DE102018108612A1

DE102018108612A1 - Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen

Info

Publication number: DE102018108612A1
Application number: DE102018108612.1A
Authority: DE
Inventors: Amir ALPERT
Original assignee: Immatics US Inc
Current assignee: Immatics US Inc
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-04-11
Publication date: 2019-09-26
Also published as: EP3768330A1; CA3094344A1; KR20200133370A; CN112512593A; WO2019183181A1; AU2019240039A1; US20190292520A1; US20210017493A1; TW202003050A; EA202092243A1; SG11202009082YA; JP2021518121A; US11905529B2; JP7344898B2; EP3768330A4; MA52138A

Abstract

Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit von T-Zellen bereit. In einem Aspekt stellt die Offenbarung ferner Verfahren zur Verbesserung der Persistenz von T-Zellen für den adoptiven Zelltransfer oder die adoptive Zelltherapie (ACT) bereit. Zytokinantwort (CR)-Assays und zugehörige Methodik, die in der Lage sind, die Persistenz von adoptiv infundierten T-Zellen vorherzusagen, sind darüber hinaus im Rahmen der vorliegenden Offenbarung bereitgestellt. Die Offenbarung umfasst auch Verfahren zur Krebsbehandlung bei einem Patienten, der diese benötigt, sowie T-Zell-Populationen, die nach den vorliegend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit von T Zellen bereit. In einem Aspekt stellt die Offenbarung ferner Verfahren zur Verbesserung der Persistenz von T-Zellen für den adoptiven Zelltransfer oder die adoptive Zelltherapie (ACT) bereit. Zytokinantwort (CR)-Assays und zugehörige Methodik, die in der Lage sind, die Persistenz von adoptiv infundierten T-Zellen vorherzusagen, sind darüber hinaus im Rahmen der vorliegenden Offenbarung bereitgestellt. Die Offenbarung umfasst auch Verfahren zur Krebsbehandlung bei einem Patienten, der diese benötigt, sowie T-Zell-Populationen, die nach den vorliegend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Stand der Technik
Adoptive(r) Zelltransfer oder -therapie (ACT) ist eine Form der Immuntherapie, bei der ex vivo die Isolierung und Expansion von antigenspezifischen T-Zellen für den adoptiven Transfer zurück zu den Patienten erfolgt. Obwohl ein klinischer Nutzen bei der Behandlung von hämatologischen Malignitäten und Melanomen erzielt wurde, ist die Wirksamkeit der ACT bei der Behandlung der meisten soliden Tumore im Allgemeinen begrenzt, da transferierte T-Zellen nicht in vivo funktionieren und persistieren. Faktoren wie die Toleranz gegenüber tumorassoziierten Antigenen (TAAs) und die Hemmung tumorspezifischer T-Zellen aufgrund der unterdrückenden Tumorumgebung können zu diesem Misserfolg beitragen. Darüber hinaus kann die Notwendigkeit einer umfangreichen Kultivierung tumorspezifischer T-Zellen, um ausreichende Mengen für die Infusion in Patienten zu erhalten, die Qualität der T-Zellen stark beeinflussen.
Die Persistenz der T-Zellen gilt als treibende Kraft für die Wirksamkeit der ACT und korreliert die T-Zellenpersistenz /Jugendphänotypen mit den präklinischen und klinischen Ergebnissen. Um die gezüchteten T-Zellen zu verstärken und den Phänotyp über zytokinvermittelte Signale zu modulieren, wird das Common-Gamma-Ketten-(γc)-Zytokin IL-2 als Expander von T-Zellen anerkannt. Hohe Dosen von IL-2 wurden auch zum Etablieren und Expandieren von ACT-T-Zellkulturen verwendet. Die erzwungene Expression von IL-2 durch T-Zellen führt zu einem verlängerten Überleben in vitro und beibehält die Tumorspezifität und -funktion. IL-2 kann jedoch die Differenzierung von T-Zellen fördern, was zu einem ungünstigen Phänotyp für die ACT-Nutzung führen kann. Um ex vivo T-Zellkulturen für ACT zu optimieren, wurden andere yc-Zytokine, wie IL-7, IL-15 und IL-21, beschrieben, die eine Rolle bei der Bildung, Proliferation und dem Überleben von Gedächtnis-T-Zellen spielen, jedoch zu einem geringeren Grad an T-Zell-Differenzierung führen, aber dennoch in der Lage sind, die Antitumorreaktionen zu verbessern.
Im US-Patent Nr. 7,993,638 werden Verfahren zur Behandlung eines Patienten beschrieben, der einer Behandlung von Krebs bedarf, einschließlich der Verabreichung der aktivierten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) an den Patienten; Verabreichung von mindestens zwei Zytokinen einschließlich Interferon-α-2b und Interleukin-2 (IL-2), die die CTL-Persistenz beeinflussen.
In der US-Patentanmeldung Nr. 2015/0017120 werden Verfahren zur Verlängerung der Persistenz von transferierten Zellen beschrieben, zur Stimulierung der Proliferation von transferierten Zellen oder zur Stimulierung einer T-Zell-vermittelten Immunantwort auf eine Zielzellpopulation in einem Krebspatienten, der eine adoptive Zelltherapie (ACT) erhält, einschließlich: Verabreichung eines verlängerten pharmakokinetischen IL-2 an einen Krebspatienten, der eine ACT erhält, in einer Menge, die wirksam ist, um die Persistenz von transferierten Zellen in dem Patienten zu verlängern.
In der US-Patentanmeldung Nr. 2017/0087185 werden Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Immunzelle zur Modifizierung einer Tumormikroumgebung (TME) eines Tumors beschrieben, einschließlich: Liefern eines ersten Vektors an eine Immunzelle, wobei der erste Vektor eine Nukleinsäure umfasst, die für ein Protein kodiert, das IL-1, IL-6, IL-7, IL-15, IL-2, IL12, IL-18, IL-21, Interferon α, Interferon β, Interferon γ, T-Zell-Chemokin, NK-Zell-Chemokin oder einen PD-1-Checkpoint-Bindungsinhibitor beinhalten kann, der die T-Zell-Proliferation induziert, die Persistenz fördert und die Aktivierung von endogenen oder adoptiv übertragenen NK- oder T-Zellen aktiviert.
Es besteht nach wie vor die Notwendigkeit, das Ergebnis der ACT bei Krebspatienten zu verbessern. Eine Lösung für dieses technische Problem wird von den Ausführungsformen bereitgestellt, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Wie vorliegend beschrieben, stellt die Offenbarung Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit und Lebensfähigkeit von T-Zellen bereit.
Die Offenbarung stellt ferner Verfahren zur Herstellung von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie bereit, umfassend
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Expandieren der aktivierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung,
Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum,
wobei die Wirksamkeit der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen zur adoptiven Immuntherapie im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, verbessert ist.
In einem Aspekt stellt die Offenbarung Verfahren zur Erhöhung des Wachstums von T-Zellen bereit, umfassend
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Expandieren der aktivierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung,
Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum,
wobei das Wachstum der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, größer ist.
In einem anderen Aspekt stellt die Offenbarung Verfahren zur Verringerung des Zelltods von T-Zellen zur Verwendung in der adoptiven Immuntherapie bereit, umfassend
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Expandieren der aktivierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung,
Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum,
wobei der Zelltod der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, reduziert ist.
Die Offenbarung stellt ferner Verfahren zur Verfügung, bei denen die aktivierten T-Zellen für etwa 4 Tage nach der Aktivierung expandiert werden und bei denen die Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie der T-Zellen größer ist als die von aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert werden.
Die Offenbarung stellt ferner Verfahren zur Herstellung von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie bereit, umfassend
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor, Expandieren der transduzierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung,
Sammeln der transduzierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum
wobei die Wirksamkeit der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen zur adoptiven Immuntherapie im Vergleich zu aktivierten und transduzierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, verbessert wird.
In einem Aspekt stellt die Offenbarung Verfahren für die Produktion von T-Zellen mit einer verbesserten Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie bereit, umfassend:
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Expandieren der aktivierten T-Zellen für eine erste Zeitspanne nach der Aktivierung,
Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum,
wobei die Wirksamkeit der für die erste Zeitspanne expandierten T-Zellen für die adoptive Immuntherapie im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für eine zweite Zeitspanne nach der Aktivierung expandiert wurden, verbessert wird;
wobei die erste Zeitspanne kürzer als die zweite Zeitspanne ist.
In einem Aspekt ist die erste Zeitspanne von etwa 2 bis etwa 5 Tagen und die zweite Zeitspanne von etwa 6 Tagen bis etwa 10 Tagen; die erste Zeitspanne von etwa 3 bis etwa 5 Tagen und die zweite Zeitspanne von etwa 7 Tagen bis etwa 10 Tagen; und die erste Zeitspanne ist weniger als etwa 6 Tage und die zweite Zeitspanne ist mehr als etwa 7 Tage.
In einem Aspekt sind die expandierten T-Zellen CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen.
In einem anderen Aspekt weisen die expandierten T-Zellen einen naiven T-Zell (T_N) und/oder T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentralen Gedächtnis-T-Zellen (T_cm) Phänotyp auf.
Gemäß weiteren Aspekten werden T-Zellen durch einen Stimulator aktiviert.
In einem Aspekt umfasst der Stimulator Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper;
In einem Aspekt werden die vorliegend beschriebenen T-Zellen in der adoptiven Immuntherapie bei einem Patienten, der einer Krebsbehandlung bedarf, verwendet, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) besteht.
In einem Aspekt stellt die Offenbarung Assays zur Bewertung der Lebensfähigkeit von T-Zellen bereit, umfassend
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Expandieren eines ersten Teiles der aktivierten T-Zellen über eine längere Zeitspanne,
Kultivierung der expandierten T-Zellen in der Gegenwart von mindestens einem Zytokin,
Messung einer Zytokinreaktion in den kultivierten T-Zellen,
Identifizieren der Zeitspanne, die eine maximale Zytokinreaktion ergibt, und Expandieren eines zweiten Teils der aktivierten T-Zellen für die Zeitspanne, die eine maximale Zytokinreaktion ergibt.
Die Offenbarung stellt weiterhin Verfahren zur Herstellung der T-Zellen bereit, umfassend
Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum;
Aktivieren der T-Zellen,
Expandieren eines ersten Teiles der aktivierten T-Zellen über eine Zeitspanne,
Kultivierung der expandierten T-Zellen in der Gegenwart von mindestens einem Zytokin,
Messung einer Zytokinreaktion in den kultivierten T-Zellen,
Identifizieren einer Zeitspanne, die eine maximale Zytokinreaktion ergibt, und
Expandieren eines zweiten Teils der aktivierten T-Zellen für die Zeitspanne, die eine maximale Zytokinreaktion ergibt.
In einem Aspekt sieht die Offenbarung vor, den expandierten ersten Teil der aktivierten T-Zellen vor der Kultivierung einzufrieren.
In einem anderen Aspekt sieht die Offenbarung das Auftauen des gefrorenen expandierten ersten Teils der aktivierten T-Zellen vor der Kultivierung vor.
In noch einem anderen Aspekt sieht die Offenbarung das Ruhen des aufgetauten erweiterten erstes Teils der aktivierten T-Zellen vor der Kultivierung vor.
In einem weiteren Aspekt sieht die Offenbarung das Transduzieren aktivierter T-Zellen mit einem viralen oder nicht-viralen Vektor vor der Expansion vor.
In einem vorliegen beschriebenen Aspekt kann der Vektor ein viraler Vektor sein, wie beispielsweise ein retroviraler Vektor, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert, oder ein lentiviraler Vektor, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert, oder ein nicht-viraler Vektor, wie beispielsweise ein Liposom, der einen TCR exprimiert.
In einem Aspekt wird die Expansion der T-Zellen über eine Zeitspanne von etwa 1 Tag bis etwa 15 Tagen, von etwa 2 Tagen bis etwa 14 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 13 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 12 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 11 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 10 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 9 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 8 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 7 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 6 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 5 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 4 Tagen, von etwa 4 Tagen bis etwa 6 Tagen oder von etwa 4 Tagen bis etwa 5 Tagen nach Aktivierung gemessen.
In einem Aspekt ist das mindestens eine Zytokin aus der Gruppe bestehend aus Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 7 (IL-7), Interleukin 15 (IL-15) und einer Kombination davon ausgewählt.
