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Stand der Technik
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In vielen in-vitro Diagnostiktests dient Blut als Ausgangsprobenmaterial. Um die eigentliche zu ermittelnde Größe (e.g. ein spezifischer DNA Abschnitt, ein spezifisches Protein) zu messen, wird das Blut durch eine Verkettung verschiedener Laborschritte aufgearbeitet. Insbesondere werden Blutzellen zentrifugiert, lysiert oder filtriert, bevor dann die Zielquantität gemessen oder charakterisiert wird. Ein Aufarbeitungsschritt beinhaltet in der Regel das Bestimmen der vorhandenen Probemenge. Dabei wird gemessen, wie viele Zellen in der Probe ungefähr vorhanden sind. Diese Information ist besonders wichtig, da in der nachgeschalteten Nachweismethode in der Regel von einer definierten Inputmenge ausgegangen wird. Im Allgemeinen wird für die Analyse erwartet, dass sich in der Probe eine bestimmte Anzahl Zellen befinden, um die Messung in quantitativen Kontext zu setzen. Sind weniger oder mehr Zellen vorhanden, kann die Probe mittels Verdünnung oder Anreicherung angepasst werden. schlimmstenfalls (wenn die Zellanzahl für die vorgesehenen Analyseschritte ungeeignet ist) wird die Probe verworfen.
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Point-of-care (PoC) Anwendungen sind in-vitro Diagnostika (IVD), welche in der Regel beim Patienten gemessen werden, ohne dass die Probe in ein Zentrallabor eingeschickt werden muss. Dabei wird die Probeaufbereitung in der Regel von einer patientennahen Person (einem anwesenden Arzt, Pfleger oder einer MPA (Medizinisch Physikalischen Assistentin)) ausgeführt, welcher eine unzureichende Ausbildung und auch unzureichend Zeit hat, um komplexe Probeaufbereitungsschritte zuverlässig und in wiederholbarer Qualität durchzuführen. Daher müssen für ein Point-of-Care in-Vitro-Diagnostikverfahren die Anzahl fluidischer Schritte (Schritte die das Handling der Probe selbst betreffen) einfach und auf ein Minimum von händischen Schritten reduziert werden, um auch bei relativ unerfahrenen Anwendern eine hohe Reproduzierbarkeit der Bearbeitung zu erreichen. Insbesondere kann solches patientennahes Personal keine eigene Zählung der Zellen vornehmen. Auch eine Anpassung der Konzentration einer Probe bereitet einem solchen Anwender erhebliche Schwierigkeiten. Als Konsequenz muss ein IVD am PoC die Fähigkeit haben, diese Volumenanpassung der Probe zur Vorbereitung der automatischen Analyse ebenfalls automatisch auszuführen.
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Offenbarung der Erfindung
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Hier soll eine mikrofluidische Vorrichtung zur Vorbereitung einer Probe mit Zellsuspension vorgeschlagen werden, welches sich zur Anwendung im klinischen Alltag besonders eignet.
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Insbesondere soll mit der Vorrichtung ein einfaches Verfahren ermöglicht werden, welches eine Blutprobe so aufbereitet, dass die Zellzahl in einem definierten Intervall liegend festgelegt ist und die Probe dann in eine automatisierte In-Vitro-Diagnose überführt werden kann. Das Verfahren ist mit der Vorrichtung und unabhängig von der Vorrichtung einsetzbar und verwendbar
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Die Vorrichtung und das Verfahren basieren auf den Konzepten der Mikrofluidik. Dies beinhaltet in der Regel eine Integration von mehreren fluidischen Prozess- und Messschritten. Dies führt in der Regel zu komplexeren Testabläufen, welche herausfordernd in der mikrofluidischen Integration sind.
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Die Vorrichtung dient zur Aufbereitung Probe mit Zellsuspension für eine automatisierte Analyse und sie weist eine Kanüle mit einer Kapillare und Saugmitteln zum Einsaugen der Probe in die Kapillare auf, wobei die Kapillare eine Innenwand mit einer für Zellen adhärenten Eigenschaften aufweist.
