-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran, insbesondere einer biologischen Membran, und ein nach diesem Verfahren hergestellten Zellkultureinsatz.
-
Beschreibung
-
Untersuchungen und Tests von Zellkulturen im großen Maßstab werden standardmäßig in Multiwellplatten durchgeführt. Für die Kultivierung von einschichtigen Zellrasen (sog. Monolayer) in solchen Multiwellplatten wurden geeignete Einsätze entwickelt, die generell als Zellkultureinsatz bezeichnet werden.
-
Zellkultureinsätze sind praktische, durchlässige oder semipermeable Auflagevorrichtungen mit leichter Anwendbarkeit zur Untersuchung sowohl von verankerungsabhängigen (adhärenten) als auch verankerungsunabhängigen (nicht adhärenten) Zelllinien. Sie sind konzipiert, um eine Zellkulturumgebung zu schaffen, die physiologischer ist als alternative zweidimensionale Kultursysteme.
-
Entsprechend den standardisierten Größen für Multiwellplatten sind auch die Durchmesser der Zellkultureinsätze entsprechend angepasst, so dass diese hängend im Multiwell positioniert sind.
-
Den entscheidenden Teil des Zellkultureinsatzs bildet eine Membran am Boden/ Fuß des Zellkultureinsatzs. Diese Membran kann eine unterschiedliche Porosität aufweisen und besteht aus einem inerten Kunststoff. Auf dieser Membran werden im Laboralltag Zellen ausgesät. Die ausgesäten Zellen wachsen im Normalfall zu einem konfluenten Monolayer. Im Anschluss können Barriere- oder Penetrationsassays durchgeführt werden.
-
Wird bei einem herkömmlichen Zellkultureinsatz die Plastikmembran entfernt und ein Biopolymer eingebracht, bildet sich aufgrund der Grenzflächenspannung ein Meniskus aus. Wird das Polymer ausgehärtet, entsteht ein Zellkultureinsatz mit einer konkaven Membran. Diese Membran lässt sich nicht oder nur schlecht mit Zellen besiedeln, da diese durch die Kombination Schwerkraft/Meniskus in die Mitte des Zellkultureinsatzes gezogen werden. Auf diesem Weg entsteht eine Zell-Agglomeration in der Mitte des Zellkultureinsatzes und kein konfluenter Monolayer.
-
Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde einen Zellkultureinsatz bereitzustellen, der eine weitgehend flache und ebene biologische Membran ohne Konus aufweist.
-
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und eines mit diesem Verfahren hergestellten Zelllkultureinsatzes mit den Merkmalen des Anspruchs 13 gelöst.
-
Entsprechend wirdein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran, insbesondere mindestens einer biologischen Membran, bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
- - Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung; und
- - Ausbilden der Membran im Einsatzrohling mittels eines Biodruckverfahrens.
-
Gemäß einer erfindungsgemäßen Variante umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:
- - Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung,
- - Einbringen des Einsatzrohlings in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält,
- - Ausbilden der Membran in einem Biodruckverfahren (z.B. durch Bestrahlung), und
- - Entfernen des Einsatzrohlings aus dem Behälter, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
-
Der in diesem Verfahren verwendete Einsatzrohling liegt in dieser Variante als separater, bereits vorgefertigter Rohling vor. Der Einsatzrohling ist bevorzugt kreisförmig mit einer unteren und einer oberen Öffnung ausgebildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren folgende Schritte:
- - Bereitstellen von mindestens einem kreisförmigen, hohlen Einsatzrohling mit einer unteren und einer oberen Öffnung;
- - Einführen und Anordnen von mindestens einem kreisförmigen Abstandshalter in den Einsatzrohling in einem vorbestimmten Abstand hm zu der unteren Öffnung des Einsatzrohlings, wobei der Abstand hm des kreisförmigen Abstandshalters von der unteren Öffnung des Einsatzrohlings durch die Dicke der im (Innenraum des) Einsatzrohling(es) zu erzeugenden Membran bestimmt wird;
- - Einbringen des mit mindestens einem Abstandshalter versehenen Einsatzrohlings in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält,
- - Ausbilden der Membran (z.B. durch Bestrahlung), und
- - Entfernen des Abstandshalters aus dem Einsatzrohling, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
-
Es wird somit ein Verfahren bereitgestellt, mit welchem unter Verwendung einer Druckertechnologie eine konusfreie, ebene biologische Membran in einem Kultureinsatz erzeugt werden kann. Diese Membran wird in einen „leeren“ Zellkultureinsatz gedruckt. Hierzu werden Zellkultureinsatzrohlinge bereitgestellt, die im Anschluss zum biologischen Membranträger durch Eindrucken der Membran fertig konfektioniert werden können. Nach Fertigstellung ist der Kultureinsatz anstelle einer Plastikmembran mit einer Biopolymermembran abgeschlossen.
-
Der Vorteil eines Biopolymers ist ein besseres Wachstum und eine individuelle Anpassung der Membran an die auszusäenden Zellen, da sich nicht jeder Zelltyp auf einer Plastikmembran kultivieren lässt und eine sehr genaue Abstimmung seiner extrazellulären Umgebung benötigt. Als Polymere kommen unter anderem alle Biopolymere der sogenannten Extrazellulären Matrix zur Anwendung, u. a. Kollagen, Hyaluronsäure, Gelatine, etc.
