DE102017115966A1

DE102017115966A1 - Polypeptide molecule with improved dual specificity

Info

Publication number: DE102017115966A1
Application number: DE102017115966.5A
Authority: DE
Inventors: Martin Hofmann; Felix Unverdorben; Sebastian Bunk; Dominik Maurer
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-01-17
Also published as: AR112228A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein bispezifisches Polypeptidmolekül, das eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette umfasst, welche eine Bindungsregion bereitstellen, die von einem T-Zell-Rezeptor (TCR) stammt, der für ein Peptidepitop, das an einen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) gebunden ist, spezifisch ist und auf eine Bindungsregion, die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Zellen bindet, sowie Verfahren zur Erzeugung des bispezifischen Polypeptidmoleküls und deren Verwendung.The present invention relates to a bispecific polypeptide molecule comprising a first polypeptide chain and a second polypeptide chain which provide a binding region derived from a T cell receptor (TCR) that is responsible for a peptide epitope attached to a major histocompatibility complex (MHC). is bound to a binding region derived from an antibody capable of recruiting human immune effector cells by binding specifically to a surface antigen of these cells, as well as methods for producing the bispecific polypeptide molecule and their use.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein bispezifisches Polypeptidmolekül, das eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette umfasst, welche eine Bindungsregion bereitstellen, die von einem T-Zell-Rezeptor (TCR) stammt, der für ein Peptidepitop, das an einen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) gebunden ist, spezifisch ist und auf eine Bindungsregion, die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Zellen bindet, sowie Verfahren zur Erzeugung des bispezifischen Polypeptidmoleküls und deren Verwendung.The present invention relates to a bispecific polypeptide molecule comprising a first polypeptide chain and a second polypeptide chain which provide a binding region derived from a T cell receptor ( TCR ) specific for a peptide epitope bound to a major histocompatibility complex (MHC), and to a binding region derived from an antibody capable of recruiting human immune effector cells by specifically targeting a surface antigen of those cells as well as methods for producing the bispecific polypeptide molecule and their use.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Durch die Entwicklung der molekularen Klontechnik und dem tiefgehenden Verständnis der Antikörperherstellung stehen verschiedene bispezifische Antikörperformate zur Verfügung, unter denen man wählen kann, um eine optimale biologische Wirkung zu erzielen und das medizinische Ziel zu erreichen. Bei der Krebstherapie wurden bispezifische Antikörper mit dem Ziel entwickelt, die Aktivität der Immuneffektorzellen durch eine erste Bindungsdomäne, die spezifisch für ein Epitop auf Tumorzellen ist und eine zweite Bindungsdomäne, die spezifisch für ein Epitop auf den Immuneffektorzellen ist, auf den Ort des Tumors neu auszurichten. Bispezifische Antikörper für das Retargeting von Immuneffektorzellen wurden in verschiedenen Formaten entwickelt, einschließlich Formaten ohne eine Fragment-kristallisierbare (Fc) Region und von IgG stammenden Formaten mit einem symmetrischen oder asymmetrischen Aufbau. Neben dem Retargeting von Effektorzellen zu dem Krebsort wurden neue Anwendungen für bispezifische Antikörper eingeführt. Bispezifische Moleküle, die zwei korrelierende Signalmoleküle zur selben Zeit inhibieren können, können entwickelt werden, um eine angeborene oder erworbene Resistenz zu überwinden und zu wirksameren Angiogenese-Inhibitoren zu werden. Darüber hinaus können bispezifische Antikörper als vielversprechende immunstimulierende Wirkstoffe zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie zum Beispiel Krebs verwendet werden. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um Hämophilie A durch die Nachahmung der Funktionsweise des Faktor VIII zu behandeln. Bispezifische Antikörper haben Aussichten auf eine breite Anwendung bei Knochenkrankheiten und Infektionen und Erkrankungen des zentralen Nervensystems (besprochen in Yang F. u. a. Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies. Int J Mol Sci. 28. Dezember 206; 18(1) ). T-Zellen exprimieren T-Zell-Rezeptor (TCR)-Komplexe, die in der Lage sind, antigenspezifische Immunreaktionen auszulösen. Das Eingreifen der Antigen-Peptid / Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I auf der Zielzelle mit dem TCR löst die Bildung einer immunologischen Synapse aus und führt zum Signalisieren durch CD3 Co-Rezeptoren, bei welchen es sich um Bestandteile des TCR- Signalkomplexes handelt. Diese Signalkaskade leitet das T-Zell-vermittelte Töten der Zelle ein, welche das Antigen durch das Freisetzen und das Übertragen von Granzymen und Perforin von der T-Zelle zur Zielzelle exprimiert.Through the development of molecular cloning technology and the in-depth understanding of antibody production, a variety of bispecific antibody formats are available, from which one can choose to achieve optimal biological effects and achieve the medical goal. In cancer therapy, bispecific antibodies have been developed with the aim of realigning the activity of immune effector cells by a first binding domain specific for an epitope on tumor cells and a second binding domain specific for an epitope on the immune effector cells to the tumor site , Bispecific antibodies for retargeting of immune effector cells have been developed in various formats, including formats without a fragment-crystallizable (Fc) region and IgG-derived formats with a symmetric or asymmetric structure. In addition to the re-targeting of effector cells to the cancer site, new applications for bispecific antibodies have been introduced. Bispecific molecules, which can inhibit two correlating signaling molecules at the same time, can be designed to overcome congenital or acquired resistance and become more potent angiogenesis inhibitors. In addition, bispecific antibodies can be used as promising immunostimulating agents for the treatment of various diseases such as cancer. Bispecific antibodies can also be used to treat hemophilia A by mimicking the mode of action of factor VIII. Bispecific antibodies have prospects of widespread use in bone diseases and central nervous system infections and disorders (discussed in US Pat Yang F. et al. Bispecific Antibodies as a Development Platform for New Concepts and Treatment Strategies. Int J Mol Sci. December 28, 206; 18 (1) ). T cells express T cell receptor (TCR) complexes that are capable of eliciting antigen-specific immune responses. The intervention of the antigen-peptide / major histocompatibility complex (MHC) class I on the target cell with the TCR triggers the formation of an immunological synapse and leads to signaling by CD3 co-receptors, which are components of the TCR signaling complex. This signaling cascade initiates T-cell mediated killing of the cell, which expresses the antigen by releasing and transferring granzymes and perforin from the T cell to the target cell.

Seit jeher diente die Entdeckung und Herstellung von variablen, einzelkettigverbundenen Antikörperdomänen (scFvs, beschrieben von Bird u. a. 1988) als ein Hauptantrieb für die Entwicklung von bispezifischen Antikörpern. Dieses Konzept führte schließlich zur Erzeugung von BiTE-Molekülen und deren klinischer Erprobung als wirksames Arzneimittel zur Behandlung von Leukämie (Baeuerle u. a. 2009). Im Falle einer Krebserkrankung lösen bispezifische Antikörper, welche die CD3-Epsilon-Untereinheit und ein Oberflächenantigen auf der Tumorzelle ineinander eingreifen lassen, das T-Zell-vermittelte Töten der Tumorzelle aus, während die Notwendigkeit des direkten Zusammenwirkens des TCR und der MHC Klasse I in einem Komplex mit einem Antigen umgangen wird. Dies erweitert das Repertoire an T-Zellen, die in der Lage sind, den Tumor zu erkennen und als Effektorzellen zu wirken ( Baeuerle, P.A.; Reinhardt, C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009, 69, 4941-4944 ).Historically, the discovery and production of variable, single-chain antibody domains (scFvs, described by Bird et al., 1988) has served as a major driver for the development of bispecific antibodies. This concept eventually led to the generation of BiTE molecules and their clinical testing as an effective drug for the treatment of leukemia (Baeuerle et al. 2009). In the case of cancer, bispecific antibodies that interfere with the CD3 epsilon subunit and a surface antigen on the tumor cell, resolve T cell-mediated killing of the tumor cell, while eliminating the need for direct interaction of the tumor cell TCR and the MHC class I is bypassed in a complex with an antigen. This extends the repertoire of T cells capable of recognizing the tumor and acting as effector cells ( Baeuerle, PA; Reinhardt, C. Bispecific T-cell participating antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009, 69, 4941-4944 ).

Stieglmaier J., u. a. (in: Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(8):1093-9 ) beschreiben, dass aktuell verschiedene Ansätze der T-Zell-basierten Krebsimmuntherapie untersucht werden, darunter sind BiTE® (bispecific T-cell engager) Antikörperkonstrukte, die eine einzigartige Struktur und einzigartige Wirkmechanismen aufweisen. Sie werden hergestellt, indem die minimal bindenden Domänen von monoklonalen Antikörpern für tumorassoziierte Oberflächenantigene und für das T-Zell-Rezeptor-assoziierte Molekül CD3 genetisch zu einer einzelnen Polypeptidkette verlinkt werden. Das gleichzeitige Eingreifen des Zielzellantigens und CD3 führt zur Aktivierung von polyklonalen zytotoxischen T-Zellen, welche zur Lyse der Zielzellen führt. Blinatumomab, ein CD19, welches BiTE adressiert, wird bezüglich einer großen Bandbreite von B-Zell-Malignitäten untersucht und wurde in den USA kürzlich von der US-amerikanischen FDA [Behörde für Lebens- und Arzneimittel] zur Behandlung der Philadelphia-Chromosom-positiven chronischen myeloischen Leukämie unter dem Handelsnamen BLINCYTO™ zugelassen. Die BiTE Plattform stellt eine der klinisch am besten untersuchten Möglichkeiten der T-Zell-Immuntherapie dar.Stieglmaier J., et al. (In: Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer. Expert Opin Biol Ther. 2015; 15 (8): 1093-9 ) describe that various approaches to T cell-based cancer immunotherapy are currently being explored, including BiTE® (bispecific T-cell engager) antibody constructs, which have a unique structure and unique mechanisms of action. They are prepared by genetically linking the minimal binding domains of monoclonal antibodies to tumor-associated surface antigens and the T-cell receptor-associated molecule CD3 into a single polypeptide chain. The simultaneous intervention of the target cell antigen and CD3 leads to the activation of polyclonal cytotoxic T cells, which leads to the lysis of the target cells. Blinatumomab, a CD19 targeting BiTE, is being investigated for a wide range of B-cell malignancies and has recently been reviewed in the US by the US Food and Drug Administration for the treatment of Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia under the trade name BLINCYTO ™. The BiTE platform represents one of the clinically best-studied options for T-cell immunotherapy.

Jedoch hat man herausgefunden, dass kleine, bispezifische Moleküle wie z.B. BiTEs den Nachteil aufweisen, dass sie nur geringe Produktionsausbeuten ergeben, komplizierte Aufreinigungsverfahren erfordern, zur Aggregation neigen und auch eine sehr kurze Serum-Halbwertszeit aufweisen. Um die inhärenten Beschränkungen dieser Klasse von Molekülen zu überwinden, wurden verschiedene bispezifische Formate auf der Grundlage von humanem IgG entwickelt, ausgehend von dem Konzept der rekombinanten bispezifischen Antikörper, die dem Prototyp Immunglobulin (Ig) G ähnlich sind, wie er vor mehr als zwei Jahrzehnten entwickelt wurde, als Morrison und Kollegen flexible Linker-Peptide mit den C-Termini der schweren Ketten von IgG fusionierten, gefolgt von einzelkettigen variablen Domänen mit verschiedenen Bindungsspezifitäten ( Coloma, M.J. und Morrison, S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159-163 ). Die Moleküle konnten von ,normalen‘ Antikörpern unterschieden werden, weil sie zwei verschiedene Funktionen aufwiesen. Technische Hürden behinderten ursprünglich die weitere Entwicklung und führten dazu, dass bispezifische Antikörper (bsAbs) vor allem in der akademischen und Biotechnologie-Umgebung ein Gegenstand der Forschung & Entwicklung blieben. Jedoch gaben die sich schnell weiterentwickelnden Technologien, welche die Erschaffung, Herstellung und Entwicklung von Derivaten von rekombinanten Proteinen ermöglichten, in Kombination mit einem erneut erwachten Interesse seitens der pharmazeutischen Industrie dem Gebiet der Erforschung von bsAb gewaltigen Auftrieb. Heute sind viele verschiedene bsAb Formate, die für die Entwicklung von therapeutischen Proteinen geeignet sind, verfügbar (zwecks Überprüfung siehe Gramer 2007, Weidle 2013, Brinkmann 2017). Zusammengefasst führte die Einbeziehung von Fc-(Fragment-kristallisierbaren) Teilen, die aus CH2- und CH3-Domänen bestehen, zu einer erhöhten Produktivität, vereinfachten Aufreinigungsprozessen und einer verbesserten Stabilität. Darüber hinaus wurde die Serumhalbwertszeit dieser auf IgG basierenden Arzneimittel aufgrund von i) der Größenzunahme und ii) der Interaktion des Fc-Teils mit humanem Fc-Rezeptor FcRn verlängert. However, it has been found that small, bispecific molecules such as BiTEs have the disadvantage that they give only low production yields, require complicated purification procedures, tend to aggregate and also have a very short serum half-life. To overcome the inherent limitations of this class of molecules, various bispecific formats based on human IgG have been developed, starting from the concept of recombinant bispecific antibodies similar to the prototype immunoglobulin (Ig) G as it was more than two decades ago when Morrison and colleagues fused flexible linker peptides to the IgG heavy chain C-termini followed by single-chain variable domains with different binding specificities ( Coloma, MJ and Morrison, SL (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat. Biotechnol. 15, 159-163 ). The molecules could be differentiated from 'normal' antibodies because they had two different functions. Technical hurdles initially hampered further development and led to biospecific antibodies (bsAbs) remaining a focus of research & development, particularly in the academic and biotechnology environment. However, the rapidly evolving technologies that enabled the creation, production and development of derivatives of recombinant proteins, in combination with a reawakened interest from the pharmaceutical industry, gave a tremendous boost to the field of bsAb research. Today, many different bsAb formats that are suitable for the development of therapeutic proteins are available (for review see Gramer 2007, Weidle 2013, Brinkmann 2017). In summary, incorporation of Fc (fragment crystallizable) parts out CH2 and CH3 domains, for increased productivity, simplified purification processes, and improved stability. In addition, the serum half-life of these IgG-based drugs was prolonged due to i) the increase in size and ii) the interaction of the Fc portion with the human Fc receptor FcRn.

Die Entwicklung von auf IgG basierenden bispezifischen Formaten wurde weiterhin durch das Erscheinen und die Einbeziehung von erzeugten Mutationen gefördert, um die Heterodimerisierung von zwei unterschiedlichen CH3-Domänen zu erleichtern und dadurch zwei unterschiedliche Polypeptidketten zu verbinden. Das grundlegende Konzept wurde durch Ridgway JB u. a. (in: ,Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization Protein Eng. 1996 Jul; 9(7):617-21 ) eingeführt, der den ,Knobs-into-holes'-Ansatz als eine neue und wirksame Herstellungsstrategie für die Erzeugung von aus schweren Ketten bestehenden Antikörper-Homodimeren für die Heterodimerisierung offenbarte. In diesem Ansatz erhielt man zuerst eine ‚Knob‘-Variante, indem man in der CH3-Domäne eines CD4-IgG-Immunadhäsins eine kleine Aminosäure durch eine größere ersetzt: T366Y. Der ,Knob‘ ist dafür ausgelegt, in das ,Hole‘ in der CH3-Domäne eines humanisierten Anti-CD3-Antikörpers eingeführt zu werden, der durch das zweckdienliche Ersetzen eines großen Rests mit einem kleineren erzeugt wurde: Y407T. Das Anti-CD3/CD4-IgG-Hybrid stellt bis zu 92% des von Protein A gereinigten Proteinpools dar, nachdem diese zwei verschiedenen schweren Ketten zusammen mit der Anti-CD3 leichten Kette exprimiert wurden. Dagegen werden nach der gemeinsamen Expression, bei welcher schwere Ketten CH3-Domänen des Wildtyps enthielten, nur bis zu 57% des Anti-CD3/CD4-IgG-Hybrids zurückgewonnen. Daher erleichtert die Herstellung mittels der ,Knobs-into-holes'-Technologie die Erschaffung eines Antikörper / Immunadhäsin-Hybrids und wahrscheinlich anderer Fc-enthaltender bifunktionaler Therapeutika, einschließlich bispezifischem Immunadhäsin und bispezifischen Antikörpern. Atwell u. a., 1997, J Mol Biol (Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library) offenbart eine ,Knob-into-hole‘-Mutation (Knob: T366W/hole: T366S+L368A+Y407V) in der CH3-Domäne der Fc-Domäne für eine verbesserte Heterodimerisierung. Dieses Konzept wurde durch die zusätzliche Einführung von Cystein-Resten weiter verbessert, um eine stabilisierende Disulfidbindung zwischen den heterodimeren CH3-Domänen zu bilden, wie von Merchant u. a. 1998, Nature Biotechnology (An Efficient Route to Human Bispecific IgG) beschrieben.The development of IgG-based bispecific formats was further promoted by the appearance and inclusion of generated mutations to facilitate heterodimerization of two distinct CH3 domains, thereby joining two distinct polypeptide chains. The basic concept was developed by Ridgway JB et al. (In: 'Knobs-into-holes' engineering of CH3 domains for heavy chain heterodimerization Protein Eng. 1996 Jul; 9 (7): 617-21 ), which disclosed the 'knobs-into-holes' approach as a new and effective manufacturing strategy for the generation of heavy chain antibody homodimers for heterodimerization. In this approach, a 'Knob' variant was first obtained by replacing a small amino acid in the CH3 domain of a CD4-IgG immunoadhesin with a larger one: T366Y. The 'Knob' is designed to be introduced into the 'hole' in the CH3 domain of a humanized anti-CD3 antibody generated by the expedient replacement of a large residue with a smaller one: Y407T. The anti-CD3 / CD4-IgG hybrid represents up to 92% of protein A purified protein pool after expressing these two different heavy chains together with the anti-CD3 light chain. In contrast, after co-expression, in which heavy chains contained wild-type CH3 domains, only up to 57% of the anti-CD3 / CD4-IgG hybrid was recovered. Thus, production by the 'knob-into-holes' technology facilitates the creation of an antibody / immunoadhesin hybrid and probably other Fc-containing bifunctional therapeutics, including bispecific immunoadhesin and bispecific antibodies. Atwell et al., 1997, J Mol Biol (Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library) discloses a 'knob-in-hole' mutation (Knob: T366W / hole: T366S + L368A + Y407V) in the CH3 domain of the Fc domain for improved heterodimerization. This concept was further enhanced by the additional introduction of cysteine residues to form a stabilizing disulfide bond between the heterodimeric CH3 domains as described by Merchant et al. 1998, Nature Biotechnology (An Efficient Route to Human Bispecific IgG).

Weitere Konzepte für das Herstellen von heterodimären Molekülen wurden von Muda u. a. 2011 offenbart, PEDS (Therapeutic assessment of SEED: a new engineered antibody platform designed to generate mono- and bispecific antibodies.); Gunasekaran u. a. 2010, J Biol Chem (Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG.); Moore u. a. 2011, MAbs (A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens.); Von Kreudenstein u. a. 2013, MAbs (Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design.) Diese Konzepte werden von Ha u. a. 2016, Front Immunol (Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Application in Therapeutic Antibodies and Proteins) und Liu u. a. 2017, Front Immunol (Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel scaffolds) zusammengefasst und überprüft.Other concepts for producing heterodimeric molecules have been described by Muda et al. a. 2011 discloses PEDS (Therapeutic assessment of SEED: a new engineered antibody platform designed to generate mono- and bispecific antibodies.); Gunasekaran u. a. 2010, J Biol Chem (Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific and monovalent IgG.); Moore u. a. 2011, MAbs (A novel bispecific antibody format enabling simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens.); From Kreudenstein u. a. 2013, MAbs (Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design.) These concepts are used by Ha u. a. 2016, Front Immunol (Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Application in Therapeutic Antibodies and Proteins) and Liu et al. a. 2017, Front Immunol (Fc Engineering for Developing Therapeutic Bispecific Antibodies and Novel scaffolds) reviewed and reviewed.

Mit der Einbeziehung von Fc-Teilen, die aus Gelenken [Hinges], CH2- und CH3-Domänen oder Teilen davon bestehen, in bispezifische Moleküle, trat das Problem der unspezifischen Immobilisierung dieser Moleküle auf, hervorgerufen durch Fc:Fc-Gamma-Rezeptor (FcgR)- Interaktionen. FcgRs bestehen aus verschiedenen Zelloberflächenmolekülen (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIb, FcgRIII), welche mit unterschiedlichen Affinitäten an Epitope binden, die durch Fc-Teile von IgG-Molekülen getragen werden. Da diese unspezifische (d. h. eine nicht durch eine der zwei bindenden Domänen eines bispezifischen Moleküls ausgelöste) Immobilisierung aus folgenden Gründen unvorteilhaft ist: i) ihrer Auswirkung auf die pharmakokinetischen Eigenschaften eines Moleküls und ii) der „Off-Target“-Aktivierung von Immuneffektorzellen, wurden verschiedenen Fc-Varianten und Mutationen entdeckt, um eine FcgR-Bindung aufzulösen.With the inclusion of Fc parts made of joints [Hinges], CH2 and CH3 Domains or parts thereof exist in bispecific molecules, the problem of nonspecific immobilization of these occurred Molecules elicited by Fc: Fc-gamma receptor ( FcgR ) - interactions. FcgRs consist of different cell surface molecules ( FcgRI . FcgRIIa . FcgRIIb . FcgRIII ) which bind with different affinities to epitopes carried by Fc portions of IgG molecules. Because this nonspecific immobilization (ie one not triggered by one of the two binding domains of a bispecific molecule) is unfavorable for the following reasons: i) its effect on the pharmacokinetic properties of a molecule and ii) the off-target activation of immune effector cells various Fc variants and mutations discovered to be one FcgR Bond dissolve.

Morgan u. a. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcyRI and FcyRIII binding) offenbart den Austausch der Reste 233-236 von humanem IgG1 mit der entsprechenden Sequenz, die von humanem IgG2 stammt, was zu einer aufgelösten FcgRI-Bindung, aufgelösten C1q-Bindung und einer verminderten FcgRIII-Bindung führt.Morgan et al. 1995, Immunology (The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q . FcyRI and FcyRIII binding) reveals the replacement of the radicals 233 - 236 of human IgG1 with the corresponding sequence, that of human IgG2 stems, resulting in a dissolved FcgRI Bond, resolved C1q Bond and a diminished FcgRIII Binding leads.

