DE102017102604A1

DE102017102604A1 - Verfahren zum Steuern eines Laserscanning-Mikroskops beim Abtasten einer Probe und Laserscanning-Mikroskop

Info

Publication number: DE102017102604A1
Application number: DE102017102604.5A
Authority: DE
Inventors: Andreas SCHÖNLE; Lars KASTRUP
Original assignee: Abberior Instruments GmbH
Current assignee: Abberior Instruments GmbH
Priority date: 2017-02-09
Filing date: 2017-02-09
Publication date: 2018-08-09
Anticipated expiration: 2037-02-10
Also published as: DE102017102604B4

Abstract

Beim Steuern eines Laserscanning-Mikroskops beim Abtasten einer Probe mit einer ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht (3) aufweisenden Lichtintensitätsverteilung wird die Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber der Probe bewegt und das Anregungslicht (3) wird binnen unterschiedlich langer Zeiträume (Δt_i), in denen Messbereiche (Δx) gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe mit dem Anregungslicht beaufschlagt werden, derart für unterschiedlich lange Teilzeiträume (39) ausgeschaltet oder ausgeblendet, dass über jeden der Messbereiche (Δx) eine gleiche Lichtmenge (34) des Anregungslichts (3) auf die Probe trifft.

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Steuern eines Laserscanning-Mikroskops beim Abtasten einer Probe mit einer ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht aufweisenden Lichtintensitätsverteilung, wobei die Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber der Probe bewegt wird. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Laserscanning-Mikroskop mit einer Anregungslicht bereitstellenden Lichtquelle und einem Scanner, der eine ein Intensitätsmaximum des Anregungslichts aufweisende Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber einer Probe bewegt.
Die variierende Geschwindigkeit, mit der die Lichtintensitätsverteilung gegenüber der Probe bewegt wird, kann insbesondere daraus resultieren, dass Ablenkmittel des jeweiligen Scanners resonant betrieben werden. Ein solcher resonanter Betrieb von Ablenkmitteln weist vielfach Vorteile in Bezug auf den erreichbaren Ablenkwinkel und die erreichbare Ablenkgeschwindigkeit auf.
STAND DER TECHNIK
Es sind Ansätze bekannt, mit denen versucht wird, die Geschwindigkeit, mit der eine Lichtintensitätsverteilung in einem Laserscanning-Mikroskop gegenüber der Probe bewegt wird, auch bei hohen Geschwindigkeiten konstant zu halten.
Aus der DE 197 02 752 A1 ist ein Ansteuersystem für einen Scanner eines Laserscanning-Mikroskops mit einem Schwingmotor zum Antreiben eines Schwingspiegels bekannt, der zur linear oszillierenden Ablenkung eines Strahlenbündels dient. Zur Speisung des Schwingmotors mit einem Erregerstrom, der hinsichtlich der Ansteuerfrequenz, der Frequenzkurve und der Amplitude veränderbar ist, ist eine mit einem Funktionsgenerator verbundene Ansteuereinheit vorgesehen. Mit einem Messwertaufnehmer, der über eine Logikeinheit zur Ermittlung von Korrekturwerten für den Erregerstrom mit dem Funktionsgenerator verknüpft ist, wird eine Folge von Informationen über die Ablenkpositionen des Schwingspiegels gewonnen. Unter Auswertung der von dem Messwertaufnehmer zur Verfügung gestellten Informationen über die tatsächliche Ablenkposition des Schwingspiegels werden mithilfe der Logikeinheit Korrekturwerte ermittelt, die dazu genutzt werden, die von dem Funktionsgenerator ausgegebenen Ansteuerfrequenzen so zu beeinflussen, dass die Abweichungen minimiert werden.
Aus der DE 198 43 596 A1 ist ein Pixeltaktgeber mit variabler Frequenz bekannt, der eine Reihe vorprogrammierter Frequenzen erzeugt, um Schwankungen in der Strahlgeschwindigkeit entlang einer Abtastlinie auszugleichen. Der Pixeltaktgeber umfasst einen direkten digitalen Synthesizer, eine Suchtabelle, die den Synthesizer mit Frequenzinformationen versorgt, und eine ersten Oszillator, der ein Referenzsignal an den Synthesizer abgibt. Ein Zähler gibt Informationen über eine Position des Stahls entlang der Abtastlinie an die Suchtabelle weiter, und der Synthesizer erzeugt ein Ausgangssignal in Abhängigkeit von der Position des Strahls.
Zudem sind Ansätze bekannt, eine variierende Geschwindigkeit, mit der eine Lichtintensitätsverteilung in einem Laserscanning-Mikroskop gegenüber der Probe bewegt wird, bei der Zuordnung von Licht aus der Probe zu verschiedenen Messbereichen in der Probe zu berücksichtigen.