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Mit einer Probe „mit“ Zellsuspension ist insbesondere eine Probe bestehend aus Zellsuspension gemeint, die beispielsweise eine Blutprobe sein kann.
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Die Kapillare hat ein längliches Innenvolumen welches einen Hohlzylinder bildet. Bevorzugt liegt die Innenwand mit der für Zellen adhärenten Eigenschaft nur im Bereich dieses Hohlzylinders vor. In diesem Hohlzylinder hat allerdings die gesamte Innenwand die beschriebenen adhärenten Eigenschaften für Zellen.
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Die Saugmittel umfassen insbesondere einen Anschluss an welchen Mittel zum Erzeugen eines Unterdrucks zum Einsaugen der Probe und ggf. auch zum Erzeugen eines Überdrucks, um die Probe ganz oder teilweise wieder auszustoßen, angeschlossen werden kann. An die Saugmittel kann eine manuell betätigbare Saugvorrichtung angeschlossen werden. An die Saugmittel kann alternativ auch eine automatisch betätigbare Saugvorrichtung angeschlossen werden.
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Durch das Einsaugen einer Probe mit Zellsuspension in die Vorrichtung gelangen die Zellen in der Probe in die Nähe der Innenwand mit den adhärenten Eigenschaften und sie bleiben hieran haften. Die Zellen bedecken die Innenwand mit den adhärenten Eigenschaften vollständig. Durch die Fläche der Innenwand mit den adhärenten Eigenschaften ist die Menge an Zellen (ungefähr) definiert, die auf der Oberfläche anhaften. Es ist wünschenswert, dass eine etwas größere Menge von der Probe eingesaugt wird, als notwendig dafür ist, die Kapillare bzw. den Hohlzylinder der Kapillare vollständig auszufüllen, damit jeder Teil der Innenwand mit adhärenten Eigenschaften Gelegenheit hat mit Zellsuspension in Kontakt zu gelangen. Es ist allerdings nicht erforderlich, dass die Menge an eingesaugtem Probenmaterial absolut exakt eingehalten wird, weil durch die Menge an eingesaugtem Probenmaterial nicht vorgegeben wird wieviele Zellen in die weitere Probenauswertung gelangen. Dies wird vielmehr durch die Fläche der Innenwand mit adhärenten Eigenschaften definiert.
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Besonders bevorzugt ist die Vorrichtung, wenn die Innenwand der Kapillare mit mindestens einem Adhäsionsmolekül beschichtet ist.
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Außerdem bevorzugt ist die Vorrichtung, wenn die Innenwand der Kapillare mit mindestens einem der folgenden Moleküle beschichtet ist:
- - Leukozytenadhäsionmoleküle,
- - Poly-D-Lysin,
- - Fibronektin, und
- - spezifische Marker.
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Die Kapillare ist besonders bevorzugt aus einem der folgenden Materialien gefertigt:
- - Glas,
- - Flexible Polymerschläche, z.B. Tygon,
- - Polycarbonat, und-
- - Metalllegierungen.
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Mit einer für Zellen „adhärenten“ Eigenschaft der Innenwand der Kanüle ist gemeint, dass die Innenwand der Kanüle so ausgeführt ist, dass Zellen an dieser Innenwand haften.
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Der Kern des beschriebenen Verfahrens besteht darin, dass eine Kanüle oder Kapillare beschichtet wird, damit Zellen daran unspezifisch haften bleiben. Über die Innenmantelfläche wird die Anzahl der möglichen Zellen durch die Saturation durch Zellen kontrolliert, überflüssige Zellen werden wieder ausgestoßen. Durch eine Volumenreduktion in der Kanüle durch ein bewegliches Teil können diese Zellen in ein kleineres Volumen überführt werden und für weitere Tests lysiert werden.
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Aus der Vorrichtung und dem Verfahren mit welchem diese Vorrichtung angewendet wird ergeben sich folgende Vorteile:
- 1) Es stellt sich immer die gleiche Anzahl Zellen in einem Toleranzintervall für weitere Tests ein.
- 2) Probevorbereitungsverfahren für quantitative Messungen werden weniger komplex.