EP1075496 offenbart Antikörper und andere Fc-enthaltende Moleküle, die Variationen in der Fc-Region aufweisen (233P, 234V, 235A und keinen Rest oder G an der Position 236 und 327G, 330S und 331S), wobei der rekombinante Antikörper in der Lage ist, das Zielmolekül zu binden, ohne eine signifikant komplementabhängige Lyse oder die zellvermittelte Zerstörung des Ziels auszulösen. EP1075496 discloses antibodies and other Fc-containing molecules that exhibit variations in the Fc region ( 233P . 234V . 235A and no rest or G at the position 236 and 327g . 330S and 331S ), wherein the recombinant antibody is capable of binding the target molecule without causing significant complement dependent lysis or cell mediated destruction of the target.

Dual Affinity Retargeting (DART) Moleküle werden verwendet, um zum Beispiel eine Zerstörung von B-Zell-Lymphomen durch optimal umgelenkte T-Zellen zu erreichen. Dual Affinity Retargeting (DART) molecules are used, for example, to target the destruction of B cell lymphomas by optimally inverted T cells.

Die originale DART-Technologie ist in Moore u. a. beschrieben (in: Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma, Blood. 28. Apr. 2011; 117(17):4542-51 ). Der Vergleich mit einer einzelkettigen, bispezifischen, antikörpertragenden, identischen CD19- und CD3-Antikörper Fv-Sequenz zeigte, dass DART-Moleküle bei der Steuerung der B-Zell-Lyse wirksamer sind. Die Weiterentwicklung der DART-Technologie wurde durch die DART-Fc-Moleküle erreicht, wie in Root u. a. 2016 antibodies (Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer) beschrieben. Neben anderen positiven Eigenschaften kombinierte dieses Molekül die hohe Wirksamkeit des DARTs mit der verlängerten Serumhalbwertszeit von auf Fc basierenden Molekülen.The original DART technology is described in Moore et al. (In: Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimally redirected T-cell killing of B-cell lymphoma, Blood. Apr. 28, 2011; 117 (17): 4542-51 ). Comparison with a single chain, bispecific, antibody-bearing, identical CD19 and CD3 Antibody Fv sequence showed that DART molecules are more effective in controlling B cell lysis. The further development of DART technology was achieved by the DART-Fc molecules as described in Root et al. 2016 antibodies (Development of PF- 06671008 , a Highly Potent Anti-P-cadherin / Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer). Among other positive features, this molecule combined the high efficacy of the DART with the extended serum half-life of Fc based molecules.

Das aßTCR (TCR) erkennt antigene Peptide, die von MHC präsentiert werden und ist für die Spezifität der T-Zellen verantwortlich. Sowohl α- als auch β-Ketten des TCR besitzen variable (V) und konstante Domänen. Die V-Domänen sind an der Bindung der antigenen Peptide beteiligt und die konstanten Domänen erstrecken sich durch die Membranen der T-Zellen. Bei der Kristallstrukturanalyse von einem an den Peptid-MHC-Komplex gebundenen TCR, interagieren Complementarity Determining Regions (CDR) 3 von sowohl den V_α - als auch den V_β-Ketten bevorzugt mit Peptiden, während CDRs 1 und 2 mit dem MHC interagieren. Jedoch wurde das Erkennen der Peptide durch CDR 1 und das Erkennen des MHC durch CDR 3 ebenfalls beschrieben ( Piepenbrink u. a., The basis for limited specificity and MHC restriction in a T cell receptor interface, Nat Commun, 2013; 4, 1948 ). Das TCR aß Heterodimer ist eng mit CDR3-Proteinen, CD4 oder CD8 und anderen Adhäsions- und signalübertragenden Proteinen assoziiert. Das Binden von antigenen Peptiden durch die TCR V Regionen löst die T-Zell-Aktivierung durch Signalübertragung durch die konstanten TCR-Domänen über CD3 und CD4 oder CD8 zytoplasmatische Proteine aus.The aßTCR ( TCR ) recognizes antigenic peptides presented by MHC and is responsible for the specificity of T cells. Both α- and β-chains of TCR have variable (V) and constant domains. The V domains are involved in the binding of the antigenic peptides and the constant domains extend through the membranes of the T cells. In the crystal structure analysis of a bound to the peptide-MHC complex TCR , interacting Complementarity Determining Regions (CDR) 3 from both the V _α - as well as the V _β chains preferably with peptides, while CDRs 1 and 2 interact with the MHC. However, the recognition of the peptides by CDR 1 and recognizing the MHC by CDR 3 also described ( Piepenbrink et al., The basis for limited specificity and MHC restriction in a T cell receptor interface, Nat Commun, 2013; 4, 1948 ). The TCR ate heterodimer is tight with CDR3 proteins, CD4 or CD8 and other adhesion and signal transduction proteins. The binding of antigenic peptides by the TCR V regions triggers T cell activation by signaling through the constant TCR Domains over CD3 and CD4 or CD8 cytoplasmic proteins.

Im Unterschied zu dem full-length TCR Format bringen einzelkettige TCRs (scTCRs) erhebliche Vorteile in Bezug auf die Erschaffung, die Expression von löslichen Proteinen und die medizinischen Möglichkeiten mit sich. Aus der Perspektive der Expression von löslichen Proteinen (d. h. die Herstellung) werden TCRs als ein einzelnes Polypeptid hergestellt, wobei vermieden wird, jede TCR-Kette als separates Polypeptid herstellen zu müssen und wobei ermöglicht wird, größere Mengen des ordnungsgemäß zusammengesetzten scTCR, der an seinen Peptid-MHC-Liganden bindet, herzustellen. Dieses Merkmal kann es ermöglichen, Herstellungsausbeuten zu erzielen, die für die medizinische Nutzung notwendig sind. Aus medizinischer Sicht können schließlich scTCRs, die nur aus den V-Regionen (scTv) bestehen, als Therapeutika oder Diagnosewirkstoffe ähnlich wie scFv-Fragmente gestaltet werden.Unlike the full-length TCR Format bring single-chain TCRs ( scTCRs ) have considerable advantages in terms of the creation, the expression of soluble proteins and the medical possibilities. From the perspective of the expression of soluble proteins (ie the preparation) are TCRs prepared as a single polypeptide, avoiding each TCR Chain as a separate polypeptide and to allow larger amounts of properly assembled scTCR which binds to its peptide-MHC ligand. This feature may allow to achieve manufacturing yields necessary for medical use. From a medical point of view, finally scTCRs only from the V regions ( SCTV ), as therapeutics or diagnostic agents similar to scFv fragments.

US2006-0166875 offenbart einen einzelkettigen T-Zell-Rezeptor (scTCR), der ein Segment umfasst, das durch eine Sequenz der variablen Region der TCR-Alpha-Kette gebildet wird, die mit dem N-Terminus einer extrazellulären Sequenz der konstanten Region der TCR-Alpha-Kette fusioniert, ein Beta-Segment, das aus einer variablen Region der TCR-Beta-Kette, die mit dem N-Terminus einer extrazellulären Sequenz der konstanten Region einer TCR-Beta-Kette fusioniert ist, besteht und eine Linker-Sequenz, die den C-Terminus des Segments mit dem N-Terminus des Beta-Segments oder umgekehrt verlinkt, wobei die extrazellulären Sequenzen der Alpha- und Beta-Segmente der konstanten Region durch eine Disulfidbindung verlinkt sind, die Länge der Linker-Sequenz und die Position der Disulfid-Bindung so gestaltet sind, dass die Sequenzen der variablen Region der Alpha- und Beta-Segmente im Wesentlichen wie bei nativen alpha / beta T-Zell-Rezeptoren gemeinsam ausgerichtet sind. Komplexe von zwei oder mehreren scTCRs und die Verwendung der scTCRs bei der Therapie und bei verschiedenen Untersuchungsanwendungen werden auch offenbart. Im Gegensatz zu dem in der US 2006-0166875 beschriebenen scTCR, offenbart die US 2012-0252742 einen löslichen, humanen, einzelkettigen TCR ohne konstante Domänen, der nur aus den variablen Fragmenten des TCR (scTv) besteht, der für viele Zwecke nützlich ist, einschließlich der Behandlung von Krebs, Viruserkrankungen und Autoimmunerkrankungen. US2006-0166875 discloses a single-chain T cell receptor ( scTCR ) comprising a segment formed by a sequence of the TCR alpha chain variable region fused to the N-terminus of a TCR alpha chain constant region extracellular sequence, a beta segment consisting of a TCR beta chain variable region fused to the N-terminus of a TCR beta chain constant region extracellular sequence, and a linker sequence comprising the C terminus of the N-terminus segment the beta segment or vice versa linked to the extracellular Sequences of the alpha and beta segments of the constant region are linked by a disulfide bond, the length of the linker sequence and the position of the disulfide bond are designed so that the sequences of the variable region of the alpha and beta segments substantially as in native alpha / beta T cell receptors are aligned together. Complexes of two or more scTCRs and the use of scTCRs in therapy and in various examination applications are also disclosed. In contrast to that in the US 2006-0166875 described scTCR , discloses the US 2012-0252742 a soluble, human, single chain TCR without constant domains consisting only of the variable fragments of the TCR ( SCTV ), which is useful for many purposes, including the treatment of cancer, viral diseases and autoimmune diseases.

McCormack E, u. a. (in: Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NYESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunol Immunother. Apr 2013; 62(4):773-85 ) offenbaren, dass NY-ESO-1 und LAGE-1 Cancer-Testis-Antigene mit einem idealen Profil für die Tumor-Immuntherapie sind und die Hochregulierung in vielen Krebsarten mit der hochgradig beschränkten Expression in normalen Geweben verbinden und ein gemeinsames HLA-A*0201 Epitop, 157-165, teilen. Sie präsentieren Daten, um die Spezifität und Anti-Tumor-Aktivität eines bifunktionalen ImmTAC zu beschreiben, welches einen löslichen, hoch-affinen T-Zell-Rezeptor (TCR) umfasst, der für ein mit einem anti-CD3 scFv fusionierten NY-ESO-1157-165 spezifisch ist. Es wurde gezeigt, dass dieses Reagenz, Imm TAC-NYE, HLA-A2, antigen-positive Tumorzelllinien und frisch isolierte HLA-A2- und LAGE-1-positive NSCLC-Zellen abtötet. Die Ergebnisse der in vivo optischen Abbildung zeigen das in vivo Ausrichten von fluoreszenzmarkierten hoch-affinen NYESO-spezifischen TCRs auf HLA-A2-, NYESO-1157-165-positive Tumoren in xenotransplantierten Mäusen. Die in vivo ImmTAC-NYE-Wirksamkeit wurde in einem Tumormodell getestet, in welchem humane Lymphozyten stabil in immundefiziente NSG-Mäuse implantiert wurden, die bereits Tumor-Xenotransplantate enthielten, dabei wurde unter Verwendung eines Lesesystems für GFP-Fluoreszenz eine Wirkung sowohl bei der Tumorprävention als auch bei etablierten Tumormodellen beobachtet. Die quantitative RT-PCR wurde verwendet, um die Expression sowohl von NY-ESO-1 und LAGE-1 Antigenen in 15 normalen Geweben, 5 Krebszelllinien, 10 NSCLCs und 10 Eierstockkrebsproben zu untersuchen. Insgesamt wurde LAGE-1 RNA in den Tumorproben mit einer größeren Häufigkeit und in größeren Mengen exprimiert als NY-ESO-1. ImmTACs umfassen eine einzelkettige Fv, die von Anti-CD3 Antikörper UCHT-1, das kovalent mit dem C- oder N-Terminus der Alpha- oder Beta-Kette des TCR verlinkt ist, stammt.McCormack E, et al. (In: Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NYESO-1 and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunol Immunother. Apr 2013; 62 (4): 773-85 ) disclose that NY-ESO-1 and LAGE-1 are cancer testis antigens with an ideal profile for tumor immunotherapy and associate the upregulation in many cancers with the highly restricted expression in normal tissues and a common HLA-A * 0201 epitope, 157-165, share. They present data to describe the specificity and antitumor activity of a bifunctional ImmTAC which is a soluble, high affinity T cell receptor ( TCR ) specific for a NY-ESO-1157-165 fused to an anti-CD3 scFv. This reagent has been shown to kill Imm TAC-NYE, HLA-A2, antigen-positive tumor cell lines and freshly isolated HLA-A2 and LAGE-1 positive NSCLC cells. The in vivo optical imaging results demonstrate the in vivo alignment of fluorescently labeled high affinity NYESO-specific TCRs on HLA-A2, NYESO-1157-165-positive tumors in xenografted mice. In vivo ImmTAC-NYE activity was tested in a tumor model in which human lymphocytes were stably implanted into immunodeficient NSG mice already containing tumor xenografts, thereby having an effect in both tumor prevention using a GFP fluorescence reading system as well as in established tumor models. Quantitative RT-PCR was used to assess expression of both NY-ESO-1 and LAGE-1 antigens 15 normal tissues, 5 To examine cancer cell lines, 10 NSCLCs and 10 ovarian cancer samples. Overall, LAGE-1 RNA was expressed in the tumor samples at a higher frequency and in greater amounts than NY-ESO-1. ImmTACs include a single-chain Fv derived from anti-CD3 antibody UCHT-1, which is covalently linked to the C- or N-terminus of the alpha or beta chain of the TCR linked, stems.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte bispezifische Moleküle bereitzustellen, die in der Lage sind, sich auf Peptid-MHC-Komplexe auszurichten, die einfach hergestellt werden können, eine hohe Stabilität zeigen und darüber hinaus eine hohe Wirksamkeit entfalten, wenn sie sich an die jeweiligen Antigenepitope binden. Andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden offensichtlich, wenn man die folgende Beschreibung und deren bevorzugte Ausführungsformen sowie die jeweiligen Beispiele untersucht.It is an object of the present invention to provide improved bispecific molecules capable of targeting peptide-MHC complexes which are easily prepared, show high stability, and moreover exhibit high activity when attached bind the respective antigen epitopes. Other objects and advantages of the present invention will become apparent upon examining the following description and preferred embodiments thereof as well as the respective examples.

Unter einem ersten Aspekt der Erfindung wird die oben aufgeführte Aufgabe dadurch gelöst, dass ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität bereitgestellt wird, das eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette umfasst, wobei: die erste Polypeptidkette eine erste Bindungsregion einer variablen Domäne (VD1) umfasst, die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächen-Antigen dieser Zellen bindet, und eine erste Bindungsregion einer variablen Domäne (VR1), die von einem TCR stammt, der für ein MHC-assoziiertes Peptidepitop spezifisch ist, und einen ersten Linker-Abschnitt (LINK1), der die beiden Domänen verbindet, wobei die zweite Polypeptidkette eine zweite Bindungsregion einer variablen Domäne (VR2) umfasst, die von einem TCR stammt, der spezifisch für ein MHC-assoziiertes Peptidepitop ist, und eine zweite Bindungsregion einer variablen Domäne (VD2), die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Zellen bindet, und ein zweiter Linker-Abschnitt (LINK2), der die beiden Domänen verbindet, wobei diese erste Bindungsregion (VD1) und diese zweite Bindungsregion (VD2) assoziieren, um eine erste Bindungsstelle (VD1) (VD2) zu bilden, welche die Epitope auf dem Zelloberflächenmolekül bindet, wobei diese erste Bindungsregion (VR1) und diese zweite Bindungsregion (VR2) assoziieren, um eine zweite Bindungsstelle (VR1) (VR2) zu bilden, dass dieses MHC-assoziierte Peptidepitop bindet, wobei mindestens eine dieser Polypeptidketten an ihrem C-Terminus mit Gelenkregionen verbunden ist, CH2- und / oder CH3-Domänen oder Teilen davon, die von humanem IgG stammen und wobei dieses Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität in der Lage ist, gleichzeitig an das Immuneffektorzellantigen und das MHC-assoziierte Peptidepitop zu binden.In a first aspect of the invention, the above object is achieved by providing a double specificity polypeptide molecule comprising a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, wherein: the first polypeptide chain is a variable domain first binding region ( VD1 derived from an antibody capable of recruiting human immune effector cells by specifically binding to a surface antigen of these cells, and a first variable domain binding region ( VR1 ), by one TCR which is specific for an MHC-associated peptide epitope and a first linker segment ( LINK1 ) connecting the two domains, wherein the second polypeptide chain comprises a second variable domain binding region ( VR2 ), that of a TCR which is specific for an MHC-associated peptide epitope and a second binding region of a variable domain ( VD2 ) derived from an antibody capable of recruiting human immune effector cells by binding specifically to a surface antigen of these cells, and a second linker section ( LINK2 ) connecting the two domains, this first binding region ( VD1 ) and this second binding region ( VD2 ) to form a first binding site ( VD1 ) ( VD2 ) which binds the epitopes on the cell surface molecule, this first binding region ( VR1 ) and this second binding region ( VR2 ) to form a second binding site ( VR1 ) ( VR2 ) to bind this MHC-associated peptide epitope, at least one of said polypeptide chains being linked at its C-terminus to hinge regions, CH 2 and / or CH3 domains or portions thereof derived from human IgG and wherein said dual specificity polypeptide molecule is capable of simultaneously binding to the immune effector cell antigen and the MHC-associated peptide epitope.

Bevorzugt bindet das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der vorliegenden Erfindung mit hoher Spezifität sowohl an das Immuneffektorzellantigen als auch an ein spezifisches Antigenepitop, das als ein Peptid-MHC-Komplex z. B. mit einer Bindungsaffinität (KD) von ungefähr 100 nM oder weniger, ungefähr 30 nM oder weniger, ungefähr 10 nM oder weniger, ungefähr 3 nM oder weniger, ungefähr 1 nM oder weniger präsentiert wird.Preferably, the dual specificity polypeptide molecule of the present invention binds with high specificity to both the immune effector cell antigen and a specific antigenic epitope as a peptide-MHC complex e.g. With a binding affinity ( KD ) of about 100 nM or less, about 30 nM or less, about 10 nM or less, about 3 nM or less, about 1 nM or less.

Das erfindungsgemäße Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der vorliegenden Erfindung wird hier durch ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität dargestellt, das eine erste Polypeptidkette mit SEQ ID No. 16 und eine zweite Polypeptidkette mit SEQ ID No. 17 umfasst, beispielhaft dargestellt.The double specificity polypeptide molecule of the present invention according to the present invention is represented herein by a double specificity polypeptide molecule comprising a first polypeptide chain of SEQ ID NO. 16 and a second polypeptide chain with SEQ ID NO. 17, exemplified.

Unter einem zweiten Aspekt der Erfindung wird die oben dargestellte Aufgabe gelöst, indem eine Nukleinsäure(n) bereitgestellt werden, die für eine erste Polypeptidkette und / oder eine zweite Polypeptidkette kodieren, wie vorliegend offenbart, oder für einen Expressionsvektor(en), die diese Nukleinsäure umfassen, kodieren. Unter einem dritten Aspekt der Erfindung wird die oben dargestellt Aufgabe gelöst, indem eine Wirtszelle, die einen Vektor / Vektoren umfasst, wie vorliegend definiert, bereitgestellt wird.In a second aspect of the invention, the above object is achieved by providing a nucleic acid (s) encoding a first polypeptide chain and / or a second polypeptide chain, as disclosed herein, or an expression vector (s) containing that nucleic acid include, encode. In a third aspect of the invention, the object set forth above is achieved by providing a host cell comprising a vector / vectors as defined herein.

Unter einem vierten Aspekt der Erfindung wird die oben dargestellte Aufgabe gelöst, indem ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, welches die geeignete Expression in einer geeigneten Wirtszelle dieses Expressionsvektors / dieser Expressionsvektoren, welche(r), wie offenbart, die Nukleinsäure(n) umfasst / umfassen, und die geeignete Aufreinigung des Moleküls / der Moleküle von der Zelle und/oder deren Medium umfasst.In a fourth aspect of the invention, the above object is achieved by providing a method of producing a dual specificity polypeptide molecule according to the present invention which comprises appropriate expression in a suitable host cell of said expression vector (s), such as which comprises nucleic acid (s), and comprises the appropriate purification of the molecule (s) from the cell and / or its medium.

Unter einem fünften Aspekt der Erfindung wird die oben dargestellte Aufgabe dadurch gelöst, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt wird, welche das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, die Nukleinsäure oder den / die Expressionsvektor(en) gemäß der Erfindung oder die Zelle gemäß der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Träger(n) oder Hilfsstoff(en) umfasst.In a fifth aspect of the invention, the above object is achieved by providing a pharmaceutical composition comprising the double specificity polypeptide molecule according to the invention, the nucleic acid or the expression vector (s) according to the invention or the cell according to the invention together with one or more pharmaceutically acceptable carrier (s) or excipient (s).

Unter einem sechsten Aspekt der Erfindung bezieht sich die Erfindung auf das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, die Nukleinsäure(n) oder den / die Expressionsvektor(en) gemäß der Erfindung, die Zelle gemäß der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur medizinischen Verwendung.In a sixth aspect of the invention, the invention relates to the polypeptide molecule having dual specificity according to the invention, the nucleic acid (s) or the expression vector (s) according to the invention, the cell according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention medical use.

Unter einem siebten Aspekt der Erfindung bezieht sich die Erfindung auf das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, die Nukleinsäure oder den / die Expressionsvektor(en) gemäß der Erfindung, die Zelle gemäß der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, wie in dieser Patentschrift offenbart, insbesondere ausgewählt unter Krebserkrankungen und infektiösen Erkrankungen.In a seventh aspect of the invention, the invention relates to the polypeptide molecule of dual specificity according to the invention, the nucleic acid or the expression vector (s) according to the invention, the cell according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention for use in the Treatment of a disease or disorder as disclosed in this patent, especially selected from cancers and infectious diseases.

Unter einem achten Aspekt der Erfindung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, welche das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, der Nukleinsäure oder des / der Expressionsvektor(en) gemäß der Erfindung, der Zelle gemäß der Erfindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst.In an eighth aspect of the invention, the invention relates to a method of treating a disease or disorder comprising administering a therapeutically effective amount of the double specificity polypeptide molecule according to the invention, the nucleic acid or the expression vector (s) according to the invention, the cell according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention.

Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung neue und verbesserte Polypeptidmoleküle mit zweifacher Spezifität bereit. Die Moleküle umfassen üblicherweise eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette, wobei die Ketten gemeinsam eine variable Domäne eines Antikörpers bereitstellen, die für ein Epitop oder ein Immuneffektorzelloberflächenantigen spezifisch ist, und eine variable Domäne eines TCR, der für ein MHC-assoziiertes Peptidepitop, z. B. ein Krebsepitop oder Epitope, die in Folge einer Infektion, z. B. einer Virusinfektion wie HIV, präsentiert werden, spezifisch ist. Variable Domänen, die von Antikörpern und TCRs stammen, werden durch kovalente und nicht-kovalente Bindungen stabilisiert, die zwischen Fc-Teilen oder Teilen davon gebildet werden, die sich auf beiden Polypeptidketten befinden. Das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität ist anschließend in der Lage, gleichzeitig an den Zell-Rezeptor und das MHC-assoziierte Peptidepitop zu binden.As mentioned above, the invention provides novel and improved polypeptide molecules with dual specificity. The molecules usually comprise a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, wherein the chains together provide a variable domain of an antibody specific for an epitope or an immune effector cell surface antigen, and a variable domain of an antibody TCR which is responsible for an MHC-associated peptide epitope, e.g. As a cancer epitope or epitopes resulting in an infection, eg. A viral infection such as HIV, is specific. Variable domains of antibodies and TCRs are stabilized by covalent and non-covalent bonds formed between Fc portions or portions thereof located on both polypeptide chains. The polypeptide molecule of dual specificity is then able to bind simultaneously to the cell receptor and the MHC-associated peptide epitope.

Vor dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung werden variable Domänen (VD1) und (VD2) von Antikörpern abgeleitet, die in der Lage sind, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem sie spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Effektorzellen binden. In einer besonderen Ausführungsform binden diese Antikörper spezifisch an Epitope des TCR-CD3 Komplexes von humanen T-Zellen, welche die Peptidketten TCRalpha, TCRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, und CD3zeta umfassen.In the context of the present invention, variable domains ( VD1 ) and ( VD2 ) derived from antibodies capable of recruiting human immune effector cells by binding specifically to a surface antigen of these effector cells. In a particular embodiment, these antibodies bind specifically to epitopes of the TCR - CD3 Complex of human T cells comprising the peptide chains TCRalpha, TCRbeta, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, and CD3zeta.

EP1868650 bezieht sich auf Diabody-Moleküle und deren Verwendung bei der Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen und Störungen, einschließlich immunologischen Störungen, Infektionserkrankungen, Vergiftungen und Krebserkrankungen. Die Diabody-Moleküle umfassen zwei Polypeptidketten, die assoziieren, um mindestens zwei Epitopbindungsstellen zu bilden, welche dieselben oder unterschiedliche Epitope auf demselben oder unterschiedlichen Antigenen erkennen können. Darüber hinaus können die Antigene vom selben oder von unterschiedlichen Molekülen stammen. Die einzelnen Polypeptidketten des Diabody-Moleküls können durch kovalente Bindungen, bei denen es sich nicht um Peptidbindungen handelt, kovalent gebunden werden, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Disulfidbindungen von Cysteinresten, die sich innerhalb jeder Polypeptidkette befinden. In besonderen Ausführungsformen umfassen die Diabody-Moleküle weiterhin eine Fc-Region, welche vorliegend offenbart wird, da diese die Erzeugung von Antikörper-ähnlichen Eigenschaften (z. B. lange Halbwertszeit) in dem Molekül ermöglicht. EP 1868650 erfordert die Anwesenheit von Bindungsregionen von variablen Leichtketten- oder Schwerketten-Domänen eines Immunglobulins und erörtert umfangreich funktionale Fc-Rezeptor-Bindemittel. EP1868650 refers to diabody molecules and their use in the treatment of a variety of diseases and disorders, including immunological disorders, infectious diseases, intoxications and cancers. The diabody molecules comprise two polypeptide chains that associate to form at least two epitope binding sites that can recognize the same or different epitopes on the same or different antigens. In addition, the antigens may be from the same or different molecules. The individual polypeptide chains of the diabody molecule can be covalently linked by covalent bonds other than peptide bonds, such as, but not limited to, disulfide bonds of cysteine residues located within each polypeptide chain. In particular embodiments, the diabody molecules further include an Fc region, which is disclosed herein, as it enables the generation of antibody-like properties (eg, long half-life) in the molecule. EP 1868650 requires the presence of binding regions of variable light chain or heavy chain domains of an immunoglobulin and discusses extensively functional Fc receptor binding agents.

Das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine erste Polypeptid- und eine zweite Polypeptidkette, die eine erste (VD1) und eine zweite (VD2) Bindungsregion von jeweils einer variablen Domäne bereitstellt, die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Zellen bindet. Diese erste Bindungsregion (VD1) und diese zweite Bindungsregion (VD2) assoziieren, um eine erste Bindungsstelle (VD1)(VD2) zu bilden, welche das Epitop des Immuneffektorzelloberflächenantigens bindet. Darüber hinaus umfasst die erste und die zweite Polypeptidkette des Polypeptidmoleküls eine erste (VR1) und eine zweite (VR2) Bindungsregion, jeweils von einer variablen Domäne, die von einem TCR stammt, der für ein MHC-assoziiertes Peptidepitop spezifisch ist. Diese erste Bindungsregion (VR1) und diese zweite Bindungsregion (VR2) assoziieren, um eine zweite Bindungsstelle (VR1)(VR2) zu bilden, welche das Epitop dieses MHCassoziierten Peptids bindet. In einer Ausführungsform des Polypeptids mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung wird die Reihenfolge / die Orientierung der Regionen in der ersten Polypeptidkette aus VD1-LINK1-VR1 ausgewählt und VR1-LINK1-VD1 in einer anderen Ausführungsform, in der Reihenfolge / Orientierung der Regionen in der zweiten Polypeptidkette wird aus VD2-LINK2-VR2 und VR2-LINK-VD2 ausgewählt, d. h. die Anordnung der Bindungsstellen kann neu zu einem „linkshändigen“ oder „rechtshändigen“ Molekül geordnet werden (siehe ). Auch kann die Konfiguration der Alpha- und Beta-Ketten des mit dem TCR verknüpften Teils getauscht werden.The double specificity polypeptide molecule according to the present invention comprises a first polypeptide and a second polypeptide chain comprising a first ( VD1 ) and a second ( VD2 ) Provides a variable domain binding region derived from an antibody capable of recruitment of human immune effector cells by specifically binding to a surface antigen of those cells. This first binding region ( VD1 ) and this second binding region ( VD2 ) to form a first binding site ( VD1 () VD2 ) which binds the epitope of the immune effector cell surface antigen. In addition, the first and second polypeptide chains of the polypeptide molecule comprise a first ( VR1 ) and a second ( VR2 ) Binding region, each of a variable domain, by a TCR which is specific for an MHC-associated peptide epitope. This first binding region ( VR1 ) and this second binding region ( VR2 ) to form a second binding site ( VR1 () VR2 ) which binds the epitope of this MHC-associated peptide. In one embodiment of the dual specificity polypeptide according to the invention, the order / orientation of the regions in the first polypeptide chain is selected from VD1-LINK1-VR1 and VR1 - LINK1 - VD1 in another embodiment, in the order / orientation of the regions in the second polypeptide chain is selected from VD2-LINK2-VR2 and VR2-LINK-VD2, ie the location of the binding sites can be re-arranged into a "left-handed" or "right-handed" molecule (please refer ). Also, the configuration of the alpha and beta chains of the with TCR linked part exchanged.

Vor dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptidmolekül mit zweifacher Affinität gemäß der Erfindung durch ein Konstrukt beispielhaft dargestellt, welches das SLYNTVATL-Peptid (SEQ ID No. 7) bindet, wenn dies als ein Peptid-MHC-Komplex präsentiert wird. Nichtsdestotrotz ist das Konzept der Erfindung eindeutig nicht auf dieses spezielle Peptid beschränkt und umfasst im Prinzip jedes krankheits- oder störungsbezogene Epitop, das im Zusammenhang mit dem MHC-Molekül präsentiert wird. Dieses Präsentieren kann sowohl in Bezug auf die MHC-Klasse I oder II erfolgen. Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes Klasse I (MHC-I) sind auf der Oberfläche von allen kernhaltigen Zellen vorhanden und zeigen eine große Auswahl an Peptidepitopen für die Überwachung durch das CD8⁺ T-Zell-Repertoire. CD8⁺ T-Zell-Antworten sind von essentieller Bedeutung für die Steuerung und Befreiung von Virusinfektionen sowie die Eliminierung von transformierten und tumorerzeugenden Zellen. Beispiele für bevorzugte zu erkennende Peptidepitope sind in der entsprechenden Literatur zu finden und umfassen insbesondere die in den Tabellen 1 bis 5 der WO 2016/170139 ; Tabellen 1 bis 5 der WO 2016/102272 ; Tabellen 1 oder 2 der WO 2016/156202 ; Tabellen 1 bis 4 der WO 2016/146751 ; Tabelle 2 der WO 2011/113819 ; Tabellen 1 bis 4b der WO 2016/156230 ; Tabellen 1 bis 4b der WO 2016/177784 ; Tabellen 1 bis 4 der WO 2016/202963 ; Tabellen 1 und 2 der WO 2016/207164 ; Tabellen 1 bis 4 der WO 2017/001491 ; Tabellen 1 bis 4 der WO 2017/005733 ; Tabellen 1 bis 8 der WO 2017/021527 ; Tabellen 1 bis 3 der WO 2017/036936 ; und Tabellen 1 bis 4 der PCT/EP2016/073416 offenbarten Peptide für die Behandlung(en) von Krebs, deren Inhalte von jeder der Anwendungen durch Hinweis vorliegend ganz aufgenommen wurden.In the light of the present invention, the dual affinity polypeptide molecule of the invention is exemplified by a construct that binds the SLYNTVATL peptide (SEQ ID NO: 7) when presented as a peptide-MHC complex. Nonetheless, the concept of the invention is clearly not limited to this particular peptide and, in principle, includes any disease or disorder related epitope presented in the context of the MHC molecule. This presentation can be made both in terms of MHC class I or II. Major histocompatibility complex class I molecules (MHC-I) are present on the surface of all nucleated cells and show a wide variety of peptide epitopes for monitoring by the CD8 ⁺ T-cell repertoire. CD8 ⁺ T-cell responses are essential for the control and clearance of viral infections as well as the elimination of transformed and tumorigenic cells. Examples of preferred peptide epitopes to be recognized can be found in the corresponding literature and in particular include those in Tables 1 to 5 of WO 2016/170139 ; Tables 1 to 5 of WO 2016/102272 ; Tables 1 or 2 of WO 2016/156202 ; Tables 1 to 4 of WO 2016/146751 ; Table 2 of WO 2011/113819 ; Tables 1 to 4b of WO 2016/156230 ; Tables 1 to 4b of WO 2016/177784 ; Tables 1 to 4 of WO 2016/202963 ; Tables 1 and 2 of WO 2016/207164 ; Tables 1 to 4 of WO 2017/001491 ; Tables 1 to 4 of WO 2017/005733 ; Tables 1 to 8 of WO 2017/021527 ; Tables 1 to 3 of WO 2017/036936 ; and Tables 1 to 4 of PCT / EP2016 / 073416 disclosed peptides for the treatment (s) of cancer, the contents of each of which applications have been fully incorporated by reference herein.

Andere geeignete Epitope können von Datenbanken, wie zum Beispiel der Datenbank für Immunepitope (Zugriff unter http://www.iedb.org/), identifiziert werden.Other suitable epitopes can be identified by databases such as the Immunopitope Database (accessed at http://www.iedb.org/).

Der Begriff „humane Immuneffektorzelle(n)“ bezieht sich auf eine Zelle innerhalb des natürlichen Zellrepertoires im humanen Immunsystem, die, wenn sie aktiviert wird, in der Lage ist, eine Änderung der Lebensfähigkeit einer Zielzelle herbeizuführen. Der Ausdruck „Lebensfähigkeit einer Zielzelle“ kann sich innerhalb des Rahmens der Erfindung auf die Fähigkeit der Zielzelle beziehen, zu überleben, proliferieren und / oder mit anderen Zellen zu interagieren. Diese Interaktion kann entweder direkt erfolgen, zum Beispiel wenn die Zielzelle Kontakt zu einer anderen Zelle hat oder indirekt, zum Beispiel wenn die Zielzelle Substanzen sezerniert, welche einen Einfluss auf die Funktionsfähigkeit einer anderen, entfernten Zelle haben. Bei der Zielzelle kann es sich entweder um eine humane native Zelle oder um eine nicht-humane Zelle handeln. Im Falle, dass die Zelle eine humane native Zelle ist, handelt es sich bei der Zielzelle vorteilhafter Weise um eine Zelle, welche sich verändert hat und zu einer malignen Zelle geworden ist. Bei der nativen Zelle kann es sich zusätzlich um eine pathologisch veränderte native Zelle handeln, zum Beispiel eine native Zelle, die mit einem Organismus, wie z. B. einem Virus, einem Plasmodium oder einem Bakterium infiziert ist. Im Falle, dass die Zelle keine humane, sondern eine nicht-humane Zelle ist, handelt es sich bei der Zielzelle vorteilhafterweise um eine eingedrungene pathogene Zelle, zum Beispiel ein eingedrungenes Bakterium oder Plasmodium.The term "human immune effector cell (s)" refers to a cell within the natural cell repertoire in the human immune system which, when activated, is capable of inducing a change in the viability of a target cell. The term "viability of a target cell" may, within the scope of the invention, refer to the ability of the target cell to survive, proliferate and / or interact with other cells. This interaction can occur either directly, for example when the target cell is in contact with another cell or indirectly, for example when the target cell secretes substances, which have an impact on the functioning of another, remote cell. The target cell may be either a human native cell or a nonhuman cell. In case the cell is a human native cell, the target cell is advantageously a cell that has changed and become a malignant cell. The native cell may additionally be a pathologically altered native cell, for example a native cell associated with an organism, such as an organism. B. a virus, a plasmodium or a bacterium is infected. In the case where the cell is not a human but a non-human cell, the target cell is advantageously an invaded pathogenic cell, for example an invaded bacterium or plasmodium.

Bevorzugt ist das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei diese ersten und zweiten Polypeptidketten weiterhin mindestens eine Gelenkdomäne (Hingedomäne) und / oder eine Fc-Domäne oder einen Teil davon umfassen. In Antikörpern bezieht sich das „Gelenk“ oder die „Gelenkregion“ oder die „Gelenkdomäne“ auf den flexiblen Teil einer schweren Kette, die sich zwischen der CH1-Domäne und der CH2-Domäne befindet. Sie ist ungefähr 25 Aminosäuren lang und ist in ein „oberes Gelenk“, ein „mittleres Gelenk“ oder ein „Kerngelenk“ und ein „unteres Gelenk“ unterteilt. Eine „Gelenkunterdomäne“ bezieht sich auf das obere Gelenk, das mittlere (oder Kern-) Gelenk oder das untere Gelenk. Die Aminosäuresequenzen der Gelenke eines IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 Moleküls lauten wie folgt (EU Nummerierung ist angegeben):

 IgG3:
 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE216PKSCDTPPPCPRCPAPELLG
 (SEQ ID No. 3)

Preferred is the polypeptide molecule having dual specificity according to the invention, said first and second polypeptide chains further comprising at least one hinge domain (Hingdomäne) and / or an Fc domain or a part thereof. In antibodies, the "hinge" or "hinge region" or "hinge domain" refers to the flexible part of a heavy chain located between the CH1 domain and the CH2 domain. It is about 25 amino acids long and is divided into an "upper joint", a "middle joint" or a "core joint" and a "lower joint". An "articular subdomain" refers to the upper joint, the middle (or core) joint, or the lower joint. The amino acid sequences of the joints of a IgG1 . IgG2 . IgG3 and IgG4 Molecule read as follows (EU numbering is indicated):

 IgG3:
 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPE216PKSCDTPPPCPRCPAPELLG
 (SEQ ID No. 3)

Die Kerngelenkregion enthält für gewöhnlich mindestens eine Cysteinbrücke, welche die zwei schweren Ketten verbindet. Darüber hinaus können Mutationen in der unteren Gelenkregion ausgelöst werden, um die unerwünschte antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu verbessern.The core joint region usually contains at least one cysteine bridge connecting the two heavy chains. In addition, lower hinge region mutations can be triggered to reduce unwanted antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ( ADCC ) to improve.

Bevorzugt ist ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der vorliegenden Erfindung, das mindestens eine IgG-Domäne mit einem kristallisierbaren Fragment (Fc) umfasst, d. h. ein kristallisierbares Fragment (Fc-Region), die Endregion eines Antikörpers, der mit Fc-Rezeptoren und einigen Proteinen des Komplementsystems interagiert. Fc-Regionen umfassen zwei oder drei konstante Domänen einer Schwerkette (CH-Domänen 2, 3 und 4) in jeder Polypeptidkette. Die Fc-Regionen des IgG tragen auch eine hochkonservierte N-Glykosylierungsstelle. Die Glykosylierung des Fc-Fragments ist für die Fc-Rezeptor-vermittelte Aktivität von essentieller Bedeutung. Die geringe Größe von bispezifischen Antikörperformaten wie zum Beispiel BiTEs und DARTs (~50 kD) kann zu einer schnellen Clearance und einer kurzen Halbwertszeit führen. Daher kann das scTv-zelluläre Rezeptor-Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität mit einer (humanen IgG1) Fc-Domäne fusioniert werden, um damit die Molekülmasse zu erhöhen und dadurch verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften zu erhalten. Es wurde für mehrere Mutationen an der Schnittstelle zwischen den CH2- und CH3-Domänen wie zum Beispiel T250Q/M428L und M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F gezeigt, dass sie in vivo die Bindungsaffinität zu dem neonatalen Fc-Rezeptor (FcRn) und die Halbwertszeit von IgG1 erhöhen. Dadurch könnte die Serum-Halbwertszeit eines Fc-enthaltenden Moleküls weiter verlängert werden.Preferred is a polypeptide molecule with dual specificity according to the present invention which comprises at least one IgG domain with a crystallizable fragment ( fc ), ie, a crystallizable fragment (Fc region), the end region of an antibody that interacts with Fc receptors and some proteins of the complement system. Fc regions comprise two or three heavy chain constant domains (CH domains 2 . 3 and 4 ) in each polypeptide chain. The Fc regions of IgG also carry a highly conserved N-glycosylation site. Glycosylation of the Fc fragment is of essential importance for Fc receptor-mediated activity. The small size of bispecific antibody formats such as BiTEs and DARTs (~ 50 kD) can lead to rapid clearance and a short half-life. Therefore, the scTv cellular receptor polypeptide molecule having dual specificity can be linked to one (human IgG1 ) Fc domain can be fused to increase the molecular mass and thereby obtain improved pharmacokinetic properties. Several mutations at the interface between the CH2 and CH3 domains, such as T250Q / M428L and M252Y / S254T / T256E + H433K / N434F, have been shown to enhance binding affinity to the neonatal Fc receptor in vivo ( FcRn ) and the half-life of IgG1 increase. This could further extend the serum half-life of an Fc-containing molecule.

In den Polypeptidmolekülen mit zweifacher Spezifität der Erfindung kann diese Fc-Domäne eine CH2-Domäne umfassen, die mindestens eine Mutation enthält, welche die Effektorfunktion ausschaltet. Vorzugsweise werden diese Mutationen in die ELLGGP-Sequenz von humanem IgG1 (Reste 233-238) oder entsprechenden Resten von anderen Isotypen) eingeführt, von denen bekannt ist, dass sie für Effektorfunktionen relevant sind. Grundsätzlich werden eine oder mehrere Mutationen, die den von IgG2 stammenden Resten entsprechen und / oder IgG4 in IgG1 Fc eingebracht. Bevorzugt werden: E233P, L234V, L235A und keine Reste oder G an Position 236. Eine andere Mutation ist P331S. EP1075496 offenbart einen rekombinanten Antikörper, der eine chimärische Domäne umfasst, die von zwei oder mehreren humanen Immunglobulin-Schwerketten-CH2-Domänen stammt, wobei die humanen Immunglobuline von IgG1, IgG2 und IgG4 ausgewählt werden und die chimärische Domäne eine Immunglobulin-Schwerketten-CH2-Domäne ist, welche über die folgenden Aminosäureblöcke an den dargestellten Positionen verfügt: 233P, 234V, 235A und kein Rest oder G an Position 236 und 327G, 330S und 331S in Übereinstimmung mit dem EU-Nummerierungssystem, und ist zu mindestens 98% zu einer CH2-Sequenz (Reste 231-340) von humanem IgG1, IgG2 oder IgG4 identisch, welche diese modifizierten Aminosäuren aufweist.In the double specificity polypeptide molecules of the invention, this may be Fc Domain comprising a CH2 domain containing at least one mutation that shuts down the effector function. Preferably, these mutations are incorporated into the ELLGGP sequence of human IgG1 (residues 233 - 238 or corresponding residues from other isotypes) that are known to be relevant to effector functions. Basically, one or more mutations that are from the IgG2 correspond to corresponding residues and / or IgG4 in IgG1 Fc brought in. Preference is given to: E233P, L234V, L235A and no residues or G at position 236 , Another mutation is P331S. EP1075496 discloses a recombinant antibody comprising a chimaeric domain derived from two or more human immunoglobulin heavy chain CH2 domains, wherein the human immunoglobulins of IgG1 . IgG2 and IgG4 selected and the chimeric domain is an immunoglobulin heavy chain CH2 domain having the following amino acid blocks at the positions shown: 233P, 234V, 235A and no residue or G at position 236 and 327g . 330S and 331S in accordance with the EU numbering system, and is at least 98% CH2 Sequence (residues 231 - 340 ) of human IgG1 . IgG2 or IgG4 identical, which has these modified amino acids.

Beispiele von bevorzugten zu verwendenden CH2-Teilsequenzen können (vollständig oder teilweise) wie folgt lauten:


 231-
 APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
 VHNAKTKPREEQYQSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-
 334 (SEQ ID No. 5);

und


 231-
 APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
 VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-
 334 (SEQ ID No. 6)

mit unterstrichenen Änderungen, die an Position 297 ein N (glykosilierte Variante) oder einen aus der Gruppe von A, G und Q (deglykosilierte Variante) ausgewählten Rest enthalten.Examples of preferred CH 2 subsequences to be used may be (fully or partially) as follows:


 231-
 APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
 VHNAKTKPREEQYQSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-
 334 (SEQ ID No. 5);

and


 231-
 APPVA-GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
 VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEK-
 334 (SEQ ID No. 6)

with underlined changes in position 297 an N (glycosylated variant) or one from the group of A . G and Q (deglycosylated variant) selected radical.

