A shared scanning device can also be provided on the detector side and the illumination side.
Eine Verkippung des Strahlengangs des Beleuchtungslichtes, d.h. eine Verkippung des Beleuchtungsstrahlengangs wird durch eine fokussierende Optik (oder das fokussierende optische System des Objektivs) in einen Versatz umgesetzt und entsprechend ein Versatz in eine Verkippung.A tilting of the beam path of the illuminating light, i.e. a tilting of the illuminating beam path, is converted into an offset by a focusing optics (or the focusing optical system of the objective) and, accordingly, an offset is converted into a tilt.
Da die Verwendung von Endlich-Objektiven keinen kollimierten Beleuchtungsstrahlengang erfordert, kann der Strahldurchmesser des Beleuchtungsstrahls vorteilhafterweise kleiner gewählt werden. Folglich kann auch die Scanvorrichtung kleiner gewählt werden, was neben Kostenersparnis auch zu einem Geschwindigkeitszuwachs des Scanvorgangs führen kann.Since the use of finite lenses does not require a collimated illumination beam path, the beam diameter of the illumination beam can advantageously be selected to be smaller. Consequently, the scanning device can also be selected to be smaller, which, in addition to cost savings, can also lead to an increase in the speed of the scanning process.
Eine bevorzugt kombinierte Variation des Versatzes und der Verkippung des Beleuchtungsstrahlengangs mittels der Scanvorrichtung erlaubt es, die Position des Lichtblatts im Probenvolumen, d.h. im Objekt zu variieren und beispielsweise durch das Objekt zu scannen, ohne dass das Probenvolumen oder das Beleuchtungsobjektiv bewegt werden müssen.A preferably combined variation of the offset and tilting of the illumination beam path by means of the scanning device allows the position of the light sheet in the sample volume, i.e. in the object, to be varied and, for example, to be scanned through the object without the sample volume or the illumination objective having to be moved.
Insbesondere kann das Lichtblatt in Breiten- und Höhenrichtung verschiebbar sein und somit das Beleuchten von Objekten ermöglichen, die (beispielsweise aufgrund ihrer Größe) mittels eines einzigen Lichtblattes nicht gänzlich beleuchtet werden können. Die Breitenrichtung kann als Richtung definiert werden, die innerhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs bzw. einer dazu parallelen Ebene liegt, d.h. senkrecht zur Detektionsachse und parallel zur Beleuchtungsachse, orientiert ist. Entsprechend kann die Höhenrichtung als Richtung definiert werden, die senkrecht zur Beleuchtungsebene liegt, aber parallel zur Detektionsachse der optischen Achse des Detektionsobjektivs orientiert ist. Bevorzugt sind die Breiten- und die Höhenrichtung senkrecht zueinander orientiert.In particular, the light sheet can be displaced in the width and height direction and thus enable the illumination of objects which (for example due to their size) cannot be completely illuminated by means of a single light sheet. The width direction can be defined as a direction which lies within the focal plane of the detection objective or a plane parallel to it, ie is oriented perpendicular to the detection axis and parallel to the illumination axis. Correspondingly, the height direction can be defined as a direction which is perpendicular to the plane of illumination but which is oriented parallel to the detection axis of the optical axis of the detection objective. The width and height directions are preferably oriented perpendicular to one another.
Der Versatz und/oder die Verkippung des Beleuchtungsstrahlengangs kann bei Benutzung des optischen Lichtwellenleiters auf einfache Weise dadurch realisiert werden, dass das bewegliche Ende des Lichtwellenleiters mittels einer entsprechenden Vorrichtung verschoben und/oder verkippt wird. Ebenso ist die Verwendung eines Kippspiegels oder mehrerer Kippspiegel möglich, um die Beleuchtung, das heißt die Lage des Lichtblattes, zu variieren. Alternativ oder zusätzlich kann das Beleuchtungsobjektiv ein oder mehrere elektrisch fokussierbare Linsen (engl.: electrically tunable lenses, ETL) beinhalten, deren Verstellung ebenfalls eine Variation der Lage des Lichtblatts ermöglicht. Sowohl das Beleuchtungsobjektiv, als auch das Detektionsobjektiv können bei allen diesen Varianten bezogen auf ihre räumliche Position statisch ausgestaltet sein und beim Scannen bezüglich dieser keine Beweglichkeit erfordern.The offset and / or the tilting of the illumination beam path can be implemented in a simple manner when using the optical fiber-optic cable in that the movable end of the optical fiber is displaced and / or tilted by means of a corresponding device. It is also possible to use one tilting mirror or several tilting mirrors in order to vary the lighting, that is to say the position of the light sheet. Alternatively or additionally, the lighting objective can contain one or more electrically focusable lenses (electrically tunable lenses, ETL), the adjustment of which also enables the position of the light sheet to be varied. In all of these variants, both the illumination objective and the detection objective can be configured statically in relation to their spatial position and do not require any mobility with respect to this during scanning.