Aus der DE 102 61 155 A1 sind ein Verfahren und ein konfokales Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts bekannt, wobei das Objekt entlang einer Richtung mit einer vorgebbaren Rastergeschwindigkeit und entlang einer anderen Richtung mit einer langsameren Rastergeschwindigkeit jeweils bidirektional abgerastert wird. Hierdurch werden Objektinformationen des Objekts detektiert und einzelnen Bildelementen zugeordnet. Zum Erzielen einer weitgehend fehlerfreien Zuordnung der detektierten Objektinformationen zu den einzelnen Bildelementen auch bei hohen Rastergeschwindigkeiten erfolgt die Zuordnung der Objektinformationen zu dem jeweiligen Bildelement in Abhängigkeit vom zeitlichen Verlauf des Rastervorgangs. Dabei wird jedem einzelnen Bildelement eine Zeitinformation zugeordnet, die den Zeitpunkt umfasst, an dem der dem Bildelement entsprechende Objektbereich abgerastert wurde. Von einer Rastereinrichtung des Rastermikroskops wird ein Referenzsignal oder ein den momentanen Zustand der Rastereinrichtung entsprechendes Signal ausgegeben und für die Zuordnung verwendet.
Aus der DE 10 2007 008 009 B3 ist ein Verfahren zur Steuerung eines eine Strahlablenkeinrichtung umfassenden Laserscanning-Mikroskops bekannt, bei dem die Strahlablenkeinrichtung mittels eines Ansteuersignals angesteuert wird, um eine Scanbewegung durchzuführen. Ein Messsignal wird erzeugt, das mindestens eine Information über eine Frequenz und/oder eine Phase und/oder eine Amplitude der Strahlablenkeinrichtung aufweist. Das Messsignal wird einer Signalverarbeitung unterworfen, um eine aufbereitetes Signal zu erzeugen, mit dem dann das Ansteuersignal gesteuert und/oder geregelt und/oder modifiziert wird. Mittels des aufbereiteten Messsignals wird zudem eine Aufnahme von Bilddaten gesteuert und/oder aufgenommene Bilddaten werden einer Position auf einer Probe zugeordnet. Konkret wird durch eine direkte digitale Synthese ein synthetisches Signal erzeugt, das mindestens eine Information über die Frequenz und/oder die Phase und/oder die Amplitude der Strahlablenkeinrichtung beinhaltet. Aus dem synthetischen Signal wird ein synthetisches Aufnahmesignal erzeugt, das eine Information über eine Position eines Mikroskopstrahls auf und/oder in einer Probe beinhaltet. Das synthetische Aufnahmesignal wird im Aufnahmeschritt verwendet, um die Aufnahme von Bilddaten zu steuern und/oder aufgenommene Bilddaten einer Position auf und/oder in einer Probe zuzuordnen. Konkret kann die Bilderfassung derartig getriggert werden, dass jeweils Bildpunkte in äquidistanten Abständen in bzw. auf der Probe erfasst werden. Das synthetische Aufnahmesignal kann auch dazu benutzt werden, um die Lichtquelle anzusteuern, was bei bestimmten laserspektroskopischen Verfahren, beispielsweise der Anregungs-Abfrage-Spektroskopie, von Vorteil sein soll.
Aus Rolf T. Borlinghaus: Smart Control for Resonant Galvo Scanners - High time-resolution confocal microscopy requires fast scanning devices, SCIENCE LAB by Leica Microsystems, August 1, 2014 ist es bekannt, dass die Verwendung von resonant betriebenen Galvonometer-Scannern in der zeitlich hochauflösenden konfokalen Mikroskopie (high time-resolution confocal microscopy = HTRCLSM) zu einem sinusförmigen Verlauf der Geschwindigkeit führt, mit der eine Lichtintensitätsverteilung, mit der eine Probe abgetastet wird, gegenüber der Probe bewegt wird. Dies hat zur Folge, dass bei konstanter Pixelclock jedem Pixel unterschiedlich große räumliche Messbereiche zugeordnet werden. Eine derart korrigierte Pixelclock, dass die jedem Pixel zugeordneten räumlichen Messbereiche in der Probe gleich groß sind, führt dazu, dass die Pixel in den Umkehrpunkten der Lichtintensitätsverteilung heller sind und hier das Rauschen kleiner ist als in der Mitte des Abtastwegs. Daher wird zum Sicherstellen gleicher Eigenschaften vorgeschlagen, die Pixellänge längs des Abtastwegs auf eine Konstante zu beschränken. Konkret wird die Bewegung eines Spiegels des Scanners mithilfe einer positionsempfindlichen Einrichtung (PSD) erfasst, die Licht registriert, welches von einer Photodiode stammt und von der Rückseite des Spiegels reflektiert wird. Basierend auf dem Signal der positionsempfindlichen Einrichtung wird die Pixelclock so gesteuert, dass das Emissionssignal von dem Mikroskop in räumlich äquidistante Segmente unterteilt wird. Die Integrationszeit pro Pixel wird so gesteuert, dass sie auf zeitlich äquidistante Messungen beschnitten wird.