In einem weiteren Aspekt liegt die Konzentration von IL-2 bei etwa 10 U/ml bis etwa 500 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 450 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 400 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 350 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 300 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 250 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 200 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 150 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 100 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 50 U/ml, von etwa 20 U/ml bis etwa 40 U/ml, von etwa 25 U/ml bis etwa 35 U/ml oder von etwa 30 U/ml bis etwa 35 U/ml.
In einem weiteren Aspekt beträgt die vorliegend vorgesehene Konzentration von IL-7 von 0,1 ng/ml bis 50 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 45 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 40 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 35 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 30 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 25 ng/ml, von 0.1 ng/ml bis 20 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 15 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 10 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 5 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 4 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 3 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 2 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 1 ng/ml oder von 0,1 ng/ml bis 0,5 ng/ml.
In einem weiteren Aspekt beträgt die Konzentration von IL-15 von 0,1 ng/ml bis 50 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 45 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 40 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 35 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 30 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 25 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 20 ng/ml, von 0.1 ng/ml bis 15 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 10 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 5 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 4 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 3 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 2 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 1 ng/ml oder von 0,1 ng/ml bis 0,5 ng/ml.
Die Offenbarung stellt ferner Verfahren bereit, wobei die Zytokinreaktion aus einem oder mehreren von erhöhter Proliferation, reduzierter Apoptose, erhöhter Population von naiven T-Zellen (T_N) und/oder T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentralen Gedächtnis-T-Zellen (T_cm) und einer Kombination davon ausgewählt ist.
In einem Aspekt wird der Ruheschritt innerhalb einer Zeitspanne von etwa 0,5 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 36 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 18 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 12 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 6 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 6 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden, oder etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden, etwa 2 bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 120 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 108 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 96 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 84 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 0,5 Stunden bis etwa 60 Stunden durchgeführt.
Entsprechend der Offenbarung weist der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,6 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,3 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,4 µg/ml, oder etwa 0,4 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml auf.
In einem anderen Aspekt wird die Aktivierung innerhalb einer Zeitspanne von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt.
In einem Aspekt sind die gemäß den vorliegend beschriebenen Verfahren erhaltene T-Zellen CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen.
In einem Aspekt stellt die Offenbarung Verfahren bereit, um die Lebensfähigkeit von T-Zellen unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Verfahren und Verfahrensschritte zu beurteilen. In einem Aspekt beinhalten die vorliegend beschriebenen Verfahren nur in vitro Verfahrensschritte. In einem Aspekt beinhalten die vorliegend beschriebenen Verfahren keine in vivo Verfahrensschritte. In einem weiteren Aspekt beinhalten die vorliegend beschriebenen Verfahren eine Kombination von in vitro und in vivo durchgeführte Verfahrensschritte.
In einem Aspekt beinhalten die vorliegend beschriebenen Verfahren keine Analyse oder Bewertung durch den Einsatz transgener Tiere, wie beispielsweise transgener Mäuse. In noch einem weiteren Aspekt sind die vorliegend beschriebenen Verfahren in der Lage, Bedingungen für die Produktion von T-Zellen und/oder die Lebensfähigkeit von T-Zellen schneller zu bestimmen als Verfahren, bei denen ein transgenes Tier, zum Beispiel eine transgene Maus, verwendet wird.
In einem anderen Aspekt sehen die vorliegend beschriebenen Verfahren lebensfähige T-Zellen vor, die zur Infusion in einen Patienten oder ein Subjekt, der diese benötigt, verwendet werden können. In einem weiteren Aspekt werden die vorliegend beschriebenen Verfahren in vitro durchgeführt und sind aussagefähig für in vivo Ergebnisse. In weiteren Aspekten ermöglicht die Offenbarung Hochdurchsatz in vitro-Assays, die die in-vivo-Lebensfähigkeit von T-Zellen für die Transfusion vorhersagen.
In einem Aspekt sieht die Beschreibung Zytokinantwort- (CR)-Assays und eine zugehörige Methodik vor, die in der Lage sind, die Persistenz von adoptiv infudierten T-Zellen vorherzusagen. In einem Aspekt sieht die Beschreibung Zytokin-Sensitivitätstests vor, die in der Lage sind, den Effekt der in-vitro-Expansionslänge auf die Fähigkeit, auf Zytokin zu reagieren und in Abwesenheit einer kontinuierlichen Zytokinstimulation zu überleben, zu messen.
In einem weiteren Aspekt können die vorliegend beschriebenen Verfahren verwendet werden, um zu bestimmen, welche Arten von T-Zellen in vivo persistieren, indem die Hochdurchsatzmethodik in vitro verwendet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die T-Zellen umfassen, die in diesem Dokument beschrieben werden, werden auch zur Verfügung gestellt. In einem weiteren Aspekt beinhalten die vorliegend beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Hilfsstoff oder Salz davon.
Die nach den vorliegend beschriebenen Verfahren hergestellte T-Zellpopulation wird durch die Offenlegung weiter bereitgestellt. In einem Aspekt sind die T-Zellen modifizierte T-Zellen.
Figurenliste

1 zeigt T-Zell-Apoptose (z. B. Durch Restimulation induzierter Zelltod (RICD) und durch Zytokin-Entzug induzierter Zelltod (CWID)) und Gedächtnisbildung.
2 zeigt ein Modell des in vivo T-Zellüberlebens in der ACT, das auf hämatologische Tumore und solide Tumore abzielt, indem es jeweils den intrinsischen oder extrinsischen apoptotischen Weg hemmt.
3 zeigt ein Testmodell zum T-Zell-Überleben in vivo in der ACT, das durch Serientötungsassay bzw. Zytokinempfindlichkeitsassay auf hämatologische Tumore und solide Tumore abzielt.
4 zeigt den Zytokinempfindlichkeitstest gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
5A-5D zeigen eine Tscm-ähnliche Bildung während der in-vitro-Expansion, gekennzeichnet durch CD45RO(niedrig) und CCR7+.
6A-61 zeigen, dass früh expandierte Tscm die IL-15-Zytokinempfindlichkeit über 21 Tage im Test beibehalten.
7A-7C zeigen, dass früh expandierte Zellen (Expansion für etwa 4 Tage) ein erhöhtes Zellwachstum im Vergleich zur Expansion nach 7 und 10 Tagen aufweisen. Die Beschriftung unter den Diagrammen stellt die Menge des verwendeten Zytokins dar. Eine lineare quadratische Linienanpassung wird verwendet, um das Zellverhalten zu modellieren.
8A-8C zeigen, dass eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen (Expansion für ca. 4 Tage) mit einem erhöhten Überleben bei höheren Zytokin-Konzentrationen im Vergleich zur Expansion nach 7 und 10 Tagen korreliert.
8D-8F zeigen, dass eine verkürzte in vitro-Expansion transduzierter T-Zellen mit einem erhöhten Überleben bei höheren Zytokin-Konzentrationen korreliert.
9A-9C zeigen, dass eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen mit einem erhöhten Überleben bei niedrigeren Zytokin-Konzentrationen korreliert.
10A-10C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen, die mit einer reduzierten Apoptose korreliert.
11A-11C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen, die mit einer reduzierten Apoptose bei höheren Zytokin-Konzentrationen korreliert.
12A-12C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen, die mit einer reduzierten Apoptose korreliert.
13A-13C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen, die mit einer erhöhten Zellteilung in Gegenwart von (A) IL-7, (B) IL-15 und (C) IL-2 korreliert.
14A-14C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion transduzierter T-Zellen, die mit einer erhöhten Zellteilung bei höheren Zytokin-Konzentrationen korreliert.
Flg. 15A-15C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen, die mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber (A) IL-7, (B) IL-15 und (C) IL-2 korreliert.
16A-16C zeigen eine verkürzte in vitro-Expansion transduzierter T-Zellen, die mit einer erhöhten Zellteilung bei höheren Zytokin-Konzentrationen korreliert.
16D zeigt eine verkürzte in vitro-Expansion transduzierter T-Zellen, die mit einer erhöhten CD25-Expression korreliert.
17 zeigt eine Korrelation zwischen der Expression des IL-2-Rezeptors (CD25) und dem Überleben/Teilung in Gegenwart von IL-2.
18 zeigt eine Korrelation zwischen der Expression des IL-15-Rezeptors (CD122) und dem Überleben/Teilung in Gegenwart von IL-15.
19 zeigt eine Korrelation zwischen der Expression des IL-7-Rezeptors (CD127) und dem Überleben/Teilung in Gegenwart von IL-7.
20 zeigt eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen, die das T-Zell-Potenzial erhalten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Wie vorliegend beschrieben, stellt die Offenbarung Verfahren zur Verbesserung der Wirksamkeit und Lebensfähigkeit von T-Zellen bereit.
In einem vorliegend beschriebenen Aspekt weisen minimal expandierte, modifizierte T-Zellen eine höhere klinische Wirksamkeit auf als T-Zellen, die über längere Zeiträume in vitro expandiert wurden, da sie eine erhöhte Naivität und Fähigkeit zur Proliferation und Persistenz in vivo aufweisen. In einem Aspekt werden die minimal expandierten, konstruierten T-Zellen für ungefähr 3 bis ungefähr 5 Tage, relativ zu der verlängerten Expansion von ungefähr 7 bis zu ungefähr 10 Tage expandiert.
In einem vorliegend beschriebenen Aspekt zeigen T-Zellen mit einer kürzeren Expansionszeit von etwa 3 bis etwa 5 Tagen eine erhöhte Zytokinantwort durch 1) Proliferation, 2) reduzierte Apoptose und 3) Persistenz gegenüber T-Zellen, die nach dem gleichen Verfahren, aber mit einer erhöhten Expansionszeit von etwa 7 bis etwa 10 Tagen hergestellt wurden.
Adoptive Zellübertragung oder -therapie (ACT) umfasst ein Behandlungsverfahren, bei dem Zellen von einem Spender entfernt, in vitro kultiviert und/oder manipuliert und einem Patienten zur Behandlung einer Krankheit verabreicht werden. In einigen Ausführungsformen können übertragene Zellen autologe Zellen sein, was bedeutet, dass der Patient als sein eigener Spender agiert. In einigen Ausführungsformen können übertragene Zellen Lymphozyten sein, z. B. T-Zellen. In einigen Ausführungsformen können übertragene Zellen vor der Verabreichung an einen Patienten gentechnisch verändert werden. So können beispielsweise die übertragenen Zellen so konstruiert werden, dass sie einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimieren, der eine Spezifität für ein interessierendes Antigen aufweist. In einer Ausführungsform können übertragene Zellen so konstruiert werden, dass sie einen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren. In bestimmten Ausführungsformen können transferierte Zellen so konstruiert werden (z. B. durch Transfektion oder Konjugation), dass sie ein Molekül exprimieren, das die Anti-Tumor-Aktivität der Zellen, solcher wie ein Zytokin (IL-2, IL-12), ein anti-apoptotisches Molekül (BCL-2, BCL-X) oder ein Chemokin (CXCR2, CCR4, CCR2B) verstärkt. In bestimmten Ausführungsformen können übertragene Zellen so konstruiert sein, dass sie sowohl ein CAR als auch ein Molekül exprimieren, das die Antitumoraktivität oder die Persistenz der Zellen erhöht.
In einem Aspekt betrifft die Offenbarung Verfahren, bei denen das Ergebnis des Adoptiven Zelltransfers oder -therapie (ACT) durch die Verabreichung von minimal erweiterten T-Zellen an Krebspatienten verbessert werden kann.
Behandlungsverfahren
In einem Aspekt sind die vorliegend beschriebenen expandierten modifizierten T-Zellen für die Behandlung einer Erkrankung nützlich, die mit einer abnormalen Apoptose oder einem Differenzierungsprozess verbunden ist (z. B. Störungen der zellulären Proliferation oder zellulären Differenzierung, wie Krebs). Im Folgenden werden nicht einschränkende Beispiele von Krebsarten beschrieben, die mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können.