Eine Verschiebung des Lichtblattes ist vorteilhafterweise damit verbunden, dass die Lage des Bereichs, welcher vom Lichtblatt beleuchtet und vom Detektionsobjektiv detektiert wird, über eine Scanvorrichtung nachgeregelt werden kann. Insbesondere, wenn das Lichtblatt entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs, also entlang der Höhenrichtung, verschoben wird, kann durch ein Nachregeln des Detektionsobjektivs stets eine scharfe Abbildung der beleuchteten Ebene auf einem Detektor sichergestellt sein. Allgemein kann diese Scanvorrichtung wie im Fall der Scanvorrichtung im Beleuchtungsstrahlengang auf verschiedene Weisen umgesetzt werden, die äquivalent zu den bereits oben für den Beleuchtungsstrahlengang genannten Varianten sein können. Ebenso ist eine Verschiebung des Lichtblattes entlang der Breitenrichtung möglich. In diesem Fall kann eine Scanvorrichtung im Detektionsstrahlengang den Detektionsstrahlengang nachregeln. Für beide Optionen des Nachregelns können verschiedene Kombinationen von ETL + Galvo bzw. Galvo + ETL verwendet werden, wobei der Effekt einer ETL wie oben beschrieben vorteilhaft durch eine Verschiebung des Objektivs und/oder Detektors bzw. der Lichtquelle erreicht werden. Die Verschiebung findet vorzugsweise senkrecht zur Beleuchtungsachse statt, so dass ein z-Stapel aufgenommen werden kann.A displacement of the light sheet is advantageously associated with the fact that the position of the area which is illuminated by the light sheet and detected by the detection lens can be readjusted via a scanning device. In particular, when the light sheet is displaced along the optical axis of the detection objective, that is to say along the height direction, readjusting the detection objective can always ensure a sharp image of the illuminated plane on a detector. In general, as in the case of the scanning device, this scanning device can be implemented in the illuminating beam path in various ways, which can be equivalent to the variants already mentioned above for the illuminating beam path. It is also possible to shift the light sheet along the width direction. In this case, a scanning device in the detection beam path can readjust the detection beam path. For both options of readjustment, different combinations of ETL + galvo or galvo + ETL can be used, the effect of an ETL, as described above, being advantageously achieved by shifting the objective and / or detector or the light source. The shift preferably takes place perpendicular to the illumination axis, so that a z-stack can be recorded.
Bevorzugt kann die Scanvorrichtung in der beleuchtungsseitigen Brennweite (Brennebene) des Beleuchtungsobjektivs und/oder in der detektorseitigen Brennweite des Detektionsobjektivs angeordnet sein. Diese Anordnung der Scanvorrichtung hat den Vorteil, dass beispielsweise eine Verkippung der Scanvorrichtung einer Veränderung der Lage (Parallelversatz) des Strahlenganges, beispielsweise einer Lichtquelle oder zum Detektor, entspricht. Zu beachten ist dabei, dass lediglich die Scanvorrichtung in der Brennweite angeordnet ist, nicht jedoch eine punktförmige Lichtquelle oder der Fokus einer Lichtquelle, da dies zur Kollimation das Beleuchtungslichts führen würde.The scanning device can preferably be arranged in the illumination-side focal length (focal plane) of the illumination objective and / or in the detector-side focal length of the detection objective. This arrangement of the scanning device has the advantage that, for example, a tilting of the scanning device corresponds to a change in the position (parallel offset) of the beam path, for example a light source or to the detector. It should be noted that only the scanning device is arranged in the focal length, but not a point light source or the focus of a light source, since this would lead to the collimation of the illuminating light.