Weiterhin gehört Folgendes zum Stand der Technik.
Aus der DE 199 57 418 B4 sind ein Verfahren zur lichtoptischen Abtastung eines Objekts bei der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und ein Rastermikroskop zur Anwendung des Verfahrens bekannt. Zur Optimierung der Signalausbeute schon während der eigentlichen Datenaufnahme, d. h. bei der lichtoptischen Abtastung, wird die Intensität des Lichts in Abhängigkeit von der jeweiligen Fokusposition im Objektbereich des gerasterten, fokussierten Lichtstrahls geregelt. Konkret kann die Regelung der Intensität des Lichts in Abhängigkeit von der jeweiligen lateralen Fokusposition erfolgen. Dies soll von Vorteil sein, wenn einzelne Objektbereiche des Beleuchtungslichts stärker absorbieren als die übrigen Objektbereiche. In diesem Fall kann eine Erhöhung der Lichtintensität gerade dann erfolgen, wenn sich der abtastende lichtoptische Strahl an einer solchen stark absorbierenden lateralen Abtastposition befindet. Die Regelung der Intensität erfolgt gemäß einer analytischen Formel, in die die Abtastgeschwindigkeit des lichtoptischen Strahls einbezogen wird. Die Regelung der Intensität des Lichts kann mit einem im Strahlengang des Rastermikroskops angeordneten aktiven optischen Element erfolgen. Als aktives optisches Element kann ein AOM (Acousto-Optical-Modulator), ein AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) oder ein AOD (Acousto-Optical-Deflector) eingesetzt werden. Alternativ kann die Regelung der Intensität des Lichts mit einem im Strahlengang des Rastermikroskops angeordneten passiven optischen Element erfolgen. Dies kann beispielsweise eine rotierende Graufilterscheibe sein. Die Regelung der Intensität des Lichts kann auch mit der Lichtquelle selbst bzw. mit deren Steuereinheit realisiert werden.
In der STED-Laserscanning-Mikroskopie wird die jeweilige Probe mit einer Intensitätsverteilung abgetastet, die neben einem Intensitätsmaximum von Anregungslicht ein lokales Intensitätsminimum von Fluoreszenzverhinderungslicht aufweist, das konzentrisch zu dem Intensitätsminimum des Anregungslichts angeordnet ist. Das lokale Intensitätsminimum wird durch Intensitätsmaxima des Fluoreszenzverhinderungslichts begrenzt, in denen das Fluoreszenzverhinderungslicht sehr hohe Lichtintensitäten erreicht, die typischerweise weit über die Lichtintensität des Anregungslichts in dessen Intensitätsmaximum hinausgehen. Hohe Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts werden dabei bereits sehr nahe dem lokalen Intensitätsminimum des Fluoreszenzanregungslichts erreicht, weil dies Voraussetzung für die hohe räumliche Auflösung in der STED-Laserscanning-Mikroskopie ist. Entsprechend überlappen diese hohe Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts mit in der Nähe des Intensitätsminimums immer noch hohen Intensitäten des Anregungslichts. Die bei der STED-Laserscanning-Mikroskopie auf die jeweilige Probe einfallenden hohen Lichtintensitäten sind mit einer ausgeprägten Gefahr des Bleichens von Fluoreszenzmarkern verbunden, mit denen eine interessierende Struktur in der jeweiligen Probe markiert ist und von denen emittiertes Fluoreszenzlicht gemessen wird, um diese interessierende Struktur abzubilden. Es ist daher grundsätzlich erstrebenswert, die Fluoreszenzmarker nicht unnötig mit der Lichtintensitätsverteilung des Anregungslichts und des Fluoreszenzverhinderungslichts zu beaufschlagen.