- 3) Es können Zellen von einem großen Volumen in ein kleines Volumen überführt werden.
- 4) Durch die Wahl von einer unspezifischen Zelladhäsionbeschichtung müssen keine teuren spezifischen Proteine beschafft werden. Die unspezifische Bindung ist in diesem Zusammenhang kein Problem, da man alle Zellen die im Blut schwimmen adressieren will.
- 5) Die Vorrichtung kann mit Komponenten aufgebaut werden, die auch schon in anderen Bereichen Verwendung finden.
- 6) Die Verwendung der Vorrichtung ist zu einem großen Teil unabhängig vom nachfolgend eingesetzten Tests und kann mit verschiedenen Analyseplattformen kombiniert werden.
- 7) Die Verwendung der Vorrichtung kann in wenigen Schritten manuell ausgeführt werden ohne große Kentnisse der Methode. Insbesondere kann patientennahes Personal diese Schritte einfach ausführen.
- 8) Die Verwendung der Vorrichtung lässt sich auch als Methode zur Ansammlung von zirkulierenden Tumorzellen verwenden.
- 9) Die Anwendung kann auch in ein automatisiertes Pipettiersystem integriert werden.
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Auch vorteilhaft ist die Vorrichtung, wenn die Kapillare im Bereich der Innenwand ein Innenvolumen hat, in welches ein Verdrängerkörper eingebracht werden kann, um das Innenvolumen auf ein reduziertes Innenraumvolumen zu verkleinern.
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Darüber hinaus vorteilhaft ist, wenn der Verdrängerkörper nach Art eines Zylinderstabs ausgeführt ist und die Vorrichtung einen Einschiebeanschluss aufweist, in welchen der Verdrängerkörper koaxial zu der Kapillare in die Kapillare eingeführt werden kann.
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Besonders bevorzugt sind der Einschiebemechanismus, der Verdrängerkörper und die Kapillare so ausgeführt, dass der Verdrängerkörper zentral in der Kapillare Volumen verdrängt, dabei jedoch nicht in Kontakt mit der Kapillarwand gelangt und insbesondere keine mechanische Ablösung von Zellen an der Kapillarwand bewirkt wird. Bevorzugt wird der Verdrängerkörper in der Mitte der Kapillare eingeführt.
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Hier auch beschrieben werden soll ein Verfahren zur Aufbereitung einer Probe mit Zellsuspension aufweisend die folgenden Schritte:
- a) Einbringen der Probe in die Kapillare der Vorrichtung, so dass sich auf der Innenwand der Kapillare ein Film von Zellen aus der Probe bildet,
- b) Ausstoßen einer Restprobe aus der Kapillare,
- c) Ablösen der Zellen in dem Film von der Innenwand, um eine definierte Zellmenge für eine weitere Verarbeitung zu erhalten.
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Das beschriebene Verfahren kann insbesondere mit der beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden. Das Einbringen in Schritt a) ist dann insbesondere ein Einsaugen der Probe in die Kapillare mit den Saugmitteln der beschriebenen Vorrichtung.
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Die im Zusammenhang mit der beschriebenen Vorrichtung erläuterten besonderen Vorteile und Ausstattungsmerkmale sind in analoger Weise auf das beschriebene Verfahren anwendbar und übertragbar. Gleiches gilt für die im folgenden erläuterten besonderen Vorteile und Ausgestaltungsmerkmal des Verfahrens, welche entsprechend auf die beschriebene Vorrichtung anwendbar und übertragbar sind.
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Das Einbringen in Schritt a) geschieht wie beschrieben insbesondere dadurch, dass das Saugmittel einer beschriebenen Vorrichtung betätigt wird. Wenn das Saugmittel eine manuell betätigbare Saugvorrichtung ist, wird diese Saugvorrichtung manuell betätigt. Wenn es sich um eine automatisch betätigbare Saugvorrichtung handelt, kann die Betätigung der Saugvorrichtung auch automatisch ausgelöst werden, beispielsweise dadurch, dass erkannt wird, dass die Vorrichtung sich an einer Probe befindet.