Die Verkippung und der Versatz können durch ein Scannersystem der Scanvorrichtung erfolgen. Es können ein erster Scanspiegel und ein zweiter Scanspiegel vorgesehen sein, wobei der erste Scanspiegel kleiner als der zweite Scanspiegel sein kann und somit höhere Scanfrequenzen ermöglicht. Auf diese Weise kann beispielsweise während des langsamen Versatzes des Strahls noch eine schnellere Verkippung erzeugt werden. Ein solches Scannersystem kann einen parallelen Versatz des Strahlenganges ermöglichen. Ferner kann der Abstand zwischen dem Scannersystem und dem Objektiv beliebig und/oder veränderlich sein. Im Vergleich zu den Lichtblattmikroskopen aus dem Stand der Technik benötigt diese Ausgestaltung keine sogenannte Scanlinse, welche ein reelles Zwischenbild erzeugt, wobei in diesem Fall eine Scanvorrichtung an der Position des reellen Zwischenbildes der Scanlinse angeordnet ist. Somit kann insbesondere auf die optisch besonders aufwendige Scanlinse verzichtet werden. Bevorzugt können für ein Scannersystem der Scanvorrichtung kompakte MEMS-Spiegel (engl.: microelectromechanical systems) verwendet werden.The tilting and the offset can be done by a scanner system of the scanning device. A first scanning mirror and a second scanning mirror can be provided, wherein the first scanning mirror can be smaller than the second scanning mirror and thus enables higher scanning frequencies. In this way, for example, even faster tilting can be generated during the slow displacement of the beam. Such a scanner system can enable a parallel offset of the beam path. Furthermore, the distance between the scanner system and the objective can be arbitrary and / or variable. In comparison to the light sheet microscopes from the prior art, this embodiment does not require a so-called scanning lens, which generates a real intermediate image, in which case a scanning device is arranged at the position of the real intermediate image of the scanning lens. In particular, the optically particularly complex scan lens can thus be dispensed with. Compact MEMS mirrors (microelectromechanical systems) can preferably be used for a scanner system of the scanning device.
Beispielsweise ist mit einem solchen Scannersystem der Drehpunkt des Strahlbündels entlang der optischen Achse einstellbar. Das heißt auch, dass z.B. wenn das Objektiv verschoben wird, um die Vergrößerung zu ändern, diese Verschiebung durch den Scannersystem kompensiert werden kann, so dass auch in diesem Fall der Drehpunkt des Strahls wieder in der (beleuchtungsseitigen oder detektorseitigen) Fokusebene des Objektivs liegt.For example, with such a scanner system, the fulcrum of the beam can be adjusted along the optical axis. This also means that, for example, if the objective is shifted in order to change the magnification, this shift can be compensated by the scanner system, so that in this case, too, the pivot point of the beam is again in the focal plane (on the illumination side or on the detector side) of the objective.
Ferner kann im erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskop auf der Beleuchtungsseite des Beleuchtungsobjektivs und/oder auf der Detektorseite des Detektionsobjektivs ein räumliches Lichtmodulationselement angeordnet sein, welches mindestens zwei räumlich voneinander getrennte Bereiche unterschiedlicher optischer Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften aufweist.Furthermore, a spatial light modulation element can be arranged in the light sheet microscope according to the invention on the illumination side of the illumination objective and / or on the detector side of the detection objective, which has at least two spatially separated areas of different optical transmission and / or reflection properties.
Rein beispielhaft können Mikrospiegelaktuatoren (englisch: digital mirror device), kurz DMD, deformierbare Spiegel (englisch: deformable mirror), kurz DM oder räumliche Lichtmodulatoren (englisch: spatial light modulator), kurz SLM als räumliches Lichtmodulationselement verwendet werden.Purely by way of example, micromirror actuators (digital mirror device), DMD for short, deformable mirrors, DM for short, or spatial light modulators, SLM for short, can be used as spatial light modulation elements.