Beispiele für Störungen der zellulären Proliferation und/oder Differenzierung können Krebs (z. B. Karzinom, Sarkom, metastatische Störungen oder hämatopoetische neoplastische Störungen, z. B. Leukämien) beinhalten. Ein metastasierender Tumor kann aus einer Vielzahl von Primärtumorarten entstehen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die von Prostata, Dickdarm, Lunge, Brust und Leber. Dementsprechend können die Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung (z. B. minimal ex vivo expandierte, modifizierte T-Zellen) an einen krebskranken Patienten verabreicht werden.
Wie vorliegend verwendet, können die Begriffe „Krebs“ (oder „kanzerös“), „hyperproliferativ“ und „neoplastisch“ verwendet werden, um sich auf Zellen zu beziehen, die die Fähigkeit zum autonomen Wachstum aufweisen (d. h. ein abnormaler Zustand oder eine Kondition, welche/r durch schnell proliferierenden Zellwachstum gekennzeichnet ist). Hyperproliferative und neoplastische Krankheitszustände können als pathologisch eingestuft werden (d. h. sie charakterisieren oder bilden einen Krankheitszustand), oder sie können als nicht-pathologisch eingestuft werden (d. h. als eine Abweichung von der Norm, aber nicht mit einem Krankheitszustand assoziiert). Die Begriffe sollen alle Arten von Krebsgeschwüren oder onkogenen Prozessen, metastasiertem Gewebe oder bösartig veränderten Zellen, Geweben oder Organen umfassen, unabhängig von der histopathologischen Art oder dem Stadium der Invasivität. „Pathologische hyperproliferative“ Zellen können in Krankheitszuständen auftreten, die durch bösartiges Tumorwachstum gekennzeichnet sind. Beispiele für nicht-pathologische hyperproliferative Zellen können die Proliferation von Zellen im Zusammenhang mit der Wundheilung beinhalten.
Der Begriff „Krebs“ oder „Neoplasie“ kann verwendet werden, um sich auf Malignitäten der verschiedenen Organsysteme zu beziehen, einschließlich solcher, die die Lunge, die Brust, die Schilddrüse, die Lymphdrüsen und das Lymphgewebe, die Magen-Darm-Organe und den Urogenitaltrakt betreffen, sowie auf Adenokarzinome, die allgemein als Malignitäten beinhaltende angesehen werden können, wie die meisten Darmkrebsarten, Nierenzellkarzinom, Prostatakrebs und/oder Hodentumore, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Dünndarmkrebs und Speiseröhrenkrebs. In Bezug auf die Verfahren der Erfindung kann der Krebs jeder Krebs sein, einschließlich akutes lymphatisches Krebses, akuter myeloischer Leukämie, alveoläres Rhabdomyosarkoms, Knochenkrebses, Hirnkrebses, Brustkrebses, Anus-, Analkanal- oder Anorektumkrebses, Augenkrebses, Krebses des intrahepatischen Gallenganges, Krebses der Gelenke, Krebses des Halses, der Gallenblase oder des Pleuras, Krebses der Nase, der Nasenhöhle oder des Mittelohrs, Krebses der Vulva, chronischer lymphatischer Leukämie, chronisches myeloisches Krebses, Gebärmutterhalskrebses, Glioms, Hodgkin-Lymphoms, Hypopharynxkrebses, Nierenkrebses, Kehlkopfkrebses, Leberkrebses, Lungenkrebses, bösartiges Mesothelioms, Melanoms, multiples Myeloms, Nasopharynxkrebses, Non-Hodgkin-Lymphoms, Eierstockkrebses, Peritoneum-, Omentum- und Mesenteriumkrebses, Rachenkrebses, Prostatakrebses, Rektumkarzinoms, Nierenkrebses, Hautkrebses, Weichgewebekrebses, Hodenkrebses, Schilddrüsenkrebses, Harnleiterkrebses, Harnblasenkrebses und Krebses des Verdauungstraktes wie z. B. Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magenkrebs, Dünndarmkrebs, gastrointestinaler Karzinoidtumor, Krebs der Mundhöhle, Darmkrebs und hepatobiliärer Krebs.
Der Begriff „Karzinom“ bezieht sich auf Malignitäten von epithelialem oder endokrinem Gewebe, einschließlich Atemwegskarzinomen, Karzinomen des gastrointestinalen Systems, Karzinome des Urogenitaltrakts, Hodenkarzinomen, Brustkarzinomen, Prostatakarzinomen, endokrinen Systemkarzinomen und Melanomen. Exemplarische Karzinome sind solche, die sich aus dem Gewebe von Gebärmutterhals, Lunge, Prostata, Brust, Kopf und Hals, Dickdarm und Eierstock bilden. Der Begriff kann auch Karzinosarkome umfassen, zu denen bösartige Tumore gehören, die sich aus karzinomatösem und sarkomatösem Gewebe zusammensetzen. Ein „Adenokarzinom“ bezeichnet ein aus Drüsengewebe stammendes Karzinom, bei dem die Tumorzellen erkennbare Drüsenstrukturen bilden.
Weitere Beispiele für proliferative Erkrankungen können hämatopoetische neoplastische Störungen beinhalten. Wie vorliegend verwendet, kann der Begriff „hämatopoetische neoplastische Störungen“ Krankheiten einschließen, an denen hyperplastische/neoplastische Zellen hämatopoetischen Ursprungs beteiligt sind, z. B. aus myeloischen, lymphoiden oder erythroischen Linien oder Vorläuferzellen derselben. Vorzugsweise können die Erkrankungen aus schlecht differenzierten akuten Leukämien (z. B. erythroblastische Leukämie und akute megakaryoblastische Leukämie) entstehen. Weitere exemplarische myeloische Erkrankungen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die akute promyeloische Leukämie (APML), die akute myeloische Leukämie (AML) und die chronische myeloische Leukämie (CML) sein (Übersicht s. in Vaickus, L. (1991) Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97); maligne Lymphome umfassen, sind aber nicht beschränkt auf akute Lymphoblastenleukämie (ALL), die die B-Linie ALL und T-Linie ALL umfasst, die chronische lymphatische Leukämie (CLL), die Prolymphozytenleukämie (PLL), die Haarzell-Leukämie (HLL) und die Waldenströms Makroglobulinämie (WM). Weitere Formen von bösartigen Lymphomen können das Non-Hodgkin-Lymphom und Varianten davon, periphere T-Zell-Lymphome, adulte T-Zell-Leukämie/Lymphom (ATL), kutane T-Zell-Lymphome (CTCL), großkörnige lymphatische Leukämie (LGF), Morbus Hodgkin und Morbus Reed-Sternberg umfassen, sind aber nicht beschränkt darauf.
Es wird von den Fachleuten zu verstehen sein, dass die Mengen für minimal expandierte, modifizierte T-Zellen, die ausreichen, um das Tumorwachstum und die Tumorgröße zu reduzieren, oder eine therapeutisch wirksame Menge, nicht nur abhängig von den ausgewählten bestimmten Zusammensetzungen, sondern auch von der Art der Verabreichung, der Art der zu behandelnden Erkrankung und dem Alter und Zustand des Patienten variieren können und letztlich im Ermessen des Arztes oder Apothekers des Patienten liegen. Die Zeitspanne, in der minimal expandierte, modifizierte T-Zellen, die in den vorliegenden Verfahren verwendet werden, angegeben werden können, variiert von Fall zu Fall. Es wird von den Fachleuten zu verstehen sein, dass sich der Bezug auf die Behandlung im vorliegenden Kontext auf die Prophylaxe sowie die Behandlung der genannten Krebsarten und Symptome erstreckt.
Die Begriffe „T-Zelle“ oder „T-Lymphozyt“ können Thymozyten, naive T-Lymphozyten, unreife T-Lymphozyten, reife T-Lymphozyten, ruhende T-Lymphozyten oder aktivierte T-Lymphozyten umfassen. Veranschaulichende Populationen von T-Zellen, die für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen geeignet sind, sind unter anderem, aber nicht begrenzt auf, T-Helferzellen (HTL; CD4+ T-Zelle), eine zytotoxische T-Zelle (CTL; CD8+ T-Zelle), CD4+CD8+ T-Zelle, CD4-CD8- T-Zelle oder eine andere Teilmenge von T-Zellen. Andere veranschaulichende Populationen von T-Zellen, die für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen geeignet sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf T-Zellen, die einen oder mehrere der folgenden Marker exprimieren: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 und HLA-DR und können auf Wunsch durch Positiv- oder Negativauswahltechniken weiter isoliert werden.
Eine mononukleare Zelle des peripheren Bluts (PBMC) bezieht sich auf jede Blutzelle mit einem runden Kern (d. h. ein Lymphozyt, ein Monozyt oder ein Makrophag). Diese Blutzellen sind ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems, um Infektionen zu bekämpfen und sich an Eindringlinge anzupassen. Die Lymphozytenpopulation besteht aus CD4+ und CD8+ T-Zellen, B-Zellen und natürlichen Killer-Zellen, CD14+ Monozyten und Basophilen/Neutrophilen/Eosinophilen/dendritischen Zellen. Diese Zellen werden oft vom Vollblut oder von Leukopacks unter FICOLL™, einem hydrophilen Polysaccharid, das Blutschichten trennt, getrennt, wobei Monozyten und Lymphozyten unter einer Plasmaschicht einen „Buffy Coat“ bilden. In einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „PBMCs“ auf eine Population von Zellen, die mindestens T-Zellen und gegebenenfalls NK-Zellen umfasst, und antigenpräsentierende Zellen.
Der Begriff „Aktivierung“ bezieht sich auf den Zustand einer T-Zelle, die ausreichend stimuliert wurde, um eine nachweisbare Zellproliferation zu induzieren. In bestimmten Ausführungsformen kann die Aktivierung auch mit induzierter Zytokinproduktion und nachweisbaren Effektorfunktionen verbunden sein. Der Begriff „aktivierte T-Zellen“ bezieht sich unter anderem auf T-Zellen, die proliferieren. Die über die TCR erzeugten Signale allein reichen nicht aus, um die T-Zelle vollständig zu aktivieren, und es werden auch ein oder mehrere sekundäre oder kostimulatorische Signale benötigt. Somit umfasst die T-Zell-Aktivierung ein primäres Stimulationssignal durch den TCR/CD3-Komplex und ein oder mehrere sekundäre kostimulatorische Signale. Die Kostimulation kann durch Proliferation und/oder Zytokinproduktion von T-Zellen nachgewiesen werden, die ein primäres Aktivierungssignal erhalten haben, wie beispielsweise die Stimulation durch den CD3/TCR-Komplex oder durch CD2.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bedeutet eine ruhende T-Zelle eine T-Zelle, die sich nicht teilt und keine Zytokine produziert. Die ruhenden T-Zellen sind klein (ca. 6-8 Mikron) im Vergleich zu aktivierten T-Zellen (ca. 12-15 Mikron).
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, ist eine geprimte T-Zelle eine ruhende T-Zelle, die zuvor mindestens einmal aktiviert wurde und für mindestens etwa 1 Stunde, mindestens etwa 2 Stunden, mindestens etwa 3 Stunden, mindestens etwa 4 Stunden, mindestens etwa 5 Stunden, mindestens etwa 6 Stunden, mindestens etwa 12 Stunden, mindestens etwa 24 Stunden, mindestens etwa 48 Stunden, mindestens etwa 60 Stunden, mindestens 72 Stunden, mindestens etwa 84 Stunden, mindestens etwa 96 Stunden, mindestens etwa 108 Stunden oder mindestens etwa 120 Stunden aus dem Aktivierungsstimulus entfernt wurde. Alternativ kann die Ruhezeit innerhalb einer Zeitspanne von etwa 0,5 Stunden bis etwa 120 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 108 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 96 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 84 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 0.5 Stunden bis etwa 60 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 36 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 18 Stunden, etwa 0,5 bis etwa 12 Stunden, etwa 0,5 Stunde bis etwa 6 Stunden, etwa 1 bis etwa 6 Stunden, etwa 2 bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden oder etwa 4 Stunden bis etwa 5 Stunden durchgeführt werden. Geprimte T-Zellen haben in der Regel einen Memoryphänotyp.
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können das Ruhen in Abwesenheit von Zytokinen oder in Gegenwart von Zytokinen, z. B. IL-7, IL-15 oder IL-7 + IL-15 für etwa 4 bis etwa 6 Stunden einschließen.
