DE102019124795A1

DE102019124795A1 - Optischer pH-Sensor

Info

Publication number: DE102019124795A1
Application number: DE102019124795.0A
Authority: DE
Inventors: Shamil Nizamov
Original assignee: Abberior GmbH
Current assignee: Abberior GmbH
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2021-03-18
Also published as: WO2021052934A1; GB2601972B; GB202203206D0; US20230003702A1; GB2601972A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen pH-Sensor zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums mindestens umfassend eine polymere Matrix aufweisend eingebettete phosphoreszierende Nanopartikel und einen oder mehrere eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe, wobei die phosphoreszierenden Nanopartikel Übergangsmetallkomplexe mit Zentralatomen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Ru, Re, Os, Rh, Ir, Pt und der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-Derivate nach der folgenden Formel Ioder deren geladene Strukturen umfasst, wobei n größer oder gleich 5 und kleiner oder gleich 20 ist, X = -O-, -OH, -OR4, -NH2, -NH- oder NHR4, wobei R4ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C20 Alkyl und die R1, R1', R2, R3unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus H, D, substituiertes oder nicht substituiertes C1-C20 Alkyl und Halogen ausgesucht sind. Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren sowie ein System zur Bestimmung des pH-Wertes.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen pH-Sensor zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums mindestens umfassend eine polymere Matrix aufweisend eingebettete phosphoreszierende Nanopartikel und einen oder mehrere eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe, wobei die phosphoreszierenden Nanopartikel Übergangsmetallkomplexe mit Zentralatomen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Ru, Re, Os, Rh, Ir, Pt und der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein-Derivate nach der folgenden Formel I
oder deren geladene Strukturen umfasst, wobei n größer oder gleich 5 und kleiner oder gleich 20 ist, X = -O-, -OH, -OR⁴, -NH2, -NH- oder NHR⁴, wobei R⁴ ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C20 Alkyl und die R¹, R^1', R², R³ unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus H, D, substituiertes oder nicht substituiertes C1-C20 Alkyl und Halogen ausgesucht sind. Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren sowie ein System zur Bestimmung des pH-Wertes.
Die verlässliche Ermittlung des pH-Wertes ist zur umfassenden Untersuchung und Prozesskontrolle von Reaktionsabläufen in biologischen und chemischen Systemen unerlässlich. Seit den Anfängen der modernen Chemie sind optische Säure-Basen-Indikatoren, wie beispielsweise Lackmus, Phenolphtalein oder Methylrot bekannt, deren Licht-Absorptionseigenschaften, sprich deren Farbe, sich in Abhängigkeit der vorliegenden Hydroxoniumionen-Konzentration ändern. Für den flexiblen Einsatz im industriellen Umfeld und besonders für kontinuierliche Messungen haben sich aber letztendlich elektrochemische Verfahren etabliert, welche den pH-Wert wässriger Lösungen über eine Änderung des elektrochemischen Potentials einer Metall-Elektrode erfassen. Die elektrochemische Bestimmung ist hinreichend robust gegenüber der chemischen Umgebung der Messlösung und lässt sich, eine geeignete Kalibrierung vorausgesetzt, in einem breiten pH-Wertebereich einsetzten. Erst in den letzten Jahren sind insbesondere für biotechnologische Anwendungen wieder optische Systeme in den Fokus gerückt, welche anstatt der Absorptions- die Lumineszenzeigenschaften organischer Moleküle nutzen. Auch die Lumineszenz eines Moleküls kann sich in Abhängigkeit des aktuellen Ladungsstatus ändern und durch eine geeignete Wahl des Luminophors können Systeme bereitgestellt werden, welche in festgelegten pH-Wertebereichen große Änderungen der optischen Eigenschaften zeigen. In diesen Anwendungen werden Fluorophore genutzt, deren Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz eine Funktion des pH-Wertes ist. Es sind im Vergleich zu den elektrochemischen also prinzipiell maßgeschneiderte, „sensiblere“ optische Systeme verfügbar, welche in einem selektiven Messbereich eine höhere Präzision erreichen können.
Insbesondere für den Einsatz in Bioreaktoren eignen sich Kombinationssysteme zweier unterschiedlicher Luminophore, wobei einer der Luminophore eine pH-unabhängige Phosphoreszenz und der andere Luminophor eine pH-abhängige Fluoreszenz zeigt. Die Zentren werden gleichzeitig durch Einstrahlung von Licht geeigneter Wellenlänge angeregt und als Antwort ergibt sich in der Zeitdomäne ein Summensignal mit unterschiedlichen Intensitätsbeiträgen. Kurz nach der Anregung erhält man in einem frühen Detektionszeitraum sowohl Fluoreszenzwie auch Phosphoreszenzanteile, wohingegen zu einem späteren Zeitpunkt die Phosphoreszenzanteile überwiegen. Aus dem Intensitätsverhältnis der pH-abhängigen frühen Anteile (Phosphoreszenz + Fluoreszenz) und der pH-unabhängigen späteren Anteile (Phosphoreszenz) lässt sich, eine geeignete Kalibrierung vorausgesetzt, unabhängig von der Trübung der Messlösung und stabiler gegenüber Schwankungen des optischen Systems, der pH-Wert erhalten.