Ein DMD besteht aus einer Anordnung einzeln schaltbarer Spiegel, bevorzugt Mikrospiegel, mit denen Muster erzeugt werden können. Die Schaltstellungen der einzelnen Spiegel sind diskret und können beispielsweise binär oder trinär sein. Ein DMD erlaubt beispielsweise die Darstellung einer Ringblende.A DMD consists of an arrangement of individually switchable mirrors, preferably micromirrors, with which patterns can be generated. The switching positions of the individual mirrors are discrete and can be binary or trinary, for example. A DMD allows, for example, the representation of a ring diaphragm.
Ein DM weist eine kontinuierliche verspiegelte Oberfläche auf, die durch Aktuatoren verformbar ist. In Abhängigkeit von der Anzahl von Aktuatoren sind mit einem DM beinahe beliebige Oberflächenkurven der verspiegelten Oberfläche möglich, sodass dieser es erlaubt, Fehler in der Optik des entsprechenden Objektivs auszugleichen. Ferner ermöglicht ein DM, den Beleuchtungsstrahlengang und/oder den Detektionsstrahlengang bezüglich seiner Konvergenz oder Divergenz zu ändern, d.h. beispielsweise das Beleuchtungslicht zu fokussieren bzw. zu defokussieren.A DM has a continuous mirrored surface that can be deformed by actuators. Depending on the number of actuators, almost any surface curve of the mirrored surface is possible with a DM, so that it allows errors in the optics of the corresponding lens to be compensated. Furthermore, a DM enables the illuminating beam path and / or the detection beam path to be changed with regard to its convergence or divergence, i.e., for example, to focus or defocus the illuminating light.
Ein SLM arbeitet beispielsweise mit doppelbrechenden Flüssigkristallen um ortsabhängig das transmittierte oder reflektierte Licht mit Phasenunterschieden zu beaufschlagen. Durch eine entsprechende Ansteuerung kann eine fokussierende oder defokussierende Phasenplatte im SLM ausgebildet sein.An SLM works, for example, with birefringent liquid crystals in order to apply phase differences to the transmitted or reflected light depending on the location. A focusing or defocusing phase plate can be formed in the SLM by means of a corresponding control.
Das räumliche Lichtmodulationselement kann bevorzugt homogen ausgeleuchtet sein und erlaubt es durch die Konfiguration der einzelnen Bereiche, flexible Beleuchtungsmuster zu erzeugen. Im Detektionsstrahlengang kann das räumliche Lichtmodulationselement bevorzugt dafür verwendet werden, etwaige Fehler des Detektionsobjektivs auszugleichen bzw. über die Änderung des Strahlenganges durch das Detektionsobjektiv hindurch die Lage der Ebene zu variieren, welche auf dem Detektor scharf abgebildet wird. Die Lage dieser Ebene kann somit beispielsweise einer Lageänderung des Lichtblattes vom Detektionsobjektiv weg bzw. auf dieses zu nachgeregelt werden. Ferner kann das räumliche Lichtmodulationselement im Detektionsstrahlengang zur Manipulation des Streu- und/oder Fluoreszenzlichtes genutzt werden, beispielsweise zur Filterung von Raumfrequenzen.The spatial light modulation element can preferably be illuminated homogeneously and, through the configuration of the individual areas, allows flexible lighting patterns to be generated. In the detection beam path, the spatial light modulator element can preferably be used to compensate for any errors in the detection lens or to vary the position of the plane that is sharply imaged on the detector by changing the beam path through the detection lens. The position of this plane can thus, for example, be readjusted for a change in position of the light sheet away from the detection lens or towards it. Furthermore, the spatial light modulator element in the detection beam path can be used to manipulate the scattered and / or fluorescent light, for example to filter spatial frequencies.