Die kontrollierte Expansion und Kontraktion von Lymphozyten sowohl während als auch nach einer adaptiven Immunantwort kann für die Aufrechterhaltung eines gesunden Immunsystems unerlässlich sein. Sowohl extrinsische als auch intrinsische Wege der Lymphozyten-Apoptose können so programmiert werden, dass sie Zellen zum richtigen Zeitpunkt eliminieren, um die Immunhomöostase zu gewährleisten. Ohne diese Lymphozyten-Apoptoseschranke kann eine längere Persistenz und/oder eine unkontrollierte Anhäufung von aktivierten Lymphozyten zu Immunpathologie, Autoimmunität und lymphoiden Krebsarten führen.
1 zeigt, wie die meisten somatischen Zellen, dass Naiv- und Gedächtnis-T-Zellen in einem allgemein ruhigen Stoffwechselzustand funktionieren und die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) zur ATP-Erzeugung nutzen können. Nach der Stimulation des T-Zell-Rezeptors (TCR) schalten die antwortenden T-Zellen jedoch schnell auf die Glykolyse, auch in Gegenwart von Sauerstoff (Warburg-Effekt) um. Aktivierte T-Zellen können proliferieren und starke Effektorfunktionen erwerben (z. B. IFN-γ Produktion), die mit dem glykolytischen Stoffwechsel verbunden sein können. Diese Veränderungen im Zellstoffwechsel im Laufe einer T-Zellreaktion können das Überleben und die Differenzierung der Zellen, einschließlich der Gedächtnisbildung, erheblich beeinflussen. Während dieses Expansionsfensters und der aeroben Glykolyse können Effektor-T-Zellen jedoch empfindlich auf den Restimulation-induzierten Zelltod (RICD) reagieren.
Der Restimulation-induzierte Zelltod (RICD) ist ein apoptotisches Programm, das letztendlich eine Obergrenze für die Expansion der Effektor-T-Zellen während einer Infektion festlegen kann. Die RICD-Sensitivität kann von einer vorherigen Aktivierung, der Zellzyklusinduktion über Zytokine, wie IL-2, und einem nachfolgenden, starken Restimulationssignal abhängen, das sich durch den TCR ausbreitet und in einer Teilmenge von Effektoren Apoptose induziert. Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen können naive und ruhende Gedächtnis-T-Zellen relativ resistent gegen RICD sein. Durch die Begrenzung der Anzahl der Effektor-T-Zellen während der Antigen-induzierten Expansionsphase kann dieser selbstregulierende Todesweg dazu beitragen, die Immunhomöostase aufrechtzuerhalten, indem er übermäßige, unspezifische immunpathologische Schäden am Wirt ausschließt. Tatsächlich trägt ein Defekt in der RICD zu einer übermäßigen Ansammlung von T-Zellen und tödlichen Schäden am Wirtsgewebe bei, wie bei Patienten mit einer X-verknüpften lymphoproliferativen Erkrankung festgestellt wurde.
Der Zytokin-Entzugs-induzierter Zelltod (CWID) ist ein kritisches Apoptoseprogramm, das für die Keulung der Mehrheit der Effektor-T-Zellen verantwortlich ist, ausgelöst durch abnehmende Zytokine, z. B. IL-2, die nach der Beseitigung einer Infektion auftreten und einige Wenige speichern kann, die als Speicher-T-Zellen überleben. Während ein übermäßiger anaboler Stoffwechsel (z. B. Glykolyse) die Effektor-T-Zellen anfälliger für RICD machen kann, kann der katabole Stoffwechsel (z. B. Autophagie und Fettsäureoxidation (FAO)) dagegen T-Zellen, die aus verschiedenen Gedächtnisbereichen stammen, vor dem Tod durch Zytokinentzug schützen. Die CWID-Sensitivität kann daher eine wichtige Rolle bei der Bestimmung spielen, welche und wie viele T-Zellen die Kontraktion überleben und in den Gedächtnispool gelangen, wodurch sekundäre Reaktionen beeinflusst werden, die aus verschiedenen Gedächtnisuntergruppen stammen.
CWID und RICD können in verschiedenen Phasen der Immunantwort als fest vernetzte Rückkopplungsprogramme arbeiten, die durch die dynamische Lokalisierung von Zellen, Antigenen und Zytokinen beeinflusst werden. Beide Prozesse werden durch die Verfügbarkeit von Antigen und IL-2 sowie anderen Wachstums- und Überlebenszytokinen hervorragend reguliert. Mechanistisch gesehen können diese beiden Prozesse T-Zellen durch unterschiedliche biochemische Mechanismen der Apoptose eliminieren, die als intrinsische und extrinsische Wege bekannt sind. Der intrinsische Weg wird durch die relative Expression von Proteinen der Bcl-2-Familie gesteuert, die das mitochondriale Außenmembranpotenzial (MOMP) regulieren. Wenn Mitochondrien depolarisiert sind, katalysiert die Freisetzung von Cytochrom c die Spaltung und Aktivierung der Procaspase 9. Die extrinsische Apoptose wird hauptsächlich durch Todesrezeptoren (DRs) der Überfamilie der Tumornekrosefaktorrezeptoren (TNFR) wie Fas signalisiert.
CWID induziert die intrinsische Apoptose. Der Entzug von IL-2 oder anderen Zytokinen der γ-Kette reguliert und aktiviert spezifisch Bim, ein wichtiges pro-apoptotisches Protein, das die Funktion von anti-apoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie (z. B. Bcl-2, Bcl-xL und Mcl-1) antagonisiert und Bax aktiviert, was eine mitochondriale Permeabilisierung bewirkt. RICD kann auf ein extrinsisches Apoptosesignal durch Fas zurückgeführt werden, das in cis oder in trans durch membranverankertes FasL auf der Oberfläche restimulierter T-Zellen stimuliert werden kann.
Da der katabole Stoffwechsel (d. h. die Autophagie) T-Zellen aus verschiedenen Gedächtnisbereichen vor dem durch den Zytokin-Entzug, d. h. CWID, induzierten Tod schützen kann, kann ein Ziel der ex vivo T-Zell-Expansion darin bestehen, die Anzahl der gedächtnisbildenden Zellen, wie z. B. naive T-Zellen (T_N) und/oder T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T_cm) zu erhöhen.
2 zeigt Unterschiede zu herkömmlichen ACT-T-Zellen zur Behandlung von soliden Tumoren und hämatologischen Tumoren. Zur Behandlung von soliden Tumoren können T-Zellen durch Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörper aktiviert werden, gefolgt von einer Expansion über eine längere Zeitspanne. Aktivierte/expandierte, modifizierte T-Zellen in einer soliden Tumorumgebung mit reduziertem Zugang zu verwandtem Antigen im Vergleich zu hämatologischen Tumoren, nicht verwandten Antigenen und begrenzten Apoptoseinhibitoren können intrinsische apoptotische Wege durchlaufen, z. B. Beschädigungs-induzierter Zelltod (DICD) oder CWID, der während der ex vivo Expansion induziert wird. Zur Behandlung von hämatologischen Tumoren kann es weniger wahrscheinlich sein, dass aktivierte/expandierte modifizierte T-Zellen in Umgebung hämatologischer Tumore mit an verwandten Antigenen reicher Umgebung mit Tumoren und antigenpräsentierenden Zellen sich einer Apoptose von CWID unterziehen, aber sie können auch häufiger einem Aktivierungsinduzierten Zelltod (AICD) durch Erhöhungsantigenstimulation ausgesetzt sein, was darauf hindeutet, dass die Behandlung von soliden Tumoren T-Zellen erfordern kann, CWID mehr als AICD zu widerstehen.
3 zeigt, um die Fähigkeit von in vitro expandierten T-Zellen, den Entzug der Zytokinstimulation zu überleben, z. B. bei soliden Tumoren, zu testen, können Zytokin-Empfindlichkeitstests verwendet werden. Um andererseits die Überlebens- und Funktionsfähigkeit von in vitro expandierten T-Zellen bei wiederholten TCR-Stimulationen, z. B. bei hämatologischen Tumoren, zu testen, können Serientötungsassays verwendet werden.

Tabelle 1 fasst die Unterschiede des T-Zellüberlebens in vivo zwischen hämatologischen Tumoren und soliden Tumoren zusammen. Tabelle 1: Modell des in vivo T-Zellüberlebens

Hämatologische Tumore	Solide Tumore
TCR-Stimulation in der Peripherie	TCR-Stimulation lokalisiert an dem Tumor und Antigen-präsentierende Zellen (APCs)
Hohe Tumorbelastung in lymphozytenreichen Kompartments	Niedrige Tumorbelastung in lymphozytenreichen Kompartments
Weniger abhängig von Zytokinen für das Überleben (IL-7 und IL-15)	Stärker abhängig von Zytokinen für das Überleben (IL-7 und IL-15)

Da in vitro expandierte T-Zellen in der ACT, die auf solide Tumore in antigenen deprivierten Umgebungen abzielen, möglicherweise stärker von Zytokinen zum Überleben abhängig sind als solche, die auf hämatologische Tumore abzielen, kann die in vitro Gedächtnisbildung und CWID-Reduktion für in vitro expandierte T-Zellen, die auf solide Tumore abzielen, kritischer sein als für solche, die auf hämatologische Tumore abzielen. Daher kann die Auswahl von T-Zelltypen, die in vivo in einem patientenindividuellen Hochdurchsatzverfahren für die ACT persistieren könnten, die klinische Wirksamkeit der Behandlung von soliden Tumoren erhöhen. Die Zytokin-Sensitivitätstests der vorliegenden Offenbarung können verwendet werden, um vorherzusagen und auszuwählen, welche Arten von erweiterten T-Zellen in vivo in Antigen-deprivierten Umgebungen persistieren könnten.
Quelle der T-Zellen
Vor der Expansion und genetischen Veränderung von T-Zellen kann eine Quelle von T-Zellen von einem Subjekt bezogen werden. T-Zellen können aus einer Reihe von Quellen gewonnen werden, darunter mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, Knochenmark, Lymphknotengewebe, Nabelschnurblut, Thymusgewebe, Gewebe aus einer Infektionsstelle, Aszites, Pleuraerguss, Milzgewebe und Tumore. In bestimmten Ausführungsformen können beliebig viele der in der Technik verfügbaren T-Zelllinien verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen können T-Zellen aus einer Einheit Blut gewonnen werden, das von einem Probanden unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Techniken gewonnen wird, die dem erfahrenen Fachmann bekannt sind, wie z. B. Ficoll™ Trennung. In einer bevorzugten Ausführungsform können Zellen aus dem zirkulierenden Blut eines Individuums durch Apherese gewonnen werden. Das Apherese-Produkt enthält typischerweise Lymphozyten, einschließlich T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, B-Zellen, andere kernhaltige weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen und Blutplättchen. Die durch Apherese gewonnenen Zellen können gewaschen werden, um die Plasmafraktion zu entfernen und die Zellen in einen geeigneten Puffer oder ein geeignetes Medium für nachfolgende Verarbeitungsschritte zu bringen. Die Zellen können mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder mit einer Waschlösung gewaschen werden, in welcher Kalzium fehlt und Magnesium fehlen kann oder viele, wenn nicht alle zweiwertigen Kationen, fehlen können. Erste Aktivierungsschritte in Abwesenheit von Kalzium können zu einer vergrößerten Aktivierung führen. Wie die Fachleute es einfach zu verstehen vermögen, kann ein Waschschritt mit denjenigen aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie z. B. mit Hilfe einer halbautomatischen „Durchflusszentrifuge“ (z. B. dem Deckenprozessor Cobe 2991, dem Baxter CytoMate oder dem Haemonetics Cell Saver 5) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach dem Waschen können die Zellen in einer Vielzahl von biokompatiblen Puffern resuspendiert werden, wie z. B. Ca³⁺-frei, Mg²⁺-frei PBS, PlasmaLyte A oder andere Kochsalzlösungen mit oder ohne Puffer. Alternativ können die unerwünschten Bestandteile der Aphereseprobe entfernt und die Zellen direkt in Kulturmedien resuspendiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform können T-Zellen aus peripheren Blutlymphozyten isoliert werden, indem die roten Blutkörperchen lysiert und die Monozyten vermindert werden, z. B. durch Zentrifugation durch einen PERCOLL™-Gradienten oder durch Gegenstromzentrifugation (zentrifugale Elutriation). Eine spezifische Subpopulation von T-Zellen wie CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ und CD45RO+T-Zellen kann durch positive oder negative Selektionstechniken weiter isoliert werden. So können beispielsweise in einer Ausführungsform T-Zellen durch Inkubation mit Anti-CD3/anti-CD28 (d. h. 3x28)-konjugierten Beads, wie DYNABEADS^® M-450 CD3/CD28 T, für einen Zeitraum isoliert werden, der für eine positive Auswahl der gewünschten T-Zellen ausreicht.