-
Die mit dem vorliegenden Verfahren herstellbaren Kultureinsätze weisen eine Vielzahl von Verbesserungen gegenüber den herkömmlichen Zellkultureinsätzen auf:
-
Es wird eine biologische Membran bestehend aus einem oder mehreren Biopolymeren bereitgestellt. Diese liefert den Zellen eine physiologischere Kulturumgebung. Erzielte Ergebnisse biologischer Experimente sind deutlich aussagekräftiger als solche, die mit konventionellen Petrischalen oder Zellkultureinsätzen generiert werden können.
-
Die Membran kann modifiziert werden, da durch die Komposition der Matrix die physikochemischen Eigenschaften beeinflusst werden können.
-
Die Membran kann z.B. optisch transparent erzeugt werden, was eine nicht-invasive Kontrolle der Zellpopulation in Echtzeit ermöglicht.
-
Detektionssubstanzen können an die Matrix gekoppelt werden, um unterschiedliche Phänomene während des Versuchs zu detektieren.
-
Darüber hinaus können unterschiedliche Architekturen auf der Matrix erzeugt werden. Neben einer komplett planen Fläche können auch unterschiedliche Kompartimente, Kanäle etc. erzeugt werden. Ferner können z. B. leitende Elemente in die Membran eingedruckt werden, um elektrische Reize zu geben oder elektrische Signale von Zellen aufzuzeichnen.
-
Es können bereits Zellen, Bakterien, Viren und Pflanzenkeime in die Biomembran mit eingebracht werden.
-
Es kann mit mehr als einem Materialtyp in einer Ebene gearbeitet werden, um z. B, Bereiche mit einer veränderten Matrixkomposition zu erzeugen.
-
Die Membran kann aus mehreren Druckschichten bestehen, so dass nicht nur in X-Y-Ebene, sondern auch in der Z-Ebene eine unterschiedliche Membrankomposition erzeugt werden kann.
-
Die Höhe der Membran kann durch das Verfahren bestimmt werden.
-
In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der zum Einsatz kommende Einsatzrohling hohlzylindrisch oder kegelstumpfförmig ausgebildet.
-
Im Falle eines hohlen, kegelstumpfförmigen Einsatzes weist der Kegelstumpf einen sich in Richtung der unteren Öffnung verringernden Durchmesser (konische Verjüngung), eine Grundfläche G (obere Öffnung) mit Radius R, eine Deckfläche D (untere Öffnung) mit Radius r und eine Höhe hk auf.
-
Das Material des Einsatzrohlings ist ein zell- und biokompatibles Polymer, insbesondere aber PP, PE, PLA, PS, PC, PTFE, PVC, PMMA, PAA, PAN, PEG, PET, PU, Silikone, etc.
-
Die typischen Abmessungen des Einsatzrohlings orientieren sich an der Höhe und der Breite normaler Multiwellplatten. Aus Tabelle 1 sind die typischen Abmessungen für konventionell verwendete Multiwellplatten angeführt.
Tabelle 1
| Kulturgefäß | Höhe (mm) | Durchmesser (mm) | Fläche (cm2) | Volumen (ml) |
| 100 mm | 20 | 100 | 55 | 20 |
| 6-Well | 20 | 35 | 9,5 | 16,8 |
| 12-Well | 20 | 22 | 4 | 6,9 |
| 24-Well | 20 | 16 | 2 | 3,4 |
| 48-Well | 20 | 10 | 1 | 0,95 |
| 96-Well | 20 | 6 | 0,3 | 0,35 |
-
Die Abmessungen des vorliegenden Zellkultureinsatzes sind entsprechend wie folgt (siehe Tabelle 2):
Tabelle 2
| Kulturgefäß | Höhe (mm) | Durchmesser (mm) |
| 100 mm | zwischen 19 und 5, z.B. 15 | zwischen 54 und 23, z.B. 44 |
| 6-Well | zwischen 19 und 5, z.B. 15 | zwischen 34 und 23, z.B. 25 |
| 12-Well | zwischen 19 und 5, z.B. 15 | 15 zwischen 21 und 11, z.B. 15 |
| 24-Well | zwischen 19 und 5, z.B. 15 | zwischen 15 und 6, z.B. 10 |
| 48-Well | zwischen 19 und 5, z.B. 15 | zwischen 9 und 2, z.B. 5 |
| 96-Well | zwischen 19 und 5, z.B. 15 | zwischen 9 und 2, z.B. 5 |
-
Die Abmessungen der vorliegenden Kultureinsätze unterliegen keiner exakten Einteilung, da die Maße einzelner Multiwellplatten von Hersteller zu Hersteller variieren. Daher wird vorliegend ein Mittelwert für die Kultureinsätze gegeben.
-
Es können Standardrohlinge oder individuell gefertigte Einsatzrohlinge zum Einsatz kommen. Die individuelle Fertigung ermöglicht eine Anpassung des Einsatzes an seine Funktion. Dabei kann seine Größe und seine Form variiert werden. Dies kann z. B. die Aufhängung am Zellkultureinsatz oder die Form des Fußes betreffen. So kann der Zellkultureinsatz an seiner oberen Seite bzw. an seinem oberen Ende mit einem nach außen gerichtetem Vorsprung versehen sein, so dass der Zellkultureinsatz hängend kultiviert werden kann. Darüber hinaus kann der Zellkultureinsatz an seiner unteren Seite bzw. an seinem unteren Ende (d.h. der Teil des Zellkultureinsatzes, der den Boden der Mulitwellplatte berührt) mit nach außen gerichteten und abgewinkelten Vorsprüngen (Füßen) versehen sein. Dies ermöglicht ein selbsttätiges Stehen des Zellkultureinsatzes in der Mulitwellplatte.