Durch die mögliche Fokussierung bzw. Defokussierung im Beleuchtungsstrahlengang ist es möglich, das sich ausbildende Lichtblatt entlang bzw. entgegen der Längsrichtung, das heißt parallel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs, zu verschieben.Due to the possible focusing or defocusing in the illumination beam path, it is possible to shift the light sheet that is being formed along or against the longitudinal direction, that is to say parallel to the optical axis of the illumination objective.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops kann auf der Beleuchtungsseite des Beleuchtungsobjektivs und/oder auf der Detektorseite des Detektionsobjektivs ein brennweitenveränderliches optisches Element angeordnet sein. Wie zuvor beschrieben kann durch eine Änderung der Divergenz oder Konvergenz im Beleuchtungsstrahlengang die Lage des Lichtblattes entlang bzw. entgegen der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs variiert werden und/oder im Detektionsstrahlengang die Lage der scharf auf den Detektor abgebildeten Ebene variiert und insbesondere das Detektionsobjektiv auf eine Lageänderung des Lichtblattes vom Detektionsobjektiv weg oder auf dieses zu nachgeregelt werden.In a further embodiment of the light sheet microscope according to the invention, an optical element with variable focal length can be arranged on the illumination side of the illumination objective and / or on the detector side of the detection objective. As described above, by changing the divergence or convergence in the illumination beam path, the position of the light sheet along or against the optical axis of the illumination objective can be varied and / or the position of the plane sharply imaged on the detector can be varied in the detection beam path, and in particular the detection objective can be varied in response to a change in position of the light sheet can be readjusted away from the detection lens or towards this.
Insbesondere kann das brennweitenveränderliche optische Element als elektrisch durchstimmbare Linse (englisch: electrically tunable lens), kurz ETL, ausgestaltet sein.In particular, the focal length variable optical element can be configured as an electrically tunable lens, or ETL for short.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung kann das erfindungsgemäße Lichtblattmikroskop sowohl ein brennweitenveränderliches optisches Element, als auch eine Scanvorrichtung aufweisen. Eine derartige Kombination erlaubt es, das auszubildende Lichtblatt im Probenvolumen in allen drei Raumrichtungen zu verschieben und gemäß dieser Verschiebung die Lage der Ebene, welche vom Detektionsobjektiv scharf auf den Detektor abgebildet wird, der Lageänderung des Lichtblattes nachzuregeln, so dass die scharf abgebildete Ebene mit der Ebene, in welcher das Lichtblatt ausgebildet ist, übereinstimmt.In a particularly advantageous embodiment, the light sheet microscope according to the invention can have both an optical element with variable focal length and a scanning device. Such a combination makes it possible to shift the light sheet to be formed in the sample volume in all three spatial directions and, according to this shift, to adjust the position of the plane that is sharply imaged by the detection lens on the detector, the change in position of the light sheet, so that the sharply mapped plane with Plane in which the light sheet is formed, coincides.
Ein ähnlicher Effekt wie durch eine ETL kann auch linsenfrei erreicht werden, indem die Faser vor- und zurückgeschoben wird.An effect similar to that of an ETL can also be achieved without a lens by pushing the fiber back and forth.
Ferner ist ein Scanmodus vorteilhaft, bei dem die Faser nicht in der hinteren Brennebene liegt, jedoch eine Taumelbewegung ausführt. Eine Taumelbewegung ist als seitlicher Versatz gekoppelt mit einer entsprechenden Verkippung zu verstehen, wobei diese kombinierte Bewegung in der konjugierten Ebene näherungsweise einem parallelen Versatz des Strahls entspricht.Furthermore, a scan mode is advantageous in which the fiber is not located in the rear focal plane, but performs a wobbling motion. A tumbling movement is to be understood as a lateral offset coupled with a corresponding tilt, this combined movement in the conjugate plane approximately corresponding to a parallel offset of the beam.
Ferner kann eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops eine Lichtquellenanordnung vorsehen, die Licht mindestens einer Wellenlänge emittiert. Die Lichtquellenanordnung kann mindestens eine Lichtquelle, d.h. auch zwei, drei oder mehrere Lichtquellen aufweisen. Die Lichtquellen können diskret oder kontinuierlich sein oder diskrete und kontinuierliche spektrale Anteile aufweisen. Ferner kann die mindestens eine Lichtquelle ein Freistrahl-Laser oder ein fasergekoppelter Laser sein.Furthermore, a further embodiment of the light sheet microscope according to the invention can provide a light source arrangement which emits light of at least one wavelength. The light source arrangement can have at least one light source, i.e. also two, three or more light sources. The light sources can be discrete or continuous or have discrete and continuous spectral components. Furthermore, the at least one light source can be a free-beam laser or a fiber-coupled laser.