Aus T. Staudt et al.: Far-field optical nanoscopy with reduced number of state transition cycles, Optics Express Vol. 19, No. 8, 14 March 2011, Seiten 5644 bis 5657 ist ein als RESCue-STED bezeichnetes Verfahren bekannt. Eine Probe wird mit einer Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, bei der ein Intensitätsmaximum von fokussiertem Fluoreszenzanregungslicht mit einem von Intensitätsmaxima in Form eines Donuts umgebenen Intensitätsminimum von fokussiertem Fluoreszenzverhinderungslicht überlagert ist. Interessierte Teile der Probe werden mit dem Intensitätsminimum des fokussierten Fluoreszenzverhinderungslichts abgetastet, und aus der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht wird registriert und dem jeweiligen Ort des Intensitätsminimums des fokussierten Fluoreszenzverhinderungslichts in der Probe zugeordnet. Das Beaufschlagen der Probe mit der Lichtintensitätsverteilung aus dem fokussierten Fluoreszenzanregungslicht und dem fokussierten Fluoreszenzverhinderungslicht wird für den jeweiligen Ort des Intensitätsminimums des fokussierten Fluoreszenzverhinderungslichts abgebrochen, wenn eine vorgegebene Maximalmenge des aus der Probe emittierten Fluoreszenzlichts registriert worden ist oder wenn bereits zuvor binnen einer vorgegebenen Zeitspanne eine vorgegebene Minimallichtmenge des aus der Probe emittierten Fluoreszenzlichts noch nicht registriert worden ist. Hierdurch wird die Anzahl der Zyklen von Anregung und Abregung, die die Fluoreszenzmarker in der Probe beim Aufnehmen eines Bilds der Probe durchlaufen, und damit die Gefahr des Bleichens der Fluoreszenzmarker reduziert. In einer alternativen Implementation des bekannten Verfahrens wird eine Vorabinformation über den Ort der Fluoreszenzmarker benutzt, um die Koordinaten direkt anzufahren, an denen eine Fluoreszenzverhinderung benötigt wird, und die Orte auszulassen, wo sie ohne Funktion wäre. Dazu wird vorgeschlagen, zuerst ein Bild niedriger Auflösung aufzunehmen, um grobe Informationen über die räumliche Struktur und die Merkmalsdichte in der Probe zu erhalten. Einige Merkmale werden eher isoliert und andere dicht gepackt sein. Anschließend ist eine gezielte Konzentration auf Bereiche möglich, in denen dichte Merkmale aufzulösen sind. Zugleich können Koordinaten ausgelassen werden, an denen keine Objekte getrennt werden müssen und entsprechend kein Einsatz von Fluoreszenzverhinderungslicht notwendig ist.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Laserscanning-Mikroskop aufzuzeigen, bei denen das Abtasten einer Probe mit einer ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht aufweisenden Lichtintensitätsverteilung, wobei die Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber der Probe bewegt wird, im Hinblick auf eine Minimierung der photochemischen Belastung der Probe optimiert ist.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zum Steuern eines Laserscanning-Mikroskops mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Laserscanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 9 gelöst. Die weiteren Patentansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Laserscanning-Mikroskops.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Steuern eines Laserscanning-Mikroskops beim Abtasten einer Probe mit einer ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht aufweisenden Lichtintensitätsverteilung, wobei die Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber der Probe bewegt wird, wird das Anregungslicht binnen unterschiedlich langer Zeiträume, in denen Messbereiche gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe mit dem Anregungslicht beaufschlagt werden, derart für unterschiedlich lange Teilzeiträume ausgeschaltet oder ausgeblendet, dass über jeden der Messbereiche eine gleiche Lichtmenge des Anregungslichts auf die Probe trifft.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nicht die Integrationszeit, für die das von der Probe kommende Licht für jeden der Messbereiche gleicher räumlicher Abmessungen aufintegriert wird, sondern die Zeit beschnitten, für die die Lichtintensitätsverteilung auf den jeweiligen Messbereich gerichtet wird. Damit kann nicht nur erreicht werden, dass die Lichtmengen des Anregungslichts, mit denen die einzelnen Messbereiche gleicher räumlicher Abmessungen beaufschlagt werden, gleich sind, d. h. für eine gleiche Photonenstatistik in allen Messbereichen gesorgt, sondern dies wird so realisiert, dass die Probe insgesamt mit möglichst geringen Lichtmengen beaufschlagt wird und diese Lichtmengen gleichmäßig über die Probe verteilt werden. Ein auftretendes Bleichen von Fluoreszenzmarkern in der Probe ist damit ebenfalls gleichmäßig über die Probe verteilt und nicht etwa an den Umkehrpunkten des Abtastwegs konzentriert, längs dem die Lichtintensitätsverteilung in der Probe bewegt wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine maximale Intensität des Anregungslichts in dem Intensitätsmaximum längs des Abtastwegs in der Probe vorzugsweise konstant gehalten, um jeden der Messbereiche nicht nur mit einer gleichen Lichtmenge, sondern auch mit einer gleichen Lichtintensität zu beaufschlagen. Mit der maximalen Intensität des Anregungslichts ist aber nur die Maximalintensität während der Teilzeiträume gemeint, in denen das Anregungslicht auch auf die Probe trifft.
Das Anregungslicht kann derart für die Teilzeiträume ausgeschaltet oder ausgeblendet werden, dass Schwerpunkte von Teilmessbereichen, über die hinweg das Anregungslicht während der einzelnen Zeiträume auf die Probe trifft, äquidistant in der Probe angeordnet sind. Der Unterschied zu einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Teilzeiträume immer so angeordnet werden, dass sie zu Beginn des Beaufschlagens des jeweiligen Messbereichs mit der Lichtintensitätsverteilung liegen, geht jedoch mit abnehmender Größe der Messbereiche zurück.