-
Darüber hinaus können bspw. auch Aussparungen oder Rillen in der Ebene der Biomatrix erzeugt werden, um eine bessere Anhaftung am Zellkultureinsatz zu erreichen. Ferner können auch in den Zellkultureinsatz leitende Elemente eingebracht werden, um eine Signalableitung oder eine Sensorik zu erhalten.
-
Des Weiteren kann der Rand des Einsatzrohlings durchgängig ausgebildet sein, so dass ein Medienaustausch nur über die Membran selbst möglich ist.
-
Es ist aber auch möglich, den Rand einzuschneiden. Der so gebildete Ausschnitt kann eine beliebig anpassbare Höhe aufweisen, z.B. kann der Ausschnitt unterhalb der Füllhöhe des in der Multiwellplatte vorhandenen Zellmediums sein. Entsprechend ist über den Ausschnitt eine Versorgung des Innenraums des Kultureinsatzes und ein Durchströmen des Membranträgers möglich. Im letzteren Fall existiert entsprechend keine Barrierefunktion des Rohlings zwischen äußerer Multiwellplatte und Innenraum des Rohlings. Ein solcher Träger dient der reinen Kultur und nicht einer Barrierefunktion.
-
In einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der in den Einsatzrohling anzuordnende Abstandshalter mit mindestens einer Öffnung versehen, der ein Ableiten von Gasblasen aus der nachfolgend hergestellten Membran ermöglicht und somit ein Ansammeln von Luftblasen in der Membran vermeidet. Die Öffnung sollte möglichst am Rand des Abstandshalters vorgesehen sein.
-
Diese Öffnung kann auch als „Bubble Trap“ beschrieben werden. Die Bubble Trap ist ein Ausschnitt im Abstandhalter oder eine freigelassene Stelle in der weiter unten beschriebenen Hilfsmembran, die ein Ausströmen von Luft gewährleistet. Die Luftblase, die beim Einsetzen des Einsatzrohlings in die Membranpolymerlösung zwischen Abstandshalter (oder Hilfsmembran) entsteht, kann auf diesem Weg entweichen. Sollte die Luft unter dem Abstandshalter bzw. der Hilfsmembran bleiben, würde diese als Lufteinschluss in die Matrix eingebaut, bzw. die Matrix hätte an dieser Stelle keine plane Fläche. Um eine plane Siedlungsfläche zu gewährleisten, muss ein Einschluss von Luft verhindert werden. Die Bubble Trap sollte im Idealfall leicht mit Membranpolymerlösung gefüllt sein, damit gesichert ist, dass alle Luft unterhalb des Abstandshalter bzw. der Hilfsmembran verdrängt wird.
-
In einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der mindestens eine Abstandshalter in Form eines Stempels ausgebildet. Solch ein Stempel ist für kegelstumpfförmige oder hohlzylindrische Einsatzrohlinge geeignet. Die Höhe bzw. Länge des Stempels gibt dabei den gewünschten Abstand hm zur unteren Öffnung des Einsatzrohlings vor und somit die Dicke der späteren Membran. Es ist vorteilhaft, wenn der Stempel auf der Außenfläche beschichtet ist, um ein Anhaften der Membran, insbesondere der Biomembran, beim Entfernen des Stempels zu verhindern.
-
Das Material des Stempels besteht aus einem nicht-haftendem Polymer. Als Nicht-Anhaftung ist in diesem Fall ein Haften zwischen Platzhalter/Stempel und Biomembran während und nach dem Druckvorgang gemeint. Das Material des Stempels kann insbesondere PTFE, PEG oder Silikon betragen.
-
In einer anderen Ausführungsform ist der mindestens eine Abstandshalter als Scheibe ausgebildet.
-
Das Material der Scheibe ist entsprechend dem Material des Stempels. Die Scheibe besteht aus PTFE, PEG oder Silikon. Der Durchmesser der Scheibe entspricht den üblichen Zellkultureinsatzmaßen. Die Dicke der Scheibe entspricht der gewünschten Membrandicke zwischen 1 µm und 20 mm, bevorzugt zwischen 50µm und 1000 µm, insbesondere bevorzugt zwischen 200 und 800 µm.
-
Eine derartige Scheibe ist insbesondere für kegelstumpfförmige Einsatzrohlinge mit sich zur unteren Öffnung verringernden Durchmesser geeignet. Bevorzugt liegt die Scheibe an der Innenwand des Einsatzrohlings an. Der Durchmesser der Scheibe ist individuell einstellbar, so dass der Abstand der Scheibe von der unteren Öffnung des Einsatzrohlings durch den Durchmesser der Scheibe bestimmt wird; d.h. je näher der Scheibendurchmesser dem Radius r der unteren Öffnung ist, desto geringer ist der Abstand hm zwischen Scheibe und offener Deckfläche, wobei der Abstand hm die Dicke (bzw. Höhe) der zu erzeugenden Membran definiert.
-
In einer weiteren Variante des vorliegenden Verfahrens wird der Abstandshalter, insbesondere ein scheibenförmiger Abstandshalter, in Kombination mit einer Hilfsmembran verwendet.