Wird ein fasergekoppelter Laser verwendet, so kann eine Strahlaufweitung direkt durch einen Kollimator erfolgen, wobei dem Auftreten möglicher chromatischer Abbildungsfehler vorgebeugt werden kann, indem achromatische Kollimatoren verwendet werden. Ebenso ist es möglich, auf reflektive Kollimatoren zurückzugreifen.If a fiber-coupled laser is used, the beam can be expanded directly by a collimator, whereby the occurrence of possible chromatic imaging errors can be prevented by using achromatic collimators will. It is also possible to use reflective collimators.
Werden Freistrahl-Laser verwendet, so können Vorrichtungen zur Strahlaufweitung vorgesehen sein. Diese können hinsichtlich chromatischer Abbildungsfehler korrigiert sein oder reflektive Optiken verwenden.If free-beam lasers are used, devices for beam expansion can be provided. These can be corrected for chromatic aberrations or use reflective optics.
Die Lichtquellenanordnung kann einen Ultrakurzpulslaser oder eine extrem breitbandige Lichtquelle, beispielsweise in Form eines Weißlichtlasers, aufweisen.The light source arrangement can have an ultrashort pulse laser or an extremely broadband light source, for example in the form of a white light laser.
Ebenso ist es möglich, dass die Lichtquellenanordnung gleichzeitig oder in einer alternierenden oder anderweitig getakteten Abfolge Licht mindestens zweier Spektralbereiche aus einem oder verschiedenen Lasern zur Verfügung stellt. Die mindestens zwei Spektralbereiche können sich stark voneinander unterscheiden, beispielsweise wenn Wellenlängen aus dem ultravioletten Spektralbereich (zum Beispiel um 405 nm) und Wellenlängen aus dem Nahinfrarotbereich (zum Beispiel 1300 nm) verwendet werden.It is also possible for the light source arrangement to provide light from at least two spectral ranges from one or different lasers at the same time or in an alternating or otherwise clocked sequence. The at least two spectral ranges can differ greatly from one another, for example if wavelengths from the ultraviolet spectral range (for example around 405 nm) and wavelengths from the near infrared range (for example 1300 nm) are used.
In solchen Anwendungsfällen ist die Verwendung von Spiegelobjektiven besonders vorteilhaft, da diese keine Dispersion und folglich keine chromatischen Abbildungsfehler aufweisen.In such applications, the use of mirror objectives is particularly advantageous, since they have no dispersion and consequently no chromatic imaging errors.
Im erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskop sind bevorzugt entlang der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs keine optischen Elemente mit einer Brechkraft angeordnet, die eine probenvolumenseitige Brennebene des Beleuchtungsobjektiv in das Probenvolumen verschieben und/oder entlang der optischen Achse des Detektionsobjektivs keine optischen Elemente mit einer Brechkraft angeordnet, welche die probenvolumenseitigen Brennebene des Detektionsobjektivs in das Probenvolumen verschieben.In the light sheet microscope according to the invention, there are preferably no optical elements with a refractive power arranged along the optical axis of the illumination objective, which shift a focal plane of the illumination objective on the sample volume side into the sample volume and / or no optical elements with a refractive power arranged along the optical axis of the detection objective, which the focal plane on the sample volume side of the detection objective into the sample volume.
Mit anderen Worten sind keine Linsen vorhanden, deren Verwendung den optischen Aufbau des Beleuchtungsobjektivs und/oder des Detektionsobjektivs derart modifizieren, dass aus einem endlich Aufbau ein unendlich Aufbau wird.In other words, there are no lenses whose use modify the optical structure of the illumination objective and / or the detection objective in such a way that a finite structure becomes an infinite structure.
Ebenso ist bevorzugt keine weitere Linse vorhanden, die als Tubuslinse bezeichnet werden kann oder als solche wirkt.Likewise, there is preferably no further lens which can be referred to as a tube lens or which acts as such.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand beispielhafter Ausgestaltungen näher erläutert. Die spezifischen Ausgestaltungen sind jeweils für sich vorteilhaft, wobei die technischen Merkmale der gezeigten Ausgestaltungen beliebig miteinander kombiniert und/oder weggelassen werden können. Gleiche technische Merkmale und technische Merkmale mit gleicher Funktion oder technischer Wirkung werden mit demselben Bezugszeichen versehen. Auf doppelte Erklärung wird der Übersichtlichkeit halber verzichtet.The present invention is explained in more detail below on the basis of exemplary configurations. The specific configurations are each advantageous in themselves, with the technical features of the configurations shown being able to be combined with one another and / or omitted as desired. The same technical features and technical features with the same function or technical effect are provided with the same reference symbols. For the sake of clarity, no duplicate explanation is made.