In den Polypeptidmolekülen mit zweifacher Spezifität der Erfindung kann diese Fc-Domäne eine CH3-Domäne umfassen, die mindestens eine Mutation enthält, welche die Bildung von Heterodimeren erleichtert. Um die Ausbeute des gewünschten heterodimären Fc-Proteins mit zweifacher Spezifität zu maximieren und die Aufreinigung zu vereinfachen, können in der Fc-Domäne „Knobs-into-holes“ Mutationen erzeugt werden. Fc-Domänen, die diese Struktur aufweisen, werden dazu bewegt, Heterodimere anstelle von den für sie normalen Homodimeren zu bilden, indem vorstehende, sperrige, hydrophobe Reste („knobs“) an einer Kette und komplementäre hydrophobe Taschen („holes“) an der anderen Kette erzeugt werden. Die ,knob‘-Variante kann durch das Ersetzen einer kleinen Aminosäure mit einer größeren für das Einführen in ein hole in der gegenüberliegenden Domäne erhalten werden, das durch das zweckdienliche Ersetzen eines großen Rests mit einem kleineren erzeugt wurde (Ridgway, J.B.B.; Presta, L.G.; Carter, P. „Knobs-into-holes“ engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng. 1996, 9, 617-621; WO 2002/002781 ).In the double specificity polypeptide molecules of the invention, this Fc domain may comprise a CH3 domain containing at least one mutation facilitating the formation of heterodimers. In order to maximize the yield of the desired heterodimeric Fc protein with dual specificity and to simplify the purification, "Knobs-into-holes" mutations can be generated in the Fc domain. Fc domains having this structure are moved to form heterodimers rather than their normal homodimers by protruding bulky, hydrophobic "knobs" on a chain and complementary hydrophobic "holes" on the chain other chain are generated. The 'knob' variant can be obtained by replacing a small amino acid with a larger one for insertion into a hole in the opposite domain, which has been generated by the expedient replacement of a large residue with a smaller one (Ridgway, JBB, Presta, LG Carter, P. "Knobs-into-holes" engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization, Protein Eng., 1996, 9, 617-621; WO 2002/002781 ).

Bevorzugt wird ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei diese „Knob-into-hole“-Mutation aus T366W als knob und T366'S, L368'A und Y407'V als hole in der CH3-Domäne ausgewählt wird (siehe, z. B. WO 98/50431 ). Dieser Satz von Mutationen kann durch das Einbeziehen der Mutationen K409A und F405'K, wie durch Wei u. a. beschrieben, erweitert werden. (Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, Oncotarget. 2017. Ein anderer knob kann T366Y und das hole Y407'T sein.Preferred is a polypeptide molecule with dual specificity according to the invention, this "knob-in-hole" mutation being selected from T366W as knob and T366'S, L368'A and Y407'V as hole in the CH3 domain (see, e.g. B. WO 98/50431 ). This set of mutations can be extended by including mutations K409A and F405'K as described by Wei et al. (Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production, oncotarget. 2017. Another knob can be T366Y and the hole is Y407'T.

Die Polypeptidmoleküle mit zweifacher Spezifität der Erfindung können weiterhin künstlich eingeführte Cysteinbrücken zwischen mindestens einem Cysteinrest an der ersten Polypeptidkette und mindestens einem Cysteinrest an der zweiten Polypeptidkette umfassen, um die Stabilität der Moleküle zu verbessern, optimalerweise ohne die Bindungseigenschaften der bivalenten Moleküle zu beeinträchtigen, und / oder um eine verbesserte Heterodimerisierung zu erreichen. Um zusätzliche Stabilität zu erreichen, kann durch die Hinzufügung eines einzelnen Cysteins in die CH3-Domäne von sowohl den knob- als auch den hole-Ketten eine Disulfidbindung eingeführt werden. Bevorzugt wird ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei die Fc-Domäne eine CH3-Domäne umfasst, die mindestens einen zusätzlichen Cysteinrest umfasst, zum Beispiel S354C und / oder Y349C.The dual specificity polypeptide molecules of the invention may further comprise artificially introduced cysteine bridges between at least one cysteine residue on the first polypeptide chain and at least one cysteine residue on the second polypeptide chain to improve the stability of the molecules, optimally without affecting the binding properties of the bivalent molecules, and / or to achieve improved heterodimerization. For additional stability, the addition of a single cysteine to the CH3 domain of both the knob and hole chains can introduce a disulfide bond. Preferred is a polypeptide molecule having dual specificity according to the invention, wherein the Fc domain comprises a CH3 domain comprising at least one additional cysteine residue, for example S354C and / or Y349C.

Bevorzugt wird ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei dieses CD-Molekül aus der Gruppe von auf die Immunantwort bezogenen CD-Molekülen CD3 wie z. B. die CD3y, CD3δ und CD3ε-Ketten, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45RA, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD152, CD163, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRalpha/beta, TCRgamma/delta und HLA-DR ausgewählt wird. In Abhängigkeit von der Kombination der zwei antigenbindenden Einheiten des Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung können spezifische Vorteile in Bezug auf die Funktionsweise des Moleküls, insbesondere eine erhöhte Wirksamkeit, erreicht werden.Preference is given to a polypeptide molecule with dual specificity according to the invention, this CD molecule being selected from the group of CD3 CD3 molecules related to the immune response, such as e.g. CD3y, CD3δ and CD3ε chains, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD22, CD25, CD28, CD32a, CD32b, CD33, CD41b, CD41b, CD42a, CD42b, CD44, CD45a, CD49, CD55, CD56, CD61, CD64, CD68, CD94, CD90, CD117, CD123, CD125, CD134, CD137, CD153, CD193, CD193, CD203c, CD235a, CD278, CD279, CD287, Nkp46, NKG2D, GITR, FcεRI, TCRalpha / beta, TCRgamma / delta and HLA-DR. Depending on the combination of the two antigen-binding moieties of the dual specificity polypeptide molecule of the invention, specific advantages in terms of the functionality of the molecule, in particular increased efficacy, may be achieved.

Bevorzugt ist das beispielhafte Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei die Regionen in der ersten Polypeptidkette SEQ ID No. 28 für VD1, SEQ ID No. 29 für VR1, SEQ ID No. 30 für LINK1 und die Regionen in der zweiten Polypeptidkette SEQ ID No. 31 für VD2, SEQ ID No. 32 für VR2, und SEQ ID No. 30 für LINK2 umfassen.Preferred is the exemplary polypeptide molecule having dual specificity according to the invention, wherein the regions in the first polypeptide chain SEQ ID NO. 28 for VD1 , SEQ ID no. 29 for VR1 , SEQ ID no. 30 for LINK1 and the regions in the second polypeptide chain SEQ ID NO. 31 for VD2 , SEQ ID no. 32 for VR2 , and SEQ ID no. 30 for LINK2 include.

Bevorzugt ist weiterhin das beispielhafte Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei die FC-Region in der ersten Polypeptidkette SEQ ID No. 26 (Fc1) und die FC-Region in der zweiten Polypeptidkette SEQ ID No. 27 (Fc2) umfasst.Also preferred is the exemplary polypeptide molecule of dual specificity according to the invention, wherein the FC region in the first polypeptide chain SEQ ID NO. 26 ( Fc1 ) and the FC region in the second polypeptide chain SEQ ID NO. 27 ( Fc2 ).

Weiterhin bevorzugt ist das beispielhafte Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, das eine erste Polypeptidkette mit SEQ ID No. 16 (1. vollständiges Molekül) und eine zweite Polypeptidkette mit SEQ ID No. 17 (2. vollständiges Molekül) umfasst.Further preferred is the exemplary polypeptide molecule having dual specificity according to the invention, which comprises a first polypeptide chain with SEQ ID NO. 16 ( 1 , complete molecule) and a second polypeptide chain with SEQ ID no. 17 ( 2 , complete molecule).

Noch weiter bevorzugt ist das beispielhafte Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, wobei diese erste Bindungsstelle (VD1) (VD2), welche das Epitop des Oberflächenantigens von humanen Immunzellen (z. B. CD3) bindet, humanisiert ist, und / oder diese zweite Bindungsstelle (VR1) (VR2), welche dieses MHC-assoziierte Peptidepitop bindet, in Bezug auf ihre Affinität ausgereift ist. Even more preferred is the exemplary polypeptide molecule of dual specificity according to the invention, wherein said first binding site ( VD1 ) ( VD2 ) containing the epitope of the surface antigen of human immune cells (e.g. CD3 ) binds, is humanized, and / or this second binding site ( VR1 ) ( VR2 ) which binds this MHC-associated peptide epitope has matured in terms of affinity.

Humanisierte Antikörper sind Antikörper (oder Teile davon) von einer nicht-humanen Spezies, deren Proteinsequenzen modifiziert wurden, um ihre Ähnlichkeit mit Antikörpervarianten zu erhöhen, die unter natürlichen Bedingungen in Menschen produziert werden. Der Prozess der „Humanisierung“ wird für gewöhnlich auf monoklonale Antikörper angewendet, die für die Verabreichung an Menschen entwickelt wurden (zum Beispiel Antikörper, die als Krebsmedikamente entwickelt wurden). Geeignete Verfahren für die Humanisierung sind aus der Literatur bekannt, und werden zum Beispiel in Olimpieri, Pier Paolo, Paolo Marcatili und Anna Tramontano überprüft. „Tabhu: Tools for Antibody Humanization.“ Bioinformatics 31.3 (2015): 434-435 . PMC; Safdari Y1, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M. Antibody humanization methods - a review and update. Biotechnol Genet Eng Rev. 2013;29:175-86 ; oder Ahmadzadeh V1, Farajnia S, Feizi MA, Nejad RA. Antibody humanization methods for development of therapeutic applications. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. Apr. 2014; 33(2):67-73 .Humanized antibodies are antibodies (or parts thereof) of a non-human species whose protein sequences have been modified to enhance their similarity to antibody variants produced in humans under natural conditions. The process of "humanization" is usually applied to monoclonal antibodies that have been developed for administration to humans (for example, antibodies that have been developed as anticancer drugs). Suitable methods for humanization are known from the literature, and are described, for example, in Olimpieri, Pier Paolo, Paolo Marcatili and Anna Tramontano checked. "Tabhu: Tools for Antibody Humanization." Bioinformatics 31.3 (2015): 434-435 , PMC; Safdari Y1, Farajnia S, Asgharzadeh M, Khalili M. Antibody humanization methods - a review and update. Biotechnol Genet Eng Rev. 2013; 29: 175-86 ; or Ahmadzadeh V1, Farajnia S, Feizi MA, Nejad RA. Antibody humanization methods for development of therapeutic applications. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. Apr. 2014; 33 (2): 67-73 ,

Im Allgemeinen kann die Affinitätsreifung von TCRs gemäß den in der Literatur beschriebenen Verfahren in vitro durchgeführt werden, insbesondere, indem man die Präsentation auf der Oberfläche von Hefe oder Phagen verwendet (zum Beispiel auf der Grundlage von Holler PD, u. a. In vitro evolution of a T cell receptor with high affinity for peptide/MHC. Proc Natl Acad Sci USA. 9. Mai 2000; 97(10):5387-92 ; Boder ET u. a., Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigenbinding affinity. Proc Natl Acad Sci USA. 26. Sep 2000; 97(20):10701-5 ; und, als jüngeres Beispiel, Zhao Q, u. a. Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential. Leukemia. 2015; 29(11):2238-2247 ).In general, the affinity maturation of TCRs according to the methods described in the literature, in particular by using the presentation on the surface of yeast or phage (for example based on Holler PD, including in vitro evolution of a T cell receptor with high affinity for peptide / MHC. Proc Natl Acad Sci USA. 9 May 2000; 97 (10): 5387-92 ; Boder et al., Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen binding affinity. Proc Natl Acad Sci USA. 26 Sep 2000; 97 (20): 10701-5 ; and, as a younger example, Zhao Q, et al. Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential. Leukemia. 2015; 29 (11): 2238-2247 ).

Die Bindungsstellen (VD1) (VD2) und (VR1)(VR2) der vorliegenden Beschreibung binden bevorzugt spezifisch an einen Peptid-HLA Molekülkomplex oder ein Oberflächenantigen von humanen Immunzellen. Wie vorliegend in Verbindung mit Bindungsstellen der vorliegenden Beschreibung verwendet, werden die Begriffe „spezifische Bindung“ und grammatikalische Varianten davon mit der Bedeutung verwendet, dass sie eine Stelle bezeichnen, die eine Bindungsaffinität (KD) für einen Peptid-HLA-Molekülkomplex und / oder ein Antikörperepitop von 100 µM oder weniger aufweist. Die Bindungsstellen (VD1) (VD2) und (VR1)(VR2) der vorliegenden Beschreibung binden an einen Peptid-HLA-Molekülkomplex oder ein CD-Antikörperepitop mit einer Bindungsaffinität (KD) von ungefähr 100 µM oder weniger, ungefähr 50 µM oder weniger, ungefähr 25 µM oder weniger, oder ungefähr 10 µM oder weniger. Noch bevorzugter sind Bindungsstellen mit hoher Affinität, die Bindungsaffinitäten von ungefähr 1 µM oder weniger, ungefähr 100 nM oder weniger, ungefähr 50 nM oder weniger, ungefähr 25 nM oder weniger aufweisen. Rein beispielhaft liegen die bevorzugten Bereiche der Bindungsaffinität von Bindungsstellen der vorliegenden Erfindung bei ungefähr 1 nM bis ungefähr 10 nM; ungefähr 10 nM bis ungefähr 20 nM; ungefähr 20 nM bis ungefähr 30 nM; ungefähr 30 nM bis ungefähr 40 nM; ungefähr 40 nM bis ungefähr 50 nM; ungefähr 50 nM bis ungefähr 60 nM; ungefähr 60 nM bis ungefähr 70 nM; ungefähr 70 nM bis ungefähr 80 nM; ungefähr 80 nM bis ungefähr 90 nM; and ungefähr 90 nM bis ungefähr 100 nM.The binding sites ( VD1 ) ( VD2 ) and ( VR1 () VR2 ) of the present specification preferably bind specifically to a peptide HLA molecule complex or a surface antigen of human immune cells. As used herein in connection with binding sites of the present specification, the terms "specific binding" and grammatical variants thereof are used with the meaning to designate a site having a binding affinity ( KD ) for a peptide-HLA molecule complex and / or an antibody epitope of 100 μM or less. The binding sites ( VD1 ) ( VD2 ) and ( VR1 () VR2 ) of the present specification bind to a peptide HLA molecule complex or a CD antibody epitope having a binding affinity ( KD ) of about 100 μM or less, about 50 μM or less, about 25 μM or less, or about 10 μM or less. Even more preferred are high affinity binding sites having binding affinities of about 1 μM or less, about 100 nM or less, about 50 nM or less, about 25 nM or less. By way of example only, the preferred ranges of binding affinity binding sites of the present invention are from about 1 nM to about 10 nM; about 10 nM to about 20 nM; about 20 nM to about 30 nM; about 30 nM to about 40 nM; approximately 40nM to about 50nM; about 50 nM to about 60 nM; about 60 nM to about 70 nM; about 70 nM to about 80 nM; about 80 nM to about 90 nM; and about 90 nM to about 100 nM.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung trägt dieses Molekül einen Wirkstoff oder einen Teil davon, der mit dem Molekül gekoppelt oder mit diesem konjugiert ist. Dieser Wirkstoff kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einer auffindbaren Markierung, einem immunstimulierenden Molekül und einem Therapeutikum besteht.In another preferred embodiment of the dual specificity polypeptide molecule of the invention, said molecule carries an active agent or a portion thereof coupled to or conjugated to the molecule. This agent can be selected from the group consisting of a detectable label, an immunostimulating molecule and a therapeutic.

Die auffindbare Markierung kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Biotin, Streptavidin, einem Enzym oder dessen katalytisch aktiven Fragmenten, einem Radionuklid, einem Nanopartikel, einem paramagnetischen Metallion oder einem fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder chemilumineszierenden Molekül besteht. Auffindbare Markierungen für diagnostische Zwecke umfassen beispielsweise fluoreszierende Markierungen, Radiomarkierungen, Enzyme, Nukleinsäuresonden und Kontrastmittel.The detectable label may be selected from the group consisting of biotin, streptavidin, an enzyme or its catalytically active fragments, a radionuclide, a nanoparticle, a paramagnetic metal ion or a fluorescent, phosphorescent or chemiluminescent molecule. Detectable labels for diagnostic purposes include, for example, fluorescent labels, radiolabels, enzymes, nucleic acid probes, and contrast agents.

Therapeutika, welche mit den Molekülen der Erfindung in Verbindung gebracht werden können, umfassen Immunmodulatoren, radioaktive Verbindungen, Enzyme (zum Beispiel Perforin), Chemotherapeutika (zum Beispiel Cisplatin) oder ein Toxin. Andere geeignete Therapeutika umfassen niedermolekulare zytotoxische Wirkstoffe, d. h. Verbindungen mit der Fähigkeit, Säugetierzellen zu töten, welche ein Molekulargewicht von weniger als 700 Dalton aufweisen. Solche Verbindungen können auch toxische Metalle enthalten, die eine zytotoxische Wirkung zeigen können. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass diese niedermolekularen zytotoxischen Wirkstoffe auch Vorstufen enthalten, d. h. Wirkstoffe, die sich zersetzen oder unter physiologischen Bedingungen umgewandelt werden, um zytotoxische Wirkstoffe freizusetzen. Beispiele für solche Wirkstoffe umfassen Cisplatin, Maytansinderivate, Rachelmycin, Calicheamicin, Docetaxel, Etoposid, Gemcitabin, Ifosfamid, Irinotecan, Melphalan, Mitoxantron, Sorfimer Sodiumphotofrin II, Temozolomid, Topotecan, Trimetreat Glucuronat, Auristatin E Vincristin und Doxorubicin; Peptidzytotoxine, d. h. Proteine oder deren Fragmente mit der Fähigkeit, Säugetierzellen abzutöten. Zum Beispiel Ricin, Diphteritoxin, bakterielles Exotoxin A von Pseudomonas, DNase und RNase, Radio-Nuklide, d. h. instabile Isotope von Elementen, welche sich unter gleichzeitiger Aussendung von einem oder mehreren α- oder β-Partikeln oder Gammastrahlen zersetzen. Zum Beispiel können Chelatbildner für Jod 131, Rhenium 186, Indium 111, Yttrium 90, Bismuth 210 und 213, Actinium 225 und Astatin 213 verwendet werden, um die Anlagerung dieser Radio-Nuklide an die Moleküle oder deren Multimere, Immunstimulatoren, d. h. Immuneffektormoleküle, welche die Immunantwort stimulieren, zu erleichtern. Beispiele für solche Immuneffektormoleküle sind Zytokine wie zum Beispiel IL-2 und IFN-γ, Chemokine wie zum Beispiel IL-8, Plättchenfaktor 4, Melanom-wachstumsstimulierendes Protein, Komplementaktivatoren oder xenogene Proteindomänen, allogene Proteindomänen, Virus- / Bakterien-Proteindomänen, Virus-/ Bakterien-Peptide.Therapeutics which may be associated with the molecules of the invention include immunomodulators, radioactive compounds, enzymes (for example perforin), chemotherapeutic agents (for example cisplatin) or a toxin. Other suitable therapeutics include low molecular weight cytotoxic agents, ie, compounds capable of killing mammalian cells which have a molecular weight of less than 700 daltons. Such compounds may also contain toxic metals which may exhibit a cytotoxic effect. In addition, it is believed that these low molecular weight cytotoxic agents also contain precursors, that is, agents that degrade or are converted under physiological conditions to release cytotoxic agents. Examples of such agents include cisplatin, maytansin derivatives, rachelmycin, calicheamicin, docetaxel, etoposide, gemcitabine, ifosfamide, irinotecan, melphalan, mitoxantrone, sorfimer sodium photofrin II, temozolomide, topotecan, trimetreat glucuronate, auristatin E vincristine and doxorubicin; Peptide cytotoxins, ie proteins or fragments thereof capable of killing mammalian cells. For example, ricin, diphtheritoxin, bacterial exotoxin A from Pseudomonas, DNase and RNase, radio nuclides, ie, unstable isotopes of elements which decompose with simultaneous emission of one or more α or β particles or gamma rays. For example, chelating agents for iodine 131 , Rhenium 186 , Indium 111 , Yttrium 90 , Bismuth 210 and 213 , Actinium 225 and Astatine 213 can be used to facilitate the attachment of these radio-nuclides to the molecules or their multimers, immune stimulators, ie immune-effect molecules that stimulate the immune response. Examples of such immune effect molecules are cytokines such as IL-2 and IFN-γ, chemokines such as IL-8, platelet factor 4 , Melanoma growth-stimulating protein, complement activators or xenogeneic protein domains, allogeneic protein domains, viral / bacterial protein domains, viral / bacterial peptides.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich dann auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine erste Polypeptidkette und / oder eine zweite Polypeptidkette kodiert, wie vorliegend offenbart, oder einen Expressionsvektor, der solch eine Nukleinsäure umfasst. Das Nukleinsäuremolekül kann eine DNA, cDNA, PNA, RNA und Kombinationen davon sein. Die Nukleotidsequenz, die für ein bestimmtes Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid kodiert, kann in der Natur vorkommen oder synthetisch hergestellt werden. Im Allgemeinen werden DNA-Segmente, welche für die Peptide, Polypeptide und Proteine dieser Erfindung kodieren, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder aus einer Oligonukleotidserie zusammengesetzt, um ein synthetisches Gen bereitzustellen, das in der Lage ist, in einer rekombinanten transkriptionellen Einheit exprimiert zu werden, die aus regulatorischen Elementen besteht, die von einem Mikroben- oder Virus-Operon stammen. Der Begriff „Expressionsprodukt“ bezeichnet das Polypeptid oder Protein, bei welchem es sich um das natürliche Translationsprodukt des Gens handelt und alle Nukleinsäurensequenzen, die Equivalente kodieren, die das Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes sind und kodiert daher für dieselbe(n) Aminosäure(n). Wenn sich der Begriff „Fragment“ auf eine kodierende Sequenz bezieht, bezeichnet er einen DNA-Abschnitt, der weniger als die vollständige kodierende Region umfasst, deren Expressionsprodukt im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Wirkung wie das Expressionsprodukt der vollständigen kodierenden Region beibehält. In Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung kann die Nukleinsäure für die Expression in einer geeigneten (z. B. mikrobiellen) Wirtszelle Kodon-optimiert werden. Eine Redundanz im genetischen Code ermöglicht es, dass einige Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert werden, aber bestimmte Codons sind aufgrund der relativen Verfügbarkeit von passenden tRNAs sowie anderen Faktoren weniger „optimal“ als andere (Gustafsson u. a., 2004). Bei der Nukleinsäure kann es sich zum Beispiel um DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon handeln, entweder einzel- und / oder doppelsträngigen, oder nativen oder stabilisierten Formen von Polynukleotiden, wie zum Beispiel Polynukleotide mit einem Phosphorthioat-Rückrat und sie kann Introns enthalten oder keine Introns enthalten, solange sie Polypeptidketten kodiert.Another aspect of the present invention then relates to a nucleic acid molecule encoding a first polypeptide chain and / or a second polypeptide chain, as disclosed herein, or an expression vector comprising such a nucleic acid. The nucleic acid molecule may be a DNA . cDNA . PNA . RNA and combinations thereof. The nucleotide sequence encoding a particular peptide, oligopeptide or polypeptide may be naturally occurring or synthetically produced. In general, DNA segments encoding the peptides, polypeptides and proteins of this invention will be useful cDNA Fragments and short oligonucleotide linkers or from an oligonucleotide series to provide a synthetic gene capable of being expressed in a recombinant transcriptional unit consisting of regulatory elements derived from a microbial or viral operon. The term "expression product" refers to the polypeptide or protein which is the natural translation product of the gene and any nucleic acid sequences encoding equivalents that result from the degeneracy of the genetic code and therefore encodes the same amino acid (n ). When referring to a coding sequence, the term "fragment" refers to a segment of DNA that comprises less than the entire coding region whose expression product retains substantially the same biological function or effect as the expression product of the complete coding region. Depending on the intended use, the nucleic acid may be codon-optimized for expression in a suitable (e.g., microbial) host cell. Redundancy in the genetic code allows some amino acids to be encoded by more than one codon, but certain codons are appropriate because of the relative availability tRNAs and other factors less "optimal" than others (Gustafsson et al., 2004). The nucleic acid may be, for example DNA . cDNA . PNA . RNA or combinations thereof, either single and / or double stranded, or native or stabilized forms of polynucleotides, such as polynucleotides with a phosphorothioate backbone, and may contain introns or contain no introns as long as they encode polypeptide chains.