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Aufgrund der adhärenten Eigenschaften der Innenwand der Kapillare lagert sich der Film von Zellen nach dem Einsaugen automatisch auf der Innenwand der Kapillare ab.
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Durch das Ausstoßen der Restprobe aus der Kapillare in Schritt b) verbleiben in der Kapillare nur die Zellen, welche an der Innenwand der Kapillare anhaften. Nun existiert eine definierte Probenmenge. Die Genauigkeit dieser Menge hängt in Teilen von der Zellgröße bzw. der stochastischen Verteilung der Zellgröße der Zellen in dem Film ab. Die Genauigkeit ist jedoch für viele weitere Probenverarbeitungsschritte bereits ausreichend hoch.
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Durch das Ablösen der Zellen in dem Film in Schritt c) von der Innenwand wird die Probe für die weitere Verarbeitung zur Verfügung gestellt.
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Das Verfahren ist bevorzugt, wenn vor Schritt a) ein Aktivieren von Adhäsionsmechanismen von Zellen in der Probe erfolgt.
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Durch die Aktivierung eines derartigen Mechanismus kann die Haftung der Zellen an der Innenwand der Kapillare deutlich verbessert werden. Es gibt verschiedene im folgenden erläuterte Adhäsionsmechanismen, die bei Zellen aktivierbar sind und die für das beschriebene Verfahren verwendbar sind.
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Darüber hinaus besonders vorteilhaft ist das Verfahren, wenn vor Schritt c) ein Deaktivieren von Adhäsionsmechanismen von Zellen in der Probe erfolgt.
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Besonders bevorzugt erfolgt Schritt c) durch ein Spülen der Kanüle mit Lysepuffer mit welchen auch RNA oder DNA aus den Zellen extrahiert wird.
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Durch einen Lysepuffer kann der Adhäsionsmechanismus deaktiviert werden. Ein solches Deaktivieren eines Adhäsionsmechanismus verbessert das Ablösen der Zellen von der Innenwand bzw. die Auflösung des Films an der Innenwand deutlich.
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Die Vorrichtung und ein Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung werden nachfolgend anhand der Figuren näher erläutert. Es ist darauf hinzuweisen, dass das Verfahren und die Vorrichtung nicht auf die Lehre der Figuren begrenzt ist, sondern die Figuren nur ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung und des Verfahrens zeigen. Die Figuren zeigen im Einzelnen:
- 1a bis 1e: den Gesamtprozess des beschriebenen Verfahrens,
- 2: ein Beispiel für die Aktivierung eines Adhäsionsmechanismuses einer Zelle,
- 3: eine geometrische Beschreibung einer Kapillare
- 4: eine Skizze einer beschriebenen Vorrichtung.
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In 1a bis 1e wird der Gesamtprozess des beschriebenen Verfahrens mit der beschriebenen Vorrichtung gezeigt. Dabei liegt eine Blutprobe 1 in einem definierten Volumen vor. Dies ist in 1b dargestellt. Für klinisch relevante PoC und mikrofluidische Anwendungen sind dies in der Regel 100-1000 µL. Weniger Volumen macht aus klinisch-statistischen Gründe oft keinen Sinn. Handelt es sich um eine Vollblutprobe, wird empfohlen in einer standardmässigen selektiven Lyse die Erythrozyten vor Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens zu lysieren.
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Die Suspension oder Teile davon, wird dann in eine behandelte Kapillare 2 einer Kanüle 3 eingezogen. Dies ist in 1b dargestellt. Die Kanüle 3 ist eine Art Rohr insgesamt mit Wandung. Die Kapillare 2 ist die in diesem Rohr gebildete Leitung. Das Material der Wandung ist nicht Teil der Kapillare 2 sondern das Material der Wandung formt lediglich die Kapillare 2. Das Material der Wandung ist allerdings Teil der Kanüle 3 bzw. des Rohrs. Die Kanüle 2 kann auch als ein von dem Material der Kapillare 3 gebildeter Hohlraum bezeichnet werden.