-
Hierbei wird die Hilfsmembran bevorzugt auf der Oberseite des Abstandshalters (d.h. der in Richtung der oberen Öffnung weisenden Seite des Abstandhalters), insbesondere des scheibenförmigen Abstandshalters, durch Eintragen einer flüssigen Zusammensetzung, enthaltend Ausgangsstoffe geeignet zur Ausbildung der Hilfsmembran und anschließender Aushärtung (z.B. durch Bestrahlen mit Licht oder einem ähnlichen physiko-chemischen Prozess), ausgebildet.
-
Die Hilfsmembran besteht aus einem Material, das sich durch einen physiko-chemischen oder enzymatischen Prozess auflösen lässt, insbesondere PEG, Poloxamer, Hyaluronsäure, Chitosan, Chitin, Kollagen etc.
-
Die Hilfsmembran wird mit Hilfe eines Druckers im Einsatzrohling erzeugt. Dabei wird der Einsatzrohling in einen Drucker, z.B. der Bioprinter der Firma Cellbricks, eingebracht, und die Hilfsmembran durch Stereolithographie erzeugt. D. h. der Rohling wird in ein flüssiges Polymer gestellt und durch Bestrahlung von oberhalb und unterhalb des Bettes ausgehärtet.
-
Darüber hinaus kann die Hilfsmembran mit Hilfe einer Scheibe als Abstandshalter erzeugt werden. Dabei wird der Einsatzrohling in einen Träger mit flüssiger Hilfsmatrix getaucht, in dessen Boden sich der Abstandhalter, z.B. Scheibe, befindet. Der Durchmesser der Scheibe füllt dabei den Innenraum des Rohlings bündig aus. Wenn in diesem Zustand die flüssige Matrix innerhalb des Einsatzrohlings durch Bestrahlen von oberhalb oder unterhalb des Bettes ausgehärtet wird, entsteht eine feste Hilfsmembran im Einsatzrohling. Wird der Einsatzrohling mit Hilfsmembran aus dem Träger mit der flüssigen, nicht ausgehärteten Hilfsmatrix gezogen, verbleibt der Abstandshalter im Gefäß mit der flüssigen Hilfsmatrix. Im Einsatzrohling mit der Hilfsmembran entsteht hierdurch ein freier Raum zwischen Hilfsmatrix und Abschluss des Einsatzrohlings, der in einem nächsten Schritt mit einer weiteren Membran ausgekleidet werden kann. Die Hilfsmembran kann dabei so ausgehärtet werden, dass eine Struktur an der Unterseite der Hilfsmembran entsteht, die als Negativ für eine Formung der im Anschluss zu erstellenden Membran fungiert.
-
Nach der Aushärtung der Hilfsmembran wird der Abstandshalter, insbesondere der scheibenförmige Abstandshalter, entfernt, so dass eine stabile Hilfsmembran/Hilfsschicht im Einsatzrohling verbleibt. Diese Hilfsmembran enthält eine Öffnung zur Ableitung von Gasblasen (siehe auch „Bubble Trap“ wie oben beschrieben).
-
Anschließend kann der mit der mindestens einen Hilfsmembran versehene Einsatzrohling in einen Behälter eingebracht werden, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält. Die Membran wird z.B. durch Bestrahlung (siehe auch weiter unten) ausgebildet, und nach Ausbildung der Membran wird die Hilfsmembran durch geeignete physiko-chemische Methoden (z.B. Auflösen) aus dem Einsatzrohling entfernt, wobei die ausgebildete (flache) Membran im Einsatzrohling verbleibt.
-
Die Hilfsmembran ist komplett plan, da diese Schicht mit Hilfe des Abstandshalters vorher hergestellt wurde. Darüber hinaus enthält die Hilfsmembran einen Einschnitt, der als Bubble Trap fungiert. Potentielle Luftblasen, die sich beim Einbringen des Biopolymers bilden, können über diesen Ablass ausströmen und werden nicht festgehalten und in das Biopolymer beim Aushärten inkorporiert. Nach Einfüllen des Biopolymers wird dieses ausgehärtet. Im Anschluss kann die Hilfsmembran mit Hilfe einer physikalisch-chemischen Reaktion aufgelöst werden, z. B. Temperaturerhöhung/ -erniedrigung, pH-Wertänderung, Auflösung etc., so dass nach Abschluss der Auflösung einzig eine plane Biopolymer-Membran (abgesehen von einem kleinen Steg bedingt durch die Bubble Trap) verbleibt.
-
Wie bereits mehrmals angeführt, wird die Membran und hier bevorzugt die biologische Membran nach Eintauchen des Kultureinsatzes mit Abstandshalter in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält, ausgebildet. Bei den Ausgangsstoffen handelt es sich insbesondere um photopolymerisierbare Stoffe.
-
Die Ausbildung der Membran erfolgt unter Anwendung eines Biodruckverfahrens, wie z.B. in der
WO 2016/075103 A1 beschrieben.
-
Hierbei wird nach Einbringen des Kultureinsatzes mit Abstandshalter in den Behälter bzw. das Reaktionsgefäß mit der photopolymerisierbaren Flüssigkeit eine Lichtstrahlung auf eine erste Fokusebene, die innerhalb eines mit der Flüssigkeit gefüllten Bereiches des Reaktionsgefäßes liegt, fokussiert. Durch diese Lichtstrahlung wird dann eine polymerisierte Struktur in dem Reaktionsgefäß erzeugt. Die polymerisierte Struktur befindet sich dabei in einer ersten Schicht.