Die Nukleinsäure (z. B. DNA) kann dann in einer geeigneten Wirtszelle enthalten und / oder exprimiert werden, um ein Polypeptid herzustellen, das die Polypeptidkette der Erfindung umfasst. Daher kann die Nukleinsäure (z. B. DNA), welche die Polypeptidkette der Erfindung kodiert, in Übereinstimmung mit bekannten Techniken verwendet werden, die im Hinblick auf die vorliegend umfassten Lehren in geeigneter Weise modifiziert wurden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann dafür verwendet wird, eine geeignete Wirtszelle für die Expression und Produktion des Polypeptids der Erfindung, wie im Stand der Technik bekannt, zu transformieren. Die Nukleinsäure (z. B. eine DNA, oder im Falle von Retrovirusvektoren, eine RNA), welche die Polypeptidkette(n) kodiert, aus denen die Verbindung der Erfindung besteht, kann mit einer großen Vielzahl von anderen Sequenzen von Nukleinsäuren (z. B. DNA) für die Einführung in einen geeigneten Wirt verbunden werden. Die ergänzende Nukleinsäure hängt von der Natur des Wirts und der Art der Einführung der DNA in den Wirt ab und davon, ob eine episomale Instandhaltung oder Integration gewünscht wird. Im Allgemeinen wird die Nukleinsäure in einen Expressionsvektor, wie zum Beispiel ein Plasmid, mit der richtigen Orientierung und dem richtigen Leserahmen für die Expression eingeführt. Wenn nötig, kann die Nukleinsäure mit den geeigneten transkriptionellen und translationellen regulatorischen Steuerungsnukleotidsequenzen, die von dem gewünschten Wirt erkannt werden, verlinkt werden, obwohl solche Steuerungen in dem Expressionsvektor allgemein verfügbar sind. Der Vektor wird anschließend in den Wirt eingeführt, wobei Standardtechniken angewendet werden. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher wird es notwendig sein, die transformierten Wirtszellen auszuwählen. Eine Auswahltechnik beinhaltet das Einfügen einer Nukleinsäuresequenz in den Expressionsvektor mit allen notwendigen Steuerungselementen, die für eine auswählbare Eigenschaft der transformierten Zelle, wie zum Beispiel eine Antibiotikaresistenz, kodieren. Alternativ kann das Gen für solch eine auswählbare Eigenschaft ein anderer Vektor sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle gleichzeitig zu transformieren. Wirtszellen, die durch die rekombinante Nukleinsäure der Erfindung transformiert wurden, wurden anschließend für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die Fachleuten im Hinblick auf die vorliegend offenbarten Lehren bekannt sind, kultiviert, um die Expression des Polypeptids zu ermöglichen, das anschließend gewonnen werden kann. The nucleic acid (eg. DNA ) can then be contained and / or expressed in a suitable host cell to produce a polypeptide comprising the polypeptide chain of the invention. Therefore, the nucleic acid (e.g. DNA ) encoding the polypeptide chain of the invention are used in accordance with known techniques that have been appropriately modified in view of the teachings herein to construct an expression vector which is then used to generate a suitable host cell for expression and expression Production of the polypeptide of the invention as known in the art transform. The nucleic acid (eg a DNA , or in the case of retroviral vectors, a RNA ) encoding the polypeptide chain (s) of which the compound of the invention is made can be treated with a wide variety of other sequences of nucleic acids (e.g. DNA ) for introduction to a suitable host. The supplemental nucleic acid depends on the nature of the host and the mode of introduction of the host DNA into the host and whether an episomal maintenance or integration is desired. In general, the nucleic acid is introduced into an expression vector, such as a plasmid, having the correct orientation and reading frame for expression. If necessary, the nucleic acid can be linked to the appropriate transcriptional and translational regulatory control nucleotide sequences recognized by the desired host, although such controls are generally available in the expression vector. The vector is then introduced into the host using standard techniques. In general, not all hosts are transformed by the vector. Therefore, it will be necessary to select the transformed host cells. A selection technique involves inserting a nucleic acid sequence into the expression vector with all necessary control elements encoding a selectable property of the transformed cell, such as antibiotic resistance. Alternatively, the gene for such a selectable property may be another vector used to simultaneously transform the desired host cell. Host cells transformed by the recombinant nucleic acid of the invention were then cultured for a sufficient time and under appropriate conditions known to those skilled in the art in view of the teachings disclosed herein to enable expression of the polypeptide which can subsequently be recovered ,

Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (zum Beispiel E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (zum Beispiel Aspergillus spec), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen. Vorzugsweise kann das System aus Säugetierzellen wie z. B. CHO-Zellen bestehen, die bei der ATCC Cell Biology Collection erhältlich sind.Many expression systems are known, including bacteria (for example E. coli and Bacillus subtilis), yeasts (for example Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi (for example Aspergillus spec), plant cells, animal cells and insect cells. Preferably, the system may be of mammalian cells, such as e.g. For example, CHO cells available from the ATCC Cell Biology Collection.

In einer Ausführungsform stellt die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorliegend beschriebenen Moleküls bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle umfasst, die in der Lage ist, die Polypeptidkette(n) unter Bedingungen zu exprimieren, die dafür geeignet sind, die Expression dieser Kette(n) zu fördern.In one embodiment, the specification provides a method of producing a molecule as described herein, the method comprising culturing a host cell capable of expressing the polypeptide chain (s) under conditions suitable for expressing them To promote chain (s).

Unter einem Aspekt werden Nukleinsäure-kodierende Polypeptidketten, welche TCR-alpha- und / oder TCR-beta-bindende Domänen umfassen, in Expressionsvektoren geklont, wie zum Beispiel dem Gammaretrovirus oder Lentivirus, um Zellen zu erhalten, welche Moleküle der vorliegenden Beschreibung exprimieren. Unter einem anderen Aspekt werden RNAs durch im Stand der Technik bekannte Techniken synthetisiert, z. B. in vitro Transkriptionssysteme, um Zellen zu erhalten, welche Moleküle der vorliegenden Beschreibung exprimieren. Die in vitro-synthetisierten RNAs werden anschließend durch Elektroporation in geeignete Zellen eingeführt, um Polypeptidketten zu exprimieren.In one aspect, nucleic acid encoding polypeptide chains comprising TCR alpha and / or TCR beta binding domains are cloned into expression vectors, such as gammaretrovirus or lentivirus, to obtain cells expressing molecules of the present specification. In another aspect RNAs synthesized by techniques known in the art, e.g. In vitro transcription systems to obtain cells expressing molecules of the present specification. The in vitro synthesized RNAs are then electroporated into suitable cells to express polypeptide chains.

Um die Expression zu steigern, können Nukleinsäure-kodierende Ketten der vorliegenden Beschreibung operativ mit starken Promotern verlinkt werden, wie zum Beispiel retroviralen langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs), Zytomegalovirus (CMV), Mausstammzellvirus (MSCV) U3, Phosphoglyzeratkinase (PGK), β-Aktin, Ubiquitin, und einem zusammengesetzten Promoter des Affenvirus 40 (SV40) / CD43, Elongationsfaktor (EF)-1a und dem Promoter von Spleen [Milz] Focus-Forming Virus (SFFV). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor für die exprimierte Nukleinsäure heterolog. Zusätzlich zu starken Promotern können Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung zusätzliche Elemente enthalten, welche die Expression von Transgenen verstärken können, einschließlich einem zentralen Polypurintrakt (cPPT), welcher die nukleäre Translokation von lentiviralen Konstrukten fördert (Follenzi u. a., 2000) und dem posttranskriptionalen regulatorischen Element des Woodchuck Hepatitis Virus (wPRE), welches das Niveau der transgenen Expression erhöht, indem es die RNA-Stabilität erhöht (Zufferey u. a., 1999).In order to increase expression, nucleic acid coding chains of the present specification may be operatively linked to strong promoters, such as retroviral long terminal repeats ( LTRs ), Cytomegalovirus ( CMV ), Mouse strain cell virus ( MSCV ) U3 , Phosphoglycerate kinase (PGK), β-actin, ubiquitin, and a monkey virus composite promoter 40 (SV40) / CD43, elongation factor (EF) -1a and the promoter of spleen [spleen] Focus-Forming Virus (SFFV). In a preferred embodiment, the promoter is heterologous to the expressed nucleic acid. In addition to strong promoters, expression cassettes of the present invention can contain additional elements that can enhance the expression of transgenes, including a central polypurine tract (cPPT) that promotes nuclear translocation of lentiviral constructs (Follenzi et al., 2000) and the woodchuck posttranscriptional regulatory element Hepatitis virus (wPRE), which increases the level of transgenic expression by increasing RNA stability (Zufferey et al., 1999).

Die alpha- und beta-bindenden Domänen-Ketten eines Moleküls der vorliegenden Erfindung können durch Nukleinsäuren kodiert werden, die sich in separaten Vektoren befinden oder können durch Polynukleotide kodiert werden, die sich im selben Vektor befinden.The alpha and beta binding domain chains of a molecule of the present invention may be encoded by nucleic acids located in separate vectors or may be encoded by polynucleotides located in the same vector.

In einer Ausführungsform ist eine Wirtszelle dafür konstruiert worden, ein Molekül der vorliegenden Beschreibung zu exprimieren. Wirtszellen der vorliegenden Beschreibung können im Hinblick auf einen zu behandelnden Patienten allogen oder autolog sein. In one embodiment, a host cell has been designed to express a molecule of the present specification. Host cells of the present description may be allogenic or autologous with respect to a patient to be treated.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, die Nukleinsäure(n) oder den / die Expressionsvektor(en) gemäß der Erfindung oder die Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Träger(n) oder Hilfsstoff(en) umfasst. Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen Zusammensetzungen aus der Massenproduktion von Arzneimitteln, die bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen (z. B. verunreinigten oder nicht-sterilen Zusammensetzungen) nützlich sind und pharmazeutischen Zusammensetzungen (d. h. Zusammensetzungen, die für die Verabreichung an ein Subjekt oder einen Patienten geeignet sind), welche bei der Herstellung von Dosierungseinheitsformen verwendet werden können. Solche Zusammensetzungen umfassen eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge der prophylaktischen und / oder therapeutischen Polypeptidmoleküle (Wirkstoff) mit zweifacher Spezifität, die vorliegend offenbart werden oder eine Kombination des Wirkstoffs und eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Bevorzugt umfassen Zusammensetzungen der Erfindung eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge von einem oder mehreren Molekülen der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.Yet another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the double specificity polypeptide molecule according to the invention, the nucleic acid (s) or expression vector (s) according to the invention or the cell according to the present invention together with one or more a plurality of pharmaceutically acceptable carrier (s) or excipient (s). The compositions of the invention include compositions of the mass production of drugs useful in the preparation of pharmaceutical compositions (e.g., contaminated or non-sterile compositions) and pharmaceutical compositions (ie, compositions suitable for administration to a subject or a patient suitable) which can be used in the preparation of dosage unit forms. Such compositions comprise a prophylactically or therapeutically effective amount of the dual specificity prophylactic and / or therapeutic polypeptide molecules (active ingredient) disclosed herein or a combination of the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, compositions of the invention comprise a prophylactically or therapeutically effective amount of one or more molecules of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen bevorzugt die Moleküle entweder in freier Form oder als Salz. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch annehmbare Salze der Moleküle, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Triflurazetat) Salze. Es muss angemerkt werden, dass die Salze der Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung erheblich von den Molekülen in ihrem Zustand / ihren Zuständen in vivo abweichen, da die Moleküle in vivo nicht als Salze vorliegen.The pharmaceutical compositions preferably comprise the molecules either in free form or as a salt. Preferably, the salts are pharmaceutically acceptable salts of the molecules, such as chloride or acetate (trifluoroacetate) salts. It must be noted that the salts of the molecules according to the present invention deviate significantly from the molecules in their state / conditions in vivo since the molecules are not present as salts in vivo.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf ein Molekül gemäß der Erfindung, das in der Natur nicht vorkommt, welches als ein pharmazeutisch annehmbares Salz synthetisch hergestellt (z. B. synthetisiert) wurde. Verfahren für die synthetische Herstellung von Peptiden und / oder Polypeptiden sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Salze der Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich erheblich von den Molekülen in ihrem Zustand / ihren Zuständen in vivo, da die Moleküle, die erzeugt werden, in vivo nicht als Salze vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch annehmbare Salze der Moleküle. Diese Salze gemäß der Erfindung umfassen Alkali- und Erdalkalisalze, wie zum Beispiel Salze der Hofmeister-Reihe, welche folgende Anionen: PO₄ ^3-, SO₄ ^2-, CH₃COO^-, CI^-, Br^-, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^- und folgende Kationen NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ und Ba²⁺ umfassen. Insbesondere werden Salze von (NH₄)₃PO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, NH₄CH₃COO, NH₄Cl, NH₄Br, NH₄NO₃, NH₄ClO₄, NH₄I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb₄CH₃COO, Rb₄Cl, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄ClO₄, Rb₄I, Rb₄SCN, K₃PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH₃COO, KCl, KBr, KNO₃, KClO₄, Kl, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCl, NaBr, NaNO₃, NaClO₄, Nal, NaSCN, ZnCl₂ Cs₃PO₄, Cs₂HPO₄, CsH₂PO₄, Cs₂SO₄, CsCH₃COO, CsCl, CsBr, CsNO₃, CsClO₄, Csl, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, Li₂SO₄, LiCH₃COO, LiCI, LiBr, LiNO₃, LiClO₄, Lil, LiSCN, Cu₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCl₂, MgBr₂, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, MgI₂, Mg(SCN)₂, MnCl₂, Ca₃(PO₄), Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCl₂, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, CaI₂, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCl₂, BaBr₂, Ba(NO₃)₂, Ba(ClO₄)₂, BaI₂, und Ba(SCN)₂ ausgewählt. Insbesondere bevorzugt sind NH-Azetat, MgCl₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCl, NaCl und CaCl₂, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Triflurazetat) Salze.One embodiment of the present invention therefore relates to a molecule according to the invention which does not occur in nature which has been synthetically produced (e.g., synthesized) as a pharmaceutically acceptable salt. Methods for the synthetic production of peptides and / or polypeptides are well known in the art. The salts of the molecules according to the present invention differ significantly from the molecules in their state / conditions in vivo, since the molecules that are generated are not present as salts in vivo. Preferably, the salts are pharmaceutically acceptable salts of the molecules. These salts of the invention include alkali and alkaline, such as salts of the Hofmeister series, which the following anions: PO ₄ ^3-, SO ₄ ^2-, CH ₃ COO ^-, Cl ^-, Br ^-, NO ₃ ^-, ClO ₄ ^-, I ^-, SCN ^- and the following cations NH ₄ ^+, Rb ^+, K ^+, Na ^+, Cs ^+, Li ^+, Zn ^2+, Mg ^2+, Ca ^2+, Mn ^2+, Cu ^2+, and Include Ba ²⁺ . In particular, salts of (NH ₄ ) ₃ PO ₄ , (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ , (NH ₄ ) H ₂ PO ₄ , (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , NH ₄ CH ₃ COO, NH ₄ Cl, NH ₄ Br , NH ₄ NO ₃ , NH ₄ ClO ₄ , NH ₄ I, NH ₄ SCN, Rb ₃ PO ₄ , Rb ₂ HPO ₄ , RbH ₂ PO ₄ , Rb ₂ SO ₄ , Rb ₄ CH ₃ COO, Rb ₄ Cl, Rb ₄ Br, Rb ₄ NO ₃ , Rb ₄ ClO ₄ , Rb ₄ I, Rb ₄ SCN, K ₃ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , KH ₂ PO ₄ , K ₂ SO ₄ , KCH ₃ COO, KCl, KBr, KNO ₃ , KClO ₄ , KI, KSCN, Na ₃ PO ₄ , Na ₂ HPO ₄ , NaH ₂ PO ₄ , Na ₂ SO ₄ , NaCH ₃ COO, NaCl, NaBr, NaNO ₃ , NaClO ₄ , NaI, NaSCN, ZnCl ₂ Cs ₃ PO ₄ , Cs ₂ HPO ₄ , CsH ₂ PO ₄ , Cs ₂ SO ₄ , CsCH ₃ COO, CsCl, CsBr, CsNO ₃ , CsClO ₄ , CsI, CsSCN, Li ₃ PO ₄ , Li ₂ HPO ₄ , LiH ₂ PO ₄ , Li ₂ SO ₄ , LiCH ₃ COO, LiCl, LiBr, LiNO ₃ , LiClO ₄ , Lil, LiSCN, Cu ₂ SO ₄ , Mg ₃ (PO ₄ ) ₂ , Mg ₂ HPO ₄ , Mg (H ₂ PO ₄ ) ₂ , Mg ₂ SO ₄ , Mg (CH ₃ COO) ₂ , MgCl ₂ , MgBr ₂ , Mg (NO ₃ ) ₂ , Mg (ClO ₄ ) ₂ , MgI ₂ , Mg (SCN) ₂ , MnCl ₂ , Ca ₃ ( PO ₄ ), Ca ₂ HPO ₄ , Ca (H ₂ PO ₄ ) ₂ , CaSO ₄ , Ca (CH ₃ COO) ₂ , CaCl ₂ , CaBr ₂ , Ca (NO ₃ ) ₂ , Ca (ClO ₄ ) ₂ , CaI ₂ , Ca (SCN) ₂ , Ba ₃ (PO ₄ ) ₂ , Ba ₂ HPO ₄ , Ba (H ₂ PO ₄ ) ₂ , BaSO ₄ , Ba (CH ₃ COO) ₂ , BaCl ₂ , BaBr ₂ , Ba ( NO ₃ ) ₂ , Ba (ClO ₄ ) ₂ , BaI ₂ , and Ba (SCN) ₂ . Particularly preferred are NH acetate, MgCl ₂ , KH ₂ PO ₄ , Na ₂ SO ₄ , KCl, NaCl and CaCl ₂ , such as chloride or acetate (trifluoroacetate) salts.

Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Polypeptidmolekül der Erfindung mit zweifacher Spezifität und einen therapeutischen Antikörper (z. B. einen tumorspezifischen monoklonalen Antikörper), der für ein bestimmtes Krebsantigen spezifisch ist und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.The invention also encompasses pharmaceutical compositions comprising a polypeptide molecule of the invention having dual specificity and a therapeutic antibody (eg, a tumor-specific monoclonal antibody) specific for a particular cancer antigen and a pharmaceutically acceptable carrier.

In einer spezifischen Ausführungsform bedeutet der Begriff „pharmazeutisch annehmbar“, dass der pharmazeutisch annehmbare Gegenstand von einer Behörde der Regierung des Bundesstaats oder Staats zugelassen wurde oder in dem U.S. Arzneibuch oder einem anderen allgemein anerkannten Arzneibuch zur Verwendung in Tieren oder speziell bei Menschen gelistet ist. Der Begriff „Träger“ bezieht sich auf einen verdünnenden Hilfsstoff oder ein Vehikel, mit welchem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten wie zum Beispiel Wasser und Öle, einschließlich Ölen von mineralischem, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung wie zum Beispiel Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und Ähnliche sein. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerollösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe umfassen Stärke, Glukose, Laktose, Sucrose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Siliziumgel, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Talk, Natriumchlorid, Natriumphosphat, Natriumazetat, L-Histidin, getrocknete Magermilch, Glycerol, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und Ähnliches. Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, ebenfalls kleinere Mengen von Benetzungsmitteln oder Emulgatoren oder pH-puffernden Mitteln enthalten. Diese Zusammensetzungen können in der Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung und Ähnlichem vorliegen. Allgemein werden die Bestandteile von Zusammensetzungen der Erfindung entweder separat zugegeben oder in Dosierungseinheitsform zusammengemischt, zum Beispiel als ein trocken lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch versiegelten Behälter wie zum Beispiel einer Ampulle oder einem Sachet, auf welchen die Menge des Wirkstoffs angegeben ist. Wenn die Zusammensetzung mittels einer Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche ausgegeben werden, welche steriles Wasser oder sterile Salzlösung pharmazeutischer Qualität enthält. Wenn die Zusammensetzung mittels einer Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser oder Salzlösung für die Injektion bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor dem Verabreichen gemischt werden können.In a specific embodiment, the term "pharmaceutically acceptable" means that the pharmaceutically acceptable article has been approved by a state or state government agency or is listed in the US Pharmacopoeia or other generally accepted pharmacopoeia for use in animals or specifically in humans. The term "carrier" refers to a diluent excipient or vehicle with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids such as water and oils, including oils of mineral, animal, vegetable or synthetic origin such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, especially for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, lime, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, sodium phosphate, sodium acetate, L-histidine, dried skimmed milk, glycerol, propylene, glycol, water , Ethanol and the like. If desired, the composition may also contain minor amounts of wetting or emulsifying or pH buffering agents. These compositions may be in the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations, and the like. Generally, the ingredients of compositions of the invention are either added separately or mixed together in dosage unit form, for example as a dry lyophilized powder or anhydrous concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet, on which the amount of active ingredient is indicated. If the composition is to be infused, it may be dispensed with an infusion bottle containing sterile water or pharmaceutical grade sterile saline. When the composition is administered by injection, a vial of sterile water or saline may be provided for injection so that the components may be mixed prior to administration.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich dann auf das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor gemäß der Erfindung, die Zelle gemäß der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur medizinischen Verwendung. Im Allgemeinen hängt die Verwendung des Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität von dem medizinischen Hintergrund des Peptid-Antigens / der Peptid-Antigene ab, das / die durch dieses Molekül erkannt werden, wie dies auch im Folgenden weiter beschrieben wird.Another aspect of the present invention then relates to the polypeptide molecule of dual specificity according to the invention, the nucleic acid or expression vector according to the invention, the cell according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention for medical use. In general, the use of the double specificity polypeptide molecule will depend on the medical background of the peptide antigen (s) recognized by that molecule, as further described below.