Das Anregungslicht kann je Messbereich für jeweils genau einen Teilzeitraum ausgeschaltet oder ausgeblendet werden, so dass es auch für jeweils genau einen hierzu komplementären Teilzeitraum auf die Probe fällt. Wenn das Anregungslicht für die Teilzeiträume ausgeschaltet oder eingeschaltet wird, indem Pulsabstände und/oder Pulsweiten von Pulsen des Anregungslichts variiert werden, können aber auch mehrere, einige oder sogar viele Pulse des Anregungslichts auf jeden der Messbereiche entfallen und gleichmäßig darüber verteilt werden.
Zur Steigerung der Ortsauflösung durch räumliche Begrenzung der effektiven Anregung kann die Lichtintensitätsverteilung, mit der die Probe bei dem erfindungsgemäßen Verfahren abgetastet wird, zusätzlich ein lokales Intensitätsminimum von Fluoreszenzverhinderungslicht aufweisen, das konzentrisch zu dem Intensitätsminimum des Anregungslichts angeordnet ist. Bei diesem Fluoreszenzverhinderungslicht kann es sich konkret um Stimulationslicht zur Stimulation von Fluoreszenzmarkern, die mit dem Anregungslicht angeregt wurden, zur stimulierten Emission handeln. In dieser Form wird das erfindungsgemäße Verfahren zur STED-Laserscanning-Mikroskopie durchgeführt.
Eine maximale Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts in der Lichtintensitätsverteilung wird beim Abtasten der Probe möglichst konstant gehalten, um überall eine gleiche Erhöhung der räumlichen Auflösung durch das Fluoreszenzverhinderungslicht zu erreichen. Damit ist aber nur die Maximalintensität während der Teilzeiträume gemeint, in denen das Fluoreszenzverhinderungslicht auch auf die Probe trifft.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nämlich vorzugsweise auch das Fluoreszenzverhinderungslicht für Teilzeiträume ausgeschaltet oder ausgeblendet. Konkret kann das Fluoreszenzverhinderungslicht für jeden Teilzeitraum, für den das Anregungslicht ausgeschaltet oder ausgeblendet wird, für einen darauf zeitlich abgestimmten anderen Teilzeitraum ausgeschaltet oder ausgeblendet werden. Es ist aber auch möglich, dass die Teilzeiträume, für die das Anregungslicht bzw. das Fluoreszenzverhinderungslicht ausgeschaltet werden in einem anderen zahlenmäßigen Verhältnis als 1:1 stehen. Dann ist jedoch ein festes zahlenmäßiges Verhältnis bevorzugt, wobei die Anzahl der Teilzeiträume, für die das Anregungslicht ausgeschaltet oder ausgeblendet wird größer oder kleiner sein kann als die Anzahl der Teilzeiträume für die das Fluoreszenzverhinderungslicht ausgeschaltet oder ausgeblendet wird.
Ein erfindungsgemäßes Laserscanning-Mikroskop mit einer Anregungslicht bereitstellenden Lichtquelle und einem Scanner, der eine ein Intensitätsmaximum des Anregungslichts aufweisende Intensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber einer Probe bzw. einer Probenhalterung bewegt, weist eine Steuerung für die Lichtquelle auf, die das erfindungsgemäße Verfahren implementiert.
Die Lichtquelle des erfindungsgemäßen Laserscanning-Mikroskops kann eine von der Steuerung angesteuerte Ausblendeinrichtung oder ein von der Steuerung hinsichtlich seiner Pulsabstände und/oder Pulsweiten angesteuerten gepulsten Laser aufweisen, um die Teilzeiträume, für die das Anregungslicht ausgeschaltet oder ausgeblendet wird, zu realisieren.
An dem Scanner des erfindungsgemäßen Laserscanning-Mikroskops ist vorzugsweise ein Sensor angeordnet, der der Steuerung einen Ort anzeigt, an welchem das Anregungslicht aktuell auf die Probe trifft. Grundsätzlich ist es aber auch möglich, dass die Steuerung diesen Ort aus einem Ansteuersignal ableitet, mit dem sie oder eine separate Vorrichtung den Scanner ansteuert, um die Lichtintensitätsverteilung gegenüber der Probe zu bewegen.
Zur Durchführung der STED-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das erfindungsgemäße Laserscanning-Mikroskop eine weitere Lichtquelle für Fluoreszenzverhinderungslicht auf, wobei die Lichtintensitätsverteilung, die der Scanner gegenüber der Probe bewegt, ein lokales Intensitätsminimum von Fluoreszenzverhinderungslicht aufweist, das konzentrisch zu dem Intensitätsmaximum des Anregungslichts angeordnet ist. Auch die weitere Lichtquelle kann eine von der Steuerung angesteuerte Ausblendeinrichtung oder einen von der Steuerung hinsichtlich seiner Pulsabstände und/oder Pulsweiten angesteuerten gepulsten Laser aufweisen.