-
Auf diese erste Schicht können beliebig weitere Schichten aufgebracht werden. Hierzu wird eine weitere photopolymerisierbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht, wobei die zuvor erzeugte polymerisierte Struktur zumindest teilweise mit der weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeit bedeckt ist. Vorzugsweise ist die zuvor erzeugte polymerisierte Struktur vollständig mit der weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeit bedeckt. Nun wird eine weitere Lichtbestrahlung in einer weiteren Fokusebene durchgeführt, die innerhalb eines mit der weiteren Flüssigkeit befüllten Bereiches des Reaktionsgefäßes liegt. Diese weitere Fokusebene unterscheidet sich damit von der ersten Fokusebene zumindest in Bezug auf die bereits erzeugte polymerisierte Struktur bzw. in Bezug auf die Schicht dieser polymerisierten Struktur.
-
Die vorgenannten Schritte des Einbringens einer weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeit, des Fokussierens von Licht auf eine weitere Fokusebene und des Erzeugens einer weiteren polymerisierten Struktur in einer weiteren Schicht können nun mit jeweils weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeiten beliebig wiederholt werden, bis die gewünschte Membran erzeugt ist.
-
Die photopolymerisierbare Flüssigkeit kann auch biologische Zellen oder andere Substanzen enthalten. Wenn es in Folge der Lichteinstrahlung zu einer Polymerisierung kommt, werden die in der Flüssigkeit enthaltenen Zellen mit in ein entsprechendes Polymer eingebettet.
-
Mit diesem Druckverfahren können Membranen aus beliebigen Polymeren, bevorzugt Biopolymeren, hergestellt werden.
-
Entsprechend kann die Membran aus folgenden Materialien aufgebaut sein bzw. umfassen: technische Biopolymere, wie Gelatine; Alpha- und Beta-Polysaccharide wie Pektine, Chitin, Callose und Cellulose; Lipide, insbesondere membranbildende Lipide, wie Phospholipide, Sphingolipide, Glycolipide und Etherlipide; Polyhydroxyalkanoate; biobasierte Polymere, wie Polylactid, Polyhydroxybutyrat; erdölbasierte Polymere, wie Polyester, insbesondere Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polybutylenadipat-terephthalat (PBAT, Polybutylensuccinat (PBS), Polycaprolactone (PCL), Polyglycolid (PGA); synthetische Peptide, wie rekombinant hergestellte Aminosäuren, Amide; Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Kollagene, Fibrillin, Elastin, Glykosaminoglykane, insbesondere Hyaluronsäuren, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat. Bevorzugte Membranmaterialien sind Kollagene, Hyaluronsäure, Chitosan, Gelatine, PLA, PEG und Kombinationen davon.
-
In einem Beispiel besteht die Membran aus Gelatine und Kollagen als Zusatz. Zur Herstellung wird den Ausgangsstoffen ein geeigneter Photoinitiator wie z.B. Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) verwendet.
-
In einer weiteren Ausführungsform ist ein Sicherungsmittel zur Haltung der Membran im Einsatz vorgesehen. Es ist dabei bevorzugt, wenn das mindestens eine Sicherungsmittel in Form eines Trägers bestehend aus unterschiedlichen Strukturen, die an das Membranmaterial angepasst sind, insbesondere aus gitterförmigen oder speichenförmigen Strukturen, ausgebildet ist.
-
In einer weiteren Verfahrensvariante wird der Zellkultureinsatz aus Einsatzrohling und Membran unter Anwendung des oben beschriebenen Druckverfahrens in einem Stück ausgebildet (one-pot Synthese). In Analogie zu dem in
WO 2016/075103 A1 beschriebenen Verfahren erfolgt die one-pot Synthese additiv mit photopolymerisierbaren Materialien. Dabei wird zunächst die Basis des Scaffolds aus einem ersten (zellabweisended) Biomaterial gedruckt. Im Anschluss wird eine biokompatible Schicht aus einem zweiten Biomaterial fabriziert. Im letzten Schritt wird das Scaffold durch die Ränder vervollständigt. Beide Materialien werden in einem einzigen Druckvorgang verarbeitet.
-
Der dabei gebildete Einsatzrohling umfasst eine (obere) Öffnung und kann einen Boden umfassen. Der Einsatzrohling ist bevorzugt aus einem ersten zellabweisenden Biomaterial bzw. Biopolymer, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) oder eines der anderen für den Einsatzrohling oben genannten möglichen Polymermaterialien, hergestellt. Auf dem Boden des Einsatzrohlings ist ein weiteres biokompatibles und biofunktionales Biopolymer als Membran, z.B. aus Gelatine eingearbeitet, auf welchem Zellmaterialien wachsen können. Durch die Kombination der zwei unterschiedlichen Materialien entsteht ein Scaffold, das auf dem biokompatiblen Material gezielt mit Zellen besiedelt werden kann.
-
Im Laufe einer längeren Kultivierungszeit kann es zu einer Veränderung der Biomembran kommen, z. B. Schrumpfung oder Veränderung durch Zellen. Das Sicherungsmittel, z.B. Gitter, verhindert in diesem Fall ein Hinausgleiten oder Herausfallen der Biomembran aus dem Kultureinsatz. In seiner einfachsten Ausführungsform kann das Sicherungsmittel auf die Unterseite des Zellkultureinsatzes, d.h. die Seite, die die Membran trägt, gesetzt werden. Die Halterung des Sicherungsmittel, z.B. eines Gitters, beruht auf einer simplen Presspassung. Um das Sicherungsmittel (und auch die Membran) aus dem Kultureinsatz im Nachgang wieder zu entfernen, kann die Presspassung z.B. mit einer Art Kapselheber wieder entfernt werden. Hierbei wird die Presspassung einfach abgehebelt.