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Die Kapillare 2 der Kanüle 3 hat eine Innenwand 6 mit für Säugerzellen (insbesondere für Leukozyten) adhärenten Eigenschaften und sie bildet einen Hohlzylinder 10. Durch diese Eigenschaften lagern sich die Zellen in der Suspension an der Mantelfläche der Kanüle ab. Ist die Mantelfläche gesättigt, i.e. es gibt keine Adhärentsfläche mehr, stellt sich in der Regel eine definierte Anzahl von Zellen ein. Zellen die sich nicht binden konnten, können wieder ausgestoßen werden. Dies ist in 1c dargestellt. Es existiert dann nur noch ein Film 11 von Zellen auf der Innenwand der Kapillare 2 der Kanüle 3, der die Bereiche der Innenwand der Kapillare mit adhärenten Eigenschaften vollständig bedeckt. Die Oberfläche wird mit Zellen gesättigt bzw. saturiert. Durch die Größe der Fläche der Innenwand mit adhärenten Eigenschaften kann die Gesamtzahl an Zellen definiert werden, die nachfolgend weiteren Analyseschritten zugeführt werden.
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Es bleibt eine Kanüle mit einer zellschichtgesättigten Oberfläche zurück. Die Kanüle 3 bzw. die Kapillare 2 kann modelhaft als ein Hohlzylinder 10 betrachtet werden, welcher ein Totalvolumen VT1 fasst. In einem nächsten Schritt kann mechanisch ein Verdrängerkörper 9 (bevorzugt in Form eines Zylinderstabes) in der Mitte des Hohlzylinders 10, welcher die Kapillare 2 bildet, eingeführt werden. Dies ist in 1d dargestellt. Hierdurch reduziert sich das Volumen VT1 in der Kapillare 2 der Kanüle 3 auf ein kleineres Volumen VT2. Nun kann in diesem kleineren Volumen ein Lysepuffer eingezogen werden und aus den Zellen DNA oder RNA extrahiert werden.
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Der große Vorteil bei dieser Umsetzung ist, dass eine relative grosse Menge Blut mit der gleichen Kanüle bearbeitet werden kann und man für die Lyse ein viel kleineres Volumen benutzen kann, um das Zellmaterial zu konzentrieren. Die Methode erlaubt also ein Bearbeiten von einem grossen Probevolumen in dem die gesuchten Analyten - in diesem konkreten Fall die Blutzellen - in ein kleineres Volumen überführt werden können. Über die Saturierung der Oberfläche liegt die Anzahl von gebundenen Zellen in einem konstanten Intervall.
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1e zeigt ein Spülen der Kanüle, um den Film von der Innenwand zu lösen.
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Sollte es gewünscht sein, Zellen aus einem kleineren Volumen in ein größeres Volumen zu überführen, dann kann die Abfolge in umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden. Dies ist insbesondere gewünscht, wenn man denselben Effekt nicht durch Verdünnen erreicht. Für eine adhärente Oberfläche kann die Mantelfläche beschichtet werden. Als allgemeine Beschichtungen eignen sich im allgemeine Adhäsionsmoleküle wie Poly-D-Lysin oder Fibronektin. Auch Leukozytenadhäsionmoleküle eignen sich besonders. Es können aber auch Oberflächenbehandlungen eingesetzt werden, welche affin zu einem Lipidbilayer sind. Soll eine hochfrequentierter Zelltyp aus der Blutprobe isoliert werden, dann können auch spezifische Marker eingesetzt werden. Als Beispiel kann hier die positive Isolation von CD4+ oder CD8+ Zellen aufgeführt werden. Dies ist insbesondere für immunologische Anwendungen interessant.