Die Steuerung kann die weitere Lichtquelle für das Fluoreszenzverhinderungslicht zeitlich versetzt zu der Lichtquelle für das Anregungslicht ansteuern. So kann grundsätzlich dasselbe Grundsignal für das Ansteuern beider Lichtquellen verwendet werden, dass dann beispielsweise für die Ansteuerung der weitere Lichtquelle verzögert wird.
Bei einem erfindungsgemäßen Laserscanning-Mikroskop mit einem Detektor für mit dem Anregungslicht angeregtes und aus der Probe emittiertes Fluoreszenzlicht kann eine Auswerteeinrichtung vorgesehen sein, die das mit dem Detektor registrierte Fluoreszenzlicht den Messbereichen gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe direkt zuordnet. Da dieses Fluoreszenzlicht mit gleichen Lichtmengen und auch gleichen Lichtintensitäten in jedem der Bereiche hervorgerufen wird, kann es direkt als Maß für die Konzentration des Fluoreszenzmarkers in dem jeweiligen Messbereich der Probe verwendet werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs „mindestens“ bedarf. Wenn also beispielsweise von einem lokalen Minimum die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein lokales Minimum, zwei lokale Minima oder mehr lokale Minima vorhanden sind. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren oder die jeweilige Vorrichtung aufweist.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Figurenliste
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.

1 illustriert ein erfindungsgemäßes STED-Laserscanning-Mikroskop zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
2 illustriert die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens längs eines Abtastwegs in einer Probe, dazu zeigt 2 A eine Ablenkung x eines Intensitätsmaximums von Anregungslicht über der Zeit t und 2 B die Intensität I des Anregungslichts über der Zeit t.
3 zeigt die Details einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Laserscanning-Mikroskops und des damit durchgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens.

FIGURENBESCHREIBUNG
Das in 1 dargestellte Laserscanning-Mikroskop 1 ist ein STED-Laserscanning-Mikroskop zur Durchführung von STED-Laserscanning-Mikroskopie, bei der eine Probe 2 nicht nur mit einem Intensitätsmaximum von Anregungslicht 3, sondern auch mit Fluoreszenzverhinderungslicht 4 in Form von Stimulationslicht mit einem von Intensitätsmaxima umgebenden Intensitätsminimum am Ort des Intensitätsmaximums des Anregungslichts 3 beaufschlagt und abgetastet wird. Die Intensitätsverteilung mit dem Intensitätsmaximum des Anregungslichts 3 und dem dazu konzentrisch angeordneten Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 bildet sich im Fokus eines Objektivs 5 aus. Zum Abtasten der Probe 2 mit der Lichtintensitätsverteilung ist ein Scanner 6 vorgesehen, dem eine Scanlinse 40 und eine Tubuslinse 7 nachgeschaltet sind. Dabei ist zwischen dem Scanner 6 und dem Objektiv 5 mit gestrichelter Linien 8 der Verlauf eines von dem Scanner 6 abgelenkten Lichtstrahls aus Anregungslicht 3 und Fluoreszenzverhinderungslicht 4 schematisch wiedergegeben. Eine Lichtquelle 9 für das Anregungslicht 3 umfasst einen Laser 10 sowie eine Ausblendeinrichtung 11, die von einer Steuerung 12 angesteuert wird. Das Fluoreszenzverhinderungslicht 4 wird von einer weiteren Lichtquelle 13 bereitgestellt, die neben einem weiteren Laser 14 und einer weiteren Strahlausblendeinrichtung 15 einen Strahlformer 16 aufweist, der das von dem Laser 14 bereitgestellte Fluoreszenzverhinderungslicht 4 so formt, dass es im Fokus des Objektivs 5 das von Intensitätsmaxima begrenzte Intensitätsminimum aufweist. Das Anregungslicht 3 und das Fluoreszenzverhinderungslicht 4 werden mithilfe von dichroitischen Strahlteilern 17 und 18 auf einer optischen Achse zusammengeführt, auf der aus der Probe 2 emittiertes Fluoreszenzlicht 19 durch ein Filter 20, eine Linse 21 und eine konfokal angeordnete Lochblende 22 zu einem Detektor 23 gelangt. Das Abtasten der Probe 2 mit der Lichtintensitätsverteilung des Anregungslichts 3 und des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 wird von der Steuerung 12 kontrolliert. Sie steuert dazu eine hier separat vorgesehene Abtaststeuerung 24 an, die ein Ansteuersignal 25 an den Scanner 6 ausgibt. An dem Scanner 6 ist ein Sensor 26 angeordnet, der die aktuelle Position des Scanners 6, d. h. seinen Ablenkwinkel erfasst und der ein entsprechendes Positionssignal 27 an die Abtaststeuerung 24 und die Steuerung 12 ausgibt. Die Steuerung 12 weiß daher, wo sich das Intensitätsmaximum des Anregungslichts 3 und das dazu konzentrische Intensitätsminimum des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 auf ihrem Abtastweg in der Probe 2 befinden und mit welcher Geschwindigkeit sie sich fortbewegen. Hiervon abhängig gibt die Steuerung 12 ein Ansteuersignal 28 an die Ausblendeinrichtung 11 der Lichtquelle 14 für das Anregungslicht 3 und ein Ansteuersignal 29 an die Ausblendeinrichtung 15 der Lichtquelle 14 für das Fluoreszenzverhinderungslicht 4 aus. Diese Ansteuersignale 28 und 29 sind so ausgebildet, dass über jeden von mehreren aneinander angrenzenden Messbereichen gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe 2 eine gleiche Lichtmenge des Anregungslichts 3 und auch eine gleiche Lichtmenge des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 auf die Probe 2 trifft. Von dem Detektor 23 erhält die Steuerung 12 ein die Intensität des von dem Detektor 23 registrierten Fluoreszenzlichts anzeigendes Messsignal 30 und ordnet dieses Messsignal 30 den zugehörigen Messbereichen gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe 2 zu. Die Steuerung 12 dient hier insoweit auch als Auswerteeinrichtung 31.