-
Es ist auch möglich und vorstellbar, die Oberfläche der Membran zu strukturieren. Die Membranoberfläche kann z.B. in Segmente eingeteilt, Zellarrays eingedruckt oder Gradienten eingebracht werden. Hiermit ist es möglich, die Membran in ihrer Dicke und Oberfläche exakt zu strukturieren. Des Weiteren kann diese Schicht auch eine dreidimensionale Architektur haben, wie z. B. Kanäle, etc. Ferner kann die optische Transparenz durch die Formulierung der Biomatrix beeinflusst werden. Es kann z. B. eine transparente Matrix erzeugt werden, die eine optische Kontrolle der Zellpopulation erlaubt. So erlaubt die Transparenz eine nicht-invasive Kontrolle der Zellpopulation, die mit einem herkömmlichen Zellkultureinsatz nicht möglich ist. Darüber hinaus kann mehr als ein Material definiert in der Membran eingebracht werden. Auf diesem Weg können bspw. noch weitere Funktionen realisiert werden durch ein Einbringen z.B. von Sensorik, Detektion, leitfähigen Materialien, Chemikalien, Nanopartikeln etc.
-
Mit dem vorliegenden Verfahren ist nunmehr ein Zellkultureinsatz herstellbar, der aus einem Einsatzrohling mit mindestens einer darin angeordneten Membran, insbesondere mindestens einer Biomembran, besteht, wobei die mindestens eine Membran eben ausgebildet ist und keinen Konus aufweist; d.h. ein Zellkultureinsatz mit einer konfluenten Monolayer kann mit diesem Verfahren bereitgestellt werden.
-
Der vorliegende Zellkultureinsatz kann zur Kultivierung von verschiedenen Zelllinien und anschließender Durchführung von Barriere- oder Penetrationsassays verwendet werden.
-
Als Ziellinien sind sämtliche Zellen und Zelllinien geeignet, die eine Barrierefunktion darstellen, z. B. Endothelzellen, Trophoblasten, Astrozyten, Enterozyten etc. oder Zellen und Zelllinien, die eine Stoffwechselfunktion darstellen, z. B. Hepatozyten, Kardiomyozyten, Myozyt etc. Generell eignen sich alle Zelltypen, die adhärent sind.
-
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von mehreren Beispielen mit Bezug auf die Figuren erläutert. Es zeigen:
- 1 ein Vergleich eines herkömmlichen Kultureinsatzes mit Poren mit einem erfindungsgemäß hergestellten Kulturzelleinsatz;
- 2 eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
- 3 eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
- 4A eine schematische Darstellung der Sicherung der hergestellten Membran im Kultureinsatz;
- 4B eine schematische Darstellung von verschiedenen Ausführungsformen des Sicherungsmittels der 4A;
- 5 eine Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Zellkultureinsatzes;
- 6A mit Zellen kultivierte Membrane eines erfindungsgemäßen Zellkultureinsatzes;
- 6B eine Querschnittsaufnahme einer mit Zellen besiedelten Membran in einem erfindungsgemäßen Zellkultureinsatz;
- 6C mikroskopische Aufnahmen einer mit Zellen besiedelten Membran in einem erfindungsgemäßen Zellkultureinsatz;
- 7 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Zellkultureinsatzes;
- 8 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Zellkultureinsatzes; und
- 9 eine noch weitere Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten Zellkultureinsatzes
-
In 1 ist auf der linken Seite a) ein herkömmlicher Zellkultureinsatz mit Poren dargestellt. Die am Boden des Zellkultureinsatzes ausgebildete Membran besteht aus einem inerten Kunststoff mit einstellbarer Porosität. Auf dieser Membran werden im Laboralltag Zellen ausgesät, die im Normalfall zu einer Monolayer wachsen und mit denen Barriere- oder Penetrationsassays durchgeführt werden können.
-
Auf der rechten Seite b) der 1 ist ein Kultureinsatz mit einer gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten biologischen Membran dargestellt. Die ausgebildete biologische Membran ist eben und weist keinen Konus auf. Die konusfreie Membran ermöglicht eine gute Besiedelung mit Zellen.
-
In 2 ist eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch dargestellt, wobei ein Abstandshalter, hier in Form eines Stempels, in einen kegelstumpfförmigen Kultureinsatz eingeführt ist. Der Stempel ist in seiner Höhe individuell anpassbar, sodass nach Einführen des Stempels in den Kultureinsatz der Abstand zwischen dem Stempel und der unteren Öffnung des Kultureinsatzes beliebig einstellbar ist. Der Abstand zwischen Stempel und unterer Öffnung des Kultureinsatzes gibt dabei die gewünschte Höhe bzw. Dicke der später auszubildenden Biomembran vor. Der Stempel muss des Weiteren mit einem geeigneten Material beschichtet sein, um ein Anhaften der ausgebildeten Biomembran beim Entfernen des Stempels aus dem Kultureinsatz zu verhindern.