Ein allgemeines Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes über die Ermittlung eines Verhältnisses phosphoreszenter und fluoreszenter Beiträge ist aus dem Stand der Technik bekannt. So beschreibt beispielsweise die EP 1 000 345 B1 ein Verfahren zur Lumineszenzbestimmung eines biologischen, chemischen oder physikalischen Parameters einer Probe unter Verwendung zumindest zweier verschiedener Leuchtstoffe (flu, ref), deren erster (flu) zumindest in der Lumineszenzintensität auf den Parameter anspricht und deren zweiter (ref) zumindest in der Lumineszenzintensität und der Abklingzeit auf den Parameter nicht anspricht, wobei die Leuchtstoffe (flu, ref) unterschiedliche Abklingzeiten aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die Abklingzeit des zweiten Leuchtstoffs (ref) länger ist als die des ersten Leuchtstoffs (flu) und dass das Zeit- oder Phasenverhalten der additiv überlagerten Lumineszenzantworten beider Leuchtstoffe durch einen einzigen Detektor gemessen wird und dass eine von der Gesamtintensität beider Leuchtstoffe unabhängige Referenzgröße aus dem gemessenen Zeit- oder Phasenverhalten erhalten wird und dass der Parameter unter Verwendung der Referenzgröße bestimmt wird.
Auch gemischt elektrische/optische Sensoren sind aus dem Stand der Technik bekannt. So offenbart beispielsweise die DE 10 2012 021 933 A1 einen optischen Sensor insbesondere für pH-Werte mit photolumineszierender und oder fluoreszierender Schicht, Lichtquelle und Detektor, wobei die mindestens eine photolumineszierende und oder fluoreszierende Schicht mindestens einen elektrischen Kontakt aufweist, und damit als eine Arbeitselektrode wirkt und der pH-Sensor mit mindestens einer Gegenelektrode und mindestens einer Referenzelektrode ausgestattet ist und die photolumineszierende Schicht ein Potential aufweist.
Auch der Einbau von Luminophoren in organische Matrices zur Bestimmung physikalischer Parameter ist bekannt. Die US 6,051,437 A1 offenbart beispielsweise eine optisch-chemische Sonde mit mindestens einem Farbstoff zum Nachweis des Vorhandenseins chemischer Analyte und ein Polymerfilm zum Binden des mindestens einen Farbstoffs, wobei der polymere Film aus aufeinanderfolgenden Schichten anionischer und kationischer Polyelektrolyte besteht.
Nachteilig an den doppelten Luminophorsystemen ist, dass sich zur verlässlichen Bestimmung des pH-Wertes die beiden Luminophore in einem geeigneten Abstand zueinander und in einer flüssigkeitsdurchlässigen Matrix befinden müssen. Letzteres um einen schnellen und innigen Kontakt mit dem zu messenden Medium zur erreichen. Aus diesem Grund werden die optischen Sonden meist in poröse Polymermatrices eingebettet, welche das System mechanisch stabilisieren und für geeignete Diffusionseigenschaften sorgen. Eine hohe Flüssigkeitsdurchlässigkeit der Matrix ist für ein schnelles Ansprechverhalten besonders wichtig, führt aber meistens zu Luminophor-Verlusten, welche durch ein Auswaschen der fluoreszenten oder phosphoreszenten Zentren aus der Matrix heraus bedingt sind. Eine geeignete Kombination aus hoher Sensitivität, schnellem Ansprechverhalten, großen dynamischem Messraum und langer Standzeit des Sensors ist demzufolge schwer zu erreichen.
Trotz der schon im Bereich der Analytik bekannten optischen pH-Messsysteme besteht weiterhin ein Interesse an neuen pH-Sensoren, welche selbst unter schwierigen Randbedingungen der Analysemethode in der Lage sind, hoch genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern und eine lange Standzeit aufzuweisen.
Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Ansprüchen beschriebenen pH-Sensor, dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes und dem erfindungsgemäßen System erfüllt. Bevorzugte Ausführungsformen derselben sind in den Unteransprüchen wiedergegeben.
Erfindungsgemäß umfasst der pH-Sensor zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums mindestens eine polymere Matrix, aufweisend eingebettete phosphoreszierende Nanopartikel und einen oder mehrere eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe, wobei die phosphoreszierenden Nanopartikel Übergangsmetallkomplexe mit Zentralatomen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Ru, Re, Os, Rh, Ir, Pt aufweisen; und der Fluoreszenzfarbstoff ein Fluorescein-Derivat nach der folgenden Formel I ist
oder dessen geladene Strukturen umfasst, wobei n größer oder gleich 5 und kleiner oder gleich 20 ist, X = -O-, -OH, -OR⁴, -NH2, -NH- oder NHR⁴, wobei R⁴ ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C20 Alkyl und die R¹, R^1', R², R³ unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus H, D, substituiertes oder nicht substituiertes C1-C20 Alkyl und Halogen ausgesucht sind. Überraschend wurde gefunden, dass obiger Aufbau aus polymerer Matrix mit den beiden beanspruchten unterschiedlichen Luminophorklassen, wobei eine der Klassen ausgesprochen phosphoreszente und die andere Klasse ausgesprochen fluoreszente Eigenschaften aufweist, zu einem besonders effizienten, langzeitstabilen pH-Sensor führt, dessen Messwerte zudem gegenüber einem weiten Spektrum weiterer Seiteneinflüsse, wie beispielsweise der Ionenstärke, weitgehend stabil ist. Insbesondere ist hervorzuheben, dass sich im Vergleich zu den im Stand der Technik beschriebenen Lösungen, ein deutlich verbessertes Auswaschverhalten ergibt, welches die Stabilität der Sensorsignale als Funktion der Lebensdauer im zu messenden Medium deutlich erhöht. Es wird also im Messbereich ein äußerst sensitiver Sensor bereitgestellt, welcher ein schnelles Ansprechen auf einen geänderten pH-Wert des Messmediums zeigt. Die Luminophore sind auswaschsicher in der polymeren Matrix verankert, sodass sich auch nach langen Zeiträumen nur eine äußerst geringe Intensitätsänderung der Signale ergibt. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, ergeben sich diese positiven Eigenschaften insbesondere durch die spezielle Anlagerung der fluoreszenten Komponente in der polymeren Matrix. Dies scheint über die direkte Anbindung einer längeren Alkylkette in der -NHCO-Alkyl-Gruppe besonders effizient zu gelingen, sodass Verluste dieser Komponente ins Messmedium hinein verringert werden können. Dies ist überraschend, da die erfindungsgemäß einzusetzende Gruppe sich eher nahe am fluoreszenten Kern des Moleküls befindet und sich durch die restlichen, eher voluminösen, Substituenten eine sterische Abschirmung zur weiteren Polymermatrix ergeben sollte. Dies ist aber anscheinend nicht der Fall, sodass diese funktionelle Gruppe, eventuell über elektrostatische Wechselwirkungen, stabiler an unterschiedliche Polymerrückgrate bindet, sodass über die Zeit ein ungewolltes Ablösen dieser Komponente effizient unterdrückt wird. Insgesamt ergibt sich somit ein effizienter, langzeitstabiler pH-Sensor. Des Weiteren ist es möglich, über die Art der R¹-Reste den Messbereich des pH-Sensors einzustellen, sodass mit nur geringen Modifikationen am Fluorophor unterschiedliche pH-Messbereiche mit einer hohen Sensitivität gemessen werden können. Man erhält also ein flexibles System, welches sich einfach auf die vorhandene Messaufgabe adaptieren lässt.
Der erfindungsgemäße pH-Sensor ist zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums geeignet. Der pH-Wert bezeichnet dabei die in der Chemie übliche Definition als negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration oder besser deren Aktivität. Ein wässriges Medium ergibt sich im Sinne der Erfindung, wenn der Wassergehalt der Lösung, in welche der pH-Wertesensor vorliegt, einen Volumenanteil von größer oder gleich 50%, bevorzugt von größer oder gleich 70 %, des Weiteren bevorzugt von größer oder gleich 80% aufweist. Das wässrige Medium kann natürlich noch weitere Bestandteile wie Salze, organische Lösungsmittel, biologische Bestandteile, gelöste Gase oder weitere, feste Bestandteile aufweisen.
Der pH-Wertesensor umfasst eine polymere Matrix, aufweisend eingebettete phosphoreszierende Nanopartikel und einen oder mehrere eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe. Eine polymere Matrix umfasst dabei zumindest ein Polymernetzwerk, bevorzugt mit hydrophilen und hydrophoben Domänen, wobei die einzelnen Polymerketten des Netzwerkes über physikalische oder kovalente Wechselwirkungen miteinander verbunden sein können. Das Netzwerk bildet einen physikalischen Schutz und sorgt dafür, dass die Luminophore in der Messlösung ihren Platz weitgehend einhalten und die Messlösung nicht kontaminieren. Das Netzwerk ermöglich zudem einen guten Wassertransport, welcher auch durch die Gegenwart hoher Konzentrationen an optischen Sonden nicht gestört wird. Vorzugsweise ist das Netzwerk porös und gestattet somit den Zutritt des Messmediums gegebenenfalls unter Wasseraufnahme, d.h. Quellung, des gesamten Netzwerkes.
Das polymere Netzwerk weist dabei Nanopartikel auf, welche Substanzen oder Komplexe umfassen, welche nach Bestrahlen mit einer Lichtquelle phosphoreszente Eigenschaften aufweisen. D.h. die Substanzen können durch Absorption eines Lichtquants in einen elektronisch angeregten Zustand überführt werden, wobei dieser elektronisch angeregte Zustand auf einer langen Zeitskala wiederum durch die Aussendung eines Lichtquants in den elektronischen Grundzustand übergeht. Vorzugsweise beträgt die Phosphoreszenzlebensdauer des phosphoreszenten Luminophors größer oder gleich 200 ns. Neben der phosphoreszenten Verbindung weist die Matrix zudem fluoreszente Verbindungen auf, welche ebenfalls durch Aufnahme eines Lichtquants in einen elektronisch angeregten Zustand übergehen können. Auch diese angeregten Zustände zerfallen unter Aussendung eines Lichtquants, aber, im Vergleich zu den phosphoreszenten Luminophoren, auf einer deutlich kürzeren Zeitskala (beispielsweise im ns-Bereich). Übliche Fluoreszenz-Lebensdauern können beispielsweise unterhalb von 15 ns, bevorzug unterhalb von 10 ns und des Weiteren bevorzugt unterhalb von 7 ns liegen. Die beiden Luminophor-Klassen liegen beispielsweise homogen in der polymeren Matrix verteilt vor.
Die phosphoreszierenden Nanopartikel weisen Übergangsmetallkomplexe mit Zentralatomen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Ru, Re, Os, Rh, Ir, Pt auf. Die phosphoreszierenden Luminophore werden also durch Metall-Komplexe gebildet, welche in Nanopartikeln eingebettet vorliegen. Das Einbetten der Metall-Komplexe in Nanopartikel kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass zur Phosphoreszenz befähigte Metallkomplexe zusammen mit einem oder mehreren Polymeren in nanopartikulärer Form abgeschieden werden. Beispielsweise können die phosphoreszenten Komplexe mit oben genannten Zentralatomen unter Zutritt organischer wie anorganischer Liganden aufgebaut werden, wobei diese dann anschließend in einem Polymer eingebettet werden. Diese Polymer/Metallkomplexmischung kann dann durch den Fachmann bekannte Methoden in Form von Nanopartikeln abgeschieden oder erhalten werden. Durch den Einbau der phosphoreszenten Metallkomplexe in die Nanopartikel können diese vor dem Zutritt weiterer, unerwünschter Substanzen, wie beispielsweise Sauerstoff, geschützt und die phosphoreszenten Metallkomplexe weiterhin in der polymeren Matrix des Sensors immobilisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zentralatome der Übergangsmetallkomplexe aus der Gruppe Ru, Ir und Pt ausgesucht sein.
Der erfindungsgemäß einzusetzende Fluoreszenzfarbstoff ist ein Fluorescein-Derivat nach der folgenden Formel I