Die Anreicherung einer T-Zellpopulation durch negative Selektion kann mit einer Kombination von Antikörpern erreicht werden, die auf Oberflächenmarker gerichtet sind, die für die negativ ausgewählten Zellen einzigartig sind. Ein Verfahren kann eine Zellsortierung und/oder Selektion über negative magnetische Immunadhärenz oder Flußzytometrie, die ein Gemisch von monoklonalen Antikörpern verwendet, die gegen Zelloberflächenmarker, die auf den negativ selektierten Zellen vorhanden sind, gerichtet sind, sein. Um zum Beispiel CD4+-Zellen durch negative Selektion anzureichen, kann ein Gemisch von monoklonalen Antikörpern typischerweise Antikörper gegen CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR und CD8 einschließen. In bestimmten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, regulatorische T-Zellen anzureichern oder positiv auszuwählen, die typischerweise CD4+, CD25+, CD62L1, GITR+ und FoxP3+ exprimieren können. Alternativ können in bestimmten Ausführungsformen T-Regulierungszellen durch konjugierte Anti-CD25-Beads oder andere ähnliche Auswahlmethoden depletiert werden.
Zur Isolierung einer gewünschten Zellpopulation durch positive oder negative Selektion kann die Konzentration von Zellen und Oberfläche (z. B. Partikel wie Beads) variiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, das Volumen, in dem Beads und Zellen miteinander vermischt werden können, deutlich zu verringern (d. h. die Konzentration der Zellen zu erhöhen), um einen maximalen Kontakt von Zellen und Beads zu gewährleisten. So kann beispielsweise in einer Ausführungsform eine Konzentration von 2 Milliarden Zellen/ml verwendet werden. In einer Ausführungsform kann eine Konzentration von 1 Milliarde Zellen/ml verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform können mehr als 100 Millionen Zellen/ml verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Zellkonzentration von 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Millionen Zellen/ml verwendet werden. In noch einer weiteren Ausführungsform kann eine Zellkonzentration von 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 Millionen Zellen/ml verwendet werden. In weiteren Ausführungsformen können Konzentrationen von 125 oder 150 Millionen Zellen/ml verwendet werden. Die Verwendung hoher Konzentrationen kann zu einer erhöhten Zellausbeute, Zellaktivierung und Zellexpansion führen. Darüber hinaus kann die Verwendung hoher Zellkonzentrationen eine effizientere Erfassung von Zellen ermöglichen, die Zielantigene von Interesse schwach exprimieren können, wie z. B. CD28-negative T-Zellen, oder von Proben, bei denen viele Tumorzellen vorhanden sind (z. B. leukämisches Blut, Tumorgewebe, etc.). Solche Zellpopulationen können therapeutischen Wert haben und wären wünschenswert zu erhalten. So kann beispielsweise die Verwendung einer hohen Zellkonzentration eine effizientere Auswahl von CD8+ T-Zellen ermöglichen, die normalerweise eine schwächere CD28-Expression aufweisen. In einer entsprechenden Ausführungsform kann es wünschenswert sein, niedrigere Zellkonzentrationen zu verwenden. Durch eine signifikante Verdünnung der Mischung aus T-Zellen und Oberfläche (z. B. Partikel wie Beads) können Wechselwirkungen zwischen den Partikeln und Zellen minimiert werden. Dies kann für Zellen gewählt werden, die hohe Mengen an gewünschten Antigenen exprimieren, die an die Partikel gebunden werden sollen.
Ob vor oder nach der genetischen Veränderung der T-Zellen, die Zellen können im Allgemeinen mit Verfahren aktiviert und erweitert werden, wie z. B. in US-Pat. Nr. 6,352,694 ; 6,534,055 ; 6,905,680 ; 6,692,964 ; 5,858,358 ; 6,887,466 ; 6,905,681 ; 7,144,575 ; 7,067,318 ; 7,172,869 ; 7,232,566 ; 7,175,843 ; 5,883,223 ; 6,905,874 ; 6,797,514 ; 6,867,041 ; und US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2006/0121005 beschrieben wird. Die Inhalte von jeder der Patente und Anmeldungen wurden durch Hinweis vollständig als Referenz aufgenommen. Weitere Strategien zur Erweiterung der Population von T-Zellen werden z. B. in Dudley et al. Journal of Immunotherapy 2003; 26:332-42; Rasmussen et al., Journal of Immunological Methods 2010; 355:52-60; and Somerville et al., Journal of Translational Medicine 2012; 10:69 beschrieben. Der gesamte Inhalt der vorgenannten Referenzen ist im vorliegenden Kontext durch Verweis in ihrer Gesamtheit enthalten.
Verabreichung von autologen Zellen
Die autologen Zellen können auf jedem geeigneten, in der Technik bekannten Weg verabreicht werden. Vorzugsweise können die Zellen als intraarterielle oder intravenöse Infusion verabreicht werden, die etwa 30 bis etwa 60 Minuten dauert. Weitere exemplarische Verabreichungswege können intraperitoneal, intrathekal und intralymphatisch sein.
Ebenso kann jede geeignete Dosis autologer Zellen verabreicht werden. In einer Ausführungsform können beispielsweise von etwa 1,0×10⁸ Zellen bis etwa 1,0×10¹² Zellen verabreicht werden. In einer Ausführungsform können von etwa 1,0×10¹⁰ Zellen bis etwa 13,7×10¹⁰ T-Zellen verabreicht werden, mit durchschnittlich etwa 5,0×10¹⁰ T-Zellen. Alternativ können in einer anderen Ausführungsform von etwa 1,2×10¹⁰ bis etwa 4,3×10¹⁰ T-Zellen verabreicht werden.
In einer Ausführungsform können die für die ACT verwendeten autologen Zellen Lymphozyten, z. B. T-Zellen, sein. In einer Ausführungsform können die T-Zellen „junge“ T-Zellen sein, z. B. zwischen 19-35 Tagen alt, wie z. B. in US-Pat. Nr. 8.383.099 beschrieben, welches durch Verweis in die vorliegende Beschreibung in seiner Gesamtheit aufgenommen wurde. Es wird angenommen, dass junge T-Zellen längere Telomere haben als ältere T-Zellen, und eine längere Telomerlänge kann in einigen Fällen mit einem verbesserten klinischen Ergebnis nach der ACT verbunden sein.
In einem Aspekt können die vorliegend beschriebenen T-Zellen und Verfahren zur Herstellung von T-Zellen in Verbindung mit einer oder mehreren repräsentativen Strategien für die ACT verwendet werden: tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL), antigenexpandierte CD8+ und/oder CD4+ T-Zellen, T-Zellen, die genetisch verändert sind, um einen T-Zell-Rezeptor (TCR) zu exprimieren, der ein Tumorantigen spezifisch erkennt, und T-Zellen, die genetisch modifiziert sind, um einen chimären Antigenrezeptor (CAR) zu exprimieren. Eine kurze und nicht einschränkende Beschreibung jedes dieser Ansätze ist im Folgenden aufgeführt.
Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL)
Eine ACT-Strategie beinhaltet die Transplantation von autologen TILs, die ex vivo aus Tumorfragmenten oder enzymatischen Einzelzellenverdauungen von Tumormetastasen erweitert wurde. T-Zellinfiltrate in Tumoren sind polyklonal und erkennen gemeinsam mehrere Tumorantigene. Siehe zum Beispiel Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. (1988) 319:1676-1680, die in die vorliegende Beschreibung durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist.
In einem exemplarischen TIL ACT-Protokoll können Tumore von Patienten reseziert und unter sterilen Bedingungen in kleine (z. B. 3-5 mm²) Fragmente geschnitten werden. Die Fragmente können in Kulturplatten oder Flaschen mit Wachstumsmedium eingebracht und mit hochdosiertem IL-2 behandelt werden. Diese erste TIL-Erweiterungsphase (auch bekannt als „Pre-REP“-Phase) dauert in der Regel etwa 3 bis etwa 5 Wochen, wobei in dieser Zeit etwa 5×10⁷ oder mehr TILs produziert werden können. Die resultierenden TILs können dann weiter expandiert werden (z. B. nach einem Rapid Expansion Protocol (REP)), um TILs herzustellen, die sich für die Infusion in ein Subjekt eignen. Die Pre-REP TILs können für eine spätere Expansion kryokonserviert oder sofort expandiert werden. Pre-REP TILs können auch gescreent werden, um Kulturen mit hoher Anti-Tumor-Reaktivität vor der Expansion zu identifizieren. Ein typischer REP kann die Aktivierung von TILs mit einem T-Zell-stimulierenden Antikörper, z. B. einem Anti-CD3 mAb, in Gegenwart von bestrahlten PBMC-Feederzellen beinhalten. Die Futterzellen können vom Patienten oder von gesunden Spendern gewonnen werden. IL-2 kann der REP-Kultur in Konzentrationen von etwa 6.000 U/mL zugesetzt werden, um eine schnelle TIL-Zellteilung zu fördern. Die Expansion von TILs auf diese Weise kann etwa 2 Wochen oder länger dauern und führt zu einem Pool von etwa 10-150 Milliarden TILs. Die expandierten Zellen können gewaschen und gepoolt werden und können für die Infusion in einen Patienten geeignet sein. Die Patienten können typischerweise 1 oder 2 Infusionen (mit 1-2 Wochen dazwischen) von 10⁹ - 10¹¹ Zellen erhalten. Den Patienten wurde eine hochdosierte IL-2-Therapie (z. B. 7,2×10⁵ IE/kg alle 8 Stunden für etwa 2 bis etwa 3 Tage) verabreicht, um die TIL-Zellen nach der Infusion zu unterstützen. Siehe zum Beispiel Rosenberg et al., Nat. Rev. Cancer (2008) 8:299-308, der in die vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird. Vor der Infusion kann ein Patient optional mit Cyclophosphamid (Cy) und Fludaribin (Flu) lymphodepletiert werden. Siehe zum Beispiel Dudley et al., Science (2003) 298:850-854, das in die vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird. Um das Wiederauftreten endogener regulatorischer T-Zellen (Tregs) zu verhindern, wurde die Ganzkörperbestrahlung (TBI) mit Lymphodepletion verwendet, siehe z. B. Dudley et al., J. Clin. Oncol. (2008) 26(32):5233-5239, das in die vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird.
Die Infusion von minimal expandiertem TIL bei Patienten, die ein ACT-Schema erhalten, kann die Persistenz der übertragenen Zellen fördern, die Persistenz, Proliferation und das Überleben der übertragenen Zellen stimulieren und die Tumorregression verbessern.
Antigen-expandierte CD8+ und/oder CD4+ T Cells
Autologe mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) können in vitro mit einem Antigen stimuliert werden, um tumorantigenspezifische oder polyklonale CD8+ und/oder CD4+ T-Zellklone zu erzeugen, die für die ACT verwendet werden können. Siehe, zum Beispiel, Mackensen et al., J. Clin. Oncol. (2006) 24(31):5060-5069; Mitchell et al., J. Clin. Oncol. (2002) 20(4):1075-1086; Yee et al., Proc. Natl. Aad. Sci. USA (2002) 99(25):16168-16173; Hunder et al., N. Engl. J. Med. (2008) 358(25):2698-2703; Verdegaal et al., Cancer Immunol. Immunother. (2001) 60(7):953-963, deren Inhalt durch Verweis in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird. Um den zeit- und arbeitsintensiven Prozess der Expansion tumorspezifischer T-Zellen aus naiven PBMC-Populationen zu vermeiden, wurde kürzlich ein Ansatz beschrieben, bei dem antigenspezifische T-Zellen für die ACT durch Mehrfach-Stimulation von autologem PBMC mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen (aAPC), die HLA-A0201 exprimieren, kostimulatorischen Molekülen und membrangebundenen Zytokinen erzeugt werden können. Siehe, zum Beispiel, Suhoski et al., Mol. Ther. (2007) 15(5):981-988; Butler et al., Sei. Transl. Med. (2011) 3(80):80ra34, das in die vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird.
In einer Ausführungsform können T-Zellen durch Stimulation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) in vitro mit einem oder mehreren Antigenen (einschließlich antigener Abschnitte davon, wie Epitop(en) oder einer Zelle) des Krebses, die optional aus einem Vektor exprimiert werden können, in Gegenwart eines T-Zell-Wachstumsfaktors, wie 300 IU/ml IL-2 oder IL-15, wobei IL-2 bevorzugt wird, schnell expandiert werden können. Die in vitro induzierten T-Zellen können durch Re-Stimulation mit dem/den gleichen Antigen(en) des Krebses, der auf HLA-A2-exprimierende antigenpräsentierende Zellen gepulst wird, schnell erweitert werden. Alternativ können die T-Zellen mit bestrahlten, autologen Lymphozyten oder mit bestrahlten HLA-A2+ allogenen Lymphozyten und IL-2 beispielsweise re-stimuliert werden.
In einer Ausführungsform kann die Zellpopulation für CD8+ T-Zellen angereichert werden. Eine T-Zellkultur kann von CD4+ Zellen depletiert und für CD8+ Zellen angereichert, z. B. mit einer CD8 Microbead Trennung (z. B. mit einem Clini-MACSPplus CD8 Microbead System (Miltenyi BiotecTM), werden. Die Anreicherung für CD8+ T-Zellen kann das Ergebnis der ACT verbessern, indem sie CD4+ T-regulatorische Zellen entfernt.
Die Infusion von minimal expandierten T-Zellen, z. B. CD8+ und/oder CD4+ T-Zellen, die durch Stimulation von PBMCs erhalten wurden, mit Probanden, die ein ACT-Schema erhalten, kann die Persistenz der übertragenen Zellen fördern, die Persistenz, Proliferation und Überleben der übertragenen Zellen stimulieren und die Tumorregression verbessern.
Genetisch modifizierte T-Zellen zur Expression eines T-Zell-Rezeptors (TCR), der ein Tumorantigen spezifisch erkennt
In einigen Fällen ist es möglicherweise nicht möglich, TILs mit hoher Avidität für Tumorantigene in der für die ACT erforderlichen Menge zu erhalten. Dementsprechend kann es wünschenswert sein, Lymphozyten genetisch zu modifizieren, um eine Zellpopulation zu erhalten, die vor der Infusion in ein Subjekt ein Antigen von Interesse spezifisch erkennen kann. Gene, die TCRs kodieren, können aus T-Zellen isoliert werden, die Krebsantigene mit hoher Avidität spezifisch erkennen. Aus peripherem Blut isolierte T-Lymphozyten können mit einem Retrovirus oder einem Lentivirus transduziert werden, das Gene enthält, die für TCRs mit der gewünschten Spezifität kodieren. Dieses Verfahren kann eine schnelle Produktion einer großen Anzahl von tumorantigenspezifischen T-Zellen für die ACT ermöglichen.
T-Zellen können transduziert werden, um einen T-Zell-Rezeptor (TCR) mit antigener Spezifität für ein Krebsantigen zu exprimieren, wobei Transduktionstechniken verwendet werden, die in Heemskerk et al. Hum Gene Ther. 19:496-510 (2008) und Johnson et al. Blood 114:535-46 (2009) beschrieben sind. Der Inhalt dieser Referenzen wird hiermit durch Verweis vollständig übernommen. Die ACT mit T-Zellen, die genetisch verändert sind, um einen TCR zu exprimieren, der ein interessierendes Antigen erkennt, kann in Übereinstimmung mit dem von Morgan et al., Science (2006) 314(5796):126-129 veröffentlichten klinischen Studienprotokoll durchgeführt werden. Der Inhalt dieser Referenz wird hiermit durch Verweis vollständig übernommen.
Die Infusion von minimal expandierten T-Zellen, z. B. T-Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um einen TCR (oder modifiziertes TCR) zu exprimieren, der ein Tumorantigen erkennt, an Subjekten, die ein ACT-Schema erhalten, kann die Persistenz der übertragenen Zellen fördern, die Persistenz, Proliferation und Überleben der übertragenen Zellen stimulieren und die Tumorregression verbessern.
Genetisch modifizierte T-Zellen zur Expression eines chimären Antigenrezeptors (CAR)
Die gentechnische Modifikation von T-Zellen zur Expression eines TCR mit einer gewünschten Spezifität, wie vorstehend beschrieben, kann ein sehr vielversprechender Ansatz für die ACT sein. Ungeachtet dessen besteht das Potenzial für ein Mispairing der modifizierte TCR alpha- und beta-Ketten mit endogenen TCR-Ketten. Darüber hinaus hängt der Erfolg der ACT mit Zellen, die modifizierte TCR exprimieren, von der Expression des spezifischen MHC-Moleküls ab, das vom TCR in den Zielzellen vom Krebs erkannt wird. Um diese möglichen Komplikationen zu vermeiden, können T-Zellen alternativ so modifiziert werden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren.
In ihrer einfachsten Form können CARs eine Antigenbindungsdomäne enthalten, die mit der Transmembrandomäne und der Signaldomäne vom zytoplasmatischen Schwanz der CD3 ζ-Kette gekoppelt ist. Es gibt einige Hinweise darauf, dass die CD3 ζ-Kette möglicherweise nicht ausreicht, um transduzierte T-Zellen vollständig zu aktivieren. Dementsprechend können CARs vorzugsweise eine Antigen-Bindungsdomäne, eine kostimulatorische Domäne und eine CD3 ζ-Signaldomäne enthalten. Die Verwendung einer kostimulatorischen Domäne in Kombination mit der CD3 ζ-Signaldomäne imitiert das Zwei-Signal-Modell der T-Zell-Aktivierung. Die CAR-Antigen-Bindungsdomäne kann ein Antikörper oder ein Antikörperfragment sein, wie beispielsweise ein Fab oder ein scFv.
Die Antigenbindungsdomäne wird durch eine Transmembrandomäne von der CD3 ζ-Signaldomäne und der kostimulatorischen Domäne getrennt. Die Transmembrandomäne kann von jedem Transmembranprotein abgeleitet werden. In einer Ausführungsform kann eine Transmembrandomäne verwendet werden, die natürlich mit einer der Domänen im CAR verbunden ist. In einer weiteren Ausführungsform wird eine exogene oder synthetische Transmembrandomäne verwendet. In einigen Ausführungsformen kann die Transmembrandomäne durch Aminosäuresubstitution ausgewählt oder modifiziert werden, um Wechselwirkungen mit anderen Membranproteinen zu minimieren.
Zwischen der extrazellulären Domäne und der Transmembrandomäne des CAR oder zwischen der zytoplasmatischen Domäne und der Transmembrandomäne des CAR kann optional ein Spacer eingebaut werden. Der Spacer kann jedes Oligo- oder Polypeptid sein, das die Transmembrandomäne entweder mit der extrazellulären Domäne oder der zytoplasmatischen Domäne verbindet. Ein Spacer kann bis zu 300 Aminosäuren, vorzugsweise 10 bis 100 Aminosäuren und insbesondere 25 bis 50 Aminosäuren enthalten.
Die intrazelluläre Domäne eines CAR kann für die Aktivierung mindestens einer der normalen Effektorfunktionen der Immunzelle, in der das CAR exprimiert wird, verantwortlich sein. Effektorfunktionen können beispielsweise zytolytische Aktivität oder Helferaktivität, wie z. B. die Sekretion von Zytokinen, beinhalten. So kann sich die intrazelluläre Signaldomäne eines Moleküls auf den Teil eines Proteins beziehen, der das Effektorfunktionssignal umwandelt und die Zelle anweist, eine spezielle Funktion auszuführen. Während die gesamte intrazelluläre Signalisierungsdomäne verwendet werden kann, kann in vielen Fällen ein Teil der intrazellulären Domäne verwendet werden, sofern der ausgewählte Abschnitt das Effektorfunktionssignal transduziert. Die zytoplasmatische Domäne eines CAR kann die CD3 ζ-Signaldomäne allein oder in Kombination mit einer kostimulatorischen Domäne beinhalten. Die kostimulatorische Domäne enthält die intrazelluläre Domäne eines kostimulatorischen Moleküls. Kostimulatorische Moleküle können Zelloberflächenmoleküle sein, die eine effiziente Reaktion der Lymphozyten auf das Antigen fördern. In einigen Ausführungsformen kann die kostimulatorische Domäne eine intrazelluläre Domäne eines kostimulatorischen Moleküls, wie beispielsweise 4-1BB, CD27, CD28, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, Lymphozyten-funktionsassoziiertes Antigen-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, einen CD83-Liganden oder Kombinationen davon enthalten. In einer exemplarischen Ausführungsform kann das kostimulatorische Molekül die intrazelluläre Domäne von 4-1 BB oder CD28 sein.
Die Infusion von minimal expandierten T-Zellen, z. B. T-Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um ein CAR zu exprimieren, das ein Tumorantigen erkennt, an Subjekten, die ein ACT-Schema erhalten, kann die Persistenz der übertragenen Zellen fördern, die Persistenz, Proliferation und Überleben der übertragenen Zellen stimulieren und die Tumorregression verbessern.
Wie bereits erwähnt, kann die Behandlung von soliden Tumoren erfordern, dass T-Zellen CWID mehr als AICD aushalten. Herkömmliche Verfahren zur Bestimmung der Persistenz von hergestellten T-Zellen in einer an verwandten Antigenen mangelnden Umgebung des soliden Tumors hängen oft von Tiermodellen ab. Im Gegensatz dazu verwenden Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung in vitro-Assays als Surrogate, um T-Zell-Herstellungsbedingungen zu bestimmen, die die Persistenz von T-Zellen in vivo verbessern können. Zu diesem Zweck können hergestellte T-Zellen in Umgebungen mit nicht verwandten Antigenen oder mit wenig verwandten Antigen getestet werden. So können beispielsweise hergestellte T-Zellen in der Kultur mit geringer Dichte geimpft werden, z. B, von etwa 1.000 bis etwa 1×10⁶ Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 500.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 250.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 200.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 150.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 100.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 50.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 10.000 Zellen/cm² oder von etwa 1.000 bis etwa 5.000 Zellen/cm², in Abwesenheit von verwandten antigenpräsentierenden Zellen, d. h. verwandten antigenpräsentierenden Tumorzellen, dendritischen Zellen oder Makrophagen Um hergestellte T-Zellen in Umgebungen mit reduzierter Zytokinstimulation zu testen, können hergestellte T-Zellen in den Umgebungen mit nicht verwandtem Antigen oder wenig verwandten Antigen in Gegenwart niedriger Zytokin-Konzentrationen z. B von etwa 1 bis etwa 1.000 ng/ml, von etwa 1 bis etwa 500 ng/ml, von etwa 1 bis etwa 250 ng/ml, von etwa 1 bis etwa 100 ng/ml, von etwa 1 bis etwa 50 ng/ml, von etwa 5 bis etwa 50 ng/ml, von etwa 5 bis etwa 40 ng/ml, von etwa 5 bis etwa 30 ng/ml, von etwa 5 bis etwa 20 ng/ml, oder von etwa 5 bis etwa 10 ng/ml, für einen längeren Zeitraum, z.B, von etwa 1 bis etwa 30 Tagen, von etwa 2 bis etwa 25 Tagen, von etwa 3 bis etwa 21 Tagen, von etwa 3 bis etwa 14 Tagen, von etwa 3 bis etwa 10 Tagen oder von etwa 3 bis etwa 7 Tagen kultiviert werden.
BEISPIELE:
Beispiel 1
Durch die Apherese können T-Zellen von gesunden allogenen Spendern oder Patienten erhalten werden. Diese T-Zellen können mit aktivierendem Anti-CD3-Antikörper, z. B. OKT3, in Gegenwart von IL-2 oder mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichteten paramagnetischen Beads in Gegenwart von IL-2 oder mit einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle (aAPC), die 4-1BBL und einen Fc-Rezeptor mit OKT3 und IL-2 exprimiert, aktiviert oder stimuliert werden. Aktivierte T-Zellen können dann mit rekombinantem TCR über eine retro- oder lentivirale Plattform transduziert werden. Transduzierte T-Zellen können für verschiedene Zeiträume erweitert werden, z. B. 4 Tage (Tag 4), 7 Tage (Tag 7) oder 10 Tage (Tag 10), wobei die Aktivierung am Tag 0 beginnt. Da sich rekombinanter TCR in das T-Zell-Genom integrieren lässt, können alle bei der Expansion erzeugten Tochterzellen auch rekombinante TCR exprimieren. Expandierte/transduzierte T-Zellen können sofort verwendet oder für die zukünftige Verwendung kryokonserviert werden.
4 zeigt eine Ausführungsform eines vorliegend beschriebenen Zytokin-Empfindlichkeitstests. In 4 können kryokonservierte oder gefrorene expandierte TCR-transduzierte T-Zellen (z. B. für 4 Tage, 7 Tage oder 10 Tage) für 4 Stunden ohne Zytokin aufgetaut und ausgeruht werden, bevor sie in Zellkultur-Wells in begrenzter Anzahl, z.B. 2 × 10⁵ Zellen/Well, zugegeben werden. Proliferationsfarbstoff, z. B. PkH26-Färbung und entsprechende Zytokine (z.B. IL-2, IL-15, IL-7 oder eine Kombination davon) in unterschiedlichen Konzentrationen können hinzugefügt und für einen Zeitraum von beispielsweise 21 Tagen inkubiert werden. Frische Zytokine können den kultivierten T-Zellen alle 7 Tage, d. h. am Tag 0, Tag 7 und Tag 14, während des 21-tägigen Tests zugeführt werden. Gegen Ende jedes 7-tägigen Assays hätten die Kulturmedien den Zytokinspiegel im Vergleich zu dem zu Beginn des Assays reduziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten im Assay können expandierte modifizierte T-Zellen gesammelt und auf Zellmenge, Proliferation, Apoptose, z. B. über Annexin-V-Färbung, Gedächtnisphänotypen, z. B. CD45RO- und CCR7-Marker, und Zytokinrezeptorexpression, z. B. IL-2-Rezeptor (CD25), IL-7-Rezeptor (CD127) und IL-15-Rezeptor (CD122), analysiert werden.
BEISPIEL 2
Verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen zeigt einen persistenten Tscm-ähnlichen Phänotyp (erwünscht für die in vivo-Wirksamkeit) in einem 21-tägigen Assay
5A-5D zeigen Phänotypen von TCR-transduzierten T-Zellen, die von einem gesunden Spender erhalten und für (A) 0 Tage, (B) 4 Tage, (C) 7 Tage und (D) 10 Tage expandiert wurden. Expandierte T-Zellen wurden von Lymphozyten durch CD45RO-Färbung und anschließend durch CCR7-Färbung getrennt, um Tnaïve/Tscm (CD45RO-CCR7+) zu unterscheiden, z. B. 23,2% (Tag 4 expandierte T-Zellen), 16,4% (Tag 7 erweiterte T-Zellen) und 22,9% (Tag 10 expandierte T-Zellen). Im Vergleich zu Tag 0 (49,4%, ohne Expansion) zeigen Tag 4, Tag 7 und Tag 10 expandierte T-Zellen eine geringere Anzahl von Zellen mit Tscm-ähnlichem Phänotyp.
Um die Wirkung von Zytokin-Entzug auf TCR-tranduzierte T-Zellen zu untersuchen, wurden T-Zellen, die für 4 Tage, 7 Tage oder 10 Tage expandiert wurden, in Gegenwart von IL-15 für 21 Tage kultiviert. Frisches IL-15 (10 ng/ml) wurde den kultivierten T-Zellen alle 7 Tage, d. h. am Tag 0, Tag 7 und Tag 14, während des 21-tägigen Assays zugeführt. Der Tscm-ähnliche Phänotyp wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von CD45RO und CCR7 am Ende jeder 7-tägigen IL-15-Zufuhr untersucht, d. h. am Tag 7, Tag 14 und Tag 21, als die IL-15-Spiegel in der Kultur am niedrigsten waren.
6A-6I zeigen, dass expandierte T-Zellen am Tag 4 eine bessere IL-15-Empfindlichkeit aufweisen, indem sie die Tscm-ähnliche, d. h. Tnaive/Tscm, Zellpopulation während des 21-tägigen Assays beibehalten. Da Tscm-ähnliche Phänotypen mit der Persistenz von T-Zellen in vivo korrelieren, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass früher expandierte (z. B. etwa im Laufe von 4 Tagen) modifizierte T-Zellen besser sein können als solche, die über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. mehr oder gleich etwa 7 Tage.
BEISPIEL 3
Verkürzte in vitro Expansion von T-Zellen korreliert mit erhöhter Überlebensrate
Um die Auswirkungen vom Zytokin-Entzug auf die Proliferation oder das Überleben von expandierten T-Zellen zu bestimmen, wurde das Zellwachstum von expandierten TCR-transmittierten T-Zellen in Gegenwart von IL-2, IL-7 oder IL-15 über 21 Tage gemessen. 7A-7C zeigen, dass T-Zellen, die an Tag 4 expandiert wurden, ein höheres Zellwachstum oder mehr überlebende Zellen in Gegenwart von (A) IL-7, (B) IL-15 und (C) IL-2 über einen Zeitraum von 21 Tagen aufweisen, im Vergleich zu solchen, die über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. Tag 7 und Tag 10-Expansion. Die gepunktete Linie ist auf 1 gesetzt, um keinen Unterschied im Wachstumsausmaß im Verhältnis zur Ausgangszahl der Zellen anzuzeigen. Das Zellverhalten im Laufe der Zeit ist für früher expandierte TCR-tranduzierte T-Zellen besser als für solche, die bei höheren Konzentrationen von Zytokinen über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. IL-2 (300 U/ml) (8A), IL-7 (10,0 ng/ml) ( 8B) oder IL-15 (10,0 ng/ml) (8C). Am 21. Tag im Assay ist das integrierte Überleben auch für früher expandierte TCR (z. B. CD8Vb8+)-transduzierte T-Zellen besser als für solche, die bei höheren Konzentrationen von Zytokinen über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. IL-2 (300 U/ml) (8D), IL-7 (10,0 ng/ml) (8E) oder IL-15 (10,0 ng/ml) (8F). Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen beobachtet, z. B. IL-2 (30 U/ml) (9A), IL-7 (1,0 ng/ml) (9B) oder IL-15 (1,0 ng/ml) (9C). Zum Beispiel, am 21. Tag im Assay wurde das bessere Überleben der T-Zellen, die für 4 Tage expandiert wurden, im Vergleich zu den T-Zellen, die für längere Zeiträume expandiert wurden, z. B. 7 und 10 Tage der Expansion. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen mit einem erhöhten Überleben bei Zytokin-Entzug korreliert.
BEISPIEL 4
Verkürzte in vitro Expansion von T-Zellen korreliert mit verminderter Apoptose
Um die Wirkung von Zytokin-Entzug auf die Apoptose von expandierten T-Zellen zu bestimmen, wurde die Apoptose von expandierten T-Zellen in Gegenwart von IL-2, IL-7 oder IL-15 über 21 Tage gemessen. 10A-10C zeigen, dass T-Zellen, die für 4 Tage expandiert wurden, weniger apoptotische Zellen in Gegenwart von (A) IL-7 (10 ng/ml), (B) IL-15 (10 ng/ml) und (C) IL-2 (300 lU/ml) enthalten als solche, die für 7 und 10 Tage expandiert wurden. Die %-Apoptose der Lymphozyten wurde durch den Ausschluss von Rückständen und niedrigen FSC-Populationen gegated. 11A-11C zeigen am Tag 10 im Assay eine niedrigere integrierte Apoptose, wie es durch die Fläche unter der Kurve, von TCR-transduzierten T-Zellen, die nach etwa 4 Tagen expandiert wurden, bestimmt wurde.
12 zeigt, dass T-Zellen, die nach 4 Tagen expandiert wurden, am 10. Tag im Assay weniger (4,97%, Annexin-V+/PI-) (A) apoptotische Zellen enthalten als solche, die über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. (B) Tag 7 (10,6%, Annexin-V+/PI-) und (C) Tag 10 (18,2%, Annexin-V+/PI-), in Gegenwart von IL-15 (10 ng/ml). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen mit einer verminderten Apoptose bei Zytokin-Entzug korreliert.
BEISPIEL 5
Verkürzte in vitro-Expansion von T-Zellen korreliert mit erhöhter Zellteilung
Um die Wirkung von Zytokin auf die Zellteilung von expandierten T-Zellen zu bestimmen, wurde die Zellteilung von expandierten T-Zellen in Gegenwart von IL-2, IL-7 oder IL-15 gemessen. 13A-13C zeigen, dass früher expandierte, z. B. Tag 4, TCR-transduzierte T-Zellen im Vergleich zu den über einen längeren Zeitraum expandierten, z. B. Tag 7 und Tag 10 mehr teilende Zellen in Gegenwart von (A) IL-7 (10 ng/ml), (B) IL-15 (10 ng/ml) und (C) IL-2 (300 IU/ml) enthalten. Die Daten werden bis zu 10 Tage angezeigt, da an Tag 10 keine Zellen nach 10 Tagen im Assay vorhanden sind. Am 10. Tag im Assay wurden mehr teilende Zellen von früher expandierten TCR-transduzierten T-Zellen, z. B. am Tag 4 expandiert, als solche, die über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. am Tag 7 und Tag 10 expandiert, in Gegenwart höherer Konzentrationen von Zytokinen, z. B. IL-2 (300 U/ml) (14A), IL-7 (10,0 ng/ml) (14B) oder IL-15 (10,0 ng/ml) (14C).
BEISPIEL 6
Eine verkürzte in vitro-Expansion korreliert mit einer erhöhten Zytokinempfindlichkeit
Die Zytokinempfindlichkeit kann durch die durch Zytokine induzierte Zellteilungsniveaus bestimmt werden. Um die Zytokinempfindlichkeit von expandierten T-Zellen zu bestimmen, wurde die integrierte Zellteilung von expandierten T-Zellen, die durch IL-2, IL-7 oder IL-15 induziert wurden, unter nicht einschränkenden Zytokinbedingungen gemessen, z. B. 3 Tage im Assay. Die integrierte Zellteilung kann durch Durchführung einer Integration berechnet werden, indem die Fläche unter der Kurve der Zellteilung über 3 Tage im Assay berechnet wird. 15A-15C zeigen, dass früher expandierte, z. B. Tag 4, T-Zellen mehr teilende Zellen in Gegenwart von (A) IL-7 (10,0 ng/ml), (B) IL-15 (10,0 ng/ml) und (C) IL-2 (300 lU/ml) im Vergleich zu den über einen längeren Zeitraum expandierten, z. B. Tag 7 und Tag 10, enthalten. Diese Ergebnisse zeigen eine verkürzte in-vitro-Expansion von T-Zellen, die besser auf Zytokine reagieren als länger expandierte T-Zellen. Ebenso werden am 3. Tag im Assay mehr teilende Zellen von früher expandierten T-Zellen als solche, die bei höheren Konzentrationen von Zytokinen über einen längeren Zeitraum expandiert wurden, z. B. IL-2 (300 U/ml) (16A), IL-7 (10,0 ng/ml) (16B) oder IL-15 (10,0 ng/ml) (16C).
Die Zytokinempfindlichkeit kann auch durch die Expressionsniveaus von Zytokinrezeptoren bestimmt werden, die zelluläre Signalwege in Gegenwart von Zytokinen vermitteln. 16D zeigt beispielsweise am Tag 4 expandierte T-Zellen, die nach 3 Tagen im Assay mehr IL-2-Rezeptor (CD25) exprimieren als die über einen längeren Zeitraum expandierten, z. B. Tag 7 und Tag 10. 17A zeigt, dass diese erhöhte Expression des IL-2-Rezeptors (CD25), die gemessen wurde, bevor am Tag 4 expandierte TCR-transduzierte T-Zellen einem Assay unterzogen wurden, gut mit einem erhöhten IL-2-vermittelten Zellüberleben, z. B. R² = 0,89 und 0,82 korreliert. AUC bedeutet „Fläche unter der Kurve“. 17B zeigt, dass diese erhöhte Expression des IL-2-Rezeptors (CD25) auch gut mit einer erhöhten IL-2-vermittelten Zellteilung korreliert, z. B. R² = 0,81 und 0,69.