-
In einem zweiten anschließenden Schritt wird der Kultureinsatz mit dem darin eingeführten Stempel in ein Reaktionsgefäß mit einer polymerisierbaren Flüssigkeit eingebracht, wobei die polymerisierbare Flüssigkeit die Ausgangskomponenten für die Herstellung der gewünschten Biomembran enthält. Der Stempel sollte eine Öffnung („Bubble Trap“) enthalten, um ein Ansammeln von Luftblasen in der Biomembran zu vermeiden
-
Im nächsten, dritten Schritt des Verfahrens erfolgt die Ausbildung der Biomembran in einem Druckverfahren, wobei Licht in einer Fokusebene auf die polymerisierbare Flüssigkeit gestrahlt wird, wodurch es zu einer Polymerisierung zur Biomembran in der Fokusebene kommt.
-
Nach Aushärtung der Biomembran kann der Stempel aufgrund seiner Materialbeschichtung leicht aus dem Kultureinsatz entfernt werden (Schritt 4) und zurück bleibt eine ebene Biomembran im Kultureinsatz.
-
Die in 3 gezeigte zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet anstelle eines Stempels als Abstandshalter eine Scheibe. Die Scheibe wird in einem ersten Schritt in den Kultureinsatz eingeführt und definiert über den Abstand zur unteren Öffnung des Kultureinsatzes die Dicke der auszubildenden Membran. Nach der Festsetzung der gewünschten späteren Membranhöhe durch die Scheibe als Platzhalter bzw. Abstandshalter wird in einem zweiten Schritt innerhalb des Kultureinsatzes eine polymerisierbare Flüssigkeit eingebracht, die anschließend durch Lichteinstrahlung oder einem ähnlichen physiko-chemischen Prozess unter Ausbildung einer Hilfsmembran ausgehärtet wird.
-
Nach der Aushärtung der Hilfsmembran wird in einem dritten Schritt die Scheibe als Abstandshalter wieder entfernt und zurück bleibt eine stabile Hilfsmembran, die eine Öffnung als „Bubble Trap“ aufweist.
-
Im nächsten, vierten Schritt wird der Kultureinsatz mit der Hilfsmembran in ein Reaktionsgefäß mit dem flüssigen Biopolymer eingebracht und anschließend durch Bestrahlung in einem Druckverfahren ausgehärtet.
-
Nach Aushärten der Biomembran und Entfernen des Kultureinsatzes aus dem Reaktionsgefäß verbleibt eine Doppelschicht aus Biomembran und Hilfsmembran im Kultureinsatz. Die Hilfsmembran wird in einem abschließenden Schritt durch einen physiko-chemischen Prozess oder simples Auflösen entfernt und zurück bleibt eine flache Biomembran.
-
Um ein Herausfallen der gedruckten Membranschicht zu verhindern kann nach Fertigung der Biomembran ein Plastikgitter unter dem Kultureinsatz angebracht werden (siehe 4A). Die Halterung bzw. Sicherung der Biomembran erfolgt mithilfe eines Gitters, das mit einer Presspassung am Fuß des Kultureinsatzes gesichert wird. Diese Sicherung der Biomembran kann mit einem Kapselheber einfach wieder entfernt werden, um einen Zugriff auf die Biomembran bzw. ihre Entfernung zu gewährleisten. Das Sicherungsmittel kann gitterförmig oder speichenförmig ausgebildet sein (siehe 4B).
-
Eine Ausführungsform eines erfindungsgemäß hergestellten Zellkultureinsatzes ist in 5 gezeigt. Hier ist der Zellkultureinsatz zylinderförmig ausgebildet. An der oberen Öffnung sind Halterungsstege vorgesehen, die ein Einsetzen in und Entfernen des Zellkultureinsatzes aus einer Nährlösung in einer Multiwellplate ermöglichen. An der unteren Öffnung ist ein Gitter als Sicherungsmittel zum Halten der Biomembran in dem zylindrischen Gehäuse zu erkennen.
-
Auf der Biomembran können je nach Membranmaterial verschiedene Zellen siedeln, die Monolayer ausbilden (siehe 6A, 6B).
-
Die Abbildungen der 6A zeigen mikroskopische Durchlicht-Aufnahmen der Oberseite und Unterseite eines besiedelten Trägers. Links wird die Unterseite mit einer Halterung für die Membran gezeigt, rechts die Oberseite des Trägers mit besiedelter Oberfläche. Als Zellen wurden Caco-2 Zellen verwendet.
-
Das Bild der 6B zeig einen lateralen Querschnitt durch eine mit HUVEC-Zellen besiedelte Gelatine-Membran, durchgeführt mit einem 2-Photonenmikroskop. Die einzelnen Farben zeigen die unterschiedlichen Marker, die bei diesem Versuch untersucht wurden: DAPI (Zellkern), vWF und CD31 (Gefäßzellmarker). Es kann eine Polarisation und damit ein natürliches Verhalten der Zellen nachgewiesen werden.
-
Die in 6C gezeigten mikroskopischen Aufnahmen zeigen einen lateralen Schnitt durch die Membran. Die obere Seite des Bildes stellt die Oberseite der Membran dar, die mit Zellen besiedelte Membran teilt das Bild und die untere Hälfte des Bildes stellt die Unterseite des Trägers dar. Die einzelnen Färbungen zeigen dabei eine Polarisierung der Zellen zur Membran hin an. Im Falle der mikroskopischen Aufnahme kann eine verstärkte Kollagen-Produktion der Zellen zur Membran hin gezeigt werden. Bei den Zellen handelt es sich um Vero-Zellen. Darüber hinaus wurden ebenfalls die Zellkerne mit DAPI angefärbt. Mit Hilfe des Versuchs sollte ein Polarisation und Interaktion der Zellen gezeigt werden. Im Vergleich dazu ist dieser Effekt in einer Petrischale weniger oder gar nicht ausgeprägt
-
In den nachfolgenden zwei Bildern wurden die Marker ITGB1 (rechts) und aPKC (links unten) untersucht, die ebenfalls eine Polarisation zur Membran hin oder von der Membran weg dokumentieren.