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In 2 wird gezeigt, wie die Bindung von Blutzellen an der Mantelfläche effizienter gemacht werden kann. Leukozyten in Blut sind in der Regel Monozyten, i.e. nicht im Zellverbund und liegen daher als Einzelzellsuspension vor, insbesondere wenn mit EDTA versetzt. Leukozyten befinden sich aber nicht immer im Blut, sondern können in die Lymphgefässe oder Gewebe wandern. Dazu müssen diese dem Blutstrom entkommen, was über Zelladhäsionsignalwege geschieht. Diese Zellprozesse finden in der Regel im Rahmen von Immunreaktionen statt. Dabei gibt es Immunsignale wie zum Beispiel LPS, LPA oder IFNa durch welche Blutzellen eine schnelle Signalkaskade auslösen durch welche die Adhäsionsmoleküle auf der Zellmembrane freigesetzt werden. Somit kann der Vollblutprobe ein solcher Stoff dazugegeben werden, um die Zellen in einen adhärenteren Zustand zu überführen. So findet eine Aktivierung von Adhäsionsmechanismen von Zellen in der Probe statt. 2 zeigt einen unbehandelten Leukozyten 7, der durch Zugabe eines Adhäsionsmoleküls A in einen behandelten Zustand 8 überführt wird in welcher ein solcher Leukozyt besser an einer Oberfläche haftet.
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Der in der Klinik klassisch eingesetzte Stoff EDTA agiert als starker Chelator, i.e. Metallkationen wie Ca2+ und Mg2+ werden stark gebunden und stehen für andere Prozesse nicht mehr frei zur Verfügung. Genau diese Kationen werden aber für Adhäsionsmoleküle von Blutzellen wie Selektine oder Integrine für den Bindungsprozess benötigt. Um daher Zellen wieder in einen adhärenten Zustand zu überführen, kann ein stöchiometrisches Äquivalent von Calcium (in Form eines Calciumhalogensalzes) hinzugefügt werden. Beide oder nur ein einzelner Enhancer kann als Lyophilisat als Feststoff bei Raumtemperatur vorgelagert und dazugegeben werden. Durch die Zugabe eines Äquivalents von Calcium in die Kapillare 2 der Kanüle 3 können Zellen also wieder von der Kapillare 2 bzw. der Kanüle 3 gelöst werden. So findet ein Deaktivieren von Adhäsionsmechanismen von Zellen in der Probe statt.
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In 3 ist die technische Umsetzung der Kapillare 2 als Hohlzylinders 10 gezeigt. Die zu absorbierende Fläche, ist dabei die Innenwand des Hohlzylinders. Kapillaren (z.B. aus Glas, Tygon oder Polycarbonat) oder klassische Spritzenkanülen aus Metalllegierungen können da angewandt werden, welche beschichtet werden (z.B. Poly-D-Lysin oder Fibronektin). Die Fläche A kann durch das Produkt von Durchmesser d1 und der Kapillarenlänge h berechnet werden. Die Sättigung dieser Fläche A bestimmt das Intervall an gebunden Zellen in der Kanüle. Diese kann für verschiedene Tests beliebig, durch die Variation von d1 und h, entworfen werden. Das Totalvolumen VT1 ist dann ebenfalls durch diese zwei Parameter (d1,h) definiert. Mit der Konzentration des Beschichtungsmoleküls kann das Sättigungsintervall weiter verfeinert werden. Die Totalanzahlzellen sind dann abhängig von der durchschnittlichen Zellgrösse und Streuung. Bei der Wahl der Parameter ist zudem zu beachten, dass die Totalzellzahl in VT1 über der Sättigungszahl an Zellen sein muss, also ein Zellüberschuss vorliegen soll.
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Der Volumenverdränger für den zweiten Prozessschritt hat dabei einen Durchmesser d2, wobei d1 > d2 ist und besitzt eine Länge h. Mit der Variation von d2 kann dann das zweite, verkleinerte Totalvolumen VT2 eingestellt werden.
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Blutproben werden in der Regel in mit bekannter Konzentration an EDTA beschichteten Röhrchen eingezogen. Diese behandelten Röhrchen sind nötig, damit während der Blutentnahme und vor dem Einzug in die hier vorgeschlagene Adhäsions- und Lyseeinheit kein Blutklotting entsteht.
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4 zeigt weitere Komponenten der Vorrichtung 4. Zu erkennen sind die in Form eines Anschluss ausgeführten Saugmittel 5, die Kanüle 3 mit der Kapillare 2 sowie der stabförmige Verdrängerkörper 9, welcher in einen Einschiebeanschluss an der Vorrichtung eingeführt ist.