18A bzw. 18B zeigen jeweils, dass die Expression des IL-15-Rezeptors (CD122), die gemessen wurde, bevor am Tag 4 expandierte TCR-transduzierte T-Zellen einem Assay unterzogen wurden, moderat mit einem erhöhten IL-15-vermittelten Zellüberleben, z. B. R² = 0,67 und 0,42, und IL-15-vermittelter Zellteilung, z. B. R² = 0,55 und 0,67 korreliert.
19A bzw. 19B zeigen, dass die Expression des IL-7-Rezeptors (CD127), die gemessen wurde, bevor Tag 4 erweiterte TCR-transduzierte T-Zellen untersucht wurden, eine schlechte Korrelation mit einem erhöhten IL-7-vermittelten Zellüberleben, z. B. R² = 0,76 und 0,004, und IL-7-vermittelter Zellteilung, z. B. R² = 0,61 und 0,08, zeigen.
Die Ergebnisse dieser Assays zeigen, dass früher hergestellte (oder minimal expandierte) modifizierte T-Zellen, zum Beispiel etwa 3 bis etwa 5 Tage, eine bessere Leistung erbringen als länger expandierte Zellen, zum Beispiel etwa 7 bis etwa 10 Tage. Zum Beispiel, wie in 20 dargestellt, können minimal expandierte, zum Beispiel etwa 3 bis etwa 5 Tage, modifizierte T-Zellen eine höhere klinische Wirksamkeit aufweisen als die über längere Zeiträume expandierte, z. B. etwa 7 bis etwa 10 Tage, in vitro, aufgrund erhöhter Naivität, z. B. erhöhte Population von naiven T-Zellen (T_N) und/oder T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentralen Gedächtnis-T-Zellen (T_cm), eine erhöhte Fähigkeit zur Vermehrung und erhöhte Persistenz, z. B. durch Verringerung der durch CWID verursachten Apoptose, zeigen.
Zu den Vorteilen der vorliegenden Offenbarung können Zytokin-Sensitivitätstests gehören, die verwendet werden können, um zu bestimmen, welche Arten von in vitro hergestellten T-Zellen potenziell in vivo persistieren können, indem die Proliferation und das Überleben erhöht und die Apoptose der übertragenen Zellen in einer patientenspezifischen Weise mit hohem Durchsatz verringert wird, wodurch die Tumorregression verbessert und die Wirksamkeit der ACT erhöht wird.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 7993638 [0004]
US 2015/0017120 [0005]
US 2017/0087185 [0006]
US 6352694 [0078]
US 6534055 [0078]
US 6905680 [0078]
US 6692964 [0078]
US 5858358 [0078]
US 6887466 [0078]
US 6905681 [0078]
US 7144575 [0078]
US 7067318 [0078]
US 7172869 [0078]
US 7232566 [0078]
US 7175843 [0078]
US 5883223 [0078]
US 6905874 [0078]
US 6797514 [0078]
US 6867041 [0078]
US 8383099 [0081]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Dudley et al. Journal of Immunotherapy 2003; 26:332-42 [0078]
Rasmussen et al., Journal of Immunological Methods 2010; 355:52-60 [0078]
Somerville et al., Journal of Translational Medicine 2012 [0078]
Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. (1988) 319:1676-1680 [0083]
Dudley et al., Science (2003) 298:850-854 [0084]
Dudley et al., J. Clin. Oncol. (2008) 26(32):5233-5239 [0084]
Mackensen et al., J. Clin. Oncol. (2006) 24(31):5060-5069 [0086]
Mitchell et al., J. Clin. Oncol. (2002) 20(4):1075-1086 [0086]
Yee et al., Proc. Natl. Aad. Sci. USA (2002) 99(25):16168-16173 [0086]
Hunder et al., N. Engl. J. Med. (2008) 358(25):2698-2703 [0086]
Verdegaal et al., Cancer Immunol. Immunother. (2001) 60(7):953-963 [0086]
Suhoski et al., Mol. Ther. (2007) 15(5):981-988; Butler et al., Sei. Transl. Med. (2011) 3(80):80ra34 [0086]

Claims

Verfahren zur Herstellung von T-Zellen mit verbesserter Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie, umfassend Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum; Aktivieren der T-Zellen, Expandieren der aktivierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung, Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum, wobei die Wirksamkeit der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen zur adoptiven Immuntherapie im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, verbessert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die T-Zellen für etwa 4 Tage nach der Aktivierung expandiert werden und wobei die Wirksamkeit für die adoptive Immuntherapie der T-Zellen größer ist als die von aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die expandierten T-Zellen CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die expandierten T-Zellen einen naiven T-Zell (T_N) und/oder einen T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentralen Gedächtnis-T-Zellen (T_cm)-Phänotyp aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die T-Zellen durch einen Stimulator aktiviert werden, der Anti-CD3-Antikörper und einen Anti-CD28-Antikörper umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen in der adoptiven Immuntherapie bei einem Patienten, der eine Krebsbehandlung benötigt, verwendet werden, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die T-Zellen, die für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandiert wurden, eine erhöhte Proliferation und Überlebensrate im Vergleich zu aktivierten T-Zellen aufweisen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden.
Verfahren zum Erhöhen des Wachstums von T-Zellen, umfassend Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum; Aktivieren der T-Zellen, Expandieren der aktivierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung, Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum, wobei das Wachstum der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, größer ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die T-Zellen für etwa 4 Tage nach der Aktivierung expandiert werden und wobei das Wachstum der T-Zellen größer ist als das der aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, wobei die expandierten T-Zellen CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die T-Zellen durch einen Stimulator aktiviert werden, der Anti-CD3-Antikörper und einen Anti-CD28-Antikörper umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen in der adoptiven Immuntherapie bei einem Patienten, der eine Krebsbehandlung benötigt, verwendet werden, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus Leberzellkarzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartige Prostatavergrößerung (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronische lymphatische Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akute lymphatische Leukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) ausgewählt ist.
Verfahren zur Verringerung des Zelltods von T-Zellen zur Verwendung in der adoptiven Immuntherapie, umfassend Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum; Aktivieren der T-Zellen, Expandieren der aktivierten T-Zellen für ca. 3 Tage bis ca. 5 Tage nach der Aktivierung, Sammeln der expandierten T-Zellen zur Infusion in den mindestens einen gesunden Spender, Patienten oder Individuum, wobei der Zelltod der für etwa 3 bis etwa 5 Tage expandierten T-Zellen im Vergleich zu aktivierten T-Zellen, die für etwa 7 Tage oder mehr nach der Aktivierung expandiert wurden, reduziert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die expandierten T-Zellen CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, wobei die Anzahl der expandierten T-Zellen, die einen naiven T-Zell (T_N) und/oder einen T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentralen Gedächtnis-T-Zellen (T_cm) Phänotyp aufweisen, mehr ist als die der aktivierten T-Zellen, die mehr als etwa 7 Tage nach der Aktivierung expandiert wurden.
Verfahren zum Herstellen von T-Zellen umfassend Erhalten von T-Zellen von mindestens einem gesunden Spender, Patienten oder Individuum; Aktivieren der T-Zellen, Expandieren eines ersten Teiles der aktivierten T-Zellen über eine längere Zeitspanne, Kultivierung der expandierten T-Zellen in der Gegenwart von mindestens einem Zytokin, Messung einer Zytokinreaktion in den kultivierten T-Zellen, Identifizieren der Zeitspanne, die eine maximale Zytokinreaktion ergibt, und Expandieren eines zweiten Teils der aktivierten T-Zellen für die Zeitspanne, die eine maximale Zytokinreaktion ergibt.
Verfahren nach Anspruch 16, ferner umfassend das Einfrieren des expandierten ersten Teils der aktivierten T-Zellen vor der Kultivierung.
Verfahren nach Anspruch 17, ferner umfassend das Auftauen des gefrorenen expandierten ersten Teils der aktivierten T-Zellen vor der Kultivierung.
Verfahren nach Anspruch 18, ferner umfassend das Ruhen des aufgetauten expandierten ersten Teils der aktivierten T-Zellen vor der Kultivierung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die T-Zellen durch einen Stimulator aktiviert werden, der Anti-CD3-Antikörper und einen Anti-CD28-Antikörper umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 8, 13 und 16, ferner umfassend das Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor vor dem Expandieren, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen lentiviralen Vektor handelt, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der Zeitraum von etwa 1 Tag bis etwa 15 Tagen, von etwa 2 Tagen bis etwa 14 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 13 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 12 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 11 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 10 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 9 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 8 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 7 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 6 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 5 Tagen, von etwa 3 Tagen bis etwa 4 Tagen, von etwa 4 Tagen bis etwa 6 Tagen oder von etwa 4 Tagen bis etwa 5 Tagen nach der Aktivierung beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20 und 23, wobei das mindestens eine Zytokin aus der Gruppe bestehend aus Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 7 (IL-7), Interleukin 15 (IL-15) und einer Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Konzentration von IL-2 von etwa 10 U/ml bis etwa 500 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 450 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 400 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 350 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 300 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 250 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 200 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 150 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 100 U/ml, von etwa 10 U/ml bis etwa 50 U/ml, von etwa 20 U/ml bis etwa 40 U/ml, von etwa 25 U/ml bis etwa 35 U/ml oder von etwa 30 U/ml bis etwa 35 U/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Konzentration von IL-7 von 0,1 ng/ml bis 50 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 45 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 40 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 35 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 30 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 25 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 20 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 15 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 10 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 5 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 4 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 3 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 2 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 1 ng/ml oder von 0,1 ng/ml bis 0,5 ng/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Konzentration von IL-15 von 0,1 ng/ml bis 50 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 45 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 40 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 35 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 30 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 25 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 20 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 15 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 10 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 5 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 4 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 3 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 2 ng/ml, von 0,1 ng/ml bis 1 ng/ml oder von 0,1 ng/ml bis 0,5 ng/ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 27, wobei die Zytokinreaktion aus einem oder mehreren von erhöhter Proliferation, reduzierter Apoptose, erhöhter Population von naiven T-Zellen (T_N) und/oder T-Gedächtnisstammzellen (T_SCM)/zentraler Gedächtnis-T-Zellen (T_cm) und einer Kombination davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Ruhen innerhalb einer Zeitspanne von etwa 0,5 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 36 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 18 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 12 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 6 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 6 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden, etwa 2 bis etwa 24 Stunden, etwa 12 bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 120 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 108 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 96 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 84 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 0,5 Stunden bis etwa 60 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,6 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,3 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,4 µg/ml oder etwa 0,4 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 30, wobei die Aktivierung innerhalb einer Zeitspanne von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 31, wobei die erhaltene T-Zelle eine CD3⁺ CD8⁺ T-Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 32, umfassend das Sammeln des expandierten zweiten Teils der aktivierten T-Zellen zum Infundieren in mindestens einen Spender, Patienten oder ein Individuum.
Verwendung einer wirksamen Menge des gesammelten expandierten zweiten Teils der aktivierten T-Zellen nach einem der Ansprüche 16 bis 33 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Verwendung gemäß Anspruch 34, wobei die T-Zellen vom Patienten erhalten werden oder wobei die T-Zellen vom gesunden Spender erhalten werden.
Verwendung gemäß Anspruch 34, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus hepatozellulärem Karzinom (HCC), Darmkrebs (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Speiseröhrenkrebs, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartiger Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akuter myeloischer Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasenkrebs (UBC), akuter Lymphoblastenleukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC) ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den gesammelten expandierten zweiten Teil der aktivierten T-Zellen nach einem der Ansprüche 16 bis 33 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine T-Zellpopulation, erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 8 und 13.
Eine T-Zellpopulation, erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 33.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 33, wobei die Aktivierung in der Abwesenheit einer antigenpräsentierenden Zelle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Kultivieren das Aussäen der expandierten T-Zellen mit einer Dichte von etwa 1.000 bis etwa 200.000 Zellen/cm², von etwa 1.000 bis etwa 150.000 Zellen/cm² oder von etwa 1.000 bis etwa 100.000 Zellen/cm² umfasst.