wobei der Farbstoff auch dessen geladene Strukturen umfasst. Dies bedeutet, dass je nach Resonanzstruktur an den bindungsfähigen Zentren noch ein oder weitere Wasserstoffe angelagert oder abstrahiert sein können. Des Weiteren ist es auch möglich, dass über die Markush-Gruppe CO-X eine Ringstruktur am Grundgerüst des Fluorophors ausgebildet wird. Dies wird dadurch zum Ausdruck gebracht, dass beispielsweise X für Hydroxyl auch in der Form -O-möglich ist. So ist es möglich, dass diese Markush-Formel eine Carbonsäuregruppe (CO-X mit X = -OH) oder aber auch eine Verbindung, in welcher die Carbonsäuregruppe durch Anbindung an die weiteren Strukturen des Fluorophors zyklisch vorliegt, repräsentiert. Es handelt sich dabei um tautomere Strukturen, welche durch Reaktion der Carbonsäuregruppe mit weiteren Strukturen des Ringgerüsts unter Abspaltung des Wasserstoff-Protons ausgebildet werden. Die Bindungen zu beiden Seiten des Sauerstoffs deuten also den Einbau in eine zyklische Struktur an, welche durch eine Umlagerung gebildet wird. Üblicherweise handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion, wobei die Anteile der zyklischen und nicht-zyklischen Strukturen durch die restliche Struktur des Fluorophors und die chemische Umgebung bestimmt wird. Es können sich für die erfindungsgemäßen Fluorophore offene und geschlossene Strukturen ergeben, wobei zur Verdeutlichung im nachfolgenden Schema die weiteren funktionellen Gruppen des Fluorophors nicht dargestellt werden:
Beide Formen liegen üblicherweise im Gleichgewicht miteinander vor, wobei die Lage des Gleichgewichtes und damit auch die vorherrschende strukturelle Form über die chemische Umgebung bestimmt wird. Für den Fall, dass X eine stickstoffhaltige Gruppe repräsentiert gilt natürlich entsprechendes. Für den Fall, dass X für eine -OR Gruppe steht, können natürlich keine geschlossenen Strukturen ausgebildet werden.
Zur Definition der einzelnen Markush-Gruppen für oben angegebene Formel I ist n größer oder gleich 5 und kleiner oder gleich 20, X = -O-, -OH oder -NH2 oder -NH- und die R¹, R^1', R², R³ können unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus H, D, substituiertes oder nicht substituiertes Alkyl und Halogen ausgesucht sein. Der Index n kann also oben genannten Wertebereich umfassen, wobei größere Werte für n den Wassertransport in der polymeren Matrix verschlechtern können. Die R¹ bis R³ in der Formel I können unabhängig voneinander einen substituierten oder nicht substituierten Alkylrest umfassen, wobei Akyl für einen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 C-Atomen steht. Dieser Kohlenwasserstoffrest kann ein, zwei oder drei Substituenten, wie beispielsweise -OH, Halogene, -CN, NO₂ aufweisen. Die Halogene können insbesondere aus der Gruppe Cl, F, Br ausgesucht sein. Durch diese Gruppen können die Fluoreszenzeigenschaften des Fluorophors mit beeinflusst werden. Insbesondere für R¹ und R^1' hat sich herausgestellt, dass sich über die chemischen Eigenschaften dieser Reste die Lage des pH-Messbereiches ändern lässt. Werden für die R¹ elektronenziehende Gruppen, wie beispielsweise Fluor, eingesetzt, so kann der Messbereich des Sensors in den sauren Bereich hin verschoben werden. Es lassen sich beispielsweise Messfenster bis zu pH 5 realisieren. Werden an diesen Stellen elektronendichtespendende Gruppen, wie beispielsweise Alkylgruppen, eingesetzt, so kann der Messbereich in den alkalischen Bereich bis zu pH 8 verschoben werden. Durch die geeignete Wahl dieser Substituenten lässt sich also der Sensor flexibel durchstimmen und auf die zu messende Umgebung anpassen. Weiterhin kann in einer bevorzugten Ausführungsform n größer oder gleich 8 und kleiner oder gleich 20 und des Weiteren größer oder gleich 9 und kleiner oder gleich 18 sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des pH-Sensors kann n größer oder gleich 10 und kleiner oder gleich 18 sein. Insbesondere die längeren Alkylketten können zu einer verbesserten Stabilität und Sensitivität des Sensors beitragen. Gerade mit n = 10 bis 16 ergeben sich lange Standzeiten des Sensors, wobei beim Einfahren des Sensors nur ein geringer Einbruch der Intensitäten durch Auswaschen beobachtbar ist. Dies deutet darauf hin, dass der Sensor mit dieser C-Atom-Anzahl in dieser Seitenkette sehr gut in der Polymermatrix verankert ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des pH-Sensors kann X = -OH oder -O- sein. Für eine besonders quanteneffiziente und „auswaschsichere“ Verbindung hat es sich als günstig herausgestellt, dass die Markush-Gruppe mit dem X eine Carbonsäuregruppe oder deren weiteres Reaktionsprodukt in Form einer zyklischen Verbindung aufweist. Diese Ausgestaltung der X-Gruppe kann die Langlebigkeit des Sensors erhöhen.
In einer weiteren, bevorzugten Charakteristik des pH-Sensors kann der Fluoreszenzfarbstoff ein 5-N-(Octadecanoyl)aminofluorescein nach der folgenden Strukturformel II sein
Gerade dieser Fluorophor kann über das dargestellte Substitutionsmuster besonders effizient an die polymere Matrix gebunden werden, sodass neben einer hohen Quanteneffizienz, einem schnellen Ansprechverhalten, einer sehr hohen Genauigkeit auch sehr langzeitstabile pH-Sensoren erhältlich sind, welche nur einen geringen Grad an Auswaschungen zeigen.
Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform des pH-Sensors kann der Fluoreszenzfarbstoff ein 5-N-(Octadecanoyl)aminofluorescein nach den folgenden Strukturformeln IIIA oder IIIB sein
Diese beiden tautomeren Formen haben sich als besonders sensitiv und auswaschsicher gezeigt. Zudem zeigen diese Fluorophore eine besonders große Änderung des Fluoreszenzverhaltens als Funktion des pH-Wertes.