2 A zeigt die Ablenkung x des Intensitätsmaximums des Anregungslichts 3 und des dazu konzentrischen Intensitätsminimums des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 längs eines Abtastwegs 32 über der Zeit t. Der Abtastweg 32 ist dabei eine Kurve, weil sich die längs des Abtastwegs 32 bewegte Lichtintensitätsverteilung mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in der Probe 2 bewegt. Bei dem dargestellten sinusförmigen Verlauf des Abtastwegs 32 über der Zeit t ist auch der Verlauf der Geschwindigkeit sinusförmig. Gleichgroße Messbereiche Δx entsprechen damit unterschiedlich langen Zeiträumen Δt_i um äquidistante Abtastpunkte 33.
Um trotzdem die Probe über jeden Messbereich Δx bei konstanter Intensität I des Anregungslichts 3 und des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 mit jeweils einer gleichen Lichtmenge 34 des Anregungslichts 3 und einer gleichen Lichtmenge des Fluoreszenzverhinderungslichts 4 zu beaufschlagen, wird das Anregungslicht 3 und das Fluoreszenzverhinderungslicht 4 für einen Teilzeitraum 39 des jeweiligen Zeitraums Δt_i ausgeblendet, wobei die verschiedenen Teilzeiträume 39 der verschiedenen Zeiträume Δt_i unterschiedlich lang sind. Dies ist in Fig. 2 B für das Anregungslicht 3 gezeigt. Dabei liegt ein jeweils gleichlanger komplementärer Teilzeitraum 35, in dem das Anregungslicht 3 nicht ausgeblendet wird und der die Lichtmenge 34 bestimmt, am Anfang des jeweiligen Zeitraums Δt_i . Damit liegt er, wie ein Vergleich mit 2 A zeigt, nicht um den jeweiligen Abtastpunkt 33 herum. Dies könnte jedoch durch Verschieben der Teilzeiträume 35, so dass sie um den jeweiligen Abtastpunkt 33 herum angeordnet sind, erreicht werden.
3 zeigt die Lichtquelle 9 für das Anregungslicht 3, den Scanner 6 mit dem Sensor 26 und der Abtaststeuerung 24 sowie die Steuerung 12 einer weiter detaillierten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanning-Mikroskop 1. In der Steuerung 12 werden die Teilzeiträume 35 bezüglich ihrer Dauer vorgegeben. Zudem wird mit dem Positionssignal 27 ein Taktgeber 36 angesteuert, der eine Pixelclock 37 ausgibt. Mit der Pixelclock 37 und der Dauer der Teilzeitraums 35 wird ein Zeitgeber 38 angesteuert, der das Ansteuersignal 29 für die Ausblendeinrichtung 11 so vorgibt, dass die ein gleiches Beleuchten jedes Messbereichs Δx der Probe 2 mit dem Anregungslicht 3 realisiert wird.