-
Der vorliegende Zellkultureinsatz kann mit einem durchgängigen Rand (7, a) für eine Barrierefunktion oder einem Ausschnitt (7, b) ausgebildet sein. Der Ausschnitt kann dabei unterhalb des Mediienspiegels im Multiwell liegen, so dass eine Nährstoffversorgung der auf der Membran angesiedelten Zellen erfolgen kann.
-
8 zeigt einen Zellkultureinsatz, der an seiner unteren Seite bzw. an seinem unteren Ende (d.h. der Teil des Zellkultureinsatzes, der den Boden der Mulitwellplatte berührt) mit nach außen gerichteten und abgewinkelten Vorsprüngen (Füßen) versehen ist. Dies ermöglicht ein selbsttätiges Stehen des Zellkultureinsatzes in der Mulitwellplatte.
-
9 zeigt eine weitere Variante des Zellkultureinsatzes. In dieser Variante des Zellkultureinsatzes werden zwei Biomaterialien verwendet, die sich in ihren Eigenschaften unterscheiden können. Der Zellkultureinsatz besteht aus einem Zylinder mit Boden (vgl. Abbildung Biopolymer 2, blau). Auf dem Boden ist ein weiteres Biopolymer (vgl. Abbildung Biopolymer 1, grün) eingearbeitet. Material b (siehe Abbildung) bildet das Gerüst, das dem Konstrukt Stabilität gibt. Im Beispiel basiert das Biopolymer auf Polyethylenglycol (PEG), einem biokompatiblem, aber zellabweisendem Polymer. In Material b ist Material a eingearbeitet, welches im Beispiel auf Gelatine basiert. Im Gegensatz zu PEG ist Gelatine nicht nur biokompatibel, sondern biofunktional, sodass Zellen auf diesem Material anwachsen. Durch die Kombination beider Materialien entsteht ein Scaffold, das gerichtet mit Zellen besiedelt werden kann. Dabei legt die Fläche, die Biopolymer 1 (a) umfasst, den maximalen Bereich fest, auf dem Zellen wachsen können. Bei einer Besiedlung wachsen die Zellen bis zum Rand. Da der Rand aus dem zellabweisenden Polymer 2 (b) besteht, können diese nicht den Rand besiedeln. Das Wachstum stoppt an dieser Grenze.
-
Beispiel:
-
Es wurden mit Hilfe des Stempelverfahrens Zellkultureinsätze mit einem Durchmesser von 12 mm hergestellt. Hierbei wurde eine Gelatine-Matrix mit einer Konzentration von 10 %(W/V) verwendet, die mit LAP als Initiator in einer Konzentration von 0,1 % (W/V) versetzt war. Darüber hinaus wurde Kollagen I als Zusatz eingesetzt.
-
Der Rohling wurde mit einem Silikonstempel ausgefüllt und in ein Becken im Drucker, das die oben beschriebene, flüssige Gelatine-Matrix enthielt, eingebracht, so dass der Rohling auf dem Boden des Beckens im Drucker aufsitzt. Um eine Membran von 500 µm zu erzeugen, wurde der Abstand entsprechend mit dem Stempel vorher eingestellt.
-
Im Anschluss wurde die Gelatine-Matrix durch Bestrahlen mit einer Wellenlänge von 385 nm ausgehärtet. Nach dem Aushärten wurde der Träger aus dem Becken und dem Drucker entfernt. Darüber hinaus wurde der Stempel entfernt und zurück blieb ein Zellkultureinsatz mit der vorher definierten Höhe und mit einer planen Fläche zur Besiedlung.
-
Es wurden zwei unterschiedliche Zellkultureinsätze hergestellt. Ein erster Einsatz mit einer Membran mit Kollagen I als Zusatz und ein zweiter Einsatz mit einer Membran ohne diesen Zusatz. Die Gelatine-Membran wurde in diesem Fall transparent gestaltet und konnte optisch untersucht werden.
-
Nach Herstellung der Zellkultureinsätze mit biologischer Membran wurden diese mit Vero-Zellen besiedelt. Hierbei handelt es sich um eine Nierenzell-Linie der Grünen Meerkatze. Diese Zelllinie wird häufig für Infektionsversuche eingesetzt. Nach der Besiedlung bildeten die Vero-Zellen einen konfluenten Monolayer über die gesamte Fläche des Zellkultureinsatzes aus.
-
Nach der Besiedlung wurde ein GFP-getaggter Kuhpockenstamm eingesetzt, um die Vero-Zellen mit dem Stamm zu infizieren. Die Ausbreitung der Infektion konnte durch die fluoreszenten Viren und den transparente Zellkultureinsatz über den Verlauf des Experiments von 28 Tagen untersucht und beobachtet werden.
-
Im Anschluss an das Experiment wurde die Membran ausgestanzt und tiefgefroren. Darüber hinaus ließ sich die Membran mit den üblichen histologischen Methoden schneiden und anfärben, so dass eine histologische Nachuntersuchung möglich war.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- WO 2016/075103 A1 [0050, 0059]