In einem weiteren Aspekt des pH-Sensors kann die polymere Matrix aus der Gruppe bestehend aus HYPAN, Polyurethan, Poly-Hema, oder Mischungen mindestens zweier Komponenten daraus ausgewählt sein. Die Anbindung der erfindungsgemäß einsetzbaren Luminophore an oben genannte Polymere hat sich als besonders effizient und langzeitstabil erwiesen. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein ergibt sich dies hochwahrscheinlich auch durch das erfindungsgemäße Substitutionsmuster des Fluorophors mit der Anbindung einer längeren Alkylkette an die -NHCO- Gruppe. Diese Kombination kann dazu beitragen, dass Verluste dieser Komponente ins Messmedium hinein verringert werden können.
In einer weiteren Ausgestaltung des pH-Sensors kann die polymere Matrix zu einem Gewichtsanteil von größer oder gleich 75 % und kleiner oder gleich 100% Polyurethan umfassen. Die erfindungsgemäß einsetzbaren Luminophore lassen sich insbesondere gut an Polyurethane koppeln und führen so zu besonders langzeitstabilen Sensoren. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, scheint dies auf die Wechselwirkung besonders der -HNCO-Gruppe und der daran angekoppelten Alkylgruppe des Fluorophors mit dem Rückgrat des Polyurethans zurückführbar zu sein. Dies kann zum einen durch die besonderen elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den unterschiedlichen Sauerstoff- und Stickstoffatomen der funktionellen Gruppe des Fluorophors und durch die van-der-Wals-Wechselwirkungen der an dieser Gruppe vorliegenden Alkylkette mit dem oben genannten Polymerrückgrat gegeben sein. Weiterhin bevorzugt kann der Polyurethan-Anteil größer oder gleich 85 %, bevorzugt größer oder gleich 90 % (Gew.-%) betragen. Der Anteil ergibt sich als der Anteil an den Polymeren, welche die Matrix ausbilden und lässt sich nach Auflösen der Matrix mittels üblicher HPLC-Methoden bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des pH-Sensors können die phosphoreszierenden Nanopartikel ein Ru-Zentralatom aufweisen. Für die erfindungsgemäß einsetzbare Kombination aus den beiden unterschiedlichen Luminophoren haben sich Nanopartikel mit Metallkomplexen umfassend Ruthenium-Zentralatome als besonders geeignet herausgestellt. Es ergeben sich hohe Quatenausbeuten und zudem sind die spektralen Anregungseigenschaften zwischen phosphoreszenten und fluoreszenten Zentrum hinreichend gleich, sodass die Anregung beider über Licht eines engen spektralen Bereiches erfolgen kann. Dies kann dazu beitragen, den Aufbau und die Optik des Sensors zu vereinfachen.
Im Rahmen einer weiteren Ausgestaltung des pH-Sensors können die phosphoreszierenden Nanopartikel durch Einbetten von Ru(dpp)₃Cl₂ in eine Matrix aus Polyacrylnitril ausgebildet werden. Gerade die Kombination von in ein Acrylnitril eingebetteten Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)ruthenium(II)-dichlorid-Komplex mit den erfindungsgemäßen fluoreszenten Luminophoren kann zu einer hohen Quantenausbeute und zu einem stabilen System beitragen. Die Nanopartikel weisen also Ruthenium-Zentralatome mit Diphenyl-Phenanthroline-Liganden auf, welche eine lange Lumineszenslebensdauer, hohe Quantenausbeuten und eine ausgezeichnete thermische und chemische Stabilität zeigen. Insofern eignen sich die derart ausgerüsteten Nanopartikel insbesondere zur Verwendung mit den erfindungsgemäß einsetzbaren fluoreszenten Luminophoren.
Weiterhin erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums, wobei das wässrige Medium mit dem erfindungsgemäßen pH-Sensor kontaktiert und die Fluoreszenzeigenschaften der Zusammensetzung über Bestrahlen der Zusammensetzung mit Licht und Aufnehmen der Fluoreszenzantwort der Zusammensetzung bestimmt werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich hoch präzise und über einen langen Bobachtungszeitraum der pH-Wert in wässrigen Medien bestimmen. Diese Methode eignet sich insbesondere für den Einsatz in Bioreaktoren, da die eigentliche Bestimmung der optischen Eigenschaften des Sensors von „Außen“ erfolgen kann. Insofern kann eine einfache Trennung der unterschiedlichen Messkomponenten im Rahmen des Verfahrens erreicht werden. Des Weiteren wird für die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens explizit auf die Vorteile des erfindungsgemäßen pH-Sensors verwiesen.
Des Weiteren erfindungsgemäß ist ein System zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums, wobei das System eine Lichtquelle, eingerichtet zur Aussendung von Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches; einen erfindungsgemäßen pH-Sensor; einen optischen Sensor, eingerichtet um zeit- und wellenlängenaufgelöste Lichtsignale zu detektieren und eine Auswerteeinheit, eingerichtet um die Intensität der zeit- und wellenlängenaufgelösten Lichtsignale zu bestimmen, umfasst. Mittels des oben genannten Systems lassen sich sehr klangzeitstabile pH-Wertemessungen durchführen. Erfindungsgemäße Systeme können insbesondere den pH-Wert wässriger Lösungen in einem pH-Wertebereich von ca. 4 bis 9 über eine Zeitdauer von bis zu mehreren Tagen mit einer hohen Präzision verfolgen. Ein einzelnes erfindungsgemäßes System kann dabei an einen engeren pH-Wertebereich, z.B. an einen Wertebereich von 5 bis 8, adaptiert sein, in dem es eine besonders hohe Sensitivität aufweist. Zur Messung der optischen Eigenschaften können bevorzugt blaue LEDs als Lichtquellen eingesetzt werden. Zu den weiteren Vorteilen des erfindungsgemäßen Systems wird auf die Vorteile des erfindungsgemäßen pH-Sensors verwiesen.
Beispiele
Die Herstellung des erfindungsgemäßen pH-Wertesensors kann beispielsweise drei-schrittig erfolgen:

Schritt 1: Herstellung lumineszierender Nanopartikel aus Polyacrylnitril und Ru(dpp)₃Cl₂

Es wird mittels Dispersionspolymerisation ein Polyacrylnitril-Nanopartikel mit einem mittleren Partikeldurchmesser unterhalb von 100 nm hergestellt. Ein Gemisch aus Acrylnitril (6 ml), Ru(dpp)₃Cl₂ (Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)ruthenium(II) dichlorid, 10 mg) in DMF (2 mL), PVA (MW=80 kDa, 1 mg), AIBN (1mg) und Wasser (150ml) wird auf ca. 60°C erhitzt und über 20 Stunden gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 50% wässrigen Ethanol und Wasser gewaschen. Die phosphoreszenten Nanopartikel werden anschließend in Wasser (50 mL) suspendiert.
Schritt 2: Herstellung der Farbstoff-Lösung mit fluoreszierenden Farbstoffmolekülen
Es wird eine Lösung 2 hergestellt indem N-Octadecyl-5-carboxamidofluorescein in 90% wässerigem Ethanol gelöst wird. Es wird eine Konzentration von 5 mM erhalten.
Schritt 3: Herstellung der Polymermatrix
Es wird eine Lösung 3 hergestellt indem Hydrogel D4 in 90% (v/v) wässerigem Ethanol gelöst wird. Es wird eine Konzentration von 4% (w/w) erhalten.
Schritt 4: Herstellung des pH-Sensors
Die Suspension 1, Lösung 2 und Lösung 3 werden in Verhältnis 1:4:20 (v/v/v) vermischt bis eine homogene Verteilung der Lösungen/Suspension erreicht ist. Die homogene Mischung wird in einer Schichtdicke von ca. 1 µm auf eine ebene Platte ausgebracht und unter Erwärmen getrocknet.
Auswaschung des optischen Sensors im Blindtest
Eine Lösung aus Hydrogel D4 in 90% (v/v) wässerigem Ethanol wird zusammen mit einer wässrigen Suspension von Ru-Nanopartikeln (2% w/w) gemischt. 4 Proben wurden aus der resultierenden Mischung entnommen und je 1 g davon mit verschiedenen Fluorescein-Derivaten gemischt. Es ergeben sich folgende Proben:

- Probe 1 (Blind): ohne Fluorescein-Derivat
- Probe 2 (C0): 5-Aminofluorescein (5µmol)
- Probe 3 (C12): 5-Dodecanoylaminofluorescein (5µmol)
- Probe 4 (C18): 5-Octadecanoylaminofluorescein (5µmol)

Jede Probe wurde in einem 250 ml Kolben gegeben und über 24 Stunden getrocknet. Zu den getrockneten Matrices werden jeweils 100 ml ein Ammoniak Pufferlösung pH = 9,5 gegeben und jeder Kolben wurde bei 37°C für 72 h gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die wässrige Lösung abfiltriert und lyophilisiert. Die Menge an ausgewaschenem Material wird nach der folgenden Formel: %(Auswaschen) = [m(Rest)-m(Blind)]/m(Cx) berechnet.

Probe C0 C12 C18

Auswaschen 7,2% 5,7% 1,2%
Die Menge an ausgewaschenem Material ergibt sich dabei sowohl aus den optischen Komponenten des Systems wie auch aus dem Matrixmaterial selber. Die Auswaschversuche zeigen, dass nur ein äußerst geringer Anteil des Sensors aus der Matrix gelöst wird. Zudem scheinen längere C-Ketten am Stickstoff die Menge an ausgewaschenem Material zu reduzieren.
Kalibration des pH-Sensors
Der durch die Verfahrensschritte 1-3 hergestellte Sensor wurde mittels PBS-Pufferlösungen kalibriert. The PBS-Puffer weist bei einem pH-Wert von ungefähr 7,4 eine Ionenstärke I von 0,142 auf. Zur Einstellung der unterschiedlichen pH-Werte im Bereich zwischen pH 5,0 und pH 9,0 wurde 0,142M Salzsäure oder 0,142M NaOH-Lösung verwendet. Der pH-Wert an den einzelnen Datenpunkten wurde nach einer Kalibrierungszeit von mindestens 4 Minuten gemessen. Die Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt (+- 1°C). Die Bestimmung der jeweiligen pH-Werte an den Kalibrierpunkten erfolgte mittels eines digitalen pH-Meters.
Die Zusammensetzung des Puffers bei pH 7,4 ist über die nachstehende Tabelle angegeben.