Es zeigen:
-
1a eine erste Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops; -
1b die schematische Darstellung einer Taumelbewegung der Lichtquelle; -
2a eine zweite Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops; -
2b das Lichtblattmikroskop der2a mit einem Kippspiegelsystem; -
3 eine dritte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops; -
4 eine vierte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops; -
5 eine fünfte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops; und -
6 eine sechste Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Lichtblattmikroskops.
-
1a a first embodiment of the light sheet microscope according to the invention; -
1b the schematic representation of a tumbling movement of the light source; -
2a a second embodiment of the light sheet microscope according to the invention; -
2 B the light sheet microscope of2a with a tilting mirror system; -
3 a third embodiment of the light sheet microscope according to the invention; -
4th a fourth embodiment of the light sheet microscope according to the invention; -
5 a fifth embodiment of the light sheet microscope according to the invention; and -
6th a sixth embodiment of the light sheet microscope according to the invention.
Das Lichtblattmikroskop
Der Einfachheit halber sind beide Objektive
Die in
Analog der
In
Der gezeigte Beleuchtungsstrahlengang
Das Beleuchtungslicht
Im Probenvolumen
Sowohl das Beleuchtungsobjektiv
Im Allgemeinen weist das Beleuchtungsobjektiv
Wie aus
In
Die Objektive
Im Stand der Technik (nicht gezeigt) weisen die Objektive
In
In den folgenden
Die in
In der in
In
Die optische Faser
In
Eine solche Kombination ermöglicht, abgesehen vom Versatz vor-zurück 70d, alle Freiheitsgrade
Die
Das in
In
In weiteren Ausgestaltungen des Lichtblattmikroskops
Beide Elemente
Die Scanvorrichtung
Sowohl der räumliche Lichtmodulator
In
Die ETL
Die sich unterscheidenden Konvergenzen
In einer weiteren Ausgestaltung kann die ETL
Auch die ETL
Die
Sowohl der Beleuchtungsstrahlengang
Auch die gezeigte fünfte Ausgestaltung weist ein über die Scanvorrichtung
Die
In
Die Immersionsobjektive
Die gezeigten transparenten Grenzflächen
Die technischen Merkmale der in den
BezugszeichenlisteList of reference symbols
- 11
- LichtblattmikroskopLight sheet microscope
- 33
- optische Hauptbestandteilemain optical components
- 55
- BeleuchtungsobjektivLighting lens
- 66th
- LinsensystemLens system
- 77th
- DetektionsobjektivDetection lens
- 99
- optische Achseoptical axis
- 9a9a
- optische Achse des Beleuchtungsobjektivsoptical axis of the illumination lens
- 9b9b
- optische Achse des Detektionsobjektivsoptical axis of the detection lens
- 1111
- BikonvexlinseBiconvex lens
- 1313th
- refraktives Objektivrefractive lens
- 1515th
- SpiegelobjektivMirror lens
- 1717th
- optischer Lichtwellenleiteroptical fiber optic cable
- 1919th
- optische Faseroptical fiber
- 2121
- BeleuchtungslichtIlluminating light
- 2323
- BeleuchtungsseiteLighting side
- 2525th
- ProbenseiteSample side
- 2727
- BeleuchtungsstrahlengangIlluminating beam path
- 27a27a
- erster Beleuchtungsstrahlengangfirst illumination beam path
- 27b27b
- zweiter Beleuchtungsstrahlengangsecond illumination beam path
- 2929
- DetektionsstrahlengangDetection beam path
- 3131
- ProbenvolumenSample volume
- 3333
- LichtblattLight sheet
- 3535
- LängsrichtungLongitudinal direction
- 3737
- BreitenrichtungWidth direction
- 3939
- HöhenrichtungHeight direction
- 4141
- Objektobject
- 4343
- HauptebeneMain level
- 43a43a