Bezugszeichenliste

1: Laserscanning-Mikroskop
2: Probe
3: Anregungslicht
4: Fluoreszenzverhinderungslicht
5: Objektiv
6: Scanner
7: Tubuslinse
8: gestrichelte Linie
9: Lichtquelle
10: Laser
11: Ausblendeinrichtung
12: Steuerung
13: weitere Lichtquelle
14: weiterer Laser
15: weitere Ausblendeinrichtung
16: Strahlformer
17: dichroitischer Strahlteiler
18: dichroitischer Strahlteiler
19: Fluoreszenzlicht
20: Filter
21: Linse
22: Lochblende
23: Detektor
24: Abtaststeuerung
25: Ansteuersignal
26: Sensor
27: Positionssignal
28: Ansteuersignal
29: Ansteuersignal
30: Messsignal
31: Auswerteeinrichtung
32: Abtastweg
33: Abtastpunkt
34: Lichtmenge
35: Teilzeitraum
36: Taktgeber
37: Pixelclock
38: Zeitgeber
39: Teilzeitraum
40: Scanlinse
x: Ablenkung
t: Zeit
I: Intensität
Δx: Messbereich
Δt_i: Zeitraum

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 19702752 A1 [0004]
DE 19843596 A1 [0005]
DE 10261155 A1 [0007]
DE 102007008009 B3 [0008]
DE 19957418 B4 [0011]

Claims

Verfahren zum Steuern eines Laserscanning-Mikroskops (1) beim Abtasten einer Probe (2) mit einer ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht (3) aufweisenden Lichtintensitätsverteilung, wobei die Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber der Probe (2) bewegt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) binnen unterschiedlich langer Zeiträume (Δt_i), in denen Messbereiche (Δx) gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe (2) mit dem Anregungslicht (3) beaufschlagt werden, derart für unterschiedlich lange Teilzeiträume (39) ausgeschaltet oder ausgeblendet wird, dass über jeden der Messbereiche (Δx) eine gleiche Lichtmenge (34) des Anregungslichts (3) auf die Probe (2) trifft.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine maximale Intensität (I) des Anregungslichts (3) in dem Intensitätsmaximum konstant gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) derart für die Teilzeiträume (39) ausgeschaltet oder ausgeblendet wird, dass Schwerpunkte von Teilmessbereichen, über die hinweg das Anregungslicht (3) während der einzelnen Zeiträume (Δt_i) auf die Probe (2) trifft, äquidistant in der Probe (2) angeordnet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) für die Teilzeiträume (39) ausgeschaltet oder ausgeblendet wird, indem Pulsabstände und/oder Pulsweiten von Pulsen des Anregungslichts (3) variiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtintensitätsverteilung, mit der die Probe (2) abgetastet wird, ein lokales Intensitätsminimum von Fluoreszenzverhinderungslicht (4) aufweist, wobei das lokale Intensitätsminimum konzentrisch zu dem Intensitätsmaximum des Anregungslichts (3) angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine maximale Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts (4) in der Lichtintensitätsverteilung konstant gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzverhinderungslicht (4) für jeden Teilzeitraum (39), für den das Anregungslicht (3) ausgeschaltet oder ausgeblendet wird, für einen darauf zeitlich abgestimmten anderen Teilzeitraum ausgeschaltet oder ausgeblendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzverhinderungslicht (4) STED-Licht ist.
Laserscanning-Mikroskop (1) mit einer Anregungslicht (3) bereitstellenden Lichtquelle (9) und einem Scanner (6), der eine ein Intensitätsmaximum des Anregungslichts (3) aufweisende Lichtintensitätsverteilung mit variierender Geschwindigkeit gegenüber einer Probe (2) bewegt, gekennzeichnet durch eine Steuerung (12) für die Lichtquelle (9), die das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausführt.
Laserscanning-Mikroskop (1) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (9) eine von der Steuerung (12) angesteuerte Ausblendeinrichtung (11) oder einen von der Steuerung (12) hinsichtlich seiner Pulsabstände und/oder Pulsweiten angesteuerten gepulsten Laser (10) aufweist.
Laserscanning-Mikroskop (1) nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass an dem Scanner (6) ein Sensor (26) angeordnet ist, der der Steuerung (12) einen Ort anzeigt, an welchem das Anregungslicht (3) aktuell auf die Probe (2) trifft.
Laserscanning-Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere Lichtquelle (13) für Fluoreszenzverhinderungslicht (4) vorgesehen ist, wobei die Lichtintensitätsverteilung, die der Scanner (6) gegenüber der Probe (2) bewegt, ein lokales Intensitätsminimum von Fluoreszenzverhinderungslicht (4) aufweist, wobei das lokale Intensitätsminimum konzentrisch zu dem Intensitätsmaximum des Anregungslichts (3) angeordnet ist.
Laserscanning-Mikroskop (1) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Lichtquelle (13) eine von der Steuerung (12) angesteuerte weitere Ausblendeinrichtung (15) oder einen von der Steuerung (12) hinsichtlich seiner Pulsabstände und/oder Pulsweiten angesteuerten weiteren gepulsten Laser (14) aufweist.
Laserscanning-Mikroskop (1) nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung (12) die weitere Lichtquelle (13) für das Fluoreszenzverhinderungslicht (4) zeitlich versetzt zu der Lichtquelle (9) für das Anregungslicht (3) ansteuert.
Laserscanning-Mikroskop (1) nach einem der Ansprüche 9 bis 14 mit einem Detektor (23) für mit dem Anregungslicht (3) angeregtes Fluoreszenzlicht (19) aus der Probe (2) dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswerteeinrichtung (31) vorgesehen ist, die das mit dem Detektor (23) registrierte Fluoreszenzlicht (19) den Messbereichen (Δx) gleicher räumlicher Abmessungen in der Probe (2) zuordnet.