Reagenz MW in g Einsatzmenge in g Einsatzmenge in Mol

Na₂HPO₄ 141,95 1,419 0,010

KH₂PO₄ 136,08 0,244 0,001

NaCl 58,44 8,006 0,137

KCl 74,55 0,201 0,002
Die Ergebnisse der Kalibrationskurve sind in der 1 dargestellt. Die Kurve zeigt die Abhängigkeit des Phasenwinkels von dem pH-Wert. Die dargestellten Messpunkte ergeben sich aus dem Mittelwert vierer unabhängiger Messungen. Die Fehlerbalken ergeben sich anhand der Standardabweichung der Messungen pro pH-Wert. Es zeigt sich, dass das erfindungsgemäße System aus Nanopartikel, Polymer und Fluorophor einen sehr großen Unterschied im Phasenwinkel als Funktion des pH-Wertes zeigt (2). Mit anderen Worten, das erfindungsgemäße System ist ein sehr sensitives System, welches auch kleinste Änderungen des pH-Wertes über eine große Änderung des Phasenwinkels auflöst. Dies ist insbesondere im Bereich zwischen pH 6,0 und pH 8,0 der Fall. Zudem zeigt das System für unterschiedliche Chargen eine äußerst geringe Standardabweichung, sodass sich das erfindungsgemäße System für sehr reproduzierbare Messungen eignet. Betrachtet man den Bereich um einen pH-Wert von 6,5 mit einem Delta pH von +- 1,5, so findet sich über eine lineare Regression eine Steigung des Phasenwinkels als Funktion des pH-Wertes von ca. 18,2 (° pro pH-Einheit mit einem R² von 0,96). Diese Aufspreizung ist im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Systemen größer und somit bildet das erfindungsgemäße System ein äußerst sensitives optisches Instrument zur Bestimmung des pH-Wertes.
Stabilität des pH-Sensors in Lösung
Als pH-Sensor wird das System aus den Herstellschritten 1-4 verwendet. Der pH-Sensor wird auf die frei liegende Wand eines transparenten Abschlussstückes für eine optische Lichtleitfaser gegeben. Der so vorbereitete Sensor wird in einen Bioreaktor eingeführt und mittels des Sensors wird der pH-Wert der wässrigen Lösung im Bioreaktor über eine Zeitdauer von Tagen bei Raumtemperatur verfolgt. Die Lösung wurde während der Messung gerührt. Als Messmedium wurde eine PBS-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 verwendet.
Durch die Verwendung eines Puffers sollte der pH-Wert der Lösung eigentlich konstant sein. Man findet, dass sich sowohl die gemessene Intensität wie auch der Phasenwinkel über die Zeit ändert. Der Intensitätsverlauf über ca. einen Tag Messzeit ist in der 3 und der Änderung des Phasenwinkels ist in der 4 dargestellt. Sowohl die Intensität wie auch der Phasenwinkel nehmen im Laufe der Messung ab. Die Abnahme der Messwerte kann dabei sowohl durch das Auswaschen des oder der Sensoren (Nanopartikel oder Fluorophor) oder aber auch durch ein Bleaching, also dem lichtinduzierten Abbau, einer der Bestandteile hervorgerufen werden. Weitere Untersuchungen ergeben, dass der Hauptteil der Intensitäts- und Phasenwinkeländerung auf ein Bleaching der Nanopartikel zurückgeführt werden kann. Der erfindungsgemäße Fluorophor ist verglichen mit den eingesetzten Nanopartikeln erstaunlicherweise deutlich stabiler gegenüber einem lichtinduzierten Abbau. Zudem haben weitere Untersuchungen ergeben, dass der durch Auswaschung hervorgerufene Verlustanteil sehr klein ist (s.o.). Insgesamt lässt sich festhalten, dass insbesondere der Phasenwinkel über die Messzeit äußerst stabil ist. In Anbetracht der Ergebnisse aus der Kalibration erhält man, dass als Funktion des pH-Wertes sich der Phasenwinkel um ca. 18° pro pH-Einheit ändert. Aus der linearen Regression der hier durchgeführten Messung ergibt sich eine Änderung des Phasenwinkels von ca. 0,047° pro Stunde (Regression aus der 4). Somit ergibt sich rein rechnerisch eine Änderung des pH-Wertes von ca. 0,0026 pro Stunde. Diese Änderung kann als äußerst gering bezeichnet werden.
Diese Ergebnisse konnten auch für einen weiteren Fluorophor, nämlich dem 5-N-(Dodecanoyl)aminofluorescein, reproduziert werden (Daten nicht gezeigt). Der weitere Fluorophor zeigt eine sehr vergleichbare Spreizung des Phasenwinkels als Funktion des pH-Wertes wie auch einen ähnlichen zeitabhängigen Verlauf des Phasenwinkels und der Intensität. Dies ist erstaunlich, da man aufgrund der unterschiedlichen Kettenlängen des Fluorophors zumindest einen unterschiedlichen Beitrag durch ein verändertes Auswaschverhalten erwarten würde. Somit wird deutlich, dass der erfindungsgemäße Aufbau mit den erfindungsgemäß einsetzbaren Fluorophoren, durch die hohe Aufspreizung und den kleinen Anteil an Leaching und Bleaching im hohen Maße zur optischen Bestimmung des pH-Wertes in wässrigen Lösungen geeignet ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1000345 B1 [0004]
DE 102012021933 A1 [0005]
US 6051437 A1 [0006]

Claims

pH-Sensor zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums mindestens umfassend eine polymere Matrix aufweisend eingebettete phosphoreszierende Nanopartikel und einen oder mehrere eingebettete Fluoreszenzfarbstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass die phosphoreszierenden Nanopartikel Übergangsmetallkomplexe mit Zentralatomen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Ru, Re, Os, Rh, Ir, Pt aufweisen; und der Fluoreszenzfarbstoff ein Fluorescein-Derivat nach der folgenden Formel I ist
oder dessen geladene Strukturen umfasst, wobei n größer oder gleich 5 und kleiner oder gleich 20 ist, X = -O-, -OH, -OR⁴, -NH2, -NH- oder NHR⁴, wobei R⁴ ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus C1-C20 Alkyl und die R¹, R^1', R², R³ unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus H, D, substituiertes oder nicht substituiertes C1-C20 Alkyl und Halogen ausgesucht sind.
pH-Sensor nach Anspruch 1, wobei n größer oder gleich 10 und kleiner oder gleich 18.
pH-Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei X = -OH oder -O- ist.
pH-Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Fluoreszenzfarbstoff ein 5-N-(Octadecanoyl)aminofluorescein nach der folgenden Strukturformel II ist
pH-Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die polymere Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HYPAN, Polyurethan, Poly-Hema oder Mischungen mindestens zweier Komponenten daraus.
pH-Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die polymere Matrix zu einem Gewichtsanteil von größer oder gleich 75 % und kleiner oder gleich 100% Polyurethan umfasst.
pH-Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die phosphoreszierenden Nanopartikel ein Ru-Zentralatom aufweisen.
pH-Sensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die phosphoreszierenden Nanopartikel durch Einbetten von Ru(dpp)₃Cl₂ in eine Matrix aus Polyacrylnitril ausgebildet werden.
Verfahren zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Medium mit einem pH-Sensor nach einem der Ansprüche 1-8 kontaktiert und die Fluoreszenzeigenschaften der Zusammensetzung über Bestrahlen der Zusammensetzung mit Licht und Aufnehmen der Fluoreszenzantwort der Zusammensetzung bestimmt werden.
System zur Bestimmung des pH-Wertes eines wässrigen Mediums umfassend eine Lichtquelle, eingerichtet zur Aussendung von Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches; einen pH-Sensor nach einem der Ansprüche 1-8; einen optischen Sensor, eingerichtet um zeit- und wellenlängenaufgelöste Lichtsignale zu detektieren und eine Auswerteeinheit, eingerichtet um die Intensität der zeit- und wellenlängenaufgelösten Lichtsignale zu bestimmen.