- beleuchtungsseitige Hauptebenemain level on the lighting side
- 43b43b
- probenvolumenseitige Hauptebenemain plane on the sample volume side
- 43c43c
- detektorseitige Hauptebenemain level on the detector side
- 45a45a
- beleuchtungsseitige Brennweitefocal length on the lighting side
- 45b45b
- probenvolumenseitige Brennweitefocal length on the sample volume side
- 45c45c
- detektorseitige Brennweite focal length on the detector side
- 46a46a
- Brennweite des BeleuchtungsobjektivsFocal length of the lighting lens
- 46b46b
- Brennweite des DetektionsobjektivsFocal length of the detection lens
- 4747
- Abstanddistance
- 4949
- Filterfilter
- 5151
- Detektordetector
- 5353
- DetektorseiteDetector side
- 5555
- Streu- und/oder FluoreszenzlichtScattered and / or fluorescent light
- 5757
- Endeend
- 5959
- ScanvorrichtungScanning device
- 6161
- Verschiebungshift
- 61b61b
- probenvolumenseitige Verschiebungsample volume shift
- 6363
- auf endlich korrigiertes Objektivon finally corrected lens
- 6565
- konjugierte Ebeneconjugate plane
- 65a65a
- konjugierte Ebene des Beleuchtungsobjektivsconjugate plane of the illumination lens
- 65b65b
- konjugierte Ebene des Detektionsobjektivsconjugate plane of the detection objective
- 6767
- gefalteter Strahlengangfolded beam path
- 6969
- nicht gefalteter Strahlengangnon-folded beam path
- 7070
- TaumelbewegungTumbling motion
- 70a70a
- VersatzOffset
- 70b70b
- VerkippungTilt
- 70c70c
- ParallelversatzParallel offset
- 70d70d
- Versatz vor-zurückOffset front-back
- 70e70e
- Versatz links-rechtsLeft-right offset
- 70f70f
- Verkippung horizontalHorizontal tilt
- 7171
- zweite Scanvorrichtungsecond scanning device
- 7373
- KippspiegelTilting mirror
- 7474
- KippspiegelsystemTilting mirror system
- 7575
- DrehachseAxis of rotation
- 75a75a
- erste Drehachsefirst axis of rotation
- 75b75b
- zweite Drehachsesecond axis of rotation
- 77a77a
- erste Drehungfirst turn
- 77b77b
- zweite Drehungsecond rotation
- 8181
- Fokusfocus
- 81a81a
- Facettefacet
- 81c81c
- Detektionsfokus Detection focus
- 8383
- ÖffnungswinkelOpening angle
- 8585
- räumliches Lichtmodulationselementspatial light modulation element
- 8787
- MikrospiegelaktuatorMicromirror actuator
- 8989
- KoordinatensystemCoordinate system
- 9191
- deformierbarer Spiegeldeformable mirror
- 9393
- räumlicher Lichtmodulatorspatial light modulator
- 9292
- stetige und kontinuierliche Spiegeloberflächesteady and continuous mirror surface
- 9595
- PolarisatorPolarizer
- 9797
- PixelelektrodePixel electrode
- 9999
- FlüssigkristallschichtLiquid crystal layer
- 101101
- RückseitenelektrodeBack electrode
- 103103
- ReflexionselementReflective element
- 105105
- brennweitenveränderliches optisches Elementfocal length variable optical element
- 107107
- elektrisch durchstimmbare Linse (ETL)electrically tunable lens (ETL)
- 109a109a
- erste Brennweitefirst focal length
- 109b109b
- zweite Brennweitesecond focal length
- 111a111a
- erste Konvergenzfirst convergence
- 111b111b
- zweite Konvergenzsecond convergence
- 113113
- UmlenkspiegelDeflection mirror
- 114114
- LichtquellenanordnungLight source arrangement
- 115115
- LichtquelleLight source
- 117117
- Laserlaser
- 119119
- ImmersionsobjektivImmersion lens
- 121121
- transparente Grenzflächetransparent interface
- 123123
- ImmersionsflüssigkeitImmersion liquid
- 125125
- ProbenkammerSample chamber
- 127127
- dünne Membranthin membrane
- 129129
- FreiheitsgradeDegrees of freedom
Claims (12)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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