Bevorzugt wird das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor gemäß der Erfindung oder die Zelle gemäß der Erfindung oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit oder Störung, die unter immunologischen Störungen, Infektionskrankheiten, Vergiftung und Krebserkrankungen ausgewählt wird, einschließlich der Behandlung oder Vorbeugung einer Vielzahl von Krebserkrankungen oder anderen anormalen proliferativen Erkrankungen, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) folgende Erkrankungen: Karzinom, einschließlich der Harnblase, Brust, des Darms, der Niere, Leber, Lunge, Eierstöcke, Bauchspeicheldrüse, des Magens, der Prostata, des Gebärmutterhalses, der Schilddrüse und Haut, einschließlich Plattenepithelkarzinom, hämatopoetischen Tumoren lymphoider Abstammung, einschließlich Leukämie, akute lymphozytische Leukämie, akute lymphoblastische Leukämie, B-Zell-Lymphom, T-Zell-Lymphom, Burketts Lymphom, hämatopoetischen Tumoren myeloider Abstammung, einschließlich akuter und chronischer myeloischer Leukämie und Promyelozytenleukämie, Tumoren mesenchymalen Ursprungs, einschließlich Fibrosarkom und Rhabdomyosarkom, anderen Tumoren einschließlich Melanom, Seminom, Teratokarzinom, Neuroblastom und Gliom, Tumoren des zentralen und peripheren Nervensystems, einschließlich Astrozytom, Neuroblastom, Gliom, Schwannomen und Osteosarkom; und anderen Tumoren, einschließlich Melanom, Xenoderma pigmentosum, Keratoakanthom, Seminom, Schilddrüsenkarzinom und Teratokarzinom. Zusätzliche Krebserkrankungen können follikuläres Lymphom, Karzinome mit p53 Mutationen, hormonabhängige Tumoren der Brust, Prostata und Eierstöcke und prekanzeröse Läsionen wie zum Beispiel familiäre adenomatöse Polyposis und myelodysplastische Syndrome umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. In spezifischen Ausführungsformen werden Änderungen bei der Malignität oder dysproliferative Änderungen (wie zum Beispiel Metaplasie und Dysplasie) oder hyperproliferative Krankheiten durch die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung in den Eierstöcken, der Harnblase, der Brust, des Darms, der Lunge, der Haut, der Bauchspeicheldrüse oder des Uterus behandelt oder verhindert. In anderen spezifischen Ausführungsformen wird Sarkom, Melanom oder Leukämie mit den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung behandelt.Preferred is the polypeptide molecule of dual specificity according to the invention, the nucleic acid or expression vector according to the invention or the cell according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention for use in the treatment or prevention of a disease or disorder resulting from immunological disorders, infectious diseases , Intoxication and cancers, including the treatment or prevention of a variety of cancers or other abnormal proliferative disorders, including (but not limited to) the following diseases: carcinoma, including the bladder, breast, bowel, kidney, liver, lung, Ovaries, pancreas, stomach, prostate, cervix, thyroid and skin, including squamous cell carcinoma, hematopoietic tumors of lymphoid lineage, including leukemia, acute lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, B-cell lymphoma, T-cell lymphoma, Burkett's lymphoma, hematopoietic tumors of myeloid lineage, including acute and chronic myelogenous leukemia and promyelocytic leukemia, tumors of mesenchymal origin, including fibrosarcoma and rhabdomyosarcoma, other tumors including melanoma, seminoma, teratocarcinoma, Neuroblastoma and glioma, tumors of the central and peripheral nervous system, including astrocytoma, neuroblastoma, glioma, schwannomas and osteosarcoma; and other tumors, including melanoma, xenoderma pigmentosum, keratoacanthoma, seminoma, thyroid carcinoma and teratocarcinoma. Additional cancers include, but are not limited to, follicular lymphoma, p53 mutant carcinomas, breast hormone-dependent tumors, prostate and ovaries, and precancerous lesions such as familial adenomatous polyposis and myelodysplastic syndromes. In specific embodiments, changes in malignancy or dysproliferative changes (such as metaplasia and dysplasia) or hyperproliferative diseases are presented by the methods and compositions of the invention in the ovaries, bladder, breast, intestine, lung, skin, pancreas or the uterus treated or prevented. In other specific embodiments, sarcoma, melanoma or leukemia are treated with the methods and compositions of the invention.

Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Verhindern, Behandeln oder der Linderung von einem oder mehreren Symptomen, die mit einer entzündlichen Erkrankung eines Subjekts verbunden sind, zur Verfügung, weiterhin umfassend das Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines oder mehrerer entzündungshemmender Wirkstoffe gemäß der Erfindung an das Subjekt. Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Verhindern, Behandeln oder Linderung von einem oder mehreren Symptomen, die mit einer Autoimmunerkrankung verbunden sind, zur Verfügung, weiterhin umfassend das Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines oder mehrerer immunmodulierenden Wirkstoffe gemäß der Erfindung an das Subjekt. Infektionskrankheiten, die mit den Molekülen der Erfindung behandelt oder verhindert werden können, werden durch Infektionserreger hervorgerufen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Viren, Bakterien, Fungi, Protozoen und Viren. Viruserkrankungen, die unter Verwendung der Moleküle der Erfindung zusammen mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Viruserkrankungen, die durch Hepatitis Typ A, Hepatitis Typ B, Hepatitis Typ C, Grippe, Varicella, Adenovirus, Herpes simplex Typ I (HSV-I), Herpes simplex Typ II (HSV-II), Rinderpest, Rhinovirus, Echovirus, Rotavirus, Respiratorisches Synzytial Virus, Papilloma Virus, Papovavirus, Zytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Hantavirus, Coxsackievirus, Mumpsvirus, Masernvirus, Rötelnvirus, Poliovirus, Pocken, Epstein Barr Virus, humanes Immunschwächevirus Typ I (HIV-I), humanes Immunschwächevirus Typ II (HIV-II), und Erreger von Viruserkrankungen, wie zum Beispiel virale Meningitis, Enzephalitis, Denguefieber oder Pocken hervorgerufen werden.The invention also provides methods for preventing, treating or alleviating one or more symptoms associated with an inflammatory disease of a subject, further comprising administering a therapeutically or prophylactically effective amount of one or more anti-inflammatory agents according to the invention the subject. The invention also provides methods of preventing, treating or ameliorating one or more symptoms associated with an autoimmune disease, further comprising administering to the subject a therapeutically or prophylactically effective amount of one or more immunomodulating agents according to the invention. Infectious diseases that can be treated or prevented with the molecules of the invention are caused by infectious agents, including, but not limited to, viruses, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Viral diseases that can be treated or prevented using the molecules of the invention in conjunction with the methods of the present invention include, but are not limited to, viral diseases characterized by hepatitis type A, type B hepatitis, Type C hepatitis, influenza, varicella, adenovirus, herpes simplex type I (HSV-I), herpes simplex type II (HSV-II), rinderpest, rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus, papilloma virus, papovavirus, cytomegalovirus, echinovirus , Arbovirus, hantavirus, coxsackievirus, mumps virus, measles virus, rubella virus, poliovirus, smallpox, Epstein Barr virus, human immunodeficiency virus type I (HIV-I), human immunodeficiency virus type II (HIV-II), and viral pathogens such as viral Meningitis, encephalitis, dengue or smallpox.

Bakterielle Krankheiten, die unter Verwendung der Moleküle der Erfindung zusammen mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden können, die durch Bakterien verursacht werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria, Streptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi (Borreliose), Bacillus antracis (Anthrax), Tetanus, Streptococcus, Staphylococcus, Mycobacterium, Tetanus, Pertussis, Cholera, Pest, Diphtherie, Chlamydien, S. aureus und Legionellen.Bacterial diseases that can be treated or prevented using the molecules of the invention in association with the methods of the present invention caused by bacteria include, but are not limited to, Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria, Streptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi (Lyme disease ), Bacillus antracis (anthrax), tetanus, streptococcus, staphylococcus, mycobacterium, tetanus, pertussis, cholera, plague, diphtheria, chlamydia, S. aureus and legionella.

Protozoenerkrankungen, die unter Verwendung der Moleküle der Erfindung zusammen mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden können, die durch Protozoen verursacht werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Leishmaniose; Kokzidioa, Trypanosoma oder Malaria. Parasitäre Krankheiten, die unter Verwendung der Moleküle der Erfindung zusammen mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden können, die durch Parasiten verursacht werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Chlamydien und Rickettsia.Protozoal diseases which can be treated or prevented using the molecules of the invention together with the methods of the present invention caused by protozoa include, but are not limited to, leishmaniasis; Coccidioa, Trypanosoma or malaria. Parasitic diseases that can be treated or prevented using the molecules of the invention in conjunction with the methods of the present invention caused by parasites include, but are not limited to, chlamydia and rickettsia.

Beispiele für infektiöse Erreger und Infektionskrankheiten umfassen, aber sind nicht beschränkt auf Bakterien (z. B. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans und Pseudomonas aeruginosa), ein Pathogen (z. B. Blymphotrophisches Papovavirus (LPV); Bordetella pertussis; Borna Disease Virus (BDV); Bovines Coronavirus; Choriomeningitis Virus; Dengue Virus; a Virus, E. coli; Ebola; Echovirus 1; Echovirus-11 (EV); Endotoxin (LPS); Enterobakterien; Entero Orphan Virus; Enteroviren; Katzenleukämievirus; Maul-und-Klauenseuche-Virus; Gibbonaffenleukämievirus (GALV); Gram-negative Bakterien; Helicobacter pylorii; Hepatitis-B-Virus (HBV); Herpes Simplex Virus; HIV-I; humanes Zytomegalovirus; humanes Coronavirus; Influenza A, B und C; Legionella; Leishmania mexicana; Listeria monocytogenes; Masernvirus; Meningococcus; Morbilliviren; murines Hepatitis-Virus; murines Leukämie-Virus; murines Gamma-Herpesvirus; murines Retrovirus; murines Coronavirus murines Hepatitis-Virus; Mycobacterium avium-M; Neisseria gonorrhoeae; Newcastle Disease Virus; Parvovirus B 19; Plasmodium falciparum; Pockenvirus; Pseudomonas; Rotavirus; Salmonella typhiurium; Shigella; Streptococci; T-Zelllymphotropisches Virus 1; Vacciniavirus).Examples of infectious agents and infectious diseases include, but are not limited to, bacteria (e.g., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans and Pseudomonas aeruginosa), a pathogen (e.g. Blymphotrophic papovavirus (LPV); Bordetella pertussis; Borna disease virus (BDV); Bovine coronavirus; Choriomeningitis virus; Dengue virus; a Virus, E. coli; Ebola; Echovirus 1; Echovirus-11 (EV); Endotoxin (LPS); Enterobacteria; entero-orphan virus; enterovirus; feline leukemia virus; foot-and-mouth disease virus; gibbon monkey leukemia virus (GALV); gram-negative bacteria; helicobacter pylorii; hepatitis B virus (HBV); herpes simplex virus; HIV-I; human cytomegalovirus human coronavirus; influenza A, B and C; Legionella; Leishmania mexicana; Listeria monocytogenes; measles virus; meningococcus; morbillivirus; murine hepatitis virus; murine leukemia virus; murine G amma-herpesvirus; murine retrovirus; murine coronavirus murine hepatitis virus; Mycobacterium avium-M; Neisseria gonorrhoeae; Newcastle Disease Virus; Parvovirus B 19; Plasmodium falciparum; Smallpox virus; Pseudomonas; rotavirus; Salmonella typhiurium; Shigella; Streptococci; T cell lymphocyte virus 1; Vaccinia virus).

Unter noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, welche das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Moleküls mit zweifacher Spezifität gemäß der Erfindung, der Nukleinsäure oder des Expressionsvektors gemäß der Erfindung, der Zelle gemäß der Erfindung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst.In yet another aspect of the present invention, the invention relates to a method of treating a disease or disorder comprising administering a therapeutically effective amount of the dual specificity molecule according to the invention, the nucleic acid or the expression vector according to the invention to the cell according to of the invention or the pharmaceutical composition according to the invention.

Das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität kann in einem Verfahren für das Verhindern oder Behandeln einer Krankheit oder eines Zustands verwendet werden, die / der durch das Verabreichen des Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität verbessert wird. Solche Behandlungen können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Hilfsstoffen bereitgestellt werden. Therapeutische Polypeptidmoleküle mit zweifacher Spezifität werden für gewöhnlich als ein Teil einer sterilen pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die normalerweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen wird. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann in jeder geeigneten Form vorliegen (in Abhängigkeit von dem gewünschten Verfahren ihrer Verabreichung an einen Patienten). Es kann in Dosierungseinheitsform bereitgestellt werden und wird im Allgemeinen in einem versiegelten Behälter bereitgestellt und kann als Teil eines Kits bereitgestellt werden. Dieser Kit würde normalerweise (aber nicht notwendigerweise) Gebrauchsanweisungen umfassen. Er kann eine Vielzahl dieser Dosierungseinheitsformen enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auf jede geeignete Weise an das Verabreichen angepasst werden, wie zum Beispiel auf parenteralem (einschließlich subkutanem, intramuskulärem oder intravenösem) Weg. Diese Zusammensetzungen können durch jedes im Stand der Technik auf dem Gebiet der Pharmazie bekannte Verfahren hergestellt werden, indem der Wirkstoff mit dem / den Träger(n) oder Hilfsstoff(en) unter sterilen Bedingungen gemischt wird.The dual specificity polypeptide molecule can be used in a method for preventing or treating a disease or condition that is enhanced by administering the polypeptide molecule having dual specificity. Such treatments may be provided in a pharmaceutical composition together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients. Therapeutic polypeptide molecules having dual specificity are usually provided as part of a sterile pharmaceutical composition which will normally comprise a pharmaceutically acceptable carrier. This pharmaceutical composition may be in any suitable form (depending on the desired method of administration to a patient). It may be provided in unit dosage form and is generally provided in a sealed container and may be provided as part of a kit. This kit would normally (but not necessarily) include instructions for use. It may contain a variety of these dosage unit forms. The pharmaceutical composition may be adapted for administration in any suitable manner, such as parenteral (including subcutaneous, intramuscular or intravenous) routes. These compositions may be prepared by any method known in the art in the pharmaceutical arts by mixing the active ingredient with the carrier (s) or excipient (s) under sterile conditions.

Dosierungen der Polypeptidmoleküle mit zweifacher Spezifität der vorliegenden Erfindung können innerhalb eines weiten Bereichs variieren, in Abhängigkeit von der zu behandelnden Erkrankung oder Störung, dem Alter und dem Zustand des Individuums, das behandelt werden soll, etc. zum Beispiel kann ein geeigneter Dosierungsbereich für ein Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität zwischen 25 ng/kg und 50 µg/kg liegen. Ein Arzt wird schließlich die geeigneten zu verabreichenden Dosierungen bestimmen.Doses of the dual specificity polypeptide molecules of the present invention may vary within a wide range, depending on the disease or disorder to be treated, For example, the age and condition of the subject to be treated, etc., for example, a suitable dosage range for a polypeptide molecule with dual specificity may be between 25 ng / kg and 50 μg / kg. A doctor will eventually determine the appropriate dosages to administer.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, Vektoren, Nukleinsäuren und Zellen der Erfindung können in einer im Wesentlichen reinen Form bereitgestellt werden, zum Beispiel mit einer Reinheit von mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% oder 100%.Pharmaceutical compositions, vectors, nucleic acids and cells of the invention may be provided in a substantially pure form, for example having a purity of at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100%.

Bevorzugte Merkmale von jedem Aspekt der Erfindung gelten mutatis mutandis für jeden anderen Aspekt. Die vorliegend erwähnten Druckschriften werden in vollem Maße, soweit dies gesetzlich erlaubt ist, einbezogen. Obwohl die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile im Einzelnen beschrieben wurden, sollte klargestellt werden, dass verschiedene Änderungen, Ersetzungen und Veränderungen vorliegend vorgenommen werden können, ohne von dem Geist und dem Umfang der in den angehängten Ansprüchen definierten Erfindung abzuweichen. Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, die nur zum Zweck der Veranschaulichung bereitgestellt werden und nicht dafür bestimmt sind, die Erfindung auf irgendeine Art und Weise zu beschränken.Preferred features of each aspect of the invention apply mutatis mutandis to any other aspect. The documents mentioned herein are fully incorporated, to the extent permitted by law. Although the present invention and its advantages have been described in detail, it should be understood that various changes, substitutions and alterations can be made herein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. The present invention will be further described in the following examples, which are provided for the purpose of illustration only and are not intended to limit the invention in any way.

zeigt einen schematischen Überblick über eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dem humanen IgG1 Fc-enthaltenden Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität. VD1, VD2 = variable Domänen, die von Antikörpern stammen; VR1, VR2 = variable Domänen, die von TCR stammen; Link1, Link2 = verbindenden Linkern; Cys-Cys = Cysteinbrücken. shows a schematic overview of a preferred embodiment of the present invention, the human IgG1 Fc -containing polypeptide molecule having dual specificity. VD1 . VD2 = variable domains derived from antibodies; VR1 . VR2 = variable domains of TCR come; link1 . Link2 = connecting linkers; Cys-Cys = Cysteine bridges.

zeigt einen schematischen Überblick über 4 verschiedene Konstrukte von IgG Fc-enthaltenden Polypeptidmolekülen mit zweifacher Spezifität, die vor dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung untersucht wurden. Schwarz = variable Domänen, die von TCR stammen; hellgrau = variable Domänen, die von Antikörpern stammen; weiß = konstante Domänen, die von humanem IgG stammen. Knob-hole-Mutationen werden durch einen Zylinder aufgezeigt. Die Diabody-Moleküle IA-ID stimmen mit der Erfindung überein. shows a schematic overview of 4 different constructs of IgG Double-specificity Fc-containing polypeptide molecules that have been studied in the background of the present invention. Black = variable domains of TCR come; light gray = variable domains derived from antibodies; white = constant domains of human IgG come. Knob-hole mutations are indicated by a cylinder. The diabody molecules IA - ID agree with the invention.

zeigt die HPLC-SEC-Analyse von verschiedenen bispezifischen TCR / mAb Molekülen mit einer molekularen Struktur gemäß den in gezeigten Konstrukten, welche in einem 2-Säulen-Aufreinigungsvorgang aufgereinigt wurden. Die in den verschiedenen Molekülen enthaltenen Monomere wurden wie folgt bestimmt. II: 93.84%; III: 96.54%; IV: 98.49%; IA_1: 95.48%; IA_3: 98.45%; ID_1: 95.75%; IC_4: 95.22%; IC_5: 92.76%; ID_4: 99.31%; ID_5: 99.44%. shows the HPLC SEC analysis of various bispecific TCR / mAb Molecules with a molecular structure according to the in shown constructs, which were purified in a 2-column purification process. The monomers contained in the different molecules were determined as follows. II: 93.84%; III: 96.54%; IV: 98.49%; IA_1: 95.48%; IA_3: 98.45%; ID_1: 95.75%; IC_4: 95.22%; IC_5: 92.76%; ID_4: 99.31%; ID_5: 99.44%.

zeigt die Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays mit unterschiedlichen bispezifischen TCR / mAb Konstrukten (wie in gezeigt), die als auf IgG4 basierende Moleküle hergestellt wurden. Jurkat_NFATRE_Iuc2 Zellen wurden gleichzeitig mit HIV-Peptid SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) beladene T2 Zellen in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von bispezifischen TCR (bssTCR) Molekülen inkubiert. Das bispezifische TCR / mAb Diabody-Molekül IA-IgG4 zeigte eine größere Wirksamkeit als zwei alternative TCR / mAb Moleküle mit zweifacher Spezifität. shows the results of the efficacy assay with different bispecific TCR / mAb constructs (as in shown) as on IgG4 based molecules were produced. Jurkat_NFATRE_Iuc2 cells were co-infected with HIV peptide SLYNTVATL (SEQ ID NO: 7) T2 cells in the presence of increasing concentrations of bispecific TCR (bssTCR) molecules incubated. The bispecific TCR / mAb diabody molecule IA-IgG4 showed greater efficacy than two alternative TCR / mAb molecules with dual specificity.

zeigt die Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays mit unterschiedlichen bispezifischen TCR / mAb Konstrukten (wie in gezeigt), die als auf IgG1 basierende Moleküle hergestellt wurden. Jurkat_NFATRE_Iuc2 Zellen wurden gleichzeitig mit HIV-Peptid SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) beladene T2 Zellen in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von bispezifischen TCR (bssTCR) Molekülen inkubiert. Die bispezifischen TCR / mAb Diabody-Moleküle ID_1, IA_3 und IA1 zeigten eine deutlich größere Wirksamkeit als drei alternative TCR / mAb Moleküle mit zweifacher Spezifität. shows the results of the efficacy assay with different bispecific TCR / mAb constructs (as in shown) as on IgG1 based molecules were produced. Jurkat_NFATRE_Iuc2 cells were co-infected with HIV peptide SLYNTVATL (SEQ ID NO: 7) T2 cells in the presence of increasing concentrations of bispecific TCR (bssTCR) molecules incubated. The bispecific TCR / mAb Diabody molecules ID_1 . IA_3 and IA1 showed a much greater effectiveness than three alternative TCR / mAb molecules with dual specificity.

zeigt die Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays, der mit unterschiedlichen, auf IgG1 basierenden Molekülen mit bispezifischen TCR / mAb Konstrukten (wie in gezeigt), durchgeführt wurde, wobei verschiedene variable AntikörperDomänen verwendet wurden, die beide auf den TCR-CD3-Komplex abzielen. Konstrukt ID_1 umfasst variable Domänen von dem auf CD3 abzielenden Antikörper UCHT1(V9), während die Konstrukte ID_4 und ID_5 variable Domänen des alpha / beta TCR-spezifischen Antikörpers BMA031 umfassen. Jurkat_NFATRE_Iuc2 Zellen wurden gleichzeitig mit HIV-Peptid SLYNTVATL (SEQ ID No. 7) beladenen T2 Zellen in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von bispezifischen TCR (bssTCR) Molekülen inkubiert. shows the results of the efficacy assay, with different, on IgG1 based molecules with bispecific TCR / mAb constructs (as in shown), using different variable antibody domains, both of which are based on the TCR - CD3 Target complex. construct ID_1 comprises variable domains from that CD3 targeted antibody UCHT1 (V9), while the constructs ID_4 and ID_5 variable domains of alpha / beta TCR specific antibody BMA031. Jurkat_NFATRE_Iuc2 cells were co-infected with HIV-peptide SLYNTVATL (SEQ ID NO 7) T2 cells in the presence of increasing concentrations of bispecific TCR (bssTCR) molecules incubated.

zeigt einen schematischen Überblick über die möglichen Orientierungen der VD- und VR-Domänen in den Molekülen der vorliegenden Erfindung. VH: von Antikörpern stammende VH-Domäne, VL: von Antikörpern stammende VL-Domäne, Va: von TCR stammendes Valpha; Vβ: von TCR abgeleitetes Vbeta. Figure 4 shows a schematic overview of the possible orientations of the VD and VR domains in the molecules of the present invention. VH: antibody-derived VH domain, VL: antibody-derived VL domain, Va: von TCR native Valpha; Vβ: from TCR derived Vbeta.

zeigt die Ergebnisse der HPLC-SEC-Analyse von Aggregaten (HMWS-hochmolekulare Spezies) innerhalb von verschiedenen bispezifischen, auf IgG1 basierenden TCR / mAb Molekülen. Aggregate wurden nach der Aufreinigung und Lagerung der Moleküle bei 40°C für jeweils 1 Woche und 2 Wochen analysiert. shows the results of HPLC-SEC analysis of aggregates (HMWS high molecular weight species) within different bispecific IgG1 based TCR / mAb molecules. Aggregates were analyzed after purification and storage of the molecules at 40 ° C for 1 week and 2 weeks, respectively.

zeigt die Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays, der mit verschiedenen bispezifischen, auf IgG1 basierenden TCR / mAb Molekülen durchgeführt wurde. Die Wirksamkeit wurde nach der Aufreinigung und Lagerung der Moleküle bei 40°C für jeweils 1 Woche und 2 Wochen analysiert. Die Lagerung bei 40°C unter Belastung führte nicht zu einem erheblichen Verlust der Wirksamkeit der Moleküle, aber ein drastischer Anstieg der unspezifischen (d. h. Ziel-unabhängigen) Aktivierung von Jurkat T-Zellen wurde für die Moleküle III und IV entdeckt. shows the results of the efficacy assay involving different bispecific IgG1 based TCR / mAb molecules was performed. The efficacy was analyzed after purification and storage of the molecules at 40 ° C for 1 week and 2 weeks, respectively. Storage at 40 ° C under load did not result in significant loss of efficacy of the molecules, but a dramatic increase in nonspecific (ie, target-independent) activation of Jurkat T cells was detected for molecules III and IV.

BEISPIELEEXAMPLES

BEISPIEL 1EXAMPLE 1

Struktur von Fc-enthaltenden, bispezifischen TCR / mAb Diabodies und Steuerungsmolekülen.Structure of Fc-containing bispecific TCR / mAb diabodies and control molecules.

Fc-enthaltende, bispezifische TCR / mAb Diakörper und Steuerungsmoleküle (wie in ) wurden hergestellt, um spezifisch an den humanen TCR-CD3-Komplex und an den Peptid:MHC-Komplex zu binden, welcher das von HIV stammende Peptid SLYNTVATL, das an HLA-A2*01 gebunden ist, umfasst. Um auf den TCR-CD3-Komplex abzuzielen, wurden VH und VL-Domänen, die von dem CD3-spezifischen humanisierten Antikörper hUCHT1(V9) stammen, der durch Zhu u. a. beschrieben wird (Identification of heavy chain residues in a humanized anti-CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation. J Immunol, 1995, 155, 1903-1910 ) oder VH- und VL-Domänen, die von dem alpha / beta TCR-spezifischen Antikörper BMA031, der in Shearman u. a. beschrieben wird, stammen ( Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha/beta T cell receptor. J Immunol, 1991, 147, 4366-73 ) und in der humanisierten Version Variante 10 eingesetzt werden (firmenintern erzeugte Daten), verwendet Um den Peptid:MHC-Komplex zu adressieren, wurden Valpha- und Vbeta-Domänen der vorstehend beschriebenen Stabilität und der affinitätsgereifte, humane, einzelkettige T-Zell-Rezeptor 868Z11, der von Aggen u. a. offenbart wurde ( Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors. PEDS, 2011, 24, 361 - 372 ), verwendet.Fc-containing, bispecific TCR / mAb Diabodies and Control Molecules (as in ) were prepared to be specific to the human TCR - CD3 Complex and to the peptide: to bind MHC complex, which is that of HIV derived peptide SLYNTVATL linked to HLA-A2 * 01. To be on the TCR - CD3 Complex, VH and VL domains derived from the CD3 HUCHT1 (V9) -specific humanized antibody described by Zhu et al. (Identification of heavy chain residues in a humanized antibody). CD3 antibody important for efficient antigen binding and T cell activation. J Immunol, 1995, 155, 1903-1910 ) or VH and VL domains derived from the alpha / beta TCR-specific antibody BMA031 described in Shearman et al. ( Construction, expression and characterization of humanized antibodies directed against the human alpha / beta T cell receptor. J Immunol, 1991, 147, 4366-73 ) and in the humanized version variant 10 (In-house generated data) used To address the peptide: MHC complex, Valpha and Vbeta domains of the stability described above and the affinity matured human single-chain T cell receptor 868Z11 disclosed by Aggen et al ( Identification and engineering of human variable regions that allow expression of stable single-chain T cell receptors. PEDS, 2011, 24, 361-372 ).

Im Falle von Fc-enthaltenden, bispezifischen TCR / mAb Diabodies DNA-Sequenzen, die für verschiedene Kombinationen von VH und VL kodieren (die jeweils VD1 und VD2 entsprechen) und Va und Vb (die jeweils VR1 und VR2 entsprechen), sowie die Kodierung für die Linker Link1 und Link2 wurden durch Gensynthese erhalten. Resultierende DNA-Sequenzen wurden in Expressionsvektoren, die für die Gelenkregion kodieren, rastermäßig geklont, die CH2- und CH3-Domäne stammt jeweils von humanem IgG4 [Eintragungsnummer: K01316] und IgG1 [Eintragungsnummer: P01857] und wurden weiter manipuliert. Die Manipulation wurde ausgeführt, um Knob-into-hole Mutationen in CH3-Domänen mit und ohne zusätzliche Stabilisierung durch Disulfidbindungen zwischen den Ketten einzufügen, um eine N-Glykosilierungsstelle in CH2 (z. B. N297Q Mutation) zu entfernen, um Fc-Abschaltungsmutationen einzuführen, um jeweils in VL und VH eine Stabilisierung durch zusätzliche Disulfidbindungen einzuführen gemäß den durch Reiter u. a. beschriebenen Verfahren ( Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451 - 5459 ). Ein Überblick über hergestellte bispezifische TCR / mAb Diabodies, den Varianten sowie den entsprechenden Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1 Überblick über alle erzeugten und überprüften Fc-enthaltenden, bispezifischen TCR / mAb Diabodies: KiH: Knob-into-hole; K / O: Fc-abgeschaltet; KiH-ds: Knob-into-hole stabilisiert mit künstlichen Disulfidbindungen, um CH3:CH3' zu verbinden; ds-hUCHT1(V9): durch Disulfidbindung stabilisierte hUCHT1(V9) variable Domänen; Link1: Linker, der VR1 und VD1 verbindet. Molekül TCR mAb SEQ Ids Modifikationen IA-IgG4 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 8 IgG4 (KiH) SEQ ID No. 9 IA_1 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 10 IgG1 (K/O, KiH) SEQ ID No. 11 IA_2 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 12 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 13 IA_3 868Z11 ds-hUCHT1(V9) SEQ ID No. 14 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 15 ID_1 868Z11 ds-hUCHT1(V9) SEQ ID No. 16 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 17 IC_4 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID No. 18 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 19 IC_5 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID No. 20 IgG1 (K/O, KiH-ds) erweiterter Link1 SEQ ID No. 21 ID_4 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID No. 22 IgG1 (K/O, KiH-ds) SEQ ID No. 23 ID_5 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID No. 24 IgG1 (K/O, KiH-ds) erweiterter Link1 SEQ ID No. 25 In the case of Fc-containing, bispecific TCR / mAb Diabodies DNA sequences encoding various combinations of VH and VL (the respective VD1 and VD2 correspond) and Va and Vb (each VR1 and VR2 correspond), as well as the coding for the linker link1 and Link2 were obtained by gene synthesis. resulting DNA Sequences were cloned in expression vectors encoding the hinge region, the CH2 and CH3 domain are each from human IgG4 [Registration number: K01316] and IgG1 [Registration Number: P01857] and have been further manipulated. The manipulation was performed to insert knob-in-hole mutations in CH3 domains with and without additional stabilization by disulfide bonds between the chains to form an N-glycosylation site in CH2 (e.g., N297Q mutation) to introduce Fc cut-off mutations to introduce VL and VH stabilization by additional disulfide bonds, respectively, according to the methods described by Reiter et al. Stabilization of the Fv Fragments in Recombinant Immunotoxins by Disulfide Bonds Engineered into Conserved Framework Regions. Biochemistry, 1994, 33, 5451-5459 ). An overview of manufactured bispecific TCR / mAb Diabodies, the variants and the corresponding sequences are listed in Table 1. Table 1 Overview of all generated and verified Fc-containing bispecific TCR / mAb diabodies: KiH: Knob-into-hole; K / O: Fc-off; KiH-ds: Knob-into-hole stabilized with synthetic disulfide bonds to connect CH3: CH3 '; ds-HUCHT1 (V9): disulfide-bond-stabilized hUCHT1 (V9) variable domains; Link1: Linker connecting VR1 and VD1. molecule TCR mAb SEQ IDs modifications IA-IgG4 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 8th IgG4 (KiH) SEQ ID no. 9 IA_1 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 10 IgG1 (K / O, KiH) SEQ ID no. 11 IA_2 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 12 IgG1 (K / O, KiH-ds) SEQ ID no. 13 IA_3 868Z11 ds-hUCHT1 (V9) SEQ ID no. 14 IgG1 (K / O, KiH-ds) SEQ ID no. 15 ID_1 868Z11 ds-hUCHT1 (V9) SEQ ID no. 16 IgG1 (K / O, KiH-ds) SEQ ID no. 17 IC_4 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID no. 18 IgG1 (K / O, KiH-ds) SEQ ID no. 19 IC_5 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID no. 20 IgG1 (K / O, KiH-ds) extended link1 SEQ ID no. 21 ID_4 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID no. 22 IgG1 (K / O, KiH-ds) SEQ ID no. 23 ID_5 868Z11 hBMA031 (var1 0) SEQ ID no. 24 IgG1 (K / O, KiH-ds) extended link1 SEQ ID no. 25

Verschiedene Steuerungsmoleküle, welche dieselben Spezifitäten zeigen, wurden konstruiert, Tabelle 2, wobei diese VH, VL, Valpha und Vbeta-Domänen in Kombinationen mit konstanten Domänen, die von IgG1 oder IgG4 stammen und Merkmale wie die oben beschriebenen Merkmale umfassen. Tabelle 2 Überblick über alle erzeugten und überprüften Fc-enthaltenden, bispezifischen Steuerungsmoleküle: KiH: Knob-into-hole, K / O: Fc-abgeschaltet. Molekül TCR mAb SEQ Ids Modifikationen III-IgG4 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 38 IgG4 (KiH) SEQ ID No. 39 IV-IgG4 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 40 IgG4 SEQ ID No. 41 II 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 33 IgG1 (K/O, KiH) SEQ ID No. 34 III 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 35 IgG1 (K/O, KiH) SEQ ID No. 36 IV 868Z11 hUCHT1 (V9) SEQ ID No. 37 IgG1 (K/O) SEQ ID No. 42 Various control molecules exhibiting the same specificities were constructed, Table 2, wherein these VH, VL, Valpha, and Vbeta domains are in combinations with constant domains derived from IgG1 or IgG4 and include features such as the features described above. Table 2 Overview of all generated and verified Fc-containing bispecific control molecules: KiH: Knob-into-hole, K / O: Fc-switched off. molecule TCR mAb SEQ IDs modifications III-IgG4 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 38 IgG4 (KiH) SEQ ID no. 39 IV-IgG4 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 40 IgG4 SEQ ID no. 41 II 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 33 IgG1 (K / O, KiH) SEQ ID no. 34 III 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 35 IgG1 (K / O, KiH) SEQ ID no. 36 IV 868Z11 HUCHT1 (V9) SEQ ID no. 37 IgG1 (K / O) SEQ ID no. 42

BEISPIEL 2 EXAMPLE 2

Herstellung und Aufreinigung von Fc-enthaltenden, bispezifischen TCR / mAb Diabodies.Preparation and purification of Fc-containing, bispecific TCR / mAb diabodies.

Vektoren für die Expression von rekombinanten Proteinen wurden als monocistronische pUC19-Derivative erschaffen, die durch Promotorelemente gesteuert werden, die von HCMV stammen. Plasmid-DNA wurde in E.coli gemäß Standardkulturverfahren amplifiziert und anschließend unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits aufgereinigt (Macherey & Nagel). Aufgereinigte Plasmid-DNA wurde für die vorübergehende Transfektion von CHO-S-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (ExpiCHO™ system; Thermo Fisher Scientific). Transfizierte CHO-Zellen wurden 6-14 Tage bei 32°C bis 37°C kultiviert und erhielten ein bis zwei Feeds von ExpiCHO™ Feed-Solution.Vectors for the expression of recombinant proteins have been created as monocistronic pUC19 derivatives, which are controlled by promoter elements derived from HCMV come. plasmid DNA was amplified in E. coli according to standard culture techniques and subsequently purified using commercially available kits (Macherey & Nagel). Purified plasmid DNA was used for the transient transfection of CHO-S cells according to the manufacturer's instructions (ExpiCHO ™ system; Thermo Fisher Scientific). Transfected CHO cells were cultured for 6-14 days at 32 ° C to 37 ° C and received one to two feeds of ExpiCHO ™ Feed-Solution.

Der konditionierte Zellüberstand wurde durch Zentrifugation (4000 x g, 30 Minuten) geerntet und durch Filtration (0,22 µm) gereinigt. Bispezifische Moleküle wurden unter Verwendung eines Äkta Pure 25 L FPLC-Systems (GE Lifesciences) aufgereinigt, das dafür ausgerüstet ist, parallel Affinitäts- und Größenausschlusschromatografie durchzuführen. Affinitätschromatografie wurde auf Protein-A-Säulen (GE Lifesciences) unter Befolgung von Standardprotokollen für die Affinitätschromatografie ausgeführt. Direkt nach der Elution (pH 2,8) von der Affinitätssäule, um hochreine monomerische Proteine zu erhalten, wobei unter Verwendung von Standardprotokollen Superdex 200 pg 16/600 Säulen (GE Lifesciences) verwendet wurden, wurde die Größenausschlusschromatografie durchgeführt. Auf einem NanoDrop System (Thermo Scientific) wurden Proteinkonzentrationen bestimmt, wobei berechnete Extinktionskoeffizienten gemäß den vorhergesagten Proteinsequenzen verwendet wurden. Falls notwendig, wurde die Aufkonzentration und der Austausch des Puffers unter Verwendung von Vivaspin-Geräten (Sartorius) durchgeführt. Schließlich wurden aufgereinigte Moleküle in phosphat-gepufferter Salzlösung bei Konzentrationen von ungefähr 1 mg/ml bei Temperaturen von 2-8°C gelagert.The conditioned cell supernatant was harvested by centrifugation (4000 x g, 30 minutes) and purified by filtration (0.22 μm). Bispecific molecules were purified using an Äkta Pure 25 L FPLC system (GE Lifesciences) equipped to perform parallel affinity and size exclusion chromatography. Affinity chromatography was performed on Protein A columns (GE Lifesciences) following standard protocols for affinity chromatography. Immediately after elution (pH 2.8) from the affinity column to obtain high purity monomeric proteins using standard protocols Superdex 200 pg 16/600 columns (GE Lifesciences), size exclusion chromatography was performed. Protein concentrations were determined on a NanoDrop System (Thermo Scientific) using calculated extinction coefficients according to the predicted protein sequences. If necessary, the concentration and exchange of the buffer was carried out using Vivaspin instruments (Sartorius). Finally, purified molecules were stored in phosphate buffered saline at concentrations of approximately 1 mg / ml at temperatures of 2-8 ° C.

Da therapeutische Proteine bei Einwirkung von Säuren eine angemessene Stabilität zeigen sollen, um robuste industrielle Aufreinigungsprozesse zu erleichtern, wurde der Prozentsatz von monomerem Protein, das von der Säule zum Abfangen von Protein A eluiert, ermittelt (Tabelle 3). Es ist offensichtlich, dass die Einführung von stabilisierenden Mutationen in Moleküle sowie die Auswahl von kennzeichnenden Orientierungen von Bindungsdomänen die Stabilität bei der Einwirkung von Säuren deutlich beeinflusst. Tabelle 3: Fraktion von monomerischem Protein nach einer sauren Elution von der abfangenden Säule: Molekül Das von der abfangenden Säule eluierte Monomer (% der gesamten Peakfläche) IA-IgG4 (VH-beta) nicht definiert IA_1 (VH-beta) 49 IA_2 (VH-beta) 54 IA_3 (dsVH-beta) 63 ID_1 (alpha-dsVH) 46 IC_4 (VH-alpha) 62 IC_5 (VH-alpha) 67 ID_4 (alpha-VH) 65 ID_5 (alpha-VH) 69 II 39 III 51 IV 76 Since therapeutic proteins are said to exhibit adequate stability upon exposure to acids to facilitate robust industrial purification processes, the percentage of monomeric protein eluting from the Protein A capture column was determined (Table 3). It is evident that the introduction of stabilizing mutations into molecules, as well as the selection of characteristic orientations of binding domains, significantly affects the stability in the action of acids. Table 3: Fraction of monomeric protein after acid elution from the scavenging column: molecule The monomer eluted from the scavenging column (% of the total peak area) IA-IgG4 (VH-beta) not defined IA_1 (VH-beta) 49 IA_2 (VH-beta) 54 IA_3 (dsVH-beta) 63 ID_1 (alpha-dsVH) 46 IC_4 (VH-alpha) 62 IC_5 (VH-alpha) 67 ID_4 (alpha-VH) 65 ID_5 (alpha VH) 69 II 39 III 51 IV 76

Nach der Größenausschlusschromatografie zeigten die aufgereinigten bispezifischen Moleküle eine hohe Reinheit (>93% monomerisches Protein), wie durch HPLC-SEC an MabPac SEC-1-Säulen (5 µm, 7,8x300 mm) bestimmt, die in 50 mM NatriumPhosphat, ph 6,8, 300 mM NaCl innerhalb eines Agilent 1100 System enthaltend, durchlaufen (siehe ). Nicht-reduzierende und reduzierende SDS-PAGE bestätigten die Reinheit und die erwartete Größe der verschiedenen TCR / mAb-Moleküle mit zweifacher Spezifität (die Daten werden nicht gezeigt).After size exclusion chromatography, the purified bispecific molecules showed high purity (> 93% monomeric protein) as determined by HPLC-SEC on MabPac SEC-1 columns (5 μm, 7.8x300 mm) prepared in 50 mM sodium phosphate, pH 6 , 8, 300 mM NaCl within an Agilent 1100 system, go through (see ). Non-reducing and reducing SDS-PAGE confirmed the purity and expected size of the various TCR / mAb molecules with dual specificity (data not shown).

BEISPIEL 3 EXAMPLE 3

Spezifische und Zielzellen-abhängige T-Zell-Aktivierung, die durch Fc-enthaltende TCR / mAb Diabodies ausgelöst wird.Specific and target cell-dependent T cell activation triggered by Fc-containing TCR / mAb diabodies.

Die Wirksamkeit von Fc-enthaltenden TCR / mAb Diabodies wurde im Hinblick auf die T-Zell-Aktivierung unter Verwendung des T-Zell-Aktivierungs-Bioassays (Promega) ermittelt. Der Assay besteht aus einer genetisch hergestellten Jurkat Zelllinie, welche einen Luciferase-Reporter exprimiert, der durch ein NFAT-Antwortelement (NFAT-RE) angetrieben wird. Die Assays werden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Kurz gefasst wurden T2-Zellen, die entweder mit dem HIV-spezifischen Peptid SLYNTVATL beladen wurden oder ohne Peptidladung blieben (ungeladene Kontrolle) anschließend zusammen mit Promegas modifizierten Jurkat Zellen in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von bispezifischem TCR / mAb-Molekülen kultiviert. Jurkat-Reporter T-Zell-Aktivierung wurde nach 16-20 Stunden analysiert, indem die Luminiszenz-Intensität gemessen wurde.The effectiveness of Fc-containing TCR / mAb Diabodies was determined for T cell activation using the T cell activation bioassay (Promega). The assay consists of a genetically engineered Jurkat cell line expressing a luciferase reporter driven by a NFAT response element (NFAT-RE). The assays are performed according to the manufacturer's instructions. Briefly, T2 cells loaded with either the HIV-specific peptide SLYNTVATL or without peptide loading (uncharged control) were subsequently co-administered with Promegas modified Jurkat cells in the presence of increasing concentrations of bispecific TCR / mAb molecules cultured. Jurkat reporter T-cell activation was analyzed after 16-20 hours by measuring the luminescence intensity.

Repräsentative Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays werden jeweils für auf IgG4-basierende ( ) und IgG1-basierende bispezifische TCR / mAb Moleküle ( ) gezeigt. Die Daten zeigen, dass unabhängig von dem IgG-Isotyp der verwendeten konstanten Domänen die Fc-enthaltenden TCR / mAb Diabody-Konstrukte IA und ID eine überlegene T-Zell-Aktivierung zeigten, im Vergleich zu den alternativen bispezifischen TCR / mAb Konstrukten II, III und IV, wie durch die Größenordnung der Aktivierung und / oder jeweils EC50-Werte gemessen wurde. Darüber hinaus war die unspezifische T-Zell-Aktivierung von Fc-enthaltenden TCR / mAb Diabodies, die gegen ungeladene T2-Zellen ausgelöst wurde, vermindert oder zumindest gleich gegenüber dem Maß an Aktivierung, das für die alternativen bispezifischen TCR / mAb Konstrukte beobachtet wurde. Gemäß den oben aufgeführten Ergebnissen handelt es sich bei den TCR / mAb Diabody-Molekülen mit zweifacher Spezifität um bevorzugte Moleküle für die therapeutische Intervention, da sie eine starke Effektor-T-Zell-Aktivierung auf eine hoch Ziel-abhängige Art und Weise auslösen.Representative efficacy assay results are given for IgG4-based ( ) and IgG1 -based bispecific TCR / mAb molecules ( ). The data show that regardless of the IgG isotype of the constant domains used, the Fc-containing TCR / mAb diabody constructs IA and ID showed superior T cell activation compared to the alternative bispecific TCR / mAb Constructs II, III and IV as measured by the magnitude of activation and / or EC50 values, respectively. In addition, non-specific T-cell activation was Fc -containing TCR / mAb Diabodies elicited against uncharged T2 cells decreased, or at least equal to the level of activation, for the alternative bispecific TCR / mAb constructs was observed. According to the above results, the TCR / mAb Double specificity diabody molecules around preferred molecules for therapeutic intervention, as they elicit strong effector T cell activation in a highly target-dependent manner.

BEISPIEL 4EXAMPLE 4

Die Entwicklung von Fc-enthaltenden, bispezifischen TCR / mAb Diabodies als eine molekulare PlattformThe development of Fc-containing, bispecific TCR / mAb diabodies as a molecular platform

Fc-enthaltende bispezifische TCR / mAb Diabody-Konstrukte wurden erschaffen, um als molekulare Plattform zu dienen, um das Gerüst für verschiedene von TCR und mAb stammende variable Domänen bereitzustellen, die unterschiedliche Peptid:MHC-Komplexe und Effektor-Zell-Oberflächen-Antigene adressieren. Um die Eignung als Plattform zu validieren, wurden die von mAb stammenden Domänen in einem ersten Satz von Molekülen ausgetauscht. Die variablen Domänen von hUCHT1(V9) anti-CD3-Antikörpern (Konstrukt ID_1) wurden durch die Domänen der hBMA031(var10) anti-TCR-Antikörper ersetzt, welche dieselbe Domänenorientierung verwenden (Konstrukte ID_4 und ID_5) oder eine andere Orientierung (IC_4, IC_5) (siehe Tabelle 1 und wegen den Einzelheiten). Die Expression, Aufreinigung und Charakterisierung dieser Moleküle wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Reinheit und Integrität der abschließenden Vorbereitungen überstieg 92% gemäß den HPLC-SEC Analysen. Fc -containing bispecific TCR / mAb Diabody constructs were created to serve as a molecular platform to set the framework for various of TCR and mAb-derived variable domains that target different peptide: MHC complexes and effector cell surface antigens. To validate eligibility as a platform, the mAb-derived domains were exchanged in a first set of molecules. The variable domains of hUCHT1 (V9) anti- CD3 Antibodies (construct ID_1) were antagonized by the domains of hBMA031 (var10). TCR Replaces antibodies that use the same domain orientation (constructs ID_4 and ID_5 ) or another orientation ( IC_4 . IC_5 ) (see Table 1 and for the details). The expression, purification and characterization of these molecules was performed as described above. The purity and integrity of the final preparations exceeded 92% according to HPLC-SEC analysis.

Die Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays zeigten eine Ziel-abhängige Jurkat Reporter-T-Zell-Aktivierung und minimale unspezifische Wirkung gegen unbeladene T2-Zellen sowohl für variable Antikörperdomänen hUCHT1 (Konstrukt ID_1) und hBMA031 (Konstrukte ID_4 und ID_5), welche die Eignung der TCR / mAb Diabody Konstrukte ( ) mit zweifacher Spezifität für die Plattform unterstützen. Vor allem, wenn die variablen TCR- und mAb-Domänen des Konstrukts ID_4 und ID_5 zu jeder Polypeptidkette umgeschaltet wurden, woraus die Konstrukte IC_4 und IC_5 hervorgingen, wurde keine T-Zell-Aktivierung beobachtet (die Daten werden nicht gezeigt). Die letzteren Erkenntnisse zeigen, dass trotzdem bispezifische TCR / mAb Diabodies als Plattform-Konstrukt für die Einbeziehung verschiedener variabler TCR- und mAb-Domänen verwendet werden können, eine sorgfältige Optimierung der Domänenorientierung benötigt wird, um die optimale Aktivität der Moleküle zu erreichen.The results of the efficacy assay showed target-dependent Jurkat reporter T-cell activation and minimal nonspecific action against uncharged T2 cells for both antibody variable domains hUCHT1 (construct ID_1) and hBMA031 (constructs ID_4 and ID_5 ), which the suitability of the TCR / mAb Diabody constructs ( ) with dual specificity for the platform. Especially if the variable TCR and mAb domains of the construct ID_4 and ID_5 were switched to each Polypeptidkette, from which the constructs IC_4 and IC_5 no T cell activation was observed (data not shown). The latter findings show that nevertheless bispecific TCR / mAb Diabodies as a platform construct for the inclusion of various variable TCR - and mAb domains can be used, a careful optimization of the domain orientation is needed to achieve the optimal activity of the molecules.

BEISPIEL 5EXAMPLE 5

Stabilität von Fc-enthaltenden, bispezifischen TCR / mAb DiabodiesStability of Fc-containing bispecific TCR / mAb diabodies

Die Stabilität der bispezifischen TCR / mAb Moleküle wurde ursprünglich ermittelt, indem der Protein-Thermalwechsel-Assay (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, wobei ein 7500 Echtzeit PCR-System (Applied Biosciences) verwendet wurde. Kurzgefasst wurden aufgereinigte Moleküle mit PTS-Puffer und PTS-Farbe gemischt und einem ansteigenden Temperaturgradienten ausgesetzt, wobei konstant die Fluoreszenz der Proben überwacht wurde. Die aufgezeichneten Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung von PTS-Software (Thermo Fisher Scientific) analysiert und die Schmelztemperaturen (T_M) wurden durch die Derivate-Methode berechnet.The stability of bispecific TCR / mAb Molecules were originally determined using the Protein Thermal Exchange Assay (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions using a 7500 real-time PCR system (Applied Biosciences). In a nutshell Purified molecules were mixed with PTS buffer and PTS color and exposed to an increasing temperature gradient, constantly monitoring the fluorescence of the samples. The recorded fluorescence signals were analyzed using PTS software (Thermo Fisher Scientific) and the melting temperatures (T _M ) were calculated by the derivative method.

Studien zur Stabilität unter Belastung wurden durch die Lagerung von aufgereinigten Molekülen durchgeführt, die bei 40°C für bis zu zwei Wochen in PBS gelöst wurden. Proben wurden im Hinblick auf die Integrität der Proteine analysiert, wobei HPLC-SEC verwendet wurde und die Wirksamkeit wurde, wie oben beschrieben, unter Verwendung des T-Zell-Aktivierungsassays (Promega) untersucht.Stress stability studies were performed by storing purified molecules that were dissolved in PBS at 40 ° C for up to two weeks. Samples were analyzed for integrity of the proteins using HPLC SEC and efficacy was assayed as described above using the T cell activation assay (Promega).

Wie erwartet löste die Lagerung bei 40°C die Bildung von Aggregaten / Spezies mit hohem Molekulargewicht aus, wie durch HPLC-SEC Untersuchungen bestimmt (siehe ). Die Ergebnisse des Wirksamkeits-Assays von auf IgG1 basierenden Molekülen nach der Aufreinigung und Inkubation bei 40°C werden in gezeigt. Obwohl keines der getesteten Moleküle nach einer Lagerung bei 40°C eine wesentliche Verminderung der Wirksamkeit zeigte, wurde beobachtet, dass die belasteten Moleküle III und IV ein bedeutendes Maß an unspezifischer (d. h. Zielunabhängiger) Jurkat T-Zell-Aktivierung auslösten. Im Gegensatz dazu behielten die bispezifischen TCR / mAb Diabodies ihre Ziel-abhängige Wirksamkeit, trotz der Anwesenheit von einigen Aggregaten, wie in HPLC-SEC gezeigt.As expected, storage at 40 ° C triggered the formation of high molecular weight aggregates / species as determined by HPLC-SEC studies (see ). The results of the efficacy assay of IgG1 based molecules after purification and incubation at 40 ° C are in shown. Although none of the tested molecules exhibited a significant reduction in potency after storage at 40 ° C, it was observed that loaded molecules III and IV elicited a significant level of nonspecific (ie, target-independent) Jurkat T cell activation. In contrast, the bispecific TCR / mAb Diabodies their target-dependent efficacy, despite the presence of some aggregates, as shown in HPLC-SEC.

SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LISTING

<110> Immatics biotechnologies<110> Immatics biotechnologies
<120> Polypeptidmolekül mit verbesserter zweifacher Spezifität<120> Polypeptide molecule with improved dual specificity
<130> I33034DE<130> I33034DE
<160> 42<160> 42
<170> Patentin version 3.5<170> Patent version 3.5
<210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
<400> 1
<210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 2
<400> 2
Ala Gly ProAla Gly Pro
<210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 3

<400> 3
<210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 4
<400> 4
Leu GlyLeu Gly
<210> 5 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 5 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 5

<400> 5
<210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 6 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 6
<400> 6
<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 7
<400> 7
<210> 8 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 8 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 8

<400> 8
<210> 9 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 9 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 9

<400> 9
<210> 10 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 10 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 10

<400> 10
<210> 11 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 11 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 11

<400> 11
<210> 12 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 12 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 13 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 13 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 13

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<210> 14 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 14 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 14

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<210> 15 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 15 <211> 459 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 16 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 16 <211> 474 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 16

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<210> 17 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 17 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 18 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 18 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 19 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 19 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 19

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<210> 20 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 20 <211> 467 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 20

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<210> 21 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 21 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 21

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<210> 22 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 22 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 22

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<210> 23 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 23 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 24 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 24 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 24

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<210> 25 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 25 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 26 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 26 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 27 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 27 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 29 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 29 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 33 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 33 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 33

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<210> 34 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 34 <211> 451 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 35 <211> 698 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 35 <211> 698 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 36 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 36 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 37 <211> 698 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 37 <211> 698 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 38 <211> 696 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 38 <211> 696 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 40 <211> 428 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 40 <211> 428 <212> PRT <213> Homo sapiens
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<210> 41 <211> 1392 <212> PRT <213> Homo sapiens<210> 41 <211> 1392 <212> PRT <213> Homo sapiens
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Claims

Das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität, das eine erste Polypeptidkette und eine zweite Polypeptidkette umfasst, wobei: die erste Polypeptidkette eine erste Bindungsregion einer variablen Domäne (VD1) umfasst, die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Zellen bindet, und eine erste Bindungsregion einer variablen Domäne (VR1), die von einem TCR stammt, der für ein MHC-assoziiertes Peptidepitop spezifisch ist, und einen ersten Linker-Teil (LINK1), welcher die Domänen verbindet; die zweite Polypeptidkette eine zweite Bindungsregion einer variablen Domäne (VR2) umfasst, die von einem TCR stammt, der für ein MHC-assoziiertes Peptidepitop spezifisch ist, und eine zweite Bindungsregion einer variablen Domäne (VD2), die von einem Antikörper stammt, der in der Lage ist, humane Immuneffektorzellen zu rekrutieren, indem er spezifisch an ein Oberflächenantigen dieser Zellen bindet, und einen zweiten Linker-Teil (LINK2), welcher die Domänen verbindet; wobei diese erste Bindungsregion (VD1) und diese zweite Bindungsregion (VD2) assoziieren, um eine erste Bindungsstelle (VD1)(VD2) zu bilden, welche das Epitop des Zellenoberflächenmoleküls bindet; diese erste Bindungsregion (VR1) und diese zweite Bindungsregion (VR2) assoziieren, um eine zweite Bindungsstelle (VR1)(VR2) zu bilden, welche das Epitop dieses MHCassoziierten Peptids bindet; wobei diese zwei Polypeptidketten zu humanen lgG Gelenkdomänen und / oder humanen lgG Fc-Domänen oder Teilen davon fusioniert sind; und wobei diese zwei Polypeptidketten durch kovalente und / oder nicht-kovalente Bindungen zwischen diesen Gelenkdomänen und / oder Fc-Domänen verbunden sind; und wobei dieses Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität in der Lage ist, gleichzeitig das Zelloberflächenmolekül und das MHC-assoziierte Peptidepitop zu binden.The dual specificity polypeptide molecule comprising a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, wherein: the first polypeptide chain comprises a first variable domain (VD1) binding region derived from an antibody capable of recruiting human immune effector cells by binding specifically to a surface antigen of these cells, and a first variable domain (VR1) binding region derived from a TCR specific for an MHC-associated peptide epitope, and a first linker part (LINK1) connecting the domains; the second polypeptide chain comprises a second variable domain (VR2) binding region derived from a TCR specific for an MHC-associated peptide epitope, and a second variable domain (VD2) binding region derived from an antibody capable of recruiting human immune effector cells by binding specifically to a surface antigen of these cells, and a second linker part (LINK2) connecting the domains; wherein said first binding region (VD1) and said second binding region (VD2) associate to form a first binding site (VD1) (VD2) which binds the epitope of the cell surface molecule; associate this first binding region (VR1) and this second binding region (VR2) to form a second binding site (VR1) (VR2) which binds to the epitope of this MHC-associated peptide; wherein these two polypeptide chains are fused to human IgG hinge domains and / or human IgG Fc domains or parts thereof; and wherein these two polypeptide chains are linked by covalent and / or non-covalent bonds between these hinge domains and / or Fc domains; and wherein said dual specificity polypeptide molecule is capable of simultaneously binding the cell surface molecule and the MHC-associated peptide epitope.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach Anspruch 1, wobei die Reihenfolge der Bindungsregionen in den Polypeptidketten unter VD1-VR1; VD1-VR2; VD2-VR1; VD2-VR2; VR1-VD1; VR1-VD2; VR2-VD1; VR2-VD2 ausgewählt wird und wobei die Domänen entweder durch LINK1 oder LINK2 verbunden werden.Polypeptide molecule with dual specificity after Claim 1 wherein the order of the binding regions in the polypeptide chains under VD1-VR1; VD1-VR2; VD2-VR1; VD2 VR2; VR1 VD1; VR1 VD2; VR2-VD1; VR2-VD2 is selected and where the domains are connected by either LINK1 or LINK2.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach Anspruch 1, wobei die Linker-Sequenzen LINK1 und / oder LINK2 mindestens ein Sequenzmotiv enthalten, das unter GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS und TVLSSAS ausgewählt wird.Polypeptide molecule with dual specificity after Claim 1 where the linker sequences LINK1 and / or LINK2 contain at least one sequence motif selected from GGGS, GGGGS, TVLRT, TVSSAS and TVLSSAS.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei diese ersten und zweiten Polypeptidketten weiterhin mindestens eine Gelenkdomäne und eine Fc-Domäne oder Teile davon umfassen, die von humanem lgG1, lgG2 oder lgG4 stammen.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 3 wherein said first and second polypeptide chains further comprise at least one hinge domain and an Fc domain or portions thereof derived from human IgG1, IgG2 or IgG4.

Polypeptid mit zweifacher Spezifität nach Anspruch 4, wobei diese Fc-Domäne mindestens eine Mutation umfasst, welche bei einem Rest, der unter den Positionen 233, 234, 235, 236, 297 und 331 ausgewählt wird, die Effektorfunktion ausschaltet, bevorzugt wobei diese Mutation, welche die Effektorfunktion ausschaltet, erzeugt wird, indem mindestens ein Rest an Position 233, 234, 235, 236 und 331 mit dem entsprechenden von lgG2 oder lgG4 stammenden Rest ersetzt wird.Polypeptide with dual specificity Claim 4 wherein said Fc domain comprises at least one mutation which, for a residue selected from positions 233, 234, 235, 236, 297 and 331, shuts down the effector function, preferably wherein said mutation which shuts down the effector function is generated in that at least one residue at position 233, 234, 235, 236 and 331 is replaced by the corresponding residue derived from IgG2 or IgG4.

Polypeptidmoleküle mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei diese Fc-Domäne eine CH3-Domäne umfasst, die mindestens eine Mutation enthält, welche die Bildung von Heterodimeren erleichtert.Polypeptide molecules with dual specificity according to one of Claims 3 to 5 wherein said Fc domain comprises a CH3 domain containing at least one mutation facilitating the formation of heterodimers.

Das Polypeptid mit zweifacher Spezifität nach Anspruch 6, wobei sich diese Mutationen an irgendeiner Position befinden, die unter 366, 368, 405 und 407 ausgewählt wird, bevorzugt wobei diese Mutationen T366W und T366'S, L368A' und Y407'V als Knob-into-hole Mutationen umfassen.The polypeptide with dual specificity Claim 6 These mutations are located at any position selected from 366, 368, 405 and 407, preferably wherein these mutations include T366W and T366'S, L368A 'and Y407'V as knob-in-hole mutations.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei diese Fc-Domäne (eine) CH2- und CH3-Domäne(n) umfasst, die mindestens zwei zusätzliche Cysteinreste umfassen, zum Beispiel S354C und Y349C oder L242C und K334C.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 3 to 7 wherein said Fc domain comprises CH2 and CH3 domain (s) comprising at least two additional cysteine residues, for example S354C and Y349C or L242C and K334C.

Polypeptidmoleküle mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei diese von Antikörpern stammenden Domänen VD1 und VD2 eine manipulierte Disulfidbrücke zeigen, die eine kovalente Bindung zwischen VD1 und VD2 einführt und wobei diese Cysteine in die Rahmenregion (FR) 4 im Falle von VL und Rahmenregion 2 im Falle von VH eingeführt wird.Polypeptide molecules with dual specificity according to one of Claims 1 to 8th where these antibody-derived domains VD1 and VD2 show a manipulated disulfide bond that is a covalent one Introducing binding between VD1 and VD2 and introducing these cysteines into the frame region (FR) 4 in the case of VL and frame region 2 in the case of VH.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei dieses Zelloberflächenmolekül dafür bekannt ist, dass es die Aktivierung von Immunzellen auslöst oder mindestens aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus Molekülen besteht, die sich auf die Immunantwort beziehen, CD3 wie z. B. die CD3y, CD3δ, und CD3ε -Ketten, TCRa/b und TCRg/d und HLA-DR.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 9 , wherein said cell surface molecule is known to induce activation of immune cells or at least selected from the group consisting of molecules related to the immune response, CD3 such as e.g. CD3y, CD3δ, and CD3ε chains, TCRa / b and TCRg / d and HLA-DR.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Regionen in der ersten Polypeptidkette SEQ ID No. 28 für VD1, SEQ ID No. 29 für VR1, SEQ ID No. 30 für LINK1 und die Regionen in der zweiten Polypeptidkette SEQ ID No. 31 für VD2, SEQ ID No. 32 für VR2 und SEQ ID No. 30 für LINK2 umfassen.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 10 wherein the regions in the first polypeptide chain SEQ ID NO. 28 for VD1, SEQ ID NO. 29 for VR1, SEQ ID no. 30 for LINK1 and the regions in the second polypeptide chain SEQ ID NO. 31 for VD2, SEQ ID no. 32 for VR2 and SEQ ID no. 30 for LINK2.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei die FC-Region in der ersten Polypeptidkette SEQ ID No. 26 (Fc1) und die FC-Region in der zweiten Polypeptidkette SEQ ID No. 27 (Fc2) umfasst.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 3 to 11 wherein the FC region in the first polypeptide chain SEQ ID NO. 26 (Fc1) and the FC region in the second polypeptide chain SEQ ID NO. 27 (Fc2).

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität, das eine erste Polypeptidkette mit SEQ ID No. 16 und eine zweite Polypeptidkette mit SEQ ID No. 17 umfasst.Polypeptide molecule with dual specificity, which has a first polypeptide chain with SEQ ID NO. 16 and a second polypeptide chain with SEQ ID NO. 17 includes.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dieses Molekül eine auffindbare Markierung trägt.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 13 , which molecule carries a detectable label.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei diese erste Bindungsstelle (VD1) (VD2), welche das Oberflächenantigen von diesen Immunzellen bindet, humanisiert ist; und / oder diese zweite Bindungsstelle (VR1) (VR2), welche dieses MHC-assoziierte Peptidepitop bindet, gereift ist, um eine höhere Affinität und / oder Stabilität zu erreichen.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 14 wherein said first binding site (VD1) (VD2) which binds the surface antigen of said immune cells is humanized; and / or this second binding site (VR1) (VR2), which binds to this MHC-associated peptide epitope, has matured to achieve higher affinity and / or stability.

Nukleinsäure, die für die erste Polypeptidkette und / oder die zweite Polypeptidkette nach einem der Ansprüche 1 bis 15 kodiert oder ein Expressionsvektor, der mindestens eine dieser Nukleinsäuren umfasst.Nucleic acid encoding the first polypeptide chain and / or the second polypeptide chain according to any one of Claims 1 to 15 or an expression vector comprising at least one of these nucleic acids.

Wirtszelle, die einen in Anspruch 16 definierten Vektor umfasst und optional exprimiert.Host cell, a in Claim 16 comprises defined vector and optionally expressed.

Pharmazeutische Zusammensetzung, welche das Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 15, die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor nach Anspruch 16 oder die Zelle nach Anspruch 17 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Träger(n) oder Hilfsstoff(en) umfasst.A pharmaceutical composition comprising the double specificity polypeptide molecule of any one of Claims 1 to 15 , the nucleic acid or the expression vector Claim 16 or the cell after Claim 17 together with one or more pharmaceutically acceptable carrier (s) or excipient (s).

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 15, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 16 oder die Zelle nach Anspruch 17 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung in der Medizin.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 15 , the nucleic acid or the expression vector according to Claim 16 or the cell after Claim 17 or the pharmaceutical composition according to Claim 18 for use in medicine.

Polypeptidmolekül mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 15, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 16, die Zelle nach Anspruch 17 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Verwendung bei der Vorbeugung oder der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die unter Krebs, Infektionskrankheiten und Immunstörungen ausgewählt wird.Polypeptide molecule with dual specificity according to one of Claims 1 to 15 , the nucleic acid or the expression vector according to Claim 16 , the cell after Claim 17 or the pharmaceutical composition according to Claim 18 for use in the prevention or treatment of a disease or disorder selected from cancer, infectious diseases and immune disorders.

Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptidmoleküls mit zweifacher Spezifität nach einem der Ansprüche 1 bis 15, der Nukleinsäure oder des Expressionsvektors nach Anspruch 16 oder der Zelle nach Anspruch 17 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18 umfasst.A method of treating a disease or disorder comprising administering a therapeutically effective amount of a double specificity polypeptide molecule according to any one of Claims 1 to 15 , the nucleic acid or the expression vector Claim 16 or the cell after Claim 17 or the pharmaceutical composition Claim 18